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Cristalización y difracción de rayos X para la resolución de estructuras de proteínas y complejos proteicos Estudio del papel de los residuos E413, R422 y R430 en el proceso de oligomerización de la enzima AIF mediante cristalografía de rayos X José Emilio Casaos Aznar Directora: Marta Martínez Júlvez Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Universidad de Zaragoza 2 ÍNDICE 2 RESUMEN 3 1. INTRODUCCIÓN 4 1.1. Cristalografía de rayos X aplicada a la resolución estructural de proteínas 4 1.1.1. Cristalización de macromoléculas biológicas 4 1.1.2. Resolución estructural 7 1.2. Proteínas redox estudiadas 12 1.2.1. hAIF. Factor de Inducción de Apoptosis humano 12 1.2.2. Otras proteínas redox utilizadas en este trabajo 15 2. OBJETIVOS 16 3. MATERIALES Y MÉTODOS 17 3.1. Obtención de cristales 17 3.2. Resolución estructural 17 3.3. Herramientas informáticas para la representación y análisis de las estructuras cristalográficas 25 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27 4.1. Cristalización de proteínas 27 4.1.1. Factor de Inducción de Apoptosis 27 4.1.2. Citocromo c 6-2 31 4.1.3. FAD Sintetasa 33 4.2. Estudio estructural de la proteína mutada E413A/R422A/R430AhAIF ∆1-102 34 4.2.1. Generación y refinado del modelo estructural 34 4.2.2. Análisis estructural 35 4.2.3. Estructura cuaternaria 43 5. CONCLUSIONES 44 6. BIBLIOGRAFÍA 45 3 RESUMEN El factor de inducción de apoptosis (Apoptosis-Inducing Factor, AIF) es una flavoproteína mitocondrial que media en el proceso de apoptosis independiente de caspasas. Este trabajo está basado en la AIF humana, una enzima que no sólo es importante en el proceso de la apoptosis, sino que es necesaria para el correcto funcionamiento de la cadena transportadora de electrones mitocondrial. La deficiencia en esta enzima se ha asociado a diversas patologías mitocondriales. La reciente estructura cristalográfica del complejo hAIF reducida con el coenzima (hAIF rd -NAD + ) muestra un dímero estabilizado por puentes salinos (E413, R422 y R430), y determina la presencia de un segundo sitio de unión del coenzima NAD + . Las mutaciones simultáneas en E413/R422/R430 previenen la dimerización de la proteína asociada al proceso redox así como la cromatinolisis nuclear, sugiriendo que la dimerización modula las propiedades redox y apoptóticas de hAIF. Además caracterizaciones cinéticas recientes de diversos mutantes en residuos del centro redox de la hAIF involucran al residuo W483, junto con P173, F310 y H454 en la formación del complejo competente, la eficiencia de transferencia de hidruro y la reactividad de hAIF frente al oxígeno. Con el objetivo de profundizar en el papel del residuo W483 del centro redox y el proceso de oligomerización de la enzima hAIF, en este proyecto Máster se abordó la cristalización del mutante W483G hAIF ∆1-102 y la resolución estructural de la especie mutada E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 (los residuos mutados se encuentran en la superficie de interacción entre los monómeros). A partir de los datos de difracción de un cristal del mutante E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 se resolvió la estructura de esta especie. La estructura obtenida se comparó con la de la proteína hAIF ∆1-102 nativa, tanto oxidada como reducida, y se observó que aunque la proteína mutada se pliega de manera similar a la proteína nativa, los residuos 532-534 (que se encuentran en una zona que reduce la accesibilidad al anillo de flavina y al residuo W483) siguen una trayectoria distinta. Además, la especie mutada deberá sufrir cambios conformacionales similares a los de la nativa para adoptar la conformación de la hAIF en el dímero. De todas maneras, y debido a las mutaciones, este dímero no mostrará interacciones estabilizantes en la interfase entre los monómeros. 4 1 INTRODUCCIÓN 1.1. Cristalografía de rayos X aplicada a la resolución estructural de proteínas 1.1.1. Cristalización de macromoléculas biológicas Concepto de cristal. Un cristal es una estructura sólida creada por agrupaciones ordenadas de átomos, iones o moléculas que se caracterizan por la repetición en las tres direcciones del espacio (x, y, z) de una unidad estructural mínima, llamada celdilla unidad (Figura 1). La celdilla unidad está formada a su vez por una unidad mínima, denominada unidad asimétrica. La aplicación de elementos de simetría a la unidad asimétrica genera la celdilla unidad, que se define mediante tres ejes (a, b y c) y tres ángulos (α, β y γ). La traslación de la celdilla unidad en las tres dimensiones forma el cristal [1]. Figura 1. Representación esquemática de un cristal como repetición de la celdilla unidad. Cristales de macromoléculas. Características. Los cristales de macromoléculas tienen características muy distintas a los cristales inorgánicos o de moléculas pequeñas, debido a su propia naturaleza. Los cristales inorgánicos poseen unas importantes fuerzas de interacción, lo que les proporciona una mayor dureza y resistencia, así como orden interno, pueden ser expuestos al aire y son fácilmente manipulables. Poseen además fuertes propiedades ópticas y difractan los rayos X de manera intensa. Por el contrario, los cristales de proteínas se componen de proteínas en estado nativo, que se encuentran solvatadas por la disolución, por lo que entre un 25% y un 90% del cristal está compuesto por solvente. Esta característica de los cristales de proteínas hace que las interacciones entre las macromoléculas sean débiles y que la posición de las proteínas varíe ligeramente entre las diferentes celdillas 5 unidad, causando patrones de difracción débiles y que los cristales sean blandos y frágiles, sensibles a la deshidratación y a la temperatura. Presentan por tanto propiedades ópticas débiles y escasa difracción, y acaban dañados tras la exposición prolongada a la radiación. A pesar de todo, la solvatación de los cristales de proteína también es responsable de la gran utilidad de la cristalografía de rayos X en macromoléculas, ya que permite que las macromoléculas, al estar rodeadas de capas de agua, mantengan una estructura similar a la esperada en solución. Como consecuencia, los mecanismos de unión de ligandos, las propiedades enzimáticas y espectroscópicas y otras características bioquímicas son las mismas en los cristales que las de la biomolécula en solución [2]. Principios básicos de la cristalización de proteínas. Para poder cristalizar una proteína es necesario superar el límite de solubilidad de la misma, momento en el que se alcanza un estado de sobresaturación, termodinámicamente inestable, y las moléculas de la proteína, en