Repositorio Institucional de Documentos

FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular “Obtención y caracterización de proteínas Fur de microorganismos de interés biotecnológico y sanitario” Proyecto de Fin de Grado en Biotecnología dirigido por María F. Fillat y Laura Botello-Morte Álvaro Artiga Folch Curso 2013/2014 Índice 1. Resumen/ Abstract …………………………..…………………………………………………….…………1 2. Antecedentes ………………………………………..……………………………………………………………2 2.1 Introducción a las proteínas Fur …………………………………………………………………2 2.2 Fur de Staphylococcus aureus ……………………………….……………………………………3 2.3 Fur de Legionella pneumophila ………………………………….………………………………4 3. Objetivos ……………………………………………………………………………………………………………..5 4. Materiales y métodos ………………………………………………………………….……………………6 4.1 Cepas, plásmidos y medios de cultivo utilizados …………………………………………6 4.2 Clonaje de fur de L. pneumophila y fur de S. aureus ………………………………….6 4.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) …………………………………..6 4.2.2 Electroforesis de DNA …………………………………………………………………..6 4.2.3 Purificación y cuantificación de DNA ……………………………………………..7 4.2.4 Doble digestión y ligación ……………………………………………………..……...7 4.2.5 Preparación de células quimiocompetentes …………………………………8 4.2.6 Transformación de células quimiocompetentes …………………………..8 4.3 Sobreexpresión de Fur de S. aureus y L. pneumophila en E. coli y obtención de biomasa ………………………………..………………………………………………………….…………8 4.3.1 Sobreexpresión de Fur ………………………………….………………………………8 4.3.2 Electroforesis de proteínas …………………….…………………………………….8 4.3.3 Obtención de biomasa de E. coli ……………………………………………………9 4.4 Purificación y caracterización parcial de Fur de S. aureus ……………..……………9 4.4.1 Empaquetamiento de la columna de afinidad a metales ………………9 4.4.2 Obtención del extracto crudo ……………………………………………………….9 4.4.3 Purificación por cromatografía de afinidad a metales …………………..9 4.4.4 Diálisis de la proteína y cuantificación …………………………………………10 4.4.5 Espectroscopia de absorción molecular y cuantificación ……………..10 4.4.6 Pruebas de renaturalización de la proteína ………………………………..10 4.4.7 Análisis de oligomerización: ensayo de entrecruzamiento y ensayo de reducción..………………………………………………………………………………………10 4.4.8 Ensayo de actividad de unión al DNA ………….……………………………...11 5. Resultados …………………………………………………………………………………………………………12 5.1 Clonaje de fur de S. aureus y L. pneumophila ……………………………………………12 5.1.1 Obtención de plásmidos e insertos ……………..………………………………12 5.1.2 Doble digestión y ligación ………………….……………………………………….12 5.1.3 Transformación de células quimiocompetentes ……………….…………13 5.2 Sobreexpresión y obtención de biomasa …………………………………………………14 5.3 Purificación de Fur de S. aureus ………………………………………………………………..14 5.4 Resuspensión de Fur de S. aureus ..…………………………………………………………..16 5.5 Análisis de oligomerización ………………………………………………………………………17 5.6 Análisis de interacción con el DNA ……………………………………………………………18 6. Discusión ……………………………………………………………………………………………………………20 7. Conclusiones/ Conclusions ……….…………………………………………………………………..23 8. Bibliografía ………………………………………………………………………………………………………..24 9. Anexo …………………………………………………………………………………………………………….……26 Tabla 9.1 Cepas y plásmidos utilizados ………………………………………………….………26 Tabla 9.2 Mezclas de reacción para PCR ............................................................26 Tabla 9.3 Cebadores utilizados para PCR ………………………………………………….……27 Tabla 9.4 Composición para dos geles SDS-PAGE al 15 % ……………………….…..…27 Tabla 9.5 Composición para dos geles EMSA al 6 % ………………………………………28 Abreviaturas Abs Absorbancia Ac Ácido acético APS Ammonium persulfate (persulfato amónico) ATCC American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) BSA Bovine serum albumin (albúmina sérica bovina) DNA Ácido desoxirribonucleico dNTPs Desoxirribonucleótidos trifostato D.O. 600 Densidad óptica a 600 nm DTT 1,4-ditiotreitol EDC Clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida EDTA Ácido etilen-diamino-tetraacético EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay (ensayo de retardo en gel) EtOH Etanol Fur Ferric uptake regulator (regulador de la adquisición del hierro) Fur Lp Fur de Legionella pneumophila Fur Sa Fur de Staphylococcus aureus g Gramo GST Glutatión S-transferasa h Hora HAc Ácido acético HTH Helix-turn-helix (dominio hélice-giro-hélice) ICP Plasma de acoplamiento inductivo IMAC Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados) IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido kb Kilobase kDa Kilodalton Kmr Resistencia a kanamicina l Litro LB Medio de cultivo Luria-Bertani M Concentración molar mA Miliamperio MBP Maltose Binding Protein (proteína de unión a maltosa) mg Miligramo min Minuto ml