Repositorio Institucional de Documentos

Directores: José Antonio Aínsa Claver Liliana Isabel Dias Rodrigues Daniel Fuentes Martínez Trabajo fin de grado 2013-2014 Caracterización genética del gen Rv1258c en cepas de Mycobacterium tuberculosis de la familia Beijing Índice Resumen .................................................................................................................. 1 Introducción ............................................................................................................. 2 Historia de la tuberculosis ............................................................................................. 2 Transmisión, Tratamiento y Vacuna .............................................................................. 3 Mycobacterium tuberculosis ......................................................................................... 4 Resistencias a fármacos y bombas de eflujo en M. tuberculosis………………………………..4 Diagnóstico e identificación de cepas ............................................................................ 5 Antecedentes y Justificación ..................................................................................... 7 Objetivos .................................................................................................................. 8 Materiales y Métodos ............................................................................................... 9 Cepas bacterianas, plásmidos, medios, condiciones de cultivo y muestras de DNA…..9 Vectores utilizados……………………………………………………………………………………………………9 Polymerase Chain Reaction (PCR)………………………………..………………………………….…….…10 Extracción de DNA de M. tuberculosis………………………………………………………….…….……10 Purificación de los productos de amplificación……………………………………..…….………..…11 Ligación…………………………………………………………………………………………………….…….………12 Preparación de células competentes de E.coli para electroporación….……….……………12 Transformación de células competentes por electroporación…………………….……………12 Extracción de plásmidos (Mini-preparación)………………………..……………………….…………13 Digestiones de ácidos nucleicos………………….………………………..…………………….…………..14 Resultados y Discusión………………………………………………………………………………….………..15 Optimización MAMA PCR cepas H37Rv y GC1237……………………………………….………....15 Aplicación del protocolo de MAMA PCR a nuevas muestras…………………….….………....20 Clonaje del gen Rv1258c de la cepa GC1237, perteneciente a la familia Beijing de M. tuberculosis, en el vector pGEM-T……………………………………………………………….………....22 Conclusiones y perspectivas………………………………………………………………………….………..25 Referencias Bibliográficas……………………………………………………………………………….………26 Resumen 1 Resumen Las cepas de la familia Beijing de Mycobacterium tuberculosis fueron descritas inicialmente en China y desde entonces se han extendido por muchas regiones del mundo causando frecuentes brotes epidémicos. Tienen la habilidad de propagarse con rapidez y una alta capacidad para infectar fruto de ventajas genéticas y mecanismos de virulencia no identificados todavía. Se estima que un tercio de los casos de tuberculosis son causados por cepas de la familia Beijing, lo que convierte a este linaje en una de las familias con mayor índice de mortalidad. En estudios previos realizados en el laboratorio, se ha identificado un polimorfismo característico de las cepas Beijing, la inserción de un nucleótido de citosina entre las posiciones 580 y 581 del gen Rv1258c que codifica la bomba de eflujo Tap. En este trabajo se ha utilizado la cepa GC1237 del linaje Beijing junto a la cepa de referencia H37Rv, para optimizar un protocolo de detección de las cepas de la familia Beijing. El protocolo está basado en la identificación de este polimorfismo mediante la técnica MAMA PCR (Mismatch Amplification Mutation Assay Polymerase Chain Reaction). Se han optimizado diferentes variables de la técnica, como el diseño de cebadores o la temperatura de annealing, y se ha intentado aplicar a muestras clínicas de tuberculosis, incluyendo las procedentes de esputos. Por último se ha realizado el clonaje del gen Rv1258c de la cepa GC1237 con vistas a futuros estudios de la expresión y función de la proteína Tap en cepas Beijing. Summary The Beijing family of strains of Mycobacterium tuberculosis were reported originally in China, and have disseminated to several regions of the world, being responsible of a large number of outbreaks. These strains are considered to have diverse genetic changes and mechanisms of virulence (yet to be identified), which altogether confer them the capability to disseminate and infect quickly and efficiently. Several publications have reported that the Beijing family of strains is responsible of one third of cases of tuberculosis and