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UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Patología Animal Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. TESIS DOCTORAL Pablo Gómez Ochoa Zaragoza, 2004 Departamento de Patología Animal FACULTAD DE VETERINARIA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA D. MANUEL GASCON PEREZ y D. JUAN ANTONIO CASTILLO HERNANDEZ Profesores Titulares del Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza. INFORMAN: Que la presente memoria titulada “ESTUDIO DE UN NUEVO TRATAMIENTO DE LA LEISHMANIOSIS CANINA. VALORACIÓN DEL EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA DOMPERIDONA” de la que es autor el licenciado en Veterinaria D. Pablo Gómez Ochoa, ha sido realizada bajo su dirección y cumple con las condiciones exigidas para ser presentada y defendida como Tesis Doctoral. Zaragoza, febrero de 2004 Fdo: Prof. Dr. D. Manuel Gascón Pérez Fdo: Prof. Dr. D. Juan Antonio Castillo Hernández A mis padres, por todo Agradecimientos A mis directores Manolo y Juan Antonio, muchas gracias por vuestra confianza y amistad, siempre me he sentido escuchado y valorado por vosotros. A Javier Lucientes, has sido mi tercer director además de un amigo; muchas gracias por haber compartido estos cuatro años y tu despacho conmigo. A Pepín y Tere, muchas gracias, muchas gracias. Me habéis ayudado en todos los ámbitos, estaría contento de haberos aportado la décima parte de lo que me habéis dado. A Vicente Larraga, a Chus y a Tobías, gracias por vuestra amabilidad, por abrirme las puertas del C.I.B. y por vuestra comprensión con un lego en técnicas moleculares. A Chusa y a Miguel Angel Peribañez muchas gracias por animarme y por vuestro cariño. A mis compadres Juan Zárate e Iñaki Arbea, por todo lo que me habéis enseñado de las ponzoñosas leishmanias; espero que todo lo que os ocurra sea tan bueno como fueron para mi los tres años que estuve con vosotros. A Marta, si se pudiera bautizar el gen de la prolactina canina debería llevar su nombre; gracias por el trabajo que has aportado a esta Tesis. A Amaia muchas gracias por tu ayuda, has sido un amiga durante cada día de estos cuatro años; en el ámbito profesional y personal gracias. A Montse, gracias por ayudarme con la captación de casos para la prueba clínica y apoyarme en todo momento. A Mamen, a Silvia y a Carmen. Muchas gracias, siempre me habéis ayudado, me habéis tratado con cariño y con una sonrisa en la boca. A Maite. Muchas gracias por tu energía, es contagiosa, y tus enseñanzas en leishmaniosis. A todos los compañeros del HCV, y muy especialmente a Laura Ibarra y a Adolfo, muchas gracias amigos, aunque sean palabras que no consiguen reflejar fielmente todo lo que representáis para mi. A Jose y a Ramón, gracias por haberme enseñado la pasión por la clínica de pequeños animales; seguramente sin los dos años que estuve con vosotros nada de esto hubiera ocurrido. A Imanol y a Nacho, muchas gracias por todo lo que hemos compartido y por arroparme siempre que os he necesitado. A María Angeles Lostao, gracias por todos los proteinogramas, los perfiles bioquímicos, y por tu paciencia y amabilidad conmigo. A Encarna, muchas gracias por tu mano con los cultivos; cualquier célula crecería con una citoquina como tú. A María Jesús, por todas tus buenas ideas y por tu buen hacer con los animales de laboratorio. A todos los propietarios que confiaron en mí y probaron el nuevo tratamiento, muchas gracias a vosotros y a vuestras magníficas mascotas A Javi Miñana y a Joaquín Medina, espero estar a vuestra altura y demostraros día a día lo agradecido que estoy de haberos conocido. A mis padres, Paco y Lourdes y a mi hermano Nacho, gracias, gracias y mil gracias, ojalá estéis la mitad de orgullosos de mí de lo que yo lo estoy de tener una familia así. Además gracias por apoyarme en todo y por soportar estoicamente el desorden y la continúa invasión de artículos y revistas que ha sufrido la casa “últimamente”. A Cristina; esta Tesis es de los dos, has estado en cada palabra de estas páginas. No puedo concebir otra motivación que no seas tú. Indice Revisión Bibliográfica Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 3 1.- PROLACTINA 1.1.- Estructura y función La prolactina es una hormona proteica sintetizada y secretada por células especializadas en el lóbulo anterior de la hipófisis (Riskind y cols. 1991; Draca 1995), que debe su nombre a la capacidad de inducir la lactación ante el estímulo de succión de las crías hambrientas de los mamíferos. Sin embargo en estos momentos son más de 300 funciones diferentes, no relacionadas con la lactación, las que se le atribuyen a esta hormona (Bole-Feysot y cols. 1998), estando implicada en la reproducción, en la homeostasis y en la inmunidad entre otras. Además de las múltiples funciones se han encontrado diversas fuentes celulares productoras de prolactina, sobre todo en células del sistema inmune (Dardenne y Savino 1996; Oberholtzer y cols. 1996). 1.1.1.- Biología molecular La prolactina de acuerdo a su secuencia genética, estructura y función, se engloba en el grupo I de las hormonas proteicas de hélice envuelta junto con la hormona del crecimiento y los lactógenos placentarios (Boulay y Paul 1992). Los genes que codifican estas tres hormonas han evolucionado desde uno común, mediante duplicación. La divergencia de la prolactina y la hormona del crecimiento se produjo en la especie humana hace aproximadamente 400 millones de años (Cooke y cols. 1981). La característica común en la prolactina de todas las especies es la presencia de tres puentes disulfuro intramoleculares entre residuos de cisteina (Cooke y cols. 1981). La homología encontrada entre las diferentes especies es elevada, variando desde el 97% entre mamíferos y primates hasta el 56% entre primates y roedores (Sinha 1995). En la rata y en el ratón la prolactina hipofisaria consta de 197 aminoácidos (Cooke y cols. 1980), siendo de 199 en la oveja, en el cerdo, en los bóvidos y en los humanos (Freeman y cols. 2000), con una peso molecular aproximado de 23000 Daltons. La estructura secundaria y terciaria de la prolactina ha sido muy estudiada. En la primera (estructura secundaria) el 50% de la cadena aminoacídica está dispuesta en α-hélices, mientras el resto de la molécula se dispone en forma de lazos. La estructura terciaria no se conoce, pero se ha inferido mediante un modelo de homología respecto a la hormona del crecimiento (Goffin y cols. 1995). De acuerdo a este modelo la estructura tridimensional Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 4 estaría compuesta por 4 largas α-hélices den un patrón antiparalelo (Abdel-Meguid y cols. 1987). Aunque la forma más común de esta hormona es la procedente de la hipófisis, en los últimos años se han caracterizado variantes, seguramente derivadas de un splicing alternativo del transcrito primario, del cleavage proteolítico y/o de otras modificaciones posttraducción de la cadena aminoacídica. El splicing alternativo, implicado en la retención de intrones, no parece ser la mayor fuente de variantes de la prolactina. El cleavage proteolítico, se ha comprobado como fuente de variabilidad, dando lugar a varios fragmentos con actividad biológica descritos en ratones, ratas y en humanos (Sinha y Gilligan 1984). Las modificaciones post-traducción producen la mayor parte de las variantes de la prolactina (Sun y cols. 1996). Dentro de éstas las más importantes son: la dimerización y la polimerización (macroprolactina) de reducida actividad biológica (Sinha 1995), la fosforilación (prolactina fosforilada) que representa aproximadamente el 80% de la prolactina hipofisaria en el bovino (Kim y Brooks 1993) con poco valor biológico, para actuar únicamente como regulador autocrino de la liberación de prolactina no fosforilada (Ho y cols. 1989), y la glucosilación (prolactina glucosilada) encontrada en un gran número de mamíferos, anfibios y aves (Sinha 1995), regula el clearance de la molécula, aunque al igual que el resto de variantes, tiene poca actividad biológica. 1.1.2.- Lugares de síntesis y secreción Los principales lugares o células productoras de prolactina se encuentran en el lóbulo anterior de la hipófisis, el cerebro, la placenta la decidua y el útero, la glándula mamaria y las células del sistema inmune. En el lóbulo anterior hipofisario las células productoras de prolactina son las lactótropas o mamótropas, que representan entre el 20 y el 50% de la población celular del lóbulo anterior. Estas células se han reconocido y tipificado usando tinciones inmunohistoquímicas específicas en el ratón, en la rata y en el hombre. En la rata, especie en la que están especialmente estudiadas estas células, se distribuyen en la porción lateroventral del lóbulo anterior y en una banda en adyacente al lóbulo intermedio. Los contornos son heterogéneos y se describen como poliédricos, aunque a veces se presentan redondas u ovaladas (De Paul y cols. 1997). La tipificación de estas células lactótropas se realiza en función de los gránulos y de la cantidad de RNAm usando la velocidad de sedimentación y los gradientes discontinuos de Percoll. Por tanto las células lactótropas son heterogéneas en su morfología, en su fenotipo hormonal, en su distribución y en su función. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 5 La primera cita de la presencia de prolactina en el cerebro data de 1977 (Fuxe y cols. 1977) cuando se encontró inmunorreactividad frente a anticuerpos anti-prolactina en los axones terminales del hipotálamo. Posteriormente se halló también en el cortex (telencéfalo), en el hipocampo, en los núcleos de la amígdala, putamen y caudado, en el cerebelo, en la médula espinal, en los plexos coroideos y en los órganos circumventriculares (DeVito 1988). Transcurrió una década hasta que pudo probarse de una manera contundente, con ratas hipofisectomizadas, que la prolactina encontrada en el hipotálamo era de producción local independiente (DeVito 1988). La función de esta prolactina sobre el sistema nervioso central no está demostrada, y aunque se ha sugerido cierto papel como neurotransmisor central neuromodulador o como citoquina reguladora de las funciones de la glía, resulta complejo distinguir entre los efectos de esta prolactina de origen hipotalámico y los procedentes de la hipofisaria. La placenta además del transporte metabólico materno-fetal y feto-materno posee un amplio espectro de funciones endocrinas, y una de ellas es la secreción de lactógenos placentarios, hormonas de la familia de la prolactina descritos en rata, ratón, hámster, vaca, cerda y humano (Robertson y cols. 1991; Shida y cols. 1992; Soares y cols. 1983; Southard y cols. 1987; Yamaguchi y cols. 1994). También la decidua produce la prolactina J en las primeras etapas de la gestación (Toft y Linzer 1999) y una molécula similar a la prolactina que resulta indistinguible de esta última. La liberación de estas dos moléculas es estimulada por la progesterona (Maslar y Ansbacher 1986). Incluso el útero no gestante se considera una fuente productora de prolactina miometrial de la que se desconoce su función específica (Gellersen y cols. 1991). En la glándula mamaria también se ha detectado la producción de prolactina en las células epiteliales, aunque se le ha asignado un papel de procesado post-traducción al observarse tanto en la rata como en el humano más variantes en la leche que en el suero (Kacsoh y cols. 1991). La función que cumplen estos péptidos producidos en la glándula mamaria, y presentes en la leche es crucial en la rata, ya que el neonato de esta especie es bastante inmaduro, con escaso desarrollo del sistema neuroendocrino, y el 20% de la prolactina que ingiere con la leche pasa directamente a la circulación (Grosvenor y Whitworth 1983) ayudando a madurar tanto el sistema neuroendocrino como el inmune (Shah y cols. 1988). Aunque la relación entre el sistema inmune y la prolactina será tratada en profundidad en el apartado 2.2. es importante subrayar la producción de prolactina en las células del Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 6 sistema inmune (Gala y Shevach 1994), como demuestra la liberación de prolactina bioactiva y la presencia de RNAm en el interior de linfocitos tomados de sangre periférica (DiMattia y cols. 1988; Gellersen y cols. 1989). A partir de este descubrimiento la prolactina pasó a considerarse como un puente entre el sistema neuroendocrino y el sistema inmune; además la presencia de receptores para la dopamina en los linfocitos, imbrica aún más a las células del sistema inmune con el metabolismo de la prolactina (Devins y cols. 1992). 1.1.3.- Receptores de la prolactina Los receptores de la prolactina son proteínas simples de membrana clasificados dentro de la superfamilia de los receptores clase 1 de las citoquinas (Agnati y cols. 1985). Desempeñan un importante papel en la transducción de la señal al interior de la célula, desde el dominio extracelular al intracelular (Yamashita y cols. 1996). Se han descrito numerosas isoformas de este receptor en distintos tejidos (Lesueur y cols. 1991) como consecuencia de transcripciones alternativas (Hu y Dufau 1991), en las que el dominio intracelular varía en longitud y composición, siendo idéntico el dominio extracelular (BoleFeysot y cols. 1998). La vía de activación del receptor y la transducción de la señal es compleja. En el primer paso la molécula de prolactina se une al receptor induciendo una dimerización secuencial del receptor (Bole-Feysot y cols. 1998). La formación de este complejo hormona-receptor es el prerrequisito para la interacción de un segundo sitio de unión de la hormona con otro receptor adyacente (Bole-Feysot y cols. 1998). Acto seguido se produce la transducción de la señal mediante la activación de un Jak2 y la fosforilación del dominio intracelular. Algunas funciones celulares, como la proliferación, en las que está implicada la prolactina y su receptor no requieren de la fosforilación del dominio intracelular (Yao y cols. 1996). En la transmisión de la señal intracelular están implicadas 4 moléculas de la familia STAT (transductores de señal y activadores de la transcripción), muy relacionada con la transducción de la señal en las citoquinas (Ihle y cols. 1994), y específicamente la STAT1, STAT3, STAT5a y la STAT5b han sido identificadas como los transductores de señal para el receptor de la prolactina (Goffin y cols. 1998). En primer lugar una proteína STAT se une al dominio intracelular del receptor, mientras se mantiene unida es fosforilada por la proteína Jak kinasa asociada el receptor. La STAT fosforilada se disocia del receptor y forma un hetero u homodímero, mediante un puente disulfuro con otra proteína STAT (Bole-Feysot y col. 1998). Este dímero de STAT se transloca al núcleo y activa, en un sitio de unión con el DNA, la región promotora en el gen diana (Carter-Su y Smit 1998). La secuencia consenso reconocida por las STAT dimerizadas se denomina GAS (secuencia activadora del γ- Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 7 interferón) (Horseman y Yu-Lee 1994). Muchas regiones promotoras contienen esta secuencia, y se ha comprobado in vitro que numerosas citoquinas la activan (Horseman y Yu-Lee 1994). Se ha propuesto que esta secuencia de actuación de las STAT está implicada en la iniciación de la respuesta inmune celular (Stoecklin y cols. 1997), y también se ha comprobado la internalización nuclear del propio receptor, sin conocerse a día de hoy ni las implicaciones biológicas, ni las funciones que desempeña (Rao y cols. 1995). Aunque el sistema Jak/STAT es la vía más importante de activación del receptor de la prolactina, hay otros sistemas implicados como el MAP (mitógeno activado proteico) y otras kinasas como el Src y el Fyn también relacionadas con la activación del receptor (Sorensen y Sheffield 1997). Entre las diversas localizaciones en las que se han descrito y caracterizado los receptores de la prolactina, no sorprende su presencia en la glándula mamaria y en el ovario (Nagano y Kelly 1994), pero resulto un hallazgo imprevisto la detección de RNAm de estos receptores en el sistema nerviosos central (plexos coroideos, amígdala, tálamo, hipotálamo, córtex y en el bulbo olfatorio) (Freemark y cols. 1995), y recientemente también se han caracterizado en infinidad de órganos y tejidos (corazón, pulmón, timo, bazo, hígado, páncreas, riñón, adrenales, músculo esquelético, piel …) (Nagano y Kelly 1994). 1.1.4.- Actividad biológica de la prolactina Las acciones en las que está implicada la prolactina son innumerables, y aunque todas ellas están en mayor o en menor mediada imbricadas, pueden desglosarse en reproductivas (lactación, función luteínica y comportamiento) y homeostáticas (osmorregulación, angiogénesis y sistema inmune). Dentro de los efectos producidos por la hormona que atañen al aparato reproductor, el más conocido y estudiado es la lactación. Ayuda al crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria (mamogénesis), a la síntesis de leche (lactogénesis) y al mantenimiento de la secreción de leche (galactopoyesis). La mamogénesis siempre se consideró relacionada con esta hormona, pero no se demostró hasta fechas recientes, en un estudio con ratones knockout (Ormandy y cols. 1997), la influencia de la prolactina en el tamaño y en las ramificaciones de los conductos mamarios, así como en el desarrollo del patrón lóbuloalveolar durante la gestación (Brisken y cols. 1999). La relación entre la lactogénesis y la prolactina siempre ha sido clara y usando ratas hipofisectomizadas se comprueba la incapacidad que tenían para producir leche. Recientemente con ratones konckout para el gen y los receptores de la prolactina se ha demostrado la misma incapacidad para la Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 8 actación (Horseman y cols. 1997). Aunque la prolactina resulta imprescindible para la lactación son necesarias otras hormonas para la perfecta sincronía y funcionamiento de la glándula mamaria, requiriendo la acción de estrógenos, progesterona y glucocorticoides. Además, se han encontrado evidencias de un relevante papel por parte de la hormona del crecimiento, de la insulina, de la hormona tiroidea y paratiroidea, de la calcitonina y de la oxitocina en la galactopoyesis.En algunos mamíferos se ha comprobado que la prolactina influye sobre el cuerpo lúteo. Un claro ejemplo son los roedores, en los que puede ser luteotrófica o luteolítica dependiendo del estímulo que se produzca. La acción luteotrófica descrita en la rata se manifiesta con un incremento de los niveles de progesterona, lo que resulta esencial para la implantación del óvulo fecundado, el mantenimiento de la gestación y la inhibición de la ovulación (Freeman y cols. 2000). El estímulo sobre la progesterona se induce por dos vías: potenciando el efecto esteroidogénico de la hormona luteinizante sobre las células de la granulosa e inhibiendo la 20α-hidroxiesteroide deshidrogenasa, que inactiva la progesterona. En los hámsters la prolactina es parte de un complejo luteotrófico formado por la hormona luteinizante, la hormona folículoestimulante y la prolactina. Hay evidencias de que este complejo luteotrófico puede existir en perros y en primates. Además del marcado carácter luteotrófico de la prolactina, también se ha demostrado un efecto contrario, luteolítico, induciendo apoptosis de las células del cuerpo lúteo (Matsuyama y cols. 1996) que parece estar mediado por linfocitos CD3+. El mecanismo por el que la prolactina puede ser a la vez una hormona luteotrófica y luteolítica se desconoce.El último efecto de la prolactina sobre la reproducción es la influencia sobre el comportamiento reproductivo (Dutt y cols. 1994). En las hembras está ligado a la receptividad, habiéndose encontrado receptores para la prolactina en el núcleo ventromedial del hipotálamo que controlan el comportamiento sexual (Crumeyrolle-Arias y cols. 1993); sin embargo se han obtenido datos contradictorios que no acaban de dilucidar el papel de la prolactina en el comportamiento sexual de la hembra (Witcher and Freeman 1985). En otro período del comportamiento reproductivo, el comportamiento parental, que engloba pautas como la construcción del nido y el lavado y acicalado de las crías entre otras, si que se ha establecido una relación clara con la prolactina, en la rata, en el hámster, en el ratón y en la oveja (Lucas y cols. 1998). Hay que subrayar que la prolactina por si sola, no inicia el comportamiento maternal, pero si que acorta el tiempo de latencia hasta su presentación (Bridges y cols. 1990). El contacto con las crías induce la transcripción de receptores de prolactina en el cerebro de las ratas (Sugiyama y cols. 1996). Este efecto no es género dependiente, observándose también en ratas machos (Sakaguchi y cols. 1996). Se comprobó que el comportamiento parental Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 9 dependiente de la prolactina es más marcado en los peces y en las aves, que en los mamíferos (Schradin y Anzenberger 1999). Además de los efectos descritos sobre el aparato reproductor, la prolactina también influye en el mantenimiento del medio interno regulando la homeostasis. La osmoregulación ha sido una de las últimas funciones de la prolactina en ser descubierta. Regula el transporte de agua y solutos a través de las membranas celulares de los mamíferos (Shennan 1994) aumentando el transporte de potasio en las células epiteliales de la glándula mamaria (Falconer y cols. 1983), y además estimula la captación de aminoácidos en la mama de la rata y ejerce un cierto control en la osmoregulación de las membranas amnióticas y en las células epiteliales intestinales. Otro apartado importante controlado por la prolactina es el desarrollo de vasos sanguíneos o angiogénesis. La acción fundamental de esta variante de prolactina de 16000 daltons es inhibitoria, impidiendo el desarrollo de estos. También se ha demostrado recientemente que tanto la prolactina intacta, como la hormona del crecimiento y los lactógenos placentarios presentan acción angiogénica (Struman y cols. 1999) aunque todavía no se ha encontrado el significado fisiológico de estos efectos opuestos. La modulación de la respuesta inmune por la prolactina es quizá la función más interesante y desde luego la más relacionada con este trabajo, por lo que será analizada en profundidad en el apartado 2.2. 