Mililitro mM Concentración milimolar ng Nanogramo NHS N-hidroxisuccinimida nm Nanómetro nM Concentración nanomolar O/N Overnight (toda la noche) P alr0523 Promotor del gen alr0523 de Anabaena sp. PCC 7120 PCC Colección de cultivos del Institut Pasteur PCR Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) P furA Promotor del gen furA de Anabaena sp. PCC 7120 PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo P sir Promotor del gen sir de S. aureus p/p Relación peso/peso p/v Relación peso/volumen RNA Ácido ribonucleico ROS Reactive Oxygen Species (especies reactivas de oxígeno) rpm Revoluciones por minuto s Segundo SDS Sodium Dodecyl Sulfate (dodecil sulfato sódico) SDS-PAGE SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS) TBE Tris Borato EDTA TEMED N,N,N’,N’-tetra-metiletilendiamina U Unidad de actividad enzimática V Voltio v/v Relación volumen/volumen X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido ε Coeficiente de extinción molar °C Grado centígrado µg Microgramo µl Microlitro µm Micrómetro µM Concentración micromolar 1. Resumen Fur (Ferric uptake regulator) es un regulador global responsable de mantener la homeostasis del hierro en la mayor parte de procariotas. En muchos patógenos, Fur es esencial para la expresión de factores de virulencia [1] y la colonización de los tejidos infectados, por lo que Fur se considera una prometedora futura diana en la búsqueda de nuevos fármacos. En este trabajo se ha llevado a cabo el clonaje de las proteínas Fur de Legionella pneumophila y Staphylococcus aureus en un vector de expresión, se han sobreexpresado en Escherichia coli y se ha llevado a cabo una purificación y una primera caracterización de la proteína Fur de S. aureus, consistente en conocer algunas características básicas de la proteína, así como comprobar que ha mantenido su actividad. Se han elegido estos dos microorganismos ya que ambos son importantes patógenos humanos y pertenecen a grupos distintos, puesto que L. pneumophila se trata de una bacteria Gram negativa, mientras que S. aureus es Gram positiva. Esta primera caracterización tiene como objetivo conseguir toda la información posible que permitirá diseñar una estrategia de búsqueda de potenciales inhibidores mediante cribado de una quimioteca. Por tanto este trabajo se enmarca dentro de un proyecto más amplio de búsqueda de potenciales antimicrobianos basados en la inhibición de la proteína Fur en diferentes microorganismos patógenos. Abstract Fur (Ferric uptake regulator) is a global regulator responsible for maintaining iron homeostasis in most prokaryotes. In some pathogens, Fur is essential for the expression of virulence factors and infected tissues colonization. For this case Fur is considered a promising target at the future searching of novel drugs. In this project, Fur proteins from Legionella pneumophila and Staphylococcus aureus have been cloned and overexpressed in Escherichia coli. Subsequently, the Fur protein from S. aureus has been purified and firstly characterized so the basic features are known and the activity is maintained. These microorganisms were chosen because both of them are important human pathogens and belong to different groups, as L. pneumophila is a Gram negative bacteria and S. aureus is a Gram positive bacteria. The purpose of this first characterization is to obtain as much information as possible so a new strategy for searching potential inhibitors can be designed by a chemical library sieve. Therefore this project is a part of a bigger project pointed to find potential antimicrobial agents based on the Fur protein inhibition in different pathogen microorganisms. 1 2. Antecedentes 2.1 Introducción a las proteínas Fur A pesar de que el hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre, su biodisponibilidad es muy baja en ambientes aerobios [2], lo que lo convierte en un micronutriente esencial para la mayoría de organismos procariotas. Está presente en diversos grupos prostéticos, como el grupo hemo y los grupos sulfoférricos, y cumple funciones estructurales o como catalizador en determinadas enzimas. Esta baja disponibilidad ha llevado a los microorganismos a almacenar el hierro en depósitos intracelulares como las proteínas ferritina o bacterioferritina [3]. También se han desarrollado diversos mecanismos para la obtención del hierro, como la acidificación del medio para aumentar la solubilidad del Fe3+, la reducción de Fe3+ a Fe2+ (más soluble a pH fisiológico) y la quelación con sideróforos que unen Fe3+, solubilizándolo [4]. Por otro lado, el exceso de hierro en el organismo puede ser altamente tóxico ya que mediante la llamada reacción de Fenton, el