exceso, se separan de la fase acuosa y pasan a la fase sólida, hasta llegar a un equilibrio entre las dos fases. La cristalización de una proteína consta de dos etapas: una inicial de nucleación, o formación de núcleos cristalinos termodinámicamente estables y una segunda etapa de crecimiento, en la que las moléculas de proteína van incorporándose a la superficie del cristal (Figura 2A). Para que se produzcan estas dos etapas se debe superar una barrera energética. Si se alcanza muy rápidamente el estado de sobresaturación, se producirá la precipitación de la proteína como agregados amorfos, no cristalinos. Sin embargo, si el proceso ocurre lentamente, se alcanza un estado metaestable, en el que se produce el ordenamiento de las moléculas en redes cristalinas [2]. Existen diferentes maneras de alcanzar el estado de sobresaturación, como adicionar un agente precipitante, retirar moléculas de agua de la disolución, modificar el pH o la temperatura. Los diferentes métodos de cristalización consisten en llevar a cabo algunas de estas estrategias [2,3]. 6 A B Figura 2. A. Diagrama de cristalización de una proteína. Se representan la fase acuosa (estable) y la fase sobresaturada (coexiste fase sólida y proteína soluble), así como las zonas de nucleación y crecimiento de los cristales. Con la línea roja se muestra la evolución de un experimento de difusión de vapor en el que se mezclan volúmenes idénticos de proteína y agente precipitante a concentraciones [P 0 ] y [C 0 ]. La mezcla inicial presenta unas concentraciones [P 0 ]/2 y [C 0 ]/2. Debido a la diferente concentración de agente precipitante en la gota y en el reservorio, el agua de la gota comenzará a evaporarse, aumentando gradualmente la concentración de proteína y de agente precipitante, hasta igualarse la concentración de agente precipitante en la gota y el reservorio. Si en la posición final se supera la línea de solubilidad y se alcanza la zona de nucleación espontánea, comenzarán a aparecer núcleos de proteína, la concentración de proteína se reducirá, y al llegar a la zona de crecimiento cristalino el cristal aumentará de tamaño. B. Representación esquemática de los experimentos de difusión de vapor en gota sentada (superior) y en gota colgante (inferior). Actualmente, se utilizan varias técnicas de cristalización de proteínas: la difusión de vapor, la diálisis, la contradifusión a través de interfase o el llamado microbatch. La técnica de difusión de vapor es la más utilizada, en sus variantes de gota colgante y gota sentada (Figura 2.B). Se coloca una gota que contiene solución de proteína y de agente precipitante en un recipiente sellado y se equilibra frente a un reservorio que contiene únicamente la solución de agente precipitante. Como la concentración de agente precipitante en la gota es menor, se producirá difusión de vapor desde la gota al reservorio hasta que se equilibran las concentraciones. Si durante el equilibrado se alcanza el estado metaestable de sobresaturación y aparecen núcleos cristalinos, el sistema evolucionará hacia la formación de cristales. Si se alcanza un estado de sobresaturación muy alto, sobrepasando el límite de solubilidad, no se produce la formación de cristales, y sólo al proporcionar núcleos preformados se observará el crecimiento de cristales. Esta técnica se denomina siembra de cristales [2]. 7 Si se quiere obtener un cristal de un complejo proteína:ligando se pueden utilizar dos estrategias. Una de ellas consiste en la inmersión o "soaking" de los cristales de proteína preformados en una disolución del ligando a alta concentración. Como los cristales de proteína presentan grandes poros de solvente, el ligando puede difundir hasta el sitio de unión con la proteína. La cocristalización es la otra estrategia utilizada. En ella se añade el ligando en la gota al comienzo de la cristalización, o bien se incuba previamente con la proteína. Por norma general, ambas estrategias son igualmente válidas, aunque la inmersión conlleva el riesgo de poder dañar el cristal al manipularlo [2]. 1.1.2. Resolución estructural Fenómeno de difracción. La difracción de rayos X es el fenómeno físico que se produce cuando un haz de rayos X interacciona con los electrones de un cristal, produciendo una vibración de éstos acoplada a la variación del campo eléctrico. Los electrones pasan a emitir radiación en todas las direcciones del espacio, lo que se denomina dispersión. Debido a la naturaleza periódica del cristal, en determinadas direcciones se producen interferencias constructivas de los haces dispersados, lo que da lugar al fenómeno de difracción, cuyos máximos siguen la ley de Bragg (Figura 3 y Ecuación 1). 2   =  Ecuación 1. Ley de Bragg Figura 3. En una interpretación sencilla de la Ley de Bragg, las familias de planos cristalográficos paralelos de un cristal se comportarían como "espejos" que "reflejan" los rayos X para algunos ángulos de incidencia determinados. Los ángulos (θ) para los que aparecen rayos X difractados dependen de la distancia que separa los planos cristalográficos (d) y de la longitud de onda de los rayos X utilizados (λ). 8 En los experimentos de difracción, se hace incidir un haz monocromático de rayos X (de una longitud de onda del orden de 1 Å) sobre un cristal. El haz de rayos X es dispersado por el cristal, y la luz dispersada es recogida por un detector. El patrón que origina esa luz dispersada se denomina patrón de difracción. El patrón de difracción obtenido depende estrechamente de la estructura del objeto, el cristal. Sin embargo, en un cristal tridimensional no podemos observar todas las reflexiones a la vez. En el modelo de Bragg, un cristal contiene familias de planos paralelos separados por la misma distancia en distintas direcciones (Figura 3), por lo tanto, para poder obtener el patrón completo de difracción el procedimiento experimental implica la toma de imágenes sucesivas en un detector situado perpendicularmente al haz de rayos X. Para medir en distintas posiciones angulares del cristal, es necesario girar el cristal durante el experimento de difracción de tal modo que todos los planos virtuales se coloquen en la posición adecuada para cumplir la ley de Bragg. Esto se consigue mediante oscilaciones simples del cristal (geometría Phi) o por una combinación de giros más complejos (geometría Kappa) (Figura 4). Figura 4. A. Esquema de un difractrómetro con geometría Phi, y representación de un espectro de difracción. B. Esquema de un difractrómetro con geometría Kappa. Los cristales de proteínas, debido a las características especiales que presentan, sufren un gran deterioro al ser expuestos a la radiación. La longitud de onda penetrante