Repositorio Institucional de Documentos

2012 16 Munia Lanao Maldonado Investigación de la inactivación de Clostridium perfringens y Enterococcus sp. en aguas mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación Departamento Director/es Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Ormad Melero, María Peña Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Munia Lanao Maldonado INVESTIGACIÓN DE LA INACTIVACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Y ENTEROCOCCUS SP. EN AGUAS MEDIANTE PROCESOS CONVENCIONALES Y AVANZADOS DE OXIDACIÓN Director/es Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Ormad Melero, María Peña Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Investigación de la inactivación de Clostridium perfringens y Enterococcus sp. en aguas mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación Memoria que para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Zaragoza presenta Dña. Munia Lanao Maldonado Zaragoza, Mayo de 2012 Dña. Mª PEÑA ORMAD MELERO, Profesora Titular del Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente en el Área de Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza INFORMA, Que el trabajo contenido en la presente Memoria de Tesis Doctoral titulada: “Investigación de la inactivación de Clostridium perfringens y Enterococcus sp. en aguas mediante procesos convencionales y avanzados de oxidación” realizada por Dña. MUNIA LANAO MALDONADO, ha sido realizado bajo mi dirección y se corresponde y adecúa al proyecto de tesis aprobado por el Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza. Y para que así conste, firmo este certificado en Zaragoza, a 10 de mayo de 2012. Fdo.: Dra. Mª Peña Ormad Melero Índice general i Índice General Índice de figuras..................................................................................................................................vi Índice de tablas..................................................................................................................................xiv Capítulo 1. Introducción y objetivos.................................................................................................. 1 Capítulo 2. Control de calidad de las aguas de abastecimiento .................................................... 3 2.1. Contaminación microbiológica de las aguas........................................................................... 11 2.1.1. Gérmenes patógenos de transmisión hídrica................................................................. 11 2.1.2. Indicadores microbiológicos de contaminación fecal................................................... 15 2.1.3. Normas de calidad microbiológica en aguas................................................................. 20 2.2. Plantas de tratamiento de aguas para abastecimiento........................................................... 25 2.2.1. Estación de tratamiento de aguas potables.................................................................... 25 2.2.2. Estación de tratamiento de regeneración de aguas residuales depuradas................ 30 2.3. Técnicas de desinfección y oxidación convencionales........................................................... 33 2.3.1. Generalidades..................................................................................................................... 33 2.3.2. Cloro y derivados............................................................................................................... 34 2.3.3. Dióxido de cloro................................................................................................................. 36 2.3.4. Ozono................................................................................................................................... 37 2.3.5. Radiación solar................................................................................................................... 39 2.4. Procesos de oxidación avanzada............................................................................................... 42 2.4.1. Generalidades..................................................................................................................... 42 2.4.2. Ozonización a alto pH....................................................................................................... 43 2.4.3. Sistema peroxona (O 3 /H 2 O 2 )............................................................................................. 45 2.4.4. Ozonización catalítica........................................................................................................ 46 2.4.5. Fotocatálisis......................................................................................................................... 47 2.4.6. Fotocatálisis con H 2 O 2 ........................................................................................................ 52 2.4.6. Radiación solar con H 2 O 2 .................................................................................................. 53 Índice general . ii Capítulo 3. Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos............................................... 55 3.1. Parámetros de caracterización de TiO 2 ..................................................................................... 57 3.1.1. Superficie específica........................................................................................................... 57 3.1.2. Caracterización estructural............................................................................................... 58 3.2. Parámetros de caracterización físico-química de aguas ........................................................ 58 3.2.1. Demanda de cloro.............................................................................................................. 58 3.2.2. Temperatura, pH, conductividad, turbidez, carbono orgánico total, absorbancia, Cl 2 libre, H 2 O 2 y O 3 residual................................................................................................. 59 3.3. Parámetros de análisis microbiológicos................................................................................... 61 3.3.1. Análisis de C. perfringens................................................................................................... 61 3.3.1.1. Procedimiento normalizado................................................................................ 61 3.3.1.2. Medios de cultivo.................................................................................................. 61 3.3.1.3. Equipos de laboratorio......................................................................................... 63 3.3.1.4. Diluciones decimales seriadas............................................................................. 64 3.3.1.5. Método de filtración de membrana.................................................................... 65 3.3.1.6. Incubación.............................................................................................................. 66 3.3.1.7. Recuento e inactivación........................................................................................ 66 3.3.1.8. Caracterización bacteriana por la tinción de Gram.......................................... 67 3.3.1.9. Repetibilidad del método de análisis de C. perfringens.................................... 69 3.3.2. Análisis de Enterococcus sp...................................................................................................... 71 3.3.2.1. Procedimiento normalizado................................................................................ 71 3.3.2.2. Medios de cultivo.................................................................................................. 71 3.3.2.3. Equipos de laboratorio......................................................................................... 71 3.3.2.4. Diluciones decimales seriadas............................................................................. 72 3.3.2.5. Método de filtración de membrana.................................................................... 72 3.3.2.6. Incubación.............................................................................................................. 72 3.3.2.7. Recuento e inactivación........................................................................................ 72 3.3.2.8. Caracterización bacteriana por la tinción de Gram.......................................... 72 3.3.2.9. Repetibilidad del método de análisis de Enterococcus sp. ............................... 73 3.4. Tratamiento de datos.................................................................................................................. 73 3.4.1. Estudio de las variables influyentes en los tratamientos de desinfección................. 73 Índice de figuras ix Figura 5.18. Inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos de irradiación (), fotocatálisis (), irradiación/H 2 O 2 () y fotocatálisis/H 2 O 2 ().Iluminación intermitente. λ: 320-800 nm. N 0 ≈ 10 8 UFC·100 mL -1 . [H 2 O 2 ]=0,04 mM. [TiO 2 ]=1 g L - 1 ........................................................................................................................................ 147 Figura 5.19. Inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos de irradiación (), fotocatálisis (), irradiación/H 2 O 2 () y fotocatálisis/H 2 O 2 ().Iluminación continua. λ: 320-800 nm. N 0 ≈ 10 8 UFC·100 mL -1 . [H 2 O 2 ]=0,04 mM. [TiO 2 ]=1 g L -1 . ......................................................................................................................................... 150 Figura 5.20. Inactivación de Enterococcus sp. tras los tratamientos de irradiación (), fotocatálisis (), irradiación/H 2 O 2 () y fotocatálisis/H 2 O 2 (). La línea discontinua marca el comienzo del periodo de de oscuridad de 180 minutos. Iluminación intermitente. λ= 320-800 nm. N 0 ≈ 10 8 CFU·100 mL -1 . [H 2 O 2 ]=0,04 mM. [TiO 2 ]=1 g L -1 .................................................................................................................. 151 Figura 5.21. Duración de la desinfección obtenida tras los tratamientos aplicados con irradiación continua, después de 24h de permanencia en oscuridad. .................. 152 Figura 5.22. Inactivación de Enterococcus sp. tras los tratamientos de irradiación (), fotocatálisis (), irradiación/H 2 O 2 () y fotocatálisis/H 2 O 2 (). La línea discontinua marca el comienzo del periodo de de oscuridad de 180 minutos. Iluminación continua. λ: 320-800 nm. N 0 ≈ 10 8 CFU· 100 mL -1 . [H 2 O 2 ]=0,04 mM. [TiO 2 ]=1 g L -1 .................................................................................................................. 153 Figura 5.23. Influencia de las variables seleccionadas en los procesos de radiación solar sobre Enterococcus sp............................................................................................................... 154 Figura 5.24. Representación gráfica de las interacciones entre variables sobre Enterococcus sp. ......................................................................................................................................... 155 Figura 5.25. Diagrama de Pareto en el que se muestran los efectos significativos sobre el factor respuesta Enterococcus sp.................................................................................. 155 Figura 5.26. Influencia de las variables seleccionadas (sin radiación UVB) en los procesos de radiación solar sobre Enterococcus sp......................................................................... 156 Figura 5.27. Representación gráfica de las interacciones entre variables (sin radiación UVB) sobre Enterococcus sp. ................................................................................................... 157 Figura 5.28. Diagrama de Pareto en el que se muestran los efectos significativos (sin radiación UVB) sobre el factor respuesta Enterococcus sp....................................... 157 Figura 5.29. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de c de C. perfringens mediante los tratamientos de irradiación (A), irradiación/H 2 O 2 (B), fotocatálisis (C) y fotocatálisis/H 2 O 2 (D). λ 320-800 nm........................................... 164 Índice de figuras . x Figura 5.30. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de esporos de C. perfringens mediante los tratamientos de irradiación (A), irradiación/H 2 O 2 (B), fotocatálisis (C) y fotocatálisis/H 2 O 2 (D). λ 320-800 nm........................................... 165 Figura 5.31. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de Enterococcus sp. mediante los tratamientos de irradiación (A), irradiación/H 2 O 2 (B), fotocatálisis (C) y fotocatálisis/H 2 O 2 (D). λ 320-800 nm........................................... 166 Figura 5.32. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de Enterococcus sp. mediante los tratamientos de irradiación (A), irradiación/H 2 O 2 (B), fotocatálisis (C) y fotocatálisis/H 2 O 2 (D). λ 290-800 nm........................................... 167 Figura 5.33. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las células vegetativas de C. perfringens mediante tratamiento de irradiación. λ 320-800 nm.................................................................. 168 Figura 5.34. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre los esporos (arriba) y Enterococcus sp. (abajo) mediante tratamiento de irradiación. λ 320-800 nm.................................................................. 169 Figura 5.35. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las células vegetativas de C. perfringens mediante tratamiento de irradiación/H 2 O 2 . λ 320-800 nm........................................................ 170 Figura 5.36. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre los esporos de C. perfringens mediante tratamiento de irradiación/H 2 O 2 . λ 320-800 nm. ................................................................................. 171 Figura 5.37. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre Enterococcus sp. mediante tratamiento de irradiación/H 2 O 2 . λ 320-800 nm. ................................................................................. 172 Figura 5.38. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de las células vegetativas de C. perfringens en el tratamiento de fotocatálisis. λ 320-800 nm........................................................................................... 173 Figura 5.39. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de las células vegetativas de esporos en el tratamiento de fotocatálisis. λ 320-800 nm........................................................................................... 174 Índice de figuras xi Figura 5.40. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de fotocatálisis. λ 320-800 nm. ......................................................................................................................................... 175 Figura 5.41. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica obsevada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las células vegetativas de C. perfringens en el tratamiento de fotocatálisis/H 2 O 2 . λ: 320-800 nm. ......................................................................... 176 Figura 5.42. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de esporos en el tratamiento de fotocatálisis/H 2 O 2 . λ 320-800 nm. ......................................................................................................................................... 177 Figura 5.43. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de fotocatálisis/H 2 O 2 .λ 320800 nm. ........................................................................................................................... 178 Figura 5.44. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de irradiación. λ 290-800 nm. ......................................................................................................................................... 179 Figura 5.45. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de irradiación/H 2 O 2 .λ 290-800 nm. .................................................................................................................................. 180 Figura 5.46. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de fotocatálisis. λ 290-800 nm. ......................................................................................................................................... 181 Figura 5.47. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de fotocatálisis/H 2 O 2 . λ 290800 nm. ........................................................................................................................... 182 Figura 6.1. Esquema de generación de ozono mediante descarga eléctrica............................. 190 Figura 6.2. Descripción de la instalación de ozonización........................................................... 191 Figura 6.3. Inactivación de las células vegetativas de C. perfringens en el tratamiento de ozonización sobre la muestra natural y sintética. N 0 =2,7·10 6 y N 0 =3,9·10 7 UFC·100mL -1 , respectivamente. .................................................................................. 195 Índice de figuras . xii Figura 6.4. Inactivación de las células vegetativas de C. perfringens en el tratamiento de peroxona sobre la muestra natural y sintética. N 0 = 9,8·10 5 y N 0 =9·10 7 UFC·100mL -1 , respectivamente. [H 2 O 2 ]=0,04 mM.............................................................................. 199 Figura 6.5. Inactivación de las células vegetativas de C. perfringens en el tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural y sintética. N 0 = 10 6 y N 0 =5,7·10 7 UFC·100mL -1 , respectivamente. [TiO 2 ]=1 g L -1 .......................................................... 201 Figura 6.6. Influencia de las variables seleccionadas en los procesos de ozono sobre C. perfringens....................................................................................................................... 204 Figura 6.7. Representación gráfica de las interacciones entre las variables utilizadas en los tratamientos de ozonización sobre C. perfringens..................................................... 204 Figura 6.8. Diagrama de Pareto en el que se muestran los efectos significativos sobre el factor respuesta de inactivación............................................................................................. 205 Figura 6.9. Influencia de las variables seleccionadas en los procesos de ozono sobre C. perfringens (estudio complementario)........................................................................ 206 Figura 6.10. Representación gráfica de las interacciones entre las variables utilizadas en los tratamientos de ozonización sobre C. perfringens (estudio complementario). ..... 206 Figura 6.11. Diagrama de Pareto en el que se muestran los efectos significativos sobre el factor respuesta de inactivación.................................................................................. 207 Figura 6.12. Inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de ozonización sobre la muestra natural. N 0 = 3,2·10 8 UFC·100mL -1 ................................................................. 208 Figura 6.13. Inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de peroxona sobre la muestra natural. N 0 = 4,7·10 8 UFC·100mL -1 . [H 2 O 2 ]=0,04 mM................................................. 210 Figura 6.14. Inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural. N 0 = 6,2·10 7 UFC·100mL -1 . [TiO 2 ]= 1 g L -1 ........................ 212 Figura 6.15. Inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento O 3 /H 2 O 2 /TiO 2 sobre la muestra natural. N 0 = 7,5·10 7 UFC·100mL -1 . [H 2 O 2 ]=0,04mM. [TiO 2 ]=1 g L -1 ......................... 213 Figura 6.16. Influencia de las variables seleccionadas en los procesos de ozono sobre Enterococcus sp............................................................................................................... 215 Figura 6.17. Representación gráfica de las interacciones entre las variables utilizadas en los tratamientos de ozonización sobre Enterococcus sp.................................................. 215 Figura 6.18. Diagrama de Pareto en el que se muestran los efectos significativos sobre el factor respuesta de inactivación.................................................................................. 216 Figura 6.19. Ajuste de los cuatro modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de las células vegetativas de C. perfringens en los tratamientos de ozonización (A), peroxona (B) y O 3 /TiO 2 (C). ......................................................................................... 221 Índice de figuras xiii Figura 6.21. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de C. perfringens en el tratamiento de ozonización................... 223 Figura 6.22. Representación de la correlación entre los valofes observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de C. perfringens en el tratamiento de peroxona............................. 224 Figura 6.23. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de C. perfringens en el tratamiento de O 3 /TiO 2 ................................ 225 Figura 6.24. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de ozonización. ............. 226 Figura 6.25. Representación de la correlación entre los valofes observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de peroxona........................ 227 Figura 6.26. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de O 3 /TiO 2 . .......................... 228 Figura 6.27. Representación de la correlación entre los valores observados experimentalmente y los valores estimados por los modelos cinéticos aplicados en la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de O 3 /TiO 2 /H 2 O 2 . ................ 229 Índice de tablas . . xiv Índice de tablas Tabla 2.1. Enfermedades bacterianas de transmisión hídrica (EPA, 1999)................................. 14 Tabla 2.2. Enfermedades parasitarias de transmisión hídrica (EPA, 1999)................................ 14 Tabla 2.3. Enfermedades víricas de transmisión hídrica (EPA, 1999)......................................... 14 Tabla 2.4. Normas de la ISO y AENOR para la detección y recuento de bacterias indicadoras fecales en agua................................................................................................................. 17 Tabla 2.5. Referencias sobre C. perfringens como indicador adecuado de patógenos resistentes. ........................................................................................................................................... 20 Tabla 2.6. Normas de calidad microbiológica en aguas continentales, en función de su uso.23 Tabla 2.7. Normas de calidad microbiológica en aguas reutilizadas, en función de su uso.... 24 Tabla 2.8. Microorganismos presentes en aguas del Canal Imperial de Aragón antes de su entrada a la ETAP de Zaragoza.................................................................................... 25 Tabla 2.9. Tratamiento recomendado para cada categoría de agua prepotable........................ 26 Tabla 2.10. Microorganismos presentes en aguas residuales urbanas, antes y después del tratamiento de depuración............................................................................................ 30 Tabla 2.11. Posibles tratamientos de regeneración en función del uso destinado. ................... 31 Tabla 3.1. Instrumentación, metodología, rango de medida y error de cada uno de los instrumentos para la caracterización físico-química de las muestras..................... 60 Tabla 3.2. Composición del agar SPS............................................................................................... 63 Tabla 3.3. Equipos de laboratorio utilizados en los análisis microbiológicos............................ 63 Tabla 3.4. Coeficiente de variación del método de filtración de membrana sobre C. perfringens para varios volúmenes de muestra. ............................................................................. 70 Tabla 3.5. Composición del agar SB................................................................................................. 71 Tabla 3.6. Modelos cinéticos de estudio aplicados. ....................................................................... 78 Tabla 4.1. Etapas de la ETAP de Navarra. ...................................................................................... 87 Tabla 4.2. Rangos de residencia del agua en cada una de las etapas de la ETAP..................... 88 Tabla 4.3. Caracterización físico-química de las muestras en cada punto de muestreo de la ETAP................................................................................................................................. 89 Índice de tablas xv Tabla 4.4. Eliminación de células vegetativas de C. perfringens y Enterococcus sp. en cada punto de muestreo de la ETAP..................................................................................... 89 Tabla 4.5. Caracterización de la muestra de agua natural............................................................ 93 Tabla 4.6. Pruebas bioquímicas de confirmación de C. perfringens. ............................................ 94 Tabla 4.7. Composición del caldo tioglicolato con resazurina..................................................... 95 Tabla 4.8. Composición del agar Schaedler.................................................................................... 95 Tabla 4.9. Composición del caldo de esporulación Duncan-Strong............................................ 96 Tabla 4.10. Composición del agar nutritivo.................................................................................... 97 Tabla 4.11. Recuentos de células vegetativas de C. perfringens durante el tratamiento de cloración (UFC·100mL -1 ) y concentración de cloro residual (mg L -1 ). .................... 99 Tabla 4.12. Recuentos de esporos de C. perfringens durante el tratamiento de cloración (UFC·100mL -1 ) y concentración de cloro residual (mg L -1 )..................................... 100 Tabla 4.13. Recuentos de Enterococcus sp. durante el tratamiento de cloración (UFC·100mL -1 ) y concentración de cloro residual (mg L -1 )................................................................ 102 Tabla 4.14. Parámetros cinéticos del modelo de Hom modificado aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de cloración......................................................................................................................... 