Fe2+ potencia el efecto tóxico de las especies reactivas de oxígeno (ROS) catalizando la descomposición del H2O2 para formar el OH∙. Por tanto, el control de todos estos procesos para mantener la homeostasis del hierro es muy importante y las proteínas Fur (ferric uptake regulator) son las principales responsables de este proceso. En muchos patógenos humanos también regulan importantes factores de virulencia [19]. Además, las proteínas Fur están englobadas en una superfamilia de metalorreguladores implicados en el estrés oxidativo y el metabolismo de otros metales: Zur (zinc uptake regulator), Mur (manganese uptake regulator), Nur (nickel uptake regulator), PerR (peroxide stress response regulator) y el regulador de la respuesta a hierro hemodependiente, Irr [11]. El mecanismo clásico aceptado para el funcionamiento de las proteínas Fur consiste en que la coordinación de Fe2+ [5] causa un cambio conformacional que provoca la unión a los promotores de sus genes diana en secuencias ricas en A/T [6] formando dímeros de forma general para reprimir la transcripción del DNA. Las proteínas Fur se componen de una región C-terminal de dimerización y de un dominio de unión a DNA del tipo WH (winged helix), situado en el extremo N-terminal. El dominio de unión a metales es responsable de la dimerización y contienen el motivo HHHXHXXCXXC al comienzo del dominio C-terminal [1]. En algunos miembros de la familia se ha encontrado zinc con función estructural estabilizando la forma dimérica [7] y se ha descrito que es necesario que las cisteínas de la proteína se encuentren en estado reducido para mantener a la proteína Fur de E. coli en estado dimérico [8]. Esta estructura es muy general y algunas proteínas de la familia no se ajustan a ella, como Fur de Helicobacter pylori [9]. La caja Fur de E. coli, secuencia consenso de DNA a la que se une Fur, consiste en dos motivos GATAAT separados por una base de un tercer hexámero similar en la orientación inversa [10]. Tradicionalmente se ha considerado que Fur interaccionaba con el DNA para actuar como represor como un dímero de Fur-Fe2+, pero se están encontrando casos en los que Fur modula (activa o reprime) a sus genes diana como apoproteína o los activa en la forma Fur-Fe2+ [12], mediante posicionamiento directo de la 2 RNA polimerasa o de forma indirecta mediante el desplazamiento de una proteína que evite la unión de la RNA polimerasa. También se han descrito funciones de Fur a través de la represión de genes que codifican RNAs antisentido[13]. Las proteínas Fur parecen tener otras funciones, ya que algunas son capaces de interaccionar con moléculas señalizadoras como el grupo hemo, el NO y el CO [14] y con otras proteínas que responden al estrés oxidativo, por lo que podrían participar en respuestas detoxificantes. Recientemente se ha descrito la capacidad de reducir puentes disulfuro de la proteína FurA de Anabaena [15]. También se ha descrito su participación en diversos procesos como la tolerancia a ácido, la captación de riboflavina, la formación de biofilms, la respuesta a estrés osmótico, la regulación del quorum sensing, la resistencia a cianuro, el control de la respiración y la diferenciación de los heterocistos en las cianobacterias [1]. La regulación de las proteínas Fur es muy compleja. La regulación principal suele producirse mediante unión de las mismas a sus propios promotores. En su regulación también intervienen reguladores transcripcionales de respuesta al nivel de hierro y otros que responden a ROS, a Mn2+ y a las reservas intracelulares de carbono y nitrógeno [1]. También se ha descrito regulación postranscripcional mediante RNAs antisentido [16] y mediante modificaciones postraduccionales que impiden su unión al DNA o el cambio en el estado redox de sus cisteínas [1]. 2.2 Fur de Staphylococcus aureus S. aureus es una bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva, con forma de cocos de 0,5 a 1,5 µm de diámetro, catalasa y coagulasa positiva, no esporulada, ampliamente distribuida y productora de gran variedad de enzimas y toxinas. Puede producir una amplia gama de enfermedades, desde infecciones cutáneas hasta enfermedades de riesgo vital como meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía y causa amplios problemas hospitalarios por la adquisición de resistencia a antibióticos [17]. La proteína Fur de S. aureus (Fur Sa en el resto del trabajo) detecta los cambios en la disponibilidad del hierro y modifica la expresión de una gran cantidad factores de virulencia. Estos cambios mediados por Fur protegen a S. aureus frente al ataque de los neutrófilos y se ha demostrado que Fur es necesaria para