y la intensidad del haz, unidas a los largos tiempos de exposición, provocan fenómenos de absorción que hacen que la muestra se caliente, generando radicales libres en las moléculas de proteína y solvente, que con el tiempo, dan lugar a daños irreparables en el cristal que provocan la pérdida del orden interno. Para minimizar este tipo de daños es conveniente enfriar el cristal durante el proceso de difracción, mediante un flujo laminar de nitrógeno frío [4]. Para poder realizar cristalografía sobre proteínas es necesario 9 sumergir previamente el cristal en una disolución crioprotectora (glicerol, sacarosa, etilenglicol, etc.) para que las moléculas de agua no estructurales sean reemplazadas por las crioprotectoras impidiendo la formación de hielo que produciría la ruptura del cristal. Como ya se ha mencionado, el espectro de difracción de rayos X consiste en un patrón de intensidades. La información estructural está concentrada en dicho patrón de difracción (Figura 5) y en forma de los denominados factores de estructura, asociados a cada intensidad, cuya fase no se puede medir durante el experimento de difracción. Haciendo uso de la teoría de interferencias de ondas es fácil demostrar que la geometría del espectro da cuenta de la celdilla unidad y la simetría de las intensidades informa de la simetría cristalina. Gracias a ello se puede establecer una relación directa entre el experimento y la estructura del cristal mediante la transformada de Fourier (Figura 5) [3]. Figura 5. Función de densidad electrónica. V es el volumen de la celdilla unidad y ϕ(hkl) es la fase asociada al módulo factor de estructura, |F(hkl)| La ecuación que aparece en la Figura 5 relaciona la densidad electrónica, ρ(x,y,z) (espacio real), en cada punto (x,y,z) del cristal, es decir, la estructura, con el experimento de difracción (espacio recíproco), donde |F(hkl)| es la raíz cuadrada de la intensidad de cada punto (hkl) del espectro de difracción. Para poder resolver la ecuación es necesario no solo disponer de los módulos, |F(hkl)|, sino también de las fases, ϕ(hkl), asociadas a los factores de estructura, pero cuya información se pierde durante el experimento. Esto constituye el denominado "problema de la fase" y el trabajo del cristalógrafo consiste en averiguar el valor de ϕ(hkl). 16 2. OBJETIVOS El objetivo principal de este Trabajo Fin de Máster es formarse en la técnica de cristalografía de rayos X aplicada a estudios estructurales de proteínas redox, en concreto el Factor de Inducción de Apoptosis, el citocromo c 6-3 y la FAD Sintetasa. Para alcanzar estos objetivos generales, se han diseñado las siguientes tareas a desarrollar en este Trabajo Fin de Máster: - Resolver la estructura de la especie mutante E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 que muestra un comportamiento cuando se reduce y estabiliza su CTC diferente al de la hAIF nativa. - Cristalizar y resolver la estructura de la especie mutante W483G hAIF que muestra un comportamiento diferente al de la nativa en la formación del complejo competente, la eficiencia de transferencia de hidruro y la reactividad de hAIF rd frente al oxígeno. - Cristalizar y resolver la estructura de una isoforma del citocromo c 6-3 , de la cianobacteria Nostoc sp. PCC 7119 cuya función se desconoce. - Cristalizar y resolver la estructura de algunas especies mutantes de la enzima FADS de Corynebacterium ammoniagenes que se diseñaron para estudiar la estructura cuaternaria de la proteína. Durante la realización de este Trabajo Fin de Máster se han adquirido las siguientes competencias: - Conocimiento teórico y manejo de los programas informáticos necesarios para la resolución estructural y representación de proteínas (Refmac5, Coot, Pymol, etc.). - Estudiar los cambios estructurales que producen las mutaciones en la estructura de las proteínas, y cómo esos cambios pueden afectar a su función. 17 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Obtención de cristales Para la obtención de cristales se ha utilizado el método de difusión de vapor en las dos modalidades de gota sentada y de gota colgante. Los experimentos en gota colgante se realizaron en placas Linbro de 24 pocillos. Las gotas contenían 1 ó 2 µL de disolución de proteína y 1 µL de líquido madre, y se equilibraron frente a 500 µL de líquido madre. En gota sentada se utilizaron placas "MRC 2-well" de 96 pocillos (SWISSCI). Las gotas contenían 0,3 µL de disolución de proteína y 0,3 µL de líquido madre y fueron equilibradas frente a 60 µL de líquido madre. Para encontrar las condiciones iniciales de cristalización se utilizaron 60 µL de las condiciones contenidas en los siguientes kits comerciales: JBScreen Basic HTS, JBScreenClassic HTS I, PEGSalt (Jena Bioscience), JCSG+, StructureScreen I+II, ProPlex y Midas (Molecular Dimensions). Para poner las gotas se utilizó un robot Nanodrop II (Innovadyne Technologies, Inc. (USA)), propiedad del Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI). Las placas se almacenaron en el Rock Imager (Formulatrix), propiedad del BIFI, un sistema automatizado de incubación de placas y toma periódica de imágenes de las gotas. Los cristales obtenidos se difractaron en el sincrotrón ALBA (Universidad Autónoma de Barcelona) en la línea 13 (XALOC) y en el sincrotrón Diamond (Harwell Science and Innovation Campus, UK). 3.2. Resolución estructural Tras la obtención de cristales de proteína, éstos se someten a un experimento de difracción de rayos X. La recogida de datos de difracción de rayos X es la última etapa física antes del procesamiento de los mismos in silico que concluirá con la resolución de la estructura (Figura 8). 18 Figura 8. Esquema de las etapas que constituyen la resolución estructural de una proteína mediante cristalografía de rayos X. La recogida se inicia con la toma de una imagen o varias imágenes separadas un cierto ángulo (típicamente 90º), utilizando 1º de rotación (∆φ = 1º). La inspección de estas imágenes permite estimar la resolución a la que difracta el cristal, la anisotropía, presencia de maclas o de varios cristales, anillos de hielo, separación y forma de las reflexiones, la determinación inicial de la celdilla y grupo espacial, etc. Este proceso inicial permite identificar la estrategia de recogida de datos más adecuada, incluyendo los tiempos de exposición, el rango de φ, la rotación por imagen, la distancia hasta el detector, etc. La optimización de la estrategia de recogida es indispensable para obtener un conjunto completo de datos de difracción, y, en algunos casos (como los experimentos de dispersión anómala) fundamental para la resolución de la estructura. Este primer procesamiento