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Trabajo Fin de Autor/es Director/es Facultad de Veterinaria Máster Prevalencia de infección por Bartonella henselae en saliva de gatos de colonia en Zaragoza Manuel Alamán Valtierra María Carmen Simón Valencia y Amaia Unzueta Galarza 2014 "Prevalencia de infección por Bartonella henselae en saliva de gatos de colonia en Zaragoza" RESUMEN La infección por Bartonella spp. da lugar a una variada y amplia gama de condiciones clínicas que afectan a seres humanos y numerosos animales. Una parte importante de estas infecciones son zoonóticas, como la producida por B. henselae (la más importante por su incidencia), responsable de la Enfermedad del Arañazo del Gato o la Angiomatosis bacilar. Se ha demostrado que algunos animales de compañía como ciertos animales salvajes pueden actuar como reservorios de varias de las especies zoonóticas. Algunos artrópodos como las pulgas juegan un importante papel en la transmisión. El gato parece ser el principal reservorio de B. henselae (entre otras especies de Bartonella). La transmisión más probable ocurre por arañazos y mordedura de gatos infectados, aunque el modo en el que esta ocurre no está bien definido. Tanto la presencia de heces de pulgas contaminando las garras y la mucosa bucal del gato, como la posible presencia de sangre infectada en lesiones de estas zonas, se ha contemplado como origen de la transmisión. Este estudio preliminar pretende conocer la prevalencia de ADN de Bartonella henselae en muestras de mucosa oral de gatos de colonias callejeras y del Centro de Protección Animal de Zaragoza. SUMMARY Infection with Bartonella spp. results in a varied and wide range of clinical conditions affecting humans and many animals. A significant proportion of these infections are zoonotic, as produced by B. Henselae (the most important because of its impact), responsible of Cat Scratch Disease (CSD) or Bacillary angiomatosis. It has been demostrated that some pets and some wild animals can be reservoirs for several zoonotic species. Some arthropods like fleas play an important role in transmission. The cat seems to be the main reservoir of B. henselae (among other species of Bartonella). The most likely transmission occurs by scratches and bites from infected cats, although the way in which this transfer occurs is not well defined. Both the presence of flea feces contaminating the jaws and oral mucosa of the cat, as the possible presence of blood infected lesions of these areas, it has been referred to as the source of transmission. This preliminary study aims to determine the prevalence of Bartonella henselae DNA in oral mucosa of street cat colonies and cats from the shelter of the city of Zaragoza. INTRODUCCIÓN Los primeros datos recogidos sobre infecciones causadas por Bartonella spp. datan de hace más de 1000 años. La infección de B. bacilliformis fue descrita ya en la dinastía Inca (55) y B. quintana ha podido ser aislada en restos humanos de 4000 años de antigüedad en Francia. (25). También se sospecha que Bartonella spp. fue la causa de un importante número de bajas dentro del ejército Napoleónico (37,50) La primera especie descrita fue Bartonella bacilliformis, denominada así en reconocimiento al microbiólogo peruano Alberto Barton. Se trata de una bacteria endémica en SurAmérica, no zoonótica, responsable de una forma de Bartonelosis humana transmitida por tábanos y con dos formas de presentación clínica relacionadas: Una anemia hemolítica muy grave conocida como Fiebre de Oroya o Enfermedad de Carrión (descrita por el estudiante de medicina Daniel Carrion que resultó muerto por dicha enfermedad al auto inoculársela), y la Verruga peruana, una enfermedad sistémica que produce lesiones cutáneas de tipo verrucoso debidas a la proliferación de células endoteliales. (37) La Enfermedad del Arañazo del Gato (CSD) fue descrita en Francia en 1950 , aunque la primera referencia data de 1889 por Perinaud y no fue hasta 1992 cuando se documentó que B. henselae era el agente etiológico responsable de tal enfermedad. Se trata de la especie de Bartonella más conocida y, probablemente, la que con mayor frecuencia actúa como zoonosis. Los gatos son el principal vector y reservorio de dicha bacteria, la cual se transmite entre ellos principalmente a través de la picadura de la pulga felina (Ctenocephalides felis). La Angiomatosis bacilar, forma clínica propia de CSD en individuos inmunodeprimidos, fue descrita en 1990. Entre las especies más conocidas están B. henselae (probablemente la que actúa en mayor número de ocasiones como zoonosis), B. quintana y B. tricoborum, de las que se conoce la secuencia de su genoma y se han desarrollado algoritmos que han mejorado su diagnóstico e incrementado el conocimiento tanto de su biología como de su patogenicidad. (37) Al menos 14 especies de Bartonella y especies Candidatus, son reconocidas como zoonóticas o potencialmente zoonóticas de las cuales seis han sido aisladas en perros o gatos. Es posible que especies de Bartonella, previamente consideradas no zoonóticas, sí lo sean. (4) Muchas de las infecciones por Bartonella spp. se transmiten por medio de pulgas y piojos. Las garrapatas también podrían transmitirlas, ya que se ha demostrado de forma directa, (garrapatas infectadas) e indirecta, (una descripción de posible trasmisión a una persona) (4). Los animales infectados de forma natural por Bartonella spp. suelen padecer una bacteriemia desde intermitente hasta de varios años de duración y, en la mayoría de las ocasiones, asintomática (20). Esta situación de “equilibrio” entre la infección y su hospedador favorecería la transmisión de la infección a otros vectores (54) A pesar de que los gatos son el principal reservorio de B. henselae y B. clarridgeiae, algunas personas infectadas niegan haber tenido contacto con estos animales. Esto hace sospechar que pudiera transmitirse a partir de fuentes medio ambientales, otros vectores artrópodos y otros hospedadores animales, por lo que el término “Enfermedad del Arañazo del Gato” sería algo restrictivo a la hora de expresar la variedad de cuadros clínicos y especies involucradas de Bartonella. El término “Bartonelosis” podría ser más adecuado (16) Las infecciones por Bartonella en la especie humana pueden suponer un riesgo importante para la salud si no son tratadas adecuadamente. La alta mortalidad, presentada principalmente en individuos inmunodepremidos, la variedad de formas clínicas y de especies del microorganismo que pueden estar involucrados en la infección y su potencial para la recidiva obliga a adaptar el tratamiento a cada situación. Hasta la fecha, el método más eficaz para prevenir la enfermedad consiste en establecer pautas de desparasitación adecuadas frente a artrópodos hematófagos como pulgas, piojos o garrapatas (4) I) ETIOLOGÍA El género Bartonella contiene numerosas especies de pequeños bacilos o cocobacilos (11,2 m y 0,5-0,8 m de diámetro) Gram negativos, aerobios o microaerófilos, hemotropos y pleomórficos, pertenecientes al subgrupo α2 de la Clase Proteobacterias. Son transmitidas a través de vectores y aisladas en un amplio rango de animales, tanto domésticos como salvajes. Este tipo de bacterias tienen la capacidad de hacerse intracelulares en eritrocitos y células endoteliales y producir bacteriemia intraeritrocítica persistente en mamíferos específicos, que actúan como hospedadores y reservorio de la infección (21) I-1) Clasificación Clase α-2-Proteobacteria Orden Rhizobiales