mantener la virulencia en modelo murino. Concretamente se ha observado que en mutantes de S. aureus con delección en el gen fur la expresión de proteínas inmunomoduladoras decrece [18]. También se ha descrito la importancia de Fur en la resistencia a estrés oxidativo, ya que las cepas con el gen fur inactivado presentan menor actividad catalasa [19]. El gen fur de S. aureus presenta un alto grado de homología con el gen fur de Bacillus subtilis. Se ha encontrado una caja Fur conservada en S. aureus en el promotor del operon fhu, un operon que se cree que regula la entrada de ferricromo (un sideróforo) [20]. Se ha descrito que la proteína Fur Sa, de 149 aminoácidos, presenta un dominio de unión a metales 3 0-1 M de imidazol en el tampón de unión a 2 ml/min mientras se recogían alícuotas de 1 ml que se han guardado a 4 °C. Las fracciones proteicas se han analizado mediante electroforesis desnaturalizante. La matriz se ha regenerado haciendo pasar 10 volúmenes de agua milliQ, 0,5 volúmenes tampón de lavado (0,2 M EDTA, 0,5 M NaCl), seguido de 5 volúmenes de NaCl 0,5 M y 5 volúmenes de agua milliQ, siguiendo las instrucciones del fabricante. La matriz regenerada se ha conservado a 4 °C en 20 % (v/v) EtOH. 4.4.4 Diálisis de la proteína La proteína se dializó a 4 °C en tampón de diálisis (50 mM Tris/HCl pH 8, 100 mM de NaCl y 10 % (v/v) glicerol), cambiando el tampón cada 2-3 horas al menos 3 veces. Posteriormente se han centrifugado las muestras a 4000 rpm y 4 °C durante 15 min para desechar los posibles precipitados. Las alícuotas se han guardado a -20 °C. 4.4.5 Espectroscopia de absorción molecular y cuantificación Se ha realizado un espectro de absorción de las muestras desde 250 a 700 nm con un equipo Specord® 250 Plus (Analytikjena). La cuantificación de la proteína purificada se ha llevado a cabo midiendo la absorbancia a 280 nm y aplicando la Ley de Beer-Lambert (Abs=ε.c.l), utilizando como blanco el tampón de diálisis y usando el coeficiente de extinción teórico de la proteína suministrado por el servidor ProtParam de ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/) para la proteína oxidada (ε280nm= 4720 mM-1 cm-1). 4.4.6 Pruebas de renaturalización de la proteína Dado que en los pellets del extracto crudo se detecta gran cantidad de Fur Sa precipitada, se ha decidido intentar renaturalizar y resolubilizar la proteína utilizando cloruro de guanidinio y urea, dos potentes agentes caotrópicos que ya han demostrado su eficacia como renaturalizantes proteicos [24]. Una alícuota de pellet del extracto crudo se ha incubado con tampón de unión con cloruro de guanidinio 2 M (GndCl) y otra con tampón de unión con urea 6 M. Después se han centrifugado ambas a 14000 rpm y 4 °C durante 20 minutos para separar los sobrenadantes de los pellets. Se ha realizado un espectro de absorción y se han sometido a electroforesis SDS-PAGE. 4.4.7 Análisis de oligomerización: ensayo de entrecruzamiento y ensayo de reducción En el ensayo de entrecruzamiento se ha incubado Fur Sa (65 µM) durante 15 min en oscuridad con 2 mM Clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y 2 mM Nhidroxisuccinimida (NHS) seguido de una electroforesis SDS-PAGE. En el ensayo de reducción se ha incubando Fur Sa (65 µM) durante 10 min con 10 mM de 1,4ditiotreitol (DTT) y se ha llevado a cabo una electroforesis SDS-PAGE no reductora utilizando tampón de carga sin β-mercaptoetanol. 10 4.4.8 Ensayo de actividad de unión al DNA Los ensayos de actividad de unión al DNA (EMSA) se han realizado en condiciones nativas con geles de poliacrilamida al 6% cuya composición se detalla en el anexo, tabla 9.5. El tampón de electroforesis se ha preparado con una composición de 10 mM Tris, 100 µM MnCl2 y pH 7,5 ajustado con 1 M de ácido bórico [20]. Los geles se han precorrido 45-60 min a 4 °C y 60 V para equilibrar el sistema. El tampón de unión utilizado para Fur Sa contenía 100 mM de MnCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM KCl, 10 mM Tris, ajustado a pH 7,5 con 1 M de ácido bórico [20] y el tampón de carga utilizado fue 40 % (p/v) de sacarosa, 0,1 % (p/v) de naranja de xilenol, 0,1 % (p/v) de azul de bromofenol en el tampón de unión empleado [20]. El tampón de unión utilizado para la proteína FurA de Anabaena sp. PCC 7120 (utilizada como control positivo del EMSA) contenía 10 mM Bis Tris pH 7,5, 40 mM KCl, 100 µM de MnCl2, 1 mM MgCl2 y 5 % glicerol [15] y el tampón de carga empleado ha sido el mismo que para Fur Sa. Cada muestra se ha preparado en un volumen final de 20 µl, con 40 ng de DNA inespecífico de la región promotora del gen alr0523 de Anabaena sp. PCC 7120 (Palr0523), 40 ng de DNA específico (promotor