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Estudio de factores genéticos que afectan a casos esporádicos de la Enfermedad de Parkinson Trabajo Fin de Máster Biología Molecular y Celular Autor/es: Sheila Sánchez García Director/es: Dr. Mª Pilar Bayona-Bafaluy Dr. Nuria Garrido Pérez Facultad de Ciencias Septiembre 2014 1 ÍNDICE 1. Introducción Pág. 3 1.1. La enfermedad de Parkinson Pág. 3 1.2. La mitocondria y la enfermedad de Parkinson Pág. 4 La mitocondria Pág. 4 El sistema OXPHOS Pág. 5 Fosforilación oxidativa en la EP Pág. 6 DNA mitocondrial en la EP Pág. 7 Tóxicos ambientales en la EP Pág. 8 1.3. Mutaciones en genes asociados al Parkinson y su relación con la mitocondria Pág. 8 α-sinucleína Pág. 9 LRRK2 Pág. 10 PINK1 Pag. 11 Parkina Pág. 13 DJ-1 Pág. 15 HTRA2 Pág. 16 1.4. Interacciones genes-ambiente en la EP Pág. 16 2. Objetivo Pág. 19 3. Material y métodos Pág. 20 Material Pág. 20 3.1. Kits y reactivos comerciales Pág. 20 3.2. Líneas celulares eucariotas Pág. 21 3.3. Cebadores Pág. 21 3.4. Anticuerpos Pág. 22 Métodos Pág. 22 3.5. Cultivos celulares eucariotas Pág. 22 3.5.1. Crecimiento de células SH-SY5Y Pág. 22 3.5.2. Transfección celular Pág. 22 3.6. Preparación de cebadores Pág. 24 3.7. Técnicas de manipulación de RNA total Pág. 24 3.7.1. Técnicas de extracción de RNA total Pág. 24 3.7.2. Técnicas de cuantificación de RNA total Pág. 25 3.7.3. Obtención de cDNA a partir de RNA (RTPCR) Pág. 26 3.7.4. RT-PCR a tiempo real Pág. 26 3.8. Técnicas de manipulación de DNA Pág. 26 3.8.1. Reacción en cadena de la polimerasa Pág. 26 3.8.1.1. Amplificación de DNA por PCR utilizando como molde cDNA Pág. 26 3.8.2. Electroforesis horizontal de DNA en geles de agarosa Pág. 28 3.8.3. Purificación de productos de PCR Pág. 28 3.8.4. Secuenciación automática del DNA Pág. 28 3.9. Técnicas de manipulación de proteínas Pág. 29 3.9.1. Extracción de proteínas de cultivos Pág. 29 2 celulares 3.9.2. Determinación de la concentración de proteínas por el método Bradford Pág. 29 3.9.3. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE Pág. 30 3.9.4. Western-blot Pág. 32 3.9.4.1. Transferencia y fijación de proteínas a membrana Pág. 32 3.9.4.2. Incubación de la membrana con los anticuerpos primario y secundario Pág. 32 3.9.4.3. Revelado de la autorradiografía Pág. 33 3.9.4.4. Cuantificación de las bandas y estadística Pág. 33 4. Resultados Pág. 35 4.1. Análisis de las secuencias de los genes relacionados con la EP Pág. 35 4.2. Análisis de la expresión de proteínas mediante Western-blot Pág. 39 4.3. Estudio de la sobreexpresión de Parkina Pág. 43 4.3.1. Estudio de la sobreexpresión de Parkina mediante Western-blot Pág. 43 4.3.2. Estudio de la expresión de Parkina mediante qRT-PCR Pág. 47 5. Discusión Pág. 50 6. Conclusiones Pág. 55 7. Bibliografía Pág. 56 Anexo I. Cebadores utilizados Pág. 59 Anexo II. Abreviaturas Pág. 61 Anexo III. Cuantificación de las bandas obtenidas por WB Pág. 63 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1 La enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden neurodegenerativo que se caracteriza por la presencia de cuerpos de Lewy y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. Los cuerpos de Lewy son inclusiones proteicas intracitoplasmáticas compuestas principalmente de α-sinucleína y en las que se encuentran otras proteínas relacionadas con la EP. El papel que los cuerpos de Lewy desempeñan en la enfermedad es controvertido, ya que no está claro si causan la degeneración de la célula en la que se hayan o la protegen acumulando proteínas que de otra forma podrían ser dañinas. Figura 1. Imagenes obtenidas mediante tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) de la sustancia negra de la zona compacta de un sujeto sano (1) y de un individuo con la EP (2) en las que se observa la pérdida de neuronas dopaminérgicas característica de la enfermedad. En la última imagen (3) observamos la aparición de un cuerpo de Lewy (Lewy body) en el interior de una neurona dopaminérgica. Imagen tomada de Gasser T, Hardy J, Mizuno Y. Milestones in PD Genetics. Hoy en día se reconoce a la EP como una enfermedad neurodegenerativa multisistémica que afecta a diversas vías neuronales y sistemas de neurotransmisores [1], y cuyos síntomas característicos son: temblor, bradiquinesia (lentitud de 4 movimentos), rigidez articular e inestabilidad postural. Debido a la afectación de otras poblaciones celulares y otros circuitos dentro del sistema nervioso, otros síntomas aparecen asociados a la enfermedad de Parkinson: depresión, ansiedad, trastornos del sueño, apatía, demencia,… que a menudo no se consideran como propios de la enfermedad. La enfermedad de Parkinson es una de las enfermedades neurodegenerativas con más prevalencia en la sociedad (se trata de la segunda causa de trastorno neurológico, por detrás de la enfermedad de Alzheimer) y con gran repercusión, tanto en las actividades de la vida diaria, como en la calidad de vida del paciente, lo que supone una carga social y económica. Su prevalencia aumenta con la edad: desde un 1% en la población por encima de 60 años hasta un 4% por encima de los 85 años [2]. Debido a los cambios demográficos y al aumento de la esperanza de vida en los países desarrollados la prevalencia de la EP seguirá creciendo en las próximas décadas debido a la falta de tratamientos preventivos o cura. Además de la edad, factores ambientales como los pesticidas, el tabaco o la cafeína podrían tener influencia en el riesgo de un individuo a padecer la EP. [3] La gravedad del fenotipo, la alta prevalencia de la enfermedad, su impacto económico y la inhabilidad para prevenirla, junto con el hecho de que hoy en día la EP es incurable, hacen que encontrar sus causas sea uno de los puntos clave para el desarrollo de futuras terapias o tratamientos. 1.2 La mitocondria y la enfermedad de Parkinson La mitocondria Las mitocondrias son unos orgánulos celulares que se encuentran en prácticamente todas las células eucariotas, su principal función es la oxidación de metabolitos (ciclo de Krebs, beta-oxidación de ácidos grasos) y la obtención de ATP mediante la fosforilación oxidativa (sistema OXPHOS), que es dependiente de la cadena transportadora de electrones (CTE). El ATP producido en la mitocondria supone un porcentaje muy alto del ATP sintetizado por la célula. 5 Figura 2. Imagen de una mitocondria obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM). (P. Motta & T. Naguro , Science Photo Library) Aparte de su importante papel como la fábrica de energía de las células, las mitocondrias también están altamente involucradas en muchos otros procesos celulares, incluyendo la homeostasis del calcio, la respuesta al estrés y la inducción de la muerte celular. Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos con una amplia gama de morfologías dependiendo del tipo, la salud y la actividad de determinadas células. La morfología mitocondrial está regulada por el equilibrio de eventos altamente coordinados de fisión y fusión. Estos cambios dinámicos en la morfología mitocondrial son necesarios para mantenerlas saludables y son cuidadosamente regulados ya que un desequilibrio entre los procesos de fusión y fisión podría acarrear la fragmentación o la elongación inapropiada de las mitocondrias [4]. Es evidente que las mitocondrias son vitales para el buen funcionamiento de las células neuronales, que son particularmente sensibles a la disfunción mitocondrial debido a sus altos requerimientos de energía para el mantenimiento y la transmisión sináptica [5]. El sistema OXPHOS El sistema de fosforilación oxidativa es el encargado de producir ATP en las mitocondrias y está compuesto por la ATP sintasa (complejo V) y la cadena de transporte de electrones (complejos respiratorios I, III, y IV, citocromo c o coenzima Q). Siete polipéptidos del CI, uno del CIII, tres del CIV y dos del CV están codificados en el mtDNA, el cual también codifica los RNAs (2 rRNAs y 22 tRNAs) que se necesitan para la expresión de estos polipéptidos. Además de la generación de ATP, en este sistema también se generan otros productos como las especies reactivas de oxígeno (ROS). 