the largest number of deaths. Previously, in our laboratory, a genetic polymorphism has been identified as characteristic of the Beijing strains. A cytosine nucleotide is inserted between positions 580 and 581 of the Rv1258c gene, which encodes Tap efflux pump. In this work, we have used strain GC1237 (Beijing) and H37Rv (a reference strain) in order to set up a protocol for detecting strains of the Beijing family, based in the identification of such polymorphism by MAMA-PCR (Mismatch Amplification Mutation Assay Polymerase Chain Reaction). Primer design and annealing temperature have been optimised, and we have tried to use this protocol in order to analyse clinical specimens, including sputum samples. Finally, we have cloned the Rv1258c gene from GC1237 strain in order to set up the starting point for further studies on the expression and function of Tap protein in Beijing strains. Resumen / Summary Introducción 2 Historia de la tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por micobacterias, fundamentalmente por Mycobacterium tuberculosis. En función del órgano afectado, proporciona una gran variedad de cuadros clínicos, siendo los mayores afectados los pulmones. La tuberculosis junto con el sida y la malaria siguen siendo las tres enfermedades infecciosas que causan un mayor número de muertes a nivel mundial (World Health Organization 2014). Se considera como una de las primeras enfermedades humanas de las que se tiene constancia, y a lo largo de la historia, ha recibido multitud de nombres: mal del rey, peste blanca o tisis, entre otros. Se admite el hecho de que el organismo que produce la tuberculosis evolucionó a partir de otros microorganismos más primitivos dentro del propio género Mycobacterium. A partir de las micobacterias ancestrales fueron derivando las especies actuales, algunas patógenos de humanos (M. tuberculosis) y otras patógenos de animales (M. bovis, M. caprae, etc.). En 1882, Robert Koch consiguió aislar el bacilo tuberculoso, teñirlo mediante coloración de derivados de anilina y demostrar su patogenicidad haciéndolo saber finalmente en la Sociedad de Fisiología de Berlín. En 1921, Albert Calmette y Camille Guérin fueron los artífices de la primera vacuna contra la tuberculosis, una variante atenuada de M. bovis denominada BCG. En 1944, gracias a los esfuerzos por encontrar un fármaco eficaz contra M. tuberculosis, se descubrió la estreptomicina. A partir de este momento, surgieron nuevos medicamentos antituberculosos: ácido para-amino salicílico (1949), isoniazida (1952), pirazinamida (1954), etambutol (1962) y rifampicina (1963). Todos estos hallazgos transformaron la tuberculosis en una enfermedad curable, sin embargo, la idea de que esta enfermedad se encontraba controlada se esfumó décadas después con la irrupción de la epidemia del SIDA así como con la aparición de casos de tuberculosis multirresistentes. Introducción Introducción 3 Transmisión, Tratamiento y Vacuna La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que alrededor de dos mil millones de personas se encuentran infectadas de forma latente por tuberculosis, con ocho millones de nuevos casos de tuberculosis activa y dos millones de muertes cada año. Por ello, la OMS declaró en 1993 una situación de emergencia global frente a la tuberculosis y uno de los Objetivos del Milenio que se han planteado es reducir la incidencia y mortalidad producida por la tuberculosis (World Health Organization 2014). Si bien ya se ha cumplido el Objetivo de Desarrollo del Milenio de cambiar el curso de la epidemia de tuberculosis, el descenso del 2% en el número de personas que contraen esta enfermedad cada año sigue siendo todavía insuficiente. La infección se trasmite por vía aérea mediante la inhalación de bacilos tuberculosos. A lo largo de la vida, las personas infectadas de forma latente presentan un riesgo de desarrollar tuberculosis activa del 10%, probabilidad que se ve incrementada considerablemente si se tiene el sistema inmunitario dañado, como ocurre en casos de infección por el VIH, malnutrición o diabetes. Cuando la forma activa de la enfermedad se presenta, los síntomas (tos, fiebre, sudores nocturnos, pérdida de peso, etc.) pueden ser leves durante muchos meses. Como resultado de ello, en ocasiones los pacientes tardan en buscar atención médica y transmiten la bacteria a otras personas. Afortunadamente, la tuberculosis es una enfermedad curable. El tratamiento requiere de un largo periodo en el cual se administran diversas combinaciones de fármacos de primera línea, que son los que presentan una mayor actividad bactericida. Se inicia con la toma durante dos meses de rifampicina, isoniazida, pirazinamida y etambutol o