del operon sir de S. aureus (Psir) para Fur Sa [20] y promotor del gen furA de Anabaena sp. PCC 7120 (PfurA) para el control positivo [15]) y 0,01 mg/ml de BSA en el tampón de unión adecuado. Los fragmentos de DNA se han obtenido mediante amplificación por PCR a partir de DNA genómico de S. aureus o Anabaena sp. PCC 7120. Se han utilizado concentraciones de proteína entre 500 nM y 1200 nM en presencia o ausencia de 1 mM DTT según la muestra. Las mezclas de reacción se han incubado durante 15 min a temperatura ambiente antes de añadirles 3 µl del tampón de carga y cargarlas en el gel. Los geles se han corrido a 90 V y 4 °C durante 2 h. Para visualizar los resultados, se han teñido los geles con 50 ml de tampón de electroforesis a los que se les añadió 5 µl de Vistra GreenTM 10000X (Amersham Biosciences), durante 20 min, en agitación suave y oscuridad. Los resultados se visualizaron con un Gel Doc 2000 (Bio-Rad). 11 5. Resultados 5.1 Clonaje de fur de S. aureus y L. pneumophila 5.1.1 Obtención de plásmidos e insertos El plásmido pET-28a se ha obtenido mediante miniprep a partir de células E. coli DH5α que contenían el vector, se ha cuantificado y se ha comprobado mediante electroforesis (figura 5.1 A). El inserto del gen fur de L. pneumophila y del gen fur de S. aureus se ha obtenido mediante PCR a partir del DNA genómico de cada uno. A continuación se han comprobado la PCR por electroforesis (figura 5.1 B y C), se han purificado los insertos y se han cuantificado. Las electroforesis han permitido comprobar que las bandas amplificadas tienen el tamaño correcto y que la amplificación ha sido específica ya que no hay más fragmentos de DNA detectables. Figura 5.1. Amplificación de los insertos y purificación de pET-28a. Purificación de pET-28a (A): carril 1: plásmido purificado; carril M: marcador de peso molecular. Amplificación del gen fur de L. pneumophila (B) y de S. aureus (C): carril M: marcador de peso molecular; carril +: producto de PCR; carril -: control negativo de la PCR (sin DNA molde). 5.1.2 Doble digestión y ligación Primero se ha realizado una digestión de vector pET-28a con las enzimas de restricción NcoI y HindIII simultáneamente, seguida de una electroforesis para comprobar que ha ido correctamente (figura 5.2), donde no se aprecia plásmido sin digerir. Figura 5.2. Doble digestión de pET-28a con NcoI y HindIII : carril M: marcador de peso molecular; carril 1: pET28a digerido; carril 2: pET-28a control (sin digerir). A continuación se ha efectuado la digestión con las enzimas NcoI y HindIII simultáneamente y en las mismas condiciones del inserto de fur de L. pneumophila (Lp). Se ha realizado una electroforesis como comprobación y se ha purificado y cuantificado. El inserto de fur de S. aureus (Sa) se ha digerido en primer lugar con PagI, a continuación se ha purificado, se ha 12 digerido con HindIII, purificado y cuantificado. Posteriormente se ha llevado a cabo la ligación de cada uno de los insertos digeridos con el pET-28a digerido, obteniéndose los plásmidos de sobreexpresión pET-28a:fur Sa y pET-28a:fur Lp. 5.1.3 Transformación de células quimiocompetentes Se han preparado células quimiocompetentes de las cepas DH5α y BL21 de E. coli y se han mantenido congeladas a -80 °C hasta su uso. A continuación se han transformado las células DH5α mediante choque térmico con las mezclas de ligación pET-28a:fur Sa, pET-28a:fur Lp y pET-28a digerido y ligado sin inserto como control negativo. Las células transformadas se han sembrado en placas de LB agar con kanamicina, viéndose un bajo número de colonias en el control negativo, indicativo de que la digestión ha sido correcta y no se ha producido recircularización en gran medida. De cada una de las dos placas transformadas con las ligaciones se han cogido 10 colonias con un palillo, se han replicado en otras dos placas con kanamicina y se ha llevado a cabo una PCR seguida de una electroforesis para comprobar que realmente portan los insertos deseados. En la figura 5.3, correspondiente a la PCR de colonias transformadas con pET-28a:fur Lp, se puede ver que 4 de las 10 colonias replicadas portan realmente el plásmido de interés; el resto posiblemente hayan incorporado el plásmido recircularizado o sin digerir a pesar de que no se detectaba plásmido sin digerir en las etapas anteriores (figura 5.2). Figura 5.3 PCR de colonias transformadas con pET-28a:fur Lp. Carril M: marcador de peso molecular (medido en pb); carriles 1-10: distintas colonias; carril +: DNA genómico de L. pneumophila (control positivo de la PCR); carril DH5α: E. coli DH5α sin transformar (control negativo); carril pET-28a: pET-28a sin inserto (control