1.1.5.- Patrones de liberación La secreción de la prolactina está influida por factores tales como el ritmo circadiano, el estado reproductivo y algunos estímulos estereoceptivos que determinan patrones de liberación específicos. El ritmo circadiano. Se ha comprobado en varias especies y en los humanos que los niveles de prolactina se encuentran elevados en las horas de sueño y disminuidos en la vigilia. Estudios recientes han clasificado al patrón de la liberación de la prolactina como un ritmo circadiano verdadero, ya que se mantiene en pacientes voluntarios independientemente del estado (sueño o vigilia) relacionándose con el núcleo supraquiasmático del hipotálamo. Así mismo en ratas hay una amplia base bibliográfica que evidencia este patrón (Freeman y cols. 2000). Uno de los moduladores es la dopamina, que inhibe la secreción, y está fuertemente influenciada a su vez por las horas de luz (BenJonathan 1985). A partir de estos resultados se están postulando muchos candidatos en la regulación de la prolactina y la oxitocina es quizá el que parece tener una relación más clara con el mantenimiento del ritmo circadiano de la hormona (Arey y Freeman 1992). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 16 adrenalectomizadas. Efectos similares a la adrenalectomía se obtienen suministrando RU486 (mifepristone), un bloqueante de los receptores de los glucocorticoides (Van der Schoot y cols. 1990). Además de regular la secreción, los corticoides también influencian la diferenciación y la morfología de los lactótropos (Carretero y cols. 1997) hacia somatotropos, suprimiendo los lactótropos en hipófisis de fetos de rata (Sato y Watanabe 1998). La placenta de las ratas genera un lactógeno de actividad biológica similar a la de la prolactina hipofisaria y además de mantener la gestación y preparar la glándula mamaria, también interviene en el proceso de liberación de la prolactina hipofisaria. En humanos este lactógeno se ha asociado a la activación de las neuronas TH, provocando la liberación de dopamina y suprimiendo consecuentemente la secreción de prolactina durante las primeras etapas de la gestación (Grattan y Averill 1991). El útero no gestante es la fuente de una sustancia todavía no tipificada que actúa directamente sobre los lactótropos inhibiendo la liberación de prolactina (Kanyicska y cols. 1990). Este factor se ha aislado de células epiteliales, del estroma y del miometrio. El tejido adiposo, es el último tejido implicado en la regulación de la secreción de prolactina. Se ha comprobado desde hace tiempo la relación existente entre el status nutricional y la capacidad reproductiva (Cunningham y cols. 1999). La leptina es un producto generado por este tejido que actuó en el sistema nervioso central regulando la ingesta y el peso (Houseknecht y cols. 1998). Esta sustancia estimula la liberación de prolactina in vitro en células de la hipófisis (Yu y cols. 1997). In vivo se ha demostrado que la inyección de prolactina eleva los niveles de leptina (Gualillo y cols. 1999), estando ambas imbricadas en el control del balance energético y reproductivo (Cincotta y Meier 1989). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 17 1.2.- La prolactina y el sistema inmune 1.2.1.- Relación con el sistema inmune e implicación en diversas patologías La colaboración en los fenómenos inmunitarios es otra de las numerosas funciones de la hormona; por su relevancia y la relación con este trabajo se revisan en un apartado ad hoc. Tradicionalmente se había considerado al sistema inmune un ente autónomo sin influencia por parte de las hormonas sexuales, tiroideas, suprarrenales o hipofisarias (Duran Chavez y Diaz Cristerna 1993). Hace unos años se demostró la función inmunorreguladora de la prolactina en mamíferos y aves, observando una relación recíproca entre la secreción de la hormona y la adecuada ontogenia, el perfecto desarrollo y funcionamiento, así como la correcta maduración de los tejidos del sistema inmune (Skwarlo-Sonta 1992). Estos hallazgos se realizaron casualmente, cuando se estaban desarrollando estudios con ratas hipofisectomizadas en las que se observaron numerosos desórdenes inmunitarios, linfopenia, atrofia del timo . . ., que no eran explicables con el paradigma del sistema endocrino y el sistema inmune como elementos independientes (Bouchard y cols. 1999). También se observaron en enanos hipofisarios estas deficiencias de la inmunidad celular y humoral, que se corregían al administrar GH y prolactina (Gala 1991). A partir de estos hechos se empezaron a investigar las imbricaciones entre el sistema inmune y el neuroendocrino (Berczi 1994; Dardenne y Savino 1996) considerándo a la prolactina como la llave entre ambos (Matera y cols. 2001). En la actualidad la prolactina no se considera un péptido mamotrópico, si no una citoquina pro-inflamatoria con efecto inmunomodulador (Hinterberger-Fischer 2000), muy semejante a la eritropoyetina, al GM-CSF, a la IL-2 y a la IL7 (familia citoquinas/células hematopoyeticas) (Oberholtzer y cols. 1996). Los trabajos relacionando esta hormona con el sistema inmune en mamiferos son numerosos (Gala 1991; Kelley y cols. 1992; Lavalle 1992; Di Carlo y cols. 1992; Berczi 1994; Murphy y cols. 1995; Hooghe-Peters y Hooghe 1998; Neidhart 1998; Walker y cols. 1998; Buckley y Buckley 2000; Dorshkind y Horseman 2000; Montero y cols. 2000), e incluso se ha observado esta relación en aves y en peces teleósteos (Skwarlo-Sonta 1990; Skwarlo-Sonta 1992; Narnaware y cols. 1998; Nevid y Meier 1995). Prácticamente todas las investigaciones referentes a la hormona, llevadas a cabo en la actualidad, están encaminadas a dilucidar el papel de esta en el sistema inmune. Aun quedan muchos puntos que aclarar y en otros muchos hay resultados contradictorios. Un hecho comprobado es el hallazgo de RNAm de la hormona en un gran número de líneas celulares inmunitarias y tejido hematopoyético, con mayor concentración en médula ósea Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 18 que en timo. Se demostró u presencia en neutrófilos, fibroblastos, macrófagos y linfocitos B y T de sangre periférica de ratón y rata (Gagnerault y cols. 1993). Kooijman y cols. en el 2000 también evidenciaron la producción de hormona, así como de variantes en peso molecular (isoformas), pero bioactivas por todas estas células, encontrando además receptores ubicados en stem cell medulares, en linfocitos B y T, sobre todo en T, en monocitos, en NK y en neutrófilos, lo que sugiere la función paracrina o autocrina de la prolactina en los órganos linfoides periféricos y centrales (Kiess and Belohradsky 1986; Gala 1991 Dardenne y cols. 1994; Draca 1995; Bouchard y cols. 1999; Montero y cols. 2000; VeraLastra y cols. 2002). La gran cantidad de células secretoras, y la existencia de receptores en estas mismas podría hacernos pensar en un cierto descontrol e inespecificidad, que no es tal, ya que la existencia a su vez de múltiples subunidades en los receptores y la complejidad en la transmisión intracelular de la señal garantizan una alta especificidad en cada tipo de las diferentes células del sistema inmune (Matera 1997). También es un hecho demostrado la función que desempeña la hormona junto a la GH en la organogéneis, relacionándose directamente con el desarrollo de los órganos linfoides primarios (médula ósea, bolsa de Frabicio en aves y timo) y secundarios (bazo, linfonodos y MALT), con la regeneración tisular, (Skwarlo-Sonta 1992; Draca 1995; Murphy y cols. 1995; Anisman y cols. 1996; Karabulut y Pratten 1998; Vera-Lastra y cols. 2002), con la maduración de los linfocitos (Matera y cols. 2000) y junto con el GM-CSF regulando la maduración de las células dendríticas (Matera y cols. 2001), cada vez más relevantes dentro de la respuesta inmune. De acuerdo con estos datos se ha evidenciado el importantísimo papel del condicionante genético en los niveles de expresión del gen de la prolactina así como en el grado de desarrollo de todos estos tejidos (Grossman 1989). Además de coadyuvar en el desarrollo tisular, regula la proliferación y la función de los linfocitos y la producción de inmunoglobulinas por parte de las células plasmáticas (Kiess y Belohradsky 1986; Giusti y cols. 1999), modifica la diferenciación, proliferación y supervivencia celular, y modula la respuesta inmune e inflamatoria (Yu-Lee 2002). Dicha acción inmunomoduladora se concreta en su capacidad para reconstituir el status inmune en ratas hipofisectomizadas o estimularlo mediante un patrón bifásico en animales con niveles bajos de hormona, en los que la inmunidad está totalmente alterada (Spangelo y cols. 1987; Cesario y cols. 1994). También en ratones enanos hipofisarios restaura la inmunocompetencia al ser administrada (Russell 1989; Gala 1991). La inmunomodulación que produce la hormona es positiva, estimulando la respuesta inmune frente a mitógenos (in vitro) y frente a antígenos (in vivo) (Leanos Miranda y cols. 1997; Montero y cols. 2000). Dos ensayos demostraron este papel inmunoestimulante de la prolactina: Meli y cols. en 1996 redujeron la mortalidad de ratones Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 19 infectados con Salmonella typhimurium administrándoles prolactina ovina, y anteriormente Di Carlo y cols. en 1993 habían demostrado un cierto grado de protección frente a Salmonella typhimurium en ratón usando prolactina recombinante humana. Las características de dicha estimulación son básicamente dos: sigue un patrón circadiano y presenta dimorfismo sexual. El ritmo circadiano de la hormona existe en todas las especies, incluso en los peces (Nevid y Meier 1995), estando influenciado por las horas de luz y por otros factores como el estrés, que aumenta los niveles de la hormona en algunas especies y en otras como en los hámsters sirios, sobre todo en los machos subordinados, los disminuye (Huhman y cols. 1995). El fotoperíodo, además de elevar los niveles de prolactina, actúa sobre la inmunidad mediante los corticoides y la melatonina (Nelson y Demas 1996). Los niveles bajos de la hormona se dan sobre todo en los días cortos (otoño e invierno), habiéndose demostrado una correlación entre este hecho y la presencia de infecciones oportunistas y de ciertos tipos de cáncer (Nelson y Demas 1996). La asociación entre la prolactina, fotoperíodo e inmunidad es patente por ejemplo en los hámsters en los que la estimulación linfoide producida por la hormona es mucho mayor a las 10 horas después amanecer que a las 15 horas; incluso la prolactina puede llegar a inhibir esta estimulación entre las 18 y las 23 horas (Cincotta y cols. 1995). También se ha demostrado en los monos rhesus , portadores del campilobacter , una sintomatología intestinal estacional dependiente de la bajada en los niveles de prolactina (Mann y cols. 2000). La segunda característica de la estimulación producida por la prolatina es la existencia de un marcado dimorfismo sexual. La respuesta inmune difiere en machos y en hembras, estas últimas parecen tener una mayor capacidad defensiva, dependiente de la concentración de esteroides sexuales, de GH y de prolactina (Grossman y cols. 1991). Tanto la inmunidad humoral como la celular son más activas en hembras; este mecanismo puede resultar compensatorio al estrés producido por la reproducción (Grossman 1989). Un hecho que demuestra esta hipótesis es la menor resistencia y la predisposición a sufrir complicaciones por sepsis tras un trauma hemorrágico en los varones (Angele y cols. 2000). La prolactina contrarresta la inmunodepresión producida por el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal en ratones hembra sometidos a sangrado severo, restaurando los niveles de linfoproliferación de los esplenocitos 2 horas después del sangrado (Zellweger y cols.1996), y para demostrarlo definitivamente, Nickel y cols. en 2002 usaron ratones machos y hembras a los que se les provocó un trauma hemorrágico. La administración de prolactina en ratones machos tras la hemorragia previno la inmunodepresión de la respuesta inmune celular, que no llegó a producirse en los ratones hembra. Por lo tanto la hipoprolactinemia daña el sistema inmune mientras que una hiperprolactinemia crónica puede inducir autoinmunidad (Chikanza 1999), Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 20 así el exacerbamiento de la respuesta inmune celular en las hembras tiene la contrapartida de predisponerlas a padecer enfermedades autoinmunes como el lupus sistémico, la artritis reumatoide o la esclerosis múltiple, con mayor frecuencia que los varones (Grossman y cols. 1991). Otra de las consecuencias de la estimulación de la inmunidad retardada por parte de la prolactina es la activación de las reacciones de rechazo de transplantes e injertos (Shen y cols. 1992) y para contrarrestar este efecto ya se está usando una droga, la bromocriptina, que produce una hipoprolactinemia que induce inmunosupresión y mejora la tolerancia al transplante (Compton y cols. 1994; Martinelli y cols. 1996). En contraposición a estos “efectos adversos” de la prolactina, se vislumbran varios posibles usos terapéuticos basados en el incremento de la respuesta antiinflamatoria y antitumoral que la situaría como una opción terapéutica en pacientes inmunocomprometidos y con cáncer (Matera y cols. 2000). Un claro ejemplo es el antagonismo de la prolactina sobre el TGFβ, una citoquina inmunosupresora asociada a la evolución de ciertos tipos de cáncer y al SIDA (Murphy y cols. 1995; Richards y cols. 1998). También es fundamental su papel supresor sobre la apoptosis, que regula el pool de linfocitos (Buckley y Buckley 2000) y sirve como cofactor para la regulación del receptor del CD25 en pacientes con cáncer de mama y con niveles de prolactina menores (Bauernhofer y others 2003). El hallazgo más reciente es la posible implicación de la prolactina en pacientes de VIH+ con buen pronóstico (Galli y cols. 2003). 1.2.2.- Mecanismos de actuación El mecanismo de acción de la hormona sobre la respuesta inmune es complejo y todavía hoy no está muy bien caracterizado. Parece ser que las diferentes isoformas de la hormona mantienen regulaciones diferentes: La producida por las células del sistema inmune interacciona con citoquinas linfocíticas regulando la propia liberación de la hormona en el sitio de la respuesta inmune, y por el contrario la de origen hipofisario está bajo el control del sistema inmune (estimulo no cognitivo) y del sistema nervioso central (estímulo congnitivo) (Matera 1997) mediante la actuación de los centros corticales y subcorticales (Kiess y Belohradsky 1986). En el apartado 1.1.6 ya se abordó la regulación y el mecanismo de acción de la prolactina hipofisaria, tratándose en esta sección únicamente de la originada en el sistema inmune. La prolactina de origen inmune transmite su señal al interior de las células hasta el núcleo, a través de receptores en linfocitos, y da lugar a la expresión de algunos genes y a la síntesis de proteínas (Skwarlo-Sonta 1992). Esta relación con la transcripción genómica es recíproca, la prolactina interviene en la transcripción genómica de los linfocitos (Yu-Lee y cols. 1990) y la respuesta inmune in vivo regula la expresión Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 21 genómica de la prolactina (Shen y cols. 1992), estableciéndose un feed-back entre respuesta inmune y prolactina controlado por numerosas citoquinas. El proceso molecular del que se sirve la hormona implica la estimulación de receptores específicos de superficie en linfocitos T, similares a los de la IL-12, utilizando después una ruta clásica de cascada de receptor de protein kinasa y una activación mediante translocación nuclear (Skwarlo-Sonta 1992; Prystowsky y Clevenger 1994). Concretamente la transducción de la señal se lleva a cabo a través de una Janus tirosin kinasa y por un STAT (Goffin y cols. 1999). Además de actuar en las células del sistema inmune la prolactina estimula la activación de la proteina kinasa C en el bazo y en el hígado, lo que explica su implicación en el crecimiento junto a la GH (Russell 1989). 1.2.3.- Macrógagos, NK y linfocitos T citotóxicos La influencia de la prolactina en la inmunidad celular es muy relevante y parece controlar la expresión de la respuesta Th1/Th2. El esquema de esta respuesta comienza en las células dendríticas, con la presentación de los antígenos a los linfocitos T helper (CD4+), divididos en dos subpoblaciones Th1 y Th2 que son indistinguibles morfológicamente. La separación es exclusivamente funcional y está basada en las interleucinas que producen: Los Th2 generan IL-3, IL-4 y TNFβ entre otras, que activan a los linfocitos B y a las células plasmáticas dando lugar a una respuesta humoral con elevada producción de anticuerpos. Los Th1 producen INFγ, IL-2 e IL-12 entre otras, que inducen una respuesta celular con activación de linfocitos citotóxicos (CD8+), macrófagos y células NK. Obviamente la respuesta no está tan polarizada, encontrando en el mismo animal ambas en equilibrio. Además existe otra subpoblación, Th3, que se encarga de modular a las otras dos (Neurath y cols. 2002). De forma esquemática la articulación de estas respuestas se resume en la Figura I.2. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 22 Figura I.2. Paradigma Th1/Th2. Esquema de la respuesta inmune humoral y celular Parece claro que la prolactina actúa principalmente sobre la respuesta innata no específica (Di Carlo y cols. 1993). La hormona no sólo estimula la respuesta Th1 si no que suprime la Th2, este hecho ha sido recientemente demostrado por Youn y cols. en 2002 usando ratones tratados con bisfenol, una droga que aumenta los niveles de prolactina circulantes. Esta relación con la inmunidad celular ya se había observado mientras se estudiaban potentes drogas inmnuosupresoras de este tipo de respuesta (Th1). Fueron Bernton y cols. en 1992 usando bromocriptina -capaz de disminuir la respuesta inmune retardada, la activación macrofágica T dependiente y la proliferación de linfocitos T y B in vitro al igual que los glucocorticoides, la ciclosporina A y la cisteaminalos que comprobaron que la mayoría de estas drogas reducían los niveles de prolactina circulantes suprimiendo la respuesta blastogénica de los linfocitos en ratones. Si a estos mismos ratones se les administraban drogas que aumentaban la liberación de prolactina o prolactina exógena, se antagonizaban todos los efectos inmunosupresores de las drogas anteriores. Sin embargo el efecto de los niveles de prolactina sobre la inmunidad celular no es directamente proporcional, y se ha comprobado que tanto la hipoprolactinemia como la hiperprolactinemia mantenida resultan inmunosupresoras (Matera 1997). Para mantener un estado inmune Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 23 competente se necesitan niveles fisiológicos, aunque parece que moderados incrementos de prolactina en momentos de inmunosupresión mediada por el eje hipotálamo-hipófisisadrenal, pueden contrarrestarlo (Matera 1997). Cuanto más se profundiza en el estudio de la hormona y de sus isoformas, más se concretan las diferencias entre ellas. Hay variedades, las de mayor peso molecular, que no parecen producir efecto alguno sobre el sistema inmune como se observó en personas con hiperprolactinemia crónica producida por un macroprolactinoma sin inmunoestimulación mesurable (Koller y cols. 1997), y sin embargo las otras isoformas son capaces además de modular la respuesta inmune, y de incrementar la respuesta antiinflamatoria y antitumoral (Matera y cols. 2000). El papel inmunomodulador de la respuesta inmune de la prolactina está sobradamente demostrado, activándola o inhibiéndola en función de su concentración (Matera y cols.1989), pero la influencia sobre cada tipo celular es aun controvertida. Las células dendríticas son las encargadas de presentar el antígeno, entre otras células, a los linfocitos T helpers. Cada día están cobrando mayor importancia y no se consideran ya unas meras espectadoras, inclinando la balanza inmmunitaria según la manera en que presentan los antígenos. La prolactina está implicada en la maduración de estas (Matera y Mori 2000) regulándola junto con el GM-CSF. Además influye sobre la tasa de presentación antigénica y una mayor concentración de prolactina aumenta la tasa de presentación, comprobándose que altas concentraciones de prolactina aumentan la permisividad en la presentación, iniciándose una respuesta frente al MHC que puede ser la explicación a la relación entre hiperprolactinemia y autoinmunidad (Matera y cols. 2001). Los linfocitos se encuentran divididos en varias familias que incluyen a los linfocitos T helpers o colaboradores, T supresores, T citotóxicos y linfocitos B. La prolactina actúa especialmente sobre los Th1 y los T citotóxicos, aunque se hayan identificado receptores específicos también en los NK (Draca 1995). Parece claro quer la hormona participa en la diferenciación temprana y tardía de los linfocitos T (Matera y Mori 2000), regula la respuesta local (Matera and others 2001) y además modula su reactividad (Hiestand y cols. 1986), aunque la mayor parte de los datos están elaborados en ensayos in vitro. En estos experimentos, por ejemplo mediante el uso de ciclosporina, se demuestra la relación de la hormona y la competencia linfocitaria, observando como la unión de la ciclosporina a los linfocitos T en el receptor de la hormona la desplaza, y adicionando nuevamente prolactina recombinante al cultivo, se restaura la competencia inmune (Hiestand y cols. 1986; Pichler Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 24 1987). Además de la funcionalidad la prolactina estimula la proliferación linfoide; incluso se ha encontrado un péptido específico similar a la prolactina segregado por los esplenocitos murinos que resulta imprescindible para la proliferación linfoide (Montgomery y cols. 1987). Mediante estudios de linfoproliferación en los que se valora la incorporación de [3H] timidina en el DNA de linfocitos, se ha demostrado la activación linfocítica que produce la hiperprolactinemia en esplenocitos de ratas tratados con metoclopramida, una droga hiperprolactinemiante (Zerek-Melen y cols. 1990). La prolactina participa también en la activación linfocitaria y en particular en la citotoxicidad de los NK y de los LAK, CD56+, CD16+ incrementándola cuando se encuentra en condiciones fisiológicas y suprafisiológicas (Matera y cols. 1999). Sin embargo la hiperprolactinemia patológica, es decir tumoral o autoinmune, deteriora el estado citotóxico de las NK y de los linfocitos T (Kadioglu y cols. 2001). Los macrófagos son unas de las células efectoras más importantes de la respuesta inmune celular, y también en éstas se han encontrado receptores para la prolactina (Thorat y cols. 1993). Es quizá en los macrófagos en donde está ampliamente aceptado el papel inmunoregulador y activador de la fagocitosis de la prolactina (Gaytan y cols. 1994; Ortega y cols. 1996; Meli y cols. 1996; Zhu y cols. 1997). Hay numerosos ensayos usando diferentes modelos animales que lo confirman; Di Carlo y cols. en 1993 en ratas in vivo, demostraron la activación sin movilización desde otras localizaciones, subrayando así la regulación producida por la prolactina en la inmunidad no específica. La misma observación la realizó Ortega y cols. en 1996 usando macrófagos peritoneales de ratón in vitro con dosis de prolactina semejantes a la hiperprolactinemia. Más tarde, en teleósteos Narnaware y cols. en 1998 inyectaron prolactina ovina intraperitoneal encontrando un incremento de la activación de la capacidad fagocitaria y del número de linfocitos circulantes. Incluso en aves, la incubación in vitro de heterófilos con prolactina ovina hace incrementar su capacidad fagocítica, la destrucción de partículas fagocitadas y el test de reducción del NBT (nitroazul de tetrazolio), además in vivo se obtienen los mismos resultados en la fase final de la incubación cuando los niveles de prolactina están elevados (Rodriguez y cols. 1996). El mecanismo molecular por el que la prolactina consigue esta activación macrofágica está bien estudiado, la primera observación fue la realizada por Edwards y cols. en 1992 al administrar GH y prolactina, comprobando un incremento de la producción de INF γ y del anión superóxido. Un año después se corroboró este hallazgo usando macrófagos peritoneales de ratones tratados con prolactina en los que estaba aumentada la producción de anión superoxido y de peróxido de hidrógeno (Chen y Johnson 1993). La misma Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 25 observación realizaron Warwick-Davies y cols. en 1995 usando monocitos. Hasta ese momento se habían implicado como causantes de la activación macrofágica al INF γ, al anión superóxido y al peróxido de hidrógeno; en 1996 un experimento realizado por Meli y cols. comprobó la acción profiláctica de la prolactina recombinante humana frente a Salmonella typhimurium , implicando al óxido nítrico como elemento fundamental. Si se trataba a los ratones con un inhibidor de éste (L-NAME) se revertía totalmente el papel protector de la prolactina. Este importantísimo hallazgo ha sido relacionado recientemente con un nuevo papel de la prolactina. La hormona consigue estimular a los macrófagos peritoneales hacia un estado tumoricida, aumentando la producción de NO2, de oxido nítrico sintasa y de O2 en estos macrófagos (Raso and others 1999). In vivo la administración de prolactina inhibe la progresión del carcinoma ascítico de Ehrlich (EAC) en ratones (Majumder y cols. 2002), incrementando la citotoxicidad frente a tumores, aumentando el tiempo de supervivencia y disminuyendo el número de metástasis (Sun y cols. 2002). Las células NK representan una subpoblación linfocítica derivada de la médula ósea y diferente de los linfocitos B y T que actúan en la respuesta inmunitaria innata para destruir células infectadas por microorganismos. Este grupo celular es uno de los más controvertidos en su relación con la prolactina. Inicialmente se relacionó la hiperprolactinemia patológica (tumoral o autoinmune) con una reducción de la actividad y del número de células NK, que se restablecía en pacientes tratados con bromocriptina (Gerli y cols. 1986). Posteriormente se volvió a reseñar esta perdida de actividad en la hiperprolactinemia del puerperio (Nicoletti y cols. 1989), y prácticamente al mismo tiempo se decía que la prolactina no interfería en la funcionalidad de estas células (Matera y cols. 1989). Tres años después se volvió a asociar la hiperprolactinemia con la reducción en la funcionalidad de las células NK (Vidaller y cols.1992). El primer trabajo que presenta la prolactina junto a la IL-12 como dos potentes inductores de la activación de las NK fue el de Cesano y cols. en 1994. Después se tipificaron receptores específicos para la hormona (Draca 1995) y se delineó una relación más compleja dependiente de la concentración de la hormona (Chakraborty y cols. 1996). A partir de entonces se comenzaron a asociar los altos niveles de INFγ inducidos por la prolactina con la activación de las NK (Matera 1997), tanto a niveles fisiológicos como suprafisiológicos (Matera y cols. 1999), considerando incluso a la prolactina y a la GH, y no a la presencia de antígenos, como los verdaderos reguladores del número de células y del aumento de celularidad en la médula ósea (Berczi y cols. 2000; Sun y cols. 2002). Sin embargo todavía sigue habiendo resultados contradictorios respecto a la relación entre estas células y la prolactina a altas concentraciones; algunos estudios apuntan la posibilidad de Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 32 1.4.- Utilidad clínica de la hormona y de los fármacos relacionados A lo largo de la revisión se han citado aplicaciones terapéuticas actuales o experimentales de la prolactina que incluyen, las enfermedades que producen inmunodepresión, como fármaco estimulador de la hematopoyesis y hasta como terapia frente a ciertos tipos de cancer; sin embargo la ausencia de prolactinas específicas de especie y el elevado coste de las recombinantes restringen su uso en el ámbito veterinario de los pequeños animales. Para circunvalar este problema en este trabajo se recurrió a un fármaco que incrementase los niveles séricos de la hormona. Se usó la domperidona un antiemético con actividad antiD2, antagonista de la dopamia. Sus principales indicaciones son los vómitos por uremia, migraña, pancreatitis, dismenorrea y las dispepisas. Su biodisponibilidad oral es de un 15%, y su volumen de distribución de 6 l/kg con una semivida de 7 horas y media, eliminándose mediante metabolismo hepático. En este trabajo se aprovecha la capacidad antagonista de los receptores D2 de la dopamina (Nasello y cols. 1997; Freeman y cols. 2000; Matera y Mori 2000; Matera y cols. 2000) que hace elevar los niveles de prolactina, a través del aumento en la liberación de serotonina, sin cruzar la barrera hematoencefálica (Nasello y cols. 1997; Freeman y cols. 2000; Matera y Mori 2000; Matera y cols. 2000). Este aspecto resulta crucial; otros posibles candidatos provocan reacciones adversas de origen extrapiramidal, que nunca se manifestarán usando domperidona; así otros fármacos como la fenfluramina (Dulchin y cols. 2001), la sulfirida, la clormpromacina (Gabay 2002), la metoclopramida (Cunha-Filho y cols. 2001; Gabay 2002) y la cimetidina (Knigge 1990; Meltzer y cols. 1993; Willems y cols. 2000) son capaces de elevar los niveles séricos de prolactina, pero presentando más efectos secundarios que la domperidona. Este fármaco anti-emético induce un pico en la secreción de prolactina entre la primera y cuarta hora tras su administración, que produce un efecto estimulador in vitro en los linfocitos T con ConA, aumentando significativmente dos horas despues de la administración, la producción de INFγ por parte de leucocitos (Rovensky y cols. 1995). Por tanto la hiperprolactinemia producida por la domperidona actúa sobre el sistema inmune, en la misma forma que la natural, elevando los CD4+Th1, el INF-gamma y haciendo descender los CD4+Th2 (Berczi y Bertok 2000). Además otra dato a tener en cuenta acerca del uso de la domperidona es su bajo coste, que puede ser administrada en tratamientos prolongados y la ausencia de efectos adversos (Mann y Akinbami 2000). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 33 2.- LEISHMANIOSIS 2.1.- Biología 2.1.1El género Leishmania La Leishmaniasis engloba las enfermedades parasitarias causadas por protozoarios de los géneros Leishmania y transmitidos por insectos hematófagos de los géneros Lutzomyia y Phlebotomus en América y Europa (Slappendel y Green 1990; Bravo y cols. 1993). Se considera una zoonosis que afecta a los animales y al hombre (Rodríguez y cols. 1999), y aunque éste es un hospedador accidental, la leishmaniasis humana tiene una distribución muy amplia que incluye al menos 88 países (Hu y cols. 2000) en todos los continentes excepto algunas islas del Pacífico, Australia y la Antártida (Dereure y cols. 1999). William Leishman y Charles Donovan en 1903 fueron los primeros en identificar al parásito en biopsias de enfermos hindúes (Alvar 1997). Desde entonces estos protozoos se encuadraron en el Reino Protista, aunque actualmente tiendan a incluirse en el Reino Animalia (Figura I.3.) Reino: Protista (Animalia) Subreino: Protozoa Tipo: Sarcomastigophora Subtipo: Mastigophora Clase: Zoomastigophora Orden: Kinetoplastida Suborden: Kinetoplastida Familia: Trypanosomatidae Género: Leishmania Subgénero: Leishmania Especie: Leishmania infantum (Nicolle 1908). Figura I.3. Clasificación del género Leishmania (Adaptado de Molyneux y Ashford, 1983). Las clasificaciones del género Leishmania siempre han presentado una gran dificultad porque la morfología del parásito no proporciona rasgos discriminativos útiles y por eso se Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 34 ha ido recurriendo a criterios circunstanciales como la geografía, el descubridor, el cuadro clínico y otras características, que al final han proporcionado nomenclaturas confusas y poco eficaces para la identificación de un conjunto en expansión del que al menos se han descrito 23 especies como causantes de enfermedad (Killick-Kendrick 1990) . La incorporación a la biología de nuevas tecnologías basadas en el estudio del fenotipo y en el análisis del DNA del género Leishmania , se han ido utilizando para perfilar clasificaciones cada vez más precisas que permitan establecer sus relaciones con la patogenia y su propagación. La clasificación fenotípica usa la caracterización electroforética de los isoenzimas del parásito para separar hasta 26 especies, tal como se recoge en la Figura I.4., estando considerada como la técnica de referencia. Los patrones isoenzimáticos idénticos en parásitos de la misma especie se agrupan en un único zimodema (Miro y Fraire 1999) que se considera un elemento básico en la taxonomía, porque permite compartir criterios idénticos. Actualmente en Europa se están utilizando 15 sistemas enzimáticos con la nomenclatura descrita por Chance (Alvar 1997). Figura I.4. Clasificación del género Leishmania por medio de isoenzimas (Rioux y cols. 1990). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 35 La caracterización genotípica basada en el estudio del ADN tiene la ventaja de que estudia un material, el genoma, que no se altera con los cambios morfológicos del ciclo biológico ni con la respuesta inmune del huésped. La variedad de técnicas utilizadas incluye la hibridación con sondas de ADN (Noyes y cols. 1998), la amplificación de DNA al azar (RAPD) (Noyes y cols. 1996), el PPIP-PCR (Eisenberger y Jaffe 1999), el análisis del polimorfismo en los fragmentos de restricción (RFLP) (Bulle y cols. 2002) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Katakura y cols. 1998; Mauricio y cols. 2001). La morfología del parásito se concreta básicamente en dos variantes que cubren todo su ciclo vital: el promastigote -extracelular, flagelado y localizado en el tracto digestivo del hospedador invertebradoy el amastigote -aflagelar y situado en el interior de los macrófagos de los vertebrados- (Urquhart y cols. 1996). Figura I.5. Promastigotes de L. infantum en cultivo. La evolución del promastigote se inicia cuando está anclado en las microvellosidades del tubo digestivo del flebotomo gracias a un flagelo único y muy largo, con un cuerpo que mide entre 10-20μm y un kinetoplasto muy próximo al núcleo celular, y se denomina promastigote nectomona. Cuando migra hacia las porciones más anteriores del estómago, se redondea, su flagelo rico en lipofosfoglicanos (LPG) se acorta para facilitar la adhesión a las lecitinas que revisten el tubo digestivo, y entra en la fase de promastigote haptomona que carece de capacidad infectiva (Hoare y Wallace 1966; Alvar 1997; Boelaert y cols. 2000). Posteriormente vuelve a perder la adherencia por cambios en los LPG, el flagelo se hace muy largo en comparación con el cuerpo fino y corto, y recupera la capacidad de infectar; Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 36 entonces se sitúa en la hipofaringe del flebotomo, listo para ser inoculado, y se denomina promastigote metacíclico (Alvar 1997). Los estudios realizados en cultivos de promastigotes de L. major , tanto en formas no infectivas -en fase de crecimiento logarítmica o procíclicacomo en formas infectivas -en fase de crecimiento estacionario o metacíclicademostraron que la estructura del LPG es común, y estaba constituida por un anclaje lipídico, un núcleo glicano y una larga cadena de oligosacáridos unidos por enlaces fosfodiéster con ramificaciones y grupos terminales. La configuración corta, P-LPG, favorece la unión del promastigote al intestino del flebotomo y le protege de la digestión, mientras que la forma P-LPG permite su liberación del intestino y favorece la unión a los macrófagos (Mc Conville y cols. 1992; Sacks y cols. 2000). El amastigote es la forma aflagelar que se desarrolla en los macrófagos de los vertebrados con una configuración ovoidea o redondeada de 2.5 a 5 μm de diámetro, y con un núcleo y un kinetoplasto característico en forma de barra (Hoare y Wallace 1966; Simpson y cols. 1982). Aunque la evolución natural de promastigote a amastigote se produce con el cambio de hospedador, se ha demostrado in vitro con la Leishmania mexicana que también es posible esta transformación de promastigotes metacíclicos a formas similares a amastigotes tratándolos con suero humano y reactantes de fase aguda como la proteina C reactiva (Bee y cols. 2001) Figura I.6. Amastigotes de L. infantum en el interior de un macrófago de perro. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 37 El estudio de la infección por Leishmania con anticuerpos específicos, va incrementando el número de proteínas involucradas en la biología del parásito, y entre éstas son especialmente relevantes proteínas de membrana tales como la gp63 (Shreffler y cols. 1993; Morales y cols. 1997), la gp46 (Burns y cols. 1991), la PSA (Jiménez-Ruiz y cols. 1998), la KMP-11 (Berberich y cols. 1997), la proteína de unión al ácido hialurónico (HABP) (Rao y cols. 1999) y la p36/LACK, que aunque no es una proteína de membrana, tiene un papel importante en la supervivencia del parásito, relacionado con los mecanismos de síntesis y reparación del DNA nuclear y del kinetoplasto (González-Aseguinolaza y cols. 1999) 2.1.2.