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Abstract
Vibrio parahaemolyticus es una especie bacteriana que puede ser un patógeno importante en humanos, causante principalmente de infecciones gastrointestinales tras el consumo de moluscos crudos o poco cocinados. La especie es heterogénea y comprende variantes no patogénicas, al carecer por ejemplo, de los genes de virulencia tdh y/o trh, y patogénicas, por poseer los mencionados genes. A diferencia de EE.UU., en Europa se han realizado pocos estudios epidemiológicos sobre este patógeno en moluscos, por ello, la información de la que se dispone es limitada. La presente Tesis Doctoral pretende cubrir parte de este vacío al obtener nuevos datos sobre esta bacteria en Europa, en concreto en la costa mediterránea española. Los resultados que se han obtenido, no sólo son novedosos sino que, además, tienen el valor añadido de que podrán ser utilizados en un modelo de análisis de riesgo y servir para el desarrollo de un nuevo marco normativo de regulación en seguridad alimentaria que controle la amenaza que representa este patógeno emergente en Salud Pública. A grandes rasgos, esta Tesis Doctoral se divide en dos partes y en cada una de ellas se plantearon una serie de objetivos específicos. En la primera parte se procedió a la detección, aislamiento y caracterización de V. parahaemolyticus a partir de bivalvos en la costa mediterránea, y al estudio de su prevalencia y de sus relaciones con otras cepas de origen europeo. Y en la segunda, se procedió al desarrollo de un modelo de experimentación in vivo para la exposición de almejas con cepas seleccionadas representativas de las variantes patogénica y no patogénica de V. parahaemolyticus, para estudiar el crecimiento y la supervivencia de esta especie en Ruditapes spp. tanto en el medio acuático (contaminación in vivo de almejas adultas por baño), como en la fase de post-cosecha, por almacenamiento de las almejas tras la exposición experimental a diferentes temperaturas. Para asegurarnos de que el modelo es repetible se tuvo que conseguir determinadas condiciones como que las almejas utilizadas en las contaminaciones estuvieran libres de vibrios no fermentadores de sacarosa (entre los cuales se encuentra V. parahaemolyticus) por lo que se abordó el estudio de la eficacia de un sistema experimental de depuración. Los moluscos bivalvos estudiados en el presente trabajo doctoral proceden de las dos bahías que componen el delta del Ebro, y que se caracterizan por ser importantes zonas de producción acuícola a nivel nacional. Para la detección y caracterización de V. parahaemolyticus se llevaron a cabo pruebas fenotípicas, que componen la microbiología clásica y diferentes técnicas moleculares que determinaron la presencia de los genes tlh, tdh y trh. El análisis de la variabilidad genética de las cepas identificadas se realizó usando las técnicas de valor epidemiológico rep-PCR y electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE). Los datos recogidos se analizaron estadísticamente en función del diseño de los diferentes estudios y las características de las variables recogidas. Los resultados que se han obtenido en la primera parte de esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto la presencia de V. parahaemolyticus potencialmente patógeno para humanos en cuatro especies de moluscos bivalvos cultivados en el delta del Ebro, y la detección por primera vez en Europa de la coexistencia de los genes tdh y trh en una misma cepa bacteriana. Al analizar estadísticamente los datos de prevalencia en función de diversas variables asociadas con el hospedador y con el medio ambiente, se encontraron diferencias significativas en relación a la especie de molusco, siendo las almejas del género Ruditapes las que presentaron un mayor riesgo de estar contaminadas por V. parahaemolyticus en comparación con el resto de las especies de bivalvos estudiadas. Además, se detectó una relación directamente proporcional entre la prevalencia de V. parahaemolyticus en bivalvos y la salinidad (incrementándose el riesgo 1,27 veces por cada unidad de ppt que aumentara la salinidad) y, lo que es más interesante, una relación inversamente proporcional entre prevalencia de la variante patogénica de V. parahaemolyticus (trh+) y la salinidad (disminuyendo el riesgo 1,64 veces por cada unidad de ppt que aumentara la salinidad). Finalmente, se observó una gran diversidad genética al comparar diferentes cepas europeas de V. parahaemolyticus. La segunda parte de esta Tesis se centró en diversos estudios experimentales en laboratorio bajo condiciones controladas de algunas variables. Fundamentalmente se estudió la supervivencia de V. parahaemolyticus en Ruditapes spp., tanto en el medio acuático por contaminación in vivo de R. decussatus y R. philippinarum por baño, como también en la fase de post-cosecha por almacenamiento de Ruditapes spp., tras la contaminación in vivo de estas almejas por baño, a diferentes temperaturas del aire. Para llevar a cabo estos estudios, se validó en primer lugar la eficacia de un protocolo experimental de depuración con el fin de lograr la eliminación hasta niveles casi indetectables de vibrios no fermentadores de sacarosa con el fin de realizar la incorporación bacteriana bajo condiciones ambientales controladas y con dosis inoculadas conocidas. Posteriormente se estableció el crecimiento y supervivencia de V. parahaemolyticus en diferentes especies de almejas en el modelo, llevando a cabo una contaminación in vivo por baño, encontrando que R. decussatus incorporó y eliminó ambas variantes de V. parahaemolyticus más rápidamente que las almejas de la especie R. philippinarum. Por otra parte, en las mismas condiciones se observó que la variante no patogénica podría sobrevivir mejor que la variante patogénica de V. parahaemolyticus en las dos especies de almejas estudiadas. La importancia y, por lo tanto, el impacto de estos resultados es doble, ya que no sólo amplían el conocimiento de esta bacteria, sino que se demuestra que es posible el uso de la variante no patogénica para estudios posteriores de modelización evitando los riesgos para los investigadores. Seguidamente, se llevó a cabo un estudio con las dos especies de almejas cohabitando en el mismo tanque para describir un posible efecto hospedador en la etapa de meseta del estudio anterior (de 20 a 70 h post-inoculación). Los resultados obtenidos en este experimento no fueron lo suficientemente significativos como para confirmar las diferencias en el patrón de incorporación de la variante no patogénica de V. parahaemolyticus en el periodo citado; sin embargo se observó una tendencia marginal diferencial que ponía de manifiesto que R. decussatus tenía concentraciones ligeramente superiores de la variante no patogénica de V. parahaemolyticus que R. philippinarum, lo que concuerda con los resultados obtenidos en el estudio anterior en el que las dos especies de almejas se contaminaron y mantuvieron por separado. A su vez, los resultados de este estudio ponen de manifiesto que la diferencia en los niveles bacterianos adquiridos por cada una de las especies de almejas podrían estar relacionados con la temperatura del tanque (16-18ºC), temperatura más próxima a la temperatura óptima de filtración de R. decussatus que de R. philippinarum. Finalmente se abordó el estudio del comportamiento de V. parahaemolyticus en almejas del género Ruditapes que habían sido almacenadas a diferentes temperaturas del aire, tras la exposición experimental por baño a esta bacteria. Las temperaturas elegidas para este estudio fueron las temperaturas típicas del invierno y del verano en el mediterráneo, simulando la situación de manejo comercial (en puerto pesquero, cubierta de barcos, etc.), y, asimismo, temperaturas de refrigeración, simulando el ambiente de restaurantes y hogares. Las densidades de V. parahaemolyticus totales y patógenos fueron determinadas en distintos momentos (0, 24, 48, 72 y 96 horas) de almacenamiento. Tanto la variante patogénica humana como la variante no patogénica de V. parahaemolyticus se multiplicaron rápidamente en almejas almacenadas a 28ºC, mostrando un incremento de al menos 3 log ufc/g a 72 h, en ambas variantes. La variante no patogénica de V. parahaemolyticus almacenada a 4ºC y a 15ºC mostró una disminución de 1 log ufc/g y de 2 log ufc/g a 96 h, respectivamente, mientras que no se detectaron diferencias significativas para la variante patogénica de V. parahaemolyticus almacenada a dichas temperaturas. Estos resultados sugieren que la variante patogénica de V. parahaemolyticus podría sobrevivir mejor que la variante no patogénica en almejas (R. philippinarum) almacenadas tras la cosecha a 4 y a 15ºC. En definitiva los estudios que forman parte de esta Tesis Doctoral proporcionan información relevante que podrá utilizarse para cumplimentar las lagunas que existen en las actuales evaluaciones del riesgo relativo a la presencia de V. parahaemolyticus en Europa. Estos datos podrán ser utilizados ¿si se estima adecuado¿ en futuros modelos de análisis de riesgo de esta bacteria, así como para la elaboración de políticas de gestión de riesgo encaminadas a reducir las enfermedades en humanos asociadas a este patógeno de origen alimentario. López Joven, María Carmen; Ruiz Zarzuela, Imanol; Trigo de Sousa Roque, Ana Margarida; Blas Giral, Ignacio de
Full text
2012 12 María Carmen López Joven Epidemiología y cinética de crecimiento y supervivencia de vibrio parahaemolyticus en moluscos bivalvos de interés comercial Departamento Director/es Patología Animal Ruiz Zarzuela, Imanol Trigo de Sousa Roque, Ana Margarida Blas Giral, Ignacio de Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Departamento Director/es María Carmen López Joven EPIDEMIOLOGÍA Y CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y SUPERVIVENCIA DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN MOLUSCOS BIVALVOS DE INTERÉS COMERCIAL Director/es Patología Animal Ruiz Zarzuela, Imanol Trigo de Sousa Roque, Ana Margarida Blas Giral, Ignacio de Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
UniversidaddeZaragoza FacultaddeVeterinaria DepartamentodePatologíaAnimal UnidaddePatologíaInfecciosayEpidemiología Epidemiologíaycinéticadecrecimientoy supervivenciadeVibrioparahaemolyticusen moluscosbivalvosdeinteréscomercial MemoriapresentadaporMaríaCarmenLópezJoven ParaoptaralgradodeDoctor conMencióndeDoctoradoEuropeo Abril2012
Dra.ANATRIGODESOUSAROQUE,InvestigadoradelInstitutdeRecercai TecnologiaAgroalimentàries(IRTA)deSantCarlesdelaRàpita;Dr.IGNACIODE BLASGIRAL,ProfesorTitulardelDepartamentodePatologíaAnimaldelaFacultad deVeterinariadelaUniversidaddeZaragozayDr.IMANOLRUIZZARZUELA, ProfesorAyudanteDoctordelDepartamentodePatologíaAnimaldelaFacultad deVeterinariadelaUniversidaddeZaragoza,comoDirectores, CERTIFICAN: QueDª.MARÍACARMENLÓPEZJOVENharealizadobajonuestradirecciónlos trabajoscorrespondientesasuTesisDoctoraltitulada“Epidemiologíaycinéticade crecimientoysupervivenciadeVibrioparahaemolyticusenmoluscosbivalvosde interéscomercial”queseajustaconelProyectodeTesispresentadoycumplelas condicionesexigidasparaoptaralGradodeDoctorporlaUniversidadde Zaragoza,porloqueautorizansupresentacióncomocompendiodepublicaciones yconlamención“DoctorEuropeo”paraquepuedaserjuzgadaporelTribunal correspondiente. Yparaqueconste,firmamoselpresentecertificado EnZaragoza,a03deabrilde2012 Dra.A.RoqueDr.I.deBlasDr.I.RuizZarzuela
Agradecimientos/ Acknowledgements Enprimerlugar,agradeceramisdirectoresdetesisporlapaciencia,elapoyoyladedicaciónquehe recibidodecadaunodeellos.Sinellos,nadadeestohubierasidoposible.Ylaverdadquetengoque reconocerquehetenidomuchasuerteyquelacomunicaciónentretodoshasidolabasedeléxito. Graciasdeverdadacadaunodevosotrosporlacercanía,losconsejos,losdetalles,laayudaysobretodo portransmitirmelasensacióndequesiempreestabaisconmigo.Estohasidoparamílomásimportante. AlaDra.AnaRoquequeduranteestosañoshaestadopreocupándosepormíentodoslossentidosy haciendoquemeconviertaenloquesoyenestosmomentos.Graciasportuconfianza,dedicación, consejos,apoyoyportodoeltiempo,engeneral,quehemoscompartido.Hansidovariosañosde convivencia,quesehanconvertidoenamistadyesoesprecioso.GraciasAna! AlDr.IgnaciodeBlascuyadirecciónhasidocrucialysinlacualestatesishubierasidodiferente.Ojala puedallegaraalcanzarlacapacidadpersonalyprofesionalquetieneél.Graciasportodoloqueme hasayudadoytehaspreocupado,yportodoesoyasabesquepuedecontarconmigoparaloque quiera.GraciasNacho! AlDr.ImanolRuizZarzuelaporestarahí,porcomprenderme,ayudarmeyalentarmealolargode todoelcamino.Graciasporestarsiempredispuestoaescucharme,poraconsejarmeypordarmeese puntodevistarealytannecesarioenlavida.GraciasImanol! Tambiénquieroagradecerelapoyoyelcariñoqueherecibidodeotraspersonasalolargodetodo esteproceso: ACarmenAmaro,quemehaenseñadoaqueelglamournoestáreñidoconelestadointelectualoide delconocimiento.Eresunamujeradmirableportodoloquesabes,porcomolotransmitesyporese espíritudelas“milyunanoches”.Nuestroencuentrofueun“chispazao”yesperoqueestemos unidasparasiempre.Vivaelglamour!VivaParis2007!GraciasCarmen! Tambiénunfuerteabrazoparatodosuequipoquejuntoconellamerecibióconlosbrazosabiertos: Paco,Amparo,David,Eva(siemprerecordaréelviajeaSanAntonio‐Texas,graciasporrecibirmeen tucasayporportartetanbienconmigo),entreotros,quehicieronlaestanciaensulaboratorio agradableyenriquecedora.YunbesoparaBelén,porsupuesto,unamujerfuerte,inteligenteycon uncarácterdesbordanteyhuracanado. IwouldliketoexpressasinceregratitudetoDr.JamesD.OliverfromTheUniversityofNorth CarolinaatCharlotte,USAforintroducingmetotheAmericanSociety,acceptingmeinhislabfor3 monthandforhisscientificadviceandencouragementalongthewholeprocess.Iwouldalsoliketo thankJamesandPennyformakingmefeelathomewiththeirhospitality.Iwillalways,rememberall moments,excursions,meetingsatyourhouse,etc.. IwouldalsoliketothankallthemembersofDr.JamesD.Oliverresearchgroup,particularlyMelissa K.Jones(whonowisinFlorida)andEricaHye‐YoungKim(thatIhopeallthebestinChicago)... Thanksfortryingtounderstand,althoughmyEnglishwasnotgoodandformakingmefeelless aloneonthatfirsttripandespeciallyatthefirsttime.