estreptomicina, seguidos de cuatro meses con rifampicina e isoniazida. Durante este proceso es muy importante tanto la información y supervisión del tratamiento como el apoyo por parte de un agente sanitario, con el objetivo de garantizar la finalización del tratamiento, crucial para evitar el desarrollo de resistencias a fármacos. En el caso de tuberculosis causada por cepas resistentes a los fármacos de primera línea, se utilizan los fármacos de segunda línea (etionamida, cicloserina, ácido p-amino salicílico, kanamicina, capreomicina, amikacina, fluoroquinolonas y linezolid), aunque estos fármacos son bacteriostáticos y poseen más contraindicaciones. Existe además, una vacuna contra la tuberculosis: el bacilo de Calmette-Guerin (BCG). Contiene bacilos tuberculosos de origen bovino (M. bovis) atenuados, sin embargo, no ofrece una protección total ya que no previene ni de la infección primaria en adultos ni de la reactivación de la tuberculosis pulmonar latente. No obstante, protege contra las formas diseminadas de la tuberculosis, por lo que es de uso general en aquellos países donde la tuberculosis es común. Introducción 4 Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis pertenece al dominio Bacteria, dentro de la clase Actinobacteria, del orden Actinomycetales, del suborden Corynebacterineae y de la familia Mycobacterium agrupándose finalmente en el complejo de Mycobacterium tuberculosis (Whitman 2012). Aunque filogenéticamente pertenece al grupo de bacterias Gram positivas, el alto carácter hidrofóbico de su pared celular, le confiere un carácter ácido-alcohol resistente y por esto solamente adquiere una leve coloración en la tinción de Gram. Por este motivo, las micobacterias suelen teñirse mediante la tinción de Ziehl-Neelsen. Es un bacilo delgado, recto o ligeramente curvado con bordes redondeados y cuyo tamaño suele oscilar entre 2-5 µm de longitud y 0,2-0,5 µm de anchura. Se caracteriza por ser un microorganismo aerobio estricto, inmóvil (no posee flagelos), no formador de esporas, con bastantes gránulos citoplasmáticos. Posee una velocidad de crecimiento muy lenta y actividades catalasa y nitrato reductasa. En 1998 se publicó la secuenciación del primer genoma de M. tuberculosis, concretamente de la cepa H37Rv (Cole, Brosch et al. 1998) y desde ese momento, la información genómica ha facilitado los estudios de patogenicidad, virulencia, fisiología, genética y resistencia a fármacos. Resistencia a fármacos y bombas de eflujo en M. tuberculosis La aparición de cepas de M. tuberculosis multirresistentes (MDR-TB, resistentes a los fármacos de primera línea isoniazida y rifampicina) y extremadamente farmacorresistentes (XDR-TB, cepas MDR-TB con resistencia adicional a las fluoroquinolonas y a uno de los tres medicamentos inyectables de segunda línea kanamicina, amikacina o capreomicina) ha complicado de forma dramática el control de esta enfermedad, debido a que en estos casos, las opciones terapéuticas disponibles quedan severamente limitadas. En todos estos casos, se trata de fenómenos de resistencia adquirida, porque las cepas resistentes presentan mutaciones en los genes que codifican las dianas de los fármacos o bien en las enzimas que activan algunos de los pro-fármacos. Por ejemplo, en el caso de la isoniazida, las cepas de M. tuberculosis presentan mutaciones en el gen que codifica la diana InhA o en el que codifica la enzima catalasa-peroxidasa KatG, que es la encargada de activar la isoniazida. Junto a estos fenómenos de resistencia adquirida, M. tuberculosis también presenta mecanismos de resistencia natural o intrínseca. En las bacterias en general, la resistencia intrínseca se debe a la ausencia de la diana, a la falta de permeabilidad de su pared celular, y a la expresión constitutiva o inducible de los sistemas de eflujo. Estos últimos se encargan de Introducción 5 expulsar los fármacos, facilitando así la adquisición de las mutaciones relevantes que conferirán altos niveles de resistencia. (Li, Livermore et al. 1994; Nikaido 2001; Ryan, Dougherty et al. 2001; Piddock 2006). (McMurry, Petrucci et al. 1980) fueron los primeros en demostrar que estas resistencias podían estar causadas por un eflujo activo. Desde entonces, este mecanismo ha sido reconocido como uno de los principales causantes de dicha resistencia (Nikaido 1994). Existe una gran cantidad de bombas de eflujo que se pueden clasificar en cinco familias; ATPBinding Cassette Superfamily (ABC), Major Facilitator Superfamily (MFS), Resistance Nodulation-Cell Division Superfamily (RND), Small Multidrug Resistance family (SMR) y Multidrug and Toxic Compound Extrusion (MATE). En el caso de las familias MFS, SMR, RND y MATE se trata de