6 Figura 3. Representación gráfica del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). (Pearson Education). Fosforilación oxidativa en la enfermedad de Parkinson El sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) es el principal proveedor de ATP en las neuronas, y a partir de este ATP se genera la fosfocreatina (PCr), que se produce mediante la fosforilación de la creatina. El sistema OXPHOS también reoxida el NADH glucolítico, pero en ausencia de éste, el NADH es oxidado por fermentación produciéndose ácido láctico. En estudios mediante espectroscopía de resonancia magnética en cerebros de pacientes con la EP se han encontrado niveles disminuidos de ATP y PCr además de concentraciones altas de lactato [6, 7]. Estos resultados son consistentes con una disfunción del sistema OXPHOS. La idea de que el sistema OXPHOS tiene un papel importante en la patología de la EP es respaldada por los estudios postmortem en tejidos humanos en los que se observa que la actividad del complejo I mitocondrial disminuye en la sustancia negra y en la corteza frontal [8]. Esta disminución podría además ser sistémica ya que también se ha encontrado en músculo [9], linfocitos [10], leucocitos [11] y en las plaquetas procedentes de pacientes con la EP [12]. 7 Por lo tanto, a pesar de la heterogeneidad aparente de la EP, una alteración del sistema OXPHOS podría ser un evento patogénico sistémico en muchos casos de la enfermedad. DNA mitocondrial en la enfermedad de Parkinson El mtDNA se localiza en la matriz mitocondrial, unido a la membrana interna donde se encuentra la cadena de transporte de electrones, principal productor de especies reactivas de oxígeno (que son mutagénicas). Por esta y otras características particulares del mtDNA, la proporción de mutaciones es mucho más alta en este genoma que en el nDNA [13]. Las delecciones de fragmentos largos de mtDNA (que incluyen tRNAs y genes que codifican proteínas) son mutaciones somáticas relativamente frecuentes. Dado que existen varias copias de mtDNA en cada mitocondria y varias mitocondrias por célula, dependiendo del porcentaje de mtDNA que se vea afectado por estas mutaciones los efectos pueden ser graves. Se ha observado que la cantidad de delecciones en el mtDNA aumenta en las neuronas de la sustancia negra en individuos de avanzada edad (lo que concuerda con el hecho de que la edad sea el mayor factor de riesgo) y en pacientes con EP [14]. Se sospecha, por tanto, que la disfunción mitocondrial en la EP podría provenir de mutaciones adquiridas o heredadas en el mtDNA. Varios estudios han proporcionado evidencias genéticas de que una mutación heredada del mtDNA (p.ej: m.117786 > A:MT-ND4 ó m.1095T < C:MT-RNR1) podría contribuir a la patogénesis de la EP [15, 16]. Estas mutaciones no son muy frecuentes en la población, pero otros polimorfismos mitocondriales mucho más comunes y que presentarían unos efectos fenotípicos menos acusados, han sido propuestos como factores de susceptibilidad [17] o de protección frente a la EP en distintos estudios epidemiológicos. Una de las evidencias que más sustentan esta teoría es el hecho de que defectos en el complejo I mitocondrial de pacientes con EP pueden transferirse a diferentes líneas celulares. Si fusionamos las plaquetas (que contienen mitocondrias 8 con su mtDNA pero no poseen núcleo) procedentes de pacientes con EP con células en cultivo sin mtDNA (células rho0), se obtienen híbridos citoplasmáticos con deficiencias en el complejo I [18]. Dado que solo el mtDNA de las plaquetas es capaz de mantenerse durante sucesivas generaciones de células (no así las proteínas o los lípidos), el defecto debe estar codificado en el genotipo mitocondrial. Tóxicos ambientales en la enfermedad de Parkinson La primera evidencia de que la mitocondria podría jugar un papel en la patogénesis del Parkinson surgió a partir del descubrimiento de que un inhibidor del complejo I, el 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), podía causar graves e irreversibles síntomas parkinsonianos en humanos [19]. Se propone que es el metabolito activo del MPTP, MPP+, el que se concentra en las neuronas dopaminérgicas dada su gran afinidad por el transportador de dopamina e inhibe el complejo I de la cadena de transporte de electrones. Esta inhibición, y la obstrucción de la transferencia normal de los electrones, pueden llevar a la generación de especies reactivas de oxígeno y a la reducción de la cantidad de ATP generado. Otras toxinas mitocondriales como, por ejemplo, la rotenona o el paraquat han sido descritas como inductores de la pérdida selectiva de neuronas y la agregación de proteínas similares a las encontradas en el caso del MPTP [20, 21]. Por tanto, algunos xenobióticos que inhiben los complejos del sistema OXPHOS parecen causar Parkinsonismo. 1.3 Mutaciones en genes asociados al Parkinson y su relación con la mitocondria La mayoría de los casos de EP parecen ocurrir de forma esporádica aunque durante las últimas dos décadas varias mutaciones genéticas han demostrado causar formas familiares de la enfermedad con clínica y rasgos patológicos similares a la EP idiopática [22, 23]. Estudiar las proteínas codificadas por estos genes y sus correspondientes mutaciones ha proporcionado una visión importante sobre las vías moleculares y los mecanismos que pueden subyacer en la neurodegeneración producida en la EP. 15 PARK7 (DJ-1): se han descrito mutaciones de cambio de aminoácido, delecciones o truncamientos en el gen DJ-1 (PARK7, OMIM 606324) en casos raros de Parkinson de inicio temprano autosómico recesivo. DJ-1 codifica una proteína de 189 aminoácidos, que pertenece a la superfamilia ThiJ/PfpI. DJ-1 existe como una proteína homodímerica en la que las mutaciones de cambio de sentido impiden la dimerización y/o la estabilidad de la proteína lo que conlleva una mayor degradación por parte del proteasoma. La función fisiológica de DJ-1 sigue sin estar clara, aunque los datos actuales apuntan a un papel como chaperona redox, una proteína de unión a RNA o una peroxirredoxina antioxidante tipo peroxidasa [39]. Figura 7. Representación tridimensional del dímero biológicamente activo que presenta DJ-1, con la mutación asociada al Parkinson (L166P) señalada con una flecha. (Front. Neurol., 18 April 2013) En condiciones normales, DJ-1 se localiza en el citoplasma de las neuronas con una pequeña proporción localizada en la matriz y el espacio intermembrana mitocondriales. La inactivación de DJ-1 en ratón lleva al aumento del estrés oxidativo que tiene como resultado la oxidación de las proteínas de la matriz mitocondrial de forma específica en las neuronas dopaminérgicas. Estas observaciones llevan a pensar que DJ-1 podría tener una función neuroprotectora en situaciones de estrés de la mitocondria. 