IreallyappreciatethefriendshipandaffectionofCricketetPhilippe,THANKS,MERCItoinvitemeto yourhome,totakecareofmeandforbeingmyfriends.Thanksforchangingthesenseofloneliness forweekendsfullofactivity. AndaspecialdedicationtomyfriendRussell,THANKYOUforboating,formusicandnightlife.Last monthsinCharlotte,everythingwasfilledwithlightandmagic!!! IwouldliketosincerelythanktoDra.LucianaCrociandDra.ElisabettaSuffredini(IstitutoSuperiore diSanità)fortheirfriendshipandadvice.Theyhelpedmetogethere.Also,Ireallyappreciatethe friendshipandhelpfrommylabmateLilianaMaddalena.Also,Iamfortunatetohavefoundfantastic peoplethere:Aida,Angie,etc… IwouldliketoexpressmygratitudetoDr.AngeloDePaola,fromtheFoodandDrugAdministration (FDA)inDauphinIsland,USA,notonlyforacceptingmeinhisgroupfor2month,butalsoforhis scientificadviceandencouragement. IreallyappreciatethefriendshipandhelpfromallpeoplewhoworkintheFDAinDauphinIsland.My stagetherewasfantastic,thanksallofthem.IlearnedandIimprovedasaprofessionalscientistand asabetterperson.IwouldliketosincerelythanktoDra.JessicaL.Jonesforherworkand motivationandmakingthisstayagreatexperience.ThanksJessicaforhelpingmealotinthe laboratoryandformakingmefeelamongfriends.And,Iwouldliketoexpressspecialgratitudeto thebestman,myfriendGeorgeDoup!!!Ohhhhman…fantasticman!!Iamsurethatmystagewould havedifferentincasethatGeorgehadnotbeenthere.So,Iwas/amaveryfortunatewomantomeet withyou,George.Always,IwillwishyouthebestandIcarryyouinmyheart!Thanksalsotomydear Susan.Youareanincrediblewoman.Thanksforopeningyourhomedoorandformakingmefeel partofyourfamily.ThanksGeorge,thanksSusantolovemelikeamemberofyourfamily.Ihopesee usoon!!Waitforme…. IwouldliketosincerelythanktoJeffwhereeveryouareIalwaysrememberyou,yoursmileandyour BIGheart. IwouldliketosincerelythankDra.CarlaPruzzofromtheUniversityofGenova,Italy,andDra. FlorbelaSoaresfromIPIMAR,Portugal,fortheirgreathelpasEuropeanexpertsforthisthesis. AgradecersinceramenteaMariaDoloresFurones,comodirectoradelcentro,yaAliciaEstevez,jefe deUnidaddeCultivosexperimentaleselhabermerecibidoenelIRTA‐SCRconlaspuertasabiertasy habermedadotodotipodefacilidadespararealizarlosexperimentosenlasinstalacionesdelIRTA. AgradecersinceramenteaM.DoloresFuroneslabecaIRTAquemefueconcedidadesdeseptiembre adiciembre2006parainiciaresteprocesodoctoral. Agradeceratodoelequipodirectivo,administrativo,conMaiteCaballeralacabeza(unagranmujer yunaamigaestupenda…Maite,aquíestoy,paratodo),alequipotécnico,yatodoslos investigadoresquetrabajanenelIRTA‐SCRtodossusconsejosytodalaayudaprestada.Graciasa RicardCarbóporayudarmeencuántohenecesitadoalgo,aJosepCidporestarsiemprependiente delasconexiones,aCarmenRevertèporayudarnosconlabibliografía,aJosuPérezporlasalgasysu inestimableayudayacertadassugerencias,aKarlAndreèporestarsiempreahí,porsusideas, comprensiónycariño,aChrisRodgersunhombreexcepcional,aNunoporesegrancorazónyesa sonrisa,aNeilporsuamistad,aJosepM.Reverteportodasuayudaenlatomademuestras,a MargaritaFernándezporsuinestimableayudaenlosdatosdecalidaddelagua,aIsasisiempretan encantador,aRosaT.porlosbuenostiemposquesiempreestaránahí,aVanessa,Laura,Cristina, Nuria,Beatriz,ypordescontadoaMagda,Gloria,Xavi,Rafel,etc…porayudarmeenalgúnmomento conlalogísticadelosmoluscosyhacerlosiempreconalegría,aCarlesporayudarmeconel entramadomundodelosnúmeroscuándoestuveenapuros,aLydia,aDavidV.,etc…Tambiéna
I Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Índice Índice I 1.Resumen/Summary V 2.Justificación 1 3.Introducción 3 4.Revisiónbibliográfica 5 4.1.Estadoactualdelaacuicultura 5 4.2.FamiliaVibrionaceae:GéneroVibrio 8 4.2.1.Característicasgenerales 8 4.2.1.1.CaracterísticasdelgéneroVibrio 9 4.2.2.Taxonomía 11 4.2.3.Patogenicidad 13 4.2.3.1.Infeccionesgastrointestinalesyextraintestinalesenhumanos 13 4.2.3.2.Vibriosis 15 4.3.Vibrioparahaemolyticus 16 4.3.1.Variabilidadserológica 17 4.3.2Ecología 18 4.3.3.Estrategiadesupervivenciayestadoviablenocultivable(VBNC) 20 4.3.4.Factoresdevirulencia 21 4.3.5.Manifestacionesclínicas 23 4.3.6.Epidemiología 25 4.3.7.Incidenciadeinfecciónenhumanos 26 4.3.8.Métodosdecultivoparaelaislamientoeidentificación 27 4.3.8.1.AgarTiosulfato‐citrato‐salesbiliares‐sacarosa(TCBS) 28 4.3.8.2.AgarCHROMagarVibrio 28 4.3.9.Caracterizaciónfenotípicaeidentificaciónbioquímica 29 4.3.10.Métodosmolecularesparaladetección ytipificación 30 4.3.10.1.Reacciónencadenadelapolimerasa(PolymeraseChainReaction,PCR) 30 4.3.10.2.rep‐PCR(Repetitiveelement‐basedPCR) 30 4.3.10.3.Técnicadeelectroforesisengeldecampopulsado(Pulsed‐ FieldGelElectrophoresis,PFGE) 31 4.3.11.Prevencióndelainfección 32 4.3.11.1.Clasificaciónmicrobiológicadezonasdeproducción 34 4.3.11.2.Reinstalaciónydepuración 35 4.3.11.3.Técnicasdeconservaciónparalacomercializaciónde moluscosvivosofrescos 38 4.3.11.4.Procesadodemoluscos 41 4.4.AnálisisderiesgodeV.parahaemolyticusenacuicultura 43
II Índice 5.Objetivos 45 5.1Objetivogeneral45 5.2Objetivosespecíficos 45 6.MaterialyMétodos 47 6.1.Estudiosobservacionales 47 6.1.1.Ámbitogeográfico 47 6.1.2.Poblaciónestudiada 48 6.1.3.Diseñodelosmuestreos 50 6.2.Estudiosexperimentales 52 6.2.1.Animalesdeexperimentación 52 6.2.2.Instalaciones 53 6.2.3.CepasdeV.parahaemolyticus 55 6.2.4.Diseñoexperimental 56 6.2.4.1.Depuración 56 6.2.4.2.Cinéticadeincorporaciónencondicionesexperimentalesde cultivo 56 6.2.4.3.Cinéticasdeincorporaciónencondicionesdepost‐cosecha 57 6.3.Técnicasdiagnósticas 58 6.3.1.Procesadodelasmuestras 59 6.3.2.Recuentobacteriológico 59 6.3.3.Identificaciónbacteriana60 6.3.4.Diagnósticomolecular60 6.3.5.Hibridacióndecolonias 61 6.3.6.Caracterizaciónmolecular61 6.3.7.Susceptibilidadaantibióticos62 6.3.8.Variabilidadserológica62 6.4.Análisisestadístico63 7.Publicaciones 65 7.1.DeteccióneidentificacióndeV.parahaemolyticuseneldeltadelEbroysu relaciónintraespecíficaconotrosaisladosdelaUniónEuropea(Estudios observacionales)65 7.1.1.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,200965 Detectionandidentificationoftdh‐andtrh‐positiveVibrioparahaemolyticusstrains fromfourspeciesofculturedbivalvemolluscsontheSpanishMediterraneanCoast 7.1.2.ISMEJournal:MultidisciplinaryJournalofMicrobialEcology(enrevision) 71 SpatialdistributionandtemporalevolutionofVibrioparahaemolyticusinbivalve molluscsfromtheSpanishMediterraneanCoast 7.1.3.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2011 105 Pulsed‐FieldGelElectrophoresisandPCRcharacterizationofenvironmental Vibrioparahaemolyticusstrainsofdifferentorigins
III Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 7.2.Caracterizaciónexperimentaldeladinámicadeinfecciónde V.parahaemolyticusenalmejas(Estudiosexperimentales) 111 7.2.1.FoodMicrobiology,2011111 PersistenceofsucrosefermentingandnonfermentingvibriosintissuesofManila clamspecies,Ruditapesphilippinarum,depuratedinseawaterattwodifferent temperatures 7.2.2.JournalofAppliedMicrobiology,2011 119 Experimentaluptakeandretentionofpathogenicandnonpathogenic Vibrioparahaemolyticusintwospeciesofclams:Ruditapesdecussatusand Ruditapesphilippinarum 7.3.2.AquacultureResearch(enrevisión) 133 EvolutionofnonpathogenicVibrioparahaemolyticusinacohabitatingpopulationof RuditapesdecussatusandRuditapesphilippinarumunderexperimentalconditions 7.2.4.JournalofFoodProtection(enrevisión) 155 Effectofdifferenttemperaturesonthegrowthandsurvivalofpathogenicand nonpathogenicVibrioparahaemolyticusintissuesofpostharvestManilaclam (Ruditapesphilippinarum) 8.DiscusiónGeneral/Discussion 181 9.Conclusiones/Conclusions 197 10.Bibliografía 199 11.Apéndices 227 11.1.Característicasdelasrevistas 227 11.2.ContribucióndeladoctorandayrenunciadecoautoresnoDoctores 229 11.3.Trabajosactualmenteenelaboracióndentrodelmarcodelapresente TesisDoctoral233 11.3.1.RecoveryandDetectionofVibrioparahaemolyticusandVibriovulnificusin experimentalinoculatedsamplesandenvironmentalsamples,UsingTangentialFlow FiltrationProcedure(TFF)followingwithMPNandReal‐TimePCRmethods 233 11.3.2.Comparisonofdepurationprotocolsinseawaterforcleaningofnatural populationsucrosefermentingandnonfermentingvibriosintissuesoftwospecies ofclams:RuditapesphilippinarumandRuditapesdecussatus 234
IV Índice
V Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 1 Resumen/Summary Resumen Vibrioparahaemolyticusesunaespeciebacterianaquepuedeserunpatógeno importanteenhumanos,causanteprincipalmentedeinfeccionesgastrointestinales traselconsumodemoluscoscrudosopocococinados.Laespecieesheterogéneay comprendevariantesnopatogénicas,alcarecerporejemplo,delosgenesde virulenciatdhy/otrh,ypatogénicas,porposeerlosmencionadosgenes.A diferenciadeEE.UU.,enEuropasehanrealizadopocosestudiosepidemiológicos sobreestepatógenoenmoluscos,porello,lainformacióndelaquesedisponees limitada.LapresenteTesisDoctoralpretendecubrirpartedeestevacíoalobtener nuevosdatossobreestabacteriaenEuropa,enconcretoenlacostamediterránea española.Losresultadosquesehanobtenido,nosólosonnovedosossinoque, además,tienenelvalorañadidodequepodránserutilizadosenunmodelode análisisderiesgoyservirparaeldesarrollodeunnuevomarconormativode regulaciónenseguridadalimentariaquecontrolelaamenazaquerepresentaeste patógenoemergenteenSaludPublica. Agrandesrasgos,estaTesisDoctoralsedivideendospartesyencadaunadeellas seplantearonunaseriedeobjetivosespecíficos.Enlaprimeraparteseprocedióala detección,aislamientoycaracterizacióndeV.parahaemolyticusapartirdebivalvos enlacostamediterránea,yalestudiodesuprevalenciaydesusrelacionesconotras cepasdeorigeneuropeo.Yenlasegunda,seprocedióaldesarrollodeunmodelo deexperimentacióninvivoparalaexposicióndealmejasconcepasseleccionadas representativasdelasvariantespatogénicaynopatogénicadeV.parahaemolyticus, paraestudiarelcrecimientoylasupervivenciadeestaespecieenRuditapesspp. tantoenelmedioacuático(contaminacióninvivodealmejasadultasporbaño), comoenlafasedepost‐cosecha,poralmacenamientodelasalmejastrasla exposiciónexperimental,adiferentestemperaturas.Paraasegurarnosdequeel modeloesrepetiblesetuvoqueconseguirdeterminadascondicionescomoquelas almejasutilizadasenlascontaminacionesestuvieranlibresdevibriosno fermentadoresdesacarosa(entreloscualesseencuentraV.parahaemolyticus)por loqueseabordóelestudiodelaeficaciadeunsistemaexperimentaldedepuración. Losmoluscosbivalvosestudiadosenelpresentetrabajodoctoralprocedendelas dosbahíasquecomponeneldeltadelEbro,yquesecaracterizanporser
VI Resumen/Summary importanteszonasdeproducciónacuícolaanivelnacional.Paraladeteccióny caracterizacióndeV.parahaemolyticussellevaronacabopruebasfenotípicas,que componenlamicrobiologíaclásicaydiferentestécnicasmolecularesque determinaronlapresenciadelosgenestlh,tdhytrh. Elanálisisdelavariabilidadgenéticadelascepasidentificadasserealizóusandolas técnicasdevalorepidemiológicorep‐PCRyelectroforesisengeldecampopulsante (PFGE).Losdatosrecogidosseanalizaronestadísticamenteenfuncióndeldiseño delosdiferentesestudiosylascaracterísticasdelasvariablesrecogidas. LosresultadosquesehanobtenidoenlaprimerapartedeestaTesisDoctoral ponendemanifiestolapresenciadeV.parahaemolyticuspotencialmentepatógeno parahumanosencuatroespeciesdemoluscosbivalvoscultivadoseneldeltadel Ebro,yladetecciónporprimeravezenEuropadelacoexistenciadelosgenestdhy trhenunamismacepabacteriana.Alanalizarestadísticamentelosdatosde prevalenciaenfuncióndediversasvariablesasociadasconelhospedadoryconel medioambiente,seencontrarondiferenciassignificativasenrelaciónalaespeciede molusco,siendolasalmejasdelgéneroRuditapeslasquepresentaronunmayor riesgodeestarcontaminadasporV.parahaemolyticusencomparaciónconelresto delasespeciesdebivalvosestudiadas.Además,sedetectóunarelación directamenteproporcionalentrelaprevalenciadeV.parahaemolyticusenbivalvosy lasalinidad(incrementándoseelriesgo1,27vecesporcadaunidaddepptque aumentaralasalinidad)y,loqueesmásinteresante,unarelacióninversamente proporcionalentreprevalenciadelavariantepatogénicadeV.parahaemolyticus (trh+)ylasalinidad(disminuyendoelriesgo1,64vecesporcadaunidaddepptque aumentaralasalinidad).Finalmente,seobservóunagrandiversidadgenéticaal comparardiferentescepaseuropeasdeV.parahaemolyticus. LasegundapartedeestaTesissecentróendiversosestudiosexperimentalesen laboratoriobajocondicionescontroladasdealgunasvariables.Fundamentalmente seestudiólasupervivenciadeV.parahaemolyticusenRuditapesspp.,tantoenel medioacuáticoporcontaminacióninvivodeR.decussatusyR.philippinarumpor baño,comotambiénenlafasedepost‐cosechaporalmacenamientode Ruditapesspp.,traslacontaminacióninvivodeestasalmejasporbaño,adiferentes temperaturasdelaire. Parallevaracaboestosestudios,sevalidóenprimerlugarlaeficaciadeun protocoloexperimentaldedepuraciónconelfindelograrlaeliminaciónhasta nivelescasiindetectablesdevibriosnofermentadoresdesacarosaconelfinde realizarlaincorporaciónbacterianabajocondicionesambientalescontroladasycon dosisinoculadasconocidas. PosteriormenteseestablecióelcrecimientoysupervivenciadeV.parahaemolyticus endiferentesespeciesdealmejasenelmodelo,llevandoacabounacontaminación
VII Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial invivoporbaño,encontrandoqueR.decussatusincorporóyeliminóambas variantesdeV.parahaemolyticusmásrápidamentequelasalmejasdelaespecie R.philippinarum.Porotraparte,enlasmismascondicionesseobservóquela variantenopatogénicapodríasobrevivirmejorquelavariantepatogénicade V.parahaemolyticusenlasdosespeciesdealmejasestudiadas.Laimportanciay,por lotanto,elimpactodeestosresultadosesdoble,yaquenosóloamplíanel conocimientodeestabacteria,sinoquesedemuestraqueesposibleelusodela variantenopatogénicaparaestudiosposterioresdemodelizaciónevitandolos riesgosparalosinvestigadores.Seguidamente,sellevóacabounestudioconlas dosespeciesdealmejascohabitandoenelmismotanqueparadescribirunposible efectohospedadorenlaetapademesetadelestudioanterior(de20a70hpost‐ inoculación).Losresultadosobtenidosenesteexperimentonofueronlo suficientementesignificativoscomoparaconfirmarlasdiferenciasenelpatrónde incorporacióndelavariantenopatogénicadeV.parahaemolyticusenelperiodo citado;sinembargoseobservóunatendenciamarginaldiferencialqueponíade manifiestoqueR.decussatusteníaconcentracionesligeramentesuperioresdela variantenopatogénicadeV.parahaemolyticusqueR.philippinarum,loque concuerdaconlosresultadosobtenidosenelestudioanteriorenelquelasdos especiesdealmejassecontaminaronymantuvieronporseparado.Asuvez,los resultadosdeesteestudioponendemanifiestoqueladiferenciaenlosniveles bacterianosadquiridosporcadaunadelasespeciesdealmejaspodríanestar relacionadosconlatemperaturadeltanque(16‐18ºC),temperaturamáspróximaala temperaturaóptimadefiltracióndeR.decussatusquedeR.philippinarum. FinalmenteseabordóelestudiodelcomportamientodeV.parahaemolyticusen almejasdelgéneroRuditapesquehabíansidoalmacenadasadiferentes temperaturasdelaire,traslaexposiciónexperimentalporbañoaestabacteria.Las temperaturaselegidasparaesteestudiofueronlastemperaturastípicasdelinvierno ydelveranoenelmediterráneo,simulandolasituacióndemanejocomercial(en puertopesquero,cubiertadebarcos,etc.),y,asimismo,temperaturasde refrigeración,simulandoelambientederestaurantesyhogares.Lasdensidadesde V.parahaemolyticustotalesypatógenosfuerondeterminadasendistintos momentos(0,24,48,72y96horas)dealmacenamiento.Tantolavariante patogénicahumanacomolavariantenopatogénicadeV.parahaemolyticusse multiplicaronrápidamenteenalmejasalmacenadasa28ºC,mostrandoun incrementodealmenos3logsufc/ga72h,enambasvariantes.Lavarianteno patogénicadeV.parahaemolyticusalmacenadaa4ºCya15ºCmostróuna disminuciónde1logufc/gyde2logufc/ga96h,respectivamente,mientrasqueno sedetectarondiferenciassignificativasparalavariantepatogénicade V.parahaemolyticusalmacenadaadichastemperaturas.Estosresultadossugieren quelavariantepatogénicadeV.parahaemolyticuspodríasobrevivirmejorquela
VIII Resumen/Summary variantenopatogénicaenalmejas(R.philippinarum)almacenadastraslacosechaa 4ya15ºC. EndefinitivalosestudiosqueformanpartedeestaTesisDoctoralproporcionan informaciónrelevantequepodráutilizarseparacumplimentarlaslagunasque existenenlasactualesevaluacionesdelriesgorelativoalapresenciade V.parahaemolyticusenEuropa.Estosdatospodránserutilizados“siseestima adecuado”enfuturosmodelosdeanálisisderiesgodeestabacteria,asícomopara laelaboracióndepolíticasdegestiónderiesgoencaminadasareducirlas enfermedadesenhumanosasociadasaestepatógenodeorigenalimentario.