transportadores secundarios, normalmente impulsados por gradientes de protones (antiporters), mientras que los miembros de la familia ABC son considerados transportadores primarios porque utilizan la hidrólisis de ATP como fuente de energía. Destacar que en micobacterias la mayoría de las bombas de eflujo caracterizadas pertenece a la familia MFS (De Rossi, Arrigo et al. 2002). En concreto, este trabajo se ha hecho con la bomba de eflujo de M. tuberculosis Rv1258c (Tap), la cual pertenece a la familia MFS y se encuentra involucrada en resistencia a fármacos como la tetraciclina, estreptomicina, gentamicina y otros aminoglicósidos, además de otros procesos fisiológicos como son la respuesta frente al estrés oxidativo o cinética de crecimiento. La presencia de motivos conservados en su secuencia proteica ubicuos dentro de la familia MFS, el transporte de compuestos estructuralmente diferentes y su implicación en distintos procesos fisiológicos, sugieren que esta bomba tiene un papel vital en M. tuberculosis (Paulsen, Brown et al. 1996; Ainsa, Blokpoel et al. 1998; Silva, Bigi et al. 2001; Ramon-Garcia, Martin et al. 2006; Ramon-Garcia, Martin et al. 2009; Ramon-Garcia, Mick et al. 2012). Diagnóstico e identificación de cepas La limitada capacidad de diagnóstico ha sido un obstáculo crucial para controlar la tuberculosis en general, y en particular, los casos asociados al VIH y los causados por tuberculosis farmacorresistente. Por tanto, la ampliación de la capacidad para diagnosticar la tuberculosis, y en especial en los casos más graves, es una prioridad mundial para el control de esta infección (World Health Organization 2014). En los últimos años, gracias a los avances en el campo de la genómica de M. tuberculosis, la investigación sobre nuevos medios de diagnóstico de la tuberculosis se ha acelerado, y como resultado de ello el número de pruebas de diagnóstico en desarrollo ha ido creciendo rápidamente. Además, se han logrado caracterizar genéticamente diversos linajes o familias Introducción 6 genéticas de M. tuberculosis (Beijing, LAM, Haarlem, etc.), lo que ha permitido inferir su evolución y su predominio en las distintas regiones del mundo. El genotipo de M. tuberculosis ha sido esencial para la identificación de contaminaciones cruzadas, una tarea casi imposible antes del comienzo de las técnicas de biología molecular. Por su relevancia en este trabajo, se detallan las características más relevantes de la cepa H37Rv y de las cepas del linaje Beijing. La cepa H37 fue aislada originalmente en 1905 y llamó la atención por su gran virulencia en el conejillo de indias (una característica distintiva usada en la clasificación de la tuberculosis humana al comienzo del siglo XX). En 1934, se comenzó a distinguir entre H37 virulenta (Rv) y H37 avirulenta (Ra). Por lo que la cepa original aislada en 1905 quedo obsoleta, y las cepas H37Rv y H37Ra aisladas, han sido mantenidas desde entonces en la colección de micobacterias de Trudeau (TMC) y en la colección americana de cultivos tipo (ATCC). En ellas existen 18 variantes disponibles, 15 de H37Rv y 3 de H37Ra (Bifani, Moghazeh et al. 2000) que se usan mayoritariamente como cepas control o de referencia. Por otra parte, la capacidad de infección y la habilidad de las cepas de M. tuberculosis de la familia Beijing para propagarse con rapidez, muy probablemente es fruto de ventajas genéticas y mecanismos de virulencia no identificados todavía. Entre los mecanismos propuestos se encuentran, las reorganizaciones genéticas (inserciones IS6110 o delecciones) y la capacidad diferencial para modular la respuesta específica del hospedador. Las cepas del genotipo Beijing fueron descritas inicialmente en China y países vecinos en 1995, y desde entonces se han extendido por muchas regiones del mundo causando frecuentemente brotes epidémicos. Diferentes estudios han indicado que un tercio de los casos de tuberculosis son causados por cepas de la familia Beijing, lo que convierte a este linaje en una de las familias con mayor índice de mortalidad. Algunos estudios relacionan la hipervirulencia de estas cepas con una mayor producción de glicolípidos fenólicos, un factor de virulencia que atenúa el sistema inmune innato del huésped, a lo que se suma su ya conocida propensión a adquirir multirresistencia a antibióticos. La cepa clínica que se ha utilizado en este trabajo es M. tuberculosis GC1237, pertenece a la familia Beijing y ha sido responsable de brotes epidémicos en la isla de de Gran Canaria desde 1993. Hoy en día esta cepa continúa siendo predominante en este área debido a su rápida y exitosa diseminación dentro de la comunidad (Alonso, Aguilo et al.) Materiales y Métodos 13 Extracción de plásmidos (Mini-preparación) Reactivos: - Solución I (50 ml): - 1 ml EDTA 0,5 M pH 8,0 - 1,25 ml TRIS 1 M pH 8,0 - 5 ml Glucosa 0,5 M - 42,75 ml H2O - Solución II (10 ml): - 7 ml H2O - 1 ml SDS 10% (w/v) - 2 ml NaOH 1 M - Solución III (100 ml): - 60 ml KAc 5 M - 11,5 ml HAc glaciar - 28, 5ml H2O - NaAc 3 M - EtOH absoluto frío (-20˚C) - RNasa (1 µg/ml) - H2O estéril Procedimiento:  Se centrifugan 1,4 ml de cultivo, crecido previamente en medio LB, a 9600 g durante 3min. Se decanta el sobrenadante, se resuspende el pellet en 100 µl de Solución I y se deja incubar durante 5min a temperatura ambiente.  