16 HTRA2: el gen HTRA2 codifica una proteína de 458 aminoácidos, que forma un homotrímero. Es una proteasa que muestra actividad proteolítica frente a sustratos beta-caseína no específicos. Se localiza principalmente en el espacio intermembrana de la mitocondria aunque puede pasar al citosol si se estimulan procesos de apoptosis. Se había descrito inicialmente una función como factor proapoptótico para HTRA2 por varios grupos de investigación. Sin embargo, estudios in vivo llevados a cabo más recientemente con ratones que tenían una mutación en el gen HTRA2 o que no expresaban la proteína, mostraron que los ratones presentaban un desorden neurodegenerativo letal con una acumulación de proteínas desplegadas en la mitocondria. Esto parece indicar que la actividad de la proteasa HTRA2 mitocondrial podría ser importante para controlar los niveles de proteínas mal plegadas en la mitocondria. Como en otras muchas proteasas, la actividad proteolítica de HTRA2 está altamente regulada para prevenir proteólisis no requeridas. 1.4 Interacciones genes-ambiente en la enfermedad de Parkinson. A pesar de que se hayan encontrado casos en los que la enfermedad es causada por una mutación o un xenobiótico, estos casos no son muy frecuentes. Normalmente es una combinación de estos dos factores lo que aumenta el riesgo de padecer la EP. Se ha observado que la unión de unos antecedentes genéticos nucleares concretos junto con algunos xenobióticos pueden interaccionar para aumentar la disfunción celular [40]. Esto puede ocurrir también con los antecedentes genéticos mitocondriales y su interacción con xenobióticos. Pero aún más complicado de descifrar que estos efectos aditivos, es la posibilidad de que determinados polimorfismos, que no son factores de riesgo por sí mismos, determinen directamente la susceptibilidad a algunos xenobióticos que sin el componente genético, tampoco serían factores de riesgo. Por lo tanto, sería necesaria la combinación de ambos factores para aumentar el riesgo a padecer la enfermedad. Para más complicación, un mtDNA determinado podría albergar dos variantes genéticas que determinen de manera distinta la susceptibilidad de un individuo frente a la EP. Por ejemplo, la interacción entre un polimorfismo en el rRNA que aumente la 17 susceptibilidad frente a determinados antibióticos junto con un polimorfismo en el sitio Q del citocromo b que disminuya la susceptibilidad a ciertos pesticidas. Estos hechos podrían explicar los diferentes resultados obtenidos en estudios epidemiológicos de asociación entre haplogrupos de mtDNA y la EP, ya que los resultados dependerían de la distinta exposición de la población, lo que no suele ser tenido en cuenta. La obtención de pruebas directas de la interacción entre los tóxicos que afectan al sistema OXPHOS y las distintas variantes genéticas de mtDNA precisan modelos experimentales adecuados para su estudio. Los modelos animales permitirían el estudio de la enfermedad considerando al individuo completo, sin embargo, si la mayor parte de los casos de la EP se deben a combinaciones de distintos factores de susceptibilidad con efectos fenotípicos individuales suaves o moderados, los modelos animales no serían convenientes porque el ambiente genético de los posibles polimorfismos en el mtDNA sería muy diferente al que se encuentran expuestos los seres humanos. Por lo tanto, se necesitan modelos basados en genomas humanos. Afortunadamente, existen modelos celulares con condiciones ambientales y antecedentes genéticos muy bien controlados, que son los denominados como híbridos citoplasmáticos (véase pag. 7 introducción) que permitirían, una vez caracterizados los genes anteriormente descritos, estudiar la influencia de los haplogrupos del mtDNA en la EP. Para desarrollar estos modelos celulares, lo mejor sería utilizar neuronas diferenciadas, sin embargo. Hasta el momento sin embargo, no ha sido posible cultivarlas, por lo que una alternativa ha sido crecer células madre (NSC) y diferenciarlas posteriormente a neuronas, o bien utilizar células tumorales inmortalizadas, como la línea celular SK-N-(BE)2-C. Dentro de estas últimas, la más ampliamente utilizada es la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y que se ha convertido en un modelo celular popular para la investigación sobre la EP dado que esta línea celular posee muchas características de las neuronas dopaminérgicas. Por ejemplo, estas células expresan la tirosina hidroxilasa y la dopamina-β-Hidroxilasa, así 18 como el transportador de dopamina. Por otra parte, esta línea celular se puede diferenciar a neurona en presencia de diversos reactivos. En estos modelos falta, sin embargo, la caracterización de los genes implicados en casos de Parkinson familiar (SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 y HTRA2) que sería un paso previo necesario para la utilización de estas líneas celulares como modelos de estudio de las variantes polimórficas del mtDNA que pudieran tener relación con el riesgo de padecer la EP. Homogeneizando los factores genéticos nucleares, estas líneas celulares permitirían, en un primer paso, entender más profundamente las complejas relaciones que existen entre los factores genéticos y ambientales que afectan al mtDNA y, posteriormente, mediante introducción de genes cromosómicos con mutaciones, se podría añadir complejidad nuclear al modelo. 19 2. OBJETIVOS  Caracterizar el genotipo de los genes que han sido previamente asociados a casos de Parkinson familiar (SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 y HTRA2) en las tres líneas celulares a estudio (hNSC, SH-SY5Y y SK-N-(BE)2-C).  Analizar el patrón de expresión de las proteínas codificadas por estos genes en células sin diferenciar y en células diferenciadas a neuronas a modo de estudio comparativo entre ambos estados.  Estudiar la sobreexpresión del gen de la Parkina salvaje (PARK2) y de la Parkina con dos mutaciones distintas (K161N y G430D) en estas líneas celulares. 20 3. MATERIAL Y MÉTODOS Material 3.1. Kits y reactivos comerciales Todos los reactivos químicos usados en este trabajo fueron de grado analítico o de grado apto para biología molecular y en su caso, aptos para cultivo celular. La mayoría fueron adquiridos en las siguientes casas comerciales: Bio-Rad, Bioron, Invitrogen, Panreac, Promega Biotech Ibérica, Roche y SIGMA-ALDRICH. Las enzimas de restricción, así como otras enzimas modificadoras del DNA (fosfatasa alcalina, ligasa, retrotranscriptasa, DNAsa) se obtuvieron de las casas comerciales: New England Biolabs, Roche, Fermentas, Stratagene e Invitrogen. La enzima Taq polimerasa empleada para la reacción de PCR fue la DFS Taq DNA polimerasa de Bioron. Los medios empleados en el cultivo celular, así como el suero fetal bovino fueron de la marca GIBCO® suministrados por Invitrogen. Los kits comerciales y reactivos empleados en la realización de este trabajo de fin de máster, han sido recogidos en la siguiente tabla: Tabla 1. Reactivos y kits comerciales utilizados durante la realización del trabajo de fin de máster. Nombre Utilidad Casa comercial EZ-ECL Detección de quimioluminiscencia BI Biological Industries iScriptTM Reverse Transcription Supermix for RT-PCR kit Síntesis de cDNA Bio-Rad Low Mass Ladder Marcador de pesos moleculares de DNA Life technologies Material de cultivos celulares (Medio DMEN, SFB…) GIBCOTM de Life technologies Precision Plus dual Color Marcador de pesos moleculares de proteínas Bio-Rad Reactivo de Bradford Cuantificación de proteínas Bio-Rad 21 Reactivo TRIZOL® Extracción de DNA Life technologies Revelador Kodak® y fijador Kodak® Revelado de autorradiografías Sigma Rojo Ponceau Tinción reversible de proteínas en membranas Sigma Tampón completo de PCR y enzima DFS Taq DNA polimerasa Amplificación de DNA Bioron Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Síntesis de cDNA Roche Applied Science UltraClean® PCR Clean-Up Kit Purificación de productos de PCR MO BIO Laboratories 3.2. Líneas celulares eucariotas  Células madre neurales humanas (hNSC) derivadas de H9 hESC obtenidas en la casa comercial Life Technologies.  