de los datos de difracción se llevó a cabo mediante el programa X-Ray Detector Software (XDS). El procesamiento de los datos de difracción consta de las siguientes etapas: Indexación: En esta etapa se utilizan varias imágenes para determinar los parámetros del cristal, la celdilla unidad, el grupo de Laue, la orientación del cristal y la mosaicidad. En ocasiones esta etapa no permite la identificación inequívoca del grupo espacial, por lo que se selecciona un grupo de menor simetría. La determinación de la red o el grupo de Laue es indispensable para conseguir un conjunto completo de datos 19 durante la etapa de recogida de datos de difracción, por lo que esta etapa suele realizarse al principio del experimento de difracción. Integración: En esta etapa se determinan las intensidades de las reflexiones así como su error estándar relativo. Como resultado se obtiene un conjunto de datos con todas las reflexiones (h, k, l), su intensidad y su error. Escalado: Durante la recogida de datos de difracción se puede producir un decaimiento del cristal, fluctuaciones en la intensidad de la fuente, de la temperatura, etc. En la etapa de escalado se normalizan las intensidades teniendo en cuenta los factores anteriores, y se reducen los datos a la unidad asimétrica. De esta manera el conjunto de datos resultante (denominado merged) ya no contendrá reflexiones simétricas y habrá promediado las reflexiones medidas varias veces así como las relacionadas por simetría. En esta etapa se obtienen una serie de parámetros estadísticos que permiten evaluar la calidad de los datos de difracción en función de la resolución: - Multiplicidad o redundancia: Representa el número de veces que se ha medido cada reflexión. Cuanto mayor sea su valor mejor será la estimación de los errores asociados a cada medida. Los valores altos de redundancia son indispensables cuando se intenta fasear con dispersión anómala, ya que la intensidad de la señal anómala es muy pequeña. - Completitud: Indica el porcentaje del espacio recíproco que se ha recogido. Es indispensable que la completitud global de los datos supere el 90%, siendo deseable que en la última capa de resolución sea superior al 80%. Cuando la pérdida de reflexiones se debe a errores no sistemáticos aparecen mapas ruidosos, mientras que si las reflexiones no medidas se deben a errores sistemáticos (como por ejemplo, la pérdida de las reflexiones muy intensas por sobresaturación del detector, la pérdida de reflexiones por no cubrir la totalidad del espacio recíproco o la ausencia de datos a baja resolución) se pueden producir problemas graves que impiden la resolución de la estructura. - Factor R sym : Este parámetro evalúa la diferencia entre la intensidad de una reflexión medida N veces y su promedio (o entre las intensidades de reflexiones simétricas) según la Ecuación 3, 20 Ecuación 3: Factor R sym donde I(h) es la intensidad de cada reflexión “h”, medidas N veces, y siendo Ī(h) la intensidad promedio de cada reflexión. Este valor se calcula para cada concha de resolución, observándose un incremento a altas resoluciones. En general se aceptan valores globales de R sym inferiores al 10 %. - I/σ (I): Representa la relación de la intensidad con respecto al ruido. Son aceptables valores por encima de 2. Cálculo del módulo de factor de estructura: Una vez se ha determinado la intensidad de las reflexiones se calculan los módulos de los factores de estructura, cuyo cuadrado es proporcional a la intensidad. Con los módulos medidos y las fases calculadas de los factores de estructura se obtiene una densidad electrónica interpretable. Generación y refinado del modelo estructural Se inicia entonces la construcción del modelo de estructura de la proteína. La primera etapa consiste en el trazado de la cadena polipeptídica dentro de la densidad. A partir del modelo inicial se realizan ciclos de refinado matemático y de refinado manual. El refinado matemático implica el ajuste de las coordenadas (x,y,z) de cada átomo así como el factor térmico isotrópico B, que se relaciona con su estado de vibración térmica. Durante el refinado de estructuras proteicas se imponen además restricciones estereoquímicas, las cuales permiten mantener distancias y ángulos de enlace correctos, así como la planaridad de enlaces peptídicos y cadenas laterales. Estas restricciones son esenciales en el caso de estructuras a baja resolución, donde el número de parámetros que han de refinarse no es mucho menor que las observaciones experimentales. En el caso de existir varias copias de la misma molécula en la unidad 21 asimétrica, la introducción de restricciones debidas a simetrías no cristalográficas también conduce a una mejora en el proceso de refinado, sobre todo en estructuras a baja resolución. El proceso de refinado se evalúa mediante el factor R, el cual mide la diferencia entre las amplitudes observadas |Fo| y calculadas |Fc| (Ecuación 2). Para asegurar que los cambios que se realizan durante cada etapa son representativos del modelo real, se utiliza la validación cruzada, mediante el uso del Rfree. Para calcularlo se excluyen entre un 5 % y un 10 % de las reflexiones durante el refinado, calculando para este set de reflexiones (test set) el factor Rfree. El factor R calculado con el 90-95 % restante se denomina Rwork e incluye las reflexiones utilizadas en el refinado. Si este factor Rfree disminuye en una etapa de refinado, será síntoma de que la etapa ha conducido a una mejora de las fases. El refinado matemático se suele iniciar mediante un refinado de cuerpo rígido, en el que la proteína es tratada como un todo y se modifica su posición y giro, así como un refinado de tipo simulated annealing, en el que se simula un calentamiento y posterior enfriamiento de la proteína. Posteriormente se realizan refinados tipo “máxima verosimilitud” (del inglés, maximum likelihood). Además se añaden moléculas de agua al modelo, así como ligandos e iones. Los ciclos de refinado matemático se alternan con ciclos de refinado manual, en los cuales se ajustan cadenas laterales, se modelan regiones peor definidas o se ajustan las conformaciones de los ligandos. Para ello se calculan los denominados mapas de densidad electrónica diferencia, 2Fo-Fc y Fo-Fc utilizando la diferencia entre las amplitudes observadas y calculadas y las fases calculadas. Por último, puede utilizarse el denominado refinado TLS de los factores B (del inglés Translation-Libration-Screw). En este tipo de refinado las cadenas de proteína se dividen en fragmentos (grupos TLS) que se comportarán como cuerpos rígidos en cuanto a su vibración, y se refinan anisotrópicamente. Este refinado conduce a una mejora con respecto al refinado B isotrópico, y a diferencia del refinado anisotrópico, puede usarse a bajas resoluciones, ya que no supone la introducción adicional de demasiados parámetros que refinar. El proceso de refinado concluye cuando el modelo estructural se ajusta a la densidad electrónica, no aparece densidad electrónica no explicada en los mapas diferencia, los valores de R y Rfree son adecuados (valores de Rfree inferiores al 30%, y R de 20-25%) y la geometría del modelo es la correcta. 