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Trabajo Fin de Máster Estudio in vitro del efecto de ácidos fenólicos naturales sobre el crecimiento de mohos y la producción de aflatoxinas. Autor/es Agostina Rodríguez Larrosa Director/es Agustín Ariño Moneva. Juan José Carramiñana Esteban. Facultad de Veterinaria 2014 Agradecimientos. El presente trabajo ha sido financiado por el Proyecto I+D+i AGL2011/26808 “Prevención y reducción de toxinas de Fusarium en cereales mediante el uso de ácidos fenólicos naturales” del Ministerio de Ciencia e Innovación del Gobierno de España, así como por el Grupo de Investigación Consolidado A01 “Análisis y Evaluación de la Seguridad Alimentaria” del Gobierno de Aragón y el Fondo Social Europeo. En primer lugar dar las gracias a mis tutores el Dr. Agustín Ariño Moneva y el Dr. Juan José Carramiñana por la oportunidad de llevar a cabo este proyecto y por la confianza depositada. También agradecer la Dra. Susana Loran por su tiempo y dedicación, así como a mi compañera Noemí Bervis. A mis padres, a Sabrina y a Daniel, gracias familia… Trabajo Fin de Máster. Índice. Índice General: 1. Resumen………………………………………………………………………………………….. 1 2. Introducción……………………………………………………………………………………… 3 2.1. Justificación…………………………………………………………………………………. 3 3. Objetivos…………………………………………………………………………………………. 5 4. Revisión bibliográfica……………………………………………………………………………. 6 4.1. Micotoxinas y aflatoxinas…………………………………………………………………… 6 4.2. Efectos toxicológicos de las aflatoxinas…………………………………………………….. 7 4.3. Mohos productores de aflatoxinas: factores que influyen en su desarrollo y en la producción de toxinas……………………………………………………………………………………. 8 4.4. Incidencia en alimentos……………………………………………………………………. 10 4.5. Ácidos fenólicos……………………………………………………………………………. 12 5. Material y Métodos……………………………………………………………………………... 13 5.1. Estudio in vitro del efecto de los ácidos fenólicos sobre el crecimiento y la producción de toxinas de Aspergillus parasiticus CECT 2682 en medio líquido Yeast extract sucrose broth (YES)……………………………………………………..………………………………… 13 5.1.1. Obtención de la cepa de referencia………………………………………………….. 14 5.1.2. Preparación de la cepa………………………………………………………………. 14 5.1.3. Preparación de la suspensión de esporos……………………………………………. 15 5.1.3.1. Recuento en cámara de Neubauer…………………………………………… 15 5.1.3.2. Confirmación por recuento en placa………………………………………… 16 5.1.4. Ácidos fenólicos…………………………………………………………………….. 16 5.1.4.1. Preparación de las soluciones madres de ácidos fenólicos………………..… 17 5.1.5. Preparación del medio con ácidos fenólicos e inoculación de la cepa de Aspergillus parasiticus……………………………………………………………………..…….… 18 5.1.6. Efecto de los ácidos fenólicos sobre el crecimiento de Aspergillus parasiticus……. 19 5.1.7. Efecto de los ácidos fenólicos sobre la producción de micotoxinas………………... 20 Trabajo Fin de Máster. Índice. 5.2. Optimización de un método analítico para la determinación de aflatoxinas……………..... 23 5.2.1. Optimización de las condiciones cromatográficas………………………………….. 23 5.2.1.1. Tiempos de retención………………………………………………………... 23 5.2.1.2. Longitud de onda de excitación y emisión………………………………….. 24 5.2.1.3. Composición de la fase móvil y flujo……………………………………….. 24 5.2.2. Purificación: columnas de adsorción………………..………………………………. 25 5.3. Validación………………………………………………………………………………….. 25 5.3.1. Especificidad………………………………………………………………………… 25 5.3.2. Linealidad…………………………………………………………………………… 26 5.3.3. Sensibilidad………………………………………………………………………….. 26 5.3.3.1. Límite de detección (LD)……………………………………………………. 26 5.3.3.2. límite de cuantificación (LC)………………………………………………... 26 5.3.4. Exactitud (Recuperación)…………………………………………………………… 27 5.3.5. Precisión…………………………………………………………………………….. 27 5.3.5.1. Precisión de la inyección……………………………………………………. 27 5.3.5.2. Repetibilidad del método……………………………………………………. 28 5.3.5.3. Reproducibilidad del método………………………………………………... 28 6. Resultados y discusión…………………………………………………………………………. 29 6.1. Optimización del método analítico……………………………………………………….... 29 6.1.1. Optimización de las condiciones cromatográficas………………………………….. 29 6.1.1.1. Tiempos de retención………………………………………………………... 29 6.1.1.2. Longitud de onda de excitación y emisión………………………………..… 30 6.1.1.3. Composición de la fase móvil y flujo……………………………………..… 31 6.1.2. Purificación: columnas de adsorción……………….…………………………….…. 33 6.2. Validación………………………………………………………………………………..… 34 6.2.1. Especificidad……………………………………………………………………….... 34 6.2.2. Linealidad…………………………………………………………………………… 36 6.2.3. Sensibilidad………………………………………………………………………….. 37 6.2.3.1. Límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC)………………...... 37 6.2.4. Exactitud (Recuperación)…………………………………………………………… 38 6.2.5. Precisión…………………………………………………………………………….. 38 6.2.5.1. Precisión de la inyección……………………………………………………. 38 6.2.5.2. Repetibilidad y reproducibilidad del método………………………………... 39 Trabajo Fin de Máster. Índice. 6.3. Efecto de los ácidos fenólicos sobre el crecimiento de A. parasiticus CECT 2682……..… 40 6.4. Efecto combinado de los ácidos fenólicos y el crecimiento del moho sobre el pH del medio YES ……………………………………………………………………………………...… 42 6.5. Efecto de los ácidos fenólicos sobre la biosíntesis de aflatoxinas, producidas por la cepa de Aspergillus parasiticus CECT 2682……………………………………………………...… 43 7. Conclusiones………………………………………………………………………………….… 48 8. Bibliografía…………………………………………………………………………………….... 49 9. Anexos Trabajo Fin de Máster. Índice de figuras y tablas. Índice de figuras. Figura 1. Estructura química de las aflatoxinas……………………………………………………… 6 Figura 2. Género Aspergillus. Colonias tipo de A. flavus……………………………………...….…. 8 Figura 3. Estructura química de los ácidos fenólicos……………………………………………….. 12 Figura 4. Aspergillus parasiticus CECT 2682. Colonias en agar PDA………………………...…... 14 Figura 5. Aspecto de conidióforos y esporos al microscopio……………………………………….. 15 Figura 6. Confirmación del recuento de esporos en placa………………………………………..… 16 Figura 7. Esquema. Experimento in vitro…………………………………………………………… 19 Figura 8. Peso del micelio seco……………………………………………………………………... 20 Figura 9. Esquema. Proceso de extracción y purificación de la muestra………………………….... 22 Figura 10. Patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. Tiempos de retención y áreas…………………………………………………………………………………………………. 29 Figura 11. Cromatograma a 435 nm de emisión, patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2 ……………………………………………………………………………………………… 30 Figura 12. Cromatograma a 420 nm de emisión, patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2 ……………………………………………………………………………………………… 31 Figura 13. Cromatograma a 365 nm de ex. y de 435 nm de em. de patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2 con fase móvil agua/acetonitrilo/metanol (60:15:30) …………………. 32 Figura 14. Cromatograma a 365 nm de ex. y 435 nm de em. de patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2 con fase móvil agua/acetonitrilo/metanol (28,1:10,5:61,4) ………….……... 32 Figura 15.Cromatograma de una muestra de maíz fortificado en 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2, purificada con la columna Mycosep ® AflaZON 224……………………………….. 33 Figura 16. Cromatograma de una muestra de maíz fortificado con 10 ng/mL para G1 y B1 y 3 ng/mL para G2 y B2, purificada con la columna Isolute® Myco………………………………………….... 34 Trabajo Fin de Máster. Índice de figuras y tablas. Figura 17. Cromatograma a 365 nm de ex. y 435 nm de em. de un patrón de 10ng/ml para G1 y B1 y 3 ng/mL para B2 y G2, fase móvil agua/acetonitrilo/metanol (40:10:50)………………………….... 35 Figura 18.Cromatograma de blanco de proceso…………………………………………………….. 35 Figura 19. Cromatograma de una muestra de medio líquido YES, libre de aflatoxinas……………. 35 Figura 20. Rectas de calibrado con concentraciones de 0,5 ng/mL a 10 ng/mL para B1 y G1 y de 0,15 ng/mL a 3 ng/mL para B2 y G2….