Familia Bartonellaceae Género Bartonella Hasta la fecha se han podido registrar hasta 30 especies pertenecientes al Género Bartonella (Tabla 1). Además, a este número podrían sumarse alguno de las varios Candidatus (microorganismos que pudieran reunir las características propias del género) aislados tanto en personas como en animales domésticos y salvajes (4). Recientemente se han aislado 2 nuevas Bartonella sp. BAR15 and B1-1C a partir de ardilla roja y rata Americanas no incluidas en la Tabla 1. La implementación de técnicas específicas de detección de anticuerpos en suero frente a Bartonella spp. y, sobre todo, el gran desarrollo que han experimentado nuevas herramientas y métodos basados en la biología molecular como la Polymerase Chain Reaction (PCR), ha supuesto un importante incremento en la identificación de estas bacterias en los últimos años. Ya en la década de los 90, el análisis filogenético y la secuenciación de la fracción 16S del ARN ribosómico permitió situar el género Bartonella próximo a los Géneros Brucella, Agrobacterium y Afipia, y separarlo del Orden de las Rickettsias, así como permitir la unificación de las diferentes especies que conformaban los Géneros Rochalimaea, Grahamella y Bartonella dentro de la familia Bartonellaceae, que únicamente incluía hasta entonces a la B. bacilliformis (8). Se han secuenciado el genoma de 10 Bartonella spp. (Tabla 1) Anexo 1: Adaptación del listado de especies de Bartonella spp. descritas hasta marzo de 2014: epidemiología y datos clínicos. (4) Tabla 1: especies de Bartonellas asignadas a las líneas genéticas tras la secuenciación de su genoma, basada en los genes rpoB, gltA, ribC y groEL. (63) Línea genética Especies de Bartonella 1 B. bacilliformis 2 B. bovis, B. chomelii, B. capreoli, B. schoenbuchensis 3 B. rochalimae, B. clarridgeiae, B. spp. AR 15-3, B. sp. 1-1C 4 B. henselae, B. quintana, B. tribocorum, B. grahamii, B. koehlerae, B. vinsonii subsp. Berkhoffii, B. elizabethae En las especies marcadas en negrita se ha secuenciado su genoma. La agrupación filogenética se ha inferido de la colección de datos genómicos y de la secuencia de los genes rpoB, gltA, ribC y groEL que revelaban las mismas 4 líneas genéticas de Bartonella. Quedan excluidas de la tabla las Bartonella spp. que no han sido secuenciadas.(63) En los años 90 se describieron dos genotipos de B. henselae (tipo I y II) basado en las diferencias del 16S rDNA, y se conocen subgrupos en cada tipo. Hay una gran diversidad de patrones genómicos en todos los aislados de B. henselae. En la especie humana predomina el Genotipo I, que parece representar a los aislados mas patógenos para las personas, mientras que muchos de los gatos analizados estaban infectados por el Genotipo II (12, 43) Se ha descrito la coinfección con ambos genotipos en un mismo gato (34). También hay evidencia de variación genómica en el curso de la infección en los gatos (7), que probablemente aumenta la habilidad de B. henselae para persistir en el hospedador (5). Igualmente, se ha observado la infección de un solo animal por diferentes especies de Bartonella (34). ). El conocimiento de nuevos datos sobre ambos genotipos se está viendo incrementando considerablemente gracias a la aplicación de nuevas técnicas moleculares. I-2) Cultivo, aislamiento e identificación La ventaja del hemocultivo, o cultivo a partir de muestras obtenidas de otros tejidos, es su alta especificidad, que demuestra la existencia de infección activa por Bartonella. Por el contrario, la naturaleza recidivante de la bacteriemia producida por este tipo de agentes (tanto en la especie felina como en otras especies reservorio y en humanos) impide considerar esta técnica como un método de diagnóstico sensible. (33) Al tratarse de una bacteria de crecimiento lento, (las colonias se detectan entre 5 a 45 días según el método), se han probado una amplia variedad de sistemas y métodos de cultivo que serán detallados en el apartado correspondiente al Diagnóstico. La incubación se realiza generalmente a temperaturas variables de 35ºC o 37ºC, en cámara húmeda en atm. del 5 a 10% de CO2. El cultivo en líneas celulares continuas de mamíferos o insectos con diversas metodologías ha contribuido a disminuir el tiempo y aumentar la probabilidad de aislar Bartonella spp. (63). II) EPIDEMIOLOGIA de la infección por Bartonella spp. Se trata de una infección de distribución mundial que no produce brotes epidémicos importantes. La prevalencia de la enfermedad varía en función del área geográfica encontrándose mayores prevalencias en zonas donde las condiciones ambientales favorecen la proliferación de artrópodos que actúan como vectores de la infección. Dichos vectores varían en función de las especies de Bartonella involucradas. Se calcula que B. henselae causa alrededor de 22000 casos diagnosticados de CSD al año, requiriendo hospitalización en torno a un 10% de los enfermos. La mayoría de los casos se concentran al final del otoño e invierno, debido al contacto más estrecho y prolongado que se produce entre los propietarios y sus mascotas. La CSD puede ocurrir en individuos de cualquier edad, si bien la mayoría de los casos se producen en niños y jóvenes. La infección por Bartonella en las diferentes especies animales, tanto domésticas como salvajes, es cada vez más conocida y documentada. Cabe destacar la importancia que tienen los mamíferos, sobre todo las especies domésticas, dentro de la epidemiología de la infección, ya que suponen el principal reservorio de la bacteria y la principal fuente de contagio para el ser humano. La prevalencia de las diferentes especies de Bartonella varía en función del mamífero que actúa como reservorio. II-1) Epidemiología de la infección por Bartonella spp. en Gatos B. henselae, responsable de la llamada Enfermedad del Arañazo del Gato (CSD), presenta una alta prevalencia en la especie felina (más del 93% en algunas colonias) y algo menor en el perro (10-35%) (a) Prevalencia de la Bacteriemia: La bacteriemia por B. henselae es bastante variable entre regiones y tipos de gato usados en los estudios. En los gatos sanos muestran prevalencias desde el 25 al 41% según la región (30) Estudios realizados en Noruega, Francia, Alemania, Reino Unido, Holanda, España e Italia, con gatos tanto callejeros como con propietario, muestran prevalencias de bacteriemia por B. henselae que oscilan entre el 0 % en Noruega y el 61.1 % encontrado en Lombardía (Italia) (14, 32, 59) Namekata et al., en el año 2010 (45), observó bacteriemia en el 25% de gatos de un albergue en el Norte de California, sobre todo en los más parasitados con pulgas, y en gatos procedentes de Michigan, los infestados con pulgas tenían 4 veces más probabilidad de ser bacteriémicos que los gatos no infestados. Tabla 2: relación de prevalencia de Bacteriemia por Bartonella spp. en diferentes localizaciones geográfica y tipos de gatos analizados (Tabla extraída de H.J. Boulouis et al., año 2005, (14)) País (localización) Población felina Bartonella Prevalencia de bacteriemia positivo/total (%) Año Francia (París) Mascotas B. spp. 72/436 (16.5) B. henselae H: 11/72 (15.3) (2001) M: 36/72 (50) H+ M: 2/72+E21 (2.8) Francia (Nantes) Callejeros B.spp. 50/94 (53) B. henselae H: 17/50 (34) (2002) M: 18/50 (36) Alemania (Berlín) Mascotas/callejer os B. henselae 20/193 Mascotas: 1/97 (1) (2001) Callejeros: 19/96 (18.7) H: 1/20 (5) M: 18/20 (90) Holanda Refugios B. henselae 25/113 (22) H: 6/25 (24) (1997) M: 10/25 (40) Reino Unido Mascotas B. henselae 40/351 (11.4) (2001) Noruega Mascotas B.spp. 0/100 (2002) Italia (Lombardía) Callejeros B.spp. 140/769 (18) B. henselae H: 27/131 (20.6) (2004) M: 80/131 (61.1) H + M: 24/131 (18) Italia (norte) Callejeros B. henselae 361/1585 (23) (2004) España (Mallorca) / B. henselae 8/40 (20) España (Noreste) (2006) España (La Rioja) Callejeros B. henselae 21/79 (26.6) Mascotas B. henselae 6/51 (11.8) (2013) Corral B. henselae 4/17 (23.5) B.spp: Bartonella spp. (b) Seroprevalencia: La seroprevalencia detectada en diferentes estudios realizados en Reino Unido, Alemania, Francia, Italia y España, con gatos tanto con dueño como de la calle, varía entre un 9.4% y un 71.4%. (6, 14, 59) Tabla 3: relación de datos de seroprevalencia de Bartonella spp. en diferentes localizaciones geográfica y tipos de gatos analizados. (Tabla extraida de H.