22 CCP4 El paquete de programas CCP4 (The collaborative computational proyect number 4) de cristalografía de proteínas se creó en 1979 como colaboración entre los investigadores que trabajaban en software aplicado a la cristalografía para formar una colección completa de software para satisfacer los requerimientos computacionales de los grupos de Reino Unido. A diferencia de otros paquetes de software cristalográfico para moléculas pequeñas, CCP4 es un conjunto de programas separados que se comunican a través de archivos de datos estándar, en lugar de tener todas las operaciones integradas en un gran programa. La gran ventaja que deriva de dicho paquete es que es muy fácil añadir programas nuevos o modificar los ya existentes. Los principales tipos de datos que se utilizan en este programa son los datos de reflexión, mapas de densidad electrónica y las coordenadas de los átomos. En la definición de estos formatos se realizan una serie de ventajas y desventajas (en el espacio y el tiempo de acceso) portabilidad, flexibilidad y sencillez de uso [24, 25]. Refmac El programa REFMAC [26] permite realizar refinamiento de cuerpo rígido, TLS (modelación de los desplazamientos anisotrópicos), refinamiento restringido y no restringido. Normalmente los datos de rayos X se dan en forma de amplitudes de factores de estructura observadas, aunque la versión más reciente de Refmac puede refinar a partir de intensidades, que además, se pueden usar si las fases experimentales son de calidad. Refmac minimiza los parámetros de coordenadas para satisfacer un residuo de probabilidad máximo. Refmac también produce un archivo de salida mtz que contiene los coeficientes de ponderación para los mapas FWT PHWT y DELFWT PHDELWT, donde han sido restaurados los “datos que faltan”. Refmac5 refinará un modelo atómico ajustando los parámetros del modelo (coordenadas, factores B, TLS…) con el fin de obtener el modelo que mejor explica los datos experimentales, maximiza la probabilidad. El progreso se mide por el R factor y R free , así como su ponderación. Para ejecutar este programa se necesita un archivo que contenga un conjunto de factores de estructura observados y un modelo atómico inicial obtenido por reemplazo molecular o construcción molecular [26]. 23 Entre las opciones (Figura 9) de refinamiento existen: - Revisión de las restricciones (review restraints): No se produce refinamiento, pero se comprueba la geometría del modelo. - Refinamiento restringido (restrained refinement): Es el valor predeterminado. El modelo se refina para obtener el mejor ajuste a la densidad experimental, mientras que mantiene una buena geometría. - Refinamiento no restringido (unrestrained refinement): No restringe la geometría del modelo, sólo es válido para alta resolución. - Refinamiento de cuerpo rígido (rigid body refinement): No mueve los átomos individualmente, sino que mueve toda la molécula como unidad única. Muy útil cuando se tiene baja resolución, por ejemplo, después del reemplazo molecular. - Idealización de la estructura (structure idealization): No utiliza datos experimentales, sólo corrige los errores en la geometría. - TLS y refinamiento restringido (TLS and restrained refinement): Es como el refinamiento restringido, pero también se modela el movimiento térmico del cuerpo rígido de la molécula, dando una primera aproximación a un refinamiento anisotrópico, incluso a baja resolución. Figura 9. Interfaz de Refmac5, programa del CCP4. 24 COOT Coot es una aplicación interactiva de gráficos moleculares diseñado principalmente para el ajuste manual de modelos macromoleculares de datos de rayos X (Figura 10) [27]. Las herramientas principales que utiliza este programa son: - El uso de restricciones de péptidos planos. - El uso del gráfico de Ramachandran. - La utilización del llamado rotámeros “Bac Rub”, para encontrar conformaciones alternativas de las cadenas laterales. A B hAIF nativa hAIF mutante Figura 10. A. Detalle del residuo 413. Al utilizar el reemplazo molecular se ha considerado este residuo como Glu, y aparece una densidad electrónica no observada en el experimento de difracción (en rojo). B. Mediante una herramienta del programa Coot, se ha mutado el residuo 413 a Ala. Validación La etapa de validación del modelo constituye la última etapa de la resolución estructural, y en ella se comprueba tanto la estereoquímica del modelo como la correlación de la densidad electrónica. El modelo generado se ha validado mediante el diagrama de Ramachandran, disponible en el programa Coot. La estructura resuelta también se ha validado con el programa MolProbity [28], que comprueba además la conformación de los residuos Gln, Asn e His, indicando la 25 necesidad de realizar torsiones de 180º en la cadena lateral cuando así lo sugieren los puentes de hidrógeno. La razón es que la densidad electrónica de C, N y O es similar, por lo que en estos residuos no es posible identificar la conformación adecuada si no se analiza la formación de puentes de hidrógeno con otros átomos de la proteína o solvente. 3.3. Herramientas informáticas para la representación y análisis de las estructuras cristalográficas. La representación de estructuras tridimensionales se ha realizado mediante el programa PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrödinger, LLC). PyMOL es un programa de visualización molecular, potente y completo para la presentación y animación en 3D de estructuras moleculares. En muchas de las imágenes los átomos se han coloreado mediante variaciones del sistema CPK, con los átomos de C en diversos colores, los átomos de N en azul, los átomos de O en rojo, los átomos de fósforo en naranja y los átomos de azufre en amarillo. Análisis de la estructura cuaternaria La estructura cuaternaria se analizó mediante el servidor PISA (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/pistart.html), el cual realiza un análisis termodinámico de las interacciones que se establecen dentro del cristal, predice la existencia de ensamblados macromoleculares y discrimina interacciones “irrelevantes” (debidas al empaquetamiento cristalino) de aquellas que tienen una relevancia biológica. Este servidor