- El papel de los Phlebotomos y Lutzomyias La primera descripción de Phlebotomus perniciosus la hizo Newstead en 1911 en la isla de Malta, sin embargo tuvieron que pasar algunos años hasta que se le relacionó con la Leishmaniosis, cuando distintos autores lograron infectar hembras de esta especie después de ser alimentadas sobre un perro con Leishmaniosis visceral (Parrot y cols. 1930; Adler y Theodor 1930). Hasta ahora se han identificado al menos 39 especies del género Phlebotomus que se alimentan de sangre humana (Killick-Kendrick y cols. 1979) aunque en el área del Mediterráneo occidental se considera a Phlebotomus perniciosus como el principal vector de la Leishmaniosis. Los Phlebotomu s son pequeños dípteros hematófagos pertenecientes a la subfamilia Phlebotominae (Díptera, Psychodidae) que incluyen dos géneros con especial interés en medicina: Phlebotomus que transmite la enfermedad en Europa (Boelaert y cols. 2000) y Lutzomyia que la transmite en América (Bejarano y cols. 2001). En España se han identificado al menos 11 especies. La morfología de todos los miembros de este género que pasan por una metamorfosis de tipo holometábola, incluye cuatro estadios bien diferenciados y fácilmente distinguibles Los huevos tienen un aspecto fusiforme con un tamaño entre 350–360µm de largo, por 100-120 µm de ancho (Fausto y cols. 1992) y cuando están recién puestos tienen una coloración blanca o grisácea según la especie, aunque al poco tiempo adquieren un color café oscuro o negro. El corion está esculpido en relieve con protuberancias o polígonos, que forman patrones específicos de especie. La observación de estos patrones por microscopia electrónica, ha permitido la identificación de muchas especies (Ward y Ready 1975; Zimmerman y cols. 1977; Endris y cols. 1987). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 38 La larva eclosiona a los 5 a 7 días después de la oviposición, gracias a una estructura en forma de diente situada en su cabeza y que le permite romper la pared del huevo (Ward 1985). La morfología de las larvas es semejante a la de una oruga, que sigue cuatro etapas bien definidas en su desarrollo. En el primer estadio, recién salida del cascarón, mide aproximadamente 0.5mm de largo por 0.1mm de ancho, para crecer dos veces su tamaño original antes de mudar el segundo estadio. Sucede lo mismo con el tercer y cuarto estadio, hasta llegar a unas dimensiones máximas antes de la pupación de 4 mm de largo y 0.6mm de ancho, con un cuerpo blanco por la evacuación de su intestino (Eldridge y Edman 2000), cilíndrico, recubierto de cerdas y dividido en nueve segmentos abdominales y tres torácicos. En los primeros siete segmentos abdominales posee patas falsas, que le permiten desplazarse en el medio. La cabeza es de color marrón, carece de ojos y tiene un aparato bucal masticador. La pupa conserva la exuvia de la última muda y se fija verticalmente a la superficie en la que se encuentre en donde va cambiando de color, pasando del blanco al marrón oscuro. Al principio de la evolución es sésil y aunque son inmóviles reaccionan a los estímulos táctiles con movimientos de forma pendular; con el paso del tiempo se van desarrollando las características morfológicas del insecto adulto, perfectamente visibles a través de la cutícula, y aproximadamente 40 días después de la ingestión de sangre emerge el insecto adulto (Molina 1991). El flebotomo adulto es más pequeño que otros dípteros, inferior a 5 mm, y además tiene una apariencia frágil. Se les puede reconocer por algunos rasgos característicos como la gran cantidad de sedas que recubren su cuerpo, las patas largas y las alas de aspecto lanceolado, que se insertan en el cuerpo con un ángulo de 45º a 60º con respecto al eje logitudinal. El color del cuerpo, sin diferencias entre machos y hembras, varía desde el marrón claro hasta el negro según la especie a la que pertenece. La cabeza tiene una implantación inferior en el tronco, lo que le confiere un aspecto giboso (Eldridge y Edman 2000). En las hembras la boca está especializada para la ingestión de sangre y dispone de un fascículo con seis estiletes. El aparato genital de los machos (externo e interno) y de las hembras (interno) tiene una gran importancia taxonómica. Las hembras tienen un abdomen cilíndrico y grueso que contiene los conductos genitales internos y las espermatecas, con grandes variaciones en el tamaño y en la forma entre especies y subespecies. Los machos tienen un aparato genital externo con simetría bilateral (Eldridge y Edman 2000), y es característica la rotación de la genitalia en 180º durante las 24 horas siguientes a la eclosión, antes de las cuales no se puede realizar el apareamiento con la hembra (Molina 1994). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 39 Figura I.7. Hembras de Phlebotomus perniciosus alimentandose sobre membrana con un preparado de eritrocitos. 2.1.3.- Ciclo biológico Leishmania tiene un ciclo biológico complejo en el que participan hospedadores invertebrados, dípteros de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia, y un amplio rango de mamíferos que incluye al hombre (Alexander y Russell 1992). El esquema general del ciclo biológico de Leishmania spp. sitúa en el primer plano a las hembras del insecto vector, hematófagas, por lo que son consideradas como las únicas responsables de la transmisión del parásito (Lariviere y cols. 1987). La secuencia de la infección da los siguientes pasos: La hembra del mosquito, infectada al alimentarse de un animal, le inocula formas infectivas del parásito que son fagocitados por los macrófagos en cuyas vacuolas se transforman en amastigotes y se multiplican. Cuando el macrófago infectado no puede contener más formas parasitarias estalla, liberando a los amastigotes que pueden infectar nuevos macrófagos y a través de la picadura también pueden infectar a un nuevo vector, situándose en el tubo digestivo del flebotomo. En unos días se transforma en promastigotes y evoluciona a formas metacíclicas en la parte anterior del tracto digestivo, en la proximidad de la probóscide, quedando listos para ser inoculados en la siguiente ingesta, cerrando de esta forma el ciclo biológico (Molyneux y Killick-Kendrick 1987). En el interior del insecto vector, el ciclo biológico del parásito pasa por tres fases. La primera fase se inicia con la ingurgitación del parásito y llega hasta los 2 días post-ingestión. Todo el desarrollo de esta etapa en la que los amastigotes ingeridos evolucionan a Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 40 promastigotes pro-cíclicos, ocurre en el intestino medio, en la membrana peritrófica que contiene la ingesta de sangre. Algunos autores han observado divisiones previas de los amastigotes antes de dar lugar a las formas procíclicas (Killick-Kendrick y cols. 1979). Esta transformación ocurre entre las 6-12 horas post-ingestión, que es cuando aparecen las formas procíclicas ligeramente móviles, cortas, ovoides, con un núcleo difuso y un flagelo corto, que se pueden observar nadando en la periferia del cúmulo de sangre ingerida. Transcurridas entre 36 y 48 horas desde la infección, estas formas tempranas de promastigotes empiezan a transformarse en Promastigotes Nectomonas, adquiriendo una morfología esbelta, alargada y con un flagelo largo. En la segunda etapa, 2-5 días post-ingesta, la membrana peritrófica constituda por un armazón de quitina y una matriz de proteínas y carbohidratos, se rompe y su contenido parcialmente digerido es arrastrado hasta alcanzar el íleon. Existen fuertes evidencias de que el deterioro y ruptura de la membrana peritrófica es favorecido por la multiplicación desmedida del parásito, así como por la transformación de Promastigotes procíclicos a Nectomonas que liberan quitinasas; estos Promastigotes Nectomonas se unen a las microvellosidades de la pared intestinal por medio de los flagelos y se van desplazando hasta alcanzar la porción torácica del intestino medio uniéndose a la íntima cuticular del cardias y a la válvula estomodeal, mediante estructuras flagelares llamadas hemidesmosomas (Killick-Kendrick y cols. 1974), unión favorecida por una matriz similar a un gel (Lawyer y cols. 1987). Figura I.8. Preparación en fresco de un intestino de Phlebotomus perniciosus repleto de promastigotes. Durante el tercer estadio, a partir del quinto día post-ingestión, el intestino se limpia de contenido sanguíneo, los huevos completan su desarrollo, se inicia la oviposición, y simultáneamente se produce una infección masiva del aparato digestivo anterior por Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 41 haptomonas que migran hacia el esófago y faringe posterior para acabar dispersas en el cibarium y probóscide, mientras se transforman en Promastigotes metacíclicos que son las formas específicamente preparadas para infectar a un nuevo hospedador (Eldridge y Edman 2000). Se han planteado varias hipótesis para explicar las formas de transmisión, y hay tres a las que se les da especial relevancia. En la primera de éstas, la transmisión se realiza con la inoculación de formas infectivas durante la ingestión de sangre o mediante la regurgitación de ésta, en la segunda hipótesis hay una ingestión directa del vector como ocurre en el caso de las Sauroleishmanias, y en la tercera opción, la transmisión se produciría al aplastar una hembra infectada sobre la piel (Adler 1929). Recientemente se ha sugerido una nueva forma de transmisión que se explicaría por la contaminación de lesiones o heridas con fluidos excretados por el insecto vector durante la ingestión de sangre sobre el hospedador vertebrado, y las observaciones realizadas por Sádlová y Volf en 1999, aislando parásitos a partir de muestras de excreciones de P. papatasi (37.5%) y P. duboscqi (16.1%) parecen demostrarlo. 2.1.4.- Modelos experimentales Se han desarrollado diversos modelos experimentales para el estudio de la Leishmaniosis, con la intención de controlar los componentes genéticos del parásito y del huésped, y sin embargo hasta ahora, ninguno ha sido capaz de reproducir fielmente la enfermedad humana, y seguramente uno de los factores que más contribuye a establecer las diferencias entre los modelos animales y humanos es la naturaleza del inóculo. En las infecciones naturales, el flebótomo introduce en la piel un número muy pequeño (posiblemente alrededor de 100 a 1,000) de promastigotes metacíclicos junto con su saliva fuertemente biorreactiva, mientras que en las infecciones experimentales, se inyectan miles o tal vez millones de promastigotes obtenidos de cultivos o amastigotes derivados de tejidos. Además el punto de inoculación es superficial y el inóculo de parásitos infectivos es probablemente muy pequeño, en contraste con las infecciones de laboratorio en las que se inoculan volúmenes relativamente grandes, de 50μl o más, en la hipodermis o por vía intravenosa (Handman 2001). La ausencia de modelos definitivamente concluyentes, ha llevado a proponer la utilización de distintas vías de infección en el mismo animal (Grimm y cols. 1991; Bories y cols. 1998; Requena y cols. 2000 Martínez y cols. 2000), además de la evaluación de la eficiencia de diversos animales. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 48 diferenciación de las células pluripotenciales hematopoyéticas y activa la capacidad bactericida del macrófago (Grabstein y cols. 1986). En 1984 Murray y col. señalan que el GM-CSF es capaz de incrementar la actividad leishmanicida del macrófago (Guarga 1998). El Interferón El Interferón gamma (IFN-γ) conocido también como IL-18 (Tone y cols. 1997) es una citoquina secretada principalmente por las células T (Karupiah y cols. 1990) que estimula en el macrófago la producción de intermediarios tóxicos del oxígeno como el Óxido Nítrico (ON) (Nacy y Meltzer 1991). Los estudios realizados in vitro e in vivo , han podido demostrar la efectividad del IFN-γ como un potente activador de los macrófagos infectados por Leishmania (Ho y cols. 1994), considerando a esta citoquina como una molécula clave en la curación de la leishmaniosis (Holaday y cols. 1993). La interacción del IFN-γ y la IL-2 con los macrófagos murinos induce la producción de IFN-α en respuesta a la infección por Leishmania (Narumi y cols. 1990). El IFN-γ aumenta la expansión de células Th1 y su diferenciación (Kemp y cols. 1996), pero por sí sólo no es capaz de generar una respuesta Th1 y necesita la intervención de otras citoquinas (Heinzel 1994) y especialmente de la IL12 (Scott 1993). De todas formas el IFN-γ sigue siendo el mediador final del desarrollo de clones Th1, considerándose un inhibidor de la proliferación de clones Th2 (Powrie y cols. 1993). Recientemente se ha observado que en ratones BALB/c irradiados con Rayos Ultra Violeta (UVA) se detecta RNAm codificante para IFN-γ y respuesta Th1, mientras que en los ratones no irradiados no se detectó RNAm y tuvieron respuesta Th2. Cuando además se les infectó con L. amazoniensis , el grupo irradiado mostró una supresión significativa en el desarrollo de lesiones cutáneas, en comparación con el grupo no irradiado (Khaskhely y cols. 2001). Factores de Necrosis Tumoral El Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) es una citoquina pleiotrópica producida por los macrófagos (Guarga 1998) e implicada en la regulación inmune y en la defensa del hospedador frente a numerosos patógenos intracelulares (Derouich-Guergour y cols. 2001). En la leishmaniosis cutánea experimental por L. major , la adición de TNF-α, tanto endógeno como exógeno, incrementa la resistencia (Kossoda y cols. 1994). En estudios in Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 49 vivo se ha observado que induce la formación del granuloma tisular (Amiri y cols. 1992) y que disminuye durante la leishmaniosis visceral aguda, pero su producción se restablece tras el tratamiento (Ho y cols. 1992). El Factor de Necrosis Tumoral beta (TNF-β), también conocido como Linfotoxina alfa, es una potente citoquina que se asocia con la respuesta inflamatoria (Carroll y cols. 1987) y se le ha relacionado con la miastenia grave experimental de los ratones (Christadoss y Goluszko 2002) y con el inicio y progresión del daño renal (Abboud 1993) en la glomerulonefritis de distintos modelos animales (Boswell y cols. 1988). También se ha descrito que la presencia en humanos del genotipo (TNFA2/TNFA2), se valora como un factor genético de pronóstico desfavorable para el desarrollo de nefropatía por IgA. La respuesta Th2 se caracteriza por la imposibilidad de la destrucción intracelular del parásito en el macrófago y por la producción de IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 y GM-CSF, así como por la estimulación de la respuesta humoral con la producción de cantidades significativas de IgG1, IgE e IgA y el desarrollo de eosinofilia (Deplazes y cols. 1995). En general a la respuesta de tipo Th2 se la considera perjudicial y es la que se observa en las formas de leishmaniosis con mal pronóstico tanto en ratones como en humanos (Uzonna y Bretscher 2001). Interleucinas La Interleucina-3 (IL-3) está producida tanto por células con fenotipo Th1 como por las Th2 (Pinelli y cols. 1999). A pesar de que en humanos parece ser que la IL-3 es capaz de inhibir la replicación intracelular de L. amazonensis y Trypanosoma cruzi (Ho y cols. 1992a), en modelos murinos la producción de esta citoquina se asocia con una leishmaniosis generalizada (Bourdeau 1994). También se ha observado que la administración de IL-3 y GM-CSF recombinante aumenta el desarrollo de las lesiones producidas por L. major así como la multiplicación de los parásitos dentro de los macrófagos incluso en lugares distantes a la lesión primaria, independientemente de la susceptibilidad o la resistencia de los ratones a la infección (Guarga 1998). La Interleucina 4 (IL-4) posee una gran capacidad para la estimulación de células B, por lo que originalmente se le denominó como Factor-1 estimulante de células B (Nacy y Meltzer 1991) ya que estimula la síntesis preferente de anticuerpos de clase IgE (Holaday y cols. 1993) que se consideran como un marcador de la presencia de IL-4 (Miralles y cols. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 50 1994). La producción de IL-4 está relacionada con la exacerbación de la enfermedad, tal y como se ha visto en infecciones experimentales de ratones BALB/c (Launois y cols. 1999) y en pacientes afectados de Kala-azar (Deplazes y cols. 1995) e incluso se la considera capaz de decantar la diferenciación celular hacia el fenotipo Th2 como se ha observado en modelos murinos utilizando anticuerpos monoclonales anti-IL-4, que inhibían la expansión de células Th2 favoreciendo la curación (Chatelain y cols. 1992). Estudios recientes realizados por Uzonna y Bretscher en 2001 indican que la neutralización de la IL-4 es suficiente para provocar la resolución de lesiones crónicas en ratones BALB/c. La interleucina 5 (IL-5) posee la capacidad de estimular el crecimiento, diferenciación y proliferación de los eosinófilos (Kraneveld y cols. 1997) y juega un papel preponderante en la patogénesis de infecciones por helmintos y en procesos alérgicos en humanos (Lotvall y Pullerits 1999). Esta citoquina se ha identificado en las respuestas del tipo Th2 (Pinelli y cols. 1999). La interleucina 6 (IL-6). Aunque se ha sugerido la asociación entre la secreción de IL-6 y la producción de elevados niveles de anticuerpos (Hirano y cols. 1986) se ha observado que la secreción de esta citoquina en las células mononucleares de sangre periférica en presencia de promastigotes de L. major , no mostró diferencias significativas entre los individuos curados y los no expuestos al parásito (Guarga 1998). Resultados similares se han presentado en la especie canina, ya que los sobrenadantes de células PBMC, estimuladas con antígeno soluble de Leishmania (LSA) procedentes de perros asintomáticos, no mostraron diferencias significativas de actividad IL-6 entre los perros sintomáticos y el grupo control no infectado (Pinelli y cols. 1994). La interleucina 10 (IL-10) la producen los keratinocitos, las células T, los macrófagos y determinadas células B (Enk y Katz 1992). Entre sus funciones destaca su actuación como factor de crecimiento de células T y mastocitos, incrementa la viabilidad de las células B y es un estimulador de la expresión de MHC de clase II (Guarga 1998). La IL-10 posee una clara asociación con la patología de la leishmaniosis visceral humana (Ho y cols. 1994), observándose elevados niveles de RNAm de esta citoquina en los nódulos linfoides de pacientes con infección aguda de L. donovani , mientras que en personas tratadas con éxito se observan unos niveles normales de IL-10 (Ghalib y cols. 1993). Esta citoquina es considerada en la infección humana por L. donovani como el mayor factor de inmunosupresión (Holaday y cols. 1993). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 51 A pesar de que en un principio la IL-10 se consideró como un inhibidor de la síntesis de citoquinas por los clones Th1 murinos (Fiorentino y cols. 1989), posteriormente se demostró que ese efecto inhibitorio era debido a su actuación sobre las células presentadoras de antígeno (Vieth y cols. 1994). La interleucina 13 (IL-13) al igual que la IL-4 es producida por las células T activadas, e inhibe la producción de ON y TNF-α en el macrófago (Zurwaski y De Vries 1994). Recientes estudios han demostrado que la IL-13 juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune hacia distintas enfermedades parasitarias como las helmintiasis intestinales (Finkelman y cols. 1999) o las infecciones por Schistosoma mansoni (Chiaramonte y cols. 1999) Esta interleucina también tiene un importante papel en la regulación de la inmunidad dependiente de células Th2 como se ha observado con la adición de IL-13 o IL-4 exógenas a cultivos in vitro de células CD4+ obtenidas a partir de ratones IL-13-/-, que no lograron restaurar la producción de citoquinas del tipo Th2 (Mc Kenzi y cols. 1998) Las inmunoglobulinas La IgG canina está compuesta por 4 subclases que en concordancia con la nomenclatura utilizada en medicina humana se denominan IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En el suero normal de perros, las subclases IgG1 e IgG2 son las más abundantes con unas concentraciones medias de 8,17 ± 0,95mg/ml y 8,15 ± 3,16mg/ml, respectivamente (Mazza y cols. 1994). Los niveles de cada una de estas subclases de IgG se han puesto en relación con la activación de los fenotipos Th1 y Th2, de tal forma que una respuesta de tipo Th1 predispone a una producción preferencial de IgG2a (Coffman y cols. 1988), mientras que el fenotipo Th2 favorece la secreción de la subclase IgG1 (Rizzo y cols. 1995). De todas formas no debe descartarse la posibilidad de que la respuesta de subclases de IgG sea meramente un efecto secundario de mecanismos celulares más importantes (Deplazes y cols. 1995). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 52 2.2.2.- Infección clínica La enfermedad del perro presenta gran variabilidad de presentaciones (Carrasco y cols. 1997; Ciaramella y cols. 1997; Valladares y cols. 1997) y la respuesta inmunológica se manifiestá como un condicionante de la evolución de la enfermedad (Campino y cols. 2000) La infección, incluso, puede ser asintomática en un alto porcentaje de perros (60-80%) (Ferrer 1999). La misma variabilidad que se da en las manifestaciones clínicas se da en el período de incubación en el que se registran rangos entre los 2 y los 25 meses en las formas subclínicas de la leishmaniosis canina experimental (Slappendel 1988; Oliveira y cols. 1993). Las manifestaciones clínicas van desde las formas hiperreactivas, en las que no se aprecian parásitos pero existen lesiones orgánicas importantes y sintomatología severa, hasta formas anérgicas con diseminación generalizada, con un gran número de parásitos y pocas o ninguna manifestación clínica (Griffiths 1987). Ciaramella y cols. en 1997, al realizar un estudio clínico retrospectivo con 150 perros infectados de manera natural por Leishmania infantum en Italia, observaron 16 perros en los que no fue posible demostrar la presencia de parásitos en cultivo ni por citología, y sin embargo presentaban síntomas asociados a la enfermedad, así como títulos altos de anticuerpos determinados por medio de IFI. También se observó que la gran mayoría de los animales presentaron una forma crónica de la enfermedad, mientras que la forma aguda sólo se detectó en seis animales que presentaban fiebre, linfoadenomegalia generalizada y ausencia de lesiones. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 53 Tabla I.1. Manifestaciones clínicas observadas en 158 perros con Leishmaniosis. Koutinas y cols. 1999. Tabla I.2. Manifestaciones clínicas observadas en 150 perros con Leishmaniosis Ciaramella y cols. 1997. Síntomas clínicos No. de perros % del total Linfadenopatia 133 (88.7%) Dermatitis exfoliativa 84 (56%) Ulceras 60 (40%) Onicogrifosis 36 (24%) Pérdida de peso 48 (32%) Esplenomegalia 80 (53.3%) Ascitis 3 (2.5%) Anemia 90 (60%) Síntomas clínicos No. de perros % del total Linfadenopatía 103 (65.2%) Lesiones cutáneas 80 (50.6%) Dermatitis ulcerativa 82 (64.1%) Onicogrifosis 39 (30.5%) Pérdida de peso 40 (25.3%) Atrofia muscular 39 (24.7%) Conjuntivitis 38 (24.1%) Estomatitis ulcerativa 9 (5.7%) Ascitis 4 (2.5%) Anemia 116 (73.4%) Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 54 La difusión de la Leishmaniosis canina representa un verdadero problema sanitario, y en Europa se calcula que por lo menos 7 millones de perros están en riesgo de padecer la enfermedad (Reithinger y cols. 2001). En España la LC al igual que en el humano, es causada por una sola especie Leishmania infantum (Martín-Sánchez y cols. 1999) y es zoonótica (Koutinas y cols. 1999) En el año 1913 Pittaluga, comunicó el primer caso de Leishmaniosis Canina (LC) en la península ibérica, en la misma región geográfica donde un año antes había reseñado el primer caso en humanos. La LC esta sumamente diseminada en los países que poseen costas en el Mediterráneo (Fernández-Pérez y cols. 1999; Roura y cols. 1999). La prevalencia de la LC en España oscila entre un 1.6% en Galicia y un 18% en Cataluña (Alvar 1997). En las islas Baleares la seroprevalencia de la LC es de un 24 a un 26% (Matas y Rovira 1989), mientras que en Menorca la LC parece estar ausente (Alvar 1997). Los zimodemas aislados de infecciones caninas en España, son el ZM-1, ZM-11, ZM-77 (Dereure y cols. 1999) y ZM105 (Alvar 1997), aunque el zimodema MON-1, es el más frecuente en la Cuenca Mediterránea (Aoun y cols. 2000). Actualmente se considera al perro como el principal reservorio de esta enfermedad en el sur de Europa (WHO 1990; Cavaliero y cols. 1999), aunque hay otros cánidos silvestres cuyo papel en la transmisión aun está por determinarse, y ya se han encontrado evidencias de la infección en zorros ( Vulpes vulpes ) (Martín Iniesta y cols. 1982), en ratas ( Rattus rattus ) (Benavides y cols. 1985) y en lobos ( Canis lupus ) (Zárate y cols. 2000). 2.2.3.- Diagnóstico Las opciones diagnósticas de la leishmaniosis son muy variadas y con amplios rangos de sensibilidad y de especificidad lo que permite la selección individualizada del método en relación con las condiciones técnicas y socioeconómicas de cada lugar. Los métodos diagnósticos utilizados en la leishmaniosis canina se pueden separar en dos grupos: Los métodos directos se basan en la demostración de la presencia del parásito en los frotis o en el estudio histopatológico de biopsias, el cultivo o la detección del DNA de la Leishmania con la PCR. Con un uso restringido habitualmente a la investigación también se incluyen en este grupo la inoculación a animales y el xenodiagnóstico. Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 55 Los métodos indirectos evalúan la respuesta inmune a la infección cuantificando los anticuerpos específicos por Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) o por Aglutinación Directa (DAT), y midiendo la respuesta celular con el Test de Montenegro o con la Prueba de Proliferación Linfocitaria (LPA). Métodos Directos Son los procedimientos más eficaces para demostrar la infección con una especificidad del 100% pero con una sensibilidad que varía entre el 50% de los ganglios linfáticos y el 6080% de la médula ósea (Boelaert y cols.1999). Los Frotis de Aspirados de ganglios linfáticos o médula ósea tienen la ventaja de su sencillez técnica y de la inmediatez, pero su sensibilidad está en un 60% para la médula ósea y es menor de un 30% en el ganglio linfático (Ferrer 1999). Los frotis esplénicos parecen tener mayor sensibilidad, 95-97%, aunque tienen una mayor incidencia de complicaciones ( Zijlstra y El-Hassan 2001). El Estudio Histopatológico de biopsias de piel o ganglios linfáticos solo es diagnóstico en la leishmaniosis si se observa directamente el parásito porque las lesiones tisulares son inespecíficas. Con frecuencia se comprueba una sensibilidad baja por la escasa presencia de parásitos en la muestra, lo que obliga a recurrir a la inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para mejorar los resultados de la hematoxilina-eosina (Bourdoiseau y cols. 1997). El Cultivo y aislamiento del parásito es un procedimiento sencillo y con mayor sensibilidad que el frotis, sobre todo cuando la cantidad de parásitos presentes en la muestra es bajo (Lightner y cols. 1983). Se utilizan tres categorías generales de medios de cultivo: semisólidos y bifásicos -que utilizan sangrey líquidos que utilizan Suero Bovino Fetal o eritrocitos lisados (Limoncu y cols. 1997). Con fines diagnósticos, el medio NNN (NovyNicolle-McNeal) que es un medio bifásico de agar sangre, es el más utilizado y de elección en la Cuenca Mediterránea para el aislamiento de Leishmania (Portús 1987). Con este medio se hace el primer control de la muestra en los 4-10 días posteriores a la siembra y si no se advierte crecimiento a partir del séptimo día, se realizan hasta cuatro resiembras que si son negativas se valora como un resultado definitivo (WHO1996; Dedet y cols. 1999). Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 56 Cuando se requiere una producción masiva de parásitos para la elaboración de antígenos (WHO 1996; Ozbel y cols. 2000) o para la identificación bioquímica (Evans 1989) se utilizan otros medios como el RPMI 1640, el 199 y el medio de Schneider (Evans 1989). Las Técnicas Moleculares representadas por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se usan ampliamente en el diagnóstico de la leishmaniosis (Hu y col. 2000) al que aportan algunas ventajas sobre el resto de las técnicas, como la evaluación de la respuesta terapéutica (Osman y cols. 1998), la utilización de una gran variedad de tejidos como muestra -sangre, piel, médula ósea, aspirados linfáticos- (Reithinger y cols. 2000; Lechaud y cols. 2001) o su elevada sensibilidad que permite la detección de un sólo parásito en 10mL de sangre (Rodgers y cols. 1990). Recientemente se han desarrollado diversos oligonucleótidos que permiten amplificar específicamente el DNA de Leishmania (Lechaud y cols. 2000; Solano Gallego y cols. 2001) y también es posible incrementar la sensibilidad de la prueba usando una variante de la técnica conocida como Nested PCR, que consiste en amplificar el producto de una PCR previa (Noyes y cols. 1998). La Inoculación a animales de laboratorio por vía intraperitoneal o intracardiaca (Bories y cols. 1998; Zijlstra y El-Hassan 2001) y el Xenodiagnóstico -en el que el insecto vector se alimenta directamente sobre el individuo sospechoso, (Molina y cols. 1994; Molina y J. Alvar 1996) son técnicas restringidas a la investigación o a casos clínicos muy concretos. Métodos indirectos Los Métodos Serológicos son una buena alternativa a la demostración directa del parásito (Piramez y cols. 1999) porque por su sencillez y eficiencia pueden ser utilizados en condiciones de campo (Neogy y cols. 1992). Entre las técnicas serológicas empleadas en la investigación de la Leishmaniosis canina destaca la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) que es reconocida como el "gold standard" del diagnóstico serológico por su sensibilidad y especificidad, pero que resulta poco práctica para examinar grandes muestras (Gradoni 1999). La alternativa es la Aglutinación Directa (DAT), que es un test muy sensible para la demostración de anticuerpos antiLeishmania y además permite su uso en condiciones de Revisión Bibliográfica Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 57 campo (Oskam y cols. 1999) sin perder su alta especificidad que se sitúa en un rango de 90100% en controles sanitarios de zonas endémicas (Boelaert y cols. 1999a). Figura I.9. EasyDAT de dos sueros de perros en una placa con fondo en uve. *sueros de pacientes tratados, **sueros de pacientes no tratados. Tabla I.3. Especificidad y sensibilidad del DAT frente a otros métodos diagnósticos. T écnica Sensibilidad Especificidad Referencia DAT*/parasitoló g icos 100% 100% Harith y cols. 1986 DAT**/parasitoló g icos 100% 99.3% Harith y cols. 1986 DAT/IFI 100% 100% Harith y cols. 1987 DAT/ELIS A 96.3% 100% Harith y cols. 1987 DAT/parasitoló g icos 100% 98.9% Harith y cols. 1989 DAT/parasitoló g icos 94% 72% Ziiestra y cols. 1991 DAT/parasitoló g icos 95.4% 95.4% Neo g y y cols. 1992 DAT/ELIS A 100% 100% Neo g y y cols. 1992 DAT/dot-ELIS A 100% SD Gupta y cols.1994 DAT/parasitoló g icos 100% 85% Boelaret y cols. 1999 DAT/parasitoló g icos 95.9% 99.4% Boelaret y cols.1999a DAT/Dip Stik K39 100% 93-96% Bern y cols. 2000 DAT/IFI 100% 100% Ozbel y cols. 2000 Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 64 Diagrama del diseño experimental de la tesis Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 65 2.- INFLUENCIA DE LA LACTACIÓN EN LA INFECCIÓN POR Leishmania infantum . ESTUDIO EXPERIMENTAL EN UN MODELO CRICETO ( Mesocricetus auratus ) Para este experimento se utilizaron 60 Hámsters Sirios hembras; durante los 6 meses que duró el ensayo, el mantenimiento y cuidado de los animales se realizó en el Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza, de acuerdo a las Guías Internacionales para el uso de animales de laboratorio. Se confeccionaron 3 grupos de 20, con los 60 hámsters. En el primero, grupo A, todas las hembras estaban en período de lactancia y se infectaron con 25 millones de promastigotes de Leishmania infantum intraperitonealmente. Las 20 hembras del grupo B fueron el control negativo y se les realizaron los mismos controles en ausencia de lactación y de infección. El grupo C estaba compuesto por animales no lactantes, e infectados con 25 millones de promastigotes de L. infantum por vía intraperitoneal. Figura II.1. Mesocricetus auratus , Hamster Sirio Dorado del Grupo A, en lactación e infectado Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 66 El material biológico para realizar la infección se consiguió a partir del aislamiento de Leishmania infantum (MHOM/FR/78/LEM-75) de bazos de hámsters enfermos sembrando un macerado de la pulpa esplénica en tubos con medio semisólido NNN (Novy-Nicolle-McNeal). Una vez realizado el aislamiento, aproximadamente en una semana, se escalaba a un medio RPMI 1640 enriquecido con L-glutamina y NaHCO3 (SIGMA U.K.), adicionando Suero Fetal Bovino (Sigma-Aldrich, St. Luis Mo), al 10% (v/v) inactivado por calor y una mezcla antibiótica (penicilina 100UI/ml y estreptomicina 100μg/ml) para evitar las contaminaciones bacterianas, todo él filtrado a través de membranas de 0,22μm de poro, antes de comenzar el cultivo. Nunca se realizaron más de tres pasajes, evitando así la pérdida de la capacidad infectiva del protozoo. Las condiciones, la técnica y la preparación de los medios empleados para el aislamiento y cultivo se describirán con detalle en el apartado 6 (Métodos de Evaluación). Se consiguió el inóculo mediante centrifugación y lavado del cultivo usando Solución Salina Fisiológica (B. BRAUN, Medical S.A., Barcelona), ajustándose la concentración en una cámara de recuento de Neubauer, a 25 millones de promastigotes por mililitro. Se cargó el inóculo en una jeringuilla de 1ml y se inyectó, tras desinfectar la zona, a través de la pared abdominal en el peritoneo. En el grupo A la infección se llevaba a cabo al día siguiente del parto, y en el grupo C todas las hembras se inocularon el mismo día. En los 6 meses que duró el experimento no se administró ningún tratamiento y la única manipulación ambiental que se realizó fue la retirada de las crías de la jaula de la madre a los 30 días. Durante el ensayo se controló un parámetro clínico, el peso, y se monitorizó el nivel de anticuerpos anti-leishmania mediante una prueba diagnóstica indirecta, el EasyDAT. Los días de control fueron el 0, 7, 15, 30, 60, 90, 120, 150, y el 180. El pesado y toma de muestras se realizó tras sedación de los animales usando una droga disociativa de gran seguridad como la ketamina a una dosis de entre 0,1 a 0,2 mg de anestésico por gramo de peso vivo, administrada por vía intramuscular. Tras el pesaje se obtenía una muestra de sangre periférica, entre 1,5 y 2,5 ml por animal, puncionando el plexo retroorbital con un capilar libre de anticoagulantes en tubos Eppendorf de 1,5 ml, obteniendo el suero por centrifugación (Figura II.2.) También se valoró la respuesta inmune retardada o celular usando el Test de la Intradermorreacción y un test de linfoproliferación in vitro (Kit Elisa Biotrak, Amersham Pharmacia Biotech). Ambas pruebas descriras en el apartado 6 (Métodos de Evaluación), se llevaron a cabo los días 0, 90 y 180 para evaluar el estado inmune, de gran importancia en el desarrollo de la enfermedad. La intradermorreacción se realizaba bajo sedación y se leía a las 72 horas; la última inoculación se hizo el día 177 leyéndose el día 180. El test de Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 67 estimulación linfocítica se realizó en sangre periférica, 0,5 ml, anticoagulada con EDTA y los resultados se interpretaron a los 5 días. El día 180 después de realizar todos los controles programados se eutanasió a los animales con una sobredosis de barbitúricos, cumpliendo las condiciones sobre protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos, especificados en el artículo 11 del Convenio Europeo, Estrasburgo, 18 de marzo de 1998 (B.O.E. 256, 25 de octubre de 1990). Antes de la toma de muestras se pesaron y midieron hígado y bazo, obteniéndose muestras de ambos y de médula ósea para realizar improntas, aislamiento en medio N-N-N, estudio anatomopatológico y carga parasitaria, detallados en el apartado 6 (Métodos de Evaluación) (Figura II.3.) Figura II.2. Toma de muestras mediante punción del plexo retroorbital bajo sedación Figura II.3. Día 180 después de la inoculación; necropsia Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 68 Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 69 3.-ESTUDIO PRELIMINAR DE LA RELACIÓN ENTRE LA DOMPERIDONA, LA INMUNIDAD Y LA HEMATOPOYESIS EN BEAGLES SANOS Para comprobar la influencia de la hiperprolactinemia en los perros enfermos de leishmaniosis se diseñó una prueba clínica, que al ser la primera que empleaba drogas hiperprolactinemiantes carecía completamente de antecedentes bibliográficos. Inicialmente se valoró la utilización de prolactina recombinante, pero su alto coste la hacia totalmente inviable, despojando al experimento de toda aplicabilidad posterior, por lo que se optó por una sustancia como la domperidona que elevase los niveles de prolactina sin producir efectos adversos en el animal. El siguiente paso consistió en determinar la dosis y la pauta de administración, estipulándose en 1mg/kg cada 12 horas durante 1 mes. Aunque la elevación de la prolactina empleando esa dosis era casi segura de acuerdo a la bibliografía y a los estudios farmacocinéticos en otras especies, se diseñó una prueba para comprobar dicha elevación y evaluar además la interacción con la hematopoyesis y con la inmunidad. En el ensayo se usaron 20 perros de raza Beagle, 10 machos y 10 hembras. Todos ellos se colocaron en jaulas separadas, en cuartos aislados del Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza, adecuadamente atendidos por personal del Centro de Apoyo a la Experimentación Animal de la misma Universidad, cumpliendo las condiciones sobre protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos (Real Decreto 223/1998, B.O.E. 67, 18 de marzo de 1998). Mediante venopunción de la yugular se obtuvo sangre periférica el día 0, antes de la administración, y los días 5, 15 y 30 tras administrar 1mg/kg de domperidona por vía oral cada 12 horas durante todo el mes. La sangre recogida se separaba en 5ml en medio McCoy’s 5a para cultivo de los progenitores hematopoyéticos y 2,5 ml en tubos con EDTA para la prueba del NBT (Test de la reducción del Nitroazul de Tetrazolio). Ambas técnicas se detallaran en el apartado 6 (Metodología empleada). Además el día 0 se realizo una curva de niveles de prolactina, usando un kit ELISA comercial (MILENIA, DPC), tomando sangre en la hora 0, a la hora tras administrar el fármaco, a las 4 horas y a las 10 horas. Inmediatamente, tras la toma de muestras se procesaban para evitar la degradación de la hormona. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 70 4.