104 Tabla 4.15. Parámetros cinéticos del modelo bifásico aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de cloración....................... 104 Tabla 4.16. Parámetros cinéticos del modelo de Mafart aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de cloración....................... 104 Tabla 4.17. Costes del tratamiento de cloración para la inactivación de un 1 unidad logarítmica sobre C. perfringens (células y esporos) y Enterococcus sp................... 111 Tabla 4.18. Resultados físico-químicos y microbiológicos en las etapas de coagulación, floculación y decantación............................................................................................. 113 Tabla 4.19. Resultados físico-químicos y microbiológicos en la etapa de filtración. ............. 114 Tabla 4.20. Características del carbón activo en polvo ChiemiVall V Plus.............................. 116 Tabla 4.21. Resultados físico-químicos y microbiológicos en la etapa de adsorción............. 116 Tabla 5.1. Recuentos de células vegetativas y esporos de C. perfringens (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de oscuridad e irradiación (λ: 320-800 nm) sobre la muestra natural............................................................................................................................. 126 Índice de tablas . . xvi Tabla 5.2. Recuentos de células vegetativas y esporos de C. perfringens (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de TiO 2 y fotocatálisis (λ: 320-800 nm) sobre la muestra natural. ......................................................................................................................................... 128 Tabla 5.3. Recuentos de células vegetativas y esporos de C. perfringens (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de H 2 O 2 e irradiación/H 2 O 2 (λ: 320-800 nm) sobre la muestra natural............................................................................................................................. 130 Tabla 5.4. Recuentos de células vegetativas y esporos de C. perfringens (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de H 2 O 2 /TiO 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 (λ: 320-800 nm) sobre la muestra natural............................................................................................................. 134 Tabla 5.5. Niveles de las variables en los tratamientos de radiación solar sobre C. perfringens (células vegetativas y esporos).................................................................................... 136 Tabla 5.6. Recuentos de Enterococcus sp. (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 (λ: 290-800 nm) sobre la muestra natural. ............................................................................................. 141 Tabla 5.7. Recuentos de Enterococcus sp. (UFC·100mL -1 ) antes y después de los tratamientos de oscuridad, H 2 O 2 , TiO 2 y TiO 2 /H 2 O 2 sobre la muestra natural. ......................... 142 Tabla 5.8. Recuentos de Enterococcus sp. (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 sobre la muestra natural. λ: 320-800 nm.................................................................................................. 146 Tabla 5.9. Recuentos de Enterococcus sp. (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 sobre la muestra natural. λ: 320-800 nm.................................................................................................. 149 Tabla 5.10. Niveles de las variables en los tratamientos de radiación solar sobre Enterococcus sp..................................................................................................................................... 153 Tabla 5.11. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de irradiación (λ: 320800 nm)........................................................................................................................... 159 Tabla 5.12. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de fotocatálisis (λ: 320800 nm)........................................................................................................................... 159 Tabla 5.13. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de irradiación/H 2 O 2 (λ: 320-800 nm).................................................................................................................... 160 Tabla 5.14. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de fotocatálisis/H 2 O 2 (λ: 320-800 nm).............................................................................................................. 160 Índice de tablas xvii Tabla 5.15. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de Enterococcus sp. en los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 (λ: 290-800 nm)............................................. 162 Tabla 5.16. Coste de los agentes utilizados en los tratamientos de irradiación....................... 183 Tabla 5.17. Costes del tratamiento de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 para la inactivación de un 1 unidad logarítmica sobre C. perfringens (células y esporos) y Enterococcus sp....................................................... 184 Tabla 6.1. Resultados físico-químicos en el tratamiento de ozonización sobre la muestra natural (MN) y sintética (MS) de C. perfringens (células vegetativas). .................. 194 Tabla 6.2 Recuentos de células vegetativas de C. perfringens y condiciones del tratamiento de ozonización sobre la muestra natural (MN) y sintética (MS)................................. 195 Tabla 6.3. Resultados físico-químicos en el tratamiento de peroxona sobre la muestra natural (MN) y sintética (MS) de C. perfringens (células vegetativas)................................. 197 Tabla 6.4. Recuentos de células vegetativas de C. perfringens y condiciones del tratamiento de peroxona sobre la muestra natural (MN) y sintética (MS). [H 2 O 2 ]=0,04 mM....... 198 Tabla 6.5. Resultados físico-químicos en el tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural (MN) y sintética (MS) de C. perfringens (células vegetativas).200 Tabla 6.6. Recuentos de células vegetativas de C. perfringens y condiciones del tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural (MN) y sintética (MS). [TiO 2 ]=1 g L -1 .................................................................................................................. 201 Tabla 6.7. Niveles de las variables en los tratamientos de ozono sobre C. perfringens. .......... 203 Tabla 6.8. Niveles de las variables en los tratamientos de ozono sobre C. (H 2 O 2 en lugar de TiO 2 )................................................................................................................................ 205 Tabla 6.9. Resultados físico-químicos en el tratamiento de ozonización sobre la muestra natural de Enterococcus sp............................................................................................ 207 Tabla 6.10. Recuentos de Enterococcus sp. y condiciones del tratamiento de ozonización sobre la muestra natural......................................................................................................... 208 Tabla 6.11. Resultados físico-químicos en el tratamiento de peroxona sobre la muestra natural de Enterococcus sp............................................................................................ 209 Tabla 6.12. Recuentos de Enterococcus sp. y condiciones del tratamiento de peroxona sobre la muestra natural. [H 2 O 2 ]=0,04 mM. ............................................................................. 209 Tabla 6.13. Resultados físico-químicos en el tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural de Enterococcus sp. ....................................................................... 211 Índice de tablas . . xviii Tabla 6.14. Recuentos de Enterococcus sp. y condiciones del tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural. [TiO 2 ]= 1 g L -1 .................................................... 212 Tabla 6.15. Resultados físico-químicos en el tratamiento de O 3 /H 2 O 2 /TiO 2 sobre la muestra natural de Enterococcus sp. [H 2 O 2 ]=0,04mM. [TiO 2 ]=1 g L -1 ..................................... 213 Tabla 6.16. Recuentos de Enterococcus sp. y condiciones del tratamiento de ozono combinado con TiO 2 sobre la muestra natural. [H 2 O 2 ]=0,04mM. [TiO 2 ]=1 g L -1 . ...................... 213 Tabla 6.17. Niveles de las variables en los tratamientos de ozono sobre Enterococcus sp...... 214 Tabla 6.18. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las dos formas bacterianas de estudio en el tratamiento de ozonización........ 217 Tabla 6.19. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las dos formas bacterianas de estudio en el tratamiento de peroxona. ........... 218 Tabla 6.20. Parámetros cinéticos de los modelos matemáticos aplicados sobre la inactivación de las dos formas bacterianas de estudio en el tratamiento de O 3 /TiO 2 ................ 219 Tabla 6.21. Parámetros cinéticos del modelo de Hom, modelo bifásico y modelo de Mafart aplicados sobre la inactivación de Enterococcus sp. en el tratamiento de O 3 /TiO 2 /H 2 O 2 .................................................................................................................. 219 Tabla 6.22. Coste de los agentes utilizados en los tratamientos de ozonización..................... 230 Tabla 6.23. Costes del tratamiento de ozonización, peroxona, O 3 /TiO 2 y O 3 /TiO 2 /H 2 O 2 para la inactivación de una unidad logarítmica sobre C. perfringens (células vegetativas) y Enterococcus sp............................................................................................................... 231 Capítulo 1 Introducción y objetivos 7 Contribuciones a congresos y publicaciones con ISBN • “Effect of Advanced Oxidation Processes on Inactivation of C. perfringens with regard to Conventional Chlorination” presentada en el “First International Congress on Green Process Engineering”. Toulouse, 2007. • “Bactericidal Effectiveness of O 3 , O 3 /H 2 O 2 and O 3 /TiO 2 on Clostridium perfringens” presentada en el "2007 World Congress on Ozone and Ultraviolet Technologies”. Los Ángeles, 2007. Publicado en las Actas del Congreso, p. 14-1, 14-11. ISBN 0-9818837-02. • “Effectiveness of Four Types of Disinfectants on Clostridium perfringens Viability: NaClO, O 3 , O 3 /H 2 O 2 and O 3 /TiO 2 Comparison” presentada en el “International Conference & Exhibition. Sustainable Agri-Food Industry. Use of Ozone and Related Oxidants”. Valencia, 2007. Publicado en las Actas del Congreso, p. 6.2-1, 6.2-7. ISBN 978-2-9528298-5-4. • “Clostridium perfringens Inactivation in Natural Water by Photolysis and Photocatalysis combined with H 2 O 2 ” presentada en el “Ozone & Related Oxidants in: Advanced Treatment of Water for Human Health and Environment Protection”. Bruselas, 2008. Publicado en las Actas del Congreso, p. 6.2.2-1, 6.2.2-8. ISBN 978-29528298-6-1. • “Study of the Enterococcus sp. Recovery in Treated Water with TiO 2 /H 2 O 2 /sunlight” presentada en el “11th Mediterranean Congress of Chemical Engineering”. Barcelona, 2008. • “Procesos de oxidación avanzada basados en O 3 , TiO 2 y H 2 O 2 para la eliminación de Enterococcus sp. en aguas naturales” presentada en el “XI Congreso de Ingeniería Ambiental”. Bilbao, 2008. Publicado en las Actas del Congreso, p. 91,97. ISBN 978-84612-6011-9. • "Advanced disinfection with UV/VIS, TiO 2 and H 2 O 2 for Clostridium perfringens and Enterococcus sp. removal” presentada en el “ 5 th Internacional Conference/10 th IOA-EA 3 G Berlin Conference on Oxidation Technologies for Water and Wastewater Treatment”. Berlín, 2009. Publicado en las Actas del Congreso, p. 1,7. ISBN 978-3-89720-990-9 . Capítulo 2. Control de calidad de las aguas de abastecimiento Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 11 2.1. Contaminación microbiológica de las aguas 2.1.1. Gérmenes patógenos de transmisión hídrica Un microorganismo es un ser vivo tan pequeño que sólo puede ser visualizado mediante un aparato óptico, el microscopio. Son organismos dotados de individualidad que presentan una organización biológica elemental. Los microorganismos constituyen un grupo extraordinariamente heterogéneo de seres microscópicos integrado por bacterias, hongos, protozoos, algas microscópicas y virus (Tortora et al., 2007). Las bacterias, microorganismos objeto de estudio del presente trabajo de investigación, son organismos unicelulares con una estructura celular primitiva. Su tamaño es diverso en función de la especie variando desde 0,1-0,2 µm de ancho a 5-10 µm de largo, aunque hay bacterias grandes que alcanzan 0,5 mm de largo (Madigan et al., 2003). Sus formas también son variadas, lo que permite su identificación y clasificación. Algunas bacterias tienen la capacidad de formar esporos. El esporo es un elemento de protección frente a radiaciones, desecación, temperatura, altas presiones y frente a la entrada de sustancias químicas. El fenómeno de esporulación bacteriana está codificado a nivel genético y representa una etapa inactiva cuya durabilidad permite a la célula sobrevivir largos periodos de tiempo hasta que de nuevo encuentra un medio idóneo que le permita activarse de nuevo. Debido al gran número y diversidad de especies bacterianas, el bacteriólogo danés Christian Gram, en 1884, ideó una técnica de tinción diferencial como primer paso en la diferenciación bacteriana. De esta manera, se establecen dos grandes grupos bacteriológicos: las bacterias Grampositivas, que se visualizan de color azul-violeta y las bacterias Gramnegativas, cuyo color es rojo-rosáceo. Los fundamentos de esta técnica se basan en la diferencia estructural existente entre las paredes celulares de las bacterias Grampositivas y Gramnegativas, tal y como se observa en la Figura 2.1. La pared celular de las Grampositivas posee una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, principal componente de la pared, formado por finas láminas de dos derivados de azúcares, N-acetil-glucosamina y ácido Nacetilmurámico y un pequeño grupo de aminoácidos. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gramnegativas es delgada y se encuentra unida a una segunda Dpt o. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza . 12 membrana plasmática externa. Este peptidoglicano es la clave de la tinción de Gram, cuya técnica se desarrolla con detalle en el apartado 3.3.1.8 de la presente memoria. Figura 2.1. Composición estructural de la pared celular de una bacteria Grampositiva y una Gramnegativa (Gamazo et al., 2005). Los virus son macromoléculas de ácido nucleico (desoxirribonucleico (DNA) o ribonucleico (RNA)) rodeadas por una cubierta protectora proteica. Se consideran formas vivas sólo cuando infectan a una célula y adquieren la capacidad de reproducirse, atributo clave de los sistemas vivos. Su tamaño oscila desde 20 a 300 nanómetros, siendo necesaria microscopía electrónica para su visualización y estudio. Pueden atravesar filtros que permiten la retención de bacterias e infectar a personas, animales, plantas o incluso bacterias (bacteriófagos) (Madigan et al., 2003). Al contrario que las bacterias, los virus no están presentes en el ser humano de manera natural. Cuando las personas enferman por causa de un virus, generalmente se eliminan del cuerpo humano en grandes cantidades mediante las heces. Los protozoos son microorganismos unicelulares. La mayoría son de vida libre y pueden encontrarse en el agua de manera natural; sin embargo, varias especies son parásitas y viven de sus hospedadores. En condiciones difíciles se encuentran en forma de quistes o huevos. Los huevos de Cryptosporidium y quistes de Giardia son los más comunes en aguas con presencia de contaminación fecal. Ambos protozoos son muy persistentes en el medio ambiente y muy resistentes a los tratamientos convencionales de desinfección (Venczel et al., 1997; EPA, 1999). Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 13 El agua, por naturaleza, contiene sustancias nutritivas que permiten el desarrollo de estos microorganismos. Sin embargo, los requerimientos de nutrientes de cada microorganismo son diversos y también la forma de verse afectados por las condiciones del medio donde se hallen. El agua presente en la atmósfera, al caer en forma de precipitación (lluvia, nieve,…), arrastra partículas en suspensión y microorganismos presentes en el aire, así como en la superficie del suelo. El agua natural superficial, tanto dulce como salada, recoge microorganismos presentes en residuos urbanos e industriales, actividades ganaderas y agrícolas, etc. Las aguas subterráneas están menos contaminadas, puesto que los microorganismos se eliminan durante el proceso de filtración a través del terreno (Jay et al., 2005). La interconexión existente entre agua y suelo es la que facilita que diversas bacterias puedan coexistir entre ambos hábitats diferentes. En consecuencia, los microorganismos que se encuentran en el agua pueden ser autóctonos (propios del agua) y alóctonos (procedentes del suelo, aire, animales o del hombre). Los microorganismos habitualmente presentes en el agua tienen una temperatura media de crecimiento de 22 °C, mientras que los procedentes del intestino del hombre y otros animales crecen mejor a temperaturas entre 37 y 44 °C. Este factor es importante para su aislamiento en el laboratorio. La epidemia de cólera que tiene lugar en Londres en 1854 y que provoca la muerte de 10.000 personas, representa el primer caso constatado que permite asociar el origen de las enfermedades entéricas con la transmisión de agentes patógenos vehiculados por el agua (Bates, 2000). Desde entonces, se reconoce el medio hídrico como uno de los modos de vehiculación más frecuente de enfermedades. Cuando abandonan a su huésped, los microorganismos van perdiendo progresivamente su viabilidad y su carácter infeccioso. Esa pérdida es, en general, exponencial y transcurrido un cierto periodo, el patógeno deja de ser detectable. Aquellos que muestran una baja persistencia deben hallar rápidamente un nuevo huésped y es más probable que se difundan por contacto de persona a persona, debido a una insatisfactoria higiene personal o por manipulación de alimentos, que a través del agua de bebida. Por tanto, los patógenos más comunes en el medio hídrico son los que poseen un alto carácter infeccioso o son muy resistentes fuera del organismo. Los virus y los parásitos en fase inactiva (quistes, ooquistes, huevos) no pueden multiplicarse en el agua (OMS, 1995). Las enfermedades más conocidas de origen bacteriano, parasitario y vírico trasmitidas por el agua se incluyen en las Tablas 2.1, 2.2 y 2.3. Dpt o. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza . 14 Tabla 2.1. Enfermedades bacterianas de transmisión hídrica (EPA, 1999). Agente Enfermedad Síntomas Salmonella enterica subsp. enterica Fiebre tifoidea y paratifoidea Dolor de cabeza, pérdida de apetito, diarrea o estreñimiento, fiebre continuada Shigella spp. Disentería bacilar Diarrea, fiebre, tenesmos, heces mucosas y sanguinolentas Vibrio cholerae Cólera Diarrea, vómitos, sed, coma Francisella tularensis Tularemia Comienzo agudo con dolores y fiebre; postración Brucella melitensis Brucelosis Fiebre irregular, sudores, dolor en músculos Leptospira interrogans Leptospirosis Fiebre, dolores de cabeza, náuseas, vómitos, sed, postración Pseudomonas aeruginosa Infecciones de oído Otitis en bañistas de aguas contaminadas Escherichia coli Enteropatogénica Gastroenteritis Diarrea acuosa, náuseas, postración y deshidratación Tabla 2.2. Enfermedades parasitarias de transmisión hídrica (EPA, 1999). Agente Enfermedad Síntomas Entamoeba histolytica Disentería amebiana Diarrea alternante con constipación, disentería crónica con muco y sangre Giardia lamblia Giardiasis Diarrea intermitente Naegleria fowleri Meningoencefalitis Muerte Cryptosporidium parvum Criptosporidiosis Diarrea aguda, dolor abdominal, vómitos y fiebre baja Ascaris lumbricoides Ascariasis Vómitos, gusanos vivos en heces Tabla 2.3. Enfermedades víricas de transmisión hídrica (EPA, 1999). Grupo Subgrupo Cambios patológicos en pacientes Enterovirus Poliovirus Coxsackie-virus Echovirus Destrucción de motoneuronas, inflamación de las meninges, viremia y multiplicación viral, dilatación y ruptura de vasos sanguíneos Adenovirus Invasión viral de células de la mucosa, de nodos linfáticos, de células respiratorias Hepatitis Invasión de células del parénquima Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 15 Los agentes patógenos tienen diversas propiedades que los distinguen de otros contaminantes del agua de consumo, aspectos que hay que tener en cuenta al aplicar los tratamientos de desinfección (Pérez y Espigares, 1999): • Son componentes que no están disueltos en el agua. • Con frecuencia forman agregados o se adhieren a sólidos en suspensión presentes en el agua, lo que puede influir en la disminución de la efectividad de los tratamientos aplicados. • La probabilidad de que el ataque de un patógeno tenga éxito, derivando en infección, depende de su carácter invasivo y de la virulencia del patógeno, así como de la inmunidad de la persona expuesta. • Si la infección se asienta, los agentes patógenos se multiplican en el hospedador. Algunas bacterias también son capaces de proliferar en alimentos o bebidas, lo cual aumenta las posibilidades de infección. 2.1.2. Indicadores microbiológicos de contaminación fecal En el control de calidad de las aguas resulta imprescindible realizar un análisis bacteriológico, sobre todo si ésta va a ser destinada a agua de abastecimiento. La gran variedad de agentes nocivos que pueden encontrarse en una muestra de agua así como su baja concentración y la complejidad de la mayor parte de las técnicas de aislamiento y análisis y el elevado coste, hacen que el control frecuente de todos aquellos patógenos con importancia sanitaria sea una práctica poco factible. Por ello, la rutina de los análisis microbiológicos en el agua está basada en la detección de microorganismos asociados que comparten los mismos hábitat, pero cuya detección y aislamiento es más viable desde un punto de vista técnico y económico. Estos microorganismos se conocen como indicadores de contaminación fecal y se eligen de acuerdo a unos criterios (Borrego et al., 1990): • ser fáciles de aislar y cultivar en el laboratorio • estar presentes siempre que existan agentes patógenos entéricos • ser relativamente inocuos para el hombre • ser integrantes de la microbiota intestinal • no multiplicarse en aguas naturales generando un valor superior al real Dpt o. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza . 16 • mantener un grado de eliminación durante el tratamiento similar al de los patógenos Ningún microorganismo reúne todas estas propiedades, por lo que no existe un indicador ideal. Los indicadores que tradicionalmente se han utilizado y se siguen utilizando en la actualidad son indicadores bacterianos. En la Tabla 2.4 se incluyen las normas de la Organización Internacional de Normalización (ISO) para la detección y el recuento de bacterias indicadoras fecales en el agua y sus homólogas en España, editadas por la Asociación Española de Normalización y Certificación, adaptadas como normas UNE (AENOR, 1997). Recientes investigaciones están poniendo de manifiesto carencias en el proceso de evaluación de la calidad microbiana de las aguas para consumo humano en base a este tipo de indicadores bacterianos; se ha demostrado la presencia de virus, ooquistes y quistes de protozoos y esporos bacterianos en muestras de agua, en ausencia de los indicadores fecales (Gesche et al., 2003). En consecuencia, la presencia de estos indicadores en aguas indica contaminación fecal, pero su ausencia no garantiza necesariamente la calidad higiénica de ésta (Moriñigo et al., 1990). Hay científicos que defienden la necesidad de establecer otros indicadores complementarios como indicadores de aguas tratadas (Payment et al., 1985). Según el destino final al cual se dirige un tipo de agua, los indicadores bacterianos objeto de análisis van a ser diferentes. A continuación, se describen los indicadores más comúnmente analizados en el marco del control de la calidad de las aguas. El grupo de los coliformes lo constituyen bacterias Gramnegativas habituales de la región intestinal de mamíferos y aves. Se caracterizan por su capacidad de fermentación de lactosa a 35-37 °C. Géneros que forman parte de este grupo son Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter y Edwardsiella. Pueden existir como saprófitos independientes o como microorganismos intestinales, excepto el género Escherichia que sólo puede ser fecal. Por tanto, se pueden diferenciar los coliformes totales que comprenden todos los coliformes de cualquier origen y los coliformes fecales, que designan sólo a los coliformes de origen exclusivamente intestinal, con la capacidad adicional de fermentar la lactosa también a 44,5 °C. 23 Tabla 2.6. Normas de calidad microbiológica en aguas continentales, en función de su uso. (1) Cuando la determinación sea positiva y exista una turbidez mayor a 5 UNF se determinarán, en la salida de ETAP o depósito, si la autoridad sanitaria lo considera oportuno, Cryptosporidium u otros microorganismos o parásitos. Parámetros microbiológicos (UFC·100 mL-1) Calidad aguas prepotables Orden 11 Mayo 1988 Calidad aguas de baño continentales D 2006/7/CE Calidad aguas cría moluscos D 2006/113/CE Calidad aguas potables RD 140/2003 A1 A2 A3 Calidad Excelente Calidad buena Calidad suficiente Valor guía 50 5.000 50.000 Coliformes totales 37°C Coliformes fecales 20 2.000 20.000 300 en la carne de moluscos y en el líquido intervalvar Escherichia coli 500 1000 900 0 Bacterias coliformes 0 Estreptococos fecales 20 1.000 10.000 Enterococos 200 400 330 0 Salmonella spp. Ausencia en 5 L Ausencia en 1 L Recuento colonias 22°C - a la salida de ETAP -en red de distribución - 10.000 - sin cambios anómalos C. perfringens (incluidas las esporas) 0(1) Capítulo 2 Control de la calidad de las aguas de abastecimiento 24 Tabla 2.7. Normas de calidad microbiológica en aguas reutilizadas, en función de su uso. Real Decreto 1620/2007 Uso Nemátodos (huevos/10L) E. coli (UFC 100mL-1) Legionella spp. (UFC L-1) Salmonella spp. Taenia saginata Taenia solium 1. Urbano 1 0 (residencial) 200 (servicios) 100 2. Agrícola 1 100 (consumo fresco) 1.000 (consumo no fresco y acuicultura) 10.000 (árboles, flores) 1.000 (consumo fresco) No se fija (consumo no fresco y acuicultura) 100 (árboles, flores) Ausencia (consumo fresco) Ausencia (consumo no fresco y acuicultura) No se fija (árboles, flores) 1 huevo·L-1 (consumo animales productores carne) 3. Industrial 1 0 (torres refrigeración y conductos evaporación) 1.000 -10.000 (resto) 0 (torres refrigeración y conductos evaporación) 100 (resto usos) No se fija (torres refrigeración y conductos evaporación) Ausencia (proceso y limpieza industrias agroalimentarias) 4. Recreativo 1 200 (golf) 10.000 (estanques) 100 (golf) No se fija (resto usos) 5. Ambiental 1 0 (recarga directa acuíferos) 1.000 (recarga percolación acuíferos) Dpto. de Ingeniería Química y Tecnolo gías del Medio Ambietne Universidad de Zaragoza Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 25 2.2. Plantas de tratamiento de aguas para abastecimiento 2.2.1. Estación de tratamiento de aguas potables Hoy día es prácticamente inviable una aplicación directa de las aguas naturales sin tener que corregir previamente de las mismas uno o varios parámetros indicadores de calidad. Debido a la elevada cantidad de productos de deshecho que el hombre genera y vierte al cauce natural es necesario que el agua sea sometida a un proceso de potabilización previo a su uso para consumo humano. A modo de ejemplo, la Tabla 2.8 muestra una relación de microorganismos detectados en aguas del Canal Imperial de Aragón (punto de muestreo 0507 de la red de Control del Estado de las Masas de Agua Superficiales en la cuenca del Ebro), aguas prepotables antes de su entrada a la ETAP de Zaragoza (www.chebro.es). Tabla 2.8. Microorganismos presentes en aguas del Canal Imperial de Aragón antes de su entrada a la ETAP de Zaragoza. UFC· 100 mL -1 Agua de entrada ETAP Coliformes fecales 10 1 - 10 4 Coliformes totales a 37 °C 10 1 - 10 4 Escherichia coli 1 – 10 2 Estreptococos fecales 10 2 – 10 3 Salmonella (en 1L) 1 – 10 En consecuencia, el tratamiento de potabilización tiene un doble objetivo. Por un lado, la eliminación de microorganismos patógenos (desinfección) y por otro, la eliminación de contaminantes químicos nocivos, tanto de naturaleza orgánica como inorgánica. Estos procesos se llevan a cabo en instalaciones denominadas Estaciones de Tratamiento de Aguas Potables (ETAPs). La Orden del 11 de Mayo de 1988 establece el marco legislativo para los Estados miembros de la Unión Europea en materia de aguas naturales superficiales destinadas a la producción de agua potable. Define los tratamientos tipo que permiten la transformación de las aguas superficiales, previamente clasificadas en categorías A1, Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 26 A2 y A3, en aguas aptas para abastecimiento humano. Los tratamientos recomendados para cada una de las categorías se incluyen en la Tabla 2.9 y la Figura 2.2 esquematiza gráficamente cada una de las etapas y procesos que configuran cada uno de ellos. Tabla 2.9. Tratamiento recomendado para cada categoría de agua prepotable. Categoría Tratamiento Tipo A1 Tratamiento físico sencillo + desinfección Tipo A2 Tratamiento físico normal + tratamiento químico + desinfección Tipo A3 Tratamiento físico-químico intensivo, afino y desinfección Figura 2.2. (a) Línea de tratamiento simple para un agua bruta de calidad A1. (b) Línea de tratamiento normal para un agua bruta de calidad A2. (c 1 y c 2 ) Líneas de tratamiento intensivo para un agua bruta de calidad A3. Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 27 Las aguas superficiales que poseen características físicas, químicas y microbiológicas inferiores a los valores límites para someterse a un tratamiento tipo A3 no pueden utilizarse para la producción de agua potable. La primera barrera con la que se encuentra el agua al entrar en una potabilizadora es la etapa de desbaste. Su objetivo es eliminar el material de gran tamaño que arrastra consigo el agua (hojas, ramas,...) mediante un sistema de rejas y/o tamices. De este modo, se consigue proteger y aumentar la eficacia y operatividad de los elementos posteriores de la planta de tratamiento, evitando obstrucciones en canales, conducciones y tuberías. Después del desbaste grueso, el agua se deja reposar en tanques desarenadores en los cuales se asienta la arena fina y otras partículas pequeñas. A continuación, el agua pasa por una etapa de preoxidación donde se lleva a cabo la desinfección y la oxidación de la mayor parte de la materia orgánica que transporta. Otra de las finalidades que se persigue en esta etapa es oxidar las sustancias amoniacales presentes para evitar el crecimiento de algas en las instalaciones, así como el hierro y manganeso, favoreciendo su posterior precipitación. Este proceso se puede llevar a cabo en una sola etapa (sólo habría una desinfección final), en dos etapas (preoxidación y desinfección final) o en tres (preoxidación, oxidación intermedia y desinfección final) (Figura 2.2). El compuesto tradicionalmente empleado con fines de desinfección y oxidación es el cloro o derivados. Es fácil de usar y su coste es bajo. Sin embargo, cada vez es más la preocupación por los derivados organoclorados formados como resultado de la reacción del cloro con la materia orgánica presente en el agua (Rook, 1974). Los principales compuestos organoclorados son los trihalometanos, compuestos limitados en el efluente de salida de las potabilizadoras por el Real Decreto 140/2003 a una concentración de 100 µg L -1 , debido a su carácter cancerígeno. Sin embargo, en muchos países en vías de desarrollo, la desinfección con cloro está permitiendo reducir la prevalencia de enfermedades gastrointestinales (Sobsey et al., 2003). Con estos mismos fines existen otros productos químicos oxidantes que se pueden emplear como el ozono, el dióxido de cloro o las cloraminas. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 28 La siguiente etapa en la línea de tratamiento es la etapa de clarificación, donde cuatro operaciones (coagulación-floculación, decantación y filtración) se suceden con el objetivo de eliminar la materia en suspensión y coloidal del agua, ya que con un fenómeno de sedimentación por sí solo no sería posible. El proceso de coagulación-floculación consigue desestabilizar a los coloides mediante la adición de agentes coagulantes en el agua, cuyas cargas positivas neutralizan las cargas negativas de los coloides, rompiendo sus uniones y formando así flóculos de mayor peso que pueden sedimentar con mayor facilidad. La coagulación se favorece agitando fuertemente. El coagulante más utilizado en el tratamiento de las aguas potables es el sulfato de alúmina, Al 2 (SO 4 ) 3 , u otras sales de aluminio que neutralizan las cargas eléctricas de las partículas, reduciendo o anulando las fuerzas que tienden a mantenerlas separadas. El aluminio es poco soluble, no proporciona color ni sabor y no es tóxico al pH del agua potable. Tras la coagulación tiene lugar el proceso de floculación, en el que se da a las partículas desestabilizadas una mayor cohesión con objeto de que puedan aglomerarse, formar flóculos y sedimentar con más facilidad. La floculación se favorece agitando suavemente. Estos flóculos son eliminados posteriormente en una unidad denominada decantador, donde el proceso se ve favorecido dejando el agua en reposo. El agua libre de materia en suspensión pasa a la etapa siguiente mientras que los flóculos sedimentados permanecen en el fondo hasta ser retirados, pasando a constituir parte de los fangos. Los fangos depositados se purgan de manera intermitente y automática y se gestionan posteriormente como residuo. La filtración es el proceso que conduce a la obtención de un agua perfectamente clarificada, haciéndola pasar a través de un medio poroso. Su finalidad es la eliminación de partículas suspendidas, disueltas y coloidales, así como microorganismos que no han sido eliminados en los procesos previos. Para ello, el agua atraviesa un lecho de material granular inerte. Normalmente se utiliza arena silícea de talla efectiva 0,8 – 1 mm, colocada en un falso fondo perforado. Las alturas del lecho de arena varían entre 1 – 1,2 m y la altura del agua sobre el lecho suele ser del orden de 1 – 1,5 m. Una vez que el filtro se ha obturado de partículas, se procede a su Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 29 lavado mediante la inyección de agua a contracorriente o de una mezcla de aire y agua. El aire mueve la arena y el agua arrastra hacia arriba las partículas retenidas, haciendo que salgan del lecho de arena. La etapa de adsorción es una etapa de tratamiento físico que se utiliza principalmente con las aguas de categoría A3. Se basa en la propiedad que tienen algunos materiales sólidos de fijar en su superficie moléculas orgánicas. En el tratamiento de aguas se utiliza habitualmente como agente adsorbente carbón activo. El carbón se activa mediante técnicas químicas o térmicas aumentando su superficie específica, lo que le permite retener fácilmente partículas. En los tratamientos de potabilización, el carbón activo retiene los subproductos organoclorados formados en la preoxidación, aunque indirectamente se adsorben también moléculas de cloro e incluso, microorganismos. Por eso si se realiza esta etapa, es recomendable posteriormente contar con una etapa de oxidación intermedia o final con la finalidad de reforzar el fenómeno de desinfección. La regeneración del carbón, cuando ha perdido su eficacia debido a la gran cantidad de moléculas retenidas, se efectúa en hornos especiales de pirólisis. El agua, aunque después de ser tratada es normalmente de muy alta calidad, puede verse contaminada en el sistema de distribución por diversas razones. Para evitar que esto ocurra se incluye una etapa de desinfección final. Esta etapa tiene una importancia fundamental ya que constituye la última barrera contra la transmisión de enfermedades microbianas vehiculadas a través del agua. Impide el desarrollo de microorganismos patógenos a lo largo del sistema de distribución desde la planta hasta los puntos de consumo. El único agente, hoy por hoy, que asegura una desinfección residual a lo largo de todo el sistema es el cloro. El nivel de cloro libre residual máximo legislado en aguas de consumo humano es 1 mg Cl 2 L -1. Es importante que los sistemas de conducción del agua potable estén en perfectas condiciones de mantenimiento para que mantengan una presión positiva en todo momento. Si la presión de agua cae por cualquier motivo y hay conexiones defectuosas o fracturas en las tuberías de conducción, los contaminantes pueden ser aspirados hacia el interior del sistema de distribución. En estos casos, Payment (1999) demuestra que la mayoría de microorganismos resistentes a concentraciones residuales Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 30 de cloro, tales como bacterias esporuladas y virus, se muestran levemente afectados por el cloro residual hasta pasadas varias horas. 2.2.2. Estación de tratamiento de regeneración de aguas residuales depuradas Ante la creciente demanda de agua en España y la escasez de recursos hídricos que existe en la actualidad, la reutilización de aguas tratadas en Estaciones de Depuración de Aguas Residuales (EDARs) se plantea como una posible solución para incrementar los recursos existentes. Según establece la legislación vigente, se entiende por “aguas regeneradas” las aguas residuales depuradas que han sido sometidas a un proceso de tratamiento adicional o complementario que permite adecuar su calidad al uso al que se destinan. Estos tratamientos adicionales se llevan a cabo en instalaciones creadas para ese fin denominadas Estaciones Regeneradoras de Aguas Residuales Depuradas (ERARs). Las aguas residuales objeto de reutilización son aguas que deben cumplir con las especificaciones marcadas en la Directiva 91/271/CEE sobre el tratamiento de las aguas residuales urbanas, pero en las que todavía existen sustancias que pueden ser contaminantes. Se puede decir que en general, estas aguas se caracterizan por la presencia de gérmenes patógenos, sólidos en suspensión, elevada turbidez, presencia de materia orgánica e inorgánica. La Tabla 2.10 muestra una relación de microorganismos detectados en aguas de salida de depuradoras, así como su concentración habitual ( USEPA, 2004). Tabla 2.10. Microorganismos presentes en aguas residuales urbanas, antes y después del tratamiento de depuración. Organismos · 100 mL -1 Agua residual antes EDAR Agua residual después EDAR Coliformes fecales 10 4 - 10 5 5·10 3 - 10 4 Enterococos 10 4 - 10 5 2·10 3 - 5·10 3 Virus entéricos 10 3 20 - 650 Giardia 0,5 – 10 4 5 - 2,3·10 3 Ooquistes Cryptosporidium 0,2 – 10 3 150 Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 31 En general, el agua que va a ser reutilizada, si no es sometida a un tratamiento adecuado puede presentar un riesgo sanitario y ambiental y generar problemas de ensuciamiento, corrosión, incrustaciones, obturaciones y crecimiento bacteriano (biofilm) en las instalaciones receptoras. Actualmente, las tecnologías de tratamiento que se aplican en este campo son muy variadas. El tratamiento mínimo necesario dependerá de la calidad y origen del agua bruta así como del destino y características del agua a tratar. Un esquema de tratamiento de regeneración no difiere en gran medida del que podría representar una planta potabilizadora de agua natural (ver Tabla 2.9 y Tabla 2.11). Tabla 2.11. Posibles tratamientos de regeneración en función del uso destinado. Grado Tratamiento Simple Tratamiento físico sencillo + desinfección Normal Tratamiento físico-químico + desinfección Intensivo Tratamiento físico-químico intensivo + desinfección+ etapa adicional El tratamiento más simple puede incluir un sistema de filtración convencional y una posterior desinfección (Figura 2.3). Este sistema elimina parcialmente los sólidos en suspensión presentes y la contaminación microbiológica. La filtración puede tener lugar en un lecho de arena o mediante filtros de malla metálica. Como mecanismo de desinfección en regeneración de aguas es muy utilizada la luz ultravioleta. Sin embargo, la utilización de luz ultravioleta presenta ciertos inconvenientes. Por un lado, si el agua todavía contiene cierta concentración de sólidos, éstos pueden interferir en el proceso de desinfección al crear campos de sombra sobre los cuales la luz UV no actúa, reduciéndose considerablemente su poder desinfectante. Por otro lado, las lámparas son sensibles al ensuciamiento, con lo que su mantenimiento y limpieza debe ser continuo para garantizar una eficiencia. Por último, dado que la luz UV no tiene carácter residual, durante el proceso de almacenamiento del agua tratada podría tener lugar un recrecimiento de los microorganismos. En este sentido, una postcloración garantiza el mantenimiento de su calidad durante el almacenamiento. Esta cloración Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 32 debe ser realizada al final del tratamiento puesto que de esta forma se minimiza la formación de subproductos organoclorados, considerados componentes peligrosos por la legislación vigente. Se puede obtener agua de más calidad si al tratamiento anterior se le añade un proceso de precipitación química (coagulación, floculación y decantación). Una precipitación química previa mediante la adición de coagulantes como sales de hierro, aumenta considerablemente el rendimiento de eliminación de sólidos en suspensión. Finalmente, un tratamiento intensivo puede agregar a las etapas anteriores filtraciones más precisas mediante membranas de diferente poro, en función de la calidad a obtener, o un fenómeno de saturación de oxígeno si el efluente se quiere devolver al cauce o dirigirlo a fines de riego o conservación de humedales (Ormad y Calvo, 2010; MARM, 2010). Las tecnologías de membrana son básicamente procesos de separación; en tratamientos de agua se utilizan principalmente como procesos de desmineralización. Se basan en membranas semipermeables con microporos de tamaño diverso en función del tipo de sustancia a retener. Así surge la microfiltración y ultrafiltración para retirar partículas más grandes y la ósmosis inversa y la nanofiltración para desalinizar el agua (Spellman y Drinan, 2000). Figura 2.3. Diferentes esquemas de tratamiento de regeneración en ERARs. Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 39 neutro, ambos mecanismos de reacción pueden coexistir. Por vía directa actúa a través del ozono molecular, siendo favorecida por pH bajos y por la presencia de “secuestradores” (scavengers) de radicales como iones carbonatos y bicarbonatos (Hunt y Mariñas, 1999; Cho et al., 2003). Mientras que si actúa por vía indirecta, lo hace mediante entidades radicalarias formadas en la descomposición del ozono (Hoigné y Bader, 1983). Con objeto de favorecer el mecanismo radicalario del ozono, se pueden añadir sustancias como el peróxido de hidrógeno, radiación UV y catalizadores metálicos (Oppenländer, 2003). Esta vía indirecta forma parte de los Procesos de Oxidación Avanzada y se describe más en detalle en el apartado 2.4.2 del presente capítulo. A nivel estructural, el ozono ataca en primer lugar la superficie celular al reaccionar con los componentes que forman la pared bacteriana. Esta acción deriva en la peroxidación de lípidos y cambios en la permeabilidad de la membrana celular. Hasta que estas reacciones no son completadas, la penetración al interior del citoplasma celular y la reacción directa con los componentes intracelulares están limitadas (Cho et al., 2010). Está bien establecido que la sensibilidad de los microorganismos al ozono se ve afectada por la materia orgánica y los parámetros físico-químicos del agua (Bezirtzoglou et al., 1997). Estudios de investigación sobre la efectividad microbicida del ozono señalan que las formas vegetativas de las bacterias son las más sensibles a la acción del ozono, seguidas por los virus y esporos bacterianos y finalmente, los quistes y ooquistes de protozoos (EPA, 1999). 2.3.5. Radiación solar La radiación solar es un conjunto de radiaciones electromagnéticas emitidas por el sol, que comprenden desde el infrarrojo hasta el ultravioleta (Figura 2.4). Dentro de este intervalo, el rango ultravioleta (UV) presenta las mejores propiedades de desinfección (McGuigan et al., 1998; Robertson et al., 2005). Pero de toda la radiación solar que llega la superficie terrestre, menos del 10 % es luz UV (200-400nm) (Blanco et al., 2009). Dentro del espectro UV, el rango UVC y parte del UVB es absorbido por la capa de ozono, por lo que el rango UVA representa el principal fragmento de la radiación solar ultravioleta que llega a la superficie terrestre (Byrne et al., 2011). Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 40 Figura 2.4. Espectro de la radiación UV/VIS. La desinfección de agua mediante radiación UV se empezó a utilizar desde principios del siglo XX, aunque debido a su elevado coste y a dificultades técnicas esta tecnología no fue inicialmente competitiva en comparación con los desinfectantes químicos. Sin embargo, hoy día la desinfección con radiación UV se está utilizando en la regeneración de aguas residuales, pues esta tecnología no genera organoclorados e inactiva de manera muy eficaz patógenos como bacterias, esporos, virus e incluso protozoos resistentes como Cryptosporidium y Giardia (Chang et al., 1985; Ormad y Calvo, 2010). Actualmente, muchos estudios catalíticos se realizan con la luz solar como fuente de radiación UV, bien procedente de lámparas simuladoras de luz solar (Rincón y Pulgarin, 2003; Gumy et al., 2006; Ibarz, 2008; Miguel, 2010), bien mediante colectores solares concentrados (Maldonado, 2000; McLoughlin et al., 2004; Fernández, 2003; Fernández et al., 2005), ya que representan una fuente de luz más barata y de más fácil acceso. Los mecanismos de desinfección de la radiación solar se basan en la combinación de un fenómeno de calentamiento del agua combinado con la acción fotolítica directa, que además de alterar los componentes moleculares esenciales en sus funciones vitales, activan sustancias fotosensibles presentes en el agua, las cuales reaccionan con oxígeno produciendo especies reactivas con un elevado poder desinfectante (Blanco et al., 2009). Dentro del espectro solar, los componentes que más afectan a la viabilidad de los microorganismos son el rango UVB, UVA y el rango visible. El rango UVB (280-315 Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 41 nm) indice directamente sobre el material genético de la célula llegando a impedir su replicación, mientras que el rango UVA (315-400 nm) y visible (400-780 nm) van a participar en la activación de otros agentes presentes, como los catalizadores y componentes oxidantes, influyendo en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Rincón y Pulgarin, 2004b; Robertson et al., 2005). Esta tecnología presenta numerosas ventajas por ser un método sencillo de utilizar y mantener, ser útil en tiempos cortos de contacto, no generar residuos tóxicos o subproductos y no tener ningún efecto en el gusto y el olor del agua. Sin embargo, este mecanismo sólo puede utilizarse como desinfectante primario por no poseer efecto residual, al ser un desinfectante físico. La efectividad de la radiación UV de cara a la desinfección depende de la dosis absorbida por los microorganismos, en función de la intensidad de la lámpara utilizada y el tiempo de exposición. Si la dosis no es suficiente, el materia genético puede verse dañado pero no destruido, lo que permitirá el recrecimiento bacteriano una vez que el tratamiento haya cesado (Rincón y Pulgarin, 2004a, 2007). Las bacterias contienen complejos sistemas enzimáticos de reparación del ADN dañado por la luz UV llamados sistemas reguladores SOS. Entre estos mecanismos se encuentra la fotorreactivación, activado por la luz visible, que implica entre otras la actuación de la enzima fotoliasa y el mecanismo de reparación en oscuridad, estimulado en ausencia de luz (Gamazo et al., 2005). Hay que tener en cuenta los factores que pueden reducir la eficiencia de este tratamiento como son la presencia de biofilms sobre la superficie de las lámparas UV, la turbidez y color del agua, la concentración de compuestos orgánicos e inorgánicos disueltos como el hierro, calcio o fenoles, que pueden proteger a las bacterias de la radiación o producir la dispersión de la luz y finalmente, la formación de agregados de microorganismos que pueden dispersar la radiación e impedir su exposición a la luz germicida. La Figura 2.5 resume estas situaciones. En países en desarrollo, esta técnica se aplica con el nombre de SODIS (solar disinfection). Se ha comprobado que es un tratamiento efectivo en los hogares que carecen de agua potable, siendo práctico y barato. A través del efecto combinado del calentamiento y la radiación UVA solar, los microorganismos patógenos presentes en Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 42 el agua almacenada en botellas de politereftalato de etileno (PET) son inactivados en 6 horas después de la exposición a la luz solar (Malato et al., 2009; Byrne et al., 2011). Figura 2.5. Interacciones entre partículas y bacterias, que pueden influir en la desinfección con radiación UV (Ibarz, 2008). 2.4. Procesos de oxidación avanzada 2.4.1. Generalidades Los procesos de oxidación avanzada (POAs) nacen como consecuencia de las limitaciones detectadas en la aplicación de los desinfectantes convencionales. Con el término POA se agrupa a un conjunto de procesos que son capaces de generar especies reactivas de oxígeno (ROS), especies transitorias con alto poder oxidante y de ataque poco selectivo, que degradan la mayor parte de los compuestos orgánicos (incluso lo más persistentes) hasta conseguir su total mineralización o la formación de compuestos intermedios que son más biodegradables que los primeros (Glaze et al., 1987; Peyton y Glaze, 1988; Maness et al., 1999). Las principales ROS generadas por estos procesos son los radicales hidroxilo (OH • ), los radicales Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 43 superóxido (O 2•¯ ), los radicales hidroperóxido (HO 2• ) y moléculas de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). Entre los ROS, los radicales hidroxilo son los oxidantes más potentes con un potencial de oxidación de 2,80 V, muy superior al de otros oxidantes tradicionalmente utilizados en tratamientos de agua como son el cloro, dióxido de cloro o el ozono. Su vida media es muy corta, pero suficiente como para poner de manifiesto su carácter oxidante y promocionar reacciones en cadena que dan lugar a otras especies radicalarias libres. La principal desventaja de estos procesos es su elevado coste. Hay una gran variedad de POAs, pero a continuación se desarrollan con más profundidad aquellos que son objeto de investigación en el presente trabajo. 2.4.2. Ozonización a alto pH El ozono, en medio acuoso y bajo determinadas condiciones de operación como pH elevado, exposición a la luz ultravioleta o presencia de peróxido de hidrógeno, es capaz de generar ROS a través de lo que se conoce como “reacciones por vía indirecta” (Hoignéy Bader, 1977). Estas reacciones se traducen en la producción de radicales libres hidroxilo por descomposición del ozono (Hoigné y Bader, 1983). Este mecanismo radicalario se describe a continuación [ecuaciones 2.3-2.9] (Tomiyasu et al., 1985; Andreozzi et al., 1999):  Etapa de iniciación: O 3 + OH -  HO 2- + O 2 [2.3] O 3 + HO 2-  HO 2• + O 3•- [2.4] HO 2•  O 2•- + H + [2.5] Los iniciadores son compuestos capaces de inducir la formación del ión radical superóxido (O 2 •- ) a partir de una molécula de ozono. Estos compuestos pueden ser inorgánicos como iones hidroxilo (OH - ), radicales hidroperóxido (HO 2 - ) y algunos cationes, o bien orgánicos como el ácido glioxálico, ácido fórmico o sustancias húmicas. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 44  Etapa de propagación: O 2•- + O 3 + H +  2O 2 + OH • [2.6] OH • + O 3  H + + O 2•- + O 2 [2.7] Los propagadores de las reacciones en cadena por radicales son todas las moléculas orgánicas e inorgánicas capaces de regenerar el ión radical superóxido (O 2•- ) a partir de un radical hidroxilo (OH • ). En esta fase los radiacles OH • se forman y son consumidos por la molécula de ozono. Los promotores orgánicos más comunes son los compuestos que incluyen grupos arilo, ácido fórmico, ácido glioxálico, alcoholes primarios y ácidos húmicos.  