calcula además las superficies de interacción entre subunidades así como las interacciones que se establecen entre ellas [29]. Así, entre los resultados calculados que proporciona PISA se incluyen: - Propiedades estructurales y químicas de las superficies macromoleculares. - Propiedades estructurales y químicas de las interfases macromoleculares. - Probables estructuras cuaternarias, sus propiedades estructurales y químicas y un patrón probable de disociación. - Número de simetría 32 Se recogieron 4 cristales de la gota con la condición A6 del kit Basic HTS (Figura 12.A) y 3 cristales de la gota con la condición D7 del mismo kit (Figura 12.B). Se preparó una disolución crioprotectora consistente en el líquido madre más 20% (v/v) de glicerol en la que se sumergieron los tres últimos cristales, y en un loop de nylon se congelaron en nitrógeno líquido. La disolución de MPD al 30% es ya crioprotectora, por lo que esos cristales se recogieron y congelaron en un loop sin necesidad de pasarlos previamente por una solución crioprotectora. Los cristales congelados en nitrógeno líquido se transportaron al sincrotrón ALBA (Universidad Autónoma de Barcelona) donde se llevó a cabo el experimento de difracción de rayos X en la línea Xaloc. Varios de estos cristales no presentaron difracción, y los que lo hicieron no dieron patrones con suficiente intensidad a alta resolución, por lo que no se pudo resolver la estructura del citocromo a partir de esos datos. Para mejorar los cristales, se llevó a cabo una serie de ensayos de difusión de vapor en gota colgante. La proteína estaba a una concentración de 0,8 mM y los diferentes líquidos madre están recogidos en la Tabla 5. Tabla 5. Condiciones de cristalización del citocromo c 6-3 en gota colgante. Agente precipitante Tampón (0,1M) Rango pH Sal Rango concentración 30% MPD CH 3 COONa 4,6 - 7,0 NaCl 0,10 M - 0,20 M 30% MPD CH 3 COONa 4,6 - 7,0 (CH 3 COO) 2 Mg 0,10 M - 0,20 M 14 - 18 % PEG8K MES * 4,5 - 6,5 (CH 3 COO) 2 Zn 0,02 M * MES: ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico. Tras siete días de incubación, se apreció el crecimiento de cristales rojos en la gota que tenía como líquido madre 30% (v/v) MPD, acetato de sodio 0,1 M pH 4,6 y acetato de magnesio 0,2 M (Figura 12D). Se cogieron un total de 7 cristales de los dos hábitos observados con un loop de nylon y fueron almacenados en nitrógeno líquido. Los cristales se llevaron al sincrotrón Diamond (Harwell Science and Innovation Campus, UK) para llevar a cabo los experimentos de difracción de rayos X, pero ninguno de ellos difractó. 33 Con el fin de obtener un número menor de cristales y de mayor tamaño, se realizó otra incubación de la proteína a 0,4 mM con el mismo líquido madre, y otro experimento en el que se redujo al 28% y al 26% la concentración de agente precipitante (MPD). En los tres casos se observó la aparición de un gran número de cristales y de un tamaño menor, por lo que se descartó seguir creciendo cristales por esa vía. 4.1.3. FAD Sintetasa Para la cristalizar las especies R195A/R199A, T208D y S164D FADS se utilizó el método de difusión de vapor en gota colgante. Las gotas se prepararon en proporción 1:1 y 1:2 (líquido madre: proteína, v/v) con una concentración inicial de proteína de 180 µM y líquido madre que contenía tampón fosfato 40 mM, pH 6,8 y LiSO 4 1,98 M. En esta solución había cristalizado anteriormente la FADS nativa. Tras no observar la aparición de cristales o precipitado en las gotas en un rango de tiempo de varias semanas, se realizó una segunda incubación con una concentración mayor de proteína (230 µM) en las mismas condiciones. Una de las posibles causas por la que no aparecen cristales o precipitado de una proteína es que no esté a suficiente concentración y por tanto no se alcance la zona de sobresaturación. Se probó también si la presencia de ditriotreitol (DTT) a 2 mM mejoraba la cristalización. Dicho reactivo como agente reductor previene la formación de puentes disulfuro que pueden provocar agregación de proteínas. Tras varias semanas de incubación y en presencia de este reactivo se obtuvo un precipitado de las especies mutantes, pero no cristales de las mismas. En este punto es necesario ensayar otro tipo de condiciones o mejorar la de la nativa variando pH y/o Tª. 34 4.2. Estudio estructural de la proteína mutada 4.2.1. Generación y refinado del modelo estructural Para la generación y el refinado del modelo estructural de la proteína E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 se disponía de los factores de estructura en un fichero generado por el programa XDS. Se realizó el reemplazo molecular con el programa Molrep (programa incluido dentro del paquete de programas CCP4) utilizando el modelo estructural de la enzima hAIF ∆1-102 (4BV6). El programa utilizó las fases del modelo estructural de la enzima hAIF ∆1-102 y los módulos calculados a partir del experimento de difracción, y los procesó para obtener el mapa de densidad electrónica y un fichero .pdb que contiene las coordenadas de los átomos de la molécula (o moléculas) de la unidad asimétrica. El modelo estructural obtenido (fichero .pdb) fue refinado utilizando el programa Refmac5, que realiza ajustes matemáticos. El programa Refmac5 proporciona el modelo estructural mejorado (fichero .pdb) y los mapas de densidad electrónica diferencia en un fichero .mtz. Estos archivos se visualizaron mediante el programa Coot, con el que se realizó un refinado manual de la estructura de la proteína y se introdujeron las mutaciones. Estos pasos se realizaron varias veces, siguiendo la evolución de los parámetros R y R free , así como los valores de la desviación cuadrática media (r.m.d.s.) de las distancias y ángulos de enlace, que fueron disminuyendo tras cada ciclo de refinado (Figura 13). Como se ha mencionado anteriormente, estos parámetros son indicativos de que el modelo generado explica la densidad electrónica observada, y a menor diferencia entre el modelo generado y la densidad electrónica, estos valores son menores. Figura 13. Resultado de un proceso de refinado. Los valores de R y R free están representados frente a cada ciclo de refinado. 