Se añaden 200 µl de Solución II, se mezcla suavemente invirtiendo el tubo hasta que el contenido tenga un aspecto viscoso y se incuba en hielo 5min.  Se añaden 150 µl de Solución III fría y se deja incubar en hielo 5min. Se centrifuga a 13800 g durante 10min y se transfiere el sobrenadante a un eppendorf nuevo.  Se añaden 0,1 volúmenes de NaAc y 2 volúmenes de EtOH, se invierte el tubo y se incuba 30 min a -20˚C. Se centrifuga a 13800 g durante 5min y se elimina el EtOH.  Se deja secar el precipitado, se resuspende el pellet en 50 µl de H2O estéril y se añade 1µl de RNasa para incubarlo a 37˚C durante 15min.  Finalmente, se cuantifica el plásmido extraído mediante medida de la absorbancia a 260nm en el nanodrop y se almacena a -20˚C. Cuando se necesitan mayores cantidades de DNA, se utiliza este mismo protocolo pero multiplicando los volúmenes de cultivo y de reactivos por 100. Materiales y Métodos 14 Digestiones de ácidos nucleicos. Las digestiones de ácidos nucleicos se realizaron en un volumen final de 40 L. Este contenía 3 L de la enzima de restricción, 4 L del tampón 10x correspondiente y una cantidad variable de DNA dependiendo de la concentración de este. La digestión se mantuvo a 37˚C durante 1h. Cuando fue necesario, las digestiones se llevaron a cabo en volúmenes diferentes, ajustando de modo proporcional la cantidad de los distintos componentes. Reactivos Ligación DNA 20 µl 10X Buffer 4 µl Enzima de restricciòn 3 µl H2O 13 µl Tabla 2. Reactivos y volúmenes requeridos para llevar a cabo la digestión. Resultados y Discusión 15 Resultados y Discusión Optimización MAMA PCR cepas H37Rv y GC1237 La reacción en cadena de la polimerasa o Polimerase Chain Reaction (PCR) consiste en la amplificación de fragmentos de DNA comprendidos entre dos zonas determinadas del genoma cuya secuencia es conocida. La técnica de la MAMA PCR (Mismatch Amplification Mutation Assay PCR) consiste en una PCR estándar con las 3 étapas características por ciclo de desnaturalización, annealing y elongación, pero posibilitando la amplificación específica de secuencias que difieren tan sólo en un nucleótido. Para ello utiliza cebadores con desapareamientos específicos en la región 3´ que permiten la amplificación mayoritaria de un tipo de alelo frente a otro. Por tanto puede constituir una herramienta de gran utilidad en la detección de mutaciones concretas y poco frecuentes (Cha, Zarbl et al. 1992). Esta técnica es rápida, simple y puede aplicarse facilmente para analizar cantidades de DNA genómico del orden de nanogramos (Saiki, Gelfand et al. 1988; Sarkar, Cassady et al. 1990). Sin embargo, uno de sus inconvenientes es que en ocasiones puede presentar baja sensibilidad, debido a que los cebadores con desapareamientos en la región 3´ son todavía capaces de amplificar inespecificamente las secuencias carentes de la mutación, bajo la mayor parte de las condiciones de PCR (Cha, Zarbl et al. 1992). (Kwok, Kellogg et al. 1990) estimaron la eficacia por ciclo de un cebador con un único nucleótido desapareado entre el 15% y el 50%, dependiendo de la naturaleza de la mutación. En un ensayo en el que se utilizo un alelo transformado del gen c-H-ras de rata (sustitución G-A, en el codon 12) se demostró que la MAMA PCR es suficientemente sensible para detectar 30 copias del alelo transformado presentes entre 3x106 copias del alelo wildtype (Cha, Zarbl et al. 1992). En este trabajo se ha propuesto el desarrollo de un protocolo basado en la técnica MAMAPCR para la detección del polimorfismo del gen Rv1258c característico de las cepas de la familia Beijing de M. tuberculosis. Esto implica explorar 2 variables principales: (1) el diseño de los cebadores con los desapareamientos específicos en función de la secuencia a amplificar, (2) la optimización de la tempetarura de annealing. Otras variables que puede ser necesario considerar son (3) el tiempo de elongación del cebador, (4) la optimización del número de ciclos de PCR, (5) la concentración de glicerol. Resultados y Discusión 16 Diseño de los cebadores Para llevar a cabo esta técnica se necesita