Línea aneuploide SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, (ATCC® CRL-2266™) obtenidas en Sigma.  Células de neuroblastoma SK-N-BE(2)-C cedidas por Anne Chomyn del Labotario de Giuseppe Attardi, California Institute of Technology, Division of Biology, Caltech. 3.3. Cebadores Los oligonucleótidos empleados en este trabajo de fin de máster se diseñaron de manera manual a partir de las secuencias consenso de interés obtenidas de Ensembl, comprobándolos a posteriori con la herramienta Oligo analyzer proporcionada por la página web www.idtdna.com para garantizar su especificidad y tratar de optimizar las reacciones en cadena de la polimerasa; esto es, equiparar las temperaturas de hibridación en las parejas de oligonucleótidos y tratar de minimizar las formaciones de estructura secundaria o de dímeros en los oligonucleótidos. En el anexo I se recoge una tabla con las secuencias de los cebadores para cada fragmento de cada gen, así como la Tm teórica. 22 3.4. Anticuerpos Los anticuerpos utilizados en la caracterización molecular de las células que sobreexpresaban la parkina salvaje o la parkina con alguna mutación fueron los recogidos en la tabla 2. Tabla 2. Relación de anticuerpos utilizados en este trabajo. PM prot (kDa) PM detectado (kDa) Dilución de trabajo Origen Casa comercial # Anti-PINK1 63 63 1/500 Mouse abcam 75487 Anti-a-synuclein (SNCA) 18 18 1/1000 Rabbit Life technologies 710110 Anti-Parkin PRK8 51,6 51,6 1/1000 Rabbit abcam 75487 Anti-PRK7/DJ-1 20 24 1/2000 Rabbit abcam 18257 Anti-HtrA2/Omi 49 37 1/3000 Rabbit abcam 75982 Anti-Vim 54 54 1/500 Rabbit abcam 92547 Anti-LRRK2 286 286 1/1000 Rabbit abcam 133518 Anti-actin 42 42 1/1000 Rabbit Sigma A2066 Métodos 3.5. Cultivos celulares eucariotas 3.5.1. Crecimiento de células SH-SY5Y Las células SH-SY5Y se crecieron en medio de cultivo preparado a partir de medio comercial DMEM rico en glucosa (4.5 g/l), con piruvato de sodio (0.11 g/l) y glutamina (584 mg/l), suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, el cual aporta proteínas y factores de crecimiento. Las células se mantuvieron durante su crecimiento en un incubador a 37°C, en una atmósfera húmeda conteniendo un 5% de CO2, cambiándoles el medio periódicamente cada 2 ó 3 días. 3.5.2. Transfección celular La generación de distintas líneas celulares que expresan una determinada proteína de manera estable o transitoria, se llevó a cabo mediante la técnica de transfección celular. Para ello, se utilizó un reactivo comercial XtremeGENE®HP (Invitrogen). El proceso consta de varias etapas que se llevaron a cabo en distintos días, tal y como se detalla a continuación: 23 - Día 1: El primer día del ensayo se llevó a cabo la transfección de la línea celular empaquetadora, 293T, con tres vectores plasmídicos distintos. Dos de ellos portan información para la generación de la envuelta (pMD2G), la cápside y la polimerasa (psPAX2) del virus y el tercero (pWXLd IresPuro o pWPXLD-IresNeo) contiene clonado el gen que deseamos expresar, mediante el sistema de infección lentiviral, en la línea celular de elección. La transfección química de la línea 293T se realizó utilizando el sistema XtremeGENE®6, (Roche), formado por una mezcla de lípidos y otros componentes disueltos en etanol al 80%. Este reactivo forma un complejo con el DNA y lo transportan al interior de las células animales. El día anterior a la transfección, se sembraron las células 293T en placa de 6 pocillos a una densidad adecuada para alcanzar entre el 60 y el 80% de confluencia, y se procedió tal y como se indica en las instrucciones del fabricante. Se utilizan tres vectores; 0,6 μg de plásmido de envuelta, 1,2 μg de gag-pol y 1,8 μg del que contiene el gen que se desea expresar (10,8 μl de XtremeGENE® para 3,6 μg de DNA total). - Día 2: Este segundo día se sembraron también las células que iban a ser infectadas con los virus producidos por 293T en las 48-72 h posteriores a la transfección inicial. Para ello, se sembraron en placas de 100 mm de diámetro ó de 6 pocillos (en función del experimento) a una densidad celular adecuada para tener una confluencia del 70% el día de la infección. - Día 3: Transcurridas 24 horas tras la transfección de la línea celular 293T con los vectores lentivirales, se pueden recoger los lentivirus empaquetados que se encuentran en el medio de cultivo. A las 48 horas se puede recoger de nuevo el medio, que contendrá una menor cantidad de lentivirus. 24 El medio de las células 293T se centrifugó a 1500 – 2000 rpm durante 5 minutos y se filtró a través de un filtro de 0.45 μm de tamaño de poro para evitar la contaminación de las células a infectar con células productoras de virus. A continuación, se añadió polibreno a una concentración final de 8 μg/ml, para aumentar la eficiencia de la infección, y se vertió la mezcla sobre la placa de células a transfectar. La cantidad de virus se optimizó (1,5 µL/mL de medio de cultivo) para lograr un porcentaje de infección mínimo, y con ello limitar, en lo posible, el número de inserciones del constructo en el genoma y evitar procesos de expresión aberrantes. - Día 5: El medio de las células infectadas durante dos días consecutivos, se cambió a medio de selección. Esto además permite eliminar los restos de polibreno, que pueden resultar tóxicos. 3.6. Preparación de cebadores Los cebadores se reciben de la casa comercial IDT liofilizados por lo que es necesario preparar la disolución adecuada para su uso posterior. Todos los cebadores se resuspenden para obtener una concentración final de 250 µM. Posteriormente, se preparan alícuotas de una concentración 10 µM, con 100 µL de volumen, que son las que serán empleadas de forma continuada para las PCRs. De esta forma se asegura el mantenimiento de la disolución original y se evita su deterioro por sucesivas descongelaciones y congelaciones. 3.7. Técnicas de manipulación de RNA total 3.7.1. Técnicas de extracción de RNA total Para la extracción del RNA de un pellet celular se ha empleado el método basado en el reactivo TRIZOL® de Invitrogen. En primer lugar, se lisan las células del pellet celular con 1 ml de TRIZOL® por cada 5-10 x 106 células y se homogeneiza pipeteando arriba y abajo. El homogeneizado se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se lleva a cabo la separación del RNA del resto de componentes celulares mediante la adición de 0,2 ml de cloroformo por mililitro de 31  Tampón del gel separador 4x: Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, SDS 0.4%, EDTA 8 mM.  Tampón del gel concentrador 4x: Tris-HCl 0.5 M pH 6.8, SDS 0.4%, EDTA 8 mM.  