IX Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Summary Vibrioparahaemolyticusisabacterialspeciesthatcanbeanimportantpathogenin humans,causinggastrointestinalinfectionsaftertheconsumptionofrawor undercookedshellfish.Thespeciesisheterogeneousandincludesnon‐pathogenic variants,lackingforexample,thevirulencegenestdhand/ortrh,andpathogenic, whichcontaintheaforementionedgenes.UnliketheU.S.,inEuropetherehave beenfewepidemiologicalstudiesofthispathogeninshellfish,therefore,available informationislimited.Thisthesisaimstofillpartofthisgapbyobtainingnewdata onthisbacteriuminEurope,particularlyintheSpanishMediterraneancoast.The resultsobtainedarenotonlyinnovativebutalsohavetheaddedvaluethatcanbe usedinariskanalysismodelandusedtodevelopanewregulatoryframeworkfor foodsafetyregulationtocontrolthethreatposedbythisemergingpathogenin PublicHealth. Broadlyspeaking,thisPhDthesisisdividedintotwopartsandeachaddressinga numberofspecificobjectives.Inthefirstpart,thedetection,isolationand characterizationofV.parahaemolyticusinshellfishfromtheMediterraneancoast, andthestudyofitsprevalenceanditsrelationshipwithotherstrainsofEuropean originwasaddressed.Andinthesecond,aninvivoexperimentalmodelwas developedfortheexposureofclamswithselectedstrainsrepresentingthe pathogenicandnonpathogenicvariantsofV.parahaemolyticus,inordertostudy thegrowthandsurvivalofthisspeciesinRuditapesspp.bothintheaquatic environment(invivoinoculationofadultclamsbybathchallenge),andatthestage ofpost‐harvest,throughthestorageofclams,afterexperimentalexposure,at differenttemperatures.Toensurethatthemodelisrepeatablecertainconditions hadtobeachieved,suchastheclamsusedininfectionswerefreeofnon‐ fermentingvibrios(includingV.parahaemolyticus)andthereforetheeffectiveness ofanexperimentaldepurationsystemwasstudied. Thebivalvemolluscsstudiedinthisdissertationcomefromthetwobaysthatmake uptheEbrodelta,whichareimportantareasofnationalaquacultureproduction. ForthedetectionandcharacterizationofV.parahaemolyticusphenotypictests wereperformedandmoleculartechniquesthatdeterminedthepresenceofgenes tlh,tdhandtrh. Theanalysisofthegeneticvariabilityofthestrainsidentifiedwasperformedusing techniquesofepidemiologicalvaluesuchasrep‐PCRandpulsed‐fieldgel electrophoresis(PFGE).Thecollecteddatawerestatisticallyanalyzedaccordingto thedesignofthedifferentstudiesandthecharacteristicsofthevariablescollected. Theresultsobtainedinthefirstpartofthisthesisshowthepresenceof V.parahaemolyticuspotentiallypathogenictohumansinfourspeciesofbivalve molluscsgrownintheEbrodelta,anddetectionforthefirsttimeinEuropeofthe
X Resumen/Summary coexistenceofthegenestdhandtrhinthesamebacterialstrain,andalso describingitsrelationshipwithdifferentvariablesassociatedwiththehostandthe environment.Significantdifferencesinrelationtothespeciesofmolluscwere found,beingtheclamsofthegenusRuditapeswhichhadahigherriskofbeing contaminatedwithV.parahaemolyticusthanotherbivalvespecies.Inaddition,a directrelationshipbetweentheprevalenceofV.parahaemolyticusinshellfishand salinity(increasingtherisk1.27timesforeachunittoincreasepptsalinity)was detectedand,moreinterestingly,aninverserelationshipbetweenprevalenceof pathogenicvariantV.parahaemolyticus(trh+)andsalinity(decreasingtherisk1.64 timesforeachunittoincreasethesalinityppt).Finally,ahighgeneticdiversity whencomparingdifferentEuropeanstrainsofV.parahaemolyticuswasobserved. Thesecondpartofthisthesisisfocusedonexperimentalstudiesinlaboratory undercontrolledconditionsofsomevariables.Fundamentally,thesurvivalof V.parahaemolyticusinRuditapesspp.,bothintheaquaticenvironmentthrougha bathchallengeofR.decussatusandR.philippinarum,andinthephaseofpost‐ harveststorageofRuditapesspp.,afterabathchallengeoftheseclams,atdifferent airtemperatureswasstudied. Toperformthesestudies,initiallytheefficacyofanexperimentalprotocolof depurationwasvalidatedinordertoachievealmostundetectablelevelsofsucrose non‐fermentingvibriosinordertoperformthebacterialchallengeundercontrolled environmentalconditionsandwithknownbacterialdoses. Subsequently,thegrowthandsurvivalofV.parahaemolyticusindifferentspeciesof clamsinthemodelwereassessedusingabathchallengeanditwasfoundthat R.decussatusincorporatedanddischargedbothvariantsofV.parahaemolyticus clamsfasterthanR.philippinarum.Moreover,underthesameconditionsitwas observedthatthenon‐pathogenicvariantcouldsurvivebetterthanthepathogenic variantofV.parahaemolyticusintwoclamspeciesstudied.Theimportanceand, therefore,theimpactoftheseresultsisdouble,asitnotonlyextendtheknowledge ofthisbacterium,butitshowsthatitispossibletousenon‐pathogenicvariantfor subsequentmodelingstudiesavoidingtherisksforresearchers.Astudywiththe twoclamspeciescohabitinginthesametankfordescribingahosteffectonthe plateauphaseofthepreviousstudy(20to70hpost‐inoculation)wasperformed. Theresultsobtainedinthisexperimentwerenotsignificantenoughtoconfirmthe differencesinthepatternofincorporationofnon‐pathogenicvariant V.parahaemolyticusintheperiodmentioned,buttherewasamarginaldifferential trendwhichindicatedthatR.decussatushadslightlyhigherconcentrationsofnon‐ pathogenicvariantV.parahaemolyticusthanR.philippinarum,whichisconsistent withresultsobtainedinthepreviousstudyinwhichthetwospeciesofclamswere keptseparately.Theresultsofthisstudyonthedifferenceinbacteriallevels incorporatedbyeachclamspeciesmaybeassociatedwiththetanktemperature
5 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 4 Revisiónbibliográfica 4.1.Estadoactualdelaacuicultura DeacuerdoconlaOrganizacióndelasNacionesUnidasparalaAgriculturayla Alimentación(FAO,porsussiglaseninglés),laacuiculturaes“elcultivode organismosacuáticos(peces,crustáceos,moluscosyplantasacuáticas)bajo condicionescontroladasosemi‐controladasprincipalmenteparalaalimentación humana,perotambiénconfineslúdicos”.Enlaactualidad,laacuiculturarepresenta alrededordel30%delaproducciónpesqueramundial(FAO,2010a). Enelcontextomundial,laacuiculturaesunsectordeproduccióndealimentos jovenquehaidocreciendorápidamenteenlosúltimos50años,yquesegúnlaFAO, llegaráaaportarel65%delosalimentosdeorigenacuáticoen2030(FAO,2010a citadoenAPROMAR2011).En2009,laproducciónglobalparaalimentaciónhumana llegóasersuperioralaporteprocedentedelapescaextractiva(73y65millonesde Tm,respectivamente)(excluyendodeestaúltima,los24millonesdeTmquese dedicaronapiensosparaganaderíaterrestre,acuiculturayotros).Dehecho,la pescaextractivanohaaumentadodesdemediadosdeladécadade1980yse estimaqueseestáreduciendodeformapaulatina(APROMAR,2011). Entre1950y2009,laproducciónacuícolacreciódemanerasorprendentedesde menosde0,6millonesdeTmen1950,alosmencionados73millonesdeTmen2009. Estaproducciónhamantenidouníndicedecrecimientomedioanualdel8,3%entodo elmundo(odel6,5%excluyendoaChina)(“Estadomundialdelaacuiculturaylapesca en2010”,FAO,2010a).Sinembargo,esperceptibleunareduccióngradualenelritmo decrecimientodelaacuiculturaglobal.Porotrolado,elconsumopercapitamundial deproductosacuáticostambiénhaidoincrementándoseconelpasodeltiempo, superandolos17kgporpersonayañoen2009(APROMAR,2011). Sihacemosunaclasificaciónporpaísesproductores,Chinaeselprincipale indiscutiblenúmerouno,con45,3millonesdeTmanualesdeproducciónen2009, seguidodeIndonesiacon4,7millonesdeTmydelaIndiacon3,8millonesdeTm. Españaocupólaposición19ªenelrankingmundialcon266.476Tm(FishStat,2009; APROMAR,2011).Ysisetieneencuentaelvalordelaproducciónanual(enmillonesde euros)en2009,laprimeraposiciónvuelveaserparaChina,paíscuyaacuicultura generaunvalorde45.676millonesdeeuros.Ensegundaposición,muypordebajo,se
6 RevisiónBibliográfica encuentraIndia(4.519millonesdeeuros),oEspañalacuálocupaelpuesto27ªcon413 millonesdeeurosen2009(FishStat,2009;APROMAR,2011). EnEuropa,laacuiculturaconstituye,igualmente,unafuentecadavezmás importantedepescadoymarisco,destacandolaproduccióndeespeciespiscícolasde unaltovalorcomercial(salmón,trucha,dorada,lubina,entreotras)ydemoluscos (ostra,mejillónyalmeja).Enestesentido,laproduccióndepecessupusoel49,3%en pesoyel69,4%envalordelaproducciónacuícolaeuropeatotal,mientrasquelos moluscosconstituyeronel50,6%y30,4%,respectivamente.Además,enestos momentos,laacuiculturaenalgunospaíseseuropeossuperaenrelevancia económicaysocialalapescaextractiva(APROMAR,2011). Encuantoalasprincipalesespeciesproducidasenlaacuiculturaanivelmundial,en 2009,elprimerlugarfueparaelalgalaminariajaponesaowakame (Undariapinnatifida)con4,9millonesdeTm,seguidodelacarpaherbívora (Ctenopharyngodonidella)ydelacarpaplateada(Hypophthalmichthysmolitrix),con 4,2y4,1millonesdeTm,respectivamente,yenelcasodelosmoluscosbivalvos,el ostiónjaponés(3,5millonesdeTm)ylaalmejajaponesa(3,2millonesdeTm) ocupancuartoyelquintolugar,respectivamente.Yenrelaciónconelvalordela producciónacuícolamundial(esemismoaño)enmillonesdeeuros,losdatossitúan allangostinoblanco(Litopenaeusvannamei)comolaprincipalespeciecon 7.374millonesdeeuros,seguidoporelsalmónatlántico(Salmosalar),conunvalor de5.140millonesdeeuros.Sinembargo,ningunadelasespeciesdemoluscos bivalvosestáincluidaenelrankingdelasdiezprincipales(FishStat,2009; APROMAR,2011). Teniendoencuentalosdatosde2009,ladistribuciónporcentualdelaproducciónde acuiculturamundialsitúaalospecesenprimerlugar(49,4%),seguidodelosvegetales (23,7%),losmoluscos(18,6%),loscrustáceos(7,3%),elgrupodeanfibios‐reptilescon 0,5%y,porúltimo,elgrupodeotrosinvertebradosconel0,5%restante.Porotra parte,sisetieneencuentaelvalorenprimeraventa,hayquedestacarquela produccióndepecesgenerómásde52.000millonesdeeuros,loquesupusoel59,3% delvalordelaproducciónacuícolaglobal,mientrasquelaproduccióndecrustáceos representóel21,9%ylademoluscosel11,9%(APROMAR,2011). Llegadosaestepuntoycentrandolarevisiónbibliográficaenelgrupodemoluscos, cabedestacarquelaproducción(ensuconjunto)anivelmundialaumentóaunritmo anualdel3,7%enelperíodo2000‐2008y,queen2008,lasprincipalesespecies producidasfueronlasostras(31,8%),lasalmejas(24,6%),losmejillones(12,4%)ylos pectínidos(10,7%)(FAO,2010a). Elimportantecrecimientodelaacuiculturadesdelosaños80yquecontinuaenla actualidadsehaconseguidograciasaldesarrollo,ladiversificaciónylosadelantos tecnológicos,quefavorecenelcrecimientoeconómico,lamejoradelniveldevidayel
7 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial incrementodelaseguridadalimentaria,tantoenpaísesdesarrolladoscomoenpaíses envíasdedesarrollo(DeclaraciónyEstrategiadeBangkokde2000(FAO),citadopor APROMAR,2011). LaacuiculturaespañoladestacadentrodelaUniónEuropeay,segúndatosdel 2009,estabaconsideradalaprimeraproductoraacuícolacon268.565Tm(aunque ocupabala5ªposiciónencuantoalvalortotaldelaproduccióndebidoalbajo preciomedioensucomercialización)(Eurostat,2012;APROMAR,2011).Enla actualidadocupalasegundaposiciónenproducciónsegúnelMinisteriode Agricultura,AlimentaciónyMedioambiente(http://www.magrama.es)teniendoen cuentaqueelcrecimientosehaestancadoenalgunossectores.Así,laAsociación EmpresarialdeProductoresdeCultivosMarinosdeEspaña(APROMAR)ha informadorecientementequeseprodujounareduccióndel9,4%enlaproducción depecesmarinosenEspañaenel2010. Encuantoamoluscosbivalvos,EspañasiguesiendoelprimerproductordelaUnión Europeayelsegundoproductoranivelmundial.Estosmoluscosseconsideranuna importantefuentedealimento,especialmenteenlaspoblacionesquevivencerca delmar(60.000Tmconsumidasalaño;MAPA,2001).SegúnelMinisteriode Agricultura,AlimentaciónyMedioAmbiente(MAGRAMA)yconcretamente,la JuntaNacionalAsesoradeCultivosMarinos(JACUMAR)losdatosdeproducciónen Españaen2008,fueron:moluscos(bivalvosycefalópodos),199.923,71Tm(sololos bivalvos,199.895,29Tm);pecesmarinos,40.262,65Tm,crustáceos,112,69Tm,y algas,13,67Tm(Jacumar,2011). EnEspaña,lasprincipaleszonasdecultivodemoluscosbivalvosseencuentran ubicadasenGalicia,CataluñayAndalucía.Deltotaldelaproduccióndemoluscos bivalvosenEspañaeneseaño(2008),Galiciaobtuvounaproduccióntotalde 195.062,3Tm,seguidadeCataluña(3.767,41Tm),ydeAndalucía(656,05Tm).Y segúnlaúltimaactualizacióndelosdatosdeproducción(Tm)(Jacumar,2011)enel año2010Galiciaobtuvounaproduccióntotalde215.688,84Tm,seguidadeCataluña (3.878,24Tm),ydeAndalucía(790,51Tm). Ampliandolosúltimosdatosdel2010(Jacumar,2011),enGalicialasespeciesde moluscosbivalvoscultivadasson:almejababosa(Venerupis(=Tapes)pullastra)con 146,84Tm,almejafinacon197,02Tm,almejajaponesacon1.226,30Tm,berberecho común(Cerastodermaedule)con895,97Tm,mejillóncon212.034,51Tm,ostión japonés(uostrarizada)con314,01Tm,ostraeuropea(uostraplana)(Ostreaedulis) con862,14Tm,yvolandeira(Aequipectenopercularis)con4,41Tm.Elcultivode mejillóneselmásrepresentativoyselocalizaenlasríasgallegas,siendolaríade Arousaresponsabledel60%delaproducciónespañolademejillón,seguidaporlaría deVigoylaríadePontevedra.
8 RevisiónBibliográfica EnCataluña,elcultivodebivalvosseconcentraenlaregióndelDeltadelEbro.Las especiescultivadasson:almejafinacon5,79Tm,almejajaponesacon5,49Tm, berberechocomúncon7,09Tm,mejillóncon3.604,84Tm,navaja(Ensisarcuatus)con 3,7Tm,ostiónjaponéscon249,92Tm,yostraeuropeacon1,4Tm. Yporúltimo,enAndalucía,lasespeciesdemoluscosbivalvoscultivadasson:almeja finacon4,12Tm,almejajaponesacon11,93Tm,mejillóncon756,68Tm,ostión japonéscon17,66Tmyzamburiña(Chlamysvaria)con0,05Tm. Enelapartadodemetodologíasedescribirádetalladamenteelámbitogeográficodel cultivodemoluscosenCataluña,concretamentelaregióndelDeltadelEbro,porser éstalazonadeproducciónmásimportanteenlacostamediterránea,dondese llevaronacabolostrabajosdelapresenteTesisDoctoral. 4.2.FamiliaVibrionaceae:GéneroVibrio LafamiliaVibrionaceae(Véron,1965)pertenecealordenVibrionalesyalaclase Gammaproteobacteria(Tabla1).Lafamiliaenglobadiferentesgénerosyungran númerodeespeciesdeambientesacuáticospropiasdeecosistemastempladosy tropicales. Tabla1.ClasificacióntaxonómicadeVibrioparahaemolyticus Dominio:Bacteria Phylum: Proteobacteria Clase: Gammaproteobacteria Orden: Vibrionales Familia: Vibrionaceae Género: Vibrio Especie Vibrioparahaemolyticus LafamiliaVibrionaceaetienecomogénerotipo,Vibrio(Pacini,1854),comoespecietipo, Vibriocholerae(Pacini,1854),ycomocepatipo,ATCC14035(NCTC8021)(Baumanny Schubert,1984;Farmer3rd,2006). 4.2.1.Característicasgenerales LafamiliaVibrionaceaefuepropuestaformalmenteporVéronen1965comouna agrupacióndebacteriasfermentativas,Gram‐negativas,anaerobiasfacultativasque crecíanbienenmediosordinariosdepeptonayengeneral,enmediosconsales biliaresyqueeranoxidasapositivaymóviles,graciasaunoómásflagelospolares (BaumannySchubert,1984). Muchasvibrionáceassonbacteriashalófilasohalotolerantes,loquesignificaque parasuaislamientohayquesuplementarelmediodecultivoconsal(losmedios decultivodepeptonacomercialescontienenentre0,5y0,85%deNaCl).
9 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial LasespeciespertenecientesalafamiliaVibrionaceaesonmayoritariamente sensiblesalagentevibriostáticoopteridinaO/129(2,4‐diamino‐6,7‐di‐isopropil‐ pteridina)(V.aerogenesesresistente),loquepermiteutilizarestapruebacomo discriminatoria(Farmer3rdetal.,2005). Estoesimportanteteniendoencuentaquevariasespeciesdeestafamiliason patógenasparahumanos,comoeselcasodeV.choleraeconsideradalaespecie patógenamásimportanteyresponsabledelcólera(enfermedadendémicaen muchasáreasdelmundo)(O’Sheaetal.,2004)yV.vulnificusresponsablede distintaspatologíasdependiendodelarutadeentradaalhospedadorydela existenciadefactoresderiesgorelacionadosprincipalmenteconelestado inmunológicodelpaciente(enfermedadespreexistentes,diabetesocirrosisentre otras)(StromyParanjpye,2000;JonesyOliver,2009). Enlatabla2seresumenlascaracterísticasquediferencianlafamiliaVibrionaceae deotrasfamiliasestrechamenterelacionadas(Farmer3rd,2006). Tabla2.CaracterísticasdelasfamiliasEnterobacteriaceae,Vibrionaceae,yPseudomonadaceae (adaptadodeFarmer3rd,2006) CaracterísticasaPropiedadesdelasfamiliasb EnterobacteriaceaeVibrionaceaePseudomonadaceae GéneroTipoEscherichiaVibrioPseudomonas MetabolismodelaD‐glucosaFermentativoFermentativoOxidativo Morfologíacelular Bacilosrectos+a(‐)+ Baciloscurvados‐(+)‐ Localizacióndelflagelo(s) PeriféricosPolarcPolar Crecimientoenaerobiosis+++ Crecimientoenanaerobiosis++‐ PruebadelaOxidasa‐++ Bioluminiscencia‐v‐ RequerimientodeNa+ ‐ (+)‐ InhibiciónporvibriostaticoO129‐ +‐ aLascaracterísticasexpuestassontípicasdelosgénerosyespeciesdecadafamilia,perohayalgunasexcepciones. bSímbolos:+,lamayoríadeespeciespositivas;(+),muchasespeciespositivas;v,variaciónentreespecies,algunasdeellas positivas;(‐),muchasespeciesnegativas;‐,lamayoríadeespeciesnegativas. cAlgunasespeciesdelgéneroVibriotienenunúnicoflagelopolarenmediolíquido,ysinembargosintetizanflagelos periféricoscuándocrecenenunmediosólido 4.2.1.1.CaracterísticasdelgéneroVibrio ElgéneroVibriojuntoconelgéneroPhotobacterium(ambosdelafamilia Vibrionaceae)sonlosgénerosmásantiguos,descritosenelsigloXIX.
10 RevisiónBibliográfica Concretamente,elgéneroVibriofueacuñadoporPacinien1854durantesus estudiossobreelcólera(Farmer3rdeHickman‐Brenner,2006). LasbacteriaspertenecientesalgéneroVibriosonubicuasdelmedioacuático, tantomarinocomodeaguadulce,ytambiéndezonasdeestuario, encontrándoseenunampliorangodenichosecológicos,libresoasociadasal plancton,alasbiopelículas,alasconchasdequitinadeloscopépodosoaotros hospedadores.Deestaformaconstituyenlamicrobiotadominanteenel estómagodepeces,moluscos,ycamarones,jugandounimportantepapelenla digestiónynutrición(Baumannetal.1984),oenasociacionessimbióticascon órganosytejidosdedeterminadoshospedadores(Nealsonetal.,1970;Fuqua etal.,1994;NyholmyMcFall‐Ngai,2004). Sinembargo,aunquelasespeciesdelgéneroVibriorepresentanunporcentaje elevado(>10%)delasbacteriascultivablesenambientesmarinosyde estuarios(Thompsonetal.,2004),correspondenamenosdel1%sobreeltotal delbacterioplacton(ThompsonyPolz,2006). EnlaedicióndelBergey’sManualofDeterminativeBacteriologyde1974 (BuchananyGibbons,1974)ladefinicióndelgéneroVibrioincluíael resultadopositivoendospruebas,oxidasayreduccióndenitratoanitrito (salesdeamoniocomofuentedenitrógeno).Vibrioaerogenes,V.gazogenes yV.metschnikovii,descubiertasposteriormente,nocumplenestos requisitos.Laprimeraesoxidasanegativa,mientrasquelasdosúltimasson negativasparalasdospruebas(Farmer3rdeHickman‐Brenner,2006;Shiehet al.,2000). LasespeciesdelgéneroVibriopresentanunamorfologíabacilarrectao curvada,sonGram‐negativasymidenentre0,5‐0,8µmdediámetroy1,4‐2,6µm delargo(McLaughlin,1995;Farmer3rdetal.,2005).Cuandocrecenen condicionesdelaboratorio,frecuentementereviertensumorfologíaabacilos rectos(Atlas,1997).Losvibriosnoformanesporasomicroquistes,sonaerobios oanaerobiosfacultativosycrecenóptimamenteatemperaturasentre20‐30ºC (McLaughlin,1995).Además,algunosdeellospuedencrecerentre4‐40ºC,como eselcasodeV.azureus,V.hispanicus,V.neonatus,V.neptunius,V.nereis, V.sagamiensisyV.rotiferianus(Gomez‐Giletal.,2003;Yoshizawaetal.,2009, 2010).Engeneral,surequerimientoenNa+estáentreel1yel3,5%deNaCl,con unrangoentre0y12%,loquedeterminaqueparasuaislamiento,todaslas especies,exceptoV.choleraeyV.mimicus,requierenunsuplementodeNaClen elmedio(KaysneryDePaola,2004;Farmer3rdetal.,2005). Lamayoríadelosvibriosestándotadasdeunflagelopolarquelespermite tenerunaelevadamovilidadenmedioacuoso.Sinembargo,existen excepcionesdeespeciesinmóvilescomoV.breoganii,V.comitans,V.ezurae,
11 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial V.gallicus,V.halioticoli,V.inusitatus,V.neonatus,V.rarusyV.superstes (Sawabeetal.,2004,2007;Beaz‐Hidalgoetal.,2009),yexcepcionesde especiescondosflagelos,comoeselcasodeV.aerogenes(Shiehetal.,2000). Además,algunasdelasbacteriasdeestegénerotienenlacapacidadde moversesobresustratossólidososemisólidosmediantenumerososflagelos lateralesconmenorlongitudqueelflagelopolar,movilidadqueseconoce comoswarming(ShinodayOkamoto,1977;BaumannySchubert,1984). Alolargodeltiemposehanidoobservandootrasexcepciones,comola produccióndegasalfermentarlaglucosa(fuenteprincipaldecarbonoy energía)porV.aerogenes,V.furnissii,V.gazogenesyV.mytili(Hickman‐ Brenneretal.,1984;Pujalteetal.,1993);lautilizacióndelinositolpor V.aerogenes(Shiehetal.,2000),olaproduccióndeunpigmentoanaranjado porV.gazogenes,entreotras(Harwood,1978;Baumannetal.,1984). Portodoello,lasespeciesdelgéneroVibriotienencaracterísticascomunesanivel degénero,pero,tambiéntienenunaseriedecaracterísticasquelasdiferencialas unasdelasotrasaniveldeespecie(Farmer3rdyHickman‐Brenner,2006). 4.2.2.Taxonomía Enlasúltimasdécadas,lataxonomíadelafamiliaVibrionaceaehaevolucionadoy cambiadoengranmedida. LaprimeraedicióndelBergey’sManualofSystematicbacteriology(Baumanny Schubert,1984)incluíacuatrogénerospertenecientesalafamiliaVibrionaceae: géneroAeromonas(descritoporprimeravezen1936),Photobacterium(1899), Plesiomonas(1962)yVibrio(1954).Enlaactualidad,segúnTheListofProkaryotic NameswithStandinginNomenclature(LPSN,2011)revisadaendiciembrede2011, yelInternationalCommitteeonSystematicsofProkaryote(ICSP,2010),lafamilia Vibrionaceaeincluyeochogéneros:Aliivibrio(Urbanczyketal.,2007), Catenococcus,Enterovibrio(Thompsonetal.,2002),Grimontia(Thompsonetal., 2003),Listonella,Photobacterium(BaumannyBaumann,1984),Salinivibrio (Melladoetal.,1996)yVibrio(BaumannySchubert,1984). Además,dentrodeestosgénerosy,enconcreto,enelgéneroVibrio,el incrementoenelnúmerodeespecieshasidosorprendente,ydebidoengran partealmayorpoderdiscriminatoriodelasnuevastécnicasmolecularesque incluyenlasecuenciacióndegenesribosomales(codificación5SrRNA,23Sy16S), lahibridacióndeDNA/DNAylasecuenciacióndeunoomásgeneshousekeeping (secuenciasmultilocusoMLST)(Kita‐Tsukamotoetal.,1993;Maidenetal.,1998; Stackebrandtetal.,2002).