negativo); carril -: control negativo de la PCR. A continuación se han seleccionado las colonias 7 y 8 de la figura, se han cultivado en medio LB líquido con kanamicina y se han purificado los plásmidos mediante miniprep para enviarlos al servicio de secuenciación de la Universidad de Zaragoza. Este mismo procedimiento se ha llevado a cabo con pET-28a:fur Sa obteniéndose resultados semejantes. Se ha comprobado que las secuencias de los genes fur amplificados de ambos patógenos no portan mutaciones y se han transformado células E. coli BL21 quimiocompetentes mediante choque térmico con los plásmidos pET-28a:fur Sa y pET-28a:fur Lp correctamente secuenciados y se han sembrado en placas de LB agar con kanamicina, obteniéndose ya las cepas que se utilizarán para la sobreexpresión. 13 5.2 Sobreexpresión y obtención de biomasa Se ha realizado una prueba de sobreexpresión de la proteína a partir de 4 colonias E. coli BL21 portadoras de pET-28a:fur Sa o pET-28a:fur Lp mediante ensayo de inducción con IPTG seguida de una electroforesis de proteínas SDS-PAGE (figura 5.4). La sobreexpresión de ambas proteínas sólo se produce al inducir con IPTG, que genera una elevada concentración de la proteína de interés. Figura 5.4. Sobreexpresión de Fur de L. pneumophila (A) y S. aureus (B). Carril M: marcador de peso molecular; carril control: BL21 con pET-28a sin inserto e inducido con IPTG (control negativo); las muestras del 1-4 representan distintas colonias, siendo las muestras - las que se han crecido sin inducir con IPTG y las muestras + aquellas a las que se les ha inducido con IPTG. Se ha seleccionado la muestra 3 de la sobreexpresión L. pneumophila y la 2 de S. aureus para llevar a cabo un cultivo de 5 l de cada uno, induciéndolos con IPTG y recogiendo la biomasa mediante centrifugación. Esta biomasa se ha congelado a -20 °C hasta su posterior uso. Se han obtenido 10,54 g de células E. coli BL21 que sobreexpresan Fur Sa y 10,04 g de las que sobreexpresan Fur Lp. 5.3 Purificación de Fur de S. aureus Para la purificación de Fur de S. aureus se ha decidido llevar a cabo una purificación sin cola de histidinas mediante cromatografía de afinidad a metales ya que la proteína Fur Sa presenta una región rica en histidinas con secuencia HFHHH (figura 2.1), que debería ser suficiente para interaccionar con el metal fijado en la columna y retener la proteína. Se ha purificado Fur Sa guardando una alícuota de cada uno de los pasos y se ha llevado a cabo una electroforesis SDS-PAGE. En esta electroforesis (figura 5.5) se ve que gran parte de la proteína Fur aparece en el pellet de las células indicando que se encuentra formando cuerpos de inclusión o unida a la membrana. La aparición en forma de cuerpos de inclusión también se ha descrito en otras proteínas Fur, como la de Mycobacterium tuberculosis [25]. Sin embargo también se ha detectado una banda que parece corresponder a Fur Sa en algunas de las alícuotas eluidas con un gradiente de imidazol. Se ha detectado que las alícuotas en las que podría encontrarse la proteína Fur Sa presentaban un tono ligeramente amarillento 14 (figura 5.6). Finalmente se han tomado las muestras 11, 12 y 13 de la elución, donde más proteína Fur Sa podría haber y se han juntado para dializarlas. Figura 5.5. Electroforesis SDS-PAGE al 15% de la purificación de Fur Sa. Etapas previas a la elución (A): carril M: marcador de peso molecular; carril 1: extracto crudo antes de sonicar; carril 2: extracto crudo después de sonicar; carril 3: sobrenadante del extracto crudo tras centrifugar; carril 4: pellet del extracto crudo tras centrifugar; carril 5: proteínas que han atravesado la columna sin unirse; carril 6: primer lavado de la columna; carril 7: segundo lavado de la columna; carril 8: tercer lavado de la columna. Muestras recogidas durante la elución (B): carril M: marcador de peso molecular; resto de carriles: distintas alícuotas recogidas durante la elución con gradiente de imidazol de 0 a 1M. Figura 5.6. Imagen de las alícuotas 11, 12 y 13 del eluido donde se aprecia el ligero tono amarillento de las muestras que podrían contener la proteína Fur Sa. Una vez dializada la proteína se ha centrifugado para eliminar el posible pellet formado. Durante la diálisis se ha obtenido un gran precipitado a pesar de que el tampón de diálisis contenía glicerol y NaCl para evitar la precipitación de Fur Sa. Se ha realizado otra electroforesis del sobrenadante y del pellet formado (figura 5.7), donde se puede ver la banda característica a 17 kDa de Fur Sa como la proteína mayoritaria de la muestra del sobrenadante. La purificación no ha sido completa, sino de una pureza estimada del 50 % ya que se