Tampón de carga 4x: Glicerol 10 %, TrisHCl 50mM pH 6.8, SDS 2 % (p/v), azul de bromofenol 0.02 % (p/v), β-mercaptoetanol 1 % (v/v). Los componentes para ambos geles (en el separador cambiarían las cantidades en los casos en los que se cambie el porcentaje acrilamida/bisacrilamida requerido) y el volumen necesario de cada uno para cubrir el volumen entre los cristales del soporte, se recogen en la siguiente tabla: Tabla 5. Composición de los dos tipos de geles empleados en la electroforesis SDS-PAGE. Componente Gel separador (10%) Gel concentrador Acrilamida:bisacrilamida 30:0.8 1,7 ml 0,33 ml Tampón 4x 1,25 ml 0,5 ml Agua destilada 2 ml 1,1 ml APS 10% 30 µL 20 µL TEMED 5 µL 5 µL El gel separador se vertió entre los cristales del soporte dejando aproximadamente 2 cm de espacio restante para la adición posterior del gel concentrador. Sobre el gel separador se añadió una fina capa de isopropanol para favorecer la formación de un frente uniforme y evitar la entrada de oxígeno que podría ralentizar la polimerización. Una vez polimerizado el gel separador, se retiró el isopropanol, se lavó con agua destilada su superficie y se retiró el exceso de agua con un papel secante. Para terminar, se incorporó el gel concentrador y se insertó el peine con cuidado. Una vez polimerizado el gel, se retiraron los peines y se colocó el gel en el interior de la cubeta llena de tampón de electroforesis 1x. Antes de cargar las muestras, se lavan los pocillos con tampón de electroforesis 1x con ayuda de una jeringuilla para retirar restos de acrilamida que hayan podido quedar. 32 Las muestras se mezclaron con tampón de carga 4x que posee β-mercaptoetanol, (un agente reductor de los puentes disulfuro de las proteínas) antes de cargarlas. Se cargaron 30 µg de proteína total por calle. La electroforesis se desarrolló a una intensidad de corriente constante de 10 mA por gel hasta que las muestras llegaron al gel separador, momento en el que se incrementó la intensidad a 20 mA por gel hasta el fin de la electroforesis. Como marcador de peso molecular de proteínas se emplearon 5-8 µl del Precision Plus dual Color. 3.9.4. Western-Blot 3.9.4.1. Transferencia y fijación de proteínas a membrana Con el fin de identificar las proteínas de interés, se procedió a la transferencia de las proteínas a membranas de PVDF (Fluoruro de polivinilideno) dado que este proceso no se puede llevar a cabo directamente sobre el gel. El método empleado fue el de transferencia húmeda utilizando el sistema Mini Trans-Blot Cell de Bio-Rad. Para ello, se cortó un fragmento de membrana de PVDF (Hybond-P de Amersham) adecuado al tamaño del gel que queríamos transferir. Para activar la membrana, se incubó durante 10 segundos en metanol y posteriormente, se lavó durante 5 minutos en agua destilada. Seguidamente, se equilibró la membrana con el tampón de transferencia BSN (Tris 48 mM glicina 39 mM y metanol 20% (v/v)) durante 10 minutos. De manera simultánea, el gel se incubó durante 15-20 minutos en BSN antes de iniciar la transferencia. Una vez que están todas las partes preparadas, se montó el sistema sándwich de transferencia húmeda sumergiendo todos los elementos en el tampón de transferencia. La transferencia se realizó a 4°C a 100 V durante 1-2 h o a 30 V durante toda la noche. La eficiencia del proceso se comprobó mediante la tinción reversible con Rojo Ponceau de las proteínas de la membrana durante unos segundos. Posteriormente, el agente de tinción se eliminó lavando la membrana con PBS-T (Tween20 al 0,1% en PBS) varias veces. Para conocer la correcta orientación de la membrana, una vez la sacamos del sándwich de transferencia cortamos o marcamos una de las esquinas. 33 3.9.4.2. Incubación de la membrana con los anticuerpos primario y secundario Para la inmunodetección de proteínas se suceden distintos periodos de incubación con anticuerpos y de lavados con PBS-T, todos ellos llevados a cabo en cubetas con agitación. Antes de proceder a las incubaciones con los anticuerpos, la membrana es bloqueada con leche para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos a la misma. Para ello se incubó la membrana con una disolución de PBS-T con un 5% de leche desnatada en polvo durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. Tras este tiempo, se eliminó el exceso de disolución bloqueante y se lavó la membrana mediante dos lavados cortos con PBS-T. El anticuerpo primario, específico para la proteína de interés, se diluyó a la proporción adecuada para conseguir la concentración recomendada por las casas comerciales (ver tabla 2). Esta dilución se hizo en PBS-T con un 0,25% en leche desnatada en polvo. La incubación de la membrana con el anticuerpo primario se prolonga durante 2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. Tras este tiempo, se recogió el anticuerpo y se hicieron tres lavados de 5 minutos de la membrana con PBS-T. El anticuerpo secundario es una IgG de ratón o conejo (según el origen del anticuerpo primario) conjugada con peroxidasa de rábano que reacciona al entrar en contacto con el luminol como sustrato quimioluminiscente. Se diluyó a una proporción de 1:3000 en PBS-T con 0,25% en leche desnatada en polvo. La membrana se incubó con esta dilución durante 1 hora. Tras este tiempo, se retiró la disolución y se lavó la membrana de nuevo 3 veces con PBS-T, 5 minutos cada vez. 3.9.4.3. Revelado de la autorradiografía Para el revelado es necesario trabajar sin luz ya que ésta quema las autorradiografías, por lo que se trabaja solo con luz roja. Para el proceso se emplea el kit EZ-ECL (Biological Industries). La membrana se incubó durante 1 minuto con este 34 reactivo para que se lleve a cabo la reacción. La luz emitida en esta reacción se detecta mediante el contacto de la membrana cubierta con plástico transparente en una placa de autoradiografía. Posteriormente, el film se revela mediante el revelador Kodak® (SIGMA) y se fija la señal mediante el fijador Kodak® (SIGMA). 3.9.4.4. Cuantificación de las bandas y estadística La cuantificación de las bandas obtenidas mediante Western Blot se llevó a cabo mediante el programa informático Image J, mientras que el posterior tratamiento estadístico de los datos se realizó con el programa Microsoft Excel. Para comprobar si los datos eran o no significativos, primero utilizando la Prueba F, se determinó si las varianzas eran o no iguales, para después mediante la prueba t de Student calcular la significación. Si el valor de p es menor de 0,05 se considera que la diferencia entre las medias es significativa. 35 4. RESULTADOS Los resultados se van a presentar en tres apartados: un primer apartado en el que se expondrán los resultados obtenidos en el análisis de la secuencia de los genes de interés, un segundo apartado que tratará sobre el análisis del perfil proteico y una última parte dividida en dos subapartados que hablarán sobre el estudio de la sobreexpresión de la proteína Parkina, en su forma salvaje o mutada, mediante inmunodetección y qRT-PCR. 4.1. Análisis de las secuencias de los genes relacionados con la EP. Con el objetivo de caracterizar los genes que previamente se habían relacionado con casos de Parkinson familiar en estas líneas celulares (hNSC, SH-SY5Y y SK-N-(BE)2-C) que pretendemos utilizar como modelo de estudio para la EP, se amplificaron y secuenciaron los siguientes genes: SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 y HTRA2. Para ello se sintetizaron los cDNA correspondientes y a partir de ellos se amplificaron los genes con los cebadores específicos diseñados para tal propósito. PARK2 (Parkina) El gen Parkina (localizado en 6q25.2-q27) está constituido por 12 exones y se han descrito 8 isoformas distintas producidas por procesamiento alternativo. El gen codifica una proteína (cuyo código en la base de datos UniProt es O60260) de 465 aminoácidos que se localiza predominantemente en el citoplasma. La secuencia de cDNA que se ha utilizado como base en el estudio es la secuencia canónica identificada por el código ENST00000366898 (obtenido de Ensmbl). Se ha podido secuenciar el gen en las tres líneas celulares, coincidiendo la secuencia de nucleótidos con la canónica. En la línea celular hNSC se ha encontrado un polimorfismo correspondiente a un cambio de G/C en el nucleótido 1241 del transcrito (rs1801582). En la línea celular SH-SY5Y se han encontrado otros dos polimorfismos (rs1801334 y rs1801474) que corresponden a un cambio de C/T y que dan lugar a variaciones de cambio de sentido en ambos casos. 