12 RevisiónBibliográfica Así,elnúmerodeespeciesdelcitadogéneroaumentóde20en1980,a47en 2002(Euzéby,1997),a63en2004(Tabla3,Thompsonetal.,2004)yamásde100 especiesendiciembrede2011(LPSN,2011). Tabla3.Listadodeespeciesdevibrios(Thompsonetal.,2004).
13 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 4.2.3.Patogenicidad 4.2.3.1.Infeccionesgastrointestinalesyextraintestinalesenhumanos Enlaactualidadseconocenmásde250enfermedadesquesontransmitidasa travésdelconsumodealimentosyquepuedenestarcausadasporvirus, bacterias,parásitos,toxinasymetales(Meadetal.,1999).Lossíntomas puedenvariardesdegastroenteritisligerasaprocesosletales,pasandopor dañosneurológicos,hepáticosyrenales.LosCentrosparaelControly PrevencióndeEnfermedadesdeEstadosUnidos(CDC,porsussiglaseninglés) estimanquecadaañoaproximadamente1decada6estadounidenses(es decir,48millonesdepersonas)seenferman,128.000sonhospitalizadosy 3.000muerendeenfermedadestransmitidasporlosalimentosyquedelos31 patógenosqueseconocen,transmitidosporlosmismos,Salmonellaspp.(no tifoidea),Toxoplasmagondii,Listeriamonocytogenesynoroviruscausanla mayoríadelasmuertes(CDC,2011;Scallanetal.,2011a).Además,existen enfermedadestransmitidasporlosalimentoscausadasporagentes desconocidos(Tauxe,2002;Scallanetal.,2011b),ybrotesdeinfeccionesque aumentanporelincrementodelconsumodedeterminadosalimentos (consumodebivalvos)(Potasmanetal.,2002). NotodaslasespeciespertenecientesalgéneroVibrioseencuentranasociadas coninfeccionesdeltractogastrointestinal,oenmenormedidaconpatologías extraintestinales.Dehecho,enlaactualidad,sólodiezsonconsideradas patógenasparaloshumanos:V.alginolyticus,V.cholerae(serogruposO1y non‐O1),V.cincinnatiensis,V.fluvialis,V.furnissii,V.harveyi,V.metshnikovii, V.mimicus,V.parahaemolyticus,yV.vulnificus(Tabla4)(Hickman‐Brenneret al.,1984;Hansenetal.,1993;HowardyBennett,1993;SuyLiu,2007;Turiño‐ Luqueetal.,2007;Wilkinsetal.,2008;Reillyetal.,2011;LPSN,2012). Deellas,V.choleraeO1,V.parahaemolyticus,yV.vulnificusyenmenormedida V.fluvialis,V.furnissii,V.mimicus,sonconsideradaslasmásimportantescomo agentesetiológicosdeprocesospatológicosenhumanos,comogastroenteritis, infeccionesdeheridasysepticemia(Danielsetal.,2000;Hoetal.,2010;Baker‐ Austinetal.,2010).Enestecontexto,V.cholerae(Pollitzeretal.,1959), V.parahaemolytocus(Fujinoetal.,1974),V.fluvialis(Huqetal.,1980)y V.mimicus(Davisetal.,1981)estánmayoritariamenteimplicadaseninfecciones gastrointestinates(casosdediarrea),mientrasqueV.vulnificus(Blakeetal., 1980),V.alginolyticus(Blakeetal.,1979)yV.metschnikovii(Leeetal.,1978) estánrelacionadosconinfeccionesdeheridasysepticemia,siendoV.vulnificus laespeciehalofílicaconunpotencialvirulentomayor(Roigetal.,2010). Además,tambiénsehanpublicadocasosdeinfeccionesdetejidosblandos,
14 RevisiónBibliográfica abscesos,peritonitis,otitisyconjuntivitiscausadasporvibriosnocoléricos (Penlandetal.,2000). Tabla4.Patologíascausadasenhumanosporinfeccionesconvibrios(adaptado deWest,1989;OliveryKaper,1997;DanielsyShafaine,2000) EspeciePatología GastroenteritisInfeccióndeheridasSepticemiaprimaria V.alginolyticus+++(+) V.choleraenon‐O1++(+)+ V.choleraeO1/O139+++ND V.cincinnatiensis(+)(+)(+) V.fluvialis++++ V.furnissii++(+)(+) V.harveyiND(+)(+) V.metshnikovii+(+)(+) V.mimicus++(+)(+) V.parahaemolyticus++(+)+ V.vulnificus+++++ ++:Infeccióndescritaenaltonúmerodecasos.+:Infeccióndescritaenunnúmerobajodecasos. (+):Infecciónpocohabitual.ND:Infecciónnodescrita. OtrasespeciesdelgéneroVibrioqueantesestabandentrodeestegrupode especiespatógenasparahumanoshansidoreclasificadasdentrodeotros géneros.Porejemplo,V.hollisaehasidoreclasificadadentrodelgénero Grimontia(Grimontiahollisae)(Thompsonetal.,2003;LPSN,2012),y V.damselaecomoPhotobacteriumdamselaecorreg.(Loveetal.,1981)Smithet al.1991comb.nov.quehastaelaño2000nofueformalmentepropuesto (fechadepublicacióndelanormamodificada61,Int.J.SystEvolMicrobiol. 2000,50,página2239,columna2)dandolugaraconfusiones(Holmesy Farmer3rd,2009).YV.carchariae(Grimesetal.,1985)seráelsinónimo posteriordeV.harveyi(JohnsonyShunkIV,1936)Baumannetal.,1981,comb. nov.(Pedersenetal.,1998). Lagastroenteritis,asociadaalconsumodemariscosypescadoscrudosopoco cocinados,sedescribecomounprocesocuyosprincipalessignosclínicosson diarrea,vómitosycalambresabdominales.Normalmentenoserequiere tratamientoantibióticonihospitalizacióny,enalgunoscasos,elperíodode incubaciónylasmanifestacionesclínicassonsimilareseindistinguiblesdelas ocasionadasporotrosenteropatógenos.Porotraparte,lasinfeccionesde heridas(cortes,rasguños,etc.)yapreexistentesolasproducidaspor actividadesacuáticasomanejodeanimalesy/ocomidadeorigenacuático,en ocasionesrequierenasistenciasanitaria.Además,enelcasodequelas bacteriaslleguenainvadireltorrentesanguíneopuedendesencadenar
21 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial electrones(Zimmermannetal.,1978;DufouryColon,1992)ymantenimientodela integridadcelularmediantelaexclusióndefluorocromos(Boulosetal.,1999). Todosestosmétodosdemuestranquelascélulasnocultivablessonviablesy metabólicamenteactivas(Manafietal.,1991;ColwellyHuq,1994). Enconsecuencia,estascélulaspodríanreanudarelcrecimientoactivo(resucitar) cuandolascondicionesquehanprovocadoelestadoVBNCrevierten(Nilssonet al.,1991;WolfyOliver,1992;Oliveretal.,1995;WhitesidesyOliver,1997).Sin embargo,losresultadosobtenidossoncontradictoriosyhayautoresqueafirman queestaaparente“resucitación”traslaadicióndenutrientessedebeal crecimientodeunpequeñonúmerodecélulascultivables(presentesentodo momento)ynoalaactivaciónrealdelascélulaslatentes(Raveletal,1995; Bogosianetal.,1998;BareryHarwood,1999;Oliver,2005). Enelcasodelosvibriospatógenos,sehaevaluadoelimpactoquelaentradaen elestadoVBNCencondicionesadversaspodríatenerenSaludPública.Baffoney colaboradores(2003)encontraronquelascélulasVBNCdelascepasde V.alginolyticus,V.parahaemolyticusdeorigenambientalyV.parahaemolyticus ATCC43996,inoculadasporvíaintragástricaaratonesalbinos(cepaBALB/c), conservabansucapacidadparaexpresarlasproteínasasociadasconla patogenicidad,aunquetalexpresiónpodíasertransitoriay/oimpredecible. 4.3.4.Factoresdevirulencia Antiguamente,lasespeciesdeV.parahaemolyticusseclasificabansegúnel serotipopero,enlaactualidad,seclasificanenbaseasupotencialde patogenicidadporlapresenciadediversosfactoresdevirulencia,incluyendolos productosdelosgenestdhytrh,ylossistemasdesecrecióndetipoIII (Nishibuchietal.,1992;NishibuchiyKaper,1995;Okudaetal.,1997a;Shimohatay Takahashi,2010;Akedaetal.,2011;Shinoda,2011).Acontinuaciónsedescriben algunosdelosfactoresdevirulenciamásestudiados,aunqueelnúmerototalde mecanismosdepatogénesisdeV.parahaemolyticussiguesinconocerse. Lahemolisinadirectatermoestable(TDH)eslaresponsabledeproducirlabeta‐ hemólisisdeloseritrocitoshumanosenagarWagatsuma(7%deNaCl,manitoly sangrehumanaodeconejofresca)incubadoa35‐37°Cdurante24h.Aesta hemólisisselaconoceconelnombredefenómenodeKanagawa(KP)(Sakazaki etal.,1968;Miyamotoetal.,1969;Takeda,1982;Nishibuchietal.,1985).Seha demostradoquelaTDHtieneactividadhemolítica,enterotóxica,cardiotóxicay citotóxica(Shiraietal.,1990;Nishibuchietal.,1992;HondaeIida,1993).Existe unaclaraasociaciónentreresultadoKP+ypotencialdelacepaparacausar gastroenteritis(Shiraietal.,1990).Así,másdel90%deaisladosclínicosde individuoscongastroenteritissonKP+ymenosdel1%delosaisladosambientales
22 RevisiónBibliográfica sonKP+(ThompsonyVanderzant,1976c;Josephetal.,1982).Esmás,enun estudiorealizadoconvoluntarioshumanos,lascepasKP+produjerondiarreas, mientrasquelasKP‐nolohicieron,inclusocondosisde109bacterias/individuo. EnlaactualidadsesabequelatoxinaTDHestácodificadaporelgentdh,delcual existenvariantesdesecuenciaconocida,conunorigencomúnyun97,2%de similitud(NishibuchiyKaper,1990;Yohetal.,1991). Sehadescritootratoxinadenominadahemolisinarelacionadaconlahemolisina directatermoestable(TRH)quetambiénestáasociadaconlapatogenicidad (Shiraietal.,1990).TRHestácodificadaporelgentrh,delcualtambiénhay descritasdosvariantes,trh1ytrh2,genéticamenterelacionadasentresí(84% identidad)yconelgentdh,conelquepresentanun68,6%desimilitud(Kishishita etal.,1992).Además,aunqueV.parahaemolyticusengeneralnoproduceureasa, losaisladosclínicosquelaproducentambiénposeenelgentrh(Abbottetal., 1989;Suthienkuletal.,1995;Osawaetal.,1996;Okudaetal.,1997a),loque implicaunvinculogenéticoentreelgendelaureasa(ure)yelgentrhenel cromosoma(Iidaetal.,1997). TodaslascepasaisladasdeV.parahaemolyticusasociadasaenfermedades gastrointestinalessonTDH+y/oTRH+(Hondaetal.,1987;Bejetal.,1999).Se postulaquelaproporcióndeV.parahaemolyticuspotencialmentepatógeno aisladosconrespectoaltotaldelaespecieenambientesacuáticosyalimentos deorigenmarinoesmuybaja(Wongetal.,2000). LasecuenciacióndelgenomadelacepaRIMD2210633,queesKP+yperteneceal serotipopandémicoO3:K6,hareveladoqueéstecodificaparadosSistemasde SecreciónTipoIII(T3SS)(Makinoetal.,2003).Elprimeroseencuentraenel cromosoma1(T3SS1)yessimilar,tantoenestructuracomoenorganización,al deYersiniasp.LosgenesparaT3SS1estánpresentesentodoslosgenomas analizadosdeV.parahaemolyticus,independientementedesuorigenclínicoo ambiental.Elsegundoconjuntodegenesseencuentraenelcromosoma2 (T3SS2),dentrodeunaisladepatogenicidaddeaproximadamente~80kbque, ademásllevalasdoscopiasdelgentdh.T3SS2noparecesersimilaraldeninguna otrabacteria,exceptoV.choleraeno‐O1/no‐O139T3SS(Dziejmanetal.,2005). Ambossistemasdesecreción,T3SS1yT3SS2sonaparentementefuncionales (Parketal.,2004b),ypareceserqueelSistemaT3SS2seríaexclusivodelascepas KP+(Makinoetal.,2003).Encualquiercaso,elpapeldeterminantedeTDHyel SistemaT3SSenlapatogénesisdeV.parahaemolyticus(citotoxicidad, enterotoxicidadysepticemia)estásiendoestudiado.Hiyoshiycolaboradores (2010)demostraronqueenSistemaT3SS1eselprincipalresponsabledela actividadcitotoxicidadenunmodelodeinfecciónmurina.
23 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Estossistemaspodríandesempeñarunpapelrelevanteenlamanifestaciónclínica deinfeccionesporV.parahaemolyticus,comoocurreconShigellaspp.,Salmonella spp.yEscherichiacolienteropatógena,cuyosistemaT3SSestáinvolucradoenla invasióndelascélulasepitelialesintestinales(Makinoetal.,2003).Enconcordancia conestahipótesis,estosgenesnoseencuentranenelgenomadeotrosvibriosno invasivoscomoV.choleraeO1(Heidelbergetal.,2000),V.vulnificus(Chenetal., 2003)yV.fischeri(Rubyetal.,2005).Además,losgenomasdeV.choleraenon‐ O1/non‐O139(Dziejmanetal.,2005)yV.harveyi(HenkeyBassler,2004),queson débilmenteinvasivos,contienenunsoloconjuntodegenesdeT3SS. Meadorycolaboradores(2007)encontraronexcepcionesalacorrelaciónentre presenciadegenesparaT3SS2yKP+(Makinoetal.,2003;Parketal.,2004b)y describieroncepastdh‐negativasytrh‐negativasqueeranpositivasparalos genesquecodificanT3SS2+y,alcontrario,cepasKP+,queeranT3SS2‐negativas. LaidentificaciónenelestudiodeMeadorycolaboradores(2007)dedoscepas clínicashumanasT3SS2+,tdh‐ytrh‐refuerzaaúnmáselargumentodequeT3SS2 deVibrioesunfactordevirulenciaquecontribuyealainfecciónyel desencadenamientodelaenfermedadenhumanos(Dziejmanetal.,2005,Parket al.,2004a;Parketal.,2004b).Así,aunqueelgrupodegenesT3SS2noselimitaa losmiembrosdelgrupopandémico,laadquisicióndelaT3SS2 (y,potencialmente,laisladepatogenidadde~80kb)enloquerespectaalos V.parahaemolyticuspotencialmentepatógenos,esmotivodepreocupacióny puedenrequerirunseguimientorutinariopararelacionarconmayorexactitudla presenciadeestosfactoresdevirulenciaconeltipodeinfección,lagravedadde enfermedad,ylanecesidaddehospitalización(Yuetal.,2006). Finalmente,sehandescritootrosfactoresdevirulenciaenV.parahaemolyticus relacionadosconlacapacidaddecausarlaenfermedad,queson:factoresde adherencia,colonizaciónydeinvasióncelular;piliyhemaglutininas(mannose sensitivehemagglutinin‐MSHA),entreotros(Hackneyetal.,1980;Hondaetal., 1988;NakasoneeIwanaga,1990;Nagayamaetal.,1995). 4.3.5.Manifestacionesclínicas Vibrioparahaemolyticusesunabacteriacapazdecausargastroenteritis, infeccionesdeheridase,incluso,septicemiasenhumanos(MorrisyBlack,1985; HondaeIida,1993;HladyyKlontz,1996).Lasmanifestacionesdelaenfermedad causadaporV.parahaemolyticusdependendelvehículodetransmisióndela bacteria.Normalmente,lainfecciónsemanifiestaclínicamentecomo gastroenteritisy,raravez,comounasepticemiaprimaria.Todoelmundoes susceptiblealagastroenteritisporV.parahaemolyticus,mientrasquelos individuosconenfermedadescrónicassubyacentessonmássusceptiblesala septicemia,lacualcursadeformagraveypuedellegarasermortal.