diseñar 4 cebadores. Dos de estos cebadores son externos a la zona en la que se encuentra el polimorfismo genético, se denominaron Tap-1Fw y Tap-2-Rv, y se situaban upstream y downstream respectivamente del polimorfismo. Se diseñaron siguiendo las recomendaciones habituales para el diseño de cebadores para reacciones de PCR estándar. En el diseño de los otros dos cebadores específicos de la zona en la que se encuentra el polimorfismo, MAMATap1_Rv y MAMATap2_Fw, se siguieron las pautas marcadas por (Cha, Zarbl et al. 1992). Generaban dos desapareamientos en su extremo 3´ cuando se unían a a la secuencia del gen Rv1258c de la cepa de referencia H37Rv, mientras que al unirse a la secuencia del gen Rv1258c de las cepas de la familia Beijing (que se diferencia por la inserción de una citosina entre las posiciones 580 y 581) daban lugar a un único desapareamiento. Oligonucleótidos Secuencia Nº pb Tm Tap 1_Fw 5’ AGGCTGGTCGTTGGACCGCAT 3’ 21 74˚C Tap 2_Rv 5’ TTGCTGGTGGTCGGTGAAGT 3’ 20 68˚C MAMATap1_Rv 5’ TGCGGCTTGCCGGCACCCAG 3’ 20 81˚C MAMATap2_Fw 5’ ATTGCCGCCCTGCAACTCAC 3’ 20 71,7˚C Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados en la técnica de MAMA PCR (Cha, Zarbl et al. 1992). Señalar que Tap1_Fw y MAMATap2_Fw son cebadores directos, mientras que Tap2_Rv y MAMATap1_Rv son cebadores reversos tal y como indica su nombre. Figura 2. Representación de la secuencia de la cepa H37Rv con los oligonucleótidos MAMAtap2_Fw y MAMAtap1_Rv. Se puede apreciar como hibridan, generando dos desapareamientos en el extremo 3´que se muestran en rojo. La secuencia diana de la enzima XhoI, CTCGAG, se señala en amarillo. Resultados y Discusión 17 Figura 3. Representación de la secuencia de la cepa GC1237, como modelo de la familia Beijing con los oligonucleótidos MAMAtap2_Fw y MAMAtap1_Rv. Se puede apreciar como hibridan, generando un único desapareamiento en el extremo 3´que se muestra en rojo en la imagen. Por otro lado, el rectángulo en verde señala la inserción de citosina en la posición 581 característica de las cepas Beijing, que altera la secuencia diana de la enzima de restricción XhoI. Los cebadores se combinaron de forma apropiada para lograr la amplificación de los fragmentos de interés del gen Rv1258c o bien del gen completo: o Tap1_Fw – MAMATap1_Rv (MIX 1) o MAMATap2_Fw – Tap2_Rv (MIX 2) o Tap1_Fw – Tap2_Rv (MIX 3) El uso de la MIX 1 posibilitaría la amplificación de un fragmento del gen Rv1258c, que incluiría la región 5’ de dicho gen hasta la región donde puede encontrarse el polimorfismo. El fragmento amplificado tendría un tamaño de 196 pb, se obtendrá únicamente a partir de muestras de las cepas Beijing, y comprendería desde las bases 405 a 600. El uso de la MIX 2 posibilitaría la amplificación de un fragmento desde la región donde puede encontrarse el polimorfismo hasta la región 3’ del gen. El fragmento amplificado se obtendrá únicamente a partir de muestras de las cepas Beijing, tendría un tamaño de 208 pb y comprendería desde las bases 562 a 769. Por último con la MIX 3 se trataría de llevar a cabo un control interno de la técnica de PCR, es decir, corroborar que el proceso de amplificación se ha llevado a cabo correctamente y poder excluir falsos negativos causados por problemas de amplificación. Amplificaría un fragmento mayor que los anteriores, incluyendo la región en la que puede encontrarse la inserción de citosina en su región central. Tendría un tamaño de 365 pb en el caso de las cepas Beijing y de 364 pb en el caso del resto de muestras, comprendería desde las bases 405 a 769/768 y se obtendrá a partir de cualquier muestra de DNA de M. tuberculosis. Resultados y Discusión 18 Optimización de la temperatura de annealing Teniendo en cuenta las diferentes Tm de los cebadores y el criterio aproximado de que la temperatura de annealing tiene que ser 5˚C menor que la del cebador con menor Tm, se ensayaron las siguientes temperaturas: 63, 66 y 69˚C. Puesto que a valores excesivamente mayores que la Tm de los cebadores, el proceso de amplificación es altamente restrictivo y es posible que no se lleve a cabo o bien tener un rendimiento muy bajo. Del mismo modo, la amplificación tampoco transcurre correctamente si se emplean temperaturas de annealing mucho menores que la Tm de los cebadores, ya que entonces el proceso es altamente inespecífico, obteniéndose productos de amplificación indeseados. Otros parámetros a considerar Se seleccionó un tiempo de elongación de 1 minuto, en función del tamaño de los productos que se esperaba obtener. En cuanto al número de ciclos de PCR, se optó desde el primer momento por 35 ciclos de PCR. Finalmente, en relación a la concentración de glicerol, se optó por no añadir glicerol más allá del presente en los propios tampones de los reactivos para la PCR (kit “MyTaqTM DNA Polymerase”). Una vez seleccionadas las condiciones de la MAMA PCR, se ensayaron frente a dos muestras de DNA de M. tuberculosis, procedentes de dos cepas de referencia, GC1237 como representante de la familia Beijing y H37Rv como ejemplo de cepa no perteneciente a dicha familia y que al mismo tiempo constituye la cepa modelo para el estudio de la tuberculosis en los laboratorios. Se utilizó el protocolo general de amplificación de productos por PCR que se menciona en el apartado Materiales y Métodos. El resultado de amplificación se muestra en las figuras 4,5 y 6. 