36 Figura 10. Electroferograma obtenido en la secuenciación del gen Parkina. En la parte superior se muestra el alineamiento de la secuencia consenso (recuadrada en azul oscuro) con la secuencia obtenida en la secuenciación (fondo azul claro) y en la parte inferior se muestran remarcados los picos del electroferograma (nucleótido 1241) en los que se observa un polimorfismo que presenta un cambio de G/C en uno de sus alelos. PARK7 (DJ-1) El gen PARK7 ( 1p36.23) tiene 8 exones y codifica una proteína de 189 aminoácidos (Q99497). A partir de la secuencia consenso de cDNA (ENST00000493678) se ha llevado a cabo la secuenciación del gen en las tres líneas celulares obteniéndose en los tres casos los 1088 nucleótidos correspondientes a esta secuencia. En esta ocasión no se han encontrado polimorfismos en ninguna de las líneas celulares. SNCA El gen de la α-sinucleína (4q21) presenta 6 exones y codifica una proteína (P37840) de 140 aminoácidos de la que se han descrito 3 isoformas alternativas. Teniendo como base la secuencia consenso de cDNA (ENST00000394991) se leyeron las 1290 bases del gen en las tres líneas celulares sin encontrase polimorfismos en ninguna de ellas. 37 LRRK2 El gen LRRK2 (12q12) está constituido por 51 exones y codifica una proteína (Q5S007) de 2527 aminoácidos perteneciente a la superfamilia de las proteínas kinasas. Aunque existen varios transcritos, solo se ha descrito una isoforma hasta el momento. Tras varios intentos fallidos de conseguir un cDNA completo a partir del RNA total extraído de las células con el que poder amplificar los 14 fragmentos correspondientes del gen, determinamos que el gen era demasiado largo para obtener un cDNA completo del mismo. Por ello, intentamos a continuación amplificar el gen en dos fragmentos de cDNA mediante dos cebadores específicos, uno que se unía en la mitad del gen (LRRK2004 7R) y otro al final del mismo (LRRK2-004 14R), consiguiendo bandas del tamaño adecuado en la mayoría de los fragmentos amplificados pero de baja concentración y muchas bandas inespecíficas en la mayoría de los casos. Especialmente, en aquellos fragmentos más alejados de la posición en la que se unían los cebadores reversos utilizados, es decir, el fragmento 7 (cuyo cebador reverso se había utilizado en la síntesis del cDNA) presentaba una concentración adecuada, mientras que en el fragmento 1 apenas había producto amplificado. Teniendo esto en cuenta decidimos fraccionar en más trozos el cDNA para obtener un mejor resultado en todos los fragmentos, sintetizando 6 fragmentos de cDNA distintos utilizando los siguientes cebadores específicos: LRRK2-004 3R, LRRK2004 6R, LRRK2-004 9R, LRRK2-004 12R, LRRK2-004 13R, LRRK2-004 14R. Conseguimos así secuenciar los 7584 nucleótidos del gen en la línea celular SH-SY5Y. En las otras dos líneas celulares se han secuenciado alguno de los fragmentos pero, dada la cantidad de tiempo que supone la síntesis de todos los cDNA específicos y después amplificar cada fragmento del gen, no se llegó a secuenciar el gen completo en ninguna de las dos líneas. En las secuencias obtenidas se encontraron varios polimorfismos que se resumen en la tabla siguiente: 38 Tabla 6. Polimorfismos encontrados en la secuenciación del gen LRRK2. SNPs Cambio Alelos Tipo de variación SH-SY5Y rs3761863 T/C Uno T y otro C Cambio de sentido rs10878245 T/C Uno T y otro C Sinónima rs7966550 T/C Uno T y otro C Sinónima rs11176013 A/C Uno A y otro C Sinónima rs10878371 T/C Uno T y otro C Sinónima SK-N-(BE)2-C rs199557665 C/A Uno C y otro A Cambio de sentido PINK1 El gen PINK1 (1p36) codifica una proteína (Q9BXM7) de 581 aminoácidos que se localiza en la mitocondria y que se ha visto que protege frente a la disfunción mitocondrial en situaciones de estrés celular. Se han descrito dos isoformas de la misma como resultado de procesamientos alternativos: la elegida como secuencia canónica y otra isoforma que se diferencia de la primera en la pérdida de los 307 primeros aminoácidos. En estas tres líneas celulares la isoforma encontrada ha sido la canónica (Q9BXM7-1). Se ha podido secuenciar el gen a partir del nucleótido 589 en las tres líneas celulares, obteniéndose la secuencia canónica y sin detectarse polimorfismos en ninguna de las secuencias leídas. HTRA2 El gen HTRA2 (2p12) cuenta con 8 exones que codifican una serina proteasa (O43464) de 458 aminoácidos que será sometida a procesos de proteólisis posttraduccional. Se han descrito hasta 4 isoformas alternativas de esta proteína como resultado de procesamientos alternativos, la canónica y otras tres isoformas distintas de menor tamaño. La secuencia canónica de cDNA que ha servido de base para el análisis del gen en las líneas celulares corresponde a ENST00000258080. A partir de ella se han diseñado los cebadores específicos adecuados y se ha secuenciado el gen 39 amplificándolo en dos fragmentos, obteniendo así la secuencia de 2367 nucleótidos que coinciden con la secuencia canónica arriba descrita. No se ha encontrado ningún polimorfismo en la lectura de las secuencias, aunque solo se han podido secuenciar los dos fragmentos en la línea celular SH-SY5Y. 4.2. Análisis de la expresión de proteínas mediante Western-Blot El objetivo del análisis de la expresión de las proteínas de interés a través de Western-Blot era determinar posibles diferencias en el perfil proteico de las células sin diferenciar (SD) y diferenciadas a neuronas (D) en la línea SH-SY5Y. Para ello, trabajamos con varias membranas obtenidas a partir de geles de poliacrilamida verticales con distinto porcentaje de acrilamida en función del tamaño de la proteína objeto de estudio. La primera membrana (Figura 11), que se obtuvo a partir de un gel del 14% de acrilamida, se hibridó secuencialmente con SNCA, Parkina, DJ-1 y, por último, con Actina, que se eligió como proteína de expresión constitutiva para normalizar la cantidad de proteína presente en las tres membranas. Figura 11. Membrana 1 (gel del 14% de acrilamida), cargada con tres poblaciones distintas de células sin diferenciar (SD) y otras tres poblaciones distintas de células diferenciadas a neuronas (D). Hibridada secuencialmente: A) SNCA; B) Actina, como control de carga del gel, banda a 42 kDa; C) Parkina, banda a 51,6 kDa, al hibridar secuencialmente la membrana aparece la banda correspondiente a la actina y D) DJ-1, banda de 24 kDa. 40 La α-sinucleína (SNCA) es una proteína cuyas alteraciones genéticas pueden conllevar su polimerización anormal en forma de fibrillas. Estos agregados fibrilares de SNCA representan el principal componente de los cuerpos de Lewy, que aparecen habitualmente en la EP. En la inmunodetección de la proteína se detectó una banda cuya expresión desaparece tras la diferenciación. Sin embargo, el tamaño de la banda es mayor del esperado (18 kDa) por lo que no podemos concluir que la banda corresponda a la SNCA y sería necesario repetir el experimento con otro anticuerpo. La Parkina da una banda con un tamaño de 51,6 kDa, y como se puede observar, disminuye su expresión en las células diferenciadas. En la imagen aparece además la banda correspondiente a la Actina debido a la hibridación secuencial de la membrana. En el caso de DJ-1, se detecta la banda esperada a 24 kDa y los resultados parecen apuntar a una menor expresión de la proteína una vez diferenciadas las células. La membrana 2, obtenida a partir de un gel del 8% de acrilamida, se hibridó secuencialmente con LRRK2, Actina y Vimentina. La proteína LRRK2 da una banda de ≈ 286 kDa que parece incrementar su expresión tras la diferenciación a neuronas. Sin embargo, el anticuerpo no es lo suficientemente específico y observamos la aparición de varias bandas inespecíficas. Para la Vimentina se detecta una banda de 54 kDa y, además de la banda esperada, en el caso de las células diferenciadas aparecen más bandas de menor tamaño que podrían deberse a proteólisis asociada al proceso de diferenciación. 