24 RevisiónBibliográfica Dehecho,V.parahaemolyticushasidolacausamásfrecuentementenotificada asociadaaintoxicacionesalimentariasenAsiayEE.UU.,dondeseestimaque 3.600casosdevibriosisportransmisiónalimentariaocurrenanualmente.Los brotesdeinfeccionesalimentariascausadosporV.parahaemolyticussehan relacionadoconelconsumopescadoymariscocrudooescasamentecocinados (Danielsetal.,2000),oquehayansufridounacontaminacióncruzadadespuésde lacocción.TambiénsehannotificadobrotesenCanadá,ÁfricayelsurdeEuropa, aunquepuedenpresentarsecasosimportadosencualquierlugar.Latransmisión personaapersonanosehaobservadoylatasademortalidadpor V.parahaemolyticusesmuybaja. Experimentosrealizadosenlosaños50y70convoluntarioshumanos establecieronqueladosismínimadeinfecciónporV.parahaemolyticusestaba entre105‐108ufcporml(Takikawa,1958;AisoyFujiwara,1963;SanyalySen, 1974),aunquelagravedaddependerátantodelacepabacterianacomodel hospedador.Enestecaso,diferentesinvestigacioneshancomprobadoque mujeresembarazadasypacientesconenfermedadeshepáticaspreexistentes (cirrosis,hepatitiscrónica,historialalcohólico,etc.)yenfermedadescrónicas (linfomas,tuberculosispulmonar,artritisreumatoide,úlceraduodenal,y diabetesmellitus,entreotras)tienenmayorriesgodeenfermary,además,los individuosinmunocomprometidostienenunamayorprobabilidaddeverse afectadosporunasepticemiaprimaria(Blakeetal.,1979). Comoyasecomentóanteriormentenoexisteasociaciónentreserotiposy enfermedad,dadoquetodosellospuedencausargastroenteritis(Nairy Hormazábal,2005).Sinembargo,losbrotesinfecciososquesehanpresentadoa nivelmundialenlosúltimosañossehanatribuidoalaaparicióndetresserotiposcon unimportantepotencialpandémico:O3:K6,O4:K68yO1:Katípico(KUT).Lascepas O4:K68yO1:KUTseoriginaron,muyprobablemente,apartirdeunclondelacepa O3:K6pandémica(Okudaetal.,1997b).Estosserotipospresentanmayoradherencia ycitotoxicidadencultivosdetejidos,loquecontribuiríaaincrementarsupotencial patogénico.Estostresserotiposhansidoidentificadosenvariaslocalizaciones, tantoenpacientescomoenelmedioambiente,porloqueseconsideraquesu distribuciónesmundial(Okudaetal.,1997b,Lozano‐Leónetal.,2003). Enlospacientescongastroenteritisseobservaunainflamacióndelamembrana internadelintestino.Labacteriasóloseaísladelashecesdeindividuosenfermos (StromyParanjpye,2000).Lagastroenteritispuedenoserdeclarada,yaquela enfermedadnosuelesermortalylossíntomasnosonlosuficientementegraves paraprecisaratenciónmédica. Estagastroenteritisesdegravedadmediaamoderadayesautolimitante.Tieneun periododeincubaciónde4a96h(conunamediade15h)yunaduraciónmediade
25 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 3días(MorrisyBlack,1985;NairyHormazábal,2005).Lossíntomasmás comúnmenteexperimentadossonnauseas,diarreaabundante,vómitos, calambresabdominales,dolordecabezayextremadebilidad.Laapariciónde fiebreyescalofríosesmenosfrecuente(Blakeetal.,1980;MorrisyBlack,1985; Bryan,1986).Enlasformasgravessepresentatenesmoylasdeposicionesson acuosasconmocoysangre.Eltratamientoincluyeaportehidroelectrolíticopor víaoral(solucionesderehidratación)oparenteralasícomoantibiótico (doxiciclinaociprofloxacina). EnunestudiorealizadoporHladyyKlontz(1996)seasociarondiversasespecies deVibrioconelsíndromedelaenfermedadgastrointestinal,ydetodasellas, V.parahaemolyticusfuelabacteriamásfrecuentementeasociadaconla gastroenteritis.Dehecho,lagastroenteritisproducidaportoxiinfección alimentariapormariscostransmitidaporV.parahaemolyticuseslacausaprincipal debrotesdeenfermedadestransmitidasporlosalimentosenTaiwanyJapón (Panetal.,1997).Porejemplo,Chiouycolaboradores(2000)informarondeque 542de850brotesenTaiwanentre1995y1999fueroncausadospor V.parahaemolyticus,con40serotiposdiferentesidentificados(principalmente, O3:K6).Suycolaboradores(2005a)publicaronqueentre1995y2001,hubo2.057 casosdeV.parahaemolyticusenelnortedeTaiwan,lamayoría(99,4%)delas cepasdeV.parahaemolyticuspudieronseridentificadasporKserotipos,conun 55,2%querepresentaelserovarK6.Estosdatosnosdanunaideadela importanteimplicacióndeestabacteriaenproblemasdeSaludPública. Finalmente,laentradaporvíadigestivanoeslaúnicavíadeinfección,yaque otraspresentacionesclínicas,comolainfeccióndeheridasuoídos,seproducen alentrarencontactolassuperficiescorporalesconelaguademarosuperficies contaminadasporelorganismo(Blakeetal.,1980). 4.3.6.Epidemiología Vibrioparahaemolyticustienedistribuciónmundialpresentandomúltiples reservorios:sedimentosmarinos,plancton,peces,moluscosycrustáceos.La concentracióndeV.parahaemolyticusvaríasegúnlatemperaturadelaguayla salinidad,entreotrosfactores,demaneraquelasmayoresconcentracionesse registranenveranoyenaguasdesalinidadintermedia.Latransmisiónseproduce fundamentalmenteporingestióndeproductosmarinoscontaminadoscrudoso insuficientementecocinados,ylasusceptibilidadenhumanosesuniversal. DesdelaidentificacióndeV.parahaemolyticusen1953sehandescritonumerosos brotesinfecciososasociadosaestabacteria.Setratadeunpatógenocausantede unaaltaproporcióndeenfermedadesdetransmisiónalimentariaenpaísesAsiáticos comoChina(31,1%entre1991y2001),Japón(20‐30%entre1981y1993)yTaiwan (63,8%enelperíodo1996‐1999conlasserovariedadesO5:K5,O4:K8,O3:K29)(Chiou
26 RevisiónBibliográfica etal.,2000;Nairetal.,2007).Vibrioparahaemolyticusesreconocidocomolamayor causadegastroenteritisasociadaconelconsumodemariscoenEE.UU.,conmásde 40brotesnotificadosentre1973y1998(Barker,1974;HladyyKlontz,1996;CDC, 1998,1999;Danielsetal.,2000;DePaolaetal.,2000).Además,nohayqueolvidarel broteasociadoconelconsumodeostrascrudasenAlaska(McLaughlinetal.,2005). EnEuropa,sehanpublicadobrotesesporádicosocasionadospor V.parahaemolyticusenalgunospaísescomoEspaña,Francia(Lemoineetal.,1999; Robert‐Pillotetal.,2004;Hervio‐Heathetal.,2005)e,incluso,enDinamarcadonde fuerondescritossietecasosdeinfeccióncutáneaenel2004(Andersen,2006).En EspañaesteorganismohasidoaisladodepacientescongastroenteritisenBarcelona (1986,1987,y1999)(Moleroetal.,1989),Zaragoza(1993),Madrid(1998y2000)yen Galicia,dondeelsistemasanitario,entre1997y2000,contabilizó84casosde infecciónporV.parahaemolyticus,siendoelbrotemásimportanteelqueseprodujo en1999con64casosyasociadoconelconsumodeostras(Lozano‐Leónetal., 2003).Además,enGaliciatambiénseprodujounbroteenel2004,con80casos,en unrestauranteentrelosinvitadosaunaboda(Martinez‐Urtazaetal.,2005). Estosestudiosindicanqueelriesgodeinfeccionescausadaspor V.parahaemolyticusenEuropaesbajocomparadoconeldeAméricaoAsia(Nair etal.,2007).Sinembargo,esteriesgosepodríahabersubestimado,debidoa queV.parahaemolyticusnoestáincluidoenlosactualesprogramaseuropeosde vigilancia,comoelEuropeanNetworkforEpidemiologicalSurveillanceand ControlofCommunicableDiseases(Roqueetal.,2009).Además, V.parahaemolyticuspodríallegaraserunproblemaemergenteenelámbitodela SaludPúblicaeuropeaalaumentarelconsumodealimentoscrudosopoco cocinadosincluidomarisco,sashimi(filetedepescadocrudo)ysushi(bolade arrozavinagradoconfiletedepescadocrudo),entreotros.LaFAO(2011)publicó queenJapónelsashimiyelsushisonlosresponsablesdel26%ydel23%delos brotesasociadosaV. parahaemolyticus. 4.3.7.Incidenciadeinfecciónenhumanos Laprevalenciadeunaenfermedadeslaproporcióndecasosquesedanenuna determinadapoblaciónylaincidenciaelnúmerodecasosnuevosqueaparecen enesapoblaciónduranteunperíododetiempodeterminado.Porlotanto,alser lagastroenteritiscausadaporV.parahaemolyticusunaenfermedadde prevalenciasumamentebaja,yaquesepresentacomobrotesesporádicos,muy localizadosydeduraciónlimitada,sólotienesentidocaracterizarsuincidencia. Enlaactualidad,noesposibledarcifrasrealessobrelaincidenciadelas enfermedadescausadasporespeciesdeVibrioentodoelmundo,yaqueincluso cuandoexistenprogramasdevigilancia,larecopilacióndeinformaciónes incompleta.EnlosEE.UU.seestimaqueseproducen8.000casosde
27 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial enfermedadescausadasporvibrioscadaaño(Meadetal.,1999).Además, concurrencircunstanciaseconómicasysocialesquesesganladeclaraciónde casosdeenfermedaddedeterminadasespeciesbacterianas,comoeselcasode V.cholerae(WHO,2001;Colwelletal.,2003). Desenclosycolaboradores(1991)utilizaroneldiseñodeunestudiodecohortes paraestimarlaincidenciaanualdetodaslasinfeccionescausadasporVibrio,y estimaronqueerade95,4pormillónparaconsumidoresdeostrascrudascon enfermedadhepática,9,2pormillónparaconsumidoresdeostrascrudassin enfermedadhepática,y2,2pormillónparalosquenoconsumenostrascrudas. Otrodatoepidemiológicoimportanteeslaletalidadquevaría,segúnla presentaciónclínicadelaenfermedad,desdeun1%paralagastroenteritis,un5% parainfeccióndeheridasyun44%parasepticemia.Unaelevadaproporciónde loscasosdeclaradosestáclaramenteasociadaconelconsumodeostrascrudas, elcualfueelorigendelainfecciónporV.parahaemolyticusenel68%deloscasos quecursaroncomogastroenteritisyenel83%deloscasosquesemanifestaron comosepticemiasprimarias(HladyyKlontz,1996). Finalmente,otrofactorimportanteatenerencuentaeslamarcadaestacionalidad delosbrotes,yaqueel91%deloscasosdesepticemiaprimariayel86%delas infeccionesdeheridasaparecieronentreAbrilyOctubre(HladyyKlontz,1996). 4.3.8.Métodosdecultivoparaelaislamientoeidentificación Enlaactualidadnohayningúnmétodoparaladeteccióny/oelrecuentode V.parahaemolyticusqueseaeficazal100%.Elmétodoconvencionalusadoenlos análisisrutinariosdeaislamientoeidentificacióndelosvibriosincluyeun enriquecimientoenunmediolíquido,seguidodesiembraenunmediosólido (Hara‐Kudoetal.,2001).Dosdelosprocedimientosestándarparaladeteccióny aislamientodeV.parahaemolyticusenmoluscoscrudos,recogidosenelManualpara elAnálisisBacteriológico(BAM,porsussiglaseninglés)(KaysneryDePaola,2004) son:latécnicadelnúmeromásprobable(NMP)ylasiembradirectaenmediosde cultivoseguidaporlahibridacióndeDNAdelascolonias(McCarthyetal.,1999, 2000).Esteúltimo,mejoradoporNordstromyDePaola(2003)medianteun enriquecimientopreviodelasmuestras. Lasiembradirectaenmediosdecultivosiguesiendodifícildebidoalagran cantidaddemicrobiotanaturalquetambiénpuedecrecerenestosmedios.Por ello,sehandiseñadodistintosmediosespecíficosquenospermitendiferenciarlos vibriospresentesdeotrasbacterias,comoeselcasodelagartiosulfato‐citrato‐ salesbiliares‐sacarosa(TCBS),omediosselectivosquenospermitanidentificar especiesdeV.parahaemolyticusdeotrasespeciesdelgéneroVibrio,medio
28 RevisiónBibliográfica cromogénicoCHROMagarvibrio(CHROMagar,Francia),quehanresultadoseruna herramientaútilyconeficaciavalidada(Kobayashietal.,1963;Suetal.,2005b). Acontinuaciónseexpondránconmásdetallelosmediosdecultivomás utilizadosenestaTesisDoctoral. 4.3.8.1.AgarTiosulfato‐citrato‐salesbiliares‐sacarosa(TCBS) ElagarTCBSsediseñóparaelaislamientodevibriospatógenos(Kobayashiet al.,1963).Esunmedioaltamenteselectivo,fácildeprepararydeusaryque estádisponiblecomercialmente(McCormacketal.,1974;Nichollsetal.,1976). ElagarTCBSseincubaa37ºC,durante18‐24h.Estemediodistinguelosvibrios nofermentadoresdesacarosa(SNFV)(dondeseincluyeV.parahaemolyticus) delosvibriosfermentadoresdesacarosa(SFV)(dóndeseincluyeV.cholera) (Figura1).Lascoloniasverdesde2‐5mmdediámetroseidentificancomo posiblesV.parahaemolyticus. 4.3.8.2.AgarCHROMagarVibrio ElmediodecultivoselectivoCHROMagarVibrioagaresunmediocromogénico basadoenunindicadordecambiodepHdebidoalafermentacióndela sacarosa.LascoloniasmalvaseidentificancomoposiblesV.parahaemolyticus, mientrasquelascoloniasazulescorrespondenaposiblesV.vulnificus/ V.choleraeylascoloniasincolorascorrespondenaposiblesV.alginolyticus.Este mediopermitediferenciarclaramenteV.parahaemolyticusdeV.vulnificus (Figura2)ambasincapacesdefermentarlasacarosaenTCBS(Hara‐Kudoetal., 2001;Blanco‐Abadetal.,2009). Figura1.ColoniasdevibriosSNFV(verdes)y SFV(amarillas)enTCBSagar Figura2.ColoniasdeV.parahaemolyticus(malva) yV.vulnificus(azul)CHROMagarVibrioagar
29 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 4.3.9.Caracterizaciónfenotípicaeidentificaciónbioquímica Lamorfologíadelabacteriaseobservaalmicroscopioópticotantoenfresco comotraslatincióndeGram.Laobservaciónenfrescopermite,además, determinarsilacepaesmóviloinmóvil. Enlaactualidadesposiblecaracterizarbioquímicamenteestaespeciebacteriana conmuchafiabilidadutilizandolagaleríamultipruebaAPI20Equeincluye21test bioquímicosminiaturizados(eltestdelaoxidasaserealizarásegúninstrucciones delfabricanteyseráanotadoenlahojaderesultados)yunabasededatos (BioMérieux,Marcyl’Etoile,Francia)(Tabla5).Ademásdelperfilbioquímico generaldeV.parahaemolyticusporperteneceralgéneroVibrioydelaspruebas API20E,V.parahaemolyticussecomplementaconotrascaracterísticas. Deformaresumida,V.parahaemolyticusesanaerobiofacultativo,con metabolismooxidativoyfermentativo,producecatalasayfermentalaglucosa sinproduccióndegas.Ademástieneresultadospositivosparalafermentaciónde manitol,maltosa,trealosa,D‐manosayD‐galactosa,ynegativosparalasacarosa, lactosa,inositol,dulcitol,salicina,rafinosa‐D‐xylosa,celobiosa,alfa‐metil‐D‐ glucosido,eritritol,D‐arabitol,D‐galacturonato.Esureasavariableypuede utilizaretanol,L‐leucinaylaputrescina. Tabla5.PruebasdelossistemasdeidentificaciónAPI20Eparalacaracterización bioquímicadeV.parahaemolyticus.Incubación24ha37±1ºC TestBioquímico%aislados positivos TestBioquímico%aislados positivos Orto‐nitrofenil‐bD‐galactoprianosidasa0Gelatinasa75 Argininadihidrolasa(ADH)0Fermentacióndeglucosa100 Lisinadecarboxilasa(LDC)100Fermentacióndemanitol99 Ornitinadecarboxilasa(ODC)99Fermentacióndeinositol0 Utilizacióndecitrato50Fermentacióndesobitol0 ProduccióndeH2S0Fermentaciónderamnosa1 Ureasa1Fermentacióndesacarosa1 Triptofanodesaminasa(TDA)0Fermentacióndemelibiosa0 Produccióndeindol100Amigdalina12 Voges–Proskauer1Fermentacióndearabinosa50 Lascondicionesdecultivodeestabacteriasonvariablesporsucapacidadde crecerenunampliorangodetemperaturas(inclusoa42ºC),condiferentes concentracionesdeclorurosódico(1‐8%).Algunasdeellas(75‐89,9%)soncapaces decrecerconconcentracionesdeNaClde0,4y0,5%,peronoinferiores. SegúnloscriteriosdelBAM(KaysneryDePaola,2004),V.parahaemolyticuses sensiblealagentebacteriostáticoO/129cuandolaconcentraciónesde150µg, mientrasqueesresistentesilaconcentracióndisminuyea10µg.