-J. Boulouis et al., año 2005 (14)) País (localización) Población felina Bartonella Seroprevalencia Positivo/total (%) Año España (noreste) ¿? B.henselae 120/168 (71.4) (2006) España (Madrid) Mascotas B.henselae 162/680 (23.8) (2012) Francia (París) Mascotas B.spp. 179/436 (41.1) (2001) Alemania Mascotas B.henselae 107/713 (15) (1999) Italia (Lombardía) Callejeros B.henselae 207/540 (38) (2004) Italia (Norte) Callejeros B.henselae 553/1416 (39) (2004) Reino Unido Mascotas B.henselae 28/69 (9.4) (2002) Salvaje B.henselae 33/79 (41.8) B.spp: Bartonella spp.; ¿?: No conocido Climas húmedos y secos presentan seroprevalencias muy bajas (0% en Noruega, 1% en Suecia) mientras que es elevada en países más húmedos y con temperaturas más altas (68% en Filipinas, 71% en Chile). Existen también importantes diferencias en función del estilo de vida del gato (callejero vs mascota) así como con la edad. Es fundamental ser conscientes de las limitaciones de estos estudios a la hora de evaluar los resultados, tanto los que buscan determinar la prevalencia de gatos seropositivos como la de aquellos con bacteriemia. La presencia de bacteriemias recurrentes o bajas cargas bacterianas en sangre podrían explicar porque algunos gatos bacteriémicos pueden ser seronegativos y viceversa, gatos no bacteriémicos ser positivos serológicamente. Por otro lado, las posibles reacciones cruzadas (a pesar de no estar del todo documentadas) o la existencia de individuos coinfectados por diferentes especies (B. henselae, B. clarridgeiae, B. bovis o B. quintana) podrían suponer también importantes limitaciones para las técnicas de diagnóstico por serología. Por ello es importante llegar a establecer una correlación entre ambos datos de prevalencia para T4SS, (no en B. bacilliformis): produce un poro de traslocación en la célula del hospedador que facilitará el paso de moléculas efectoras. Observado en B henselae, B qintana, B birtlesii, B. grahamii, y B. tribocorum (2) Beps: proteínas efectoras traslocadas que alteran funciones y promueven la formación de un “invasoma” que permite la entrada de Bartonella en la célula hospedadora. TrwT4SS 4 (B henselae, B qintana y B. vinsonii subsp. berkhoffii ), para adherencia a eritrocitos y otras células (2). VirB/Vir T4SS, sistema de regulación transcripcional, ejerce el control del proceso de traslocación. Investigado en B. tribocorum y B henselae., Histidin quinasa y BatR/BstS : un doble componente que regula al factor anterior (2) NFkB, o factor regulador Kappa: surgen de las acciones anteriores y provocan liberación de citoquinas proinflamatorias y proangiogénicas e inhibición de la apoptosis de células endoteliales infectadas. Flagelos (líneas genéticas 1 a 3), importante para la penetración de eritrocitos y potencian la unión de la bacteria a la célula hospedadora (2). Adhesinas autotransportadoras triméricas facilitan la unión a las proteínas de la célula hospedadora. La adhesina A de Bartonella (BadA) proteína de superficie de B. henselae, le confiere propiedades de autoaglutinatión que produce adhesión a la célula hospedadora y la matriz extracelular; inhibe la apoptosis de C. endoteliales, e induce angiogénesis. Vomps : proteínas de membrana expresadas de forma variable, de B quintana, Promueven la adhesióin (via hyaluronato y vitronectina en la matriz extracelular) y facilita la angiogénesis. LPS, lipopolisacáridos (de Gram negativas): se hallan en B. bacilliformis, B. henselae, and B. quintana no activan la respuesta inmune humoral. Con propiedades antiinflamatorias en ciertas circunstancias y pro-inflamatorias en otras condiciones. En B. quintana afectan a la RI, permaneciendo indetectable al receptor Toll-like 4, y cuando son activados por los LPS de otras bacterias Gram-negativas provocan fuerte reacción inflamatoria. IV) FORMAS CLÍNICAS: IV-1) En la Especie Humana  En individuos inmunocompentes, el cuadro típico de CSD consiste en la formación de una pápula o granuloma, que se desarrolla en la zona del arañazo o mordisco después de 3-10 días de producirse la agresión y que puede persistir durante 2-4 semanas, y una linfadenitis regional gradual en la zona de drenaje linfático. B. henselae se detecta en la lesión inicial y punto de entrada de la infección, así como en los ganglios linfáticos afectados, (mediante inmunohistoquímica sobre biopsias). Suele tratarse de un cuadro autolimitante que tiende a remitir sin tratamiento, si bien la linfadenitis puede persistir desde varias semanas hasta 12-24 meses (4). Entre un 10 y un 15% de los individuos pueden presentar abscesos ganglionares (48)  La CSD en personas inmunodeprimidas (pacientes con VIH, aquellos que han sufrido un trasplante de órganos…) es más grave. Se produce la diseminación de la infección, lo que genera un cuadro sistémico: fiebre de más de 2 semanas de evolución, mialgia, artralgia/ artropatía, malestar general, fatiga, adelgazamiento, esplenomegalia y el Síndrome oculoglandular de Perinaud (este en un 5 % de los casos de CSD) con conjuntivitis unilateral, área de reacción local granulomatosa y linfadenitis submandibular o preauricular. También se ha descrito neurorretinis, neuritis óptica y desprendimiento de retina. En pacientes pediátricos, se ha descrito una forma de encefalopatía que suele resolverse sin secuelas (4).  La Enfermedad de Carrión es una forma de presentación clínica producida por B. bacilliformis caracterizada por una anemia hemolítica severa (puede producir tasas de mortalidad de hasta el 85% en ausencia de tratamiento). Dicha hemólisis puede venir acompañada de infecciones concurrentes en un tercio de las ocasiones. (52).  La colonización, por parte de B. quintana, de los eritrocitos puede provocar la llamada Enfermedad de las trincheras. Se trata de una patología que puede provocar cuadros desde asintomáticos hasta graves, caracterizados por fiebre aguda acompañada de dolor de cabeza, dolor de la espinilla o mareos. La duración del cuadro oscila entre los 1-3 días y las 2-3 semanas (51), habiéndose descrito recidivas al cabo de unos años o incluso bacteriemias indefinidas con o sin síntomas.  