47 4.3.2. Estudio de la expresión de Parkina mediante qRT-PCR. Cuando la PCR a tiempo real se combina con una reacción de retrotranscripción o RT (RT-PCR), puede determinarse la cantidad de mRNA de una muestra mediante una cuantificación relativa. Dicha cuantificación se denomina así ya que se compara entre diferentes muestras la cantidad relativa o relación del mRNA de un gen específico respecto a la cantidad de mRNA de un gen constitutivo (control endógeno, en nuestro caso la actina). En nuestro caso queremos determinar las expresiones relativas del gen Parkina, en función de que se trate de células transfectadas con el gen salvaje o células transfectadas con alguna de las dos mutaciones, con respecto a las células transfectadas solo con GFP (control). Figura 19. Representación gráfica de las expresiones relativas del gen Parkina entre muestras de células de la línea SH-SY5Y transfectadas con: GFP (control), el gen salvaje (WT), el gen con la mutación K161N (161) y el gen portando la mutación G430D (430). Como se puede observar en la gráfica (Figura 19), en los tres casos en los que se transfectan las células con el gen de la Parkina, la expresión aumenta considerablemente con respecto al control, siendo mayor en la muestra de células transfectadas con el gen salvaje respecto a las células que expresan el gen con alguna de las dos mutaciones. 48 Figura 20. Representación gráfica de las expresiones relativas del gen Parkina entre muestras de células de la línea SK-N-(BE)2-C transfectadas con: GFP (control), el gen salvaje (WT), el gen con la mutación K161N (161) y el gen portando la mutación G430D (430). En el caso de la línea celular SK-N-(BE)2-C las células que parecen tener mayor expresión del gen son en este caso las transfectadas con la Parkina que porta la mutación K161N. También cabe destacar que la sobreexpresión generada es mayor en las muestras pertenecientes a la línea celular SH-SY5Y en relación a las de la línea SK-N- (BE)2-C. 49 5. DISCUSIÓN 5.1. Análisis de las secuencias y del perfil proteico de los genes de interés. En el estudio de la secuencia del gen Parkina en las tres líneas celulares, se encontraron 3 polimorfismos, uno en la línea celular hNSC (rs1801582) y otros dos polimorfismos en la línea celular SH-SY5Y (rs1801334 y rs1801474). Los tres han sido descritos como no patogénicos y, por lo tanto, no suponen ninguna connotación a tener en cuenta en la aplicación de estas líneas celulares para el estudio de los polimorfismos de mtDNA relacionados con la EP. En cuanto al estudio de la proteína mediante Western-Blot encontramos que la expresión decrece (con una significación p=0,005) en las células una vez se han diferenciado a neuronas. Este resultado es interesante dado que esta proteína desarrolla un importante papel neuroprotector y quizá su presencia sea incluso más relevante durante la diferenciación celular [44]. La caracterización genética de DJ-1 ha permitido comprobar la ausencia de algún tipo de mutación que pueda afectar a su función. Esta proteína se sintetiza como una proenzima y sufre un procesamiento proteolítico que supone la pérdida de 15 aminoácidos del extremo C-terminal lo que la convierte en una proteasa activa [45].Mediante el análisis por inmunodetección se ha observado que la expresión de la proteína decrece (p=0,0003) cuando las células se diferencian a neuronas. Resultado coherente con los estudios que proponen que DJ-1 tendría un papel como antioxidante y que solo aumenta su expresión en el caso de que las células se encuentren bajo estrés oxidativo [46]. La proteína α-sinucleína, codificada por el gen SNCA, es el componente principal de los cuerpos de Lewy. El papel celular de esta proteína es aún desconocido. Sin embargo, probablemente desempeña un papel en la función pre-sináptica de las neuronas dopaminérgicas, que puede incluir moderar la liberación de neurotransmisores. No se han encontrado polimorfismos en ninguna de las tres líneas celulares a la hora de su secuenciación en este estudio. En cuanto al análisis de la expresión de la proteína, el anticuerpo utilizado ha resultado no ser el idóneo para su detección, ya que no encontramos la banda del tamaño que correspondería para esta proteína y por lo tanto sería necesario repetir el experimento con otro anticuerpo más específico. 50 El Parkinson asociado al gen LRRK2 es en gran medida clínica y patológicamente indistinguible del Parkinson esporádico, lo que sugiere que entender la función de su proteína es importante para todas las formas de Parkinson. Sin embargo, alcanzar un consenso en cuanto a las funciones fisiológicas relevantes para la EP que lleva a cabo LRRK2 está siendo extremadamente difícil, especialmente por las dificultades encontradas a la hora de desarrollar anticuerpos específicos válidos para los diferentes tejidos o líneas celulares a estudio. En este trabajo se han probado de hecho dos anticuerpos para la detección de LRRK2 obteniéndose en ambos experimentos numerosas bandas inespecíficas. En esta memoria se recoge únicamente el anticuerpo que ha dado un mejor resultado. La caracterización genética de este gen ha sido especialmente laboriosa debido a su gran tamaño. Aun así, se han encontrado numerosos polimorfismos en la línea celular SH-SY5Y: rs10878245, rs7966550, rs11176013 y rs10878371, (todos ellos asociados al Parkinson autosómico dominante, lo que habrá que tener presente al utilizar como modelo esta línea celular, aunque la relevancia clínica de estos polimorfismos permanece desconocida en todos los casos) y, por último, rs3761863, un polimorfismo que no afecta a la función de la proteína y está clasificado como benigno. El único polimorfismo encontrado en la línea celular SK-N-(BE)2-C (rs199557665) corresponde a un polimorfismo de cambio de sentido también sin consecuencias clínicas descritas. En cuanto a la proteína LRRK2, los resultados obtenidos no son significativos aunque parecen indicar un ligero aumento de la expresión de la proteína una vez las células han sido diferenciadas a neuronas. La bibliografía sostiene que LRRK2 se expresa en mayor medida en los pulmones y el riñón que en el cerebro, y que dentro de éste los niveles de expresión en las neuronas dopaminérgicas son bajos [47]. Aun así, quizá su presencia sea más relevante en la célula diferenciada que durante su diferenciación y de ahí el incremento en su expresión. La secuenciación del gen PINK1 solo se pudo llevar a cabo a partir del nucleótido 589, a pesar de haber llevado a cabo numerosos intentos con diferentes condiciones en la PCR (cambios en la temperatura y el tiempo de elongación, aumento del número de ciclos, utilización de cDNA específico del fragmento), utilizado