30 RevisiónBibliográfica 4.3.10.Métodosmolecularesparaladetecciónytipificación Lastécnicasdedetecciónytipificaciónmoleculardemicroorganismossonmás resolutivasyútilesenestudiosepidemiológicosquelastécnicasfenotípicas clásicas.Estastécnicasjuntoconlastradicionales,basadasenlarecopilaciónde datos(antecedenteshistóricosdeenfermedadenelámbitogeográficoquese deseaestudiar,sintomatologíaclínica,mortalidad,etc.),permitenunestudiomás holísticodelasenfermedades. Lastécnicasdecaracterizaciónmolecularpermitenanalizarladiversidad genéticadelasdiferentescepasdeV.parahaemolyticus,loquepermiterealizar estudiosepidemiológicosmolecularesparadiferenciarlapresenciadecepasde V.parahaemolyticustantolavariantepatogénicacomolavariantenopatogénica enunadeterminadaespeciedemoluscobivalvoolocalizacióngeográfica; establecerlaexistenciadehospedadores‐reservoriosdeV.parahaemolyticusen bivalvos,asícomoenelmedioambienteparadeterminarelpapelquejueganen laenfermedad;yestudiarlarelaciónqueexisteentrediferentescepasde V.parahaemolyticusaisladosdediferentesorígenesgeográficoseuropeos. Además,enlosúltimosañoslastécnicasmolecularesestánevolucionando rápidamenteyperfeccionándose(PCRmultiplexyQuantitativeReal‐TimePCR, entreotras)paramejorarlafiabilidaddiagnóstica,disminuircosteseconómicosy aumentarcapacidaddeprocesado(Blackstoneetal.,2003;Takahashietal.,2005; Raghunathetal.,2008;Jonesetal.,2009;Rosecetal.,2009;Robert‐Pillotetal., 2010).Enrelaciónaesto,Nordstromycolaboradores(2007)desarrollaronun controlinternodeamplificación(IAC,porsussiglaseninglés)paragarantizarla integridaddelaPCRyeliminarlosfalsosnegativos). Acontinuaciónsedescribenbrevementealgunaslastécnicasmolecularesquese hanutilizadoenlapresenteTesisDoctoral. 4.3.10.1.Reacciónencadenadelapolimerasa(PolymeraseChainReaction,PCR) Estatécnicaseempleaenlacaracterizacióneidentificaciónde V.parahaemolyticus,utilizandocebadoresdiseñadosparadistintosgenes diana(Tabla6).Sinembargo,laPCRclásicamuestraalgunaslimitacionesensu aplicacióny,porello,sehandesarrolladotécnicasmásavanzadas. 4.3.10.2.rep‐PCR(Repetitiveelement‐basedPCR) Lastécnicasquegeneranpatronesdefragmentosbasadosenlaamplificación delDNAagrupandiferentesmetodologíasbasadasenlautilizaciónde cebadores,diseñadosapartirdesecuenciasrepetidasderegionesdeDNA conservadasenbacterias(Tyleretal.,1997).Haytresgruposprincipalesde elementosrepetitivos:loselementospalindrómicosextragénicosrepetitivos,
37 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Europea,queestablecelosvaloresaceptablesdecontaminaciónfecalenlas zonasdecríademoluscosbivalvos,contaminaciónfecalqueesprovocadapor lagranconcentracióndepoblaciónexistenteenlaszonascosteras,ydebida tambiénalasprácticasganaderasextensivas.Ladepuracióntambiénseutiliza enEE.UU.,Australia,Japóny,enmenormedida,enNuevaZelanda.Enotros paíseslaaplicacióndeladepuraciónserávoluntaria,oporintereses comercialescontercerospaíses(Tabla9). Tabla9.Métodosdedepuraciónendistintospaísesdelmundo(FAO,2010b) PaísPrincipalesespecies depuradasSistemaDesinfección aguamarina ChinaAlmejasyostrasRecirculación SistemaabiertoUV,ozono EspañaAlmejas,berberechos, mejillonesyostras Recirculación SistemaabiertoCloro FilipinasMejillonesyostrasEstático Sistemaabierto UV,ozono,cloro, PVP‐iodo FranciaAlmejas,berberechos, mejillonesyostras Estático Recirculación Sistemaabierto UV,ozono,cloro, aireación IrlandaMejillonesyostrasRecirculaciónUV,aguadepozo ItaliaAlmejas,chirlasy mejillones Recirculación SistemaabiertoUV,ozono,cloro JapónOstrasyvieiras Estático Recirculación Sistemaabierto UV,ozono,cloro, electrolización MalasiaOstrasRecirculaciónUV MarruecosAlmejas,mejillonesy ostras Estático RecirculaciónUV,cloro PaísesBajosMejillonesyostrasRecirculación SistemaabiertoUV PortugalAlmejas,mejillonesy ostras Estático Recirculación Sistemaabierto UV,cloro ReinoUnidoAlmejas,berberechos, mejillonesyostras Recirculación SistemaabiertoUV LanormativadelaUEespocoprecisaalrespecto,siendoelprincipalrequisito elqueelsistemadedepuraciónpermitaquelosmoluscosreanuden rápidamenteymantengansualimentaciónporfiltración.Elobjetivoesque quedenlimpiosderesiduosfecales,ynovuelvanacontaminarseyse mantenganconvidaencondicionesadecuadasparaelenvasado,el almacenamientoyeltransportequeprecedanasupuestaenelmercado. Además,seestipulaquelosmoluscosbivalvosdebendepurarse continuamenteduranteunperíodosuficienteparacumplirconelestándar
38 RevisiónBibliográfica microbiológicodelproductofinal(E.coli≤230/100gyausenciadeSalmonella en25gdecarneolíquidointervalvar)(ComisiónEuropea,2004b). EnconsecuenciacadaEstadoMiembrodelaUEhaidoespecificandocómo debenrealizarselosprincipiosdedepuraciónyestableciendootroscriterios generalesatravésdelaaplicacióndelalegislaciónenlosprocedimientosde autorizacióneinspecciónnacionales(concretamentemedianteeldesarrollo delReglamento854/2004delaComisiónEuropea,2004b). 4.3.11.3.Técnicasdeconservaciónparalacomercializacióndemoluscosvivosofrescos Elcontroldelasupervivenciadebacteriaspatógenasatravésdeprocesos destinadosacontenerlascaracterísticasdelproductocrudosellevaacabo siguiendounaspremisas:establecercientíficamenteyvalidarunprocesoque reducirálospatógenosaunnivelaceptable;diseñaryoperarlosequiposde procesamientoparaquecadaunidaddelaproductosesometaalmenosal procesomínimoestablecido;yllevaracabounseguimientocontinuodelos parámetroscríticosdelprocesoparaverificarlaconsecucióndelproceso científicamenteestablecido. Estosprocesosestándiseñadosparareducirlosmicroorganismospatógenos específicosanivelesaceptables,manteniendolascualidadesorganolépticas (aspecto,saborytextura)delproductobruto.Sonespecialmenteútilesenel tratamientodelospeligrosasociadosconundeterminadopatógenoenlas materiasprimas,talescomomoluscoscrudos(porejemplo,ostras,almejas, mejillonesyhuevasdevieiras)queestándestinadosparaserconsumidos crudosopocococinados(DePaolaetal.,2009).Algunosdeestosprocesos son:altapresiónhidrostáticadeprocesamiento(HPP),congelaciónrápidade maneraindividual(IQF)ylairradiación. Disminucióndelatemperatura:RefrigeraciónyCongelación Elcontroldelatemperaturaesunodelosfactoresclavedespuésdela recoleccióndelosmoluscosbivalvos,deformaquetemperaturasde10ºCo inferiores,impidenlamultiplicacióndevibriospatógenosaaltosniveles. Porlotantolarefrigeracióneselmétodomáscomúnmenteutilizadopara preservarlacalidadyextenderlavidaútildelosbivalvos(Andrews,2004). LacongelaciónreducelosnivelesdeVibriospp.enmariscoseimpidela multiplicacióndelosmismos(Schwarz,2000;CookyRuple,1992).Este procesocombinadoconelenvasadoalvacíoesunaherramientamuy eficienteusadafrecuentementecomotratamientopost‐cosechaparael controldeV.vulnificusyV.parahaemolyticus(FDA,2009).
39 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Procesosdealtapresiónhidrostática(HPP) Losprocesosdealtapresiónhidrostáticasonconsideradostécnicasde procesadonotérmicoquelogranlainactivacióndemicroorganismosen alimentossinaparentescambiosdesuscaracterísticasorganolépticas (Hite,1899;MañasyPagan,2005;Chenetal.,2006;Groveetal.,2006; Considineetal.,2008;Corboetal.,2009). LaHPPsebasaenlaaplicacióndepresiónhidrostáticaenelrangode 14.500a145.000librasporpulgadacuadrada(100a1.000MPa).Estas presionessoncapacesdeinactivarlospatógenossensiblesalapresión, especialmentelasformasvegetativas.Engeneral,losvibriosson extremadamentesensiblesalapresión,porloquelosprocesoscomerciales utilizanpresionesde275‐300MPa,durante3minparadesinfectarostras. Stylesycolaboradores(1991)demostraronquepresionesporencimade170 MPareducíanenpocosminutoslaspoblacionesdeV.parahaemolyticusen almejaanivelesnodetectables. Sinembargo,haydiferenciasensensibilidadalapresiónhidrostáticaentre especiese,incluso,entrecepasdeunamismaespecie.Así,V.vulnificuses, engeneral,mássensiblequeV.choleraeapresionesporencimade210 MPay,dentrodeV.parahaemolyticus,lascepasdelserotipopandémico O3:K6sonmásresistentesalapresiónhidrostáticaqueotrosserotiposo, incluso,queotrosvibrios(Cook,2003;Velazquezetal.,2005). Laeficaciadeltratamientoconaltaspresionesdependedelaintensidad delapresión,delatemperaturadelproceso,deltiempoquedurela exposicióny,porsupuesto,delmicroorganismoatratar(Hooveretal., 1989),sobretodoteniendoencuentaqueexistenmicroorganismos (denominadosbarodúricos)capacesdesobreviviraaltaspresiones(de50 a202MPa).Apesardequealutilizarestatécnicasehandescritoalgunos efectosnodeseados,enlaactualidadlasaltaspresionessonuna prometedoratécnicaemergente,económicamenteviableparapreservar lacalidadeinactivardeterminadospatógenoscomoV.parahaemolyticus enmoluscosmanteniendolaspropiedadesnutritivasysensoriales (Murchieetal.,2005;TorresyVelázquez,2005;MaySu,2011). Congelaciónrápidademaneraindividual(IQF,IndividualQuickFreezing) IQFimplicaelusodelatecnologíadecongelacióncriogénicaparabajar rápidamentelatemperaturadelproductopordebajode0ºC,dependiendo delascaracterísticasfísicasdelproductoylacapacidaddelIQF. Elusodeesteprocedimientohacequenoseanecesarioningúntipode químicosoconservantesyvaagarantizarqueelproductoconservetodala
40 RevisiónBibliográfica textura,valornutritivoyelsabororiginalunavezquehayasido descongelado,graciasalacristalizaciónqueseproduceensuinterior (cristalespequeños).Además,tienelaventajadequesepudedescongelar lacantidaddeproductodeseada. Esteprocesoproduceunareduccióndelnúmerodeagentespatógenos sensiblesalacongelación,siendoalgunosdeellos(como V.parahaemolyticusyV.vulnificus)mássensiblesqueotros(FDA,2009). Procesosderadiaciónionizante Laaplicaciónderadiacionesionizantes(esdecir,lairradiación)enlos alimentosesunprocesofísiconotérmicoqueseutilizaparaeliminaro reducirelnúmerodebacteriaspatógenas,parásitoseinsectosenlos alimentos,aunquetambiénsepuedeutilizarpararetrasardeterminados procesosfisiológicos(porejemplo,lamaduración)defrutasyverduras.Es unatécnicaquenoproducemuchasbajasenelprocesado. EnEE.UU.seconsideranfuentesaceptablesderadiacionesionizanteslos rayosgammadeunidadesselladasdelosradionucleidosdecobalto‐60 (Jakabietal.,2003)ycesio‐137,electronesgeneradospormáquinascon energíasquenoexcedanlos10millonesdeelectrón‐voltios,ylosrayosX (MahmoudyBurrage,2009)generadospormáquinasconenergíasdehasta 5‐7,5millonesdeelectrón‐voltios,dependiendodelreceptoralimentario. LaFDAhaaprobadoelusoderadiacionesionizantesparaelcontrolde V.parahaemolyticusyV.vulnificusyotrospatógenosenlosmoluscosfrescos ocongelados.Enestoscasosesobligatoriollevaracabocontrolesde irradiaciónenlaelaboraciónymanipulacióndelosalimentos.Además,la irradiacióndemoluscosfrescosycongeladosnopodráexcederdeunadosis absorbidade5,5kiloGrays(kGy)(CodeofFederalRegulations,21CFR179.26). Algunospatógenossonmássensiblesalaradiaciónionizantequeotros,aunque afortunadamentelasbacteriasdelgeneroVibrioseencuentranentrelasmás sensiblesalairradiación,mientrasqueSalmonellaspp.yListeriamonocytogenes sonmásresistentes.Dehecho,dosisde1,0‐1,5kGyenmoluscosbivalvosson efectivasparaeliminarV.parahaemolyticushastanivelesnodetectables(Mallett etal.,1991;Andrewsetal.,2003a;Jakabietal.,2003). Encualquiercasolaeficaciadelprocesoestádeterminadaporlacantidad deradiaciónionizanteabsorbidaporelalimentoque,asuvez,dependede factoresrelacionadosconelpropioirradiador(capacidadenergéticay geometríadelafuente,distanciafuente‐productoycaracterísticasdelhaz) ydefactoresasociadosconelprocesoespecífico(duracióndeltiempode irradiación,temperaturaambientalydelproducto,composiciónydensidad
41 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial delproducto,tamaño,formaycomposicióndelosenvasesyconfiguración delacargadelproductoenelirradiador). Esimportantequetodaslaspartesdelproductorecibanladosisprescrita dentrodeunrangoespecificado,porloqueesnecesariorealizarmapeosde dosimetríaparadocumentarladistribucióndeladosisabsorbidaatravésde unprocesodecargaparaunconjuntoparticulardeparámetrosdelirradiador. Aditivosalimentarios:CompuestosGRAS LassustanciasGRAS(GeneralmenteReconocidascomoSeguras)son aquellascuyousoenlosalimentosesreconocidoporlosexpertoscomo seguro(basándoseensuusoenlosalimentosantesde1958oen publicacionescientíficas). LaFDAtieneunlistadodeaditivospermitidosparaelconsumohumanode tipoGRAS.Algunosdeellos(diacetil(butanediona);lactatosódico;ácido láctico;ehidroxibutilanisol(BHA),entreotros)mejoranlavidaútildelos mariscosalcontrolarlacontaminaciónporVibriospp.(SunyOliver,1994). Éstospuedenserañadidosdirectamentealosalimentosporestardentro delestatusGRAS.Además,algunosdeellos(porejemplo,diacetil combinadoconromero)sonparticularmenteprometedoresparamejorarla calidaddelosmariscosgraciasasuspropiedadesaromatizantesadicionales (GillmanySkonberg,2002). Sehademostradoquelosaditivosquímicosdeorigennaturalcomoel ácidocítricoo,incluso,sustanciasnaturalescomoelzumodelimón(Citrus limonBeurm.f.),delima(Citrusaurantifoliaswingle)osudachi(Citrus sudachiHort.exShirai)tienenactividadantibacterianapudiendocontrolar lascepasdeVibriospp.enpescadoymariscocrudoopocococinado(Mata etal.,1994;deCastilloetal.,2000;Rodriguesetal.,2000;Hasegawaetal., 2002).Estosúltimosposeenconcentracionesdeácidocítricoentre50,8y 52,1mg/mlloquelespermitebasarsuacciónenunareduccióndelpH (Tomotakeetal.,2006),teniendoencuentaqueelpHóptimode crecimientodeV.parahaemolyticusestáentre7,6y8,6(Beuchat,1973). 4.3.11.4.Procesadodemoluscos Enelcasodequenoseaviablelacomercializaciónenvivodelosmoluscos bivalvos,osequierautilizarotraformadeprocesadoqueeliminetodoslos patógenosdeinterésenSaludPública,sepuedenaplicarprocesosde cocciónopasteurización,quegaranticenlainocuidaddeestosalimentos desdeelpuntodevistamicrobiológico,aunquenodestruyanotrostóxicos ycontaminantes(pesticidas,metalespesados...).Yademás,algunas
42 RevisiónBibliográfica técnicasayudanenelprocesadoposteriordelasostras,facilitandoel peladodelasmismas,comoeselcasodelchoquetérmicocomercialque consisteensumergirostrasrefrigeradasencestasdealambre,dentrode tanquesconaguapotablea67ºC,durante5min(dependiendodeltamaño delaostraydelacondición)yenfriamientoposteriordelasmismaspor aspersióndurante1minconaguapotable,antesdelpeladoylavado. Cocción Elcocinadoesuntratamientotérmicoquegeneralmenteserealizaantes dequeelproductosecoloqueenelenvasefinalyseandistribuidos refrigeradosocongelados.Porlogeneral,despuésdelacocción,aestos productosselesconocecomococidosylistosparacomer.Comoejemplos decocidosylistosparaconsumirnosencontramosproductosdelapesca, cangrejo,langosta,carnedecangrejo,camaróncocido,ensaladasde mariscos,sopasdemariscosysalsas,ypescadoahumadoencaliente. Elcocinadoesunamedidasumamenteefectivaparaeliminar V.parahaemolyticus(JohnstonyBrown,2002;FDA,2009). Pasteurización Lapasteurizaciónesuntratamientoqueseaplicaparaeliminarbacterias patógenasresistentesimplicadasenproblemasdeSaludPúblicayquees razonablementeprobablequesepresentenenproductosalimentarios durantesutiempodevidaútil,cuandosealmacenabajocondicionesde abusonormalymoderado.Enelcasodeproductosdelapesca,la pasteurizaciónserealizageneralmentedespuésdequeelproductose coloqueenelenvasefinalherméticamentesellado.Seaplicaalos productosquesedistribuyenyasearefrigeradosocongelados. Ademásdeeliminarlasbacteriaspatógenas,elcocinadoylapasteurización tambiénpuedenreducirconsiderablementeelnúmerodebacteriasde descomposiciónpresentesenelproductodelapesca.Estasbacterias normalmenterestringenelcrecimientodepatógenosatravésdela competencia,deformaquelaeliminacióndelasbacteriasde descomposiciónpermitiríaunrápidocrecimientodelasbacteriaspatógenas derecienteintroducción.Esodebetenerseencuentayaquedeterminadas bacteriaspatógenaspuedenserintroducidasdespuésdelacoccióno pasteurizaciónysuponerunapreocupaciónadicional.Estoesespecialmente ciertoparalapasteurización,debidoaqueelprocesopuedeprolongarla vidaútildelosproductospesqueros,loqueproporcionamástiempoparael crecimientodebacteriaspatógenasylaliberacióndetoxinas.
43 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrio parahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Diversosautoreshandemostradoquelasbajastemperaturasde pasteurización(alrededorde52ºC)durante10minenostrasinoculadascon V.vulnificusyV.parahaemolyticusreducíanlosnivelesdesde105MPN/g hastanivelesnodetectables(CookyRuple,1992;Andrewsetal.,2000).En untrabajoposterior,Andrewsycolaboradores(2003b)demostraronque ostrascontaminadasconV.parahaemolyticusO3:K6(104‐106ufc/gdeostra) trasuntratamientopasteurización,contemperaturasentre50‐52ºC durante22min,reducíanlosnivelesdevibrioshastanivelesnodetectables, sincambiosenlaspropiedadessensorialesdelproducto. Esterilización Laesterilizaciónenautoclaveesuntratamientotérmicoqueeliminacasi todoslospatógenostransmitidosporlosalimentosypermiteobtenerun productoestableenalmacenamiento. Apesardequeestetratamientoesmuyeficienteparaladestruccióndelos vibrios,hayquetenerencuentaqueenelcasodealimentospocoácidos envasadosencontenedoresherméticamentesellados,debenrealizarse controlesobligatoriosadicionalesparaevitarelcrecimientodeotras bacteriasconformasresistentes(esporastermorresistentes)quepueden producirtoxinasencondicionesdeanaerobiosis(comoeselcasodelsubtipo EdeClostridiumbotulinumpredominantementeencontradoenpescados) (WellsyWilkins,1996). 4.4.AnálisisderiesgodeV.parahaemolyticusenacuicultura Enlosúltimosaños,sehaproducidounaumentonotableenlasimportacionesy exportacionesdemarisco,aescalamundial.Estaactividadcomercialha incrementadolasposibilidadesdetrasmisióndelasenfermedadesasociadasal consumodelmariscodesdeelpuntodeproducciónalpuntodeventa,lugaresque puedenestarsituadosamilesdekilómetrosdedistancia.Además,elcambioqueel serhumanoproduceensuentornohaafectadoalasáreasdeproducciónde especiesdestinadasalconsumo,consucorrespondienterepercusiónenSalud Públicayenlaactividadcomercial. Específicamente,enrelaciónconelobjetodeestetrabajo,enel2002,la OrganizacióndelasNacionesUnidasparalaAgriculturaylaAlimentación(FAO) juntoconlaOrganizaciónMundialdelaSalud(OMS)convocaronunaConsultade ExpertossobreEvaluaciónderiesgosdeVibriospp.enpescadosymariscos (FAO/OMS,2003).Porsuparte,enel2005,laFDAllevóacabounanálisisderiesgo cuantitativoparaV.parahaemolyticusenostrascrudasenlosEstadosUnidos, teniendoencuentacomofactorprincipallatemperaturadelagua,asícomola
44 RevisiónBibliográfica temperaturadelairequeafectanaladensidaddeV.parahaemolyticusen condicionesnaturalesyencondicionesdepost‐cosecha,respectivamente. Estimaronlarelacióndosis‐respuestaenhumanosconrespectoa V.parahaemolyticusysugirieronquehabíaunriesgobajo(<0,001%)desufrir gastroenteritistraselconsumode104célulasdeV.parahaemolyticus(tdh+),yun altoriesgo(50%)traselconsumode108célulasdeV.parahaemolyticus(tdh+) (CFSAN‐FDA,2005).NohaydatosdeestetipoenEuropa.Sinembargoelhallazgo deV.parahaemolyticuspatógenoenEuropa,hacenecesarioelanálisisderiesgodel consumodemariscoenestaszonasporpartedelaAutoridadEuropeadeSeguridad Alimentaria(EFSA)olaFAOasícomolaelaboraciónderecomendacionespara poderllevaracabofuturaslegislaciones,cómoeselcasodeEE.UU.o,porejemplo, ChiledóndelasgastroenteritisporV.parahaemolyticussondenotificación obligatoriadeacuerdoalDecreto158(Octubre2004). LaUniónEuropearegulalaproducción,elcosechadoylacomercializaciónde moluscosbivalvosenlaUniónEuropea.Losrequisitosquedebencumplirlas empresasdelaindustriaalimentariasepresentanenelReglamento853/2004que incluyereglasespecíficasdehigieneparaalimentosdeorigenanimal(Comisión Europea,2004a).Losparámetrosqueutilizaparaestablecerlaidoneidaddelos moluscosestánbasadosenindicadoresdecontaminaciónfecal,comoE.colio Salmonellaspp.(ComisiónEuropea,2004b,2006,2007).Sinembargo,existen estudiosquedemuestranqueladepuraciónesmenosefectivaenlaeliminación tantodelosvirusentéricos,comodebiotoxinasmarinas,oenlaeliminacióndelos metalespesadososustanciasquímicasorgánicas,ytambiénenlaeliminacióndelos Vibriosspp.patógenosqueseencuentrandeformanaturalenmedioscosterosy estuariosynoestánasociadosacontaminacionesfecales,resultandotodosellosun riesgoparalasaluddelconsumidor(Francoetal.,1990;Crocietal.,2002;Cozziet al.,2009).