…………………………………………………………………... 36 Figura 21. Efecto de las concentraciones de ácidos fenólicos sobre el crecimiento de Aspergillus parasiticus CECT 2682, en medio de cultivo liquido YES…………………………………………. 40 Figura 22. Evolución del pH en 21 días de experimento, a distintas concentraciones de ácidos fenólicos…………………………………………………………………………………………..… 42 Figura 23. Producción de aflatoxinas totales (suma de B1 + B2 + G1 + G2)………………………... 44 Índice de tablas. Tabla 1. Ácidos fenólicos: fórmula empírica, grado de pureza y peso molecular.…………………. 17 Tabla 2. Preparación de las soluciones madre de ácidos fenólicos…………………...…………….. 17 Tabla 3 Suplementación del medio de cultivo líquido YES, con ácidos fenólicos…………………..18 Tabla 4. Composición de la fase móvil…………………………………………...………………… 24 Tabla 5. Tiempos de retención. Desviación estándar y coeficiente de variación…………………... 29 Tabla 6. Estudio de la linealidad, rectas de calibración…………………………………………….. 36 Tabla 7. Límites de detección y límites de cuantificación………………………………………….. 37 Tabla 8. LD y LC obtenidos por otros autores……………………………………………………… 37 Tabla 9. Porcentajes de recuperación para cada aflatoxina…………………………………………. 38 Tabla 10. Precisión en la inyección. Desviación estándar relativa de cada aflatoxina…………….. 38 Tabla 11. Repetibilidad y reproducibilidad del método, coeficientes de variación………………… 39 Trabajo Fin de Máster. Resumen. 1 1. Resumen: La calidad de las materias primas y la seguridad de los consumidores se ven amenazadas por diversas especies de mohos toxigénicos como es el caso del género Aspergillus. Estos mohos afectan a diversas especies de cereales y su incidencia está en aumento debido a los efectos del cambio climático. Las especies Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, son las principales responsables de la producción de aflatoxinas, metabolitos secundarios clasificados por la IARC (Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer) en el Grupo 1 como agentes cancerígenos para los humanos. Estas micotoxinas han sido detectadas en cereales, productos derivados de cereales, cacahuetes, oleaginosas, frutas desecadas, frutos secos, especias y leche. Las estrategias para el control de la contaminación por las aflatoxinas antes de la cosecha son de gran interés práctico, dado que las pérdidas económicas directas e indirectas debidas a la contaminación por estas toxinas pueden afectar gravemente a la rentabilidad de los productores, sobre todo en el caso del maíz. Existen diversas estrategias para prevenir y reducir la infección fúngica en estos cereales y la subsiguiente producción de micotoxinas. La necesidad de la agricultura para dar mayores rendimientos y ser más sostenible ha impulsado la investigación y el desarrollo de nuevos métodos y prácticas de control de plagas que no dependen de los plaguicidas químicos de síntesis, esto incluye la utilización de agentes antifúngicos naturales. El objetivo general de este estudio es evaluar in vitro el efecto de los principales ácidos fenólicos naturales (ferúlico, cafeico, cumárico, clorogénico) a distintas concentraciones, sobre el crecimiento de Aspergillus parasiticus CECT 2682 y la capacidad de síntesis de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2. Para ello se llevó a cabo la puesta a punto y la consiguiente validación de un método de detección por HPLC, cromatografía líquida de alta resolución, con una etapa previa de purificación mediante columnas de extracción en fase sólida. Los ácidos fenólicos ensayados han mostrado un efecto fungistático frente a la cepa de Aspergillus parasiticus CECT 2682. La producción de aflatoxinas se vio inhibida en su totalidad a concentraciones de 20 mM. Los ácidos fenólicos que presentaron mayor efecto fueron el ácido clorogénico y el ácido cafeico. Trabajo Fin de Máster. Resumen. 2 Abstract: The quality of raw materials and consumer safety are threatened by various species of toxigenic molds such as the genus Aspergillus. These molds affect various species of cereals and its incidence is increasing due to the effects of climate change. Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, are the main responsible species for the production of aflatoxins, secondary metabolites, classified by the IARC (International Agency for Research on Cancer) as Group 1 carcinogens to humans. These mycotoxins have been detected in cereals, cereal products, groundnuts, oilseeds, dried fruits, nuts, spices and milk. Strategies for the control of aflatoxins contamination before harvest are of great practical interest, since the direct and indirect economic losses due to aflatoxin contamination can seriously affect the profitability of producers, especially in the case of corn. There are several strategies to prevent and reduce fungal infection in these grains and the subsequent production of mycotoxins. The need for agriculture to give higher yields and be more sustainable has driven research and development of new methods and practices of pest control that do not rely on synthetic chemical pesticides, this includes the use of natural antifungal agents. The overall objective of this study is to evaluate in vitro the effect of major natural phenolic acids (ferulic, caffeic, coumaric, chlorogenic) at various concentrations on the growth of Aspergillus parasiticus CECT 2682 and its ability to synthesize aflatoxins B1, B2, G1 and G2. It was carried out the set-up and the subsequent validation of a method of detection by HPLC, high resolution liquid chromatography, with a prior step of purification by column solid phase extraction. The phenolic acids tested showed a fungistatic effect against Aspergillus parasiticus CECT 2682. Aflatoxin production was inhibited at concentrations of 20 mM. The most effective phenolic acids were chlorogenic acid and caffeic acid. Trabajo Fin de Máster. Revisión Bibliográfica. 9 juntamente con los conidios (Abarca, et al., 1986). Basándose en características morfológicas y de cultivo, Raper y Fenell (1965) describieron 18 especies, que más tarde, se denominaron secciones y se agruparon en 6 subgéneros (Samson, et al., 2004). Las especies A. parasiticus y A. flavus pertenece a la sección Flavi. Son considerados hongos de campo, aunque la colonización y la consecuente contaminación por aflatoxinas pueden ocurrir durante el almacenamiento. En maíz se ha demostrado que, incluso bajo condiciones óptimas de almacenamiento, puede haber contaminación por aflatoxinas. (Saleemullah et al., 2006) La ubicuidad de estos mohos es debida a su capacidad para crecer a diferentes temperaturas sobre substratos con diverso contenido de humedad. Los factores implicados en el crecimiento de los mohos pertenecientes al género Aspergillus en los alimentos son tanto los propios del medio en el que se desarrollan (pH, composición del alimento o actividad de agua), como factores extrínsecos: humedad ambiental, temperatura de almacenamiento y competencia microbiana (Zinedine y Mañes, 2009). A. flavus y A. parasiticus, los principales mohos productores de aflatoxinas, tienen patrones similares de crecimiento y toxicogénesis. Aunque las condiciones descritas varían ligeramente en función de la fuente bibliográfica, algunos autores refieren que A. flavus y A. parasiticus crecen en un intervalo de temperatura de 10 a 43º C, con una temperatura óptima, entre 32 y 33º C. Pueden crecer en un intervalo de pH amplio (2,1 a 11,2) con un crecimiento optimo entre 3,5 y 8. En cuanto a la actividad de agua (Aw) los valores mínimos de crecimiento están entre 0,80 y 0,83 y el óptimo en 0,99. Por lo que se refiere a la toxicogénesis, el intervalo de temperatura en el que se producen las aflatoxinas va de 12 a 40º C, con un óptimo entre 25 y 30º C. En A. parasiticus la proporción de producción de aflatoxinas B respecto a G es mayor a temperaturas altas. Se producen en un intervalo de pH entre 3,5 y 8, con un óptimo de pH 6 y, en cuanto a la actividad del agua, el mínimo para la producción es de 0,82 para A. flavus con un óptimo de 0,99. El clima típico de los países mediterráneos, caracterizado por temperatura y humedad altas, favorece tanto el crecimiento de los mohos como la producción de aflatoxinas (optimo entre 25 y 30º C) (AESAN, 2011). La composición gaseosa ambiental en la que crece el moho y la luz, también pueden influir en el crecimiento del hongo y en la producción de aflatoxinas (Sanchis, et al., 2004). Otro factor importante, que influye en el desarrollo de estos mohos, es una humedad elevada. Las combinaciones de temperatura y humedad elevadas, por ejemplo, periodos de lluvia antes de la Trabajo Fin de Máster. Revisión Bibliográfica. 