- ESTUDIO DE LA EFICACIA TERAPÉUTICA DE LA DOMPERIDONA EN PERROS ENFERMOS DE LEISHMANIOSIS El principal objetivo de la prueba clínica era demostrar el papel terapéutico de la elevación de los niveles séricos de la prolactina frente a la enfermedad. Se utilizó la domperidona, un antiemético y procinético gástrico, para aumentar los niveles de la hormona. La pauta que se usó fue de 1 mg/kg cada 12 horas durante 1 mes por vía oral, para perros de menos de 30kg. La dosis absoluta correspondiente para los perros de más de 30 kg se consideró excesiva, administrando en estos casos 0,75 mg/kg cada 12 horas durante 1 mes. Hay que destacar la ausencia de referencias bibliográficas al respecto, ya que éste es el primer ensayo con la domperidona como droga inmunopotenciadora frente a una patología. Debido al gran espectro de manifestaciones clínicas y analíticas de esta enfermedad, y a la utilización de perros infectados de forma natural que acudieron al SMIPA (Servicio de Medicina Interna de Pequeños Animales) del Hospital Clínico Veterinario de la Unirversidad de Zaragoza, se confeccionaron dos grupos de acuerdo a su sintomatología y a su título de anticuerpos. En el grupo (A) se incluyeron 70 perros con títulos bajos de anticuerpos (1/800-1/1600 en EasyDAT), 34 asintomáticos y 36 con linfadenomegalias y/o síntomas cutáneos leves. En el grupo (B) se encuadraron 28 perros con títulos altos de anticuerpos (>1/1600), todos polisintomáticos. Figura II.4. Perro del Grupo A con una marcada linfadenopatía preescapular Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 71 Cuando se diagnosticaba un perro como positivo, antes de incluirlo en el estudio se tomaron muestras de aspirado de ganglio poplíteo y de médula ósea en la unión costocondral, para visualización directa en microscopio óptico y para aislamiento en 10 tubos de medio N-N-N. En todos los perros del estudio se aisló el parásito, excluyéndse 11 perros serológicamente positivos en los que el aislamiento y la visualización directa fueron negativos. También se descartaron otros 8 perros que tenían otras enfermedades (6 Ehrlichiosis, 2 otitis crónica) o con tratamientos concurrentes (1 corticoesteroides, 1 antibióticos). Se valoraron 98 perros a los que se les realizó el siguiente control clínico: - Sintomatología: se valoraron todos los síntomas asociados a la leishmaniosis (dermatitis exfoliativa, alopecias, linfadenomegalias, palidez de mucosas, adelgazamiento, uveitis, onicogrifosis ...). Figura II.5. Perra del Grupo B con alopecias perioculares Síntoma de la cara de payaso Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 72 Figura II.6. Dermatitis exfoliativa y alopecia auricular Figura II.7. Palidez de la mucosa oral en un Dogo Alemán Figura II.8. Onicogrifosis y onicorrexia Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 73 - Perfíl bioquímico general: se incluyó perfil renal, hepático, glucosa, colesterol, proteínas totales, calcio y fósforo. Además se realizó un análisis electroforético de proteínas. - Urianálisis: se valoró el U P/C o ratio proteína/creatinina urinaria. - Titulación de anticuerpos: se uso el EasyDAT (Test de la Aglutinación Directa) considerándose positivo una dilución de 1/800. Esta valoración se efectuó los días 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, llevando a cabo todos los controles mencionados. Además se realizó una evaluación de la respuesta inmune celular, mediante pruebas de linfoproliferación in vitro los días 0, 30, 180, 360 (Biotrak cell proliferatrion ELISA,Amersham Pharmacia Biotech), y mediante la prueba de la intradermorreacción con leishmanina los días 0, 90, 360. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 80 Cabra 612 GATTCAAGCAAGATTGACACTTACCTTAAGCTCCTGAATTGCAGAATCATCTACAACAAC Oveja 655 GATTCAAGCAAGATTGACACTTACCTTAAGCTCCTGAATTGCAGAATCATCTACAACAAC Hombre 616 GATTCACATAAAATCGACAATTATCTCAAGCTCCTGAAGTGCCGAATCATCCACAACAAC Gato 622 GATTCACATAAGATTGACAGTTATCTCAAGCTTCTGAAGTGCCGAATTGTCTACGACAGC Ratón 613 GATTCCCACAAGGTTGACAATTTTCTCAAGGTCCTGAGGTGCCAAATTGCCCATCAAAAC Hamster 613 GATTCCCACAAGGTTGACAATTATCTCAAGCTCCTGAGATGTAGAGTTGTCCACAACAAC Gallina 622 GATTCCCACAAAATTGACAACTATCTTAAAGTTTTGAAGTGCCGCCTAATCCATGATAGC Pavo 622 GATTCCCACAAAATCGACAACTATCTTAAAGTTTTGAAGTGCCGCCTAATCCATGATAAC Consensus GATTCaCAtAAgaTtGACAaTTATCTCAAGCTcCTGAagTGccGAaTtgTCcACaACAaC Cabra 672 AACTGCTAA---------- Oveja 715 AACTGCTAA---------- Hombre 676 AACTGCTAA---------- Gato 682 AACTGCTAA---------- Ratón 673 AACTGCTAA---------- Hamster 673 AACTGCTAA---------- Gallina 682 AATTGCTAAATGGACAGCA Pavo 682 AATTGCTAA---------- Consensus AACTGCTAA---------- Primers Sintetizados Secuencia (5’-3’) T m Estructuras secundarias Dímeros Forward 5’-ATG RAC ANC NAR GGN TNR NC -3’ 60 Reverse 5’- T TA GCA GTT GYT GTN RTR GA -3’ 56 PRL 1 5’-ATG IAC AIC IAI GGI T -3’ 39.8 No No PRL 2 5’- T TA GCA GTT GIT GTI GT -3’ 48.8 No No PRL 3 5’-CAC AAC CTG TCC TCG GAA AT -3’ 63.8 Muy débil No PRL 4 5’-CCT CGT TTT CTC TGA CTC CG -3’ 63.8 No No * Los cebadores fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd.; las secuencias fueron las siguientes: Y = C+T; R = A+G; N = A+C+G+T; M = A+C; I = Inosina. Los cebadores Forward, Reverse, PRL 1 y PRL 2 se diseñaron basándose en las homologias encontradas en los extremos 5’ y 3’, mientras los dos restantes, PRL 3 y PRL 4, se obtuvieron de homologías internas seleccionadas por el programa Primer3Output wwwgenome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi/primer3_www.cgi. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 81 a) Primers Forward + Reverse: Temperaturas de hibridación 65.8º y 62.8ºC, respectivamente. ATG RAC ANC NAR GGN TNR NC (M-N/D-S/T/I/N-K/E/Q-G-L/S/W) TTA GCA GTT GYT GTN RTR GA (L-A-V-A/V-V-I/M/V) b) Primers PRL 1 + PRL 2: Temperaturas de hibridación 58.1º y 57.8ºC, respectivamente. ATG IAC AIC IAI GGI T (M-N/D-S/T/I/N-K/E/Q-G-L/S/W ) TTA GCA GTT GIT GTI GT (L-A-V-A/V-V-I/M/V) c) Primer PRL 1 + PRL 2 + PRL 3 + PRL 4: Temperaturas de hibridación 58.1º, 57.8ºC, 56.6º, y 67.3, respectivamente. ATG IAC AIC IAI GGI T TTA GCA GTT GIT GTI GT CAC AAC CTG TCC TCG GAA AT CCT CGT TTT CTC TGA CTC CG Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 82 6.- MÉTODOS DE EVALUACIÓN En esta sección se detallan las demás pruebas realizadas así como la metodología empleada, puesto que muchas de ellas se utilizan en varios ensayos. 6.1.- Parámetros clínicos y analíticos En el experimento descrito en el apartado 4 (Estudio de la eficacia terapéutica de la domperidona en perros enfermos de leishmaniosis) se realizó una anamnesis completa y un examen físico exhaustivo revisando la evolución de las lesiones o síntomas asociados a la enfermedad. La anamnesis consistió en preguntar a los propietarios acerca del ambiente en el que vivía su mascota, y del tiempo de evolución de los síntomas en caso de que los hubiese, ya que muchos perros del grupo A no manifestaban síntomas aparentes, siendo positivos en el control serológico anual que el HCV recomienda realizar. Al finalizar la recogida de datos se exploraba al animal, tomando su temperatura y recogiendo las constantes básicas (frecuencia cardiaca, respiratoria, pulso), después se examinaban las mucosas (conjuntiva y oral) valorando la coloración, la posible presencia de úlceras y el TRC (tiempo de relleno capilar), presionando sobre éstas y observando el tiempo de respuesta que debe ser menor de 2 segundos. En la cabeza del perro se prestaba especial atención a la presencia de signos de uveitis en el globo ocular y a las alopecias perioculares y auriculares. A continuación se valoraba el tamaño y textura de los ganglios submaxilares, preescapulares y poplíteos, considerando a estos últimos de más relevancia. Se intentó objetivar la presencia y el tipo de linfadenopatías, dividiéndolas en leves, moderadas y severas, según el tamaño y el número de linfonodos implicados. También se revisaba toda la capa del animal en busca de lesiones alopécicas, úlceras en las zonas de apoyo, hiperqueratosis o dermatitis exfoliativa. Se concluía la exploración realizando una palpación abdominal minuciosa intentando determinar el tamaño esplénico y la posible presencia de respuestas dolorosas en el cuadrante renal. Después de explorar al animal se realizaba la toma de muestras. La sangre se obtenía por venopunción yugular, cefálica o safena, dependiendo del tamaño y del carácter del perro. Para los análisis sanguíneos se echaba la sangre en tubos con anticoagulante, EDTA, para los parámetros hematológicos y en tubos sin anticoagulante, para la obtención de suero para perfiles bioquímicos. Las muestras recogidas se mantenían en refrigeración y se procesaban antes de 4 horas. El estudio hematológico se hizo usando un Diluidor automático (Sysmex AD 270) y un Microcell counter (Sysmex F 800) que determinaba el número total de Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 83 hematies, la hemoglobina, el hematocrito, el VCM (volumen corpuscular medio), la HCM (hemoglobina corpuscular media), el CHCM (concentración de hemoglobina corpuscular media), el número total de plaquetas y el número total de leucocitos. También se hizo una extensión sobre porta que se tiñó para su visualización en el microscopio óptico con tinción rápida Diff Quick. En esta extensión se valoraba la proporción de neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos para obtener la fórmula leucocitaria. Los valores de referencia y las unidades de cada parámetro se encuentran reflejados en las Tablas II.1. y II.2. VALORES DE REFERENCIA RBC (x106/mm3) 5,5 7,6 HGB (g/dl) 12 19,2 HCT (%) 37 55 VCM (fl) 64 74 HCM (pg) 22 27 CHCM (g/dl) 31 36 PLT (x103/ml) 150 430 Tablas II.1. RBC: número total hematíes, HGB: hemoglobina, HCT: hematocrito, VCM: volumen corpuscular medio, HCM: hemoglobina corpuscular media, CHCM: concentración de hemoglobina copuscular media, PLT: plaquetas Tablas II.2. Valores absolutos leucocitarios por mm3 VALORES DE REFERENCIA WBC 6000 16650 Neutrofilos 4100 11700 Linfocitos 1035 4405 Eosinófilos 0 1850 Monocitos 0 400 Basófilos 095 Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 84 Con el suero obtenido por centrifugación se determinaron 9 parámetros bioquímicos que incluyeron la glucosa, el colesterol, el B.U.N (nitrógeno ureico sanguíneo), la creatinina, el calcio, la ALT (alanin amino transferasa), la AST (aspartato amino transferasa) y la AP (fosfatasa alcalina) en un Multianalizador de química líquida (Technicom RA-500, Bayer). Los valores de referencia y las unidades de cada parámetro se encuentran reflejados en la siguiente Tablas II.3. V ALORES DE REFERENCIA Glucosa (mg/dl) 75 120 Colesterol (mg/dl) 110 300 B.U.N. (mg/dl) 724 Creatinina (mg/dl) 0,6 1,2 Calcio (mg/dl) 911,5 Fósforo (mg/dl) 3,3 6,5 AST (u/l) 15 42 ALT (u/l) 15 50 AP (u/l) 18 70 Tablas II.3. Valores bioquímicos de referencia Por su relación con la enfermedad hay que destacar dentro de este perfil bioquímico general el B.U.N., la creatinina, el calcio y el fósforo como parámetros de disfunción renal, y la AST, la ALT (hepatoespecífica en carnívoros), y la AP como marcadores de daño hepatobiliar. Además con parte del suero se determinaban las proteínas totales y se realizaba una electroforesis o proteinograma. Se usó una fuente (LKB Bromma, Pharmacia LKB) a 100 V, 12,6 mA y 2,5 W, durante 30 minutos en una cubeta para 10 tiras. El soporte donde se realizaba la migración electroforética eran tiras de Acetato de Celulosa (Cellogel, ATOM). La lectura se hizo en un densitómetro o lector electroforético a 610 nm (CS 900, SHIMADZU). Con esta prueba se monitorizaban tanto los niveles de albúmina como los de las beta globulinas y los anticuerpos o gamma globulinas. Los valores de referencia y las unidades de cada parámetro se encuentran reflejados en la Tablas II.4. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 85 Tablas II.4. Valores de las diferentes fracciones proteicas Figura II.9. Proteinograma alterado en un perro del Grupo B; la albúmina está baja y las β y las γ elevadas Figura II.10. Cistocentesis ecoguiada. La aguja se visualiza como una línea ecogénica V ALORES DE REFERENCIA Proteínas totales(g/dl) 5,7 7,5 Albúmina (g/dl) 2,3 4,6 Alfa 1 (g/dl) 0,3 0,8 Alfa 2 (g/dl) 0,5 1,3 Betas (g/dl) 0,7 1,8 Gammas (g/dl) 0,4 1 Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 86 Además de la sangre se obtenía una muestra de orina mediante cistocentesis que implica la punción ecoguiada de la vejiga. En todos los perros se desinfectaba el área y en decubito supino o lateral derecho se puncionaba para conseguir una muestra de aproximadamente 10 ml. Las ventajas de esta técnica sobre el sondaje residen en la menor dificultad en hembras, en la esterilidad de la muestra recogida y en el menor trauma generado. En la orina recogida se llevaba a cabo un urianálisis rutinario y la determinación del U P/C (Relación proteína creatinina urinaria). Esta prueba es un método útil, sensible y rápido para la detección y cuantificación de proteinuria en muestras recogidas aleatoriamente (Lulich y Osborne 1990, Ruggenenti y cols. 1998). A diferencia de otras pruebas este cociente presenta la ventaja de no verse afectado por la densidad y el volumen de orina (Lulich y Osborne 1990) y se calcula dividiendo las concentraciones de proteína y creatinina urinarias, expresadas ambas en mg/dl. La interpretación se resume en la Tabla II.5. 0-0,5 Normal 0,-1 Cuestionable >1 Patológico >1 (1-5) Prerrenal, glomerular leve o temprana, postglomerular >1 (5-13) Pérdida media a moderada. Sugiere enfermedad postrrenal o glomerulonefritis, glomerulesclerosis progresivas >1 (>13) Pérdida grave. Glomerulonefritis grave o amiloidosis Tabla II.5. Valores de U P/C y su correlación clínica Esta prueba aporta precisión a la valoración renal del perro leishmanioso (Palacio y cols. 1995). Este es otro elemento de juicio que enriquece la pobre estimación que proporciona el B.U.N y la creatinina sérica, parámetros que se elevan únicamente cuando ya hay dos terceras partes del riñón afectadas. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 87 6.2.- Pruebas diagnósticas directas Las pruebas diagnósticas directas o parasitológicas son las que permiten visualizar o demostrar la presencia del parásito ( Leishmania infantum ). En este trabajo se ha empleado la impronta, el aislamiento en medio semisólido N-N-N, el estudio anatomopatológico, y además también se determinó la carga parasitaria. En la Tabla II.6. se concreta el uso de cada prueba en los diferentes ensayos. Tabla II.6. Las improntas se realizaron presionando una sección del órgano contra un portaobjetos en los hámsters, y a partir de aspirados con aguja fina en los perros. Una vez obtenidos los frotis se teñían con coloración hematológica de diferenciación rápida (Diff Quick, DADE). Las muestras se fijaban en metanol (0,02g/l) durante 10 segundos. El primer colorante utilizado fue la eosina-G (tampón fosfato pH 6,6) y el segundo la tiazina (tampón fosfato pH 6,6); en ambos se sumergía el portaobjetos durante 5 segundos. Tras el secado se visualizaba en un microscopio óptico, considerando positivas todas las preparaciones en las que se vio al menos un amastigote, y negativas en las que después de mirar 100 campos distintos no se conseguía ver ninguna forma parasitaria (Lezama-Dávila y Gallagher 1995). Figura II.11. Célula de Mott en médula ósea, que aunque no es patognomónica, su presencia es sugestiva de leishmaniosis Impronta Aislamiento Anatomía Patológica Carga Parasitaria Apartado.2 Hamsters Sirios Hígado, Bazo, Médula ósea Hígado, Bazo, Médula ósea Hígado y Bazo Hígado y Bazo Apartado.4 Perros Domperidona Gánglio poplíteo, Médula ósea Gánglio poplíteo, Médula ósea Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 88 El aislamiento se realizaba en tubos con medio N-N-N (Novy-Nicolle-McNeal). Este es un medio semisólido bifásico formado básicamente por sangre de conejo, una combinación de antibióticos y agar en forma de pico de flauta, y por la interfase líquida. Una vez sembrados los tubos con el aspirado (en el caso de los perros) o con un macerado del órgano (en los hámsters) se dejaba en incubación a 27ºC. Una vez a la semana se examinaban microscópicamente en busca de promastigotes, realizándose pases sistemáticos cada 7 días. Al cabo de un mes, cuatro pases, sin observar promastigotes se consideraron negativas (Zijlstra y El-Hassan 2001). Figura II.12. Aspirado medular en la unión costo-condral Figura II.13. Tubos con medio N-N-N para el aislamiento de Leishmania Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 89 El estudio histológico se realizó en el hígado y en el bazo de los Hámsters. Después de registrar los pesos y medidas, los órganos se introducían en una solución de formaldehido al 10% en PBS. Para lograr una correcta imbibición se hicieron cortes en dirección al hilio de cada órgano, y después se incluían en parafina mediante procesamiento automático. Posteriormente se cortaban con un grosor de 5μm y se transferían a portaobjetos para teñirlos con Hematoxilina-Eosina y examinarlos en un microscopio óptico. La determinación de la carga parasitaria se llevó a cabo a partir de las improntas del hígado y bazo de los hámsters. Se siguió el método empleado por Baumann y cols. en 1990, por el que la carga parasitaria total se determina contando 500 núcleos y contando el número de amastigotes. La fórmula empleada para el cálculo fue la siguiente: Carga parasitaria = número de amastigotes por núcleo x peso del órgano (mg) x 2 x 105 Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 96 Test de Reducción del NBT Esta prueba permite explorar la funcionalidad leucocitaria, muy importante en la leishmaniosis. Aunque comenzó a usarse en 1967 por Baehner y Nathan como diagnóstico de la enfermedad granulomatosa crónica de la infancia, pronto su uso se extendió a todos los estados en que presumiblemente debiera existir alguna alteración en el funcionalismo leucocitario; de esta forma el NBT test pasó a ser una prueba funcional del leucocito circulante, especialmente en los estados infecciosos. La base morfológica, citoquímicamente apreciable, del NBT test se sitúa en el cambio de coloración que sufre el nitroazul de tetrazolio, de amarillo en su forma soluble a azul oscuro al reducirse a formazan insoluble, claramente apreciable por microscopía óptica. La membrana intacta del leucocito no es permeable al NBT, siendo necesaria la producción de cambios en ésta para que pueda ser atravesada. Para lograr la permeabilización se requiere la presencia de factores tales como bacterias o productos derivados de ellas, complejos antígeno-anticuerpo o una interacción del complemento; todo ello condiciona la relación entre la reducción del NBT y la capacidad bactericida de los granulocitos. La penetración del NBT al interior de la célula se realiza por fenómenos de pinocitosis como corresponde a un cuerpo soluble. La reducción se produce en el interior de la vacuola fagocítica por medio de la NADPH-oxidasa. Figura II.16. Esquema de la reducción celular del Nitroazul de Tetrazolio Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 97 El conocimiento del mecanismo a través del cual se produce la reducción del NBT, implica la necesidad de admitir la integración de dos condiciones que la hagan factible: Es necesaria la presencia de factores permeabilizadores de la membrana y también la normalidad de la función fagocítica que permita dicha reducción. Aunque esta prueba se ha utilizado en medicina humana para el seguimiento de enfermedades tan diversas como las faringitis estreptocócicas, la tuberculosis, las neoplasias febriles, las meningitis bacterianas, las sepsis por Candida albicans , la malaria y otras enfermedades parasitarias, no ha sido utilizada en el ámbito clínico de la leishmaniosis canina. La técnica del NBT puede realizarse a partir de muestras sin anticougulantes o con sangre anticoagulada. Por su mayor sencillez se eligió el segundo procedimiento (Ashburn y cols. 1973). La sangre recogida (3ml) en tubos con EDTA se dejaba reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y a continuación previa agitación suave se llenaban 2 tubos de Wintrobe por muestra, centrifugándolos a 400 xg durante 10 minutos, de esta forma se obtenía el acumulo leucocitario entre el suero y los hematíes que era extraído mediante pipeta Pasteur y depositado en tubos de plástico estériles. La incubación de los leucocitos con NBT se realizó depositando 0,05 ml de suspensión de leucocitos con la misma cantidad de solución NBT al 0,1% de concentración en tampón fosfato, durante 15 minutos en una estufa a 37º C, con una presión parcial de CO2 del 5% y humedad a saturación, y otros 15 minutos a temperatura ambiente. Después de los 30 minutos de incubación se realizan las extensiones sobre portaobjetos de vidrio en la forma habitual. Como tinción de contraste y sin ninguna fijación previa se utilizó la solución de Giemsa diluida (dos gotas de solución comercial de Giemsa (Merck) por ml de agua destilada) durante 10 minutos. Para valorar la reducción del NBT se cuentan 100 leucocitos, cuya morfología sea inequívoca y huyendo de los acúmulos celulares, contabilizando como positivas las que muestren acúmulo citoplasmático de formazán; su número total define el índice de reducción del NBT. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 98 6.5.- Cultivos de progenitores hematopoyéticos La valoración del efecto de la hiperprolactinemia sobre la hematopoyesis se llevó a cabo mediante cultivos de progenitores hematopoyéticos en medio semisólido y en medio líquido. Desde hace unos años se encuentran disponibles de manera comercial medios de cultivo con diferentes cantidades de citoquinas y factores estimulantes de colonias, para la especie humana. El primer objetivo fue la comprobación de su utilidad, en el perro y en diferentes especies animales y su posterior estandarización. Para demostrar la utilidad de esta técnica en el perro, el gato y en otras especies utilizadas en experimentación animal se diseñó el siguiente ensayo. Se tomaron muestras de sangre periférica (punción yugularperro y gato-, punción retroorbitalratón, hámster, ratae intrcardiacacerdo y conejo) a 5 animales de cada especie, en tubos que contenían 5 ml de medio de cultivo McCoy’s 5a y heparina de litio libre de aditivos (10U/ml). El volumen extraído dependió de la especie y se refleja en la Tabla II.7. Número de animales Volumen extraido (ml) Perro 5 5 Gato 5 5 Ratón CD1 5 1 Rata Wistar 5 3 Hamster Sirio 5 2,5 Cerdo 5 5 Conejo 5 5 Tabla II.7. Volumen sanguíneo extraído en cada especie Todas las muestras se procesaron de inmediato para evitar el daño celular. A continuación se separaron las PBMNC (células mononucleares de sangre periférica) usando la siguiente metodología; se diluye la muestra (1:1) con suero fisiológico y se vierte en un tubo con 5ml de Ficoll-Paque PLUS (StemCell Technologies) densidad 1077 g/ml. Después se centrifuga a 400 xg durante 30 minutos a temperatura ambiente. Usando una pipeta Pasteur se elimina el sobrenadante sin dañar la capa de células mononucleares que se encuentra en la interfase. A continuación se aspiran las PBMNC y se trasladan a un tubo estéril de poliestireno y se realizan tres lavados con volúmenes de 5 ml de medio McCoy’s 5a y Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 99 centrifugando a 400 xg durante 5 minutes. Para establecer el número y la concentración de células se usó un contador celular automático. Se sembraron 150000 células en 2ml en placas de Petri de 35mm de diámetro, usando medios semisólidos y medios líquidos. Medios semisólidos: se usaron 4 medios estandarizados que contenían citoquinas recombinantes humanas con una base de metil celulosa (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). 1.- MethoCult™ GF+ H4435: 1% Metilcelulosa en Iscove's MDM, 30% (FBS) suero fetal bovino, 1% BSA, 10-4M 2-Mercaptoethanol, 2mM L-glutamine, 50ng/ml rh Stem Cell Factor, 20ng/ml rh GM-CSF, 20ng/ml rh IL-3, 20ng/ml rh IL-6, 20ng/ml rh G-CSF, 3 u/ml rh Epo. Este medio se ha estado utilizando en ensayos con progenitores hematopoyéticos humanos muy primitivos (Kaufman y cols. 2001; Wang y cols. 2002) 2.- MethoCult™ GF H4534: 1% Metilcelulosa en Iscove's MDM, 30% FBS, 1% BSA, 10-4M 2Mercaptoethanol, 2mM L-glutamine, 50ng/ml rh Stem Cell Factor, 10ng/ml rh GM-CSF, 10ng/ml rh IL-3, sin Epo (eritropoyetina). Este medio se recomienda para el cultivo de progenitores hematopoyéticos humanos de médula ósea, sangre periférica, del cordon umbilical, de productos de la leucoféresis y células CD34+ purificadas (Gribaldo y cols. 2000; LaRosee y cols. 2002). 3.- MethoCult™ GF+ H4535: 1% Metilcelulosa en Iscove's MDM, 30% FBS, 1% BSA, 10-4M 2Mercaptoethanol, 2mM L-glutamine, 50ng/ml rh Stem Cell Factor, 20ng/ml rh GM-CSF, 20ng/ml rh IL-3, 20ng/ml rh IL-6 and 20ng/ml rh G-CSF (sin Epo). Este medio resulta apropiado para el cultivo de progenitores muy primitivos en poblaciones purificadas (Keir y cols. 2000). 4.- MethoCult™ SFBIT H4236: 1% Metilcelulosa en Iscove's MDM, 1% BSA, 10μg/ml Insulina Recombinante Humana, 200μg/ml Trnsferrina humana (a saturacion en hierro), 10-4M 2Mercaptoethanol, 2mM L-glutamine. Este medio no contiene FBS, Epo o citoquinas recombinantes humanas. Todas las placas se incubaban en una estufa a 37º C con una presión parcial de CO2 del 5% y humedad a saturación máxima. Después de 21 días de incubación se leyeron los cultivos usando un microscopio invertido. En la lectura se contaron el número de clusters (menos de 50 células) y de colonias (más de 50 células). También se tipificaron el tipo celular al que pertenecía cada colonia, diferenciando CFU-GM (granulo macrofágica), CFU-E (eritroide), CFU-Mk (megacariocítica) y CFU-Mix (mixta GM y E). Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 100 Medio líquido: para el estudio de otras características del crecimiento se usaron cultivos en medio líquido. Con las mismas muestras se sembraron 1x106 PBMNCs en placas de Petri de 35 mm con 3ml de medio McCoy’s 5a , incubándose en las mismas condiciones que las anteriores. Cada semana se renovaba la mitad del medio de cultivo, leyéndose el día 14 y el día 30 en un microscopio invertido. Posteriormente se desechaba el sobrenandante, tiñéndose las células adheridas al fondo de la placa con May Grünwald-Giemsa, para observarlas usando un microscopio convencional. Los parámetros que se valoraron en este ensayo fueron el crecimiento total, el grado de confluencia y la relación macrófagos/células fibroblásticas. 1. Crecimiento total . Se dividió en cuatro grados subjetivos; 0 ausencia de crecimiento en la placa, 1 bajo grado de crecimiento, 2 grado medio y 3 crecimiento intenso o masivo. Todas las placas fueron evaluadas por un observador entrenado. 2. Grado de confluencia . Hace referencia a la capacidad para formar mallas que tienen las células fibroblásticas, encontradas en el fondo de la placa. Se valoró con un patrón subjetivo similar al anterior en el que se clasificó de 0, no confluencia, a 3, altísimo grado de confluencia. 3. Relación macrófagos/células fibroblásticas . Se evaluó contando 100 células de 5 campos diferentes y obteniendo la relación en forma de fracción entera. Este último parámetro, por la dificultad que supone el contaje con las células vivas, se hizo con las células fijadas y teñidas. Inmunocitoquímica: para la comprobación de la naturaleza (stem cells, progenitoras hematopoyéticas) de las células cultivadas en medio líquido se usaron anticuerpos monoclonales heterólogos anti-CD34 (115 kDa), específicos de este tipo celular (Abbas y cols. 2002). Se utilizó el kit PeliCluster CD34 (M1636, CLB), siguiendo la técnica FAAFA (fosfatasa alcalina anti fosfatas alcalina) conjugada con Streptavidina. Las muestras (células del fondo de las placas de medio líquido) habían sido congeladas a -20º C y envueltas en papel de aluminio. Para su preparación se descongelaban retirando la envoltura pasados 30 minutos. A la vez se descongelaban los anticuerpos monoclonales y se ponía el sustrato del Fast-Red a temperatura ambiente. También se preparaba una solución de trabajo TBS (Concepta cod. co523 V2LT) pH 7,6 al 1/10 de concentración en volumen. La fijación de las muestras se hacía con acetona (Merck) durante 10 minutos, y mientras secaban, se aplicaba con cuidado el Sigmacotc (Sigma) alrededor del campo delimitado. Se dejaban secar otros 15 minutos y a continuación se aplicaba el anticuerpo monoclonal (CD34), incubando durante 60 minutos en una cámara húmeda. Después se lavaba con TBS 1/10 y se quitaba el exceso de líquido y se aplicaban 3 gotas del reactivo LINK (Anticuerpo Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 101 puente rabbit anti-mouse, Biogenex HK-340-9K) cubriendo las extensiones e incubando durante 20 minutos en la cámara húmeda. Se realizaba otro lavado con TBS 1/10, retirando el exceso de líquido, y se aplicaba el reactivo LABEL (complejo enzimático fosfatasa alcalinastreptavidina, Biogenex HK-330-59K), cubriendo las extensiones e incubando 20 minutos en la cámara húmeda. Se volvía a lavar otras dos veces con TBS 1/10 y se cubrían las extensiones con CHROMOGEN (colorante Fast-Red, Biogenex HK 182-5K), incubando 40 minutos en la cámara húmeda, después se volvía a lavar por inmersión, tiñendo finalmente las preparaciones con Hematoxilina durante 10 minutos, para contrastar. Tras el último lavado se montaban las extensiones (Aquatex 108562, Merck) y se dejaban secar. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 102 6.6.- Análisis estadístico Los resultados que se obtuvieron de los ensayos anteriores fueron sometidos inicialmente a un análisis descriptivo. La normalidad de los datos fue analizada por el test de Kolmogorov-Smirnov. Una vez comprobada se aplicó el análisis de homogeneidad de varianzas de Levene. De acuerdo con los resultados de estos análisis y tras realizar un ANOVA, los datos se analizaron en función del tipo de ensayo con las siguientes pruebas estadísticas: Test de la T de Student y Test de Scheffe. Para valorar adecuadamente la prueba diagnóstica del EasyDAT se calcularon los parámetros de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, eficacia y la J de Youden. Los test diagnósticos se desarrollan para detectar una enfermedad subclínica o para reemplazar otra técnica muy laboriosa o cara. Un test diagnóstico debería tener una validez alta, lo que significa que los porcentajes de resultados falsos positivos y falsos negativos deberían ser limitados. La validez será expresada por la Sensibilidad y la Especificidad, pero para determinarlos es necesaria una segunda prueba, llamada test de oro o estándar con una validez de aproximadamente el 100%. En ese caso la evaluación de la primera prueba se hace fácilmente usando una tabla de contingencia de 2x2. Enfermedad (gold standard) S í No T otal + A BA+B -C DC+D T otal A+C B+D N Donde: A= número de muestras detectados como positivos por el gold standard. B= número de muestras falsas positivas. C= número de muestras falsas negativas. D= número de muestras detectadas como negativas por el gold standard. Sensibilidad (%) = 100 )( × +CA A Especificidad (%) = 100 )( × +DB D Prueba comparativa Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 103 Se debe tener en cuenta que en la clínica, al enfrentarse a un caso, obviamente este no ha sido previamente clasificado. La cuestión que se plantea es ¿ante un caso con un resultado positivo, qué probabilidad hay de que realmente esté afectado? y ¿ante un caso con resultado negativo, qué probabilidad hay de que realmente no esté afectado? Las respuestas las proporcionan otros coeficientes, igualmente calculados a partir de la tabla de contingencia; valores predictivos. El VPP o valor predictivo positivo se obtiene aplicando la siguiente fórmula: 100 )( × +BA A El VPN o valor predictivo negativo se obtiene aplicando la siguiente fórmula: 100 )( × +DC D Estos valores nos permiten valorar la eficacia real de una prueba, pero hay que tener en cuenta que están muy influenciados por la prevalencia de la enfermedad. Por lo tanto no se podrán aplicar los mismos coeficientes a otras localizaciones con diferente prevalencia. Cálculo de la J de Youden. Otro parámetro que se ha calculado y que informa acerca de la calidad de un resultado en una prueba diagnóstica es la J de Youden, cuyo cálculo se hace con la siguiente fórmula: J = S + E – 1. Donde S es Sensibilidad y E es Especificidad. Cuanto más se aproxime a 1 el valor de la J de Youden, mayor es la calidad del resultado obtenido al aplicar una técnica sobre una muestra. Material y Métodos Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 104 Resultados Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 112 Además del estudio en medios semisólidos se sembraron placas con medio líquido (McCoy’s 5a). Los parámetros que se valoraron fueron el crecimiento total, el grado de confluencia y la relación macrófagos/fibroblastos. A continuación se retiraba el sobrenadante y se teñía con May Grünwald-Giemsa observando la morfología celular (Figura III.5. y III.6.). Figura III.5. Diferentes grados de crecimiento, en fresco y teñidos, en medio líquido. Figura III.5. Grado de confluencia en medios líquidos en fresco y teñidos. De izquierda a derecha, ausencia, grado medio y grado alto de confluencia Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 113 Los resultados obtenidos en medio líquido en la especie canina fueron un crecimiento total bajo-medio (1-2), una relación macrófagos-fibroblastos 2 a 1 y un grado de confluencia bajo. Se describieron dos poblaciones celulares, una formada por elementos macrofágicos y la otra por elementos fibroblásticos. El estudio inmunocitoquímico para tipificar estas poblaciones incluyó la aplicación de anticuerpos monoclonales anti-CD34 (células progenitoras hematopoyéticas) que detectaron una intensa positividad sobre la población fibroblástica como se demuestra en la Figura III.6. Figura III.6. En la parte superior izquierda se observan células CD34 negativas. Debajo un grupo fibroblásto-macrofágico CD34 positivo (gránulos rojos en la membrana celular). A la derecha detalle de una de estas células CD34 positiva Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 114 3.2.- Rata, hámster, ratón, conejo, cerdo y gato En estas especies se realizó la misma metodología expuesta en el perro. A continuación se hace una descripción global de los resultados de acuerdo al tipo de medio de cultivo, semisólido o líquido. Medio semisólido En la rata, los cultivos realizados con el medio A registraban un significativo crecimiento formado por pequeños clusters que cubrían la placa, sin embargo, con el medio B se obtuvieron un número muy reducido de colonias por placa (3 ± 1,2; Media ± DE), en los que a pesar de la ausencia de Epo se detectaban crecimientos del tipo CFU-Mix (familia mieloide y eritroide) como se observa en la Figura III.7. Además se observó la presencia de un alto número de células fibroblásticas. En ninguno de los ensayos realizados se obtuvo crecimiento celular en el medio C. Figura III.7. Cultivo de rata en medio semisólido. Colonia CFU-Mix con elementos mieloides y eritroides hemoglobinizados Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 115 El crecimiento global observado en el hámster fue notablemente superior al de la rata, obteniéndose 196 ± 83,0 (Media ± DE) CFU-Mix por placa en el medio A. De la misma manera, en los cultivos realizados en medio B, la placa evidenció un crecimiento en sábana, Figura III.8., apareciendo siempre cubierta por un número incontable de elementos mieloides. También se realizó el cultivo de PBMNCs en medio C, observándose la proliferación de un centenar de colonias CFU-Mix por placa (103± 47.6; Media ± DE) a pesar de que este medio carece de Epo, como ocurría en el caso del B en rata. Figura III.8. Cultivo semisólido de hámster: crecimiento en sabana En los cultivos realizados de PBMNCs provenientes de sangre de ratón en los medios A, B y C apareció un bajo número de CFU-GM (3 ± 0,9; 2 ± 1,2 y 0,5 ± 0,9 respectivamente; Media ± DE), aunque se formó una densa red de células fibroblásticas cubriendo las placas. En los cultivos realizados con PBMNCs provenientes de sangre de conejo aparecieron colonias CFU-GM (28 ± 2,3; 19 ± 1,8 y 15 ± 1,3) en los medios A, B y C. Además se observaron colonias CFU-E (32 ± 4,6) en el medio A. En el cerdo se observó un gran crecimiento. El número de colonias CFU-GM fue muy alto en los tres medios con citoquinas (158 ± 24, 173 ± 18,5 y 163,2 ± 21,3) A, B y C, respectivamente. Únicamente crecieron colonias CFU-E (110,3 ± 11,9) en el medio A. Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 116 También se comprobó la presencia de una tupida malla fibroblástica en todas las placas anteriores como se demuestra en la Figura III.9. Figura III.9. Cultivo semisólido de cerdo: se observa una tupida malla fibroblástica El crecimiento obtenido en medios semisólido a partir de los progenitores hematopoyéticos felinos fue escaso. Se obtuvieron colonias CFU-GM (6,3 ± 4,5; 4,8 ± 2,2 y 2,9 ± 1,8) en los medios A, B y C, respectivamente. También se observaron una media de 2,3 ± 1,1 colonias CFU-E en el medio A. En ninguna placa de todas las cultivadas en las 6 especies hubo crecimiento celular en medio D, carente de suero fetal bovino, eritropoyetina y citoquinas recombinantes humanas. Medio líquido Después de obtener las PBMNCs a partir estas 6 especies, también se sembraron en placas con medio líquido McCoy’s 5A (1x106 células por placa). Trascurridos 21 días desde la siembra, mediante microscopia óptica, se valoraron los mismos parámetros que en la especie canina (crecimiento total, grado de confluencia y relación macrófagos-fibroblastos). Además se examinó la proliferación de los distintos tipos celulares. Se observó que el grado de crecimiento era distinto para cada una de las especies y utilizando una escala subjetiva, se comprobó que en el caso del hámster el crecimiento era alto (grado 3 de crecimiento), mientras que las células provenientes del ratón y de la rata mostraban un crecimiento medio y bajo respectivamente (grado 2 y 1 de crecimiento). Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 117 En el conejo se estimó en 1, crecimiento bajo, mientras que en el cerdo fue de 3, crecimiento alto. El gato mostró un crecimiento medio, grado 2. En cualquier caso, siempre se observó crecimiento en todas las placas, independientemente de la especie de origen. Otro parámetro que se valoró fue el grado de confluencia de las células en la placa, lo que refleja el patrón de crecimiento fibroblástico. Las células originarias de ratón y hámster mostraron un índice de confluencia medio (grado 2 de confluencia), mientras que en rata las células aparecían aisladas (grado 1 de confluencia). En conejo y en gato el grado de confluencia fue bajo, grado 1, mientras que en el cerdo se observó un grado 3, con formación de grandes redes. Tras realizar una tinción de May Grünwald-Giemsa se pudo realizar un estudio morfológico de las células presentes en la placa y al igual que en el perro se identificaron dos tipos de subpoblaciones celulares, macrofágicas y fibroblásticas. En el hámster, el ratón, el conejo y el gato la relación macrófagos/fibroblástos fue de 2 a 1, mientras que en rata y cerdo el índice era mayor (3 a 1). Por último, mediante inmunocitoquímica, se demostró la presencia mayoritaria del marcador de stem cells hematopoyéticas CD34 en las células de la subpoblación fibroblástica, como se demuestra en la Figura III.10. Figura III.10. Célula fibroblástica de cerdo en medio líquido CD34 positiva Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 118 60 70 80 90 100 110 120 130 0 7 15 30 60 90 120 150 180 Grupo A Grupo B Grupo C 4.