45 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 5 Objetivos 5.1.Objetivogeneral ElobjetivogeneraldelapresenteTesisDoctoralfueobtenernuevosdatossobre V.parahaemolyticusenEuropa,quecubrieranlaslagunasdeinformación presentesenlosanálisisderiesgoeuropeos.Estosdatospermitirándisponerde informaciónactualizadadeesteagentepotencialmentepatógeno,yaquela informacióndelaquesedisponeactualmenteenEuropaeslimitadayseapoya parcialmenteenlosmodelosdeanálisisderiesgodesarrolladosparalosEstados UnidosdeAmérica. 5.2.Objetivosespecíficos Paraalcanzarelobjetivogeneralseplantearonlossiguientesobjetivosespecíficos: 1. DetectareidentificarcepaspotencialmentepatógenasdeV.parahaemolyticus enmoluscosbivalvosdeinteréscomercialcultivadosenlasbahíasdeldeltadel Ebro. 2. EstudiarlaprevalenciayladistribuciónespacialytemporaldeV.parahaemolyticus (totalypatogénico)enmoluscosbivalvoscultivadosencadaunadelasbahías deldeltadelEbro,asícomosuposibleasociaciónconparámetrosambientales (temperaturaysalinidad). 3. Investigarladistribucióndelosmarcadoresdepatogenicidadde V.parahaemolyticus(genestdhy/otrh)encepasdeorigenambientalaisladasen diferentesecosistemasdeEuropa,entreelloseldeltadelEbro. 4. Estudiarlaeficaciadeunsistemaexperimentaldedepuraciónde Ruditapesphilippinarumconelfindedeterminareltiemponecesariopara reducirhastanivelesindetectableslaspoblacionesnaturalestantodevibrios nofermentadoresdesacarosa(SNFV),comodevibriosfermentadoresde sacarosa(SFV).
46 Objetivos 5. Describirycompararlascaracterísticasdeincorporaciónysupervivenciade cepas,tantopatógenascomonopatógenas,deV.parahaemolyticusen moluscosbivalvosdeinteréscomercial(R.decussatusy/oR.philippinarum),en ambienteacuático. 6. Determinarelcrecimientoylacapacidaddesupervivenciadurantelaetapade post‐cosechayadiferentestemperaturasdecepasdeV.parahaemolyticus patógenasynopatógenasenunapoblacióndeR.philippinarum.
53 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Lasalmejasempleadasfueronrecogidasespecíficamenteparacadaexperimento enloslugaresseleccionadosparaelestudioobservacional:R.philippinarumenla bahíadeFangar(40°47’3’’N,0°43’8’’E),yR.decussatusenlabahíadeElsAlfacs (40°37’44’’N,0°38’0’’E). Enamboscasos,entrelosanimalesrecogidosseseleccionaronanimalesadultos sanos,cuyotamañoestuvierapróximoalatallamínimadecomercialización, establecidaen35mmparaR.philippinarum,y40mmparaR.decussatus (ReglamentoCE850/98;ReglamentoCE40/2008;ReglamentoCE43/2009). 6.2.2.Instalaciones Elsistemaexperimentaldedepuraciónfuediseñadoenhorizontal(Figura5),y constabadeuntotalde12tanquesdefibradepoliuretanoreforzada,de40litros decapacidad(90cmdelargo,45cmdeancho,y18cmdeprofundidadmáxima), conelinteriordegel‐whitecoat,asociadosaunmóduloIRTAmarTM. ElmóduloIRTAmarTM(Figura6)permitecontrolarporsondasymecanismosde reacciónlosparámetrosdecaudal(l/min),temperatura(ºC),yoxígenodisuelto (mg/l),ylosregistraautomáticamenteenunordenadorcentral. Ladepuraciónsellevóacaboencircuitoabierto,porloqueelaguasalientede lostanqueseraexpulsadaaunasbalsasdetratamiento.Latasaderenovación delaguaseestablecióalrededorde1h(equivalentea0,7l/min). Figura5.Sistemadedepuraciónexperimentalapequeñaescala
54 MaterialyMétodos 1 2 3 4 5 6 7 Componentes: (1)LámparaUV (2)Sistemadecontrol (caudal,O2y temperatura) (3)Filtrosdecartuchos (4)Biofiltro (5)Intercambiadorde calor (6)Filtromecánico (7)Tanquedeexpansión Figura6.Móduloautomáticodetratamientodeaguas(IRTAmarTM) Lasalmejasfueronsituadasenplacasdeplásticoperforadasysuspendidasdel fondodelostanquesparaminimizarlarecontaminaciónconhecesy pseudoheces(Figura7). Figura7.Ubicacióndelasalmejasenlasunidadesdedepuración Antesdeempezarconlosexperimentosyparacomprobarlaeficaciadel protocolodedesinfección,elaguademartratadafuesembradaenplacasde
55 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial TCBS,noencontrándosecrecimientodespuésde48h.Esteprocesode evaluacióndelacalidaddelsistemafuellevadoacabosemanalmentepara comprobarlaeficaciadedesinfeccióndelsistema,yevitardeesaformala entradadeV.parahaemolyticusquepudieradistorsionarlosresultadosdelos estudios,yaquehayquetenerencuentaquelafuentedeaguadelsistemade depuraciónprocedíadelabahíadeElsAlfacs,quepresentaunaconcentración variabledeV.parahaemolyticus. 6.2.3.CepasdeVibrioparahaemolyticus SeutilizarondoscepasdeV.parahaemolyticusqueprocedíandelmuestreo correspondientealacampañadevigilanciaepidemiológicallevadaacaboenel veranodel2006(Roqueetal.,2009).Lacepai747fueaisladademejillón,carece depotencialpatogénicoyllevaelgentlhquecodificaparalahemolisina termolábil.Lacepai678fueaisladadealmejaR.decussatus,espotencialmente patogénicayaqueademásdellevarelgentlh,llevaelgentdhquecodificapara lahemolisinadirectatermoestable. LaidentificacióndeambascepasserealizómediantelatécnicadePCRdiseñada porBejycolaboradores(1999)(conligerasmodificacionesenelprotocolo),que permitiólaidentificaciónaniveldeespeciemediantelaamplificacióndelgende lahemolisinatermolábil(tlh)yaniveldefactoresdevirulenciaporla amplificacióndelgendelahemolisinadirectatermoestable(tdh)ydela hemolisinarelacionadaconlahemolisinadirectatermoestable(trh). AmbascepassecaracterizaronfenotípicamentecomobacilosGram‐negativos, catalasayoxidasapositivos,anaerobiosfacultativosymóvilesquecrecíanenagar TCBS(Oxoid,Hampshire,ReinoUnido)formandocoloniasverdes.Además,ambas cepasfueroncapacesdecrecera42ºC,peronoaconcentracionesde8%deNaCl. Complementariamenteserealizaronpruebasbioquímicasdeidentificación medianteelsistemaAPI20E(BioMérieux,Marcy‐l’Etoile,Francia)quedieronun resultadopositivoparalaidentificacióndeV.parahaemolyticusconuna probabilidadde99,9%,enelcasodelacepai747(4146107),y99,5%,enelcasode lacepai678(4326106). Loscultivospurossemantuvieroncriopreservadosa‐80ºCenglicerolal10%, hastasuposteriorutilización.Paraprepararlosinóculosdecadacepaseinoculó unacriobolabacterianaenunErlenmeyercon50mldecaldodetripticasasoja (TSB)(ScharlauChemieS.A.,Barcelona,España)adicionadoconun2,0%deNaCl (TSB‐2).ElErlenmeyerinoculadofueincubadoa28ºCdurante18‐20henagitación suave(ExcellaE24Incubatorskakerseries,NewBrunswickScientific,New Jersey,EE.UU.).Posteriormente,elcaldodecultivoresultantefuetransferidoen tubosFalconestériles(ScharlauChemieS.A.,Barcelona,España)quese
56 MaterialyMétodos centrifugarona2000gya4ºCdurante10min.Elsobrenadantefuedesechado,y elsedimentoobtenidoseresuspendióensoluciónsalinaestérilconteniendo2,5% deNaCl(SSS)determinándosesuOD620nmmedianteespectrofotometríavisible (HITACHIU‐2001,HitachiInstruments,Lnc,EE.UU). Elinóculosepreparóapartirdeestasuspensiónbacterianaajustandolacantidad debacteriaa105‐106ufcpormldebañodeexposición.Losresultadosobtenidos conelespectrofotómetrofueronconfirmadosmediantesiembrasdediluciones decimalesseriadasdelasmuestrasporduplicadoenplacasdeagartripticasasoja (TSA)(ScharlauChemieS.A.,Barcelona,España)conteniendoun2,0%NaCl(TSA‐ 2),agarTCBSyCHROMagarVibrio(Biomerieux,Paris,Francia).Lasplacas sembradasfueronincubadasa28ºC(TSA‐2yTCBS)ya37ºC(CHROMagarVibrio) durante18–20h.Posteriormente,secalculóyregistroelnúmerodeunidades formadorasdecoloniasporml(ufc/ml). 6.2.4.Diseñoexperimental 6.2.4.1.Depuración Untotalde182almejasdelaespecieR.philippinarumfueroncosechadasdeun áreadecultivoenlabahíadeFangar:120individuosenprimaveray62en verano.Latalladelosindividuosfuede34,4±2,8mmenprimaveray 39,9±1,0mmenverano. Conelfindedeterminarsilatemperaturadelaguateníaalgunainfluenciaenla tasadedepuraciónenrelaciónaltiempodeeliminacióndelaspoblaciones naturalesdevibrios,sellevóacabounprimertrabajoenelqueserealizarondos experimentos:unoenprimavera(temperaturamediadelagua19,88±0,40ºC)y otroenverano(temperaturamediadelaguade25,19±0,94ºC). Encadacaso,lasalmejasfuerondivididasendosbandejasyseanalizaron microbiológicamenteuntotalde12almejaspordía,enelexperimentode primavera,atiemposdemuestreo:0,24,48,72,96,120,144,168,192,y216h,y 9almejaspordía,enelexperimentodeverano,atiemposdemuestreo:0,24, 144,168,192,y216h(conlaexcepciónde4almejaspordíaatiempode muestreo:48y72h).Lasdiferenciaseneltamañodelosgruposexperimentales fuerondebidasaproblemasdedisponibilidaddeindividuosduranteelverano. Laduracióndelosexperimentos,establecidaen9días,sedeterminóteniendo encuentaquelosindividuosestabansincomer,ypodríansufrirunapérdida depesoexcesiva,conlaconsiguientepérdidadeeconómicaenelmercado. 6.2.4.2.Cinéticadeincorporaciónencondicionesexperimentalesdecultivo Sellevaronacabovariosestudiosparaconocerlaincorporaciónde V.parahaemolyticus(patógenoynopatógeno)encondicionesdecultivoen
57 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial almejasdelgéneroRuditapes.Paraello,seseleccionaronuntotalde 569almejasdelaespecieR.decussatusy564R.philippinarum. LadistribuciónenlosdistintosgruposexperimentalesparaR.decussatusfuela siguiente:255almejascontrol(almejasnoexpuestasaV.parahaemolyticus), 123y191almejasexpuestasaV.parahaemolyticuspatógenoynopatógeno, respectivamente.MientrasqueparaR.philippinarumfue:285almejascontrol (almejasnoexpuestasaV.parahaemolyticus),123y156almejasexpuestasa V.parahaemolyticuspatógenoynopatógeno,respectivamente. Antesdecomenzarconelestudiodelaevolucióndeambascepasde V.parahaemolyticus,lasalmejasfuerondepuradassiguiendoelprotocolo previamenteevaluadoenlapresenteTesisDoctoral(Lopez‐Jovenetal.,2011a). UnavezcomprobadoquelasalmejasestabanlibresdeSNFV,éstasfueron situadasenlostanquesdeexperimentación,conteniendo330‐350mldeagua marinadepuradaporalmeja,provistasdeaireadoresysinrenovacióndeagua. Estosestudiosserealizaronatemperaturaambiente,manteniéndosela temperaturadelaguaentre16y18ºC. LosexperimentosdeincorporacióndeV.parahaemolyticusserealizaronpor separadoparacadaespeciedealmejasyparacadaunadelasdoscepasde V.parahaemolyticus,perotambiénsellevaronacaboencondicionesde cohabitacióndeambasespeciesdealmejas,utilizandolacepanopatógenade V.parahaemolyticus.Lainoculaciónexperimentaldeambascepasde V.parahaemolyticus(patógenaynopatógena)sellevóacaboconunacarga inicialbacterianaaltacomprendidaenelrangosituadoentre6,50±0,19a8,63± 0,90logufc/almeja(exceptoenelestudiodecohabitacióndóndelacargainicial bacterianafuemenor,de3,70±0,00logufc/ml).Elinóculobacterianofue administradojuntocon105células/mldefitoplanctonaxénico(Isochrysisgalbana variedadtahitiana)(PérezCamachoetal.,2002),paraestimularlaincorporación bacterianaenlasalmejassimulandolascondicionesenelmediomarino. Lostiemposdemuestreoencadaexperimentofueronvariablesenglobando unaampliafranjatemporalqueoscilóentre2y168h. 6.2.4.3.Cinéticasdeincorporaciónencondicionesdepost‐cosecha Untotalde352almejasdelaespecieR.philippinarumfueronseleccionadas: 144comoalmejascontrol(almejasnoexpuestasaV.parahaemolyticus),103y 105almejasexpuestasaV.parahaemolyticuspatógenoynopatógeno, respectivamente,paraseralmacenadasadiferentestemperaturas. Seevaluarondosfactores:latemperaturadealmacenamientoylavariantede V.parahaemolyticus.Cadaunodeestosfactoressedividióentrescategorías,
58 MaterialyMétodos temperatura(4,15y28ºC)yV.parahaemolyticus(patógeno,nopatógeno,y controlnegativo),deformaquefinalmentenuevegruposexperimentales fueronestudiadosenunexperimentofactorialcompleto. Antesdelalmacenamiento,estosbivalvosfuerondepuradossiguiendoel protocolodeLopez‐Jovenetal.(2011a),yunavezqueseverificóquelas almejasestabanlibresdeSNFVfueronsituadasenunidadesde experimentación(quecontenían10ldeaguamarinadepurada)yseprocedió alainoculaciónexperimentaldelascepasdeV.parahaemolyticus(patógenay nopatógena)conconcentracionesmediasde6,16±0,48logufc/mlyde6,72± 0,32logufc/ml,respectivamente.Lainoculaciónserealizóporseparado(es decir,endistintasunidadesdeexperimentación).Comoenlosexperimentos anterioreselinóculobacterianofueadministradoalasalmejasjuntocon105 células/mldefitoplanctonaxénico(Isochrysisgalbanavariedadtahitiana) (PérezCamachoetal.,2002).Lasalmejaspermanecieroneneltanquedurante 24h,hastaalcanzarlosnivelesmáximosdeincorporaciónbacteriana,segúnse habíaestablecidoenlosresultadosobtenidospreviamenteenestaTesis Doctoral(Lopez‐Jovenetal.,2011b). Unaveztranscurridoesetiempo,losanimalesfueronsacadosdelagua,ycada lotedealmejasquehabíasidoexpuestoacadaunadelasdoscepasy,junto conlasalmejasdellotecontrolfuerondivididosentresgruposigualesy situadosendiferentesbandejasexpuestasalaire.Unabandejadecadagrupo (unaconalmejasexpuestasaV.parahaemolyticuspatógeno,otraconalmejas expuestasaV.parahaemolyticusnopatógenoyotrabandejaconalmejas control)fuesituadaacadaunadelastemperaturasambientalesestablecidas: 4,15y28ºC. Apartirdeesemomento,setomóunamuestradecadaunodelosnueve gruposformadosparaelalmacenamiento:grupoinoculadocon V.parahaemolyticuspatógeno(n=6almejas),V.parahaemolyticusnopatógeno (n=8almejas),yelgrupocontrol(n=11almejas)fueanalizadaatiempo0,24, 48,72y96h.Así,seestimólaconcentracióndeV.parahaemolyticusenlas almejascada24hduranteunalmacenajequeduró4días.Elexperimentofue realizadoporduplicado,ysecomplementóconunexperimentoadicionalpara elalmacenamientoa4ºCconlafinalidaddeverificarresultadosobtenidos previamente(enestecasoseanalizaron5almejasdecadaunodeloslotesa tiempo0h). 6.3.Técnicasdiagnósticas LosestudiosdecaracterizacióneidentificacióndeV.parahaemolyticussellevarona caboenlasinstalacionesdelIRTA‐SCR,exceptuandolosanálisiscorrespondientesa
59 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial laelectroforesisengeldecampopulsante(PFGE)quefueronrealizadosenel IstitutoSuperiordeSanitàdeRoma(Italia). 6.3.1.Procesadodelasmuestras Todoslosindividuosfueronmedidoslongitudinalmente(Digitalcaliper0‐150mm LLG)antesdeserprocesadasyabiertasindividualmenteencondicionesestériles utilizandouncuchillopreviamenteesterilizadoconalcoholyluegoexpuestoa unallama.Tantoellíquidointervalvarcomolacarne,fueronsituados conjuntamenteenvialesestérilesquecontenían10mldeSSS,yfueronpesadas enlabalanzadeprecisión(descontadoelpesodelvialconSSS),paradeterminar supeso.Posteriormentelostejidosrecogidosfueronmaceradosy homogeneizadosdurante30susandoultraturrax(IKA,T25basic). 6.3.2.Recuentobacteriológico ElaislamientoinicialdelascepasdeV.parahaemolyticussellevóacaboapartir de1mldelmaceradodelbivalvoenriquecidoen9mldeaguadepeptonaalcalina (APW)(ScharlauChemieS.A.,Barcelona,España),durante6ha37ºCysembrado posteriormenteporagotamientoutilizandounasadesiembraenplacasde CHROMagarvibrio(CHROMagar,Francia),queseincubarondurante18‐20ha 37ºC.Todaslascoloniasmalvafueronpurificadas,primeroenplacasde CHROMagarVibrio,ydespuésenTSAadicionadoconun2%deNaCl. Elrecuentototaldebacteriasmarinasheterotróficasyvibriosserealizóenplacas deagarmarino(ScharlauChemieS.A.,Barcelona,España)yenplacasdeTCBS (ScharlauChemieS.A.,Barcelona,España),respectivamente. EspecíficamenteparaV.parahaemolyticussellevaronacabodilucionesseriadas delasmuestrasquefueronsembradasenagarTCBS(Oxoid,Hampshire,Reino Unido)(Kobayashietal.,1963),eincubadasa28ºCdurante20‐24h.Unavez transcurridoesetiempo,lascoloniasenlasplacasdeTCBSfueroncontadas manualmente,paracalcularladensidaddelascélulasviablesenlamuestra (ufc/g),considerandoquelosvibriosnofermentadoresdelasacarosa(SNFV) producencoloniasverdes,mientrasquelosquesoncapacesdefermentarla sacarosaformancoloniasamarillas.LascoloniasformadasporSNFVson distinguiblesdeotrascoloniaspertenecientesabacteriasdeotrosgéneros,por eltamañoyporelcolor,loquepermitiólaclasificacióndelascoloniasde V.parahaemolyticus(Hara‐Kudoetal.,2001).Todoslosresultadosson presentadosporgramodeindividuo,yaquetodaslasmuestrasfuerondiluidas enelmismovolumen. Cadaunadelascepasaisladasypurificadassepreservarona‐80ºCconelfinde realizaranálisisposterioresoutilizarlascomoinóculos.