10 cosecha de alimentos infectados por estos mohos, producen concentraciones inaceptables de aflatoxinas. (Russell, et al., 2010) Cuando el grano está en pleno desarrollo y hay temperaturas ambientales cálidas, con las condiciones de sequía, el grano se vuelve más susceptible a la formación de aflatoxinas. El organismo saprofito se difunde a través de sus conidios (esporas asexuales) llevados por el viento o los insectos a los cultivos en crecimiento. Cualquier condición que ofrezca un portal de entrada en el tejido de la planta hospedadora o elimine la integridad de la cubierta de la semilla permitirá al organismo entrar y crecer en el tejido vivo del huésped, incluyendo los núcleos del grano en desarrollo. Los insectos, como escarabajos y el taladro europeo del maíz pueden proporcionar transmisión y portales de entrada en la planta huésped. El maíz, los frutos secos y ciertas oleaginosas son los principales cultivos afectados. Granos almacenados con humedad por encima del 14%, a temperaturas cálidas (>20° C) y / o insuficientemente secas son susceptibles de contaminación. Para poder evitarlo, los granos deben mantenerse secos, libres de daños y libres de insectos (Richard, 2007). 4.4. Incidencia en alimentos: La contaminación por Aspergillus puede producirse en los propios cultivos, como sucede con los cacahuetes, los pistachos y el maíz, algunas veces favorecida por la acción de los insectos, o en el transporte y almacenamiento, como sucede con los cereales. La toxina puede persistir en el alimento aunque el moho toxigénico haya desaparecido y, en este sentido, se han detectado aflatoxinas en prácticamente todas las zonas del mundo y en casi todos los alimentos de primera necesidad, en mayor o menor medida. Además, resulta también un factor clave el hecho de que estas toxinas presentan una elevada estabilidad térmica, lo cual favorece que permanezcan en algunos alimentos cocinados y que la congelación no tenga apenas efectos sobre su presencia en los alimentos (Rasch et al., 2010). Los alimentos más susceptibles a la contaminación por aflatoxinas y que pueden implicar una mayor exposición están incluidos en el Reglamento (CE) Nº 1881/2006 (maíz, arroz, cereales en general, avellanas, almendras, nueces de Brasil, pistachos, cacahuetes y otras semillas oleaginosas, frutas secas como higos o pasas y especias como el pimentón, nuez moscada, jengibre, así como la leche). Para ellos se han establecido límites máximos. Trabajo Fin de Máster. Revisión Bibliográfica. 11 En el año 2013, la EFSA elaboró un informe técnico sobre la presencia de aflatoxinas (suma de B1, B2, G1 y G2) en cereales y productos alimenticios derivados de cereales. El muestreo se llevó a cabo en 16 países europeos, siendo Alemania el país más representado, seguido de Austria y Eslovenia. En cuanto a “productos elaborados a base de cereales” se analizaron un total de 842 muestras, las tres categorías con mayor número de muestras analizadas fueron "Cereales para el desayuno", 346 muestras, "los alimentos a base de cereales para lactantes y niños pequeños", 253 muestras y "Productos de panadería fina" 101 muestras. Para los alimentos a base de cereales, como por ejemplo productos de pastelería se encontró un valor medio de 0,45 µg/kg y para pasta cruda el valor medio fue de 1,87 µg/kg. Los cereales para el desayuno mostraron valores promedio de 0,05 µg/kg y 0,46 µg/kg en el límite inferior y en el límite superior, respectivamente. Entre las muestras cuantificadas, dos muestras de cereales para el desayuno estaban por encima de los límites máximos especificados en la legislación (4 µg/kg). De las 51 muestras cuantificadas de cereales o productos transformados, siete mostraron valores superiores a 1 µg/kg de la suma de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 (EFSA, 2013). Se ha descrito la presencia de aflatoxinas en otros productos alimenticios, incluyendo productos de origen animal, productos cárnicos procesados como los embutidos fermentados (Markov et al., 2013). También se ha encontrado presencia de aflatoxinas en productos vegetales, hortalizas de hoja verde (Hariprasad et al., 2013), café (Russell et al., 2014). Además se ha comprobado la presencia de estas micotoxinas en bebidas alcohólicas como el vino y la cerveza (Rasch et al., 2010) o la leche (Zinedine et al., 2007). En el caso de este último alimento la presencia de aflatoxinas B y G es mucho menos relevante que la presencia de la aflatoxina M1, metabolito de la aflatoxina B1 (Ayar et al., 2007). Las herramientas más importantes para prevenir y limitar la aparición de aflatoxinas en los alimentos son las buenas prácticas durante la producción agrícola y el almacenamiento de los alimentos, que deben realizarse a temperaturas y humedades relativas que dificulten tanto el crecimiento fúngico como la producción de aflatoxinas por parte de los hongos potencialmente productores de las mismas. Es también sumamente importante evitar la contaminación cruzada entre lotes diferentes de alimentos. Durante el procesado del alimento puede lograrse el objetivo de reducir la exposición alimentaria a las aflatoxinas mediante la selección u otro tratamiento físico antes del consumo humano directo o de su utilización como ingredientes de productos alimenticios (AESAN, 2011). Trabajo Fin de Máster. Revisión Bibliográfica. 12 4.5. Ácidos Fenólicos: Debido al considerable interés de la industria alimentaria y preferencias del consumidor por encontrar nuevos métodos para garantizar la seguridad alimentaria, se realizan esfuerzos por investigar los efectos de los antioxidantes naturales, y así poder reducir la utilización de compuestos sintéticos (Nesci et al., 2007). Los compuestos fenólicos son productos del metabolismo secundario en plantas, y cumplen funciones esenciales en la reproducción y crecimiento de las plantas, actuando como mecanismos de defensa contra agentes patógenos, parásitos y depredadores, y contribuyen al color de las plantas. Además de sus funciones en las plantas, los compuestos fenólicos en nuestra dieta pueden proporcionar beneficios para la salud asociados con un menor riesgo de enfermedades crónicas (Liu et al., 2008). Los compuestos fenólicos poseen uno o más anillos aromáticos con uno o más grupos hidroxilo, y en general se clasifican como ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos, cumarinas, y taninos. Los ácidos fenólicos se pueden subdividir en dos grupos principales, derivados del ácido hidroxibenzoico y derivados del ácido hidroxicinámico (figura 3). Los derivados del ácido hidroxibenzoico incluyen p -hidroxibenzoico, protocatecuico vaníllico, siríngico y ácido gálico, presentes en la forma ligada, son típicamente componentes de estructuras complejas tales como ligninas y taninos hidrolizables. Los derivados de ácido hidroxicinámico incluyen p-cumárico, cafeico, ferúlico, y ácido sinápico, presentes en la forma unida, ligados a los componentes estructurales de la pared celular tales como la Figura 3. Estructuras químicas de los ácidos fenólicos: (a) los derivados del ácido benzoico y (b) los derivados del ácido cinámico. (Liu, 2007). Trabajo Fin de Máster. Revisión Bibliográfica. 