La denominada Angiomatosis bacilar (AB), producida por B. henselae, B. bacilliformis o B. quintana, (Candidatus Bartonella ancashi ha sido asociada a lesiones angioproliferativas en un paciente en Perú. Ocurre en personas inmunodeprimidas y se caracteriza por una intensa angiogénesis vascular, debida a la proliferación de células endoteliales y surge como un brote a partir de un vaso sanguíneo, que provoca la aparición de tumoraciones de diversa índole. El crecimiento de estos tumores depende de la presencia constante de la bacteria en dichas lesiones. La angiogénesis por Bartonella se manifiesta típicamente en lesiones dérmicas:  Verruga Peruana (B. bacilliformis y Candidatus Bartonella ancashi): El desarrollo de esta patología, caracterizada por la formación de tumoraciones a nivel cutáneo, no guarda una relación directa con el estado inmune del paciente, pero la inmunodepresión parcial que se desarrolla al final de la Fiebre de Oroya podría ser el origen del desarrollo de la fase de verruga peruana de la infección (18)  Angiomatosis bacilar (B. quintana y B. henselae),  Peliosis hepática (primariamente asociada a B. henselae), caracterizada por la proliferación vascular de los capilares sinusoides hepáticos que crean espacios rellenos de sangre. Puede afectar también afecta al bazo, G. linfáticos y médula ósea (52). Se asocia más frecuente a personas inmunodeprimidas infectadas por B. henselae y B. quintana. Histológicamente se pueden apreciar numerosas células endoteliales, bacterias y un infiltrado de monocitosmacrófagos y neutrófilos. La bacteria se encuentra en forma de agregados, rodeando la lesión y en el interior de las células endoteliales.  Se han podido detectar casos de Endocarditis infecciosa en individuos con patología valvular degenerativa previa (particularmente fibrosis, calcificación e inflamación crónica,) y bacteríemicos por B. henselae o B. quintana preferentemente (20), aunque se han informado de casos esporádicos producidos por B, kholerae, B. viknsonii subsp berkhoffii. B. vinsonii subsp.arupensis, B. elizabethae y B. alsatica o Candidatus como B. mayotimonensis (descrita en un caso en EEUU) . Se observa fiebre (en un 90% de los casos). IV-2) En el gato Los gatos infectados de forma natural con Bartonella spp. no suelen mostrar signos clínicos, si bien la aparición y gravedad de los mismos, podría variar con la especie de Bartonella (16). Si los signos clínicos son leves, puede que no sean detectados por sus propietarios. Algunos gatos desarrollan fiebre tras sufrir procedimientos quirúrgicos (16). La uveítis puede ser otra manifestación natural. Bartonella henselae Genotipo I se ha asociado con endocarditis vegetativa de la válvula aórtica (con hemocultivo negativo), en 2 gatos infectados de forma natural (20). Se desconoce si las Bartonella spp. están presentes en ganglios linfáticos de algunos gatos con linfadenomegalia persistente o en algunos casos de Peliosis hepatis. (21) Debido a la alta prevalencia de exposición a Bartonella spp. en la población de gatos domésticos, se necesitan estudios epidemiológicos amplios cuidadosamente desarrollados para determinar si una condición clínica en particular está verdaderamente asociada a B. henselae en gatos y no a otras etiologías. En estudios realizados simulando/o en condiciones naturales:  Se ha descrito el desarrollo de enfermedad cardiaca en gatos infestados por pulgas infectadas. (21).  Se ha sugerido que Bartonella spp. podría potenciar los efectos de enfermedades crónicas debido a la larga duración de la bacteriemia. Así, en un estudio realizado en Japón se observó que los gatos seropositivos tanto a B. henselae como a FIV tenían más probabilidad de padecer gingivitis o linfoadenomegalia que los gatos seropositivos a cada uno de ellos por separado (60). En un estudio suizo se estimó que podría existir una posible asociación entre la seropositividad y la estomatitis o alteraciones urinarias inespecíficas (11).  Algunos pequeños estudios epidemiológicos han evaluado la asociación entre infección por Bartonella y signos neurológicos, estomatitis, uveítis y fiebre. Hasta la fecha no se ha podido demostrar una asociación estadística entre la exposición a Bartonella spp. y las condiciones clínicas mencionadas en el trascurso de la infección natural (40,49). En la infección experimental:  Los gatos infectados por B. henselae suelen mostrar signos clínicos leves. Tras la inoculación ID, se suelen desarrollar áreas de induración o abscesos en el lugar de inoculación en un periodo de entre 2 días y 3-4 semanas. (39).  Durante las primeras 6 semanas tras la inoculación se ha observado el desarrollo de linfadenopatía periférica generalizada, y cortos periodos de fiebre después de 48-96 horas, pudiendo volver a aparecer a las 2 semanas de contraer la infección. Se detectaron casos de animales que presentaban signos neurológicos (nistagmo, temblores corporales generalizados, leves contracturas locales, respuestas disminuidas o exageradas a estímulos externos, cambios de comportamiento) y dolor muscular epaxial (39). También se han descrito problemas reproductivos (33).  Los gatos infectados con B .khoehlerae o B. rochalimae no han mostrado signos (64) V) DIAGNÓSTICO El diagnóstico de Bartonella spp. en la especie felina, y más concretamente de B. henselae, es un reto para los veterinarios. Las altas prevalencias de bacteriemia dadas en gatos hace muy difícil establecer una asociación causaefecto entre la infección y la presencia de enfermedad. Como se ha comentado anteriormente, esta bacteriemia suele cursar de forma asintomática, por lo que será necesario testar, además de a aquellos gatos sospechosos, a los animales sanos, especialmente a esas mascotas que conviven con personas de riesgo para padecer la enfermedad. V-1) Técnicas de diagnóstico a) Cultivo microbiológico Uno de los grandes inconvenientes del aislamiento e identificación de Bartonella spp. en cultivo es la baja sensibilidad de la prueba. Si bien el hemocultivo o un cultivo de otros tejidos positivo es siempre el resultado más fiable para concluir la presencia de infección activa, la naturaleza recidivante de la infección con Bartonella spp. puede complicar el aislamiento (33). Es fundamental llevar a cabo de la forma más estéril posible la obtención y manipulación de las muestras. La liberación de la bacteria del interior de los eritrocitos para su posterior cultivo se puede llevar a cabo a través de tubos de centrifugación-lisis o mediante la congelación (-80ºC) y descongelación de la muestra de sangre entera en EDTA (se han obtenido mejores resultados) (1, 63) En la Tabla 2 se resumen los principales medios de cultivo desarrollados para mejorar el aislamiento y el tiempo de cultivo de Bartonella spp. Tabla 2: (63) Suplementados con 5 a 10% de sangre de cordero (o conejo y caballo): Agar Infusión de cerebro–corazón Agar Brucella Columbia Agar chocolate Agar Schaedler Agar tripticasa-soja Suplementados con Suero fetal bovino al 10%: Medio de Crecimiento para α-proteobacteria (BAPGM) Medio de cultivo para Drosophila de Schneider (16) Medio base preparado para el crecimiento de células de insecto (DS2) y suplementados con compuestos como NAD, NADP, ATP, Piruvato sódico, aminoácidos y extracto de levadura. Medios de cultivo basados en líneas celulares procedentes de mamíferos (Células Vero con medios como HEPES, M199 en el medio de Scheneider, o sin M199), Nota: también se realizan combinaciones entre estos métodos Los últimos métodos de cultivo desarrollados han conseguido buenos resultados dando una media de 5 días para aislar B. henselae, 7 días para B. quintana y 10 días B. vinsonii subsp. Berkhoffii (63). b) Test serológicos El gran inconveniente de las técnicas basadas en la detección de anticuerpos frente a Bartonella spp. es su incapacidad para determinar la presencia de una infección activa. La elevada persistencia en sangre de IgG en gatos infectados (no se sabe realmente cuánto tiempo puede llegar a detectarse), limita mucho la eficacia de estas técnicas. Otro inconveniente es la elevada variabilidad