1Marcador DNA lambda digerido con PstI 2 - DNA H37Rv, 63˚C 3 - DNA GC1237, 63˚C 4 - Control negativo, 63˚C 5 - DNA H37Rv, 66˚C 6 - DNA GC1237, 66˚C 7 - Control negativo, 66˚C 8 - DNA H37Rv, 69˚C 9 - DNA GC1237, 69˚C 10Control negativo, 69˚C Figura 4. Electroforesis donde se aprecian los resultados de la amplificación del DNA de las cepas H37Rv y GC1237, con la combinación de cebadores MIX1. Se analizaron las temperaturas de annealing de 63˚C, 66˚C y 69˚C. La banda que se observa tiene un tamaño de 196 pb. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Resultados y Discusión 19 1Marcador 100pb 2DNA H37Rv, 63˚C 3DNA GC1237, 63˚C 4Control negativo, 63˚C 5DNA H37Rv, 66˚C 6DNA GC1237, 66˚C 7Control negativo, 66˚C 8DNA H37Rv, 69˚C 9DNA GC1237, 69˚C 10Control negativo, 69˚C Figura 5. Electroforesis donde se aprecian los resultados de la amplificación del DNA de las cepas H37Rv y GC1237, con la combinación de cebadores MIX2. Se analizaron las temperaturas de annealing de 63˚C, 66˚C y 69˚C. La banda que se observa tiene un tamaño de 208 pb. 1Marcador 100 pb 2 - DNA H37Rv, 63˚C 3 - DNA H37Rv, 66˚C 4 - DNA H37Rv, 69˚C 5 - Marcador 100 pb 6 - DNA GC1237, 63˚C 7 - DNA GC1237, 66˚C 8 - DNA GC1237, 69˚C 9 - Control negativo, 63˚ C 10 -Control negativo, 66 ˚C 11-Control negativo, 69˚C Figura 6. Electroforesis donde se aprecian los resultados de la amplificación del DNA de las cepas H37Rv y GC1237, con la combinación de cebadores MIX3 que sirve como control interno de que la PCR funciona e indica que la muestra contiene DNA . Se analizaron las temperaturas de annealing de 63˚C, 66˚C y 69˚C. La banda que se observa tiene un tamaño de 364 pb en el caso de H37Rv y de 365 pb en el caso de GC1237. Señalar que las banda de 100 pb del marcador no se muestra en el pocillo 1, así como las bandas de 100 y 200 pb del marcador en el pocillo 5. Como se puede apreciar en las figuras 4,5 y 6, las amplificaciones funcionaron bien con las tres temperaturas y se seleccionó la temperatura de 63˚C porque producía las bandas de mayor intensidad en MIX1, MIX2 y MIX3. Con esto, se llegó a la conclusión de que, en las condiciones de ensayo, tanto la MIX1 como la MIX2 son capaces de diferenciar las dos cepas de referencia y por lo tanto, este método tiene utilidad para diagnosticar la presencia de cepas de M.tuberculosis de la familia Beijing. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Resultados y Discusión 20 Aplicación del protocolo de MAMA PCR a nuevas muestras Una vez optimizado el protocolo con las cepas de referencia, se probó con DNA aislado de cuatro cultivos de cepas clínicas de M. tuberculosis pertenecientes a la colección de muestras de DNA del laboratorio y que incluía cepas tanto de la familia Beijing como de otros linajes. En tres de estas muestras se pudo determinar con este protocolo si las muestras correspondían con cepas de la familia Beijing (muestra B1) o con cepas no-Beijing (muestras A1 y A2), tal como se aprecia en la siguiente figura. La muestra B2 que había sido tipada por otros métodos como “Beijing-like” sin embargo, no dio el resultado esperable para las cepas de la familia Beijing. Esto indica que este tipo de cepas, cuya pertenencia al linaje Beijing no termina de estar claro, y de las que se desconoce si presentan este polimorfismo o no, en principio se identifican por este método como si no pertenecieran al linaje Beijing. 1 - DNA cepa B1, MIX1 2 - DNA cepa B1, MIX3 3 - Marcador 100 pb 4 - DNA cepa B2, MIX1 5 - DNA cepa B2, MIX3 6 - Marcador 100 pb 7 - Marcador 100 pb 8 - DNA cepa A1, MIX1 9 - DNA cepa A1, MIX3 10 - DNA cepa A2, MIX1 11 - DNA cepa A2, MIX3 Figura 7. Resultados de la amplificación del DNA de cuatro muestras de DNA procedentes de cultivos celulares, utilizando el protocolo de MAMA PCR con una temperatura de annealing de 63˚C y con la combinación de oligonuclótidos MIX1 y MIX3: una cepa Beijing (B1), una cepa Bejing-like (B2) y dos cepas no Beijing (A1 y A2). Finalmente, el protocolo se probó frente a muestras de esputos. Por tratarse de muestras que “a priori” pueden tener un bajo contenido en DNA de M. tuberculosis, y que además pueden contener inhibidores de la reacción de polimerización. En primer lugar se llevo a cabo la reacción con la MIX3, que al tratarse del control positivo debe amplificar en todo tipo de cepas. Como se aprecia en la siguiente figura, en todas las muestras ensayadas el rendimiento de la reacción de amplificación fue notablemente menor al de las muestras control (DNA de las cepas H37Rv y GC1237), obteniéndose en el caso de la muestra Bc el mayor rendimiento. 