13 celulosa, lignina, y proteínas a través de enlaces éster. El ácido ferúlico se produce principalmente en las semillas y las hojas de las plantas, conjugado covalentemente a mono-y disacáridos, polisacáridos de la pared celular vegetal, glicoproteínas, poliaminas, lignina, y biopolímeros de hidratos de carbono insolubles. El ácido clorogénico y curcumina también son derivados del ácido hidroxicinámico. El ácido clorogénico es un éster de ácido cafeico, mientras que la curcumina está formada por dos moléculas de ácido ferúlico (Liu, 2007). El interés en estos compuestos radica en que además de presentar beneficios potenciales para la salud en determinadas patologías por su actividad antioxidante, está demostrada su capacidad antimicrobiana (Zabka y Pavela, 2013). Además, existe evidencia acerca de la capacidad de los compuestos fenolicos para inhibir la producción de varias micotoxinas de Fusarium incluyendo las fumonisinas y tricotecenos. También existen estudios, donde la producción de aflatoxinas se ve inhibida por la utilización de aceites esenciales naturales (Passone y Etcheverry, 2005; Palumbo y O’Keeffe, 2007; Ferrochio et al., 2013), pero estos en ocasiones, pueden alterar las propiedades organolépticas del producto. Los agentes antifúngicos ideales deben ser capaces de inhibir completamente el crecimiento y la producción de micotoxinas en niveles que no alteren la aceptabilidad sensorial del producto tratado (Samapundo et al., 2007). 5. Material y métodos. 5.1. Estudio in vitro del efecto de los ácidos fenólicos sobre el crecimiento y la producción de toxinas de Aspergillus parasiticus CECT 2682 en medio líquido Yeast extract sucrose broth (YES): El estudio se basó en la siembra de una cepa de referencia de Aspergillus parasiticus, en medio de cultivo líquido YES, compuesto por extracto de levadura al 2% y sacarosa al 15% (Gandomi et al., 2009; Sindhu, 2007), al que se le añadieron cuatro ácidos fenólicos (clorogénico, cafeico, p-cumárico y ferúlico) a cuatro concentraciones 1 mM, 5 mM, 10 mM y 20 mM (Ferrochio, 2013; Palumbo, 2007), así como su correspondiente control sin enriquecer. Se hizo el seguimiento durante 21 días a 25º C. Para determinar el grado de inhibición del crecimiento del organismo, se pesó el micelio seco, y la producción de aflatoxinas se determinó mediante el método analítico de HPLC optimizado que se describe posteriormente. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 14 5.1.1. Obtención de la cepa de referencia: La cepa de Aspergillus parasiticus utilizada en este trabajo se obtuvo de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT 2682). Esta cepa coincide con la NRRL 3145 de la colección de cultivos tipo del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Fue elegida por su capacidad para producir las cuatro aflatoxinas: B1, B2 ,G1 y G2. 5.1.2. Preparación de la cepa Se añadió al vial con el cultivo liofilizado, un volumen de caldo Sabouraud hasta una rehidratación completa. A partir de esta suspensión, con pipeta pasteur de vidrio estéril, se pasó parte del liófilo a tres tubos de ensayo con 9 mL de caldo Sabouraud. Los tubos se incubaron durante 4 días a 25ºC, para garantizar las condiciones óptimas de crecimiento, lo que se confirmó por la presencia de turbidez en los tres tubos. Una vez revivificada la cepa, fue cultivada en agar patata dextrosa (PDA, Merck®), compuesto por polvo de patata, glucosa y agar. El medio preparado y esterilizado, se vertió en placas de Petri con un volumen entre 18-20 mL. Una vez solidificadas se realizó la siembra, en tres puntos equidistantes de la placa. Las placas fueron incubadas a 25ºC durante 7 días (figura 4). A continuación, tras el periodo de incubación a partir del agar nutritivo PDA, se tomó con un asa estéril, parte de micelio del borde de la colonia, para ser almacenado en crioviales, con un 15% de gricerol y conservados a -80ºC. Figura 4. Vial de Aspergillus parasiticus CECT 2682. Aspecto de la colonia en agar PDA. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 15 5.1.3. Preparación de una suspensión de esporos. A partir de las placas de PDA, tras los siete días de incubación a 25ºC, se cogió micelio del borde de la colonia con asa estéril, para ser sembrado superficialmente en estrías en agar inclinado PDA. Los tubos de agar inclinado se incubaron nuevamente durante 7 días a 25ºC. Tras los días de incubación, se añadieron de manera aséptica 10 mL de un agente humectante (Tween 80 al 0,01% en agua destilada) a cada tubo de PDA. Se frotó con asa de Drigalski estéril la superficie del agar, para favorecer la liberación de esporos y micelio de la superficie. La suspensión obtenida, se filtró con embudo y gasa estéril (la gasa se colocó en 4-5 capas). El filtrado, con los esporos, se recogió en tubos de rosca estériles para ser almacenados a 4ºC hasta su recuento en cámara de Neubauer. 5.1.3.1 Recuento de esporos en cámara de Neubauer: La cámara de recuento de Neubauer (Optik Labor) está adaptada a un microscopio de contraste de fases (Leica) que permite el recuento de las conidias y calcular el numero de esporos por mL de suspensión, sin adición de colorantes. Con pipetas y puntas estériles se depositan 100 µL de la suspensión de esporos en el portaobjetos específico (cámara de Neubauer), se cubre con un cubreobjetos que se adhiere por tensión superficial y se observa al microscopio con el objetivo de 40 aumentos. El proceso de recuento de esporores se realizó tres veces y se calculó el promedio del número de esporos por mL de suspensión. Figura 5. Foto propia. Aspecto del conidióforo y esporos al microscopio. Software Las Ez® . Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 16 Figura 6. Agar PDA inclinado. Confirmación del recuento de esporos en Agar PDA. 5.1.3.2 Confirmación del recuento de esporos, mediante siembra en placa Esta confirmación se realizó mediante siembra en superficie en agar PDA, por duplicado. Se prepararon diluciones decimales seriadas en tubos eppendorf estériles, cogiendo 0,1 mL de suspensión madre y llevandola a 0,9 mL de agua de peptona estéril al 0,1%, así hasta obtener la dilución que permita el recuento de esporos entre 10-100 esporos/mL en placa. De las diluciones con recuentos teóricos entre los valores anteriores, se añadió 0,1 mL a una placa de agar PDA. Se sembró por extensión en en superficie con asa de Drigalski. Las placas fueron incubadas a 25ºC durante 3 días. Tras esta incubación, se cuentó el numero de esporos de cada placa, sembradas por duplicado. Se hizo el promedio y se multiplicó por el inverso del volumen de la siembra y por el inverso del volumen de la dilución. El resultado se expresó en esporos/mL Con el recuento en placa se confirma el recuento teórico obtenido en el cámara de Neubauer. Se persigue obtener una suspensión de esporos con un recuento aproximado de 106 esporos/mL. Esta solución se almacenó a 4º C hasta su uso. 5.1.4. Ácidos fenólicos: Los ácidos fenólicos utilizados fueron: Clorogénico, Cafeico, p-Cumárico y Ferúlico. De la casa comercial Sigma-Aldrich Chemie (Tabla 1). Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 17 Ácido fenólico Fórmula Empírica Grado de Pureza Peso molecular (gr/mol) Clorogénico C16H18O9 ≥ 95% 354,31 Cafeico C9H8O4 ≥ 98% 180,16 p-Cumárico C9H8O3 ≥ 98% 164,16 Ferúlico C10H10O4 99% 194,18 Tabla 1. Ácidos fenólicos utilizados en el estudio, fórmula empírica grado de pureza y peso molecular. 