Etapa de terminación: Comprende todas las reacciones que conducen a una ruptura de la cadena de reacciones. OH • + OH •  H 2 O 2 [2.8] HO 2• + O 2•-  HO 2- + O 2 [2.9] Los inhibidores son compuestos capaces de consumir radicales hidroxilo (OH • ) sin regenerar el anión superóxido (O 2•- ). Los inhibidores más comunes son los iones carbonato y bicarbonato, los grupos alquilo, alcoholes terciarios y sustancias húmicas. No se conoce todavía demasiado bien cuál es el verdadero mecanismo de la inactivación de los microorganismos mediante el ozono. Algunos investigadores creen que la desinfección con ozono es resultado de la reacción directa molecular (Hoigné y Bader, 1975, 1978; Finch et al., 1992; Labatiuk et al., 1994; Hunt y Mariñas, 1999) mientras que otros defienden el mecanismo indirecto como el más importante en la desinfección (Bancroft., 1984; Cho et al., 2003). El mecanismo de ataque de los radicales OH sobre los microorganismos se traduce en una oxidación de los componentes estructurales de la pared y membrana celular, similar a como actúa el ozono (Maness et al., 1999; Huang et al., 2000). Los radicales OH pueden ser más nocivos sobre los componentes de la superficie celular que el ozono ya que su potencial de oxidación (2,70 V) es superior al del ozono Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 45 molecular (2,07 V) y pueden reaccionar no selectivamente con los componentes de la estructura externa de la célula, que en ocasiones se resisten a la acción del ozono (Cho y Joon, 2006). 2.4.3. Sistema peroxona (O 3 /H 2 O 2 ) El oxidante más comúnmente utilizado en combinación con el ozono es el peróxido de hidrógeno. Esta combinación se denomina sistema peroxona. El peróxido de hidrógeno es un importante iniciador del mecanismo radicalario del ozono, favoreciendo el proceso de ozonización (Glaze et al., 1987; Staehelin y Hoigné, 1982). Cuando el peróxido está presente, una parte de éste se disocia en radicales hidroperóxido (HO 2- ), que tienen una mayor habilidad de iniciación que los iones hidroxilo, acelerando la descomposición de las moléculas de ozono mediante una serie de reacciones en cadena, tal y como se describen en las ecuaciones 2.10-2.17 (Andreozzi et al., 1999). H 2 O 2  HO 2- + H + [2.10] HO - + O 3  O 2 + HO 2- [2.11] HO 2- + O 3  HO 2• + O 3•- [2.12] HO 2•  H + + O 2•- [2.13] O 2•- + O 3  O 2 + O 3•- [2.14] O 3•- + H +  HO 3• [2.15] HO 3•  HO • + O 2 [2.16] HO • + O 3  HO 2• + O 2 [2.17] El H 2 O 2 además de participar activamente en las reacciones con el ozono, también reacciona con los radicales hidroxilo, tal como indican las reacciones 2.18 y 2.19. H 2 O 2 + OH •  H 2 O + HO 2• [2.18] 2 HO 2•  H 2 O 2 + O 2 [2.19] En el sistema peroxona, el ozono residual tiene un periodo corto de vida porque el peróxido añadido acelera en gran medida la descomposición del ozono. Cho y Yoon Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 46 (2006) recomiendan este sistema cuando el ozono por sí mismo tiene dificultad en la inactivación de patógenos bajo ciertas condiciones, especialmente a bajas temperaturas. También existen estudios que indican que son necesarios largos tiempos de contacto y altas concentraciones de peróxido de hidrógeno para inactivar virus y bacterias (EPA, 1999). Wolf (1989) establece que la efectividad microbicida de la peroxona depende en gran medida de varios factores, entre los que destacan la relación H 2 O 2 /O 3 , la dosis de ozono aplicada, la concentración de ozono residual, el tiempo de contacto, la calidad del agua y el tipo de microorganismo estudiado. Destaca la importancia de optimizar la relación H 2 O 2 /O 3 , porque si se añade una elevada dosis de peróxido de hidrógeno al sistema, se puede reducir la concentración de ozono residual en la muestra además de favorecer el secuestro de radicales hidroxilo libres, en detrimento de la actividad desinfectante del proceso. 2.4.4. Ozonización catalítica Otras sustancias que pueden favorecer el mecanismo radicalario del ozono son los catalizadores metálicos. Se utilizan óxidos de metales de transición en fase sólida que muestran una alta actividad catalítica (MnO 2 , TiO 2 , Al 2 O 3 ) (Gracia et al., 1999; Oppenländer, 2003). Entre ellos, el dióxido de titanio presenta la ventaja de no producir disolución de titanio en el agua ozonizada, ya que con un pH mayor que 6, el titanio que se disuelve está por debajo del límite de detección (Paillard et al., 1991). Gracia (1999) establece que en la ozonización catalítica se producen dos efectos simultáneamente. Por un lado tiene lugar una ozonización de los compuestos disueltos mediante la acción directa del ozono molecular y el ataque indirecto de las especies radicalarias generadas por la descomposición del ozono, y por otro se produce la ozonización de los compuestos adsorbidos en la superficie del catalizador, desarrollándose efectos simultáneos de ozonización y catálisis. Logemann y Annee (1997) defienden que los fenómenos superficiales en el catalizador durante los procesos de oxidación catalítica son importantes para que se produzca con éxito la desinfección. Para ello, establecen tres acciones: - En primer lugar se produce la adsorción simultánea del ozono y la materia orgánica o los subproductos de ozonización en la superficie del catalizador. Capítulo 2 Control de calidad de las aguas de abastecimiento 47 - Segundo, se produce la descomposición del ozono en los puntos activos del catalizador, generándose especies radicalarias más reactivas que el propio ozono. Estas especies oxidan los compuestos adsorbidos. - Tercero, los productos finales de la oxidación son desorbidos, pues su afinidad con el catalizador es menor. Las propiedades químicas de los catalizadores se deben a la existencia de centros activos en su superficie. En el caso concreto del dióxido de titanio, contiene sitios ácidos de Lewis. En medio acuoso, este catalizador es capaz de intercambiar cationes o aniones, generándose una carga positiva o negativa en su superficie, en función del pH de la disolución (Rincón y Pulgarin, 2004c; Miguel, 2010). El proceso de ozonización catalítica requiere menos dosificación de ozono y se ve menos afectado por atrapadores o “scavengers” de radicales presentes de manera natural en el agua, como los hidrogenocarbonatos. Actualmente, no existen prácticamente estudios de investigación relativos a la aplicación del proceso O 3 /TiO 2 en desinfección de aguas. 2.4.5. Fotocatálisis En procesos de fotocatálisis la generación de ROS tiene lugar por combinación de un catalizador y luz. Desde que en 1985, Matsunaga y su equipo propusieran un nuevo concepto de esterilización fotoquímica del agua, numerosos trabajos de investigación avalan la efectividad de los procesos fotocatalíticos en la eliminación de compuestos altamente persistentes en agua como los pesticidas utilizados en la agricultura (Ormad et al, 2010; Miguel, 2010), antibióticos y otros fármacos (Elmolla y Chaudhuri, 2009, 2010) y microorganismos presentes en agua (Blake et al., 1999; Rincón y Pulgarin 2003, 2007; Chong et al., 2010). El catalizador semiconductor más estudiado en la actualidad en los tratamientos de radiación solar es el dióxido de titanio por sus características de alta fotoactividad, bajo coste, estabilidad química y biológica e inocuidad (Mills et al., 1993), características que han hecho que haya sido elegido para la realización de este trabajo. El dióxido de titanio presenta dos zonas electrónicas, la banda de valencia y la banda de conducción, caracterizadas por una alta y una baja densidad de electrones respectivamente. La diferencia de energía entre ambos niveles se denomina salto de Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 48 energía. Cuando el catalizador es irradiado con luz UV (λ<385 nm) equivalente al salto de energía, los electrones de la banda de valencia se excitan pasando a la banda de conducción, dejando su respectivo hueco en la banda de valencia. Como consecuencia de esa activación, se generan en la superficie del catalizador estructuras duales electrón (e - )/ hueco (h + ) (Figura 2.6) [Ecuación 2.20]. A partir de estas estructuras cargadas, se inician reacciones de oxidación y reducción en su superficie. También se puede producir una recombinación de los pares e - -h + , por lo que es necesario que exista un oxidante que actúe como aceptor de electrones. Generalmente, las moléculas de oxígeno presentes en el agua reaccionan con estos electrones generando radicales superóxido (O 2 • ¯ ), especies oxidantes intermedias [2.21]. Los huecos, a su vez, reaccionan con moléculas de agua e iones hidroxilo generando radicales hidroxilo [2.22 y 2.23]. Estas especies reactivas de oxígeno (ROS) primarias darán lugar posteriormente a ROS secundarias como los radicales peróxido y moléculas de peróxido de hidrógeno [2.24 - 2.26]. Figura 2.6. Mecanismo de activación fotoinducida del dióxido de titanio con la presencia de microorganismos (M) (Oppenländer, 2003). TiO 2 + hν  TiO 2 (e ¯ + h + ) [2.20] e ¯ + O 2 (ad)  O 2 • ¯ [2.21] h + + H 2 O (ad)  · OH [2.22] h + + OH ¯ (ad)  · OH [2.23] Capítulo 3. Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 57 3.1. Parámetros de caracterización de TiO 2 El TiO 2 utilizado en este trabajo de investigación se caracteriza mediante su superficie específica y su estructura. 3.1.1. Superficie específica La determinación del área superficial del catalizador se realiza con el método Brunauer-Emmet-Teller (BET). El método BET se utiliza para determinar la superficie específica (S e ) a partir de la medida de la adsorción de un gas a baja temperatura. Se usa un equipo de la marca Micromeritics Instruments Co., modelo Pulse Chemisorb 2700, con una unidad de control y medida de caudal másico para las corrientes de N 2 y He. Está provisto de una unidad adicional para la preparación de muestras (Desorb 2300 A) de la misma marca. Para la determinación de la isoterma de adsorción de N 2 a 77 °K se emplea la técnica multipunto, determinando el volumen adsorbido en el intervalo de presiones parciales de adsorbato comprendidas entre el 5 y el 20 %. Para calcular el área BET, se toma un valor de 0,162 nm para la sección de la molécula de N 2 y una presión de saturación de éste de 775 mm Hg. Previamente, se realiza una limpieza de la superficie de las muestras para que toda su textura quede perfectamente accesible a las moléculas de N 2 . La isoterma BET se linealiza de acuerdo a la ecuación 3.1, donde Ps es la presión normal del adsorbato, V N2 el volumen absorbido en condiciones normales de presión y temperatura, Ps 0 la presión de saturación de N 2 a 77 °K, V N2,m el volumen de N 2 absorbido necesario para formar una monocapa en la superficie de la muestra, J la constante relacionada con la energía de adsorción y C a una constante relacionada con la energía de adsorción del sólido.         − += − 02202 11 Ps Ps CV J CVPsPsV Ps amNamNN ,, )( [3.1] La S e del sólido (m 2 g -1 ) se obtiene según la ecuación 3.2, donde V m es el volumen de N 2 requerido para formar la monocapa, A el número de Avogadro, N N2 la sección de la molécula de N 2 y M el volumen molar del gas. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 58 M NAV S Nm e 2 ⋅ ⋅ = [3.2] 3.1.2. Caracterización estructural Para determinar la estructura de las fases cristalinas del catalizador se utiliza la metodología de difracción de rayos X (DRX). Los espectros de difracción se obtienen en un difractómetro de la marca Rygaku/Maz system, provisto de un ánodo rotatorio. Se utiliza un monocromador de grafito con el fin de seleccionar la radiación CuKα del ánodo de cobre (λ= 1,5418 A) y se trabaja con un ángulo de barrido (2θ) entre 20 y 75 °, con un paso de 0,03 y tiempo de 1 sg por paso. 3.2. Parámetros de caracterización físico-química de aguas 3.2.1. Demanda de cloro La demanda de cloro (CD) se define como la cantidad mínima de cloro que se necesita añadir a la muestra para satisfacer el consumo tras la desinfección y oxidación de los compuestos presentes. Para determinar este parámetro se utiliza el método estándar 5710 B (Eaton et al., 2005). El método consiste en adicionar un exceso de cloro (D 0 ) a la muestra y analizar el cloro residual (R) no consumido después de un mínimo de 4 horas, siendo la diferencia de ambos valores en mg L -1 , como indica la ecuación 3.3. RDCD − = 0 [3.3] Para determinar D 0 se añaden 5 mL de hipoclorito sódico comercial de 50 000 mg Cl 2 L -1 diluido al 10% en un frasco con tapón de vidrio y se completa hasta rebose con agua destilada. Del contenido de este frasco se valoran 100 mL en un erlenmeyer con tiosulfato sódico 0,025 N (Na 2 SO 4 5-hidrato, Panreac), incluyendo en el contenido 5 mL de ácido acético (80%, Panreac), 1 g de ioduro potásico (Carlo Erba) y 2 mL de almidón (Scharlau) como indicador hasta la desaparición del color. La dosis de cloro Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 59 exacta suministrada a la muestra se calcula según la ecuación 3.4, donde V v es el volumen del agente valorante (tiosulfato sódico) consumido en la valoración, N es la normalidad del mismo (0,025 N) y V m es el volumen de muestra valorado (100 mL). 1 1 20 1000535 − − ⋅⋅⋅⋅= mv VNVLClmgD ,)( [3.4] De manera similar, para calcular R, en un frasco de las mismas características se añaden 5 mL de hipoclorito sódico comercial diluido al 10% y 5 mL de tampón fosfato I (68,1 g KH 2 PO 4 y 11,7 g NaOH en 1L de agua destilada), completando el volumen con la muestra objeto de análisis. Se almacena durante mínimo 4 horas a temperatura ambiente en oscuridad con el tapón sellado herméticamente para evitar pérdidas de cloro por volatilidad. Trascurrido ese tiempo, en el cual el cloro reacciona con la materia orgánica presente en la muestra, se mide el cloro residual de la misma manera que para D 0 . 3.2.2. Temperatura, pH, conductividad, turbidez, carbono orgánico total, absorbancia, Cl 2 libre, H 2 O 2 y O 3 residual La Tabla 3.1 muestra la metodología normalizada de análisis de los parámetros físico-químicos utilizados en la caracterización de las muestras analizadas durante los tratamientos estudiados, así como la instrumentación relacionada, el rango de medida y el error de dicha instrumentación. 60 Tabla 3.1. Instrumentación, metodología, rango de medida y error de cada uno de los instrumentos para la caracterización físico-química de las muestras. 1 Eaton et al., 2005 Parámetro Instrumento Marca Modelo Rango medida Error Método Normalizado pH Temperatura pH-metro Crison GLP 21 2 a 16 -20 a 150 °C ≤ 0,02 ≤ 0,3 °C Método estándar 1 4500HB Conductividad Conductímetro Crison Basic 30 0,01 a 19.999 µs cm -1 ≤ 0,5 µs cm -1 Norma UNE 27888:1994 Turbidez Turbidímetro Hanna LP 2000 00 a 50 NTU 50 a 1.000 NTU 0,2 NTU Norma ISO 7027: 1999 Carbono orgánico total Analizador de TOC Shimadzu TOC-Vcsh TC:0 a 25.000 mg L -1 IC: 0 a 30.000 mg L -1 5-10 % Método estándar 1 5310 B Absorbancia Espectrofotómetro UV/Visible Thermospectronic Heλios α -3 a 6 A ± 0,005 A Cloro libre residual Medidor de cloro Hanna Instruments HI 95711 0,00 a 5,00 mg L -1 ≤ 0,02 mg L -1 Método estándar 1 4500-Cl G Peróxido de hidrógeno residual Test indicador de peróxidos (tiras reactivas) Merck Merckoquant® 0,5 a 25 mg L -1 Ozono residual Test colorimétrico Merck Microquant® 0,05 a 4,00 mg L -1 ± 0,1 mg L -1 Dpto. Ingeniería y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 61 3.3. Parámetros de análisis microbiológicos Los indicadores bacterianos de contaminación fecal objeto de estudio en el presente trabajo de investigación son Clostridium perfringens (células vegetativas y esporos) y Enterococcus sp. 3.3.1. Análisis de C. perfringens 3.3.1.1. Procedimiento normalizado El cultivo y recuento de células vegetativas y esporos de C. perfringens se realiza siguiendo el procedimiento descrito en la Norma Española UNE-EN 26461-2: “Calidad del agua. Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia). Parte 2: Método de filtración por membrana.” Esta norma UNE ha sido adoptada íntegramente de la Norma Internacional ISO 6461-2:1986. 3.3.1.2. Medios de cultivo Los productos químicos que se utilizan en la preparación de los medios de cultivo son de calidad analítica reconocida. El material de vidrio, antes de su uso, se esteriliza en el autoclave mediante calor húmedo durante 15 minutos a una temperatura de 121 °C para eliminar cualquier microorganismo o forma esporulada de resistencia y trabajar en condiciones estériles. Los medios de cultivo son ambientes artificiales diseñados por el hombre para proporcionar todos los nutrientes necesarios para el crecimiento microbiano en el laboratorio. En función del tipo de medio, se encuentran en estado líquido, sólido o semisólido. Los medios sólidos, que son los que se utilizan en esta investigación, se presentan de manera diversa, pero la forma más común es desecada en forma de polvo fino o granular. Para su reconstitución, se suspende la cantidad precisa de polvo en agua destilada y se lleva a ebullición. Posteriormente, se esteriliza durante 15 minutos a una temperatura de 121 °C en el autoclave. Tras finalizar el proceso de autoclavado, los frascos con el agar líquido se colocan en el baño termostático a 50 °C y se mantienen hasta su utilización. Si el medio de cultivo preparado no se utiliza inmediatamente, se guarda refrigerado y etiquetado durante un periodo no superior a un mes. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 62 Para C. perfringens existen comercialmente una gran variedad de medios selectivos disponibles entre los que se encuentran el agar TSN (Triptona Sulfito Neomicina), el agar SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina), el agar TSC (Triptosa Sulfito Cicloserina), el agar TSCF (es el agar TSC suplementado con Fluorocult), el agar SFP (Sahidi Ferguson Perfringens), el agar m-CP y el agar WB (Wilson Blair). Básicamente, los ingredientes son los mismos pero cada uno tiene sustancias selectivas diferentes que inhiben al resto de las bacterias y favorecen el crecimiento de C. perfringens. El Real Decreto 140/2003 establece el agar m-CP como medio de cultivo de referencia para la recuperación de C. perfringens a partir de agua destinada a consumo humano. Los resultados de varios estudios llevados a cabo comparando los distintos medios de cultivo sugieren que el agar m-CP detecta niveles de C. perfringens comparables a los otros medios cuando la mayoría de los microorganismos son células vegetativas; sin embargo, funciona pobremente si las muestras de agua contienen predominantemente esporas (Araujo et al., 2001, 2004). En consecuencia, siguiendo criterios científicos, la facilidad de uso y un menor coste, se decide utilizar el medio SPS (Sharlau) (Araujo et al., 2001, 2004). Este medio contiene como sustancias inhibidoras sulfito, polimixina y sulfadiazina. Al presentar sulfito en su composición (Tabla 3.2), cuando la bacteria crece lo utiliza reduciéndolo a sulfuro ferroso, proporcionando a sus colonias un color negro (Figura 3.1). Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 63 Tabla 3.2. Composición del agar SPS. Ingredientes Concentración (g L -1 ) sulfito sódico sulfato de polimixina(B) sulfadiazina de sodio peptona de caseína extracto de levadura citrato férrico tioglicolato sódico polisorbato 80 agar 0,50 0,01 0,12 15,00 10,00 0,50 0,10 0,05 15,00 Figura 3.1. Aspecto de colonias de C. perfringens en el agar SPS. 3.3.1.3. Equipos de laboratorio Los equipos utilizados en el análisis microbiológico de C. perfringens se muestran en la Tabla 3.3. Tabla 3.3. Equipos de laboratorio utilizados en los análisis microbiológicos. Instrumento Marca Modelo Función Estufas de cultivo J.P. Selecta INCUDIGIT 36 L Cultivo bacteriológico. Baño termostático J.P. Selecta PRECISTEM 20 L Mantenimiento de ágares en estado líquido. Autoclave J.P. Selecta 437-P Esterilización del material. Microscopio óptico Zeiss Axiostar Plus Pruebas de confirmación bacteriológicas. Rampa de filtración Millipore Sistema Microfil Análisis microbiológico. Jarra de anaerobiosis Oxoid AG25 Cultivo de bacterias anaerobias. Mechero bunsen Crear condiciones de esterilidad. Agitador Vortex Velp Scientifica ZX3 Mezcla de soluciones en tubos. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 64 3.3.1.4. Diluciones decimales seriadas El volumen de agua a filtrar depende de la concentración bacteriana de la muestra. El volumen recomendado por el RD 140/2003 es 100 mL, pero en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en este volumen puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares, lo que impediría en este último caso un recuento adecuado de las colonias. Por tanto, como no se conoce de antemano la concentración microbiológica presente en la muestra de agua a analizar, se realizan diluciones de la muestra inicial. A partir del agua natural (dilución 0), se toma 1 mL de la muestra con micropipeta y se transfiere a un tubo con 9 mL de agua destilada al 0,9 % NaCl, estéril. A continuación, se homogeneiza en un vortex, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10 (o dilución -1). Para hacer las diluciones sucesivas, se toma 1 mL de la dilución precedente bien homogeneizada y se lleva a un tubo con 9 mL de agua destilada al 0,9% NaCl, todo ello en ambiente de trabajo estéril, proporcionado con un mechero Bunsen. La Figura 3.2 refleja el procedimiento de diluciones decimales seriadas de manera gráfica y la Figura 3.3 el aspecto de las placas de Petri después de la siembra de dichas diluciones. Figura 3.2. Esquema del método de diluciones seriadas. Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 71 3.3.2. Análisis de Enterococcus sp. 3.3.2.1. Procedimiento normalizado El cultivo y recuento de Enterococcus sp. se realiza siguiendo el procedimiento descrito en la Norma Española UNE-EN ISO 7899-2:2001: “Detección y recuento de enterococos intestinales. Parte 2: Método de filtración por membrana.” Esta norma UNE ha sido adoptada íntegramente de la Norma Internacional ISO 7899-2:2000. 3.3.2.2. Medios de cultivo El medio utilizado para el cultivo de Enterococcus sp. es el agar selectivo Slanetz & Bartley (Scharlau) (Tabla 3.5). La preparación de este agar conlleva después de su esterilización y enfriamiento a 50 °C, la adición de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) en una proporción de 10 mL por cada litro de medio base. La solución TTC se utiliza como indicador de color. Esta solución indica la actividad biológica de los enterococos, ya que el cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (incoloro) se reduce a trifenilformazán (rojo), de manera que las colonias adquieren un color granate característico (Figura 3.6). Tabla 3.5. Composición del agar SB. Figura 3.6. Aspecto de colonias de Enterococcus sp. en el agar SB. 3.3.2.3. Equipos de laboratorio Los equipos utilizados en el análisis microbiológico de Enterococcus sp. se recogen en la Tabla 3.3 del presente capítulo. Ingredientes Concentración (g L -1 ) Triptosa 20,0 Extracto de levadura 5,0 Glucosa 2,0 Hidrogenofosfato de dipotasio 4,0 Azida de sodio (NaN3) 0,4 cloruro de trifeniletrazolio 0,1 Agar 10 Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 72 3.3.2.4. Diluciones decimales seriadas Con la finalidad de filtrar un volumen de muestra que permita un recuento adecuado de colonias de Enterococcus sp., se realizan diluciones decimales seriadas. Esta metodología de trabajo es la misma que la utilizada en el caso de C. perfringens y se explica con detalle en el apartado 3.3.1.4 del presente capítulo. 3.3.2.5. Método de filtración de membrana El método de filtración de membrana es también el método seleccionado para aislar de manera adecuada Enterococcus sp. de las muestras de agua, cuyos pasos a seguir se detallan en el apartado 3.3.1.5 del presente capítulo. Las únicas diferencias con el procedimiento utilizado en la detección de C. perfringens se traducen en la utilización de membranas con mayor tamaño de poro (0,45 µm) y en la colocación del filtro de membrana una vez filtrada la muestra, que se coloca directamente sobre el agar SB ya solidificado en la placa de Petri, cuidando que no quede ninguna burbuja debajo del filtro. 3.3.2.6. Incubación Las placas con los filtros se invierten e introducen en la estufa incubadora a 37 °C durante 48 horas. Tras finalizar el periodo de incubación, se cuentan todas las colonias que presentan una coloración roja, marrón o rosa, bien en su centro o en su periferia después del periodo de incubación (Figura 3.6). 3.3.2.7. Recuento e inactivación El recuento de colonias de Enterococcus sp. y el cálculo del grado de inactivación alcanzado por los distintos tratamientos evaluados se desarrollan en el apartado 3.3.1.7 del presente capítulo, siendo los mismos que los utilizados sobre C. perfringens. 3.3.2.8. Caracterización bacteriana por la tinción de Gram La técnica es la misma que emplea en el caso de C. perfringens y se describe detalladamente en el apartado 3.3.1.8 del presente capítulo. Enterococcus sp. al ser una bacteria Grampositiva, se visualiza de color azulado. Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 73 3.3.2.9. Repetibilidad del método de análisis de Enterococcus sp. Ibarz (2008) calculó el coeficiente de variación del método de filtración de membrana sobre Enterococcus sp., estableciendo un CV entre el 3-10 %. 3.4. Tratamiento de datos 3.4.1. Estudio de las variables influyentes en los tratamientos de desinfección El Diseño de Experimentos es el proceso de planificación de experimentos que conduce a la obtención de resultados que serán interpretados en una etapa posterior de análisis estadístico con objeto de producir conclusiones válidas y objetivas. En primer lugar es necesario decidir el tipo de diseño más adecuado. Los diseños factoriales son ampliamente utilizados en la experimentación en la que intervienen varias variables, con el fin de estudiar su efecto conjunto sobre un factor respuesta, que en este estudio es la inactivación logarítmica de las poblaciones bacterianas. El diseño seleccionado en esta investigación es el conocido como diseño 2 k , en el que se tienen k variables, cada una con dos niveles. El diseño se realiza por duplicado y tanto para diseñar los experimentos como para el análisis de resultados, se utiliza el programa informático Minitab®, en su versión para Windows. Este programa es un software estadístico que permite tanto el diseño de experimentos como la obtención de gráficos y parámetros estadísticos, la obtención de modelos reducidos y en general, las herramientas necesarias para cualquier tratamiento de datos. Tras seleccionar las variables y sus correspondientes niveles, el programa construye la matriz de diseño para la planificación de los experimentos y su realización. Para obtener conclusiones estadísticas se establece un intervalo de confianza que expresa la probabilidad de que las conclusiones que se obtienen son ciertas. En este estudio se fija un intervalo del 95 %. Minitab® genera tres tipos de representaciones a partir del análisis de los resultados obtenidos: Gráfica del efecto de cada variable sobre el factor respuesta: se estima el efecto de cada variable sobre el factor respuesta y se representa la media de la inactivación obtenida para cada variable y para cada uno de los dos niveles seleccionados. La pendiente de la Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 74 recta obtenida para cada variable es indicativa de la influencia de dicha variable sobre el factor respuesta. A mayor pendiente, la influencia sobre el factor respuesta es más importante. Gráfica de las interacciones entre variables: esta representación permite apreciar la existencia o no de interacción entre las variables seleccionadas. Cuando en esta gráfica las líneas son paralelas o casi paralelas, la interacción entre esos dos factores es poco significativa. Si por el contrario, las líneas se cortan o tienden a cortarse, indican la existencia de una interacción entre las variables. Diagrama de Pareto: representa las variables e interacciones más importantes en el proceso a nivel estadístico sobre el factor respuesta, representando gráficamente las estimaciones de cada efecto en orden decreciente. Los efectos significativos son aquellos que en el diagrama sobrepasan la línea roja discontinua, la cual se calcula mediante el margen de error simultáneo. 