- RELACIÓN ENTRE LACTACIÓN Y LEISHMANIOSIS EN LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON UN MODELO CRICETO En este ensayo se usaron 60 hembras de hámster sirio dorado ( Mesocricetus auratus ) divididas en 3 grupos. En el grupo A las hembras en el primer día de lactación eran inoculadas por vía intraperitoneal con 25 millones de promastigostes de Leishmania infantum . El grupo B fue el control negativo compuesto por hembras no lactantes y no infectadas. El grupo C, control positivo, estaba formado por hámsters no lactantes infectadas con 25 millones de promastigostes de Leishmania infantum por vía intraperitoneal. Durante los 6 meses que duró el experimento se controló un grupo de parámetros que incluían el peso, la tasa de anticuerpos, la respuesta inmune celular y después de la necropsia, el día 180, se valoró la morfología de los órganos diana y se hicieron improntas, aislamiento y estudio anatomopatológico. 4.1.- Peso El primer parámetro obtenido durante este ensayo fue el peso que se vio incrementado en un 24,4% y en un 16,5% en los grupos A y B respectivamente, sufriendo un descenso del 23,9% en el grupo C. La evolución del parámetro peso a lo largo de la prueba se detalla en el gráfico III. 2. Gráfico III. 2. Evolución del peso durante los 6 meses del ensayo (media ± DE) Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 119 A continuación se hizo un ANOVA encontrando diferencias muy significativas entre los grupos (p<0,01). Para analizar estas diferencias se utilizó el test de Scheffe, no encontrando diferencias entre los grupos hasta el día 15. Sin embargo a partir del día 30 había diferencias muy significativas (p<0,01), entre el grupo de hembras lactantes infectadas y el de no lactantes infectadas, y entre el control negativo y el control positivo. 4.2.- Serología El siguiente parámetro estudiado durante toda la prueba fue el nivel de anticuerpos antileishmania, mediante EasyDAT. El título de corte para considerar a un animal positivo se tomó en 1/20, la segunda dilución. Aunque el método general del test es similar en perros y en cricetos, las diluciones empleadas difieren, comenzando en estos últimos desde 1/10 y acabando en el último pocillo de la placa con 1/640. En los dos primeros controles (días 0 y 7) ningún animal fue positivo, aunque 7 de los 20 animales del grupo de hembras lactantes infectadas y 16 de los 20 del grupo control positivo dieron una débil lectura 1/10. A partir del día 15 todos los hámsteres del grupo de infectados no lactantes fueron positivos (14 con un título 1/20 y 6 con un título 1/40). Ninguno de los animales del grupo A o B fue positivo. A partir de este control el título se fue elevando en los animales del grupo C, para mantenerse estable a partir del día 120 alrededor de 1/320-1/640. Los hámsteres de los grupos A y B se mantuvieron negativos durante todo el ensayo. 4.3.- Valoración de la respuesta inmune celular Las dos pruebas utilizadas para la valoración de la respuesta inmune celular fueron la intradermorreación con leishmanina y un ensayo de proliferación linfocítica. Los resultados expresados en milímetros (media ± DE) para la intradermorreacción están reflejados en la Tabla III. 3. 0 90 180 Grupo A 4,6 ± 2,5 8,1 ± 3,5 7,8 ± 2,9 Grupo B 4,4 ± 1,8 3,3 ± 1,6 2,3 ± 0,9 Grupo C 4,3 ± 2,0 4,5 ± 2,2 4,5 ± 2,4 Tabla III. 3. Media (mm) ± DE de grosor del habón formado 72 horas después de la inoculación intradérmica Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 120 Con estos datos se realizó un ANOVA que encontró diferencias muy significativas (p<0,01) entre los grupos. También se hizo un test de Scheffe que evidenció diferencias muy significativas (p<0,01) entre el grupo de hembras lactantes infectadas y el grupo C control positivo en los días 90 y 180; además en el día 180 se encontraron esta diferencias entre el grupo B, control negativo, y el grupo C. El ensayo de linfoproliferación in vitro se realizó los mismos días que la intradermorreación. Los resultados se recogen en la Tabla III. 4. y están expresados en absorbancia, leída a 405nm (media ± DE). La columna Prot p36 es la que refleja la proliferación específica frente a esta proteína de Leishmania ; pero para conocer su valor real hay que restarle la cifra de la proliferación en ausencia de mitógeno (columna Sin Mitógeno). Los valores correspondientes a este resultado se encuentran reflejados en el Gráfico III. 3. Valorando estadísticamente estos resultados mediante un ANOVA se encontraron diferencias muy significativas entre los grupos (p<0,01). Empleando un test de Scheffe para concretarlas, se encontraron diferencias muy significativas entre el grupo A y el C en el día 90 y en el día 180 (p<0,01) y entre el B, control negativo y el C, control positivo el día 180 (p<0,01). Tabla III. 4. Absorbancias (media ± DS) obtenidas con un mitógeno inespecífico (Concanavalina A), sin mitógeno (SM) y para un proteína del parásito (Prot p36) Día 0 Conc A Sin mitógeno Prot p36 Grupo A 1,54 ± 0,32 1,11 ± 0,41 1,23 ± 0,82 Grupo B 1,89 ± 0,64 1,48 ± 0,51 1,32± 0,91 Grupo C 1,74 ± 0,79 1,13 ± 0,65 1,28 ± 0,79 Día 90 Grupo A 1,43 ± 0,53 1,03 ± 0,64 2,74 ± 0,73 Grupo B 1,44 ± 0,38 1,21 ± 0,77 1,40 ± 0,84 Grupo C 1,58 ± 0,67 1,19 ± 0,83 1,33 ± 0,43 Día 180 Grupo A 1,36 ± 0,70 1,20 ± 0,66 2,54 ± 0,71 Grupo B 1,51 ± 0,63 1,36 ± 0,61 1,48 ± 0,75 Grupo C 1,54 ± 0,58 1,10 ± 0,65 1,12 ± 0,49 Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 121 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Δ(P36-SM) Día 0 Día 90 Día 180 Grupo A Grupo B Grupo C 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Grupo A Grupo B Grupo C (g) Gráfico III. 3. Diferencia entre la Absorbancia obtenida con la p36 y sin mitógeno 4.4.- Necropsia El día 180 se eutanasió a los animales realizándose la necropsia y a partir de las muestras recogidas se hicieron aislamientos en medio N-N-N, improntas y estudio anatomopatológico. Antes de procesar los órganos para estas pruebas, se pesaron y midieron tanto el hígado como el bazo. El peso del hígado (media ± DE) está reflejado en el Gráfico III. 4., el peso del bazo en el Gráfico III. 5., y la longitud y anchura de este último en los Gráficos III. 6. y III. 7. respectivamente. Gráfico III. 4. Peso del hígado (media ± DE) en los diferentes grupos Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 128 Medio líquido Usando el medio de cultivo líquido (McCoy’s 5a) se obtuvieron las mismas poblaciones celulares descritas en el apartado 3 de los Resultados, compuestas por una subpoblación macrofágica y otra conformada por células de aspecto fibroblástico. Los parámetros valorados fueron los mismos, crecimiento total, grado de confluencia y relación macrófagos/fibroblastos. El crecimiento total obtenido en los diferentes muestreos está representado en el Gráfico III. 11. dividido en machos y hembras, ya que se encontró una diferencia muy significativa (p<0,01) usando el test de la T de Student, en todos los días de la toma de muestras. El incremento del crecimiento total observado en cada uno de los sexos es a su vez muy significativo cuando se comparan los datos del día 0 con los de los demás muestreos (p<0,01 usando la T de Student), no encontrando diferencias a partir del quinto día hasta el final del mes. Gráfico III. 11. Crecimiento total (media ± DE) en machos y hembras de raza Beagle en medio líquido El grado de confluencia fue muy variable a los largo del ensayo. Por tratarse de un parámetro semicuantitativo muy influenciado por la subjetividad del observador únicamente se puede afirmar que hubo un aumento desde el 1,5% en el día 0 al 48%, 49,5% y al 48,5% de los días 5, 15 y 30 respectivamente. La relación macrófagos/fibroblastos se expresó en fracciones enteras 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, aunque para su representación gráfica se utilizó el resultado de ésta. Así en cultivo con relación 2 predominan los macrófagos, y en otro con un valor inferior a 1 predominarían las Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 129 células fibroblásticas. En el Gráfico III. 12. (media ± DE), se puede observar un viraje muy significativo (T de Student) desde una relación 2 a 1, hasta una relación próxima al 1. Estas diferencias son muy significativas (p<0,01) comparando el día 0 con el 15 y el 30 y comparando el día 5 con el 15 y el 30. Sin embargo en los cinco primeros días no hubo diferencias. Gráfico III. 12. Relación macrófagos/fibroblastos en cultivo de medio líquido (media ± DE) 5.3.- Test de la reducción del nitroazul de tetrazolio Esta prueba valora tanto la funcionalidad oxidativa leucocitaria como la permeabilidad o susceptibilidad fagocítica. Las células positivas reducen en el interior de la vacuola fagocítica el NBT soluble (amarillo) a formazán (azul oscuro grisáceo), lo que se aprecia en las figuras III.13. y III.14. En el Gráfico III. 14. se muestra (media ± DE) el tanto por ciento de células positivas en sangre periférica en los días de muestreo. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (T de Student) entre machos y hembras en ninguno de los días. Para valorar el incremento en la reducción observada en el gráfico se utilizó la T de Student con los siguientes resultados: Había diferencias muy significativas (p<0,01) entre los datos obtenidos en el día 0 y cualquiera de los otros muestreos, y sin embargo no hubo diferencias al comparar los datos de los demás días (5, 15 y 30) entre si. Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 130 Figura III.13. Extensión de sangre periférica: Neutrófilo positivo al test de reducción del NBT Figura III.14. Célula fibroblástica de cultivo en medio líquido positiva al test de reducción del NBT Gráfico III. 13. Tanto por ciento (media ± DE) de leucocitos positivos al NBT en sangre periférica en perros de raza Beagle Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 131 6.- ESTUDIO DE LA EFICACIA TERAPÉUTICA DE LA DOMPERIDONA EN PERROS ENFERMOS DE LEISHMANIOSIS La prueba clínica consistió en el tratamiento de 98 perros leishmaniósicos con 1mg/kg de domperidona cada 12 horas y durante 1 mes. Los resultados obtenidos en esta prueba se han dividido en los dos grupos (A y B) que se hicieron para clasificar a los perros enfermos. En el primer grupo (A) se encuadraron perros con título bajo de anticuerpos, oligosintomáticos y sin alteraciones en la analítica sanguínea. En el grupo B se encuadraron a los animales polisintomáticos, con alteraciones en la analítica y con un título alto de anticuerpos. Por tratarse de etapas muy diferentes de la enfermedad con consecuencias clínicas tan distintas, no se han comparado en ningún momento los grupos entre sí. Además debido a la idiosincrasia del ensayo (prueba clínica) hay una gran cantidad de datos recogidos (ciertas determinaciones bioquímicas, algunos parámetros hematológicos …) que no se han utilizado en el análisis estadístico por carecer de relación con la enfermedad. Todos estos parámetros se controlaron para obtener una valoración global del animal y para mantener intacta la confianza del propietario; por lo tanto únicamente se exponen en este apartado los resultados más relevantes que condicionan la evolución de la enfermedad. 6.1.- Grupo A Sintomatología y Analítica hematológica y bioquímica Los únicos síntomas que manifestaban los perros de este grupo eran linfadenopatías en diferentes grados (100%), dermatitis exfoliativa (17,14%), alopecias perioculares (12,86%), alopecias auriculares (10%) y onicogrifosis o excesivo crecimiento ungueal (2,86%). Durante los controles ninguno de los perros de este grupo manifestó ningún otro síntoma A partir del día 90 todos los síntomas dérmicos habían desaparecido, quedando únicamente un 25,71% de perros con linfadenopatías moderadas o leves, y el 2,86% con onicogrifosis. En el último control sólo quedaban el 2,86% con onicogrifosis, no encontrando ningún animal con linfadenopatías. Todos los parámetros hematológicos, bioquímicos y el proteinograma fueron totalmente estables durante todo el año, no encontrando en ninguno de los controles variación patológica alguna achacable a la posible evolución de la enfermedad. Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 132 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Mismo Título Incremento de Título Descenso de Título Negativos Mismo Título Incremento de Título Descenso de Título Negativos (%) GRUPO BGRUPO A Serología No hubo en ninguno de los perros incremento del título de anticuerpos; por el contrario, se observó un descenso de la tasa de anticuerpos en el 74.3%, negativizándose un 40% (1/400 o menor). La tendencia en el último control (día 360) respecto al día 0 se observa en el Gráfico III. 14. Valoración de la respuesta inmune celular La valoración inmunológica arrojó resultados similares en el grupo A, observándose un incremento del grosor del habón en la intradermorreacción muy significativo (T de Student, p<0,01) entre el día 0 y el 90, no encontrando diferencias entre el día 90 y el 360. Los resultados en mm de la intradermorreación con leishmanina (media ± DE) están reflejados en la Tabla III. 5. En el test in vitro de estimulación linfocítica también se observó un incremento muy significativo (T de Student, p<0,01) en la linfoproliferación específica (Prot 36) en los días 30, 180 y 360 respecto al día 0. La respuesta se mantuvo estable, no observándose diferencias entre los días 30, 180 y 360. Los resultados (media ± DE) medidos en absorbancia están reflejados en la Tabla III. 6. y la linfoproliferación específica real (resta de Prot36 menos Sin Mitógeno) se observa en el Gráfico III. 15. Gráfico III. 14. Diferencia entre el título inicial y el final de anticuerpos medidos con EasyDAT, en los grupos A y B Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 133 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 30 180 360 Grupo A Grupo B (p36-SM) 0 90 360 Grupo A 5,6 ± 2,7 9,1 ± 3,5 8,4 ± 2,9 Grupo B 3,8 ± 2,3 4,6 ± 2 5,3± 2,3 Tabla III. 5. Mediciones del habón en mm (media ± DE) 72 horas después de la intradermorreacción. A partir de 5 mm se consideró positivo Tabla III. 6. Absorbancia (media ± DE) leída a 405nm en la prueba de estimulación linfocítica en los días 0, 30, 180 y 360 Gráfico III. 15. Diferencia entre la Absorbancia obtenida con la p36 y sin mitógeno Día 0 Conc A Sin mitógeno Prot p36 Grupo A 1,48 ± 0,28 1,05 ± 0,11 2,01 ± 0,22 Grupo B 1,32 ± 0,37 0,98 ± 0,17 1,49 ± 0,39 Día 30 Grupo A 1,50 ± 0,15 1,22 ± 0,09 2,82 ± 0,31 Grupo B 1,28 ± 0,43 1,03 ± 0,12 1,78 ± 0,48 Día 180 Grupo A 1,32 ± 0,22 1,26 ± 0,15 2,59 ± 0,29 Grupo B 1,17 ± 0,38 1,09 ± 0,21 1,83 ± 0,37 Día 360 Grupo A 1,21 ± 0,17 1,15 ± 0,21 2,67 ± 0,16 Grupo B 1,23 ± 0,51 0,92 ± 0,19 1,72 ± 0,42 Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 134 6.2.- Grupo B Sintomatología y Analítica hematológica y bioquímica En el grupo B dos animales con insuficiencia renal crónica fueron eutanasiados en el día 30 y en el día 180, a petición de los propietarios. En la necropsia (Figura III.15.) se tomaron muestras de bazo, linfonodos e hígado para aislamiento en tubos de medio N-N-N, obteniendo resultados negativos. Los síntomas desaparecieron en 24 de los 28 perros del grupo B (85.71%), encontrando asociada una mejoría analítica (normalización de los niveles de transaminasas hepáticas, aumento de la hemoglobina …). Figura III.15. En la parte superior gastroenteritis hemorrágica producida por la uremia en el curso de la insuficiencia renal crónica. En la parte inferior riñones fruncidos característicos de la avanzada insuficiencia renal. Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 135 Serología En el grupo B se observó un incremento en el título de anticuerpos en tan sólo 2 perros (7,14%), ambos con insuficiencia renal crónica avanzada. El 32% mantuvo su titulación estable, disminuyendo en un 60% Gráfico III. 14. En todos los perros en los que se dio una disminución del título de anticuerpos se observó una mejoría asociada en el proteinograma (Figura III.16.). Figura III.16. Evolución del proteinograma en uno de los perros del grupo B. En la parte izquierda proteinograma inicial, se observa una elevación muy marcada en las fracciones beta y gamma. En el centro proteinograma correspondiente al día 90 y a la derecha al día 360 en el que el descenso de la beta-gammapatía es evidente. Valoración de la respuesta inmune celular La valoración de la respuesta celular al igual que en el grupo A se estudió en función de la intradermorreacción Tabla III. 5. y de la linfoproliferación Tabla III. 6. y Gráfico III. 15. Estadísticamente (T de Student) se encontraron diferencias significativas en la intradermorreacción entre el día 0 y el 360, pero no entre el 0 y el 90 ni entre el 90 y el 360. En el test in vitro de la linfoproliferación se encontraron diferencias muy significativas (T de Student, p<0,01) entre cualquiera de los días y el día 0, no hallando diferencias al comparar los otros muestreos (30, 180 y 360) entre sí. Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 136 7.- AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN DE LA PROLACTINA CANINA Una vez que las muestras fueron retro-transcriptas se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa-PCR (SuperScriptTM III RT-PCR System, Invitrogene). Se diseñaron primers o cebadores degenerados, y posteriormente cebadores con bases de inosina. Usando los cebadores degenerados, se realizó una PCR de 30 a 35 ciclos, según los primers utilizados, a partir del cDNA procedente de la hipófisis. Las condiciones del estudio incluyeron una etapa de desnaturalización de 45 segundos a 94ºC, una etapa de hibridación de 1 minuto y 30 segundos (la temperatura de hibridación fue variable en función del primer utilizado en cada caso particular), y 3 minutos de extensión a 72ºC. Previo a la reacción en cadena de la polimerasa las muestras de cDNA se desnaturalizaron a 94ºC durante 1 minuto, y como etapa final se realizó una elongación a 72ºC durante 10 minutos. El proceso se llevó a cabo adicionando 1 U de la enzima Platinium Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogene) y 2-3 μl del cDNA, procedente de la retrotranscripción, a cada tubo de reacción. Figura III.17. Dos amplificaciones usando los primers degenerados Forward y Reverse. Se observan 4 bandas mayoritarias de unos 350, 450, 500 y 700 pares de bases Los primers con bases de inosina, en lugar de las degeneraciones, se utilizaron siguiendo el siguiente programa en el termociclador: Una etapa de desnaturalización de 45 segundos a 94ºC, una etapa de hibridación de 1 minuto y 30 segundos a 40 ºC, y 3 minutos de extensión a 72ºC. Estas fases se repitieron durante 35 ciclos en dos vueltas. Además como paso previo a la reacción en cadena de la polimerasa las muestras de cDNA se desnaturalizaron a 94ºC durante 1 minuto, y como etapa final se realizó una elongación a Resultados Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona. 137 72ºC durante 10 minutos. El proceso se llevó a cabo adicionando 1 U de la enzima Platinium Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogene) y 2-3 μl del cDNA, procedente de la retrotranscripción, a cada tubo de reacción. Hay que recalcar que se diseñaron 4 primers con bases de inosina, PRL 1 y PRL 2 basados en los extremos 3’ y 5’ de prolactinas de otras especies y PRL 3 y PRL 4 de acuerdo a homologías centrales de las proteínas. En la Figura III.18. se observa el resultado de las primeras PCRs con los primers PRL 1 y PRL 2. En la Figura III.19. se utilizaron los 4 primers a la vez, obteniendo una única banda. La desaparición de amplificaciones inespecíficas cuando se utilizaron los 4 primers al mismo tiempo confirma que sólo puede tratarse de la prolactina canina. Además esta banda tiene un peso molecular similar, ≈ 700 pares de bases, a las prolactinas de otras especies. Figura III.18. Producto de amplificación usando los cebadores PRL 1 y PRL 2. Las bandas son más nítidas que las obtenidas con los primers degenerados Figura III.19. Producto de amplificación usando los 4 cebadores con bases de inosina. Se observa una única banda de unos 700 pares de bases