5.1.4.1 Preparación de las soluciones madre de ácidos fenólicos. Se prepararon soluciones madre de los cuatro ácidos fenólicos a estudiar, clorogénico, p-cumárico, cafeico y ferúlico, a concentraciones de 400 mM en etanol-agua en proporcion 80:20. En la tabla 2 se muestra, a modo de resumen, la preparación de estas soluciones madres. Los ácidos fenólicos se pesaron en un recipiente de cristal estéril con capacidad para 100 mL, protegidos de la luz. Al añadir la proporción correspondiente de agua-etanol, el agua estéril debe ser añadida aproximadamente a 50ºC para facilitar la solubilización del ácido. Las soluciones madre fueron almacenadas en congelación a -20ºC hasta su uso. Ácido fenólico Pm (g/mol) Peso (g) Vol. Total (ml) Etanol (%) Vol. etanol (ml) Vol. agua dest. (ml) [mM.] [ppm] Clorogénico 354,31 7,086 50 80 40 10 400 141724 Ferúlico 194,18 3,883 50 80 40 10 400 77672 Cumárico 164,16 3,283 50 80 40 10 400 65664 Cafeico 180,16 3,603 50 80 40 10 400 72064 Tabla 2. Preparación de soluciones madre de ácidos fenólicos. Pm: peso molecular, [mM]: milimolar, [ppm]:o mg/L, partes por millón. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 18 5.1.5 Preparación del medio con ácidos fenólicos e inoculación de la cepa de Aspergillus parasiticus: Se preparó el medio de cultivo líquido YES; con extracto de levadura al 2%, sacarosa al 15% y agua destilada. Una vez autoclavado y enfriado, se ajustó el pH a 5,5 con una solución de ácido clorhídrico 1N, estéril. En recipientes de vidrio, con 60 mL del medio de cultivo preparado, se añadió la solución madre del ácido fenólico correspondiente. Se suplementó el medio a cuatro concentraciones, 1 mM, 5 mM, 10 mM y 20 mM. Además de un recipiente sin suplementar, a modo de control. Este procedimiento está descrito en la tabla 3. Concentraciones de ácidos a estudiar (mM) Volumen a tomar de la solución madre (µL) Volumen de medio de cultivo liquido YES (mL) 0 - 60 1 150 60 5 750 60 10 1500 60 20 3000 57 Tabla 3. Suplementación del medio líquido YES con distintas concentraciones de ácidos fenólicos. Cada solución de medio de cultivo líquido enriquecida con ácido fenólico, se dispensó en tubos estériles. Se prepararon cuatro tubos de 9,9 mL, uno para cada concentración de ácido más un tubo control sin suplementar, para cada día de experimentacion (día 4, 7, 10, 14 y 21) hasta un total de ochenta y cinco tubos. A cada uno, se le inoculó 0,1 mL de la suspensión de esporos ( punto 5.1.3.) y se incubaron a 25 ºC. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 25 5.2.2.Purificación de la muestra: columnas de adsorción. Se probaron dos tipos de columnas de adsorción, de dos casas comerciales diferentes Mycosep® AflaZON 224 de RomerLab® y la columna Isolute® Myco de la casa Biotage®, la primera indicada para el análisis de aflatoxinas y zearalenona y la segunda para un grupo más amplio de micotoxinas tales como, las nombradas anteriormente más, fumonisinas, patulina, ergotoxinas y ocratoxina A. En los dos casos, las matrices recomendadas por las casas comerciales son granos de cereal, como el maíz, trigo y centeno; y frutos secos como los cacahuetes y las nueces. Se fortificaron dos muestras de maíz libre de aflatoxinas, a 10 ng/mL de G1 y B1 y 3 ng/mL G2 y B2 y, siguiendo el protocolo de extracción de cada columna, se procedió al analisis por HPLC. Con la columna seleccionada, se hizo el estudio de recuperación explicado en el punto 5.2.4. 5.3. Validación del metodo analítico. Según la Decisión de la Comisión de 12 de agosto de 2002 (2002/657/CE), por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de resultados”, la validación, es la confirmación mediante exámen y puesta a disposición de pruebas efectivas de que se cumplen los requisitos particulares de un uso específico previsto. La validación de este método se ha realizado tomando como referencia el Reglamento (CE) Nº 401/2006, por el que se establecen los métodos de muestreo y de anáisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios. 5.3.1. Especificidad. Es la capacidad de un método para distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias. (Decisión 2002/567/CE). Para distinguir las aflatoxinas, de otras sustancias interferentes, se analizaron: o Disolvente de inyección. o Blanco de proceso. Se realiza todo el procedimiento analitico, extracción, purificación, y determinación cromatográfica pero omitiendo la muestra. o Muestra blanco de medio de cultivo, sin producción de aflatoxinas. o Solución patrón de 10 ng/mL de aflatoxinas B1 y G1 y 3 ng/mL de G2 y B2. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 26 Todo ello para comprobar que no existían solapamientos de picos, que estos están formados por un solo componente, lo que permite una cuantificación correcta. 5.3.2. Linealidad: La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad entre la concentración de analito y su respuesta. Viene representada a través de una recta de regresión, que es la utilizada para calcular por interpolación, las concentración de aflatoxinas en las distintas muestras. Al no existir efecto matriz relevante en el análisis de las muestras de medio de cultivo, la calibracion se realizó por el metodo del patrón externo. Las concentraciones elegidas para la recta de calibrado fueron, de 0,5 ng/mL a 10 ng/mL para B1 y G1 y de 0,15 ng/mL a 3 ng/mL para B2 y G2. Para evaluar la linealidad se calculó el coeficiente de correlación (r) y el coeficiente de determinación (r2) de cuatro réplicas de rectas obtenidas para cada compuesto, así como la desviación estándar. 5.3.3 Sensibilidad: Capacidad del método analítico para discriminar interferencias en la concentración de analito. Para calcularla, determinamos el LD y LC. 5.3.3.1 Limite de detección (LD): Es la concentracion más baja de analito, que puede ser medida por el equipo. Para calcular este valor, se realizaron diluciones de la solucion patrón, disminuyendo la concentración de analito hasta que el equipo no puede detectarlo. Se partió de una concentración de 0,02 ng/mL para el caso de B1 y G1 y de 0,006 ng/mL para el caso de B2 y G2. Se obtuvo la concentración de analito por interpolación en la recta de calibrado. Se hicieron seis réplicas de este ensayo para cada micotoxina y se calcularon las concentraciones medias, así como las desviaciones estándar. El límite de detección del método se calculó sumando a la concentración más baja analizada, tres veces la desviación estándar (Pizzutti et al., 2014). 5.3.3.2 Limite de Cuantificación (LC) El límite de cuantificación, es la concentración mínima de analito que puede cuantificarse con una certeza estadística razonable. Del mismo modo, el limite de cuantificacion se calculó siguiendo el procedimiento anteriormente descrito y sumando a la concentración minima detectada por el equipo, diez veces la desviación estándar. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 27 5.3.4. Exactitud (Recuperación). La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado y se obtiene determinando la veracidad y la precisión (repetibilidad y reproducibilidad) (Decision de la Comisión 2002/657/CE). Al no disponer de material de referencia certificado que indique un valor de referencia aceptado, se llevó a cabo un estudio de recuperación enriqueciendo seis muestras de caldo de cultivo estéril, a un nivel de 10 ng/mL para B1 y G1 y de 3 ng/mL para B2 y G2. El enriquecimiento de las muestras se realizó antes de la etapa de extracción, para determinar el porcentaje de recuperación global del método. Para hallar este porcentaje de recuperación, se calcularon los resultados obtenidos en las muestras enriquecidas, con las ecuaciones de la recta procedentes de las rectas de calibración para cada aflatoxina. 