35 4.2.2. Análisis estructural La estructura cristalográfica de la especie E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 se resolvió a una resolución atómica de 2.6 Å. Las estadísticas de recogida de datos de difracción de rayos X y del refinamiento del modelo se recogen en la Tabla 6. Tabla 6. Datos de la recogida y del refinado del experimento de difracción de la proteína E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 Cristal E413A/R422A/R430A hAIF ∆1 - 102 Grupo espacial P2 1 2 1 2 1 Parámetros de la celdilla unidad (Å) a=66,43 b=107,79 c= 170,62 α=β=γ=90,00 Recogida de datos Temperatura 100 Beamline 13-XALOC Longitud de onda (Å) 0,97941 Resolución (Å) 40-2,6 (2,74-2,60) Reflexiones totales 321.742 Reflexiones únicas 37.459 Mean I/σ(I) 20,2 (8,6) Completitud (%) 97,3 (83,1) Redundancia 8,6 (6,4) R sym a 0,082 (0,206) Refinado de datos Rango de resolución (Å) 40 (2,6) Número de átomos (no hidrógenos) Proteína 7.046 Ligando 105 Solvente 122 R work (%) 0,22 R free b (%) 0,25 r.m.s.d. longitud enlace (Å) 0,005 r.m.s.d. ángulo enlace (°) 1,185 Promedio factor-B (Å 2 ) 22,44 Análisis Ramachandran Residuos en regiones permitidas (%) 99,01 Fuera (%) 0,99 Los datos entre paréntesis corresponden a la concha de mayor resolución a R sym = Σ| I - I av |/ Σ I, donde el sumatorio se refiere a las reflexiones equivalentes por simetría b R calculado para el 7 % de datos excluidos para el refinado 36 La unidad asimétrica del cristal de E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 contiene dos moléculas de proteína, que llamaremos cadena A y cadena B, dos moléculas de cofactor FAD unidas no covalentemente a cada una de ellas y un total de 123 moléculas de agua (Figura 14A). El número de cadenas polipeptídicas que aparece en la unidad asimétrica depende del empaquetamiento cristalino y su relevancia biológica debe ser probada. En el modelo estructural resuelto se encuentran los residuos 128-534 y 560-611 de la cadena A y los residuos 128-532 y 559-611 de la cadena B. Estos residuos se han colocado de forma que justifiquen la densidad electrónica observada en el experimento de difracción. Los residuos que no se muestran, 535-559 y 533-558 para las cadenas A y B, respectivamente, no pudieron ser modelados debido a su escasa o nula densidad electrónica. La ausencia de esta densidad electrónica necesaria para poder colocar los residuos podría ser debida, como en la mayor parte de los casos ocurre, a una movilidad elevada de los mismos en la proteína. Aunque las proteínas se encuentran en un estado cristalino, se encuentran rodeadas por el solvente, y las zonas que son poco rígidas (o que establecen interacciones más débiles con el resto de la proteína) pueden moverse sin alterar el conjunto de la red cristalina, es decir, estas zonas tienen conformaciones distintas en las diferentes moléculas que forman el cristal, y al realizarse el promedio de todas ellas en el experimento de difracción, no se puede establecer con exactitud suficiente una densidad electrónica que ayude a determinar su posición. Además, en este modelo, faltan los residuos de los extremos amino (residuos 102-127 en las dos cadenas) y carboxilo (residuos 612 y 613 en las dos cadenas), aparte del ya mencionado fragmento móvil (segmento 509-560). 37 Figura 14. A. Representación de la unidad asimétrica del modelo estructural de la proteína E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 . En verde la cadena A y en azul la cadena B. En rosa se muestran los cofactores FAD. B. Representación en cintas (cartoon) de la cadena A de la estructura de E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 . Las hélices α están coloreadas en rojo, las hebras β en amarillo y el resto en verde. C. Superposición de los esqueletos carbonados (Cα) de la cadena A de E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 (azul) y de la cadena A de la proteína hAIF ∆1-102 nativa (4BV6) (rosa). Se realizó la validación del modelo de E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 con el diagrama de Ramachandran contenido en el programa Coot (Figura 15). El 96.70 % de los residuos se encontraban en zonas preferentes, un 2.31% en zonas permitidas y un 0.99% de los residuos se encontraban en zonas prohibidas. Este 1% de residuos situados en zonas prohibidas del diagrama de Ramachandran se comprobaron visualmente en el programa Coot. La posición de los residuos justifica la densidad electrónica, por lo tanto están bien colocados aunque no cumplen los valores geométricos ideales. 38 Figura 15. Diagrama de Ramachandran. En los ejes están definidos los ángulos φ y ψ (en grados). Las regiones favorables están representadas en rosa y las permitidas en amarillo, el fondo gris corresponde a las regiones no permitidas. Los residuos están representados como cuadrados azul oscuro, excepto la prolina y la glicina, que están representados como cuadrados azul claro y triángulos azul claro, respectivamente. Los residuos que se encuentran en regiones prohibidas se muestran en rojo. El modelo estructural obtenido se validó también mediante el programa MolProbity. Los resultados se muestran en la Tabla 7. Tabla 7. Resultados proporcionados por el programa MolProbity para la validación de la estructura E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 . Contactos de todos los átomos Clashscore, todos los átomos: 1.74 100 th percentile * (N=227, 2.60Å ± 0.25Å) Clashscore es el número de solapamientos estéricos graves (> 0.4 Å) por 1000 átomos. Geometría de la proteína Rotámeros pobres 16 2.15% Objetivo: <1% Residuos fuera de las zonas permitidas del diagrama de Ramachandran 2 0.22% Objetivo: <0.05% Residuos en zonas permitidas del diagrama de Ramachandran 883 97.14% Objetivo: >98% Puntuación de MolProbity ^ 1.34 100 th percentile * (N=6237, 2.60Å ± 0.25Å) Desviaciones de Cβ >0.25Å 1 0.12% Objetivos: 0 Residuos con distancias de enlace incorrectas 0 / 7186 0.00% Objetivos: 0% Residuos con ángulos incorrectos 0 / 9713 0.00% Objetivos: <0.1% 39 Aunque hay más rotámeros pobres y residuos fuera de las zonas permitidas del diagrama de Ramachandran de los deseados, la posición de esos residuos en la estructura se ha comprobado que es correcta según la densidad electrónica obtenida. La validación del diagrama de Ramachandran hecha con la herramienta del programa Coot (Figura 15) también muestra que esos residuos se encuentran en zonas no permitidas. Mediante el programa PyMOL se realizó la superposición de los Cα de las cadenas A y B de E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 . Se superpusieron 458 Cα y se obtuvo un valor de la desviación cuadrática media (r.m.d.s.) de 0,104 Å, lo que indica un plegamiento similar de las dos cadenas A y B. Por esta razón a partir de ahora se tomará la cadena A como modelo estructural a efectos comparativos. De la misma forma, se realizó la superposición de la cadena A de E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 con la estructura de la proteína nativa 4BV6 (hAIF Δ1102 ) (Figura 14C). Se alinearon 414 Cα y el valor de r.m.d.s. fue de 0,323 Å. Estos datos muestran que la estructura de la proteína mutante E413A/R422A/R430A hAIF Δ1102 es globalmente similar a