3.4.2. Tratamiento estadístico de comparación de resultados Los experimentos realizados en esta investigación se llevan a cabo por triplicado, a excepción de los realizados con las técnicas de desinfección de ozono, que al depender de la concentración de ozono consumida por la muestra y por tanto variar entre los diferentes tratamientos, no han podido contar con réplicas. Los resultados se expresan a partir de la media (ecuación 3.8), más menos su desviación estándar (ecuación 3.9), representándose esta desviación en las gráficas como barras de error. A partir de los resultados microbiológicos derivados de los tratamientos de desinfección aplicados, se realiza un análisis estadístico mediante el programa GraphPad Prism® (version 4.03). Se aplica un análisis ANOVA de una vía usando el test Bonferroni con el objetivo de determinar si existen o no diferencias significativas entre las diversas condiciones de estudio aplicadas. En todos los casos se utiliza un nivel de confianza del 95%, que se corresponde con un valor de significación de 0,05. El test de Bonferroni da como resultado un valor p, de manera que cuando ese valor es mayor que el nivel de significación (p >0,05), la diferencia entre los tratamientos comparados no se considera significativa y si p es menor que el nivel de significación, entonces la diferencia entre los tratamientos se Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 75 considera significativa (p <0,05), muy significativa (p <0,01) o altamente significativa (p <0,001) (Lamotte, 1981). 3.4.3. Modelos cinéticos de inactivación microbiana 3.4.3.1. Descripción de modelos La microbiología predictiva es una parte esencial de la microbiología que pretende conocer la respuesta de las poblaciones microbianas frente a diversas condiciones ambientales o tratamientos. Combina conocimientos de diferentes disciplinas (matemáticas, microbiología, ingeniería y química) con el objetivo común de desarrollar modelos matemáticos que describan y permitan predecir el ritmo de inactivación de los microorganismos de una determinada población, sometidos a condiciones tecnológicas o medioambientales determinadas (Gómez, 2005). Dentro de los tipos modelos matemáticos existentes, este estudio de investigación se centra en los modelos de inactivación, modelos que estudian el ritmo de mortandad de las poblaciones bacterianas a lo largo de un proceso. La inactivación bacteriana en aguas ha sido bastante estudiada en la última década aplicando una gran variedad de modelos cinéticos de desinfección. La modelización cinética nace con la finalidad de simplificar e idealizar fenómenos complejos (Lee y Nam, 2002). Con ella se consigue obtener una expresión matemática que facilite el diseño adecuado de un sistema de desinfección. Durante la mayor parte del siglo XX, en los sistemas de desinfección, era práctica habitual el empleo de un exceso de desinfectante para cumplir así con los requisitos exigidos de calidad del agua. Sin embargo, en la actualidad, se considera que el diseño óptimo y el funcionamiento correcto de un sistema de desinfección exigen el desarrollo previo de modelos cinéticos que puedan ser fácilmente incorporados a las distintas configuraciones de los reactores que se emplean en el campo del tratamiento de aguas. Los modelos cinéticos desarrollados en la literatura tratan de representar la acción de un desinfectante y su particular modo de actuación sobre los microorganismos presentes en el agua, bajo las condiciones particulares del sistema que se estudia. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 76 Chick (1908) formula la primera cinética de inactivación de primer orden para la modelización de las gráficas de inactivación lineales. Con ella intenta explicar el proceso de desinfección como si de una reacción química se tratara. Considera que este proceso es análogo a una reacción química de primer orden en la que la velocidad de la reacción depende de las concentraciones relativas del desinfectante y los microorganismos, estando el desinfectante en exceso. Este modelo se expresa mediante la ecuación 3.10 donde N t es el número de bacterias supervivientes en el instante t, N 0 es el número de bacterias inicial (t=0) y k es la constante de velocidad de la reacción. Nk dt dN ·−=  tk N N Ln t⋅−= 0 [3.10] En el mismo año Watson (1908) incluye una modificación al modelo de Chick, incorporando el efecto de la concentración del desinfectante en el proceso de desinfección. El modelo de Chick-Watson se representa por la ecuación 3.11, donde C es la concentración del desinfectante y n es el número de moléculas de desinfectante necesarias para la inactivación microbiana o también descrito como coeficiente de dilución, un factor empírico que suele considerarse la unidad (Pernitsky et al., 1995; Li, 2004). NCk dt dN ··−=  tCk N N Ln n t⋅⋅−= 0 [3.11] Estas cinéticas sencillas asumen que todos los microorganismos de la población presentan la misma sensibilidad al agente letal por lo que, cuando se representa su inactivación frente al tiempo de tratamiento, bajo una intensidad constante, se obtiene una línea recta. Sin embargo, estos modelos lineales no permiten explicar desviaciones observadas en muchos procesos de inactivación microbiana, como se refleja en la Figura 3.7. La curva de inactivación A representa la cinética de primer orden o muerte exponencial, en la que la velocidad de inactivación es constante e independiente del tiempo de tratamiento. La curva B muestra un hombro inicial (shoulder) o fase “lag” en Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 77 la que una fracción de microorganismos supervivientes se mantiene constante en los primeros instantes del tratamiento, produciéndose seguidamente un descenso lineal de los mismos. Se atribuye a una mezcla inadecuada del desinfectante en la muestra, un retraso en la difusión del desinfectante a los puntos de acción bacterianos o a una resistencia inicial de los microorganismos al ataque del desinfectante. Las curvas C se caracterizan por una fase de inactivación lineal inicial rápida seguida de una disminución de las poblaciones lenta, lo que se traduce en la formación de una cola o tailing-off (Gyürék y Finch, 1998). Al igual que en el fenómeno de los hombros, existen varias teorías acerca de la aparición de colas. Puede ser debido a agrupaciones de microorganismos, a la presencia de subpoblaciones con una resistencia variable al desinfectante, bien de carácter innato o como respuesta a una adaptación al medio, o también, a que se produzca una disminución en la concentración del desinfectante durante el tratamiento. Finalmente, las curvas D presentan ambas desviaciones lineales, mostrando una fase inicial de hombro seguida de una fase lineal de inactivación y finalizando con un fenómeno de cola (curvas sigmoideas). Figura 3.7. Curvas de supervivencia microbiana posibles (Fuente: Gyürék and Finch, 1998). A partir de estas teorías se desarrollan cinéticas alternativas que permiten describir curvas de supervivencia no lineales y que han sido aplicados por numerosos Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 78 autores para describir el comportamiento de diversos microorganismos en el campo de la desinfección (Cho et al., 2003; Boyle et al., 2008; Gomes et al., 2009; Azzellino et al., 2011). La Tabla 3.6 recoge los modelos matemáticos propuestos para describir las gráficas de inactivación obtenidas en el presente trabajo de investigación. La selección de estos modelos se realiza en base al principio de parsimonia según el cual los modelos han de ser tan simples como sea posible, es decir, con el menor número de parámetros posible (Gómez, 2005). La bondad del ajuste puede mejorar en gran medida añadiendo más parámetros al modelo; sin embargo, en ocasiones, aumentar mucho el número de parámetros puede llevar a que las predicciones no tengan sentido. Tabla 3.6. Modelos cinéticos de estudio aplicados. Modelo cinético Ecuación integrada Coeficientes cinéticos Referencias Modelo de Hom mmn t tKtCk N N Log ·−=⋅⋅−= 0 K, n, m Hom, 1972 Modelo de Hom modificado m n m t m tnk Ck nk m N N Ln           − −⋅       −= ' exp '1 0 0 k, k’, n, m Haas y Joffe, 1994 Modelo bifásico ( ) [ ] tk tk t ePePLog N N Log · · ·· − − −+= 1 1 0 P,k 1 ,k 2 Pruitt y Kamau, 1993 Modelo de Mafart p t t N N Log       −= δ 0 δ , p Mafart et al., 2002 Modelo de Geeraerd ( ) ( ) res tkSk Sk tk rest N ee e eNNN +         −+ −= − − maxmax max max · ·· · 11 1 1 0 k máx , S 1 Geeraerd et al., 2000 A continuación se desarrollan con más detalle cada uno de los modelos matemáticos seleccionados: Capítulo 3 Procedimientos analíticos y de tratamiento de datos 79 Modelo de Hom (1972) Hom, tras analizar los resultados de diversos experimentos de cloración sobre sistemas algales-bacterianos y observar que respondían a cinéticas curvilíneas más que a lineales, generalizó de manera empírica la ley de Chick-Watson mediante la ecuación 3.12, donde k es la constante de velocidad de inactivación de primer orden, C es la concentración del desinfectante, n el coeficiente de dilución y m una constante empírica del modelo (Li, 2004; Méndez et al., 2008). En el caso de que la concentración sea constante, el modelo se simplifica integrándose esta concentración en una constante de velocidad aparante (k ap = k· C n ) dando lugar a la ecuación 3.13, siendo esta k ap una constante de pseudo-primer orden (min -1 ) (Malato et al., 2009). Este modelo no considera que el agua tenga una demanda de desinfectante y por tanto, que la concentración del mismo disminuya a lo largo del tratamiento (Haas y Joffe, 1994). 1mn tNCmk dt dN − ⋅⋅⋅⋅−=  mn t tCk N N Log ⋅⋅−= 0 [3.12] m ap t tk N N Log ⋅−= 0 [3.13] El nivel de inactivación predicho por el modelo de Hom es una función no lineal de C y t, que dependen de los parámetros del modelo n y m, respectivamente. Este modelo puede describir las curvas A-D de la Figura 3.7 y se simplifica al modelo Chick-Watson para n=1 y m=1. Cuando m es menor que la unidad, se visualiza un efecto de cola o tailing-off. Modelo de Hom modificado (1994) Años más tarde, Haas y Joffe en 1994 modifican el modelo de Hom estableciendo que la concentración del desinfectante puede cambiar con el tiempo, debido a la demanda de los microorganismos o de otros componentes presentes en el agua. Si la descomposición del desinfectante residual es de primer orden, como frecuentemente se observa para la descomposición del cloro y ozono, se establece una relación entre la concentración residual y el tiempo según la ecuación 3.14 donde C 0 es Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 80 la concentración inicial y ' k la constante de velocidad de descomposición del desinfectante (min -1 ). ) ' exp( tkCC − ⋅ = 0 [3.14] A partir de las ecuaciones 3.12 y 3.14, se obtiene el modelo de Hom modificado, ecuación 3.15. Este modelo añade una constante al modelo de Hom, k’, considerando la demanda del desinfectante por parte de la muestra. Ha sido utilizado en diversos estudios de ozono (Cho et al., 2003). m n m t m tnk Ck nk m N N Log           − −⋅       −= ' exp '1 0 0 [3.15] Modelo bifásico de Pruitt y Kamau (1993) En 1993, Pruitt y Kamau establecen un modelo bifásico basado en la existencia de dos poblaciones microbianas que presentan una sensibilidad al tratamiento diferente, siguiendo en ambos casos una cinética de inactivación de primer orden. La expresión matemática del modelo se define por la ecuación 3.16, donde P significa la fracción de microorganismos supervivientes correspondientes a la subpoblación 1, (1P) es la fracción de supervivientes de la subpoblación 2, k 1 representa la constante de inactivación de la población sensible y k 2 es la constante de inactivación de la población resistente. ( ) [ ] tk tk t ePePLog N N Log · · ·· − − −+= 1 1 0 [3.16] Modelo de Mafart (2002) Peleg y Cole (1998) proponen el uso de distribuciones estadísticas tipo Weibull para desarrollar modelos que incluyan tanto cinéticas convexas, con un periodo inicial sin aparente inactivación, como cóncavas en las que no se consigue una inactivación completa. La distribución de Weibull es una distribución de probabilidades diseñada para describir el comportamiento de sistemas que tienen cierto grado de variabilidad. Capítulo 4 Tratamientos convencionales 87 4.1. Estudios de eliminación bacteriana en una ETAP real Con el objeto de evaluar la efectividad de las diferentes etapas que integran una línea de tratamiento de aguas potables a escala real, se lleva a cabo un estudio microbiológico en una potabilizadora localizada en la ribera del Ebro perteneciente a la Comunidad Foral de Navarra. Esta planta de tratamiento capta agua del acuífero aluvial del río Ebro la mayor parte del año, salvo cuando las condiciones de éste no lo permiten, abasteciéndose durante ese periodo directamente de las aguas superficiales del río Ebro. 4.1.1. Descripción de la instalación y de las etapas Esta ETAP consta de varias etapas de tratamiento esquematizadas en la Tabla 4.1. El recorrido del agua por las distintas instalaciones empieza cuando ésta entra en el depósito de agua bruta de 6.000 m 3 de capacidad, donde se le adiciona una dosis media de 2 mg L -1 de Cl 2. A continuación, entra a una cámara de homogeneización de 100 m 3 donde se le añade carbón activo diluido previamente en agua. Tras pasar a la cámara de mezcla, de 29 m 3 , donde se le adiciona el coagulante (sulfato de aluminio), la materia en suspensión sedimenta en dos decantadores independientes de 1.034 m 3 cada uno. En los decantadores se adiciona una dosis media de 1 mg L -1 de Cl 2 llevándose a cabo la oxidación intermedia. Para finalizar, la etapa de filtración tiene lugar en cuatro filtros de arena de 40 m 3 cada uno y la desinfección final se lleva a cabo en los depósitos de almacenamiento con cloro gas. Tabla 4.1. Etapas de la ETAP de Navarra. 1. Agua bruta 2. Preoxidación con Cl 2 3. Adsorción 4. Coagulación-floculación 5. Oxidación intermedia con Cl 2 y decantación 6. Filtración 7. Postcloración Los tiempos de residencia del agua en cada una de las etapas se calculan en función del caudal a tratar, mostrándose el intervalo de valores mínimos y máximos en Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 88 la Tabla 4.2. El caudal de agua que entra a la potabilizadora oscila entre 120-240 L sg -1 , variando el tiempo total de permanencia del agua en la instalación entre 10 y 20 horas. Tabla 4.2. Rangos de residencia del agua en cada una de las etapas de la ETAP. Q agua tratada 120-240 L sg -1 Preoxidación 7-17 horas Adsorción 7-17 minutos Coagulación-floculación 2-5 minutos Oxidación intermedia / Decantación 2-3 horas Filtración 10-13 minutos Tiempo total 10-20 horas 4.1.2. Muestras Se toman muestras en siete puntos de la línea de potabilización correspondientes a las etapas de la línea de tratamiento mostradas en la Tabla 4.1. Para el muestreo se utilizan frascos estériles que contienen tiosulfato sódico en cantidad suficiente para neutralizar el efecto bactericida del cloro residual que puede permanecer en las muestras, ya que es el agente desinfectante que adiciona la ETAP en los procesos de preoxidación, oxidación intermedia y desinfección final. Tras su recogida, las muestras se almacenan refrigeradas y se llevan al laboratorio para su análisis. En cada una de las muestras se realiza una medición in situ de los parámetros físico-químicos de pH, cloro libre y conductividad y en el laboratorio, el análisis se completa con la medición del carbón orgánico total y el recuento bacteriano de C. perfringens y Enterococcus sp. mediante la metodología descrita en el capítulo 3 de la presente memoria. 4.1.3. Resultados de inactivación de C. perfringens y Enterococcus sp. Los resultados de la caracterización físico-química de las muestras tomadas a lo largo del tratamiento de potabilización se muestran en la Tabla 4.3. No se observa prácticamente variación en el pH y conductividad y el carbono orgánico total se reduce al final del tratamiento en un 26 %. Capítulo 4 Tratamientos convencionales 89 En la Tabla 4.4 y Figura 4.1 se muestra la disminución de la población de células vegetativas de C. perfringens y Enterococcus sp. a lo largo de las distintas etapas del proceso, estos últimos resultados objeto del trabajo de investigación de Ibarz (2008). No se detectan esporos de C. perfringens en la muestra inicial de agua bruta. Sin embargo, ésta presenta una concentración inicial media de células vegetativas de 200 UFC·100 mL -1 y una concentración de Enterococcus sp. de 120 UFC·100 mL -1 . Tabla 4.3. Caracterización físico-química de las muestras en cada punto de muestreo de la ETAP. Punto de muestreo pH Conductividad (µ µµ µs cm -1 ) TOC (mg L -1 ) Cl 2 libre (mg L -1 ) 1. Agua bruta 8,20 912 3,1 --- 2. Preoxidación 8,32 905 2,9 0,14 3. Adsorción 8,03 918 2,7 ND 4. Coagulación-floculación 7,81 923 2,9 ND 5. Ox. Intermedia / Decantación 7,85 927 2,7 ND 6. Filtración 7,90 929 2,2 0,3-0,4 7. Postcloración 7,90 928 2,3 1,0 ND: no determinado Tabla 4.4. Eliminación de células vegetativas de C. perfringens y Enterococcus sp. en cada punto de muestreo de la ETAP. C. perfringens (células vegetativas) Enterococcus sp. (Ibarz, 2008) Punto de muestreo UFC·100mL -1 Inactivación logarítmica UFC·100mL -1 Inactivación logarítmica 1. Agua bruta 200 0 120 0 2. Preoxidación 40 - 0,7 6 -1,3 3. Adsorción 48 - 0,7 3 -1,6 4. Coagulaciónfloculación 22 - 0,9 2 -1,7 5. Ox. Intermedia/ Decantación 0 -2,3 0 -2 6. Filtración 0 -2,3 0 -2 7. Postcloración 0 -2,3 0 -2 Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 90 Se observa para ambas bacterias que conforme avanza el tratamiento, las poblaciones van disminuyendo hasta llegar a las etapas de oxidación intermediadecantación y filtración, donde las poblaciones supervivientes en ambos casos son nulas. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Postcloración Filtración Ox. Intermedia Coagulación Cactivo Preoxidación Bruta UFC/100 mL C. perfringens Enterococcus sp. Figura 4.1. Eliminación de C. perfringens y Enterococcus sp. (Ibarz, 2008) a lo largo de las diferentes etapas del proceso de potabilización a escala real. Las etapas que mayor grado de eliminación bacteriana presentan son la preoxidación y la oxidación intermedia, con una reducción de 0,7 y 1,4 ciclos logarítmicos respectivamente sobre C. perfringens y de 1,3 y 0,3 sobre Enterococcus sp. Es de esperar que en estas etapas se produzca la mayor parte de inactivación de microorganismos patógenos, pues tienen como principal finalidad la desinfección. Además, como refleja la Tabla 4.3, permanece una concentración residual de cloro que sigue ejerciendo su acción bactericida tras la primera oxidación de la materia orgánica del agua. La precipitación química (coagulación y floculación) también consigue reducir parte de las poblaciones bacterianas, 0,2 unidades logarítmicas de C. perfringens y 0,1 unidades de Enterococcus sp., ya que al formarse los flóculos pueden quedarse adheridos o encerrados los microorganismos en su interior, siendo arrastrados hacia el fango. En el resto de las etapas el grado de eliminación es mucho menor, aunque debido al solapamiento de las etapas entre sí y a la baja concentración bacteriana de Capítulo 4 Tratamientos convencionales 91 partida, no se puede determinar con exactitud cuál es la verdadera influencia del resto de etapas sobre el fenómeno de desinfección. Payment (1985) estudia el nivel de inactivación de indicadores bacterianos y virales en cada una de las etapas de un grupo de potabilizadoras, resultando los procesos de precloración, coagulación y sedimentación los más eficientes en la reducción de dichos indicadores, coincidiendo con los resultados obtenidos en el presente análisis. Además de la desinfección, otro de los objetivos de estas etapas es conseguir que la media de la turbidez final no sobrepase 1 UNT, ya que los microorganismos aglomerados o adsorbidos por partículas se protegen contra la desinfección en estos casos (OMS, 2011). En la última etapa, la postcloración, se determina una concentración media de cloro libre residual de 1 mg L -1 , permitiendo que el agua potable llegue a los puntos de consumo en buen estado sanitario. El agua potable obtenida al final de este tratamiento convencional de potabilización cumple con los criterios exigidos por la actual legislación vigente (RD 140/2003). Payment y Franco (1993) establecen necesario el análisis rutinario de C. perfringens como indicador de la presencia de otros microorganismos resistentes a los tratamientos convencionales, como enterovirus y quistes de protozoos. La presencia de C. perfringens en una muestra de agua tratada no debe aceptarse y por tanto, debe desecharse como agua apta para consumo humano. Hijnen (2000b), tras un trabajo de investigación sobre la detección de indicadores bacterianos en diferentes etapas de una ETAP, señala la necesidad de filtrar volúmenes superiores al legislado (100 mL) como técnica rutinaria de filtración, ya que después de que el agua pasa por diversas etapas de la línea de tratamiento, la presencia de estos indicadores disminuye y son difíciles de detectar con el volumen establecido. Recomienda volúmenes en torno a los 100 L o superiores para asegurar la eficacia de las etapas finales y de todo el tratamiento. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 92 4.2. Estudios de eliminación bacteriana a escala de laboratorio En una potabilizadora, tal y como se refleja en el apartado 4.1.1 del presente capítulo, todas las etapas siguen un diagrama de flujo en serie, siendo difícil saber el grado de aportación de cada una de ellas al proceso completo de desinfección. Es de esperar que la mayor acción bactericida corresponda a las etapas de preoxidación y oxidación intermedia, por ser en ellas donde se adiciona el desinfectante, pero también puede ocurrir que la influencia del resto de etapas sea mayor que el detectado en los análisis de la línea de tratamiento a escala real. Por tanto, el objetivo de esta parte de la investigación se centra en simular a escala de laboratorio cada una de las etapas de manera individual, con el objetivo de determinar su influencia sobre las células vegetativas de C. perfringens. La etapa de cloración se estudia también sobre esporos y Enterococcus sp. La influencia del resto de etapas han sido estudiadas sobre Enterococcus sp. por Ibarz (2008). 