5.3.5 Precisión Grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en condiciones estipuladas. La precisión suele expresarse como desviación estándar relativa de los resultados de los ensayos. Cuanto mayor es la desviación estándar menor es la precisión (Decision de la Comisión 2002/657/CE). Estas condiciones estipuladas pueden variar, algunos ejemplos son el laboratorio, los reactivos utilizados, el analista, el equipo de HPLC o el día en que se realizararon los ensayos. Estas condiciones pueden modificar la precisión del método. Para determinar este parámetro se analizaron seis muestras independientes de caldo de cultivo estéril, contaminado a un nivel de 10 ng/mL para B1 y G1 y de 3 ng/mL para B2 y G2. La presicion se estudió bajo condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad. 5.3.5.1 Precision de la inyección Además de lo anteriormente descrito, se hizo un ensayo de precision de la inyección. Con este parámetro se pretende conocer las posibles fluctuaciones debidas a componentes del equipo como pueden ser las bombas o los detectores, en un corto periodo de tiempo. Trabajo Fin de Máster. Material y Métodos. 28 Para ello se inyectó un patrón de 10 ng/mL para las aflatoxinas B1 y G1 y de 3 ng/mL para las aflatoxinas B2 y G2 , diez veces consecutivas el mismo día, y se calculó la repetibilidad, mediante la determinación de las desviaciones estándar relativas de las áreas de pico cromatográficas correspondientes a cada aflatoxina. 5.3.5.2. Repetibilidad Es la desviación estándar relativa de los ensayos realizados bajo condiciones de repetibilidad (RSDr%). Condiciones de repetibilidad son aquellas en las que, un mismo operador, obtiene resultados de ensayos independientes con el mismo método e idénticas muestras de análisis, en el mismo laboratorio y con el mismo equipo. La repetibilidad del método se determinó, calculando la desviación estándar relativa de los resultados obtenidos tras analizar tres muestras de caldo de cultivo estéril, contaminado con 10 ng/mL de aflatoxinas B1 y G1 y 3 ng/mL de aflatoxinas B2 y G2. Las muestras fueron extraídas el mismo día, por el mismo analista y analizadas con el mismo equipo HPLC. 5.3.5.3. Reproducibilidad: Se define como la desviación estándar relativa en condiciones de reproducibilidad (RDSR%) obtenida tras analizar varias veces una misma muestra en días distintos, pudiendo variar condiciones tales como, el equipo de medida, el analista y días de análisis. En este caso, hablamos de reproducibilidad intralaboratorio. Cuando las medidas se realizan en laboratorios distintos, son estudios de intercomparación. El estudio de reproducibilidad fue llevado a cabo por el mismo analista, el mismo equipo pero en tres días diferentes. Las muestras analizadas fueron las mismas que las indicadas en el apartado anterior: tres muestras de caldo de cultivo estéril, contaminado a 10 ng/mL de aflatoxinas B1 y G1 y 3 ng/mL de aflatoxinas B2 y G2. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 29 6. Resultados y Discusión. Para poder considerar los resultados obtenidos en el estudio in vitro realizado en este trabajo, es necesario primero conocer los resultados del proceso de optimización y validación del método utilizado para la cuantificación de las aflatoxinas. 6.1. Optimización del método analítico. 6.1.1. Optimización de las condiciones cromatográficas. 6.1.1.1. Tiempos de retención. En los cromatogramas obtenidos (figura 10) pudimos observar los cuatro picos correspondientes a las cuatro aflatoxinas estudiadas. El orden de elución de estos picos fue, G2, G1, B2 y B1. Los tiempos de retención fueron, 9,204; 10,122; 10,789; 11,979 minutos. Al finalizar el proceso de optimización, se comprobaron de nuevo los tiempos de retención de las aflatoxinas. Se inyectaron diez réplicas de un patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. Los resultados se muestran en la tabla 5. DS CV Tr medio G2 0,012 0,135 9,203 G1 0,015 0,157 10,119 B2 0,015 0,149 10,781 B1 0,018 0,158 11,967 Tabla 5. Tiempos de retención: Desviación estándar y Coeficiente de Variación. Figura 10. Patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. Tiempos de retención y áreas. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 30 min 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 LU 40 45 50 55 60 65 FLD1 A, Ex=365, Em=435 (AFLAS\000022 2014-03-19.D) Area: 179.418 6.449 Area: 434.385 12.256 Area: 139.072 15.494 Area: 615.415 15.791 Area: 241.6 20.115 Figura 11. Cromatograma a 365nm de excitación (ex.) 435 nm de emisión (em.), patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. 6.1.1.2. Longitudes de onda. Es bien sabido que las aflatoxinas se detectan con detector de fluorescencia, con unos determinados valores de longitud de onda de excitación y emisión, expresados en nm. Para seleccionar la longitud de onda de emisión adecuada, se compararon las áreas de pico obtenidas a distintas longitudes de onda, eligiendo la que proporcionaba un área de pico mayor para cada aflatoxina analizada. Para la longitud de onda de emisión se eligió 435nm, valor que coincide con el trabajo de (Ariño et al., 2009). Para la longitud de onda de exitación, se fijó en 365 nm, valor más utilizado por lo autores (Gandomi, 2009; Polixeni, 2009; Sindhu, 2011; Cano-Sancho, 2013; Accinelli, 2014). En las figuras 11 y 12, se representan algunos cromatogramas obtenidos con distintas longitudes de onda ensayadas. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 31 min 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 LU 64 65 66 67 68 69 70 71 72 FLD1 A, Ex=360, Em=420 (AFLAS\000019 2014-03-19.D) Area: 10.055 12.401 Area: 77.1097 15.655 Area: 23.6434 16.061 Area: 89.8548 20.419 Figura 12. Cromatograma a 365nm de excitación (ex.) 420 nm de emisión (em.), patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. 6.1.1.3. Composición de la fase móvil y flujo. La primera fase móvil ensayada fue la del método oficial de la AOAC 991.31, compuesta por agua, acetonitrilo y metanol en proporción 30:10:10 (v/v/v). Con una mayor proporción de agua en este caso, se observó que los picos correspondientes a las aflatoxinas G1 y B2 se solapaban. Con la fase móvil utilizada por Ariño et al., (2009), compuesta por agua, acetonitrilo y metanol en proporción 60:15:30 (v/v/v) (Figura 13), ocurría lo mismo pero en menor medida. Se probó con una fase móvil con una proporción de metanol mayor, utilizada en el trabajo de Jager et al., (2013), compuesta por 28,1:10,5:61,4 de agua, acetonitrilo y metanol respectivamente. En este caso, aunque los picos de las aflatoxinas de G1 y G2 no se solapaban, la separación entre los picos todavía no era satisfactoria (Figura 14). Se ensayó experimentalmente una fase movil compuesta por agua, acetonitrilo y metanol en proporcion 40:10:50 v/v/v. Con la que se logró disminuir las interferencias y lograr una correcta separación cromatográfica (Figura 17). Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 32 min 0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 LU 32.5 35 37.5 40 42.5 45 47.5 50 52.5 FLD1 A, Ex=365, Em=435 (AFLAS\000043 2014-03-25.D) Area: 71.1592 12.804 Area: 178.935 16.352 Area: 116.394 16.704 Area: 173.757 21.521 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 LU 30 40 50 60 70 80 90 FLD1 A, Ex=365, Em=435 (AFLAS\000055 2014-03-27.D) Area: 76.697 5.161 Area: 169.642 5.404 Area: 74.4467 5.692 Area: 94.5848 5.987 Figura 13. Cromatograma a 365nm de ex. y 435 nm de em. de patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2 con fase móvil agua/acetonitrilo/metanol (60:15:30). Figura 14. Cromatograma a 365nm de ex. y 435 nm de em. de patrón de 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2 con fase móvil agua/acetonitrilo/metanol (60:15:30). Para optimizar la separación de los picos con la fase móvil elegida, se ensayaron dos velocidades de flujo, 0,5 mL/min y 0,7 mL/min, distintas a la recomendada por la casa comercial ACE® de 1 mL/min. La elegida fue la de 0,7 mL/min, ya que conseguía unos tiempos de retención menores, sin comprometer la resolución cromatográfica. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 33 min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 LU 20 40 60 80 100 120 140 FLD1 A, Ex=365, Em=460 (AFLAS\000115 2014-04-07.D) Area: 1993.91 9.177 Area: 1044.57 10.086 Area: 993.161 10.759 Area: 1672.99 11.952 Figura 15. Maíz fortificado en 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. Mycosep ® AflaZON 224. 6.1.2. Purificación, columnas de adsorción. Debido a la presencia de materiales interferentes en los extractos de las muestras (cultivos in vitro), era preciso una fase de purificación o cleanup para obtener unos extractos limpios que ofrecieran buenas respuestas cromatográficas. Se hizo un ensayo con dos columnas de adsorción, de dos casas comerciales diferentes Mycosep® AflaZON 224 de RomerLab® y Isolute® Myco de Biotage®, la primera indicada para el análisis de aflatoxinas y zearalenona y la segunda para un grupo más amplio de micotoxinas tales como, las nombradas anteriormente más, fumonisinas, patulina, ergotoxinas y ocratoxina A. En los dos casos, las matrices recomendadas por las casas comerciales son granos de cereal, como el maíz, trigo y centeno; y frutos secos como los cacahuetes y las nueces. A diferencia de las columnas de inmunoafinidad, las columnas de extracción en fase sólida, son rentables, fáciles de usar y no tienen requisitos especiales de conservación. Para seleccionar la columna adecuada se eligió una muestra de maíz, matriz alimentaria recomendada por ambas casas comerciales, libre de aflatoxinas y se fortificó a 10 ng/ml para G1 y B1 y 3 ng/mL para B2 y G2, siguiendo el protocolo de extracción de cada casa, se analizó mediante HPLC con las condiciones cromatográficas optimizadas. La columna Mycosep® fue la que presentó una purificación más eficiente (Figura 15). En contra, el cromatograma obtenido al utilizar la columna Isolute® mostró interferencias en los tiempos de retención de las aflatoxinas, que no permitían observar los picos correctamente (Figura 16). Con columna seleccionada, Mycosep®, se realizó un estudio de recuperación explicado en el punto 6.2.4 en el cual se utilizó como matriz, el medio de cultivo empleado para el estudio in vitro, compuesto por extracto de levadura y sacarosa. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 34 min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 LU 30 40 50 60 70 80 90 100 FLD1 A, Ex=365, Em=460 (AFLAS\000114 2014-04-07.D) Area: 110.071 9.185 Area: 39.6306 10.109 Area: 32.9921 10.814 Area: 91.128 11.958 Figura 16. Maíz fortificado en 10 ng/mL para G1 y B1 y de 3 ng/mL para G2 y B2. Isolute® Myco. 6.2 Validación. Una vez optimizadas las condiciones de trabajo, se procedió a validar el método tomando como referencia el Reglamento (CE) Nº 401/2006, por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios. 6.2.1. Especificidad. En primer lugar se muestra un cromatograma patrón de 10ng/ml para G1 y B1 y 3 ng/mL para B2 y G2, a modo de ejemplo para reconocer los tiempos de retención de cada aflatoxina (Figura 17). A continuación, en la figura 18 se puede observar una inyección del blanco de proceso. En el cromatogramas se puede observar que tanto los disolventes de extracción y purificación, como la fase móvil no aportan interferencias al cromatograma en los tiempos de retención de las aflatoxinas estudiadas. Por último, en la figura 19, se puede observar una muestra de medio de cultivo, libre de aflatoxinas, en donde no aparece ninguno de los picos correspondientes a las aflatoxinas, ni interferencias en los tiempos de retención correspondientes las mismas. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 41 Dia 10. Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos [mM] Crecimiento (%) respecto al control Día 14. Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos [mM] Crecimiento (%) respecto al control Día 21. Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos [mM] Crecimiento (%) respecto al control Figura 21. Efecto de las concentraciones de ácidos fenólicos sobre el crecimiento de Aspergillus parasiticus CECT 2682, en medio de cultivo liquido YES. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 42 Como se puede observar en las gráficas anteriores (Figura 21), los resultados sugieren una mayor inhibición del crecimiento conforme aumenta la concentración de ácido fenólico, así como el tiempo transcurrido. En el cuarto día de ensayo se puede observar que, concentraciones bajas de ácidos fenolicos, de hasta 10 mM podrían favorecer el crecimiento del organismo. Efecto que desaparece al séptimo día de ensayo, donde, a igual concentración de ácido fenólico, el crecimiento se ve reducido respecto al control. Este efecto coincide con lo descrito por otros autores, como Ferrochio, et al. (2013), los cuales demostraron, sobre agar a base de maíz, que el ácido ferúlico, a concentraciones inferiores a 10 mM podía favorecer el crecimiento de cepas de Fusarium verticillioides y Fusarium proliferatum. Ninguno de los cuatro ácidos fenolicos, a las concentraciones ensayadas durante 21 días, han podido inhibir por completo el crecimiento del moho. 6.4. Efecto combinado de los ácidos fenólicos y el crecimiento del moho sobre el pH del medio YES. Figura 22. Evolución del pH en 21 días de experimento, a distintas concentraciones de ácidos fenólicos. Evolución del pH a 5 mM 14710 13 16 19 22 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Control Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico Día pH Evolución del pH a 20 mM 1 4 7 10 13 16 19 22 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Control Clorogénico Caféico p-Cumárico Ferúlico Día pH Evolución del pH a 1 mM 1 4 7 10 13 16 19 22 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Control Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico Día pH Evolución del pH a 10 mM 1 4 7 10 13 16 19 22 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Control Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico Día pH Evolución del pH a 20 mM 1 4 7 10 13 16 19 22 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Control Clorogénico Caféico p-Cumárico Ferúlico Día pH Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 43 Como se puede observar en las gráficas anteriores (figura 22), el pH del medio de cultivo en presencia de ácidos fenólicos es superior al pH del control. El pH disminuye a lo largo del tiempo, pero se ve poco influido por la concentración de ácido fenólico. A excepción del ácido clorogénico que disminuye el pH del medio, incluso por debajo del control, a concentraciones de 20 mM. Los compuestos fenólicos como antioxidantes, tiene la capacidad de llevar a cabo reacciones redox en la membrana plasmática de la célula y secuestrar electrones procedentes del proceso de respiración. Un estudio llevado a cabo por Lacombe, (2010) sostiene que la capacidad antimicrobiana de los compuestos fenólicos es independiente del pH, dado que las reacciones redox implican transporte de electrones y no de hidrógeno, H+. Por otro lado, Adams y Moss (1995) plantearon la hipótesis que los ácidos fenólicos, como antioxidantes pueden actuar a nivel de la membrana celular, alterando su permeabilidad, eliminando el componente de pH. Otro estudio llevado a cabo por Kwon, et al., (2007) sugiere que la hidrofobicidad parcial de compuestos bifenoles, como es el caso del ácido clorogénico, les permitiría unirse a la membrana externa de las celulas y provocar cambios en la fluidez de la membrana; de tal manera que, una vez alterada la estructura, los compuestos fenólicos de menor tamaño podrían entrar a la célula, los compuestos antioxidantes podrían interferir indirectamente con el metabolismo secundario del hongo y por lo tanto modular la producción de micotoxinas. 6.5.Efecto de los ácidos fenólicos sobre la biosíntesis de aflatoxinas, producidas por la cepa de Aspergillus parasiticus CECT 2682. La producción de aflatoxinas se determinó mediante HPLC con el método optimizado y validado anteriormente. Los resultados se expresan como producción de aflatoxina por mL de medio de cultivo YES, así como producción de aflatoxina por gramo de micelio seco. Estos valores pueden consultarse en el Anexo 2. Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 44 Día 4 Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólico Total Aflax µg/mL Día 7 Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos Total Aflax µg/mL Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 45 Día 10 Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos Total Aflax µg/mL Día 14 Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos Total Aflax µg/mL Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 46 Día 21 Clorogénico Cafeico p-Cumárico Ferúlico 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Control 1mM 5 mM 10 mM 20 mM Ácidos fenólicos Total Aflax µg/mL Figura 23. Producción de aflatoxinas totales (suma de B1 + B2 + G1 + G2). Observando las graficas, en la figura 23 podemos decir que, de manera general, cuanto mayor es la concentración de ácido fenólico, menor es la producción de aflatoxinas. A concentraciones de 20 mM, la producción de aflatoxinas se ve inhibida, a excepción del ácido ferúlico, que parece ser el menos eficaz. Al parecer, estos compuestos actúan como factores de estrés del moho. Cuando se obstaculiza la obtención de energía debido a una disponibilidad de glucosa más baja; esto puede desencadenar la producción de metabolitos secundarios para compensar y limitar la competencia aparente por el sustrato del medio (Pagnussatt, et al., 2014), sin embargo algunos autores refieren que a concentraciones bajas de ácidos fenólicos, la producción de micotoxinas, como las fumonisinas, se ve favorecida, por ejemplo, a concentraciones de 10mM de ácido ferúlico (Ferrochio, et al., 2013), datos que coinciden con los resultados obtenidos en este trabajo. En las muestras no tratadas, los niveles de aflatoxinas siempre se incrementaron a lo largo del tiempo. Existen estudios a cerca del efecto del curso de tiempo en la producción de aflatoxinas (Molina y Giannuzzia, 2002) con un pico de producción máxima, seguida por un descenso próximo a cero, cinética que coincide con la producción de aflatoxinas en los controles analizados a lo largo de los 21 días de nuestro ensayo. Aunque los mecanismos exactos de degradación o de conjugación aún Trabajo Fin de Máster. Resultados y Discusión. 47 no se han descrito, se supone que la degradación de las aflatoxinas se inicia por enzimas liberadas durante la lisis del micelio. Los pequeños aumentos y disminuciones en la producción de aflatoxinas a lo largo de los 21 días podrían ser el resultado de la descomposición que tienen lugar durante este tiempo (Pitt, 1993). En el caso de otras micotoxinas, un estudio llevado a cabo por Bily (2003) informó que el ácido cafeico, ferúlico, cumárico y 3-hidroxibenzóico puede reducir la producción de tricotecenos tipo B por F. graminearum y que esta inhibición se produjo a concentraciones en las que el crecimiento del moho no se vio afectado; esto sugiere que la inhibición de micotoxinas no es el resultado de un efecto fungitóxico, si no que estos ácidos producen un efecto específico sobre la biosíntesis de las toxinas. De acuerdo con esta hipótesis, Boutigny (2009) sugiere que la inhibición de la síntesis de tricotecenos tipo B por el ácido ferúlico, en el género Fusarium podría estar regulada a nivel transcripcional (Tri genes). Los cambios en los parámetros oxidativos del medio podrían intervenir con el metabolismo secundario del moho y modular los niveles de producción de tricotecenos. En conclusión, el presente trabajo demuestra el posible uso de los ácidos fenólicos para controlar el crecimiento y la producción de aflatoxinas por Aspergillus parasiticus, a 25 ° C. En general, las concentraciones de ácidos fenólicos por encima de 20 mM fueron capaces de reducir el crecimiento del organismo, pero sin llegar a inhibirlo por completo, así como la producción de aflatoxinas en medio líquido. Sin embargo, las concentraciones de ácidos de 1 a 10 mM estimularon la producción de estas micotoxinas. El ácido ferúlico, por ejemplo, es un compuesto fenólico presente de forma natural en los granos de maíz a una concentración de 3 μg/g (15.5 μM) (Adom y Liu, 2002). Esta concentración es insuficiente para controlar el deterioro y la producción de toxinas de estos mohos. Si alguno de estos ácidos fenólicos se va a utilizar durante el almacenamiento de granos como el maíz como una estrategia post-cosecha para reducir el crecimiento y la producción de micotoxinas, la concentración debería aumentarse por incorporación exógena. Trabajo Fin de Máster. Conclusiones. 48 8. Conclusiones. Primera. Se realizó una puesta a punto de un método in vitro para evaluar la biosíntesis de aflatoxinas, basado en la inoculación de una suspensión de esporos en un medio de cultivo líquido a base de sacarosa y extracto de levadura e incubación durante 21 días a 25ºC. La producción de niveles elevados de estas micotoxinas ha permitido ensayar tanto el efecto de los cuatro ácidos fenólicos (clorogénico, p-cumárico, cafeico y ferúlico) sobre la síntesis de aflatoxinas, como evaluar la tasa de crecimiento del moho. Segunda. La metodología analítica optimizada y validada en este trabajo, garantiza la extracción de aflatoxinas B1, B2, G1, y G2 de manera selectiva en las muestras de medio de cultivo YES obtenidas a partir del estudio in vitro. Además, las columnas de adsorción Mycosep® permiten una adecuada separación del analito de otras sustancias interferentes. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con derivatización fotoquímica y detector de fluorescencia permite una detección sensible y selectiva de las cuatro aflatoxinas estudiadas. Tercera. El método validado cumple los criterios de especificidad, linealidad, sensibilidad, exactitud y precisión establecidos por la legislación. Cuarta. Los ácidos fenólicos ensayados en concentraciones de 1 a 20 mM han mostrado un efecto fungistático frente a la cepa de Aspergillus parasiticus CECT 2682, aunque en ninguno de los casos se observó una inhibición completa del crecimiento del moho. Quinta. La producción de aflatoxinas se vio inhibida en su totalidad a concentraciones de 20 mM. Los ácidos fenólicos que presentaron mayor efecto fueron el acido clorogénico y cafeico. En algunos ensayos, concentraciones por debajo de 20 mM, podrían favorecer una mayor producción de aflatoxinas por Aspergillus parasiticus CECT 2682 Sexta. A falta de realizar ensayos de campo, los resultados obtenidos reflejan la dificultad de correlacionar los estudios de inhibición in vitro del crecimiento fúngico con los de biosíntesis de aflatoxinas debido a la complejas relaciones que existen entre los mohos y sus toxinas, las plantas, los agentes biocidas y los factores externos. Sin embargo, arrojan una idea sobre el comportamiento de estos mohos frente a estos compuestos naturales, y todavía es necesario evaluar los efectos in vivo de una gama más amplia de compuestos fenólicos para llegar a conclusiones definitivas acerca de su utilidad como agentes antifúngicos para proteger los sistemas de granos almacenados. Trabajo Fin de Máster. Bibliografía. 49 9. Bibliografía. Abarca, L., Bragulat, R., Cabañes, F., Calvo, A. (1986). Diagnostico de laboratorio en micología clínica. Barcelona.: Facultad de Veterinaria. Universidad Autónoma de Barcelona. Adom K., Liu R.H. (2002). Antioxidant activity of grains. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 6182-6187. AESAN. (2011). Informe del Comité Científico de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición en relación al efecto sobre la población española de la derogación de la normativa nacional sobre límites máximos permitidos para las aflatoxinas en alimentos. Revista del Comité Científico 14, 2742. 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