1 2 3 7 8 9 10 11 4 5 6 Resultados y Discusión 21 1Marcador 100 pb 2DNA cepa H37Rv 3DNA cepa Hb 4DNA cepa Hc 5DNA cepa Hd 6DNA cepa He 7DNA cepa GC1237 8DNA cepa Bb 9DNA cepa Bc 10Control negativo 11Marcador 100 pb Figura 8. Resultados de la amplificación del DNA de las dos muestras de referencia (H37Rv y GC1237) y 6 muestras de DNA procedentes de esputos, utilizando el protocolo de MAMA PCR con una temperatura de annealing de 63˚C y con la combinación de oligonucleótidos MIX3: las cepas Hb, Hc, Hd y He son no Beijing, mientras que las cepas Bb y Bc son cepas Beijing. Al llevar a cabo las reacciones con las mezclas MIX1 y MIX2, únicamente apareció una débil amplificación en el caso de la muestra Bc en la reacción con la mezcla MIX2, lo que permitía identificarla como cepa Beijing. En el caso de las muestras que contenían cepas no-Beijing, utilizando la reacción con MIX1 se observó la amplificación de diversas bandas de DNA, sin embargo o bien su tamaño no corresponde con el que se obtiene a partir del DNA de las cepas Beijing, o bien su intensidad es muy débil en comparación con los controles. En principio la falta de amplificación de una banda del tamaño esperable o en cantidad detectable permite identificar las cepas como no pertenecientes a la familia Beijing, aunque esta conclusión sería más sólida si la amplificación con la reacción MIX3 hubiera dado lugar a un producto más abundante. 1Marcador 100 pb 2 - Pocillo vacío 3DNA GC1237 4DNA cepa Bb 5 - DNA cepa Bc 6Control negativo 7Marcador 100 pb 8 - DNA H37Rv 9DNA cepa Hb 10DNA cepa Hc 11 - DNA cepa Hd 12DNA cepa He Figura 9. Resultados de la amplificación del DNA de las dos muestras de referencia (H37Rv y GC1237) y 6 muestras de DNA procedentes de esputos, utilizando el protocolo de MAMA PCR con una temperatura de annealing de 63˚C y con la combinación de oligonucleótidos MIX1: las cepas Hb, Hc, Hd y He son no Beijing, mientras que las cepas Bb y Bc son cepas Beijing. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Resultados y Discusión 22 1Marcador 100 pb 2 - Pocillo en blanco 3DNA GC1237 4DNA cepa Bb 5 - DNA cepa Bc 6Control negativo 7Marcador 100 pb 8DNA H37Rv 9DNA cepa Hb 10DNA cepa Hc 11 - DNA cepa Hd 12DNA cepa He Figura 10. Resultados de la amplificación del DNA de las dos muestras de referencia (H37Rv y GC1237) y 6 muestras de DNA procedentes de esputos, utilizando el protocolo de MAMA PCR con una temperatura de annealing de 63˚C y con la combinación de oligonucleótidos MIX2: las cepas Hb, Hc, Hd y He son no Beijing, mientras que las cepas Bb y Bc son cepas Beijing. Clonaje del gen Rv1258c de la cepa GC1237, perteneciente a la familia Beijing de M. tuberculosis, en el vector pGEM -T En trabajos anteriores (Ainsa, Blokpoel et al. 1998) se ha clonado el gen Rv1258c de la cepa H37Rv de M. tuberculosis en el vector pSUM36, para después introducirlo en M. smegmatis. Esto permitió estudiar los niveles de resistencia a antibióticos que confiere esta bomba de eflujo en M. smegmatis una especie de micobacteria de crecimiento rápido y no patógena, que se utiliza como modelo de estudio de la función de proteínas de M. tuberculosis. Sin embargo, puesto que no se ha estudiado la función de la proteína Rv1258c de las cepas de la familia Beijing, otro objetivo de este trabajo ha sido clonar este gen, en condiciones similares al clonaje realizado previamente a partir de la cepa H37Rv. En primer lugar, se llevo a cabo la amplificación del gen Rv1258c a partir de DNA de la cepa GC1237 de M. tuberculosis con los oligonucleótidos Tap4 (directo, 5’ ATGCTGCAGATCTCGAACGACGA 3’) y Tap5 (reverso, 5’CGCCTGCAGCCAGGGTGAGCATGTCA 3’) utilizando el protocolo general de amplificación de DNA por PCR descrito en la sección de Materiales y Métodos con una temperatura de annealing de 63˚C. Estos oligonucleótidos habían sido diseñados previamente (Silva 2001) a partir de la secuencia de este gen en el genoma de M. tuberculosis H37Rv y dan lugar a un producto de amplificación de 2,3 kb, que incluye 634 pb delante del codón de iniciación y 415 pb detrás del codón de parada del gen Rv1258c. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12