4.2.1. Muestras 4.2.1.1. Muestras de agua natural Las muestras de agua natural utilizadas durante la experimentación en el laboratorio de la presente Tesis Doctoral, proceden de las aguas superficiales del Canal Imperial de Aragón. Esta infraestructura canaliza las aguas a partir de una derivación del río Ebro a la altura del término municipal de Fontellas (Navarra), abasteciendo a varios municipios situados a ambos lados del canal y finalmente a Zaragoza. La toma de muestras se lleva a cabo 500 metros antes de la captación de la potabilizadora de Casablanca, instalación que abastece de agua potable a la ciudad de Zaragoza. Se utilizan frascos recolectores estériles y tras recoger las muestras, se mantienen a una temperatura inferior a 10 °C hasta llegar al laboratorio. Una vez allí, se analizan sus parámetros físico-químicos y se procede a conservarlas a -20 °C hasta su posterior utilización. La Tabla 4.5 muestra los resultados de caracterización de la muestra de agua natural. Capítulo 4 Tratamientos convencionales 93 Tabla 4.5. Caracterización de la muestra de agua natural. pH Temperatura Turbidez Conductividad Carbono orgánico total C. perfringens Enterococcus sp. 7,91 - 8,29 17,8 - 20,8 °C 86-144 NTU 550 – 1.368 µs cm -1 3,36 mg L -1 1·10 2 - 4 ·10 2 UFC·100 mL -1 1·10 2 - 5·10 2 UFC·100 mL -1 4.2.1.2. Muestras de agua natural fortificadas Tras caracterizar las muestras de agua natural, se observa en la Tabla 4.5 una población de C. perfringens y Enterococcus sp. del orden de 10 2 UFC·100mL -1 , concentraciones que no permiten determinar la influencia de los tratamientos de desinfección de estudio. Por ello, se aumenta de manera artificial la concentración bacteriana originaria presente en el agua natural, partiendo así de una “muestra fortificada”. Para ello, previamente a la realización de cada uno de los tratamientos de estudio, la muestra de agua que va a ser utilizada se esteriliza en una botella de vidrio Pyrex de 1 L para eliminar las bacterias presentes en el día del muestreo y que hayan podido sobrevivir al periodo de congelación y así evitar cualquier interacción de la bacteria de estudio con otros microorganismos (Medema et al., 1997). Posteriormente, a partir de cultivos puros de C. perfringens y Enterococcus sp., se preparan suspensiones bacterianas concentradas que posteriormente se añaden a las muestras de agua natural. Fortificación con células vegetativas de C. perfringens La cepa de C. perfringens utilizada en la experimentación del presente trabajo de investigación es suministrada por el Hospital Clínico Lozano Blesa de Zaragoza, la cual se aisló a partir de un caso clínico en humana. Una vez en el laboratorio, se procede a su confirmación mediante una serie de pruebas bioquímicas que se recogen en la Tabla 4.6 (Gamazo et al., 2005; Environmental Agency, 2010). Los resultados muestran que C. perfringens fermenta los azúcares glucosa Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 94 y lactosa con producción de gas y ácido, es inmóvil, licua la gelatina y reduce los nitratos a nitritos. Tras confirmar el género y la especie, la cepa “madre” se conserva en viales pequeños (1,5 mL) con leche desnatada estéril que funciona como un agente crioprotector, congelada a -20°C (Gamazo et al., 2005); a partir de estos viales se realiza la fortificación bacteriana del agua natural previamente a cada experimento. Tras descongelar el criovial, se trasvasa con un asa de siembra un inóculo a un tubo con caldo tioglicolato con resazurina, un medio líquido de enriquecimiento (Tabla 4.7). Tras un periodo de incubación de 24 h a 37 °C en condiciones de anaerobiosis, se realiza una siembra en superficie con hisopo en agar Schaedler enriquecido con sangre (5% de sangre de carnero desfibrinada estéril) (Tabla 4.8 y Figura 4.2). Se vuelven a incubar las placas durante 24 h a 37 °C en anaerobiosis para así obtener cultivo joven y abundante, facilitando la posterior preparación de la suspensión bacteriana (Lanao et al., 2008, 2010). Tabla 4.6. Pruebas bioquímicas de confirmación de C. perfringens. Medios de cultivo Propiedad Condiciones Incubación Resultado Agar Kligler Fermentación glucosa y lactosa Generación SH 2 y gas Y G /Y/+ Agar movilidad Movilidad - Medio gelatina Capacidad de licuefacción de la gelatina + Medio reducción nitratos a nitritos Capacidad de reducir los nitratos a nitritos + Lactosa gelatina Fermentación lactosa +/+ Agar Nitrato Movilidad Reducción de nitratos a nitritos y movilidad 37 °C/ 48h Aerobiosis y Anaerobiosis +/- El agar Schaedler-sangre no es un tipo de agar selectivo, por lo que en él pueden crecer cualquier tipo de bacterias. Es importante la observación de las colonias crecidas tras la incubación para ver si hay cultivo homogéneo, trabajando en todo momento en torno al mechero Bunsen para evitar contaminación ambiental. Las Capítulo 4 Tratamientos convencionales 95 colonias de C. perfringens obtenidas en este medio dan colonias redondas, lisas, de bordes netos, abombadas, de color crema a amarillas. A veces, algunas cepas presentan colonias atípicas (planas, rugosas, con bordes lobulados) mezcladas entre las típicas. En agar sangre se produce una hemólisis visible alrededor de las colonias, de extensión variable según el tipo de hemolisinas producidas (Figura 4.2) (Bourgeois et al., 1994). Tabla 4.7. Composición del caldo tioglicolato con resazurina. Tabla 4.8. Composición del agar Schaedler. Ingredientes Concentración (g L -1 ) Extracto de levadura 5,0 Digerido pancreático de caseína 15,0 Dextrosa (anhidro) 5,0 L-cistina 0,5 Cloruro sódico 2,5 Tioglicolato sódico 0,5 Resazurina 0,001 Agar 0,75 Ingredientes Concentración (g L -1 ) Peptona de caseína 5,60 Peptona de soja 1,00 Peptona de carne 5,00 Peptona de levadura 5,00 Glucosa 5,80 Cloruro sódico 1,70 Fosfato de dipotasio 0,80 Tampón Tris 3,00 L-Cisteína HCl 0,40 Hemina 0,01 Agar 15,00 Figura 4.2. Colonias de C. perfringens en Agar Schaedler-sangre y técnica de siembra en superficie con hisopo. A partir de la placa cultivada de agar Schaedler y con un asa de siembra estéril, se trasvasan las colonias crecidas a un tubo que contiene una disolución de NaCl 0,9% Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 96 estéril. Una vez se consigue en el tubo la turbidez equivalente al patrón 2 de la escala de McFarland, se vierte el contenido del mismo en la muestra de agua natural. De esta forma se consigue partir en cada uno de los experimentos realizados de una concentración inicial de células vegetativas de aproximadamente 10 7 -10 8 UFC·100 mL -1 . La escala de McFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato bárico con el número conocido de bacterias presentes en una muestra (Gamazo et al., 2005). Hay que tener en cuenta que las poblaciones bacterianas iniciales para cada uno de los experimentos realizados no van a ser exactamente las mismas debido a la propia dificultad de preparación y calibración de la suspensión celular concentrada. Fortificación con esporos de C. perfringens La fortificación de las muestras con esporos se realiza a partir de la misma cepa de C. perfringens descrita en el apartado anterior. Tras descongelar el vial, con un asa de siembra se trasvasa un inóculo a un tubo con caldo tioglicolato con resazurina y se incuba a 37 °C durante 24 h en anaerobiosis. Tras la incubación, se inocula 1 mL del cultivo en caldo de esporulación (Tabla 4.9) acorde al procedimiento descrito por Duncan y Strong (1968), incubándose nuevamente a 37 °C durante 72 h en condiciones de anaerobiosis. Después de la incubación, los esporos se recuperan mediante centrifugación (10.000 r.p.m., 15 minutos). El cultivo se lava dos veces con agua de peptona al 0,1%. A continuación, la suspensión de esporos se calienta a 80 °C durante 15 minutos para eliminar las células vegetativas presentes. Se enfría inmediatamente bajo el grifo. Finalmente, se realizan tres lavados con agua de peptona al 0,1 % para obtener la suspensión de esporos final (Lanao et al., 2010). Tabla 4.9. Composición del caldo de esporulación Duncan-Strong. Ingredientes Concentración (g · 100mL -1 ) Extracto de levadura 0,4 Proteasa peptona 1,5 Almidón soluble 0,4 Tioglicolato sódico 0,1 Na 2 HPO 4 ·7H 2 O 1,0 Capítulo 4 Tratamientos convencionales 103 en la esporulada, necesitando una dosis de cloro menor (0,8 mg Cl 2 L -1 ) para reducir las poblaciones de partida a cero, en contraposición con dosis mayores en el caso de las células vegetativas de C. perfringens (2,4 mg Cl 2 L -1 ). Los esporos, bajo estas condiciones de estudio, no alcanzan una desinfección completa al final del ensayo. Por tanto, los esporos de C. perfringens muestran una mayor resistencia al tratamiento de cloración, seguido por sus formas vegetativas y finalmente, por Enterococcus sp. 4.2.2.5. Modelización cinética Las curvas de inactivación cóncavas que describen la muerte de las células vegetativas y esporos de C. perfringens y de Enterococcus sp. en el tratamiento de cloración se analizan mediante 3 modelos matemáticos: el modelo de Hom modificado, el modelo bifásico y el modelo de Mafart. El modelo de Hom modificado asume que la población bacteriana se inactiva a lo largo del tratamiento conforme el desinfectante se va descomponiendo, representado este proceso de desaparición por la constante k’. El modelo bifásico reconoce la existencia de dos poblaciones con distinta resistencia al tratamiento, respondiendo ambas a una cinética de primer orden. Finalmente, el modelo de Mafart también asume que existe una distribución de resistencias frente al tratamiento dentro de la población, pero estas resistencias siguen la distribución de Weibull. En el apartado 3.4.3 de la presente memoria se desarrollan con más detalle cada uno de estos modelos. Las Tablas 4.14, 4.15 y 4.16 muestran los parámetros cinéticos y el ajuste de cada uno de los modelos a los resultados experimentales obtenidos para las tres formas bacterianas de estudio, mediante el coeficiente de determinación (R 2 ) y el error cuadrático medio (ECM). La observación de los índices ECM y R 2 indica, en conjunto, una buena adecuación de los tres modelos a los valores experimentales de inactivación obtenidos. Los valores de ECM están próximos al valor 0 y en paralelo, el valor de R 2 está muy próximo al valor 1. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 104 Tabla 4.14. Parámetros cinéticos del modelo de Hom modificado aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de cloración. k (min -1 ) k’(min -1 ) n m ECM R 2 Células vegetativas de C. perfringens 5,281 0,291 0,07 0,20 0,092 0,99 Esporos de C. perfringens 1,526 0,669 0,03 0,09 0,05 0,98 Enterococcus sp. 2,077 0,45 1,01 0,50 0,12 0,99 Tabla 4.15. Parámetros cinéticos del modelo bifásico aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de cloración. P k 1 (min -1 ) k 2 (min -1 ) ECM R 2 Células vegetativas de C. perfringens 0,999994 59,91 0,81 0,691 0,97 Esporos de C. perfringens 0,9753 25,68 0,03 0,094 0,98 Enterococcus sp. 0,99999997 23,79 0,25 0,57 0,96 Tabla 4.16. Parámetros cinéticos del modelo de Mafart aplicados sobre la inactivación de las tres formas bacterianas de estudio en el tratamiento de cloración. p δ (min) ECM R 2 Células vegetativas de C. perfringens 0,17 0,000039 0,129 0,99 Esporos de C. perfringens 0,06 0,0006 0,06 0,99 Enterococcus sp. 0,13 0,0000005 0,50 0,96 Si se comparan los valores de los índices cinéticos de cada uno de los modelos entre las tres formas bacterianas de estudio se puede observar que, para el primer modelo, el modelo de Hom modificado (Tabla 4.14), la constante de velocidad de inactivación (k) de las células vegetativas de C. perfringens presenta el valor más alto, mostrando una mayor sensibilidad al tratamiento durante los primeros instantes con respecto a Enterococcus sp. y sus esporos. Respecto al modelo bifásico (Tabla 4.15), el valor P indica la fracción de la población sensible al tratamiento. A nivel logarítmico se traduce en que la población resistente de las formas vegetativas de C. perfringens aparece después de inactivarse 5,3 ciclos logarítmicos, la de los esporos después de 1,6 ciclos y finalmente, la de Enterococcus sp., tras una inactivación de 7,5 unidades logarítmicas. Los valores k 1 y k 2 Capítulo 4 Tratamientos convencionales 105 representan constantes que caracterizan la velocidad de inactivación de la población sensible y resistente al tratamiento, respectivamente. Los valores de la constante k 1 son muy superiores a los valores de la constante k 2 para las tres formas bacterianas, por lo que coexisten aparentemente dos poblaciones de resistencia diferentes. Del modelo de Mafart (Tabla 4.16), se deriva que para las tres formas estudiadas, el valor del parámetro de forma, p, es inferior a 1 indicando que las curvas de inactivación presentan una forma cóncava, lo que se traduce en la aparición de una cola. El parámetro de escala, δ , se corresponde con el tiempo necesario para reducir el primer ciclo logarítmico decimal de la población bacteriana. Las Figuras 4.8, 4.9 y 4.10 muestran el ajuste de los tres modelos a las curvas de inactivación de las células vegetativas y esporos de C. perfringens y Enterococcus sp., respectivamente. Se puede observar un ajuste bastante bueno de las curvas estimadas a partir de los modelos matemáticos sobre la curva trazada por los datos experimentales en los tres casos. -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 2 4 6 8 10 tiempo (min) Log(Nt/No) . experimentales modelo bifásico modelo Mafart modelo Hom modificado Figura 4.8. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de las células vegetativas de C. perfringens mediante el tratamiento de cloración. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 106 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 tiempo (min) Log(Nt/No) . experimentales modelo bifásico modelo Mafart modelo Hom modificado Figura 4.9. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de los esporos de C. perfringens mediante el tratamiento de cloración. -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 2 4 6 8 10 tiempo (min) Log(Nt/No) . experimentales modelo bifásico modelo Mafart modelo Hom modificado Figura 4.10. Ajuste de los tres modelos matemáticos a la gráfica de inactivación de Enterococcus sp. mediante el tratamiento de cloración. La Figura 4.11 muestra la representación gráfica de los valores logarítmicos de inactivación observados en el tratamiento de cloración sobre las formas vegetativas de C. perfringens frente a los valores logarítmicos de inactivación estimados por los tres modelos matemáticos aplicados. Si el modelo se ajusta perfectamente a los datos, los puntos se encuentran distribuidos a lo largo de la línea de equivalencia. La bondad del modelo es mayor Capítulo 4 Tratamientos convencionales 107 cuanto más próximos están los puntos a dicha línea. No se observa prácticamente dispersión de los puntos respecto a la recta, por lo que los tres modelos se ajustan adecuadamente a los resultados de inactivación experimentales obtenidos. La Figura 4.12 y 4.13 muestran el mismo tipo de representación gráfica, valores de inactivación obtenidos frente a los valores de inactivación logarímica estimados, en los tratamientos de cloración sobre los esporos y Enterococcus sp. bajo los tres modelos estudiados. Sobre los esporos, para los tres modelos, la distribución de la nube de puntos están muy próximas a la recta; sin embargo, para Enterococcus sp., el modelo de Hom modificado es el modelo que presenta los puntos más cercanos a dicha recta, por lo que se puede decir que es el modelo que mejor se ajusta a los valores experimentales obtenidos. 108 Dpto. Ingeniería y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza Figura 4.11. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre las células vegetativas de C.perfringens mediante tratamiento de cloración. 109 Capítulo 4 Trata,mientos convencionales Figura 4.12. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre los esporos de C.perfringens mediante tratamiento de cloración. 110 Dpto. Ingeniería y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza Figura 4.13. Representación de la correlación entre la inactivación logarítmica observada experimentalmente y la inactivación logarítmica calculada por los modelos cinéticos aplicados sobre Enterococcus sp. mediante tratamiento de cloración. Capítulo 4 Tratamientos convencionales 111 4.2.2.6. Estudio económico La estimación de los costes de un tratamiento es un factor importante a la hora de decidir cuál utilizar en el proceso de potabilización/regeneración a escala real. Para evaluar de manera precisa la rentabilidad coste-efectividad de un tratamiento se deberían tener en cuenta muchos factores como la calidad de agua a tratar, las condiciones y costes de operación, la configuración del reactor, entre otros (Andreozzi et al., 1999; Murillo et al., 2010). Con la finalidad de estimar los costes del tratamiento de cloración, se van a considerar exclusivamente los costes relativos al agente utilizado. Para poder comparar estos resultados con los obtenidos para el resto de tratamientos estudiados en el presente trabajo de investigación, al ser condiciones de trabajo diferentes para cada tipo de proceso, se calculan los costes derivados del tratamiento que permiten alcanzar una inactivación de una unidad o ciclo logarítmico (90 % de inactivación), para cada una de las formas bacterianas de estudio. Las dosis de cloro necesarias para realizar el cálculo corresponden a las demandas de cloro de cada una de las muestras, pues el nivel de inactivación propuesto se alcanza rápidamente en los primeros segundos del ensayo, por lo que prácticamente no se produce consumo de cloro. En este proceso, el reactivo implicado es hipoclorito sódico cuyo coste supone 97 €/Tm (con una riqueza del 15%), según la empresa suministradora Ercros, fuente consultada. En la Tabla 4.17 se indican los costes del tratamiento teniendo de referencia los distintos indicadores bacterianos estudiados y a continuación, la expresión utilizada para realizar el cálculo: Dosis cloro (mg /L)·10 -6 Kg· 150 100 ,· 1000 97 €/kg Tabla 4.17. Costes del tratamiento de cloración para la inactivación de un 1 unidad logarítmica sobre C. perfringens (células y esporos) y Enterococcus sp. Microorganismo Coste calculado Células vegetativas 0,00028 € / m 3 Esporos 0,00038 € / m 3 Enterococcus sp. 0,00024 € / m 3 Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 112 4.2.3. Coagulación, floculación y decantación 4.2.3.1. Procedimiento experimental Estos ensayos se llevan a cabo sobre muestras fortificadas con células vegetativas de C. perfringens. El experimento se realiza en un Jar Test (OVAN, modelo 6P), dispositivo que consiste en una serie de ejes agitadores de varilla que giran simultáneamente todos a una misma velocidad regulable y constante, permitiendo trabajar con varias muestras (Figura 4.14). Para que el proceso de coagulación se lleve a cabo, se adiciona como coagulante sulfato de alúmina (Al 2 (SO 4 ) 3 ⋅ 18H 2 O, Probus). Con el objetivo de optimizar la cantidad de coagulante a adicionar en el ensayo, se preparan cuatro vasos de precipitados con la misma muestra de agua y se añaden 10, 25, 50 y 75 mg Al·L -1 de coagulante respectivamente. Tras un periodo inicial de mezcla rápida a 200 r.p.m durante 3 minutos para favorecer la coagulación, se deja flocular 15 minutos con una agitación lenta, 40 r.p.m. Tras el proceso de coagulación-floculación, las muestras se someten al proceso de decantación. Esta etapa se realiza a escala de laboratorio dejando decantar la muestra un mínimo de 2 horas en un cono Imhoff, cono de vidrio de 46 cm de altura y 11 cm de diámetro (Figura 4.15). Tras finalizar la decantación, se selecciona como dosis óptima de coagulante la que consigue una mayor eliminación de turbidez y un menor volumen de fangos. Además de analizar la eliminación bacteriana en esta etapa se estudian los parámetros físico-químicos de pH, conductividad y turbidez antes y después del ensayo. 4.2.3.2. Resultados Todos los resultados físico-químicos y microbiológicos se muestran en la Tabla 4.18. Esta etapa, por definición, tiene como finalidad eliminar la materia en suspensión presente en el agua. Esta función se pone de manifiesto al reducirse en gran medida los valores de turbidez al final del tratamiento con respecto al inicio. Como se Capítulo 5. Eliminación de C. perfringens y Enterococcus sp. mediante POAs basados en irradiación UV/VIS Capítulo 5 POAs basados en irradiación 121 5.1. Procedimiento experimental 5.1.1. Muestras 5.1.1.1. Muestras de agua natural fortificadas con Enterococcus sp. Las muestras de agua natural fortificadas con Enterococcus sp. se preparan siguiendo la metodología mostrada en el capítulo 4, apartado 4.2.1.2 de la presente memoria. La concentración bacteriana inicial en las muestras es alrededor de 10 8 UFC·100 mL -1 . 5.1.1.2. Muestras de agua natural fortificadas con células vegetativas de C. perfringens Las muestras de agua natural fortificadas con células vegetativas se preparan siguiendo la metodología mostrada en el capítulo 4, apartado 4.2.1.2 de la presente memoria. La concentración inicial de células vegetativas en las muestras asciende a 10 7 - 10 8 UFC·100 mL -1 . 5.1.1.3. Muestras de agua natural fortificadas con esporos de C. perfringens Las muestras de agua natural fortificadas con esporos se preparan siguiendo la metodología mostrada en el capítulo 4, apartado 4.2.1.2 de la presente memoria. La concentración inicial de esporos en las muestras asciende a 10 3 UFC·100 mL -1 . 5.1.2. Agentes utilizados en los tratamientos 5.1.2.1. Irradiación UV/VIS La irradiación utilizada en los tratamientos de esta parte de la experimentación se simula con una cámara solar Atlas Suntest CPS+/XLS+ mediante una lámpara de xenon, cuyo intervalo de intensidad se sitúa entre 250-765 W m -2 (Figura 5.1). Mediante dos filtros que cubren la lámpara de xenon, un filtro de cuarzo y un filtro adicional de ventana (Xenochrome 320), se consigue la emisión de los dos rangos de irradiación que son utilizados en los tratamientos de desinfección: 1. Rango 290-800 nm: comprende las radiaciones UVB, UVA y visible. El filtro de cuarzo con una capa selectiva de reflexión intercepta la radiación de infrarrojo. Este rango representa la radiación solar que incide al aire libre. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 122 En la Figura 5.2 se muestra comparativamente el espectro solar simulado y el natural. 2. Rango 320-800 nm: comprende las radiaciones UVA y visible. Además del filtro de cuarzo, se coloca un filtro adicional de cristal de ventana de 6 mm (Filtro “ID 65”) que intercepta las longitudes de onda por debajo de los 320 nm, eliminando el rango UVB. Figura 5.1. Cámara solar utilizada. Figura 5.2. Radiometría de la luz solar y lámpara de xenon con y sin filtro de ventana. Espectro solar simulado y natural; (a) sin filtro de ventana, (b) con filtro de “vidrio de ventana” (Miguel, 2010). Las muestras que son tratadas se colocan en el interior de la cámara solar. Con un agitador magnético, se proporciona a la muestra un medio aireado y una mezcla Capítulo 5 POAs basados en irradiación 123 perfecta durante los experimentos. La cámara también está equipada con un regulador de intensidad y de tiempo de exposición, además de un control de temperatura. La intensidad de la irradiación seleccionada para todos los experimentos es de 500 W m -2 , que corresponde al 50% de la intensidad de la radiación solar natural al medio día y es utilizada por diversos autores en sus estudios (Yuranova et al., 2004; Gumy et al., 2006). 5.1.2.2. Dióxido de titanio El catalizador utilizado en los experimentos se prepara a partir de TiO 2 comercial (>98% anatasa, Panreac). En la literatura se establece que el TiO 2 , en la fase cristal de anatasa, exhibe la mayor fotoactividad (Mahtlig et al., 2011). Con el objeto de mejorar sus propiedades mecánicas, el catalizador comercial se somete a un tratamiento térmico de 900 °C durante 12h. Después de enfriar el TiO 2 a temperatura ambiente y con la finalidad de obtener un tamaño de partícula homogéneo, el TiO 2 se compacta en una prensa hidráulica hasta alcanzar una presión de 10 T·cm -2 de manera que se obtienen unas pastillas que posteriormente se tamizan, dando lugar a partículas de 0,5 mm de diámetro. Este proceso permite obtener un catalizador con una adecuada velocidad de sedimentación (0,4 m·min -1 ), facilitando su posterior eliminación por sedimentación (Canche, 2007; Miguel, 2010). Fernández (2003) demuestra en su investigación que más de un 97% de partículas pueden ser recuperadas a partir de una suspensión con TiO 2 . Posteriormente, el catalizador se caracteriza estructural y texturalmente. Se caracteriza mediante los métodos BET (Brunauer, Emmett and Teller) y XRD, detallados en el apartado 3.1 de la presente memoria. El área específica conseguida es 6,43 m 2 g -1 . Su espectro DRX se muestra en la Figura 5.3, en la que se observa que la fase predominante es la anatasa, más específicamente 80 % anatasa y 20 % rutilo. Esta relación se considera por algunos autores adecuada para la fotocatálisis heterogénea (Rincón y Pulgarín, 2003). Mahltig (2011) indica que las propiedades fotocatalíticas del TiO 2 pueden ser mejoradas si además de anatasa está presente cierta cantidad de otra fase cristalina del TiO 2 , en concreto de rutilo. Otros autores, como Rju y Choi (2008), defienden que la creencia de que la anatasa es más fotoactiva que el rutilo no siempre puede ser apoyada bajo ciertas condiciones de trabajo. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 124 Figura 5.3. Difractograma del TiO 2 . 5.1.2.3. Peróxido de hidrógeno El peróxido de hidrógeno comercial utilizado en los experimentos basados en irradiación es de la marca Carlo Erba y tiene una concentración del 30% (v/v). 5.2. Condiciones de operación, resultados e interpretación 5.2.1. Inactivación de células vegetativas y esporos de C. perfringens 5.2.1.1. Condiciones de operación La duración máxima de los experimentos de irradiación, irradiación/H 2 O 2 , fotocatálisis y fotocatálisis/H 2 O 2 es de 5 minutos para las muestras fortificadas con células vegetativas de C. perfringens y de 30 minutos para los esporos. El rango de trabajo utilizado corresponde al intervalo 320-800 nm, comprendiendo los rangos UVA y visible del espectro solar, a través del uso conjunto del filtro de cuarzo y el filtro de ventana. Los experimentos se realizan a temperatura ambiente (23°C) y las temperaturas máximas que se alcanzan durante los tratamientos son 29-30°C. Está bien establecido que parte de la inactivación bacteriana en estudios de desinfección solar se debe a un incremento en la temperatura de las muestras (40-45°C) (McGuigan et al., 1998); sin embargo, la temperatura más alta alcanzada en los experimentos realizados en el Capítulo 5 POAs basados en irradiación 125 presente estudio es muy inferior, siendo el grado de desinfección atribuido a este factor despreciable. En los tratamientos en los que participa el catalizador TiO 2 , para favorecer una mezcla perfecta de la muestra en el reactor, se introduce un imán magnético que evita que el TiO 2 se deposite en el fondo durante el experimento. La concentración de TiO 2 utilizada en los tratamientos en los que participa es de 1 g·L -1 , tal y como aconsejan muchos autores en tratamientos de fotocatálisis (Rincón y Pulgarín, 2003, 2004c; Cho et al., 2004; Gumy et al, 2006; Ibarz, 2008). Concentraciones muy elevadas del catalizador pueden dar como resultado la saturación del medio y con ello, una menor efectividad en la desinfección con radiación solar, ya que la luz no puede penetrar fácilmente en el agua y tanto la actividad del catalizador como la acción directa de la luz ven disminuidos su efecto. Maness (1999) obtiene como concentración más efectiva de TiO 2 para la eliminación de E. coli, mediante fotocatálisis, el valor de 1 g·L -1 , entre otras concentraciones inferiores (0,1 y 0,5 g L -1 ), partiendo de poblaciones iniciales entre 10 3 y 10 8 UFC·mL -1 . Ibarz (2008) observa un aumento proporcional en la desactivación de Enterococcus sp. hasta llegar a una concentración de 1 g·L -1 , a partir de la cual el nivel de desinfección alcanzado se mantiene constante. A lo largo del desarrollo de los experimentos, se toman muestras a diferentes intervalos de tiempo con el fin de evaluar el efecto de los tratamientos sobre las dos formas poblacionales objeto de estudio. En las muestras provenientes de los tratamientos en los que participa el H 2 O 2 , cuya dosis inicial es 0,04 mM (1,365 mg H 2 O 2 ·L -1 ), su dosis residual se neutraliza con tiosulfato sódico con el objeto de anular su efecto bactericida. 