60 MaterialyMétodos 6.3.3.Identificaciónbacteriana Lascepasbacterianasaisladasqueseutilizaronenelestudioexperimentalfueron sometidasaunabateríadepruebasfisiológicasybioquímicas(AlsinayBlanch, 1994;Farmer3rdyHickman‐Brenner,2006). Lamovilidadcelularsedeterminómedianteobservaciónenfrescoal microscopioapartirdeunasuspensiónenSSS.Lamorfologíaseobservótrasla realizacióndeunatinciónGram.Lapruebadelaoxidasasellevóacabo siguiendoelmétodoKovacs(1956). Paraestudiarlatoleranciaalasalenrelaciónalcrecimientodeestascepas bacterianasseutilizóTSAsuplementadocondiferentesconcentracionesdeNaCl (2y8%).Lasplacasseincubaronaunatemperaturade24±1ºC,durante24‐48h. Paraestudiarlatoleranciaalatemperaturaseestablecióunrangode temperaturas(4,37y42ºC)decrecimientodelasbacteriasenplacasTSA. TambiénsedeterminólasensibilidadalagentevibriostáticoO/129a150µg empleandoelmétododedifusiónenagarMüeler‐Hinton(Oxoid)conNaClal1%. Seutilizarondiscoscomerciales(Oxoid)ysedeterminólaactividad antimicrobianamediantelalecturadeloshalosdeinhibicióndespuésdeincubar lasplacasa24±1ºCdurante24h. Complementariamentelosmicroorganismosfueronidentificadosconelsistema comercialAPI20E,deacuerdoalametodologíadescritaporelfabricante,ycon unesquemareducidoqueincluye:agarTSIyagarMIO(movilidad‐indol‐ornitina). 6.3.4.Diagnósticomolecular Enprimerlugarparallevaracaboeldiagnósticomolecularyconfirmarla identidaddelascepasempleadasseextrajoelDNAutilizandoelkitde purificaciónWizardparalapurificacióndelDNAgenómico(Promega,Wisconsin, EE.UU.),siguiendolasinstruccionesdelfabricante.Posteriormente,seajustóla concentracióndeDNAa50ng/µlysecomenzaronarealizarlasPCRdeunpaso. SecomenzóconelanálisisdelosgenestlhotoxR(marcadordeespecie),y despuéslascepaspositivasaisladasfueronanalizadasparalosgenestdhytrh. Paralaidentificación/confirmaciónseusaronloscebadoresdescritosporBejet al.(1999)conligerasmodificacionesdelatécnicasegúnlassiguientes condicionesdeamplificacióneneltermociclador(EppendorfMastercycler Personal,EppendorffAG,Hamburg,Alemania):desnaturalizacióniniciala95°C durante8min,seguidapor40ciclosde1mindedesnaturalizacióna94°C, alineamientoa55°Cdurante1min,elongacióna72°Cdurante1min,yextensión finaldurante10mina72°C.
61 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial Seincluyeroncontrolesnegativosypositivosentodaslasreacciones.Elcontrol negativofuepreparadoconagualibredeDNA(Sigma‐Aldrich,España). EnlosestudiosrealizadosenelIRTA‐SCRlosdoscontrolespositivostlhfueron tdh+CAIM1400,ytrh+CAIM1772(CollectionofAquaticImportant Microorganisms),mientrasqueenlosestudiosrealizadosenelIstitutoSuperior deSanitàdeRomaseutilizaronlascepasthd+ATCC43996ytrh+ATCC17802 (AmericanTypeCultureCollection). Losproductosresultantesdelaamplificaciónfueronvisualizadosenungelde agarosaal2%,teñidoconbromurodeetidio. 6.3.5.Hibridacióndecolonias Conelfindeconfirmarlaidentificaciónmoleculardelascepasporsus característicaspatogénicasserealizóunahibridacióndecolonias. Paraellosediseñaronsondasmarcadasdedigoxigeninabasadasenlas secuenciasdelosgenestoxR,tdh,trh1ytrh2.Lascepasbacterianasse sembraronenplacasdeTSA‐2(Oxoid,Hampshire,ReinoUnido)yfueron incubadosalmenos12ha37ºC.Lapreparacióndelosfiltrosapartirdelasplacas yladeteccióncolorimétricaenNBT‐BCIP(nitroazuldetetrazolioy 5‐bromo‐4‐cloro‐3‐indolfosfato)sellevóacabosegúnelprotocoloestablecido (RocheAppliedScience,2009). Lahibridaciónsedesarrollódurante12ha54ºCenunasolucióntampóndeurea 6M,yseasegurólaespecificidaddelareacciónrealizandodoslavadosa65ºC. 6.3.6.Caracterizaciónmolecular EnprimerlugarsepurificaronlosproductosdelaPCRpositivosparatdhytrh, conelkitdepurificaciónQIAquickPCR(Qiagen,California,EE.UU.)siguiendolas instruccionesdelfabricante,yacontinuaciónseenviaronasecuenciar bidireccionalmenteaMacrogenInc.(Tokio,Japón).Lassecuenciasfueron alineadasutilizandoBioEdit(Hall,1999)yanalizadasutilizandoelprograma BLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformation). Acontinuaciónlascepasaisladasfueroncaracterizadas(fingerprint)utilizando unaPCRrepetitivaextragénicapalindrómica(rep‐PCR)(Cabanillas‐Beltránetal., 2006),ylospatronesdebandaselectroforéticasfueronanalizadosconel programaGelComparII4.5(AppliedMaths,Bélgica).Lamatrizdesimilaridadfue calculadautilizandoelcoeficienteJaccardconunatoleranciadel0,8%,yel dendogramaseconstruyóconelalgoritmoWard. PorúltimosellevóacabounaPFGEdeacuerdoconelprotocoloPulseNet ligeramentemodificado(Martinez‐Urtazaetal.,2004;Wangetal.,2008),donde
62 MaterialyMétodos lascepasenestudiofueroncultivadas12henTSAsuplementadocon2%deNaCl, ytraselcrecimientoseconformaronunosbloquesdeparafinaquefueron resuspendidosenuntampóndelisisconproteinasaKeincubados1ha50ºCcon agitaciónconstante.Traslalisisserealizarondoslavadosconagua pentadestiladaycincolavadosde10mincon15mldetampónTris‐EDTAa50ºC. Acontinuaciónserealizódurante12ha37ºCunadigestióndelDNAconla endonucleasaderestricciónNotl(Fermentas,Alemania)utilizando25U/bloque. ComomarcadordepesomolecularseutilizólacepaH9812delserovar BraenderupdeSalmonellaentéricadigerida12ha37ºCconlaenzimaXbal. Losbloquesobtenidosfueronembebidosengeldeagarosaal1%ylos fragmentosderestricciónfueronanalizadosporPFGEconCHEFIIMapper system(Bio‐RadLaboratories,California,EE.UU.)en0,5xTris‐borato‐EDTAcon tiourea300µMylassiguientescondiciones:6V/cmdurante18ha14°C,con pulsosde2a40syvelocidadesdebombeode0,7l/min.Losgelesresultantes fueronteñidosconbromurodeetidiodurante25min,aclaradosenagua destiladadurante45minyfotografiadosbajoluzUV. Lospatronesderestricciónobtenidosfueronanalizadosconelprograma BioNumerics4.0(AppliedMaths,Bélgica).Elagrupamientofuerealizado utilizandoelmétodoUPGMA(unweightedpairgroupmethodusingaverage linkages)yelcoeficientedecorrelacióndeDiceconunatoleranciadeposición del1,5%.Losconglomerados(clusters)sedefinieronasumiendounvalorumbral del80%desimilitud. 6.3.7.Susceptibilidadaantibióticos Complementariamentesecaracterizóladiferentesusceptibilidadalosantibióticos delascepasaisladasenlascampañasdel2006y2008. Paraelloserealizaronpruebasdesensibilidadinvitroalossiguientesantibióticos segúneltestdediscosdedifusiónrealizadoporduplicado(Roqueetal.,2009): gentamicina(10µg),ácidooxolínico(10µg),amoxicilina(25µg),polimixinaB (300UI),vancomicina(30µg),trimetoprim‐sulfametoxazol(1,25/23,75µg), nitrofurantoína(300µg),doxiciclina(30µg),ceftazidima(30µg),estreptomicina(10 µg),neomicina(30UI),penicilina(6µg),flumequina(30µg),tetraciclina(30µg), ampicilina(10µg),kanamicina(30µg),ciprofloxacina(5µg),ysulfonamida(300µg). 6.3.8.Variabilidadserológica FinalmentelascepasseenviaronalCEFAS(CentreforEnvironment,Fisheries& AquacultureScience,Weymouth,ReinoUnido)paraladeterminacióndel serotipomedianteelmétododeaglutinaciónutilizandoantisueroscomerciales
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71 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 7.1.2.ISMEJournal:MultidisciplinaryJournalofMicrobialEcology(enrevisión) Lopez‐JovenC,deBlasI,RoqueA.Spatialdistributionandtemporalevolutionof VibrioparahaemolyticusinbivalvemolluscsfromtheSpanishMediterranean Coast.ISMEJournal:MultidisciplinaryJournalofMicrobialEcology(manuscrito enrevisión). Resumendelartículoencastellano DistribuciónespacialyevolucióntemporaldeVibrioparahaemolyticusen moluscosbivalvoscultivadosenlacostamediterráneaespañola Vibrioparahaemolyticusesunpatógenoreconocidodelossereshumanos.En estecontextoyparacomprendermejorlaecologíadelavariantepatogénica deV.parahaemolyticusenelmedioambiente,serealizóunestudiosobrela prevalenciadeestavariante(tdh+y/otrh+)frentealavariantenopatogénica (portadoradetlh+comomarcadordeespecieparaV.parahaemolyticus)en moluscosbivalvoscultivadosendosbahíasenCataluña,España.Engeneral,la prevalenciadeV.parahaemolyticusenambasbahíasfuemásbaja(porcentaje demuestraspositivas14,2%)quelosdatosdeprevalenciaexistentesenotros estudiosdehábitatssimilaresyfuesignificativamentedependientedelabahía demuestreo,delaño,ydelasespeciesdebivalvos.Dehecho, Ruditapesdecussatusfueelhospedador/reservorioprincipaldeestepatógeno enlosdosambientesmuestreados.Lavariantepatogénicade V.parahaemolyticusfuedetectadaenel3,8%delasmuestras(56/1459),es decir,laproporcióndebivalvoscontaminadosporV.parahaemolyticus patogénicosfuede27,1%.Además,lapresenciadelavariantepatogénicade V.parahaemolyticussecorrelacionósignificativamenteconlasalinidaddel agua,deformaqueelriesgodeencontrarV.parahaemolyticuspatógeno(tdh+ y/otrh+)disminuyó1,45vecesporcadaunidadqueseincrementabalasalinidad (ppt).Estehallazgosugierequelascepasportadorasdepotencialesgenesde virulenciasonmássensiblesalasalinidad.Sinembargo,estaesuna observación,yhastanuestroconocimiento,ningúnestudiopublicadoha contrastadoestehecho.Encualquiercaso,estosresultadospodríanexplicarel bajonúmerodecasosdeenfermedadesgastrointestinalesenestaárea. Además,losresultadosdelpresenteestudioaportandatosparaelanálisis cuantitativoderiesgos.
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105 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 7.1.3.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2011 SuffrediniE,Lopez‐JovenC,MaddalenaL,CrociL,RoqueA.Pulsed‐FieldGel ElectrophoresisandPCRcharacterizationofenvironmentalVibrio parahaemolyticusstrainsofdifferentorigins.AppliedandEnvironmental Microbiology.2011;77:6301‐6304. Resumendelartículoencastellano CaracterizaciónconPCRyconElectroforesisdecampopulsantedecepasde Vibrioparahaemolyticuscondiferentesorígenes Elpresenteestudioutilizalacaracterizaciónporgeldeelectroforesisencampo pulsanteparaexaminarlavariabilidadintraespecíficaylasrelacionesgenéticas entrecepasaisladasdeVibrioparahaemolyticusdediferentespaísesEuropeos. EselprimerestudiorealizadosobreVibrioparahaemolyticusambientalesque incluyemásdeunpaísEuropeo.
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119 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 7.2.2.JournalofAppliedMicrobiology,2011 Lopez‐JovenC,deBlasI,Ruiz‐ZarzuelaI,FuronesMD,RoqueA.Experimental uptakeandretentionofpathogenicandnonpathogenicVibrioparahaemolyticus intwospeciesofclams:RuditapesdecussatusandRuditapesphilippinarum. JournalofAppliedMicrobiology.2011;111(1):197‐208. Resumendelartículoencastellano IncorporaciónexperimentalyretencióndeVibrioparahaemolyticuspatógenoy nopatógenoendosespeciesdealmejas:Ruditapesdecussatusy Ruditapesphilippinarum Objetivos:DescribirlaincorporaciónyretencióndeVibrioparahaemolyticus patógenoynopatógenoenRuditapesdecussatusyRuditapesphilippinarum. MétodosyResultados:Ruditapesdecussatusacumulaconcentraciones mayoresdeVibrioparahaemolyticuspatógenoynopatógenoque R.philippinarum.Yademás,estasconcentracionesdisminuyeronantes. Vibrioparahaemolyticusnopatógenoalcanzóconcentracionesmásaltas (aproximadamente1logUFCg‐1enR.decussatusymásde1logUFCg‐1en R.philippinarum)queV.parahaemolyticuspatógenoalosmismostiemposde muestreo.TambiénseobservóqueV.parahaemolyticusnopatógenopersistió durantemástiempoenlasdosespeciesdealmejas(72henR.decussatusy96h enR. philippinarum),mientrasqueV.parahaemolyticuspatógenopersistió48h enR.decussatusy72henR.philippinarum. Conclusiones:Ruditapesdecussatusincorporólasdoscepasde V.parahaemolyticusmásrápidoqueR.philippinarumytambién,loseliminóantes. Enlasmismascondiciones,V.parahaemolyticusnopatógenopodríasobrevivir mejorqueV.parahaemolyticuspatógenodentrodeambasespeciesdealmeja. ImportanciaeImpactodelestudio:Vibrioparahaemolyticuspatógenoesun importanteagentecausaldeintoxicacionesalimentarias.Esteestudio demuestraqueesposibleutilizarV.parahaemolyticusnopatógenoparallevara caboexperimentosqueevalúenlaevoluciónbacterianaenlasalmejas, desarrollandounmodeloinvivoútilparaelanálisisderiesgos.
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229 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 11.2.ContribucióndeladoctorandayrenunciadecoautoresnoDoctores Ladoctorandaeslaprimeraosegundaautoradetodoslostrabajospresentadosen estaTesisDoctoral,loquejustificaplenamentesucontribución. Además,debemosindicarquetodosloscoautoresquenosondoctoreshan renunciadoexpresamenteapresentareltrabajodelquesoncoautorescomoparte deotraTesisDoctoral,talycomoconstaenlosdocumentosqueseincluyena continuación.
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233 Epidemiologíaycinéticadecrecimientoysupervivenciade Vibrioparahaemolyticus en moluscosbivalvosdeinteréscomercial 11.3.Trabajosactualmenteenelaboracióndentrodelmarcodela presenteTesisDoctoral 11.3.1.RecoveryandDetectionofVibrioparahaemolyticusandVibriovulnificusin experimentalinoculatedsamplesandenvironmentalsamples,UsingTangential FlowFiltrationProcedure(TFF)followingwithMPNandReal‐TimePCRmethods Lopez‐JovenC.workedandstudiedattheU.S.FoodandDrugAdministration,Gulf CoastSeafoodLaboratoryinDauphinIsland,Alabama.SheworkedwithDr.Roberto Marrero‐Ortiz,Dr.JessicaL.JonesandDr.AngeloDePaolaonafeasibilitystudyfor directquantificationofVibrioparahaemolyticusandVibriovulnificusinseawaterusing tangentialflowfiltration(TFF)andreal‐timePCR.Themethodscurrentlyusedfor quantificationofvibriosfromseawateraremorelaboriousandlessprecisethanthe TFF‐realtimePCRapproach. Mainobjectiveswere(i)evaluatetheeffectivenessofTFFinrecovering V.parahaemolyticusandV.vulnificusfromseawaterdisinfectedbyUV‐lightthen spikedwithlaboratorystrains,(ii)evaluatetheeffectivenessofTFFinrecoveringV. parahaemolyticusandV.vulnificusfromnaturalseawatersamplescollectednear DauphinIsland,AL,(iii)comparativeanalysesbetweenthemostprobablenumber (MPN)‐real‐timePCR,TFF‐MPN‐real‐timePCRandbetweenTFF‐directreal‐timePCR enumerationmethods. RecuperaciónydeteccióndeVibrioparahaemolyticusyVibriovulnificusenmuestras inoculadasexperimentalmenteymuestrasambientales,utilizandoelprocedimientode filtracióndeflujotangencial(TFF)yrecuentosegúnelnúmeromásprobable(MPN)y laPCRatiemporeal Losobjetivosdeesteestudiofueronevaluar(i)laeficaciadelaTFFparala recuperacióndeV.parahaemolyticusyV.vulnificusinoculadosexperimentalmente enaguademarpreviamentedesinfectadaconluzUV,(ii)laeficaciadelatécnicade TFFenlarecuperacióndeV.parahaemolyticusyV.vulnificusdirectamenteenagua demar(áreadeDauphinIsland,Alabama),(iii)compararlaeficaciadediferentes técnicasdedetección:TFF‐MPN‐real‐timePCRyentreTFF‐real‐timePCR directamente. Mejorarlacapacidaddeconcentraciónpatógenosapartirdemuestrasdegran volumendeaguademarutilizandolatécnicadeTFFofrecerásensibilidad, reproducibilidadyrentabilidad,loqueharáqueestatécnicasepuedautilizarpara mejorarlaseguridadalimentaria.
234 Apéndices 11.3.2.Comparacióndelaeficaciadediferentesprotocolosdedepuraciónconaguademar paraeliminarlapoblaciónnaturaldevibriosfermentativosynofermentativosde sacarosaentejidosdedosespeciesdealmejas:Ruditapesphilippinarumy Ruditapesdecussatus Enelpresenteestudioseanalizólaeficaciadetrestratamientosdiferentes,yse comparóeltiemporequeridoporambasespeciesdealmejasparaeliminarla poblaciónnaturaldevibriosfermentativosynofermentativosdesacarosaensus tejidos.Elobjetivoprincipaldeesteestudiofueevaluarelritmoendógenoenel procesodefiltracióndecadaunadeestasespeciesdealmejascuándofueron expuestasalosdiferentestratamientos.Estainformaciónnosólocontribuyea aumentarelconocimientodelafisiologíadeestasespeciesdealmejas,sinotambién esimportanteaniveldelaseguridadalimentaria.