pueden apreciar bandas correspondientes a otras proteínas (figura 5.7). Como se ve en la figura 5.7, la diálisis ha permitido separar por precipitación una gran cantidad de proteínas no deseadas y enriquecer el sobrenadante en Fur Sa ya que en el pellet de la diálisis sólo aparece una pequeña cantidad de la proteína Fur Sa. Se ha realizado un espectro de absorción de la muestra del sobrenadante (figura 5.8) detectándose un pico en torno a 410 nm indicativo de la presencia de un grupo prostético (posiblemente hemo [26]) y se ha medido la absorbancia a 280 nm para estimar la concentración de la muestra a partir del coeficiente de extinción teórico, de la que se han obtenido 8 ml a una concentración de 1,32 mM de la proteína Fur de 15 S. aureus. Sin embargo, esta concentración está sobreestimada, ya que la proteína Fur Sa no se halla pura y el resto de proteínas presentes en la muestra influyen en la medida de la absorbancia al no utilizarse el coeficiente de extinción experimental. Figura 5.7 Electroforesis de la diálisis de Fur. Carril M: marcador de peso molecular; carril Sobrenadante: muestra dializada de Fur; carril Pellet: precipitado formado durante la diálisis. Figura 5.8. Espectros de absorción de Fur Sa. Espectro de absorción de Fur Sa purificada a 132 µM (A); Ampliación del pico entorno a 410 nm de otra muestra de Fur Sa purificada a 670 µM (B). 5.4 Resuspensión de Fur de S. aureus Como gran parte de la proteína Fur se encontraba en el precipitado de la centrifugación del extracto crudo, se ha intentado realizar un ensayo de resuspensión y renaturalización de la proteína precipitada con cloruro de guanidinio y con urea, dos potentes agentes caotrópicos ampliamente utilizados para la renaturalización proteica [24]. A continuación se ha realizado una electroforesis SDS-PAGE (figura 5.9) para evaluar la prueba de renaturalización, en la que se puede ver que tanto el cloruro de guanidinio como la urea han permitido resuspender buena parte de la proteína, que aparece en gran cantidad tanto en el sobrenadante como en el pellet. Además aparece una banda en torno a 34 kDa que parece ser Fur Sa en forma dimérica. El espectro de absorbancia de la muestra renaturalizada es similar a la de la proteína purificada y mantiene el pico en torno a 410 nm (figura 5.10). 16 Figura 5.9. Electroforesis de la renaturalización. Carril M: marcador de peso molecular; carril 1: sobrenadante de la resuspensión con 2 M cloruro de guanidinio; carril 2: pellet de la resuspensión con 2 M cloruro de guanidinio; carril 3: sobrenadante de la resuspensión con 6 M urea; carril 4: pellet de la resuspensión con 6 M urea. Figura 5.10. Espectro de absorción de Fur Sa renaturalizada 2 M cloruro de guanidinio. 5.5 Análisis de oligomerización La proteína Fur Sa presenta 4 cisteínas (figura 2.1), por lo que podría formar puentes disulfuro tanto intracomo intermoleculares. En otros microorganismos se ha visto que la proteína Fur tiende a dimerizar a través de estos enlaces [8], por lo que se ha realizado un ensayo de reducción y un análisis de entrecruzamiento. La prueba de reducción se ha realizado añadiendo DTT, un agente reductor que rompe los enlaces disulfuro, lo que se traduciría en la rotura de los complejos multiméricos estabilizados mediante esta unión. Es importante que el tampón de carga no contenga β-mercaptoetanol, ya que también es un agente reductor que actuaría de la misma manera que el DTT en el control negativo. Los resultados se han analizado mediante electroforesis SDS-PAGE (figura 5.11 A), donde se puede ver en la muestra sin reductor un patrón de bandas completamente distinto al habitual, debido a los enlaces disulfuro presentes en las proteínas no deseadas que mantienen sus estructuras nativas. No se detectan dímeros de Fur Sa, pero se aprecia que la banda correspondiente a Fur Sa se desdobla en dos bandas en la muestra sin DTT, que seguramente se corresponden con distintas conformaciones de los puentes disulfuro intramoleculares. En la muestra que 17 contiene DTT, la proteína aparece como monómero en forma de una banda única, indicando que los enlaces disulfuro intramoleculares se han reducido. El ensayo de entrecruzamiento consiste en la formación de enlaces covalentes entre proteínas cercanas en solución a través de agentes entrecruzantes, para este ensayo se ha utilizado EDC y NHS. El EDC activa los grupos carboxilo de una proteína para que reaccionen con grupos amino primarios de la otra proteína. El NHS aumenta la eficiencia de la activación del grupo carboxilo por el EDC. Los resultados se han analizado mediante electroforesis SDS-PAGE utilizando tampón de carga con agente reductor (figura 5.11 B). Dado que la proteína se purifica como monómero en ausencia de DTT, no se han visto diferencias entre la muestra con EDC y la muestra control, confirmando el resultado anterior obtenido en el ensayo de reducción. Figura 5.11. Análisis de oligomerización de Fur Sa. Ensayo de reducción (A): Carril -: control negativo de Fur Sa sin tratar con 10 mM DTT; carril +: Fur Sa tratada con 10 mM DTT; carril M: marcador de peso molecular. Ensayo de entrecruzamiento (B): carril -: Fur Sa sin 2 mM EDC ni 2 mM NHS; carril +: muestra con 2 mM EDC y 2 mM NHS; carril M: marcador de peso molecular. 