antigénica de las diferentes especies o cepas de Bartonella spp., ya que dificulta la detección de anticuerpos específicos al antígeno concreto que incluye el test y las posibles reacciones cruzadas con anticuerpos de otras especies bacterianas como Coxiella burnetti virus Epstein-Barr, citomegalovirus, Toxoplasma gondii, y Chalmydophila pneumoniae también pueden dificultarlo, (61) El valor predictivo positivo para la bacteriemia (PPV) de la IFI o ELISA (IgG) en gatos es solo de un 39 a 46%. El valor predictivo negativo para la bacteriemia o la presencia de ADN en la sangre es del 87 a 97%. No existe ningún punto de corte de los test serológicos que permita determinar si un gato está infectado en el momento del muestreo (64). El diagnóstico serológico de CSD en el hombre presenta una importante variabilidad en cuanto a la especificidad y sensibilidad de la prueba utilizada. En función de la técnica empleada, los controles usados y el paciente seleccionado la sensibilidad puede variar desde un 14 a un 100%, mientras que la especificidad oscila entre el 34 al 100%. Se ha descrito que entre la población sana la seroprevalencia de IgG es del 66%. (63). Los test comerciales para IgG e IgM, con respecto a los test de laboratorio, presentan peor sensibilidad (82 frente 93%) y especificidad (28 frente a 67%), (61) La utilización de test Western Blot (WB), está recomendada en el serodiagnóstico de infección por B. henselae en gatos, si bien su fiabilidad tiene que ser todavía más investigada ya que, en la especie humana, se ha observado una importante variabilidad de resultados del test. (33, 39). c) Detección de ADN. La PCR permite la detección de ADN del microorganismo mediante amplificación in vitro de un fragmento específico de este. Para ello, es necesario conocer al menos, parte de la secuencia de nucleótidos que queremos amplificar, por lo que es fundamental la elaboración de primers o cebadores específicos (secuencias de nucleótidos, con un grupo hidroxilo, complementarios a la hebra molde y que actuarán como punto de inicio para la replicación de dicha hebra. Son necesarios dos primers: uno en el extremo 3´ y otro para el 5´. Existe una amplia gama de cebadores útiles para detectar ADN de Bartonella spp., algunos de ellos más específicos que nos permitirán diferenciar entre especies. El ADN de Bartonella spp. ha podido ser amplificado en sangre felina (en EDTA), otros fluidos y en diferentes tejidos (35, 40, 42). Ensayos de PCR centrados en la región intergénica 16S-23S rRNA han permitido determinar la especie de Bartonella spp. en gatos infectados (11, 35, 42) La realización de técnicas de PCR debe ser realizada por laboratorios especializados, requiere estrictos controles de calidad para evitar la aparición tanto de falsos positivos como de falsos negativos, puede ser cara de desarrollar y, actualmente, no está estandarizada entre los laboratorios. La PCR en tiempo real (qPCR) aumenta la sensibilidad y tiene una menor probabilidad de contaminación. VI) TRATAMIENTO VI-1) Tratamiento en gatos El tratamiento de Bartonella spp. en la especie felina y canina continua siendo un tema controvertido ya que, hasta la fecha, no se ha podido demostrar la eficacia de los antibióticos testados en ambas especies para el control de la infección a largo plazo. Se ha observado que tanto los individuos tratados como los no tratados eran negativos a bacteriemia tras el mismo periodo de tiempo. En dicho estudio los antibióticos testados incluían Eritromicina (11-22 mg/kg/oral cada 8 horas), Amoxicilina (1122 mg/kg cada 8 h) y tetraciclina hidrocloruro (13,75 mg/kg cada 6 horas). La Doxiciclina (4–12 mg/kg, PO, cada 12 h) también ha sido testada como tratamiento de la Bartonelosis, si bien no ha demostrado una gran eficacia en cuanto a su capacidad para disminuir el tiempo de duración de la bacteriemia. (33) En los últimos años, se ha recomendado la utilización de Azythromycina (a dosis variables) en el tratamiento de perros y gatos infectados a pesar de no existir estudios de eficacia controlados durante largos periodos de tiempo. Se trata de un macrólido con una buena capacidad de penetración intracelular y un amplio espectro antimicrobiano, a lo que habría que añadirle lo que parece ser una importante actividad inmunomoduladora y antiinflamatoria (46). Estas propiedades impiden determinar con exactitud los efectos beneficiosos informados tras el tratamiento con este antibiótico en la especie felina, ya que se desconoce si estos estarían relacionados con su acción directa frente a Bartonella, son el resultado de su acción sobre otras bacterias, son debidas al resto de las propiedades mencionadas o es debido a una combinación de todas ellas. Por todo ello será conveniente aplicar únicamente el tratamiento antibiótico en aquellos pacientes positivos a la infección y que, además, muestren signos clínicos, a fin de evitar la aparición de resistencias. VI-2) Tratamientos probados y recomendados en la Especie humana, según el cuadro clínico observado El tratamiento de Bartonella spp. continúa siendo un auténtico reto para la medicina humana debido a la elevada persistencia de la infección. La existencia de una fase intraeritrocítica proporciona al microorganismo un lugar donde protegerse de la respuesta inmune, favoreciendo el desarrollo de recaídas. Además, la diversidad de formas clínicas descritas, que depende de la especie de Bartonella spp. involucrada entre otros factores, junto a la escasez de ensayos clínicos realizados, dificulta el establecimiento de protocolos antibióticos eficaces frente a la Bartonelosis. En consecuencia, el tratamiento de las infecciones por Bartonella debería adaptarse a la especie de Bartonella involucrada y a la forma clínica presentada. Los datos clínicos relacionados con el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria se basan en estudios realizados con un número limitado de pacientes. En la Tabla 3 se exponen algunos de los tratamientos descritos en base a la Patogenicidad de Bartonella spp. TABLA 3: tratamientos descritos en base al cuadro clínico producido por Bartonella spp. (extraída de la revisión de Angelakis E. y col., 2014 (4)) Patogenicidad Agente de Bartonella Manifestaciones clínicas Tratamiento Duración Manifestaciones locales B. henselae, B. quintana, B. alsatica, B. clarridgeiae Linfadenitis No tratamiento CSD atípico Neurorretinitis Doxicilina (200mg/día) + Rifampicina (600 mg/ día) 4-6 sem. Parasitismo intraeritrocítico Endocarditis Lesiones angioproliferativas B. bacilliformis B. quintana B.henselae, B. rochalimae, B. vinsonii subsp. arupensis, B. vinsonii, B. melophagi, B. quintana, B. henselae y otras Bartonella spp. B. bacilliformis, B. ancashi B. quintana, B. henselae Fiebre de Oroya Fiebre de las trincheras Bacteriemia Verruga peruana Angiomatosis bacilar, peliosis bacilar Hepatoesplécnica En gestante Complicado No complicado Recaídas Rifampicina 20mg/kg/día sola o con gentamicina (3mg/kg/día) Chloranfenicol (50 mg/kg/día durante 3 días y después 25 mg/kg/día hasta completar los 24 días) Chloranfenicol (50100mg/kg/día) y penicilina G(50000-100000 UI/Kg/día) Gentamicina (3mg/kg/día durante 2 sem.) y Doxiciclina (200mg/día durante 4 sem) Gentamicina (3mg/kg/día durante 2 sem) y doxiclina (200mg(día durante 4 sem) Gentamicina (3mg/kg/día durante dos sem.) y Doxiciclina (200mg/día durante 6 sem.) Rifampicina (10mg/kg/día) (Dosis máx. en niños: 600mg/día) Streptomicina (1520mg/kg/día) Eritromicina (2gr./día) o doxiclina (200mg/día) Doxiciclina (20mg/día) + Rifampicina (600mg/día) Eritromicina (2g /día) o Doxiciclina (200mg/día) 4-6 sem. 2 sem. 2 sem. 6 sem. 6 sem. 6 sem. 2-3 sem. 2-3 sem. 3 meses 3 meses 2-6 meses Con objeto de valorar la calidad del ADN extraído, se sometió a todas las muestras a un control mediante el sistema BioDrop LITE, (LABTECH) que permitió cuantificar la concentración de ADN y su grado de pureza mediante la determinación del ratio de absorbancia a 260 nm y 280nm. 3Análisis Estadístico Los datos intrínsecos y extrínsecos y patológicos recogidos en cada gato, han sido introducidos en la base de datos Excel (Microsoft office). Estos datos han sido tratado estadísticamente con el programa Epi-info StatCalc, vers, 3.5.3 del 2011, de uso libre y producido por el Center for de Diseases Control and Prevention, Atlanta GA, USA). Se ha calculado las frecuencias de prevalencia en relación a los datos recogidos. La posible asociación entre estas prevalencias y los factores identificados se han analizado el test de contingencia chi-cuadrado o el test exacto de Fisher. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1) Sobre la técnica de detección de ADN empleada La técnica PCR ha sido utilizada en ensayos recientes, para detectar la presencia de ADN de B. henselae en muestras orales felinas, (24, 38, 41, 45, 47, 49). En este estudio se ha utilizado la técnica de PCR a tiempo real para la detección y cuantificación del genoma de dicha bacteria mediante el uso del fluoróforo SYBR Green I. Para ello, se han utilizado una pareja de cebadores que amplifica la región intergénica 16S-23S rRNA de B. henselae. La selección de este gen pone de manifiesto que se trata de una secuencia genómica, específica y de elección por muchos miembros de la comunidad científica (9, 35, 44). Un método de detección similar al que se ha llevado cabo en este trabajo se encuentra implementado y patentado en el Instituto de Salud Carlos III de Madrid. Este análisis se basa también en la región intergénica 16S-23S rRNA de B. henselae (31) 2) Sobre el significado de la detección de ADN en muestras orales Es reconocido por diferentes autores (27, 41, 45), que la detección de ADN de Bartonella spp. en muestras orales no es equiparable a la detección de la bacteria viva. La presencia del ADN de Bartonella spp. en la cavidad oral podría tener su origen en el comportamiento del gato, que normalmente lame su piel de forma persistente ya sea por sentir dolor, picor, escozor, o al acicalarse diariamente. En este proceso, el gato puede ingerir las heces de la pulga C. felis que podrían contener Bartonella, ya que se ha encontrado niveles altos de presencia de este microorganismo en ellas (49). Shaw et al 2004 detectan un 22,8% de ADN de B. henselae y 19,6% de B. clarridgeiae en pulgas, mientras Lappin y Hawley, en un estudio realizado en 2009 (41), con gatos salvajes en Florida, Alabama y Colorado (EEUU), encontraron el ADN de B. henselae en los 10 grupos de pulgas que obtuvieron a partir de los gatos del estudio. Además Bartonella sobrevive 3 días en las heces, por lo que daría tiempo a que la bacteria fuera ingerida y depositada en la cavidad oral en los lamidos (30). Por otro lado, es importante tener en consideración que se han encontrado eritrocitos infectados en la boca de gatos con o sin lesiones bucales (41), y estos también podrían ser el origen del ADN detectado. Tabla 5: Carga de partículas por cada mil células eucariotas orales en relación con la presencia de ectoparásitos externos, en los gatos ADN positivos del estudio. Ref. Ectoparásitos Ct (media) Actina (media) Partículas de B. henselae / 1000 células Calificación carga* 22/14 Pulgas 36,5 26,9 2,67 Baja 16/14 - 35,2 27,25 8,32 Baja 5/14 Pulgas 33,6 25,79 8,79 Baja 8/14 Heces pulgas 36,6 28,82 9,03 Baja 17/14 Pulgas 35,2 27,42 9,16 Baja 13/14 Ácaros en orejas, pulgas 37,5 30,02 10,97 Baja 36/14 Pulgas 36,9 29,53 12,26 Baja 18/14 Pulgas, garrapatas 35,2 27,94 12,87 Baja 33/14 Pulgas 36,7 30,14 21,05 Baja 19/14 Pulgas 35,6 29,78 36,40 Baja 46/14 - 36,9 31,74 51,51 Baja 12/14 - 35 31,69 196,14 Baja 48/14 Pulgas 35,7 34,54 907,52 Alta (*) La calificación de la carga se ha realizado de forma arbitraria ya que no hemos encontrados datos sobre la misma en la bibliografía. Se ha considerado los valores inferior y superior encontrados y la diferencia se ha dividido por 2, esto da un punto medio de 453,93 partículas por cada mil células, de modo que las cargas inferiores los hemos considerado “bajas” y la superior, “alta”. La carga de partículas de B. henselae calculada está comprendida entre 8,79 y 196,14 por cada 1000 células eucarióticas en 12 muestras orales y en una muestra se han detectado 907,52 por cada 1000 células. En consecuencia, la mayoría de los gatos ADN positivos (92,31%) presentaban una carga baja de partículas, y un gato (7,69%) presentaba una carga alta de partículas (Tabla 5) Hasta la fecha y por lo revisado en la bibliografía, no se ha establecido una carga mínima de B. henselae en cavidad oral, que pueda ser considerada como la mínima dosis infectante para la especie humana, máxime si se considera que la capacidad de inducir un proceso patógeno en las personas agredidas está muy determinada por el estado inmune del receptor de la agresión (4, 5, 6). En 9 de los 12 gatos con carga baja (75,00%), se detectaron pulgas y/o heces de pulgas en su piel, mientras que en 3 de ellos no se observaron. El gato con mayor carga microbiana en saliva era portador de pulgas. (Tabla 5). Las posibles fuentes de este ADN en la cavidad oral de los gatos son, principalmente el depósito de pulgas y heces de pulgas tras el lamido (que es lo que se considera más probable) (24, 38, 41, 47, 49,), y la presencia de eritrocitos infectados en caso de ser gato bacteriémico. En una mayoría de los gatos había pulgas y/o heces, por lo que el origen podría ser ese, pero en 3 gatos no se detectaron estos parásitos ni sus heces. Los tres gatos en los que no había pulgas y/o sus heces, se podría sospechar que se trata de gatos bacteriémicos de B. henselae, y también podía sugerir que los eritrocitos infectados se debieran a la presencia de lesiones orales, sin embargo solo uno de los gatos (nº 5/14) mostraba gingivoestomatitis. Diferentes autores también han fallado en encontrar la correlación entre bacteriemia y lesiones orales, o la presencia de ADN en muestras orales y lesiones orales, pero se han encontrado hematíes infectados en gatos con boca sana, por lo que no se puede descartar la posibilidad de que los gatos sin pulgas y heces sean bacteriémicos (27, 41, 45). En consecuencia, podemos decir que nuestros resultados están dentro de los hallazgos contradictorios que ocurren en esta infección felina. Sea cual sea el auténtico origen del ADN de B. henselae detectado, significa que los gatos positivos son un riesgo potencial de transmisión para las personas que se relacionan con ellos. En este caso, son gatos que se reciben periódicamente en el Hospital Veterinario de la Universidad de Zaragoza, debido al acuerdo establecido con el Ayuntamiento para esterilizar y cuidar las colonias de gatos callejeros, y los que llegan al Centro de Protección Animal de Peñaflor. Estos datos deberían ser extrapolados también a los gatos domésticos, principalmente los de origen rural o con acceso al exterior en cuanto a las medidas de control y prevención a tomar. 3) Sobre la frecuencia global de ADN de B. henselae en muestras orales de la población en estudio En el total de los 47 gatos que integran el estudio, se ha detectado ADN de B henselae spp. en 13 muestras orales, lo que representa un 27,66%. Las muestras orales han sido analizadas mediante técnica PCR habitualmente, dada la dificultad de conseguir el aislamiento a partir de ellas, en parte debido a la escasa dosis de Bartonella spp. esperable en esas localizaciones y la escasa sensibilidad de los diferentes métodos de cultivo para conseguirlo (24, 38, 41, 45, 47, 49) En términos generales, se han hallado valores de ADN en muestras orales que oscilan desde un 4,8% (24), hasta un 44,1% en gatos salvajes o 43,5% en saliva de gatos de compañía en Corea (posteriormente identificada como B. henselae) (38). Un estudio realizado con gatos salvajes de Alabama, Florida y Colorado en los EEUU de América, indicaba que no se encontró ADN en ninguna de las muestras (sangre, piel, gingivales y almohadillas plantares) en Colorado (n=32), mientras que detectaron una media del 17,6% en muestras orales en los gatos de Alabama y Florida (n=51). (98). En gatos de albergue, del Norte de California, se detectó una media del 38% (45); en Italia, hasta un 60% de gatos tenían ADN en saliva (47, 49) encontraba una media de 11,1%. Observando estos datos, se puede decir que nuestros resultados arrojan un valor medio de prevalencia de ADN de B. henselae en muestras orales de la población del estudio y que las variaciones en la prevalencia con respecto a los resultados de otros autores pueden deberse al origen geográfico ya que las temperaturas cálidas y la humedad alta favorecen una mayor o menor presencia de C. felis en la población felina, o al tipo de vida de los gatos, e incluso las técnicas utilizadas en su detección, tal como indican otros autores (24, 38, 41, 47, 49) 4) sobre la posible asociación entre los datos de los gatos del estudio y la prevalencia de ADN en muestras orales Al evaluar los resultados del conjunto de los datos (tabla 5), se analizó la posible asociación entre los datos recogidos de los gatos del estudio y la presencia de ADN en muestras orales. En todos los análisis, alguna de las celdas de la tabla de contingencia contenía menos de 5 animales, de modo que se ha usado el test exacto de Fisher para evaluar la asociación. En ninguno de los análisis se observó un valor de “p”, inferior a 0,05, de lo que se deduce la ausencia de asociación estadísticamente significativa, e indicaría que ninguno de los factores analizados influyó en la presencia de ADN de B. henselae en las muestras orales de la población estudiada. Tabla 6: Porcentaje de gatos ADN positivos y negativos a B. henselae en muestras bucales respecto al total de animales del estudio (n=47) Factores Grupos ADN Positivo ADN Negativo Valor P (Fisher exact p) Grupo edad Joven 2 (4,25%) 7 (14,89%) 0,5196 (F) Adulto 11 (23,40%) 27 (57,45%) Sexo del gato Hembra 9 (19,15%) 23 (48,94%) 0,6037 (F) Macho 4 (8,51%) 11 (23,40%) Mes extracción Junio 9 (19,15%) 20 (42,56%) 0,2962 (F) (*) Julio 2 (4,25%) 10 (21,28%) Origen Colonia 11 (23,40%) 30 (63,83%) 0,5379 (F) Protectora 2 (4,25%) 4 (8,51%) Pulgas/heces de pulga SI 9 (19,15%) 25 (53,19%) 0,5175 (F) NO 4 (8,51%) 9 (19,15%) Signos clínicos SI 2 (4,25%) 12 (25,53%) 0,1646 (F) NO 11 (23,40%) 22 (46,81%) Lesion boca Sana 12 (25,53%) 27 (57,45%) 0,2801 (F) Lesion 1 (2,13%) 7 (14,89%) (*): en el mes de Mayo solo se recogieron muestras de 6 gatos, por lo que el análisis estadístico se realizó con Junio y Julio que reunían a la mayoría de los gatos muestreados (n=41). Tabla 7: Porcentaje de ADN positivo y negativo a B. henselae en muestras orales en relación al número de gatos evaluado en cada factor Factores Grupos ADN Positivo ADN Negativo Grupo edad Joven (n=9) 2 (22,22%) 7 (77,78%) Adulto (n=38) 11 (28,95%) 27 (71,05%) Sexo del gato Hembra (n=32) 9 (28,13%) 23 (71,87%) Macho (n=15) 4 (26,67%) 11 (73,33%) Mes extracción Mayo (n=6) 2 (33,33%) 4 (66.67%) Junio (n=29) 9 (31,03%) 20 (68,97%) Julio (n=12) 2 (16,67%) 10 (83,33%) Origen Colonia (n=41) 11 (26,83%) 30 (73,17,%) Protectora (n=6) 2 (33,33%) 4 (66,67%) Pulgas/heces de pulga SI (n=34) 9 (26,47%) 25 (73,53%) NO (n=13) 4 (30,77%) 9 (69,23%) Signos clínicos SI (n=14) 2 (14,29%) 12 (85,71%) NO (n=33) 11 (33,33%) 22 (66,67%) Lesion boca Sana (n=39) 12 (30,77%) 27 (69,23%) Lesion (n=8) 1 (12,50%) 7 (87,50%) Aunque ninguna de las asociaciones analizadas ha sido estadísticamente significativa, comentamos los datos de prevalencia observados en cada uno de los factores analizados, (tabla 7):  Los gatos adultos presentaban un prevalencia de casi un 29 %, siendo 6 puntos más alto que en jóvenes.  La prevalencia de ADN positivos apenas es diferente entre machos y hembras siendo entre 27-28%.  En el mes de Julio se han observado casi la mitad de gatos positivos que en Mayo y Junio que están alrededor del 33%.  Los gatos de la Protectora de Peñaflor tenían una prevalencia de positivos del 33%, siendo superior en casi 7 puntos a la de los gatos de colonias callejeras.  Los gatos ADN positivos parasitados por pulgas y/o presentara heces de pulgas en su piel, en el momento del muestreo, presentan una frecuencia 4 puntos inferior que los que no tenían pulgas o heces de pulga, que es próximo al 31%.  Los gatos con signos clínicos tenían una prevalencia de ADN de B. henselae que equivalía a menos de la mitad de la observada en los gatos sin signos clínicos en los que se ha obtenido un valor algo superior al 33%  Finalmente, la diferencia entre los gatos con boca sana, respecto a los que presentaban lesiones bucales, ha sido la más marcada dentro de los factores estudiados, de modo que los gatos con boca sana tenían alrededor de 2,5 veces más prevalencia de ADN de B. henselae en las muestras orales que en los gatos con boca con lesión (casi 31% respecto a 12,50%, respectivamente). Los datos de los que se dispone respecto a la correlación entre factores y positividad son muy dispares y, muy posiblemente, están influenciados por variables que no se tienen en cuenta en los estudios. Así se ha observado resultados como estos: En relación con la edad, en las personas se han observado más casos de CSD en niños y jóvenes que en adultos, (52) En relación con los gatos, en un estudio realizado en Connecticut, se encontró una fuerte asociación de la presencia de CSD en las personas que convivían con gatos de 12 meses o menores (16). En este sentido, nosotros hemos encontrado valores de ADN de B. henselae ligeramente superiores en los gatos adultos respecto a los jóvenes, aunque la diferencia no es significativa, sin embargo, un gato ADN positivo en muestras orales es un transmisor potencial de B. henselae, pero que para que ocurra esa transmisión, el carácter del gato y su comportamiento podrían ser determinantes. Es bien conocido el carácter alegre y juguetón de los gatos jóvenes y que la mordedura y arañazos forman parte de sus juegos, favoreciendo esa transmisión. Con este planeamiento, también podría sospecharse que el comportamiento de los niños y jóvenes pudiera ser un factor favorecedor para establecer ese tipo de relación con los gatos. En relación a la prevalencia de ADN de B. henselae, en muestras orales encontrada en hembras y machos, Pennisi y col., en el año 2010 (47), tampoco encontró diferencias significativas En principio, ambos sexos pueden ser parasitados por pulgas, y no parece haber ningún motivo para que exista diferencia en la prevalencia de infección. Respecto a la prevalencia de ADN de B. henselae en muestra oral de gatos callejeros o de protectora, no hemos encontrado estudios que hagan esta misma distinción. Generalmente se han diferenciado los gatos de compañía de los salvajes y de albergue. Lappin y Hawley, en el año 2009 (41) encontraron valores del 44,1% ADN positivo de B. henselae en gatos salvajes de Corea, y Nakemata y col. en 2010 (45) encontró un 38,3% en gatos de albergue ADN positivo de B. henselae, en el Norte de California. En una mezcla de gatos callejeros, de albergue, salvajes y domésticos del Sur de California, Quimby y col., en el año 2009 (49), determinó una prevalencia media de 11,1% de ADN de Bartonella spp. Nosotros hemos encontrado un 26,83% ADN positivo de B. henselae, en los gatos de colonias callejeras y un 33,33% en los de Protectora, son valores más próximos a los encontrados por Nakemata y col. en 2010 (45) en el Norte de California. En todos estos estudios se remarca la zona geográfica en la que se hace el estudio por la importancia que pudiera tener a la hora de favorecer o no la presencia de pulgas (u otros artrópodos hematófagos) en el entorno de los gatos. En los 3 últimos días de Mayo (28 a 31) y en Junio, la prevalencia de gatos con ADN positivo de B. henselae en muestras orales ha sido el doble (media 32,18%) que en Julio. Como ya se ha comentado en párrafos anteriores, la presencia de pulgas en el medioambiente aumenta en épocas cálidas y húmedas. Observando el histórico de Tª y Humedad de esas fechas (datos del aeropuerto de Zaragoza) vemos: Mes Tª media Humedad relativa (%) Precipitaciones (mm) Mayo 16,9º C 51,7 16 Junio 22,2º C 48,5 29,71 Julio 22,8º C 51,8 13,2 La Tª de supervivencia de C. felis, tanto para los huevos como los adultos está comprendida entre los 13 y 32ºC, mientras que el tiempo invertido en el desarrollo de las pulgas en esas condiciones puede variar de 14 a 140 días. Para llegar al desarrollo completo necesitan una humedad relativa comprendida entre el 50 al 92%. La longevidad aumenta con el aumento de la Humedad relativa y el descenso de la Tª, dentro de esos límites, (58) Con estos datos, se puede decir que en Mayo y Julio, se cumplían las condiciones necesarias para que las pulgas se desarrollen y se establezcan en el gato y su entorno, sin embargo, Junio ha sido seco y no alcanzaba la humedad relativa media. Sin embargo, y aunque no haya asociación estadística, no encontramos justificación para la diferencia observada en la baja prevalencia del mes de Julio, salvo que el tipo de gatos que llegaron en esos días llevaran poco tiempo en la colonia o la protectora, se tratase de gatos recientemente perdidos, que haya gatos de colonias que vivan en zonas cercanas a ríos, etc. La ausencia de correlación en nuestro estudio, entre la presencia de pulgas o heces de pulgas en el gato y la positividad al ADN de B. henselae en muestras orales, no es un resultado extraño, ya que otros autores han encontrado resultados similares, como ya se ha comentado en el párrafo ”2”. Así Lappin y Hawley, en el año 2009 (41), encontraron que la presencia de ADN de Bartonella spp. en sangre de gatos salvajes de Alabama y Florida, era independiente de que los gatos estuvieran infestados con C. felis. Sin embargo, es frecuente relacionar la presencia de pulgas con la infección dado que se admite que es la pulga, generalmente, la que transmite Bartonella spp. entre los gatos. Además, como ya se ha comentado en párrafos anteriores, Bartonella spp. resiste 3 días en las heces de la pulga (29), tiempo que favorecería la contaminación de la boca cuando se lamen y acicalan. Otros estudios detectan asociación entre la presencia de pulgas y la presencia de ADN en sangre del gato. El mismo Lappin y col., en 2006 (40), encontraba una prevalencia de B. henselae en gatos del 34,8% y en sus pulgas en un 22,8%, y B. clarridgeiae en un 20,7% y un 19,6% respectivamente. Esto mismo fue observado por Shaw y col. en 2004 (57), sin embargo ninguno de ellos analizó la relación de la presencia de pulgas o sus heces con la presencia del ADN en la boca de los gatos. Como se ha comentado en el párrafo “2” de esta discusión, otra posible fuente del ADN de B. henselae en la boca del gato es que la sangre del gato infectado esté presente en su boca. Por esta razón, se han realizado estudios que intentaban demostrar la relación entre la presencia de lesiones bucales y la prevalencia de ADN en las muestras orales. Nosotros no hemos encontrado esa asociación, más bien al contrario, porque aun no siendo significativa la diferencia encontrada, la prevalencia de ADN en gatos con boca sana (31%) es 2,5 veces superior a los de los gatos con lesiones bucales. Namekata y col., en 2010 (45), no encontró correlación entre la bacteriemia y la presencia de lesiones orales en los gatos de albergues del Norte de California y tampoco entre la detección ADN en muestra orales y la presencia de lesiones orales, al igual que ha pasado en nuestro estudio. Este dato también sería similar a lo observado por Dowers y col. en el año 2010 (27), los cuales no hallaron asociación entre la presencia de gingivoestomatitis y la presencia ADN de B. henselae, siendo un 11,4% (8/70) en los gatos con lesión, frente a un 8,2% encontrado en gatos con boca sana (5/6). Si bien, se entiende que un gato bacteriémico que tenga lesiones orales puede contaminarse la boca con eritrocitos infectados, también en el sentido contrario podríamos decir que un gato con lesiones bucales es posible que deje de lamerse y acicalarse, lo que impediría, en cierta medida, que la boca se contamine con pulgas y sus heces. Nuestros resultados apuntan en este sentido aunque debe comprobarse con estudios más amplios. Igualmente llamativo ha sido lo encontrado en relación con la presencia de signos clínicos en el gato, (hemos encontrado en los gatos del estudio signos respiratorios superiores o inferiores, dérmicos, oculares, bucales, afección de mamas, miasis….,). La prevalencia de ADN en los gatos sanos fue de un 33,33%, mientras que en los gatos con signos clínicos fue de un 14,29%. Estos resultados tampoco muestran asociación estadística, aun siendo contrarios a lo esperable. Dada la patogenia de Bartonella spp. que es capaz de hacerse intracelular en células endoteliales e inducir angiogénesis en órganos internos (Peliosis hepatis), o en los vasos de la dermis (Verruga Peruana), algunos autores han buscado la posible asociación entre la presencia de lesiones dérmicas y la positividad a la infección, sin embargo, los resultados no ha sido concluyentes y sugieren la necesidad de continuar progresando en su estudio (3, 4, 18, 23, 41, 54). También se ha sospechado de que podía potenciar infecciones crónicas como en caso de coinfección con FIV (60), en el que se ha observado que podía favorecer el desarrollo de estomatitis o linfadenopatía, sin embargo, desconocemos si los gatos que han entrado en nuestro estudio estaban infectados con FIV, y nosotros hemos observado lo contrario, dado que hay más gatos positivos al ADN de B. henselae en muestra oral entre los gatos sanos (18, 23, 54). 41. Lappin MR, Hawley J. Presence of Bartonella species and Rickettsia species DNA in the blood, oral cavity, skin and claw beds of cats in the United States.Vet Dermatol. 2009; 20: 509-14. 42. Maggi RG, Breitschwerdt EB. Potential limitations of the 16Se23S rRNA intergenic region for molecular detection of Bartonella species. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43: 1171-1176. 43. Maruyama S, Kasten RW, Boulouis HJ, Gurfield NA, Katsube Y, Chomel BB. 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