distintos cebadores e incluso cambiado la polimerasa utilizada en la PCR por una con mayor 51 fidelidad. La razón por la que no hemos conseguido secuenciar el fragmento podría deberse a la presencia de la proteína tan solo en pequeñas cantidades, que no facilitan la amplificación de este fragmento. Esta hipótesis se vería reforzada por los resultados obtenidos en el análisis del perfil proteico que muestran una intensidad muy baja para las bandas correspondientes a la proteína. En estos estudios mediante Western-Blot se observan tres bandas correspondientes a la proteína completa (63 kDa), y dos bandas que corresponden a dos formas procesadas proteolíticamente en el extremo N-terminal de la proteína (54, 45 kDa respectivamente) [41]. A pesar de que dada la poca intensidad de las bandas es difícil determinar si existen o no diferencias entre la expresión en células sin diferenciar y células diferenciadas, la cuantificación de las bandas indica un aumento de la expresión (p=0,03) de la proteína completa en las células diferenciadas. Esto estaría de acuerdo con los estudios que proponen que PINK1 es una proteína tremendamente importante para el control del correcto funcionamiento de las mitocondrias, y que las neuronas que portan mutaciones en esta proteína no son capaces de reconocer ni eliminar las mitocondrias dañadas, y acaban teniendo un déficit energético que compromete su viabilidad [48]. También cabe destacar la aparición de una cuarta banda en el perfil proteico de las células diferenciadas con un tamaño cercano a los 100 kDa que podría estar asociada a procesos de autofosforilación de PINK1 que ya han sido descritos con anterioridad [42]. El gen HTRA2 codifica una serina proteasa localizada en el espacio intermembrana mitocondrial cuyas mutaciones han sido asociadas a la EP, aunque su verdadera implicación en la patogénesis de la enfermedad sigue siendo un tema controvertido. En la caracterización genética no se encontró ningún polimorfismo en las secuencias leídas. En cuanto a la proteína, en los resultados obtenidos mediante Western-Blot se observan dos bandas que corresponderían a la forma precursora y a la forma madura de la proteína, aunque esta última tiene un tamaño ligeramente inferior al esperado debido a que sufre procesos de autoproteolisis. También observamos que la banda que corresponde a la forma precursora de la proteína decrece 52 significativamente (p=0,001) tras la diferenciación a neuronas de las células, mientras que en el caso de la proteína madura la intensidad es mayor (p=0,02), lo que lleva a pensar que en las células diferenciadas a neuronas la proteína se encuentra mayoritariamente en su forma activa. La Vimentina es un filamento intermedio (IF) de tipo III que se expresa en las células mesenquimales y juega un papel importante asegurado la posición y el anclaje de los orgánulos en el citosol. En los estudios de inmunodetección se observa la banda esperada de 54 kDa que corresponde a la proteína. Además de esta banda , en el caso de las células diferenciadas aparecen otras bandas de menor tamaño que podrían deberse a proteólisis mediada por una proteasa dependiente de Ca2+ que actuaría tras la diferenciación celular [49]. 5.2. Estudio de la sobreexpresión de Parkina En el estudio de la sobreexpresión de la Parkina, llevado a cabo mediante inmunodetección en las tres líneas celulares de interés, obtuvimos tres perfiles proteicos bastante parecidos donde se observa un aumento importante en la expresión de la proteína en aquellas células transfectadas con el gen con respecto a las células control ( no transfectadas o transfectadas con GFP). Este aumento es, además, mayor en el caso de las células transfectadas con el gen salvaje (WT) que en las células transfectadas con el gen mutado. También es importante destacar la aparición de dos bandas de menor tamaño y bastante intensidad en todas las muestras en las que se ha llevado a cabo la sobreexpresión de la Parkina, lo que parece indicar que la mayor parte de la proteína que se sobreexpresa acaba siendo degradada por la célula [50]. Además se ha llevado a cabo un segundo experimento disminuyendo el número de copias del gen transfectadas a las células, con el fin de obtener una menor sobreexpresión de la proteína que se acerque más a las condiciones fisiólogicas de las mismas. Aunque se comprobó la correcta transfección del gen (ya fuera salvaje o mutado) en las células mediante la amplificación por PCR del gen a partir del DNA de 53 las células, sería conveniente llevar a cabo otra comprobación realizando la amplificación del gen a partir de RNA (sintetizando el correspondiente cDNA) para asegurarnos de que la proteína expresada es la proteína mutada que queremos en cada caso. En cuanto al estudio de la sobreexpresión mediante RT-PCR a tiempo real, los resultados obtenidos muestran, de nuevo, un gran aumento de la expresión del gen en las muestras transfectadas con el mismo (tanto en su forma salvaje como mutado) con respecto a las células control transfectadas con GFP. Una vez comprobada la sobreexpresión de la proteína, habría que pasar a realizar experimentos (Polarografía, Microscopía confocal) para analizar cómo afecta esta sobreexpresión a las funciones de los complejos del sistema OXPHOS y a la morfología y biogénesis mitocondrial. 54 6. CONCLUSIONES  Se han conseguido caracterizar los siguientes genes previamente asociados a casos de Parkinson familiar:  SNCA, PARK2 y DJ-1 en las tres líneas celulares a estudio (hNSC, SH-SY5Y y SK-N-(BE)2-C).  PINK1, a partir del aminoácido 589 en las tres líneas celulares.  LRRK2, solo se ha secuenciado completo en la línea celular SHSY5Y  HTRA2, secuenciado por completo en la línea celular SH-SY5Y, en las otras dos líneas celulares solo se ha secuenciado el segundo fragmento.  Se han observado los diferentes perfiles proteicos que presentan las células de la línea celular SH-SY5Y antes y después de ser diferenciadas a neuronas, obteniéndose resultados que ayudarán a optimizar esta diferenciación.  Los estudios de la sobreexpresión de la Parkina mediante Western-Blot y RT-PCR a tiempo real han permitido comprobar el aumento de expresión (entre 100 y 300 veces más en la línea celular SK-N-(BE)2-C, y entre 250 y 1100 veces más en el caso de la línea celular SH-SY5Y) en las células transfectadas con el gen tanto en su forma salvaje como mutada.  Se ha observado la disminución de la sobreexpresión de la Parkina al transfectar la línea celular SH-SY5Y con menor número de copias del gen con el objetivo de aproximarse a las condiciones fisiológicas de las células. El estudio ha permitido, por tanto, avanzar en la caracterización exhaustiva de estas tres líneas celulares para la utilización de las mismas como modelos de estudio de las variantes polimórficas del mtDNA que pudieran tener relación con el riesgo de padecer la EP. 55 7. BIBLIOGRAFÍA 1. Hodaie, M., J.S. Neimat, and A.M. Lozano, The Dopaminergic Nigrostriatal System and Parkinson's Disease: Molecular Eventsin Development, Disease, and Cell Death, and New Therapeutic Strategies. Neurosurgery, 2007. 60(1): p. 17-30. 2. de Lau, L.M. and M. Breteler, Epidemiology of Parkinson's disease. The Lancet Neurology, 2006. 5(6): p. 525-535. 3. Elbaz, A. and F. Moisan, Update in the epidemiology of Parkinson's disease. Current opinion in neurology, 2008. 21(4): p. 454-460. 4. Detmer, S.A. and D.C. Chan, Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007. 8(11): p. 870-879. 5. 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