5.6 Análisis de interacción con el DNA Se ha descrito que Fur Sa regula el promotor de varios genes relacionados con el metabolismo del hierro en S. aureus [20]. Para comprobar si la proteína purificada es activa y mantiene la capacidad de unión al DNA in vitro se ha utilizado el ensayo de retardo en gel (EMSA), que consiste en la disminución de la movilidad electroforética del DNA debido a la formación del complejo proteína-DNA. Además, se ha añadido un DNA competidor al que la proteína no debería unirse, para comprobar que no se producen interacciones inespecíficas entre el DNA y la proteína. Para este ensayo se ha utilizado el promotor del operon sir de S. aureus. Se ha propuesto que el operon sir constituye un sistema de transporte de sideróforos en S. aureus [20], por lo que es de esperar que Fur se encuentre implicada en su regulación. 18 Los ensayos de unión a DNA se realizaron a diferentes concentraciones de proteína entre 500 nM y 1200 nM en presencia de Mn2+, ya que se ha descrito que Fur Sa requiere la interacción con un metal para unirse de forma óptima al DNA in vitro [20]. Además se ha evaluado la influencia de 1 mM DTT, que actúa como un potente reductor, dado que otras Fur requieren ambiente reductor para su unión al DNA [8]. Se ha utilizado la proteína Fur de Anabaena sp. PCC 7120 como control psotivo para comprobar que el ensayo ha funcionado correctamente. En la figura 5.13 se observa que Fur Sa requiere DTT para unirse al DNA ya que al aumentar la concentración de Fur Sa se incrementa la banda correspondiente al complejo Fur-DNA, lo cual no se percibe en ausencia de agente reductor. Por tanto, aunque las condiciones probadas en este ensayo no parecen ser las óptimas para la unión de Fur Sa, sí se puede comprobar que la proteína obtenida mediante este método de purificación sin cola de histidinas es activa. Figura 5.13. Ensayo EMSA con gel PAGE al 6 % con 40 ng de DNA. Carril 1: control negativo de Fur Sa; carriles 28: Fur Sa. 19 9. Anexo Tabla 9.1 Cepas utilizadas CEPA GENOTIPO CASA COMERCIAL USO E. coli DH5α U169 (Φ80ΔlacZΔM15), supE44, gyrA96, deoR, recA1, relA1, endA1 thi-1, hsdR17(rk-, mk+), Δ(lacZYA-argF) INVITROGEN Clonajes y propagación de los plásmidos E. coli BL21 (DE3) F, ompT, hsdS B , ( r B -, mB+), dcm, gal, λ(DE3) NOVAGEN Sobreexpresión de las proteínas Tabla 9.2 Mezclas de reacción para PCR para las dos polimerasas empleadas REACTIVO VOLUMEN (µl) VOLUMEN (µl) Agua milliQ 36 39 Buffer 10X 5 5 dNTPs 10 mM 1 1 Oligonucleótido directo 10 µM 2,5 1,5 Oligonucleótido reverso 10 µM 2,5 1,5 DNA 1 1 Pfu Ultra (2,5 U/µl) - 1 MgCl 2 50 mM 1,5 - Taq Biotools (5 U/µl) 1 - 26 Tabla 9.3 Cebadores utilizados para PCR OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA GEN AMPLIFICADO LpFur-Fw 5’-CATGCCATGGAAGAGAGTCAACAG-3’ Gen fur de L. pneumophila LpFur-Rv 5’-CCCAAGCTTTCATTGACACTGCGGAC-3’ SaFur-Fw 5’-CATTCATGAAAGAACGATTAAATCGCG-3’ Gen fur de S. aureus SaFur-Rv 5’-CCCAAGCTTCTATCCTTTACCTTTAGCTTGGC-3’ Prom-SasirA-F 5’-CCATGTTCAATGATGTACTTGG-3’ Promotor del operon sir de S. aureus [20] Prom-SasirA-R 5’-GCATTTTAATTACTTTATTCATTGAC-3’ Alr0523-F 5´-GTCTGTATGGATTAACACTATC-3´ Promotor del gen alr0523 de Anabaena sp. PCC 7120 Alr0523-R 5´-CTGCCTGTTCAACTACTTTGG-3´ ProN 5´-CTCGCCTAGCAATTTAACAAC-3´ Promotor de furA (PfurA) Anabaena sp. PCC 7120 ProC 5´-GCCTTGAGCGAAGTATTTGTG-3´ Las secuencias en negrita marcan el sitio de corte de las enzimas de restricción NcoI (LpFurFw), HindIII (LpFur-Rv y SaFur-Rv) y PagI (SaFur-Fw). Tabla 9.4 Composición para dos geles SDS-PAGE al 15 % REACTIVO Gel Separador 15 % Gel Concentrador 5 % Acrilamida : Bisacrilamida 30 % 4,5 ml O,66 ml Tris/HCl 1,5 M pH 8,8 3,36 ml - Tris/HCl 0,5 M pH 6,8 - 0,5 ml H 2 O milliQ 1,06 ml 2,80 ml SDS al 10% (p/v) 45 µl 20 µl APS al 10 % (p/v) 30 µl 20 µl TEMED 15 µl 20 µl 27 Tabla 9.5 Composición para dos geles nativos de PAGE al 6 % para EMSA REACTIVO VOLUMEN AÑADIDO Acrilamida : Bisacrilamida 30 % 4,12 ml Tampón de electroforesis 5X 3,72 ml Glicerol al 50 % 2,80 ml H 2 O milliQ 9,72 ml APS al 10 % 100 µl TEMED 60 µl 28