la estructura de la proteína nativa en su estado oxidado. Sin embargo y a pesar de la elevada similitud, hay algunas diferencias que podrían ser significativas para explicar el comportamiento del mutante. En esta comparativa con la estructura nativa se observa que los residuos 532-534 de la especie mutante siguen una trayectoria diferente que los residuos homólogos en la cadena de la enzima nativa (Figura 16A). Además en el modelo de la nativa se predice una hélice α formada por los residuos 529-533, mientras que los mismos residuos en la estructura de la mutada no son representados en esta estructura secundaria. Estos residuos y las dos hélices α cortas 517-524 y 529-533 reducen la accesibilidad al anillo de flavina a través del residuo W483, y que en el modelo de la proteína reducida (4BUR) estos residuos se encuentran desplazados y el espacio ocupado por una molécula de NAD + [12]. Como no se dispone de densidad electrónica entre los residuos 535-559 en el mutante y entre los residuos 546-558 en la nativa, no se puede visualizar si en esta zona existen diferencias en esta zona entre la especie mutante y la nativa (Figura 16B). Para saber si esta diferencia en la trayectoria de los residuos 532-534 se debe a la elevada movilidad de los mismos, se comparó su factor B con el factor B promedio de la proteína. Los residuos 532-534 tienen un factor B de 41,9 Å 2 , un valor muy alto comparado con el promedio de la proteína (22,4 Å 2 ). E stos mismos residuos en la un factor B de 19,4 Å 2 , muy similar al del embargo, a unque los residuos 532 la proteína mutante, la densidad electrónica observada i Por lo tanto la trayectoria de los residuos 532 respecto a los mismos residuos de la proteína nativa. stos mismos residuos en la e structura de la proteína , muy similar al del promedio de la proteína (17,4 unque los residuos 532 - 534 tengan una mayor movilidad en la estructura de la proteína mutante, la densidad electrónica observada i ndica que están en e Por lo tanto la trayectoria de los residuos 532 - 534 de la proteína mutante es distinta con respecto a los mismos residuos de la proteína nativa. 40 structura de la proteína nativa tienen promedio de la proteína (17,4 Å 2 ). Sin 534 tengan una mayor movilidad en la estructura de ndica que están en e sa posición. 534 de la proteína mutante es distinta con Figura 16. A. Superposición de los C los de la proteína hAIF nativa (azul). Se y E531 con sus interacciones . También se partir de los residuos 532-534. B. mutada. En azul, m odelo de la proteína hAIF nativa (4BV6) discontínua muestra la posible trayectoria de (546-558). En verde, m odelo de la proteína muestra la posible trayectoria de C. Detalle del modelo de la proteína muestra la posición mutada 430 y el desplazamiento del residuo nativa (en azul). La posición de la cadena principal de los residuos mutados 413, en la enzima nativa que en la especie mutada 431 es diferente en ambas proteínas residuos cercanos son las mismas en los dos modelos considerar significativo. La superposición de los C α del modelo estructural de la prote hAIF Δ1-102 y del modelo 4BV6 también mostró que grupo prostético FAD se encuentra También se realizó la superposición de los C hAIF red :2NAD + (4BUR) con de la cadena C del complejo el caso de la superposición del complejo reducido con la nativa un r.m.d.s. de 0,905 Å, y en el alinearon 382 Cα con un r.m.d.s. de 0,908 nativa como la proteína mutante E413A/R422A/R430A hAIF cambio conformacional para adoptar la estructura se asocia en dímeros [12]. Superposición de los C α de la cadena A de E413A/R422A/R430A hAIF proteína hAIF nativa (azul). Se han etiquetado las dos hélices α cortas y los residuos R201, T526 . También se indica con flechas el cambio de dirección de B. Estudio comparativo de una zona de la hAIF nativa y de la especie odelo de la proteína hAIF nativa (4BV6) con sus residuos 434-445 posible trayectoria de los Cα que no tienen densidad electrónica odelo de la proteína E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 .La líne a discontínua los Cα de los residuos sin densidad electrónica en el modelo (535 modelo de la proteína mutante E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 (en verde) muestra la posición mutada 430 y el desplazamiento del residuo S431 con respecto al de la proteína hAIF cadena principal de los residuos mutados 413, 422 y 430 enzima nativa que en la especie mutada . Sin embargo la conformación de la serina es diferente en ambas proteínas (Figura 16D). Como las interacciones con los las mismas en los dos modelos , este último cambio no α del modelo estructural de la prote ína E413A/R422A/R430A y del modelo 4BV6 también mostró que tanto el residuo W483 se encuentra n en la misma posición. También se realizó la superposición de los C α de la cadena C del complejo (4BUR) con la cadena A de la hAIF ∆1-102 nativa (4BV6 ) por una parte y de la cadena C del complejo con la cadena A de E413A/R422A/R430A hAIF de la superposición del complejo reducido con la nativa se alinearon 387 C un r.m.d.s. de 0,905 Å, y en el caso de la superposición del complejo con el mutante con un r.m.d.s. de 0,908 Å. Estos datos muestran que, la proteína mutante E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 deben sufrir un cambio conformacional para adoptar la estructura de la hAIF reducida con NADH que 41 E413A/R422A/R430A hAIF ∆1-102 (verde) con los residuos R201, T526 el cambio de dirección de las cadenas a Estudio comparativo de una zona de la hAIF nativa y de la especie en rojo. La línea densidad electrónica en el modelo a discontínua en el modelo (535 -559). (en verde) , en la que se con respecto al de la proteína hAIF y 430 es la misma la conformación de la serina Como las interacciones con los , este último cambio no se puede ína E413A/R422A/R430A el residuo W483 como el complejo ) por una parte y E413A/R422A/R430A hAIF Δ1-102 . En se alinearon 387 Cα con caso de la superposición del complejo con el mutante se Å. Estos datos muestran que, tanto la hAIF deben sufrir un de la hAIF reducida con NADH que 48 [25] A. Faust, S. Panjikar, U. Mueller, V. Parthasarathy, A. Schmidt, V. S. Lamzin and M. S. Weiss (2008). “A tutorial for learning and teaching macromolecular crystallography” J. Appl. Cryst. 41, 1161-1172 [26] G. N. Murshudov, P. Skubák, A. A. Lebedev, N. S. Pannu, R. A. Steiner, R. A. Nicholls, M. D. Winn, F. Long and A. A. Vagin (2011). REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Cryst. D67, 355-367 [27] P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott and K. Cowtan (2010). Features and development of Coot. Acta Cryst. 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