5.2.1.2. Resultados del tratamiento de irradiación La Tabla 5.1 muestra los recuentos bacterianos obtenidos durante del proceso de irradiación y en oscuridad, poniéndose de manifiesto la ausencia de desinfección en este último caso. Las poblaciones que sobreviven a la irradiación también son elevadas tanto a nivel vegetativo, como a nivel de esporos. Las Figuras 5.4 y 5.5 representan las curvas de inactivación de las células vegetativas y esporos, respectivamente, a lo largo del tratamiento de irradiación. En Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 126 dicha gráfica la inactivación en unidades logarítmicas se representa vs. tiempo, en minutos. Tabla 5.1. Recuentos de células vegetativas y esporos de C. perfringens (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de oscuridad e irradiación (λ: 320-800 nm) sobre la muestra natural. Forma celular Tratamiento Recuento 0’ 0,5’ 1’ 2’ 3’ 5’ Oscuridad N t 7,8·10 8 6,2·10 8 Células vegetativas Irradiación N t 7,7·10 8 4,9·10 8 3,4·10 8 2,1·10 8 8,4·10 7 4,9·10 7 Forma celular Tratamiento Recuento 0’ 5’ 10’ 20’ 30’ Oscuridad N t 2,6·10 3 3,1·10 3 Esporos Irradiación N t 5,9·10 3 5,7·10 3 5,5·10 3 4,6·10 3 3,8·10 3 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0 1 2 3 4 5 tiempo (min) Log (Nt/No) 1 Figura 5.4. Inactivación de las células vegetativas de C. perfringens en oscuridad () y en el tratamiento de irradiación () sobre la muestra natural. λ=320-800 nm.N 0 =7,7·10 8 UFC· 100 mL -1 Se observa una mayor pendiente de inactivación sobre la población de células vegetativas que sobre los esporos. Capítulo 5 POAs basados en irradiación 127 -0,6 -0,4 -0,2 0 0 5 10 15 20 25 30 tiempo (min) Log (Nt/No) _ Figura 5.5. Inactivación de esporos de C. perfringens en el tratamiento de irradiación sobre la muestra natural. λ=320-800 nm. N 0 = 5,9·10 3 UFC· 100 mL -1 . Sobre las células vegetativas, se obtiene una reducción poblacional de 1,2 ± 0,09 unidades logarítmicas al final del experimento, mientras que en el caso de los esporos, el tratamiento prácticamente no les afecta, incluso después de 30 minutos de tratamiento. Se alcanza finalmente una inactivación de 0,2 ±0,01 unidades logarítmicas. La escasa inactivación obtenida sobre las formas esporuladas es también observada por otros autores. Mamane (2007) tampoco obtiene inactivación sobre los esporos de Bacillus subtilis tras un tratamiento de radiación UVB y UVA (295-400 nm) de 15 minutos. Riesenman y Nicholson (2000) demuestran una mayor sensibilidad de los esporos a la radiación UVC. Finalmente, Dunlop (2008) consigue alcanzar una inactivación de esporos de C. perfringens cercana al 60% después de 120 minutos mediante un tratamiento de radiación UVA con aire. En consecuencia, se evidencia que son necesarios largos periodos de exposición para conseguir una inactivación completa de las formas esporuladas. 5.2.1.3. Resultados del tratamiento de fotocatálisis Las poblaciones supervivientes de células vegetativas y esporos a lo largo de los tratamientos de TiO 2 y fotocatálisis (TiO 2 + irradiación con λ 320-800 nm) se muestran en la Tabla 5.2. En ausencia de irradiación, el efecto del catalizador es prácticamente nulo sobre las dos formas poblacionales de C. perfringens, tal y como también observan Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 128 otros autores, sobre poblaciones de E. coli (Rincón y Pulgarin, 2003, 2004 a,c; Robertson et al., 2005). Tabla 5.2. Recuentos de células vegetativas y esporos de C. perfringens (UFC·100mL -1 ) durante los tratamientos de TiO 2 y fotocatálisis (λ: 320-800 nm) sobre la muestra natural. Forma celular Tratamiento Recuento 0’ 0,5’ 1’ 2’ 3’ 5’ TiO 2 N t 7,8·10 8 5,9·10 8 4,8·10 8 3,5·10 8 2,4·10 8 1,5·10 8 Células vegetativas Fotocatálisis N t 5·10 8 1,8·10 8 1,7·10 7 1,6·10 5 3,1·10 4 6,2·10 2 Forma celular Tratamiento Recuento 0’ 5’ 10’ 20’ 30’ TiO 2 N t 2,6·10 3 2,5·10 3 Esporos Fotocatálisis N t 3,3·10 3 8·10 2 6,5·10 2 4,4·10 2 1,6·10 2 En la Figura 5.6 se representa la curva de inactivación de las células vegetativas en respuesta al tratamiento fotocatalítico y en la Figura 5.7, la de esporos. Cuando el TiO 2 se activa con la presencia de radiación solar, se consigue alcanzar un nivel de inactivación sobre las células vegetativas de 5,9 ± 0,4 unidades logarítmicas, cinco veces superior al nivel alcanzado con la luz por si sola. En términos estadísticos, existen diferencias muy significativas entre el tratamiento de fotocatálisis y el tratamiento de irradiación (p<0,01). Respecto a los esporos, Figura 5.7, cuando el dióxido de titanio se suma a la radiación solar, también mejora la capacidad de desinfección sobre la muestra. Después de 30 minutos de tratamiento, la reducción de esporos se traduce en 1,3 ± 0,1 unidades logarítmicas, prácticamente una unidad de inactivación mayor sobre el resultado obtenido con el tratamiento de irradiación. A nivel estadístico, se observan diferencias altamente significativas entre la fotocatálisis y el tratamiento de irradiación (p<0,001). A los 5 minutos de tratamiento, que supone el fin de tratamiento para las células vegetativas, la eliminación de esporos observada es inferior a 1 unidad logarítmica. Se pone de manifiesto que los esporos, como formas de resistencia Capítulo 6 POAs basados en ozono 231 Tabla 6.23. Costes del tratamiento de ozonización, peroxona, O 3 /TiO 2 y O 3 /TiO 2 /H 2 O 2 para la inactivación de un 1 unidad logarítmica sobre C. perfringens (células vegetativas) y Enterococcus sp. Tratamiento Microorganismo Coste (€ m -3 ) Cél. vegetativas 0,039 Ozonización Enterococcus sp. 0,041 Cél. vegetativas 0,017 Peroxona Enterococcus sp. 0,007 Cél. vegetativas 1,584 O 3 /TiO 2 Enterococcus sp. 1,554 O 3 /TiO 2 /H 2 O 2 Enterococcus sp. 1,578 Se vuelve a observar que los tratamientos que suponen un mayor coste son aquellos que utilizan dióxido de titanio, ya que supone el reactivo más caro. El coste asociado al tratamiento peroxona es menor que el calculado para la ozonización y es que a pesar de contar con el añadido de H 2 O 2 , al utilizarse menos dosis de ozono por ser el tratamiento peroxona más rápido y efectivo que el tratamiento de ozonización, resulta en definitiva más barato. Capítulo 7. Conclusiones Capítulo 7 Conclusiones 235 Para finalizar este trabajo de Tesis, en este capítulo se presentan las principales conclusiones extraídas consecuencia de los resultados obtenidos, tanto a nivel general como a nivel particular, relativos a cada uno de los tratamientos investigados. 7.1. Conclusiones generales  Se puede conseguir eliminar de las aguas Clostridium perfringens y Enterococcus sp. de manera eficaz usando POAs de manera alternativa a los procesos de cloración convencional.  Las células vegetativas de C. perfringens presentan una mayor sensibilidad que Enterococcus sp. y a su vez, que sobre sus formas esporuladas frente a los tratamientos de oxidación avanzada.  La presencia de materia orgánica disminuye la efectividad de los tratamientos aplicados.  La radiación UVB presenta un elevado poder bactericida. La presencia de esta radiación en el tratamiento enmascara cualquier efecto producido por los otros agentes oxidantes estudiados.  Es necesaria la activación del dióxido de titanio mediante una fuente de irradiación adecuada (λ<385 nm) para que participe activamente en el fenómeno de desinfección.  La combinación de irradiación UV/VIS (λ>320 nm) con dióxido de titanio o con peróxido de hidrógeno mejora de manera sustancial la desinfección obtenida sobre C. perfringens y Enterococcus sp. respecto al tratamiento de irradiación por si solo.  La combinación de ozono con dióxido de titanio o con peróxido de hidrógeno mejora los resultados de inactivación obtenidos sobre C. perfringens y Enterococcus sp. en relación al tratamiento de ozonización en solitario.  El dióxido de titanio no interacciona de manera positiva con el peróxido de hidrógeno.  Los modelos matemáticos primarios de Hom, Hom modificado, bifásico, Mafart y Geeraerd describen adecuadamente las cinética de desinfección de los Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 236 tratamientos de cloración, ozonización y de irradiación UV/VIS estudiados, sobre células vegetativas y esporos de C. perfringens y Enterococcus sp.  En relación a los costes asociados, para obtener 1 unidad logarítmica de inactivación, el tratamiento de cloración es el que resulta el más económico, seguido de los tratamientos basados en ozono, siendo los más caros aquellos en los que interviene el dióxido de titanio. 7.2. Conclusiones particulares Eliminación de C. perfringens y Enterococcus sp. mediante tratamientos convencionales  El tratamiento convencional de potabilización a escala real cumple con los criterios de desinfección exigidos por el RD 140/2003 en base al análisis de los parámetros microbiológicos C. perfringens y Enterococcus sp., si bien las etapas que mayor grado de eliminación suponen son la preoxidación y oxidación intermedia, seguidas de la coagulaciónfloculación.  A escala laboratorial, la etapa de cloración es la responsable de la mayor parte de la eliminación de C. perfringens y Enterococcus sp., seguida de la etapa de filtración.  Las etapas de coagulación-floculación y decantación y adsorción con carbón activo no influyen mucho en la reducción de las poblaciones de C. perfringens y Enterococcus sp. con respecto al resto de las operaciones.  Las poblaciones esporuladas de C. perfringens presentan una mayor resistencia al cloro que sus formas vegetativas.  C. perfringens (tanto en su forma vegetativa como esporulada) se ve menos afectada por las concentraciones residuales de cloro que Enterococcus sp.  Las curvas de inactivación de C. perfringens, células vegetativas y esporos y de Enterococcus sp. se caracterizan por una fase de inactivación lineal inicial rápida seguida de una fase de disminución lenta, obteniéndose la formación de una cola o tailing-off.  Los modelos matemáticos de Hom modificado, Mafart y bifásico se ajustan adecuadamente a las curvas de inactivación de las tres formas bacterianas. Capítulo 7 Conclusiones 237 Eliminación de C. perfringens y Enterococcus sp. mediante radiación solar Sobre las poblaciones de C. perfringens (células vegetativas y esporos)  Los tratamientos de fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 (λ> 320 nm) mejoran la capacidad de desinfección alcanzada por el tratamiento de irradiación en solitario, tanto sobre las formas vegetativas (en 5, 7 y 5,8 veces, respectivamente) como sobre las formas esporuladas (6,5, 5,6 y 5 veces, respectivamente).  En términos estadísticos, se observan diferencias significativas entre los tratamientos de fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 respecto al tratamiento de irradiación y entre la fotocatálisis y el tratamiento de irradiación/H 2 O 2 (p<0,05) sobre las células vegetativas. Respecto a esporos, también se detectan diferencias significativas entre la fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 respecto a la irradiación (p>0,05).  Las poblaciones esporuladas de C. perfringens presentan una mayor resistencia a los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/ H 2 O 2 que sus formas vegetativas.  La presencia de H 2 O 2 como un adicional aceptor de electrones acelera la velocidad fotolítica y fotocatalítica de inactivación de las poblaciones vegetativas de C. perfringens, aunque respecto a las poblaciones esporuladas, sólo incrementa el nivel de inactivación del tratamiento de irradiación, ya que en este caso la fotocatálisis es más eficaz que el el tratamiento fotocatálisis/H 2 O 2 .  No se aprecia un fenómeno de sinergia entre el TiO 2 y el H 2 O 2 en presencia de radiación solar en los ensayos de las células vegativas y esporos de C. perfringens.  Las variables más influyentes en la inactivación de las células vegetativas son el tiempo de tratamiento y el H 2 O 2 . Respecto a los esporos, las más influyentes son el tiempo de tratamiento, el H 2 O 2 y el TiO 2 . La interacción más significativa para ambas formas celulares es la combinación [TiO 2 ][H 2 O 2 ]. Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 238 Sobre las poblaciones de Enterococcus sp.  La presencia de la radiación UVB en los tratamientos de irradiación (λ> 290 nm) produce por si sola la completa inactivación de las poblaciones de Enterococcus sp, por lo que la adición de TiO 2 , H 2 O 2 o su combinación no mejoran significativamente los resultados de desinfección obtenidos con la irradiación por si sola (λ> 290 nm).  No existen diferencias significativas entre los tratamientos de irradiación, fotocatálisis, irradiación/H 2 O 2 y fotocatálisis/H 2 O 2 (p>0,05).  El tratamiento irradiación/H 2 O 2 muestra un “efecto residual” sin detectarse un recrecimiento posterior durante 3 horas de oscuridad. El resto de tratamientos no consiguen una desinfección total del agua al final del tratamiento por lo que se observa una recuperación bacteriana en el periodo post-tratamiento.  No se aprecia un fenómeno de sinergia entre el TiO 2 y el H 2 O 2 en presencia de radiación solar en los ensayos de Enterococcus sp.  Las variables más influyentes en la inactivación de Enterococcus sp. son la radiación UVB, seguida del tiempo de tratamiento y la interacción más influyente es la [radiación UVB][TiO 2 ].  En ausencia de radiación UVB, los tratamientos fotocatálisis, fotocatálisis/H 2 O 2 e irradiación/H 2 O 2 (λ> 320 nm) obtienen resultados superiores de inactivación con respecto a la irradiación en solitario (7,6; 6,3 y 1,3 veces más, respectivamente), mostrando diferencias significativas con los dos primeros tratamientos (p<0,05).  No se observan diferencias en los resultados de inactivación obtenidos con irradiación intermitente y continua, a excepción del tratamiento de irradiación, donde el efecto bactericida es dos veces superior al incrementar el tiempo de irradiación continua.  Las células vegetativas de C. perfringens son las formas más sensibles a los tratamientos de irradiación estudiados, pues alcanzan mayores niveles de inactivación en un menor tiempo. A continuación, Enterococcus sp. alcanza inactivaciones mayores que los esporos, salvo en el tratamiento de irradiación/H 2 O 2 . Capítulo 7 Conclusiones 239  No se pueden obtener conclusiones del comportamiento post-irradiación ya que ninguno de los tratamientos alcanza una desinfección completa de la muestra al final de los ensayos.  Las variables más influyentes en la inactivación de Enterococcus sp. son el tiempo de tratamiento y el TiO 2; la interacción más importante el [tiempo][TiO 2 ]. Eliminación de C. perfringens y Enterococcus sp. mediante ozono  Los tratamientos de ozonización, peroxona, O 3 /TiO 2 y O 3 /H 2 O 2 /TiO 2 consiguen inactivar de manera efectiva las poblaciones de células vegetativas de C. perfringens y Enterococcus sp.  C. perfringens es más sensible al tratamiento peroxona que a los tratamientos de ozonización y O 3 /TiO 2 , mientras que Enterococcus sp. se inactiva de manera similar con los tratamientos de peroxona y O 3 /TiO 2 , y más lentamente con la ozonización y el O 3 /H 2 O 2 /TiO 2 .  La presencia de materia orgánica natural en el agua reduce el poder bactericida del ozono ya que compite con las bacterias presentes en la muestra por las especies reactivas desinfectantes generadas durante el proceso, confirmando que la desinfección con ozono depende de la calidad del agua.  Las variables más influyentes y las más significativas en la inactivación de las células vegetativas de C. perfringens son el tipo de muestra (natural o sintética), la dosis de O 3 y la presencia de H 2 O 2 .  La variable más influyente en la inactivación de Enterococcus sp. es la dosis de ozono y la interacción más significativa es la combinación [TiO 2 ][H 2 O 2 ].  Las curvas de inactivación de C. perfringens y Enterococcus sp. no responden a funciones lineales sino que presentan cola y en el caso concreto de los tratamientos de ozonización y O 3 /TiO 2 , las gráficas de C. perfringens son sigmoideas, con hombro y cola.  Los modelos matemáticos aplicados son adecuados para describir la inactivación de ambas especies por los tratamientos de ozono estudiados.  Los costes asociados a los tratamientos de ozonización se elevan por la incorporación del reactivo TiO 2 sin derivar en resultado que compensen su Dpto. Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 240 incorporación al proceso. Por el contrario, la adición de H 2 O 2 disminuye los costes que suponen los tratamientos de ozonización, mejorando además los resultados obtenidos. Capítulo 8 Bibliografía 247 Fernando W.J.N. y Othman R. 2006. Relevance of diffusion through bacterial spore coats/membranes and the associated concentration boundary layers in the initial lag phase of inactivation: A case study for Bacillus subtilis with ozone and monochloramine. Mathematical Biosciences, 199, 175-187. Finch G.R., Yuen W.C., Uibel B.J. 1992. Inactivation of Escherichia coli using ozone and ozone-hydrogen peroxide. Environmental Technology, 13, 571-578. Galofré B., Israel S., Dellundé J., Ribas F. 2004. Aerobic bacterial spores as process indicators for protozoa cysts in water treatment plants. Water Science and Technology, 50 (1), 165-172. Gamazo C., López-Goñi I., Díaz R. 2005. Manual práctico de microbiología. Ed. 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Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Zaragoza 264 Anexo Publicaciones científicas 265 Ozone: Science and Engineering, 30: 431–438 Copyright #2008 International Ozone Association ISSN: 0191-9512 print / 1547-6545 online DOI: 10.1080/01919510802488003 Bactericidal Effectiveness of O 3 ,O 3 /H 2 O 2 and O 3 /TiO 2 on Clostridium perfringens M. Lanao, M.P. Ormad, C. Ibarz, N. Miguel, and J.L. Ovelleiro Department of Chemical Engineering and Environmental Technologies, University of Zaragoza, Pedro Cerbuna, Zaragoza, Spain The purpose of this research is to evaluate the bactericidal capacity of different Advanced Oxidation Treatments (AOTs) based on ozone: ozone, ozone/hydrogen peroxide and ozone/titanium dioxide on a wild strain of Clostridium perfringens, a fecal bacterial indicator in drinking water. The dose of ozone consumed ranges from 0.6 mg L 1 min 1 to 5.13 mg L 1 min 1 depending on the process and on the sample. In the treatments combined with O 3 ,H 2 O 2 dose utilized is 0.04 mM and TiO 2 dose, 1 g L 1 .Inorderto evaluate the influence of natural organic matter and suspension solids over the disinfection rate, treatments are performed with two types of water – natural water from Ebro River (Zaragoza, Spain) and NaCl solution 0.9%. To achieve 4 log units of inactivation, 3.6 mg O 3 L 1 is necessary in O 3 treatment, 4.25 mg O 3 L 1 in O 3 /TiO 2 system and 2.7 mg O 3 L 1 in O 3 /H 2 O 2 after processing the natural water. In NaCl solution, to get the same inactivation, 0.42 mg O 3 L 1 is necessary in O 3 treatment, 1.15 mg O 3 L 1 in O 3 /TiO 2 system and 0.06 mg O 3 L 1 in O 3 /H 2 O 2 process. Even though the three treatments studied have a high bactericidal activity due to the number of surviving bacteria decreases to non-detectable levels, O 3 /H 2 O 2 is the most effective system for eliminating C. perfringens cells in a lower contact time, followed by O 3 and finally O 3 /TiO 2 system. Keywords Clostridium perfringens, Ozone, Hydrogen Peroxide, Titanium Dioxide, Drinking Water, Disinfection, Advanced Oxidation INTRODUCTION Historically, the transmission of pathogenic microorganisms through the water has been the more serious source of epidemics in some diseases. In 1854, London suffered a cholera epidemic, being one of the early diseases to be recognized as a waterborne illness (Bates, 2000). Nowadays, the list of waterborne diseases is considerably longer and it includes bacteria, viruses and protozoa. Above all, underdeveloped countries are the most affected by these types of diseases due to problems of access to drinking water sources (EPA, 1999). Due to the pollution of natural water by substances which come from the environment and from the massive and indiscriminate use of the human, this type of water, generally, cannot be used for a certain use without a previous correction of one of several parameters. If the purpose of water is the human consumption, the application of a previous process called potabilization is necessary and it is carried out in facilities created with this aim called drinking water plants. Potabilization process has as objectives the elimination from natural waters of pathogenic microorganisms (disinfection) and the elimination of organic and inorganic pollutants (oxidation). Drinking water disinfection provides the final barrier to transmission of a wide variety of potentially waterborne infectious agents. Most of pathogenic microorganisms are discharged into natural waters through wastewaters and their presence indicates fecal pollution, representing a public health risk. In contrast to chemical pollutants, a lower tolerable limit for microbiological pollutants is not allowed in analysis of water for human consumption, due to a little quantity of pathogens into a host is capable of developing an infection, even the death of the host. So, water for consumption, cooking and drinking and personal hygiene must not contain any pathogenic agent for human beings (WHO, 1995). This characteristic turns the microbiological analysis of water in a vital analysis. Consequently to the founding in Europe of the Directive 98/83/CE on quality of water for human consumption, a systematic control about fecal bacterial indicators must be made in this type of water. This new Directive has included the bacterium Clostridium perfringens as a new microbiological parameter to check because the traditional indicators Received 3/12/2008; Accepted 8/15/2008 Address correspondence to M. Lanao, Department of Chemical Engineering and Environmental Technologies, University of Zaragoza, Pedro Cerbuna, 12. 50009, Zaragoza (Spain). E-mail: [email protected] Bactericidal Effectiveness November–December 2008 431 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 (such as Escherichia coli and coliforms) are inactivated in a short time with the conventional disinfection treatments of water, as the chlorine (Payment, 1999) creating a false sense of security. Several researches have reported that traditional bacterial indicators often indicate water is free of fecal pollution, although viruses, protozoa and bacteria which form spores appear in it, showing that these indicators are not completely reliable (Gesche, 2003). C. perfringens, in view of adverse situations, forms spores and survives in water for much longer than coliforms. Therefore, its presence in disinfected water can indicate the treatment has been deficient and maybe, other resistant pathogens have also survived. So, in the last years it has been reported that C. perfringens could be a suitable indicator for the presence of pathogens of fecal origin in surface waters (Payment and Franco, 1993; Hijnen et al., 2000) and a biological indicator of disinfection efficiency in water systems, so it has been selected to perform this research. C. perfringens is included in the Spanish Drinking Water Decree (Royal Decree 140/2003) as part of the microbiological standards for drinking water, monitoring in 100 mL samples at surface water treatment plants. Conventional water treatment includes a group of processes (preoxidation, activated carbon adsorption, coagulation-flocculation-decantation, intermediate oxidation, sand filtration and post-chlorination) that when are applied to raw water sources contribute to the reduction of microorganisms of public health concern. Although chlorine is the most common water disinfectant currently in use in the world, undesired by-products such as trihalomethanes are formed. These disinfection by-products exhibit a potentially carcinogenic activity and as consequence, it has made possible its gradual substitution by other agents as ozone. However, it will be used as disinfectant in the final disinfection for much longer because chlorine is the only agent with residual power, ensuring the arrival of disinfected water to points of consumption (Bueno, 1997). Today, new processes called advanced oxidation techniques (AOTs) are being researched as an alternative for the removal of particular pollutants in water and so, to avoid the generation of dangerous by-products during drinking water treatment. These techniques generate high concentrations of hydroxyl radicals, highly reactive chemical species. Ozone in water can follow two pathways: direct oxidation of compounds by molecular ozone and indirect oxidation through hydroxyl free radicals produced during the decomposition of ozone and from reactions between ozone and some organic and inorganic species in water (Hoigne ´and Bader, 1983). Hoigne ´and Bader (1997) found that under acidic conditions, the direct oxidation with molecular ozone is of primary importance. Under conditions favoring hydroxyl free radical production, such as high pH, exposure to UV or addition of hydrogen peroxide, the hydroxyl oxidation stars to dominate. As well as the hydroxyl radicals, other radicals are generated such as superoxide, ozonide and hydroperoxide radicals. The chain mechanism is describing next (Kuo et al., 1999): Initiation:O3þOH!O 2þHO2 HO2$O 2þHþ Propagation:O 2þO3þHþ!2O2þOH OHþO3!HþþO 2þO2 Termination:combinations of O 2;HO2and OH At pH of natural water, both mechanisms of ozone reaction can coexist. In order to favor the radical scheme of ozone reaction, some substances can be added to ozone producing AOTs. The ozone decomposition by the radical scheme can increase with the presence of OH  , hydrogen peroxide, photolysis by ultraviolet radiation and metallic catalysts (Oppenla ¨nder, 2003). The result of the addition of hydrogen peroxide to ozone is the peroxone system. H 2 O 2 is a very important initiator, which may influence the ozonation process. After adding hydrogen peroxide to ozone, one part of this is dissociated to HO 2  which has a higher ability of initiation than OH  and accelerates the decomposition of ozone. The result of the addition of titanium dioxide to ozone is the catalytic ozonation process. The catalyst may discompose the ozone into free radicals or adsorb one or both reactants (ozone and pollutants) making easier their reactions. It is not well understood which mechanism is responsible for the inactivation of microorganisms: the molecular ozone or the intermediate radicals formed. Some researchers believe that ozone disinfection is a result of direct ozone reaction (Finch et al., 1992; Hunt and Marin ˜as, 1999; Labatiuk et al., 1994) while others believe that the hydroxyl radical mechanism for disinfection is the most important mechanism (Bancroft, 1984). The first site to be attacked seems to be the bacterial membrane. It also disrupts enzymatic activity of bacteria by acting on the sulfhydryl groups of certain enzymes. Beyond the cell membrane and cell wall, ozone may act on the nuclear material within the cell (Giese and Christensen, 1954). Despite, the sensibility of microorganisms to ozone is affected by the organic matter present in water and by the physicochemical parameters (Bezirtzoglou et al., 1994). So, the aim of this research is to compare the disinfectant capacity of several new oxidation techniques which are being studied in the last years as a substitute of the chlorine in the preoxidation and intermediate oxidation stages in the drinking water treatment, that is O 3 (ozonation) and O 3 combined with H 2 O 2 (peroxone) 432 M. Lanao et al. November–December 2008 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 and TiO 2 (catalytic ozonation) on a population of C .perfringens and to evaluate in which grade the organic matter in a surface natural water improves or makes worth that inactivation. MATERIAL AND METHODS Samples Disinfection treatments are carried out with two different types of water: natural water and NaCl 0.9% solution. Water samples are collected from the Ebro River, higher up of the entrance point to the drinking water plant in Zaragoza. A sample of 25 liters is distributed in recollection bottles ISO with a volume of 1 Liter. Samples are conserved at 20C for a perfect support. Total Organic Carbon (TOC) of the natural sample is 3±1 mg L 1 . The NaCl solution is prepared from sodium chloride reactive (Panreac) dissolved in ultrapure milliQ Ò water up to get a solution 0.9% and with a pH similar to natural water to work in the same conditions. Samples, in a natural way, present a low concentration on C. perfringens (3–5 10 2 CFU/100 mL) and it is necessary to increase this population in an artificial way, to fortify them. So, a cell concentrated suspension is prepared. For this, a wild C. perfringens strain isolated from Ebro River is incubated on the enrichment Schaedler agar (Scharlab) with 5% defibrinated sterile sheep blood. After 24 h at 37C, cells are carefully transferred from the agar layer and suspended in saline solution. The mixing natural water or NaCl solution with the cell suspension is the sample to study. These fortified samples have initial populations of C. perfringens, which range from 10 6 to 10 8 CFU/100mL. Analysis of Physical-Chemical Parameters Table 1 shows the relation of physicochemical parameters used in the characterization of samples, just as the analytic methodology and instrumentation related. Test Clostridium perfringens The culture and enumeration of C. perfringens is carried out according to the procedure ISO 6461-2:1986. The analysis of the samples is performed by the method membrane filtration. Sterile cellulose membranes (Millipore) of 0.22 mm pore size and 47 mm diameter are used. After a sample is filtered under vacuum, the membrane is placed into a Petri dish, agar SPS (Scharlab) is poured on it and is incubated in anaerobic jars (Oxoid) at 37C. After 18–24 h, black colonies are counted and Gram stain is made as confirmation test from some of them. From each sample taken, several different volumes are filtered to ensure a reliable count in each sampling time. The enumeration of colonies is explained as CFU (colony-forming units) per 100 mL of sample in each contact time. These concentrations are transformed to log 10 and the removal of bacteria, Log (N t /N 0 ), is calculated from the initial C. perfringens population (N 0 )and the remaining C. perfringens population at time t (N t ). OZONATION, PEROXONE AND CATALYTIC OZONATION ON LABORATORY SCALE Materials All glassware used is autoclaved at 121C for 15 min. to be sterile. All solutions and culture mediums are prepared with ultrapure MilliQ Ò water and analyticalreagent grade chemicals are used throughout. The catalyst used in this study is treated TiO 2 obtained from commercial TiO 2 100% anatase (Panreac). Treated TiO 2 is obtained by a thermal treatment that consists of a heating at 900C for 12 h. After cooling down until room temperature, TiO 2 was pressed, crushed and sieved to obtain a particle diameter of 0.5 mm. It is characterized by FTIR and BET Methods. Specific area is 6.43 g m 2 . FTIR shows that treated TiO 2 is a mixture of 80% anatase and 20% rutile. The solution of hydrogen peroxide is prepared from a concentrated H 2 O 2 solution at 30% by weight (Carlo Erba, quality for analysis). Ozone Generator Ozonation experiments are performed with ozone generated ‘‘in situ’’ in the laboratory from dry prefiltered oxygen by using a Fischer Model 500 ozone generator. Ozone generator consists of two electrodes. A high voltage is produced between them and pure oxygen current flows through them. A discharge occurs and atomic oxygen is produced. When atomic and molecular oxygen are combined, an ozone molecule is generated. The ozone generator is connected to a glass closed reactor where sample is located and the ozone gas is transferred to TABLE 1. Physical-Chemical Parameters Analysis Parameter Instrument Brand Model Error Standard Method pH pH-meter Crison GLP 21 0.02 pH 0.3C 4500-HB Standard Methods Conductivity Conductimeter Crison Basic 30 0.5C Norma UNE-EN 27888:1994 Ozone residual Ozone Photometric Tester Merck DPD 2.0% Total Organic Carbon (TOC) TOC tester Shimadzu TOC-Vcsh 5–10% 5310 B Standard Methods Bactericidal Effectiveness November–December 2008 433 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 it through a bubble diffuser contactor (O 3generated ). This reactor works in semi-continuous mode: continuous to gas and discontinuous to liquid. All experiments are conducted in the ozonation reactor described in Figure 1. Ozone not transferred into the process water during contacting is released from the reactor as O 3 no consumed . This O 3 no consumed is routed to two ozone destruct units containing 250 mL of a 2% KI solution. When the ozone reacts with this KI, it is reduced to oxygen and is releasing to the atmosphere as an innocuous element. Both ozone generated and ozone not consumed are calculated by a iodometric method (Kolthoff and Belchor, 1957). Ozone residual, dissolved in the sample, is measured by a color-meter test (Merck) associated to UV/Vis spectrophotometer (Thermospectronic, Helios a). Therefore, the ozone consumed by the sample is calculated according to the next formula: O3 consumed ¼O3 generatedO3 no consumed O3 residual dissolved: In the O 3 /TiO 2 and O 3 /H 2 O 2 experiments, the TiO 2 and H 2 O 2 are added into the reactor at the same time that the ozone begins to spread through the sample. In order to compare the results obtained with the three types of disinfection systems, these results are expressed as mg O 3 L 1 because of the initial volume in the reactor changes after taking the samples along the experiment, varying the ozone concentration applied. Operation Conditions The three treatments are carried out with each type of sample at room temperature in triplicate. The reactor used to house the sample is made of Pyrex glass. It is spherical and has a capacity of 3 L. Each treatment lasts 10 min. and the initial sample volume is 1.5 L. Ozone generator produces 577.6 mg O 3 h 1 using an oxygen flow of 100 L O 2 h 1 .The ozone consumed is around 3.5–3.8 mg O 3 L 1 min 1 in natural water. In NaCl solution, the ozone consumed ranges from 0.6–2.9 mg O 3 L 1 min 1 . The dose of TiO 2 added in O 3 /TiO 2 system is 1 g L 1 and the H 2 O 2 concentration utilized in O 3 /H 2 O 2 process is 0.04 mM. As well as these three experiments made with ozone as common element, two control experiments are carried out: TiO 2 and H 2 O 2 alone. At different intervals of time, samples are taken into sterile glass bottles with sodium thiosulphate to neutralize the residuals of ozone and hydrogen peroxide and so, to avoid these components go on exerting their bactericidal action. RESULTS AND DISCUSSION Physical and Chemical Results Results relating to analysis of physicochemical parameters in each contact time in the experiments performed are shown in Tables 2 and 3. Table 2 shows the results obtained using the natural sample and Table 3 the results from the synthetic sample. There is not a significant FIGURE 1. Diagram of the ozonation equipment. TABLE 2. Physicochemical Results of Experiments Realized in Natural Fortified Sample Sampling time (min) Ozone residual (mg L 1 ) pH Conductivity (mscm 1 ) O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 0 0 0 0 7.32 7.71 7.66 574 610 595 0.5 0.042 0.054 0.136 7.33 7.73 7.77 589 605 597 1 0.035 0.036 0.084 7.58 7.75 7.81 553 584 607 5 0.022 0.004 0.082 7.60 7.97 7.87 577 611 595 10 0.008 0 0.074 7.88 8.11 7.87 798 611 611 434 M. Lanao et al. November–December 2008 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 variation in pH and conductivity values after the processes studied. It is important to remark that there is not any important modification in the TOC along the different treatments. Influence of Natural Organic Matter on the Survival of C. perfringens If the treatments of ozonation, peroxone and catalytic ozonation are compared in each type of sample, as Figure 2 TABLE 3. Physicochemical Results of Experiments Realized in NaCl Solution Sampling time (min) Ozone residual (mg L 1 ) pH Conductivity (ms cm 1 ) O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 0 0 ND 0 6.72 7.96 6.42 14.80 14.95 14.76 0.17 0.024 ND 0.234 7.56 7.84 6.40 14.92 14.98 14.81 0.5 0.028 ND 0.140 8.61 7.73 6.41 14.99 15.01 14.86 1 0.022 ND 0.144 7.78 7.69 6.38 14.89 14.91 14.95 5 0.030 ND 0.126 6.87 7.31 6.32 14.73 14.96 14.80 10 0.020 ND 0.118 6.77 7.10 6.23 14.85 14.91 14.85 ND: no data 1,0E+00 1,0E+01 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 mgO3/L Baterial inactivation UFC/100ml 0 1 2 3 4 5 0123456 mgO3/L (a) 1,0E+00 1,0E+01 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 1,0E+08 1,0E+09 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 mgO3/L Bacterial inactivation UFC/100ml ,,, 0 1 2 3 4 5 0 0,5 1 1,5 2 mgO3/L (b) FIGURE 2. Inactivation curves of C. perfringens exposed to O 3 (^) , O 3 /H 2 O 2 () and O 3 /TiO 2 (&) treatments in natural fortified water (a) and in NaCl solution (b) as a function of mgO 3 /L. Bactericidal Effectiveness November–December 2008 435 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 shows, the inactivation curves of C. perfringens in the NaCl solution show faster inactivation than those with natural water. Figure 2a shows that in natural sample, the bacterial concentration decreases slower and it is necessary a higher dose of ozone to get the same level of inactivation than in NaCl solution. To achieve 4 units log of inactivation or 99.99% reduction, 3.6 mg O 3 L 1 is necessary in O 3 treatment, 4.25 mg O 3 L 1 in O 3 /TiO 2 system and 2.7 mg O 3 L 1 in O 3 /H 2 O 2 in the natural sample. However, as we can observe in Figure 2b, to achieve the same inactivation, 0.42 mg O 3 L 1 in O 3 treatment, 1.15 mg O 3 L 1 in O 3 /TiO 2 system and 0.06 mg O 3 L 1 in O 3 /H 2 O 2 process is necessary in the synthetic sample. There is a correlation between these results obtained and the fact that the presence of organic matter reduces the inactivation kinetics by competing with bacteria for the different oxidant species formed along the treatment (Ireland, 1993).The microbial aggregates can also affect the efficiency of disinfection because a fortress is created in the presence of disinfectants. As Hunt and Marin ˜as (1999) suggest, the dissolved ozone is decomposed in a way faster in the presence of humic acids and, so, bacteria are less exposed to the disinfectant, being slower their inactivation. Ozone reacts with dissolved, colloidal and particulate matter existing in natural water and these reactions might interfere with some of the reactions responsible for C. perfringens inactivation. However, in NaCl solution, there is not any natural organic matter except for integral components of the bacterial cell membranes and so, ozone and hydroxyl radicals only can attack organic structures of the bacterial membranes, altering their composition and functions and causing their death much faster. So, the slope in the curve is greater. In Tables 4 and 5, the bacterial logarithmic inactivation as a function of the contact time and of the quantity of mg O 3 L 1 is represented in the natural water and in the NaCl solution respectively. It is important to mention that the high level of logarithmic inactivation is different in each experiment carried out due to the different initial concentrations of bacteria because of the inherent difficulty of preparing the bacterial suspension. In all cases, the removal of bacteria gets non-detectable levels by the method of analysis, considering a total and successful disinfection. In the control experiments carried out with TiO 2 and H 2 O 2 (in absence of O 3 ), there is not practically removal of C. perfringens, so they have a weak bactericidal activity in water disinfection by themselves. Disinfection of O 3 ,O 3 /H 2 O 2 and O 3 /TiO 2 in Natural Water If we pay attention in Figure 2a, the most effective treatment to achieve faster levels of inactivation on the initial population of C. perfringens is the combined O 3 /H 2 O 2 system. It removes 4 units log in a lower contact time, being this reduction, a suitable disinfection (Venczel et al., 2004).The addition of H 2 O 2 increases the bactericidal effect that ozone itself has, getting a reduction of 4 log units in 45 sec. with a dose of 2.7 mg O 3 L 1 against the 58.2 sec. with O 3 alone and a dose of 3.6 mg O 3 L 1 . This combination favors the production of high-energy hydroxyl radicals (OH*) from the accelerated decomposition of ozone by hydrogen peroxide (Glaze et al., 1987; Staehelin and Hoigne ´,1982).The indirect pathway of ozone is favored in respect of the direct one due to the conversion of ozone molecules to hydroxyl radicals, increasing their concentration with respect to O 3 system and so, doing more efficiency the peroxone treatment in the conditions studied. Similar results are shown by Cho and Yoon (2006) after a study about the enhanced bactericidal effect of the peroxone followed by chlorination on Bacillus subtilis spores, suggesting this system as a viable alternative when O 3 alone does not satisfy the disinfection requirement and reporting that the OH radical itself is much more effective in inactivating microorganisms than ozone molecule. With respect to the O 3 /TiO 2 system, to achieve a reduction of 4 units log, a contact time of 1.2 minutes and 4.25 mg O 3 L 1 is necessary. It is the slowest system but the disinfection is adequate. In the catalytic ozonation in natural water, several mechanisms are produced at the same time: the ozonation in the medium of the constituents dissolved by means of a direct pathway of the molecular ozone and an indirect mechanism of the radical species formed from the autodecomposition of ozone and the ozonation on the surface of TiO 2 catalyst of the TABLE 4. Logarithmic Inactivation of C. perfringens and the Respective dose of Ozone Consumed in Natural Fortified Sample Contact time (min) Ozone consumed (mg L 1 )C. perfringens inactivation (Log Nt/No) O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 0000000 0.5 1.57 1.64 1.6 0.2 ND 0.7 1 3.76 3.53 3.46 4.3 5.3 3.9 5 23.5 21.9 21.42 5.1 6.0 5.7 10 62.5 57.97 56.7 5.7 6.0 6.0 436 M. Lanao et al. November–December 2008 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 particles adsorbed. Gogniat (2006) suggests that both OH radicals and an adsorption of bacteria on active TiO 2 particles take part in disinfection. It is important to remark that the effectiveness of the catalytic ozonation depends on many factors such as the catalyst surface, the pH of the solution, and so on. According to the bibliography reviewed (Nawrocki et al., 1993; Winkler and Marme ´, 2002; Beltra ´n et al., 2002) the pH of point of zero charge TiO 2 is between 5.6 and 6.4. Therefore, as TiO 2 has Lewis acid sites in its surface, at pH worked with the natural sample (7.5–8) the adsorption of pollutants is not effective because the presence of ions OH- (strong Lewis bases) that adsorb in the TiO 2 surface preventing pollutants adsorption (Kasprzyk-Hordern et al., 2003). A common dosage of ozone used in the main drinking water plants is about 3 mg L 1 , so if this value is taken as a reference, the removal of C. perfringens achieved is 2.8 log units in O 3 system, 4.5 log units with O 3 /H 2 O 2 process and 3.1 units with O 3 /TiO 2 treatment. So, these results indicate that TiO 2 does not suppose a significant help to the ozone action unlike the H 2 O 2 . If the parameter CT is used as tool to compare the disinfectant capacity of different agents (CT is calculated as disinfectant residual (mg L 1 ) multiplied by contact time (min) to achieve a specified level of inactivation) on the inactivation of pathogens, as Table 6 shows, the treatment with the lower value of CT such as to achieve 2 log units or 99% of removal as to achieve 4 log units or 99.99% reduction, is O 3 /H 2 O 2 treatment. So, this treatment is chosen as the best process to achieve a fast and effective disinfection. It is followed by the O 3 system and finally, O 3 /TiO 2 . CONCLUSIONS Advanced Oxidation Processes, O 3 and its combination with H 2 O 2 and TiO 2 were conducted to evaluate the bactericidal capacity of these treatments on C. perfringens, indicator of fecal pollution. All test C. perfringens were inactivated more rapidly by O 3 /H 2 O 2 than by O 3 and O 3 /TiO 2 under all conditions tested. The addition of H 2 O 2 to O 3 favors its decomposition increasing the free hydroxyl radical concentration (a 99.99% of removal is achieved with 2.7 mg O 3 L 1 in 45 seconds in O 3 /H 2 O 2 treatment against 3.6 mg O 3 L 1 and 58.2 sec in O 3 system). However, TiO 2 does not improve in an important way the disinfection efficiency if it is added to ozone (4.25 mgO 3 L 1 and 1.2 min of treatment). The three treatments studied have a high bactericidal activity due to the number of surviving bacteria decreases to nondetectable levels. Our work also indicates that organic matter in natural water makes difficult the disinfectant capacity of the treatments studied, getting an inactivation faster in NaCl solution than in natural water, due to the particulate matter competes with microorganisms for the actuation of disinfectants. ACKNOWLEDGMENTS This research is partially financed by the ‘‘Secretarı´ade Estado de Universidades e Investigacio ´n’’ of the Ministry of Education and Science (Spain) with the Project CTM2005–04585/TECNO called ‘‘Drinking Water Production By Advanced Oxidation Technologies In River Ebro Basin’’. The authors also thank ‘‘Gobierno de Arago ´n’’ for the PhD grant to Munia Lanao. TABLE 5. Logarithmic Inactivation of C. perfringens and the Respective dose of Ozone Consumed in NaCl Solution Contact time (min) Ozone consumed (mg L 1 )C. perfringens inactivation (Log Nt/No) O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 O 3 O 3 +H 2 O 2 O 3 + TiO 2 0000000 0.17 0.38 0.066 0.44 3.9 4.3 1.3 0.5 1.19 0.23 1.37 4.8 5.3 4. 1 2.5 0.6 2.88 5.6 5.5 5.8 5 14.73 3.75 16.96 7.6 7.2 7.4 10 36.15 10.9 41.36 7.6 8.0 7.7 TABLE 6. CT(mgmin/L) Parameter to Achieve 2 and 4 Log Units in the Three Treatments Studied Disinfection treatments CT for 2 log units CT for 4 log units O 3 0.028 0.032 O 3 /H 2 O 2 0.007 0.030 O 3 /TiO 2 0.080 0.10 Bactericidal Effectiveness November–December 2008 437 Downloaded By: [BOSE - Ozone: Science & Engineering] At: 12:17 27 November 2008 Author's personal copy So, it is clear that light by itself, under the operational conditions, has a poor disinfectant effect both on vegetative cells and on spores of C. perfringens. When TiO 2 and light act together, an essential improvement in the disinfection is observed on the vegetative cells and spores because when TiO 2 is irradiated with wavelengths less than 385 nm, it generates on its surface precursors of OH radicals leading to an improvement in the disinfectant activity. Rinco ´n and Pulgarin (2003) emphasizes that during the first minutes of the photolytic treatment, the self-defence mechanisms of cells get to work, trying to thwart the direct effect of the light. Thus during the first minutes, the bacterial inactivation is weak until, if the stress agent persists, these mechanisms cease to be effective. However, when the catalyst takes part in the process, the bactericidal activity is reinforced with the appearance of very reactive oxidant species, ROS, exceeding the protection mechanisms of the cells. Dunlop et al. (2008) underlines higher initial cells loading leads to higher treatment times for a complete inactivation. Another reagent whose addition improves the activity of the sunlight by itself is hydrogen peroxide. Just as TiO 2 in the dark does not have any disinfectant effect (Figs. 2 and 3), the H 2 O 2 has a slow effect by itself (Figs. 4 and 5). Therefore, in the light/H 2 O 2 treatment both on vegetative cells and on spores, the union of the direct oxidative and disinfectant effect of H 2 O 2 is evident, as well as the direct action of the light on bacteria and the break-up of hydrogen peroxide under short wavelengths, generating an important quantity of  OH radicals as by-products. Rinco ´n and Pulgarin (2004)) establishes in his photocatalytic studies about E. coli that the direct action of H 2 O 2 weakens the bacteria, making them more sensitive to the photocatalytic effect. This is in addition to the fact that irradiation also debilitates the bacteria, making them more sensitive to the H 2 O 2 attack. Hartmann and Eisenstark (1978) reported a synergistic killing of E. coli by near-UV radiation (300400 nm) and small quantities of H 2 O 2 (0.006–0.6 mM). The results of inactivation obtained with the light/TiO 2 and light/H 2 O 2 treatments are quite similar for both the cellular forms of C. perfringens under study. However, when light, H 2 O 2 and TiO 2 are combined, the results are not significantly different to the previous ones, so this combination did not play an important role in the disinfection process. There is no synergy between the peroxide and the TiO 2 catalyst because a superior result to the sum of the results of light/TiO 2 and light/H 2 O 2 is not obtained. Thus the light/H 2 O 2 /TiO 2 treatment does not contribute any improvement to the disinfection compared to the light/ TiO 2 and light/H 2 O 2 systems. In spore treatments it is observed, as expected, that spores are more resistant to the aggression than the vegetative cells. Works of Dunlop et al. (2008) and Lonnen et al. (2005) show the same behaviour: bacterial spores show a greater resistance to treatment than vegetative bacterial cells. Furthermore, spores are able to resist in spite of a residual concentration of H 2 O 2 remaining throughout the treatment. It is also observed with spores that there is no interaction between the TiO 2 and the H 2 O 2 to contribute to an improvement in the effectiveness of the process. 4. Conclusions Advanced disinfection systems with light, TiO 2 and H 2 O 2 were studied to compare their effectiveness on the inactivation of C. perfringens spores and vegetative cells. Spores show a greater resistance to all treatments than vegetative bacterial cells, so it is confirmed that C. perfringens spores are better indicators of the effectiveness of water treatments due to their strong resistance to the treatments carried out in this study. Both H 2 O 2 and TiO 2 produces a reinforcement in the synthesis of new  OH radicals which act effectively on bacterial cells and spores. However, not as we expected, when light, TiO 2 and H 2 O 2 work together, worst results are obtained. There is no interaction between TiO 2 and H 2 O 2 . Acknowledgements The authors would like to thank Dr. Javier Yangu ¨ela (University of Zaragoza) and Susana Gimeno for their help in the development of this work. This work was supported by the project CTM2005-04585/TECNO funded by the “Secretarı ´a de Estado de Universidad e Investigacio ´n del Ministerio de Educacio ´n y Ciencia”and the project CTM2008-01876/TECNO cofunded by the “Secretarı ´ade Estado de Universidad e Investigacio ´n del Ministerio de Educacio ´n y Ciencia and the “Gobierno de Arago ´n”(official announcement CAIXA-DGA). 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Ovelleiro Department of Chemical Engineering and Environmental Technologies, Science Faculty, University of Zaragoza, 12 Pedro Cerbuna Street, Zaragoza 50009, Spain Received 24 July 2011; received in revised form 19 October 2011; accepted 9 November 2011 Available online 6 December 2011 Communicated by: Associate Editor Gion Calzaferri Abstract This paper presents research carried out into the disinfectant power of a series of treatments based on the individual application and possible combinations of TiO 2 (1 g/L), H 2 O 2 (0.04 mM) and irradiation (290–800 nm and 320–800 nm) on Enterococcus sp., a faecal bacterial indicator used in water analysis. The main aims are the determination of the influence of the UVB range on the inactivation of Enterococcus sp. in natural water, the mode of application of irradiation (intermittent or continuous) and the capacity of bacterial recovery after the application of the treatments in darkness conditions. The results show that when the irradiation includes the UVB range, a very high degree of inactivation is obtained in an Enterococcus sp. solution in natural water (N 0 =10 8 CFU 100 mL 1 ) by irradiation alone. Neither the addition of TiO 2 nor of H 2 O 2 are very relevant in these conditions. However, if the irradiation does not include the UVB range, the bactericidal action of photolysis is practically nonexistent, highlighting the positive effect of TiO 2 and H 2 O 2 on the irradiation, the photocatalysis and photocatalysis/H 2 O 2 treatments obtaining a higher degree of disinfection. Continuous and intermittent illumination give rise to similar inactivation levels in all the treatments studied, except for photolysis in which a significant increase in inactivation is observed when the irradiation is continuous. During 3 h of darkness following application of the treatments, there is no change or else a slight recovery of the bacterial population. Ó2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Enterococcus; Hydrogen peroxide; Water disinfection; Photolysis; Photocatalysis 1. Introduction In general, one of the main purposes of treating water for drinking or for reuse is disinfection, that is the elimination of pathogenic microorganisms. Chlorination has traditionally been the most extensively used technology with this aim, but since the harmful character was discovered of organochlorated by-products after the application of chlorine in water treatments, the scientific literature has concentrated on finding alternative processes to achieve the disinfection of water and the removal of pollutants without the generation of these by-products (Blake et al., 1999; Chong et al., 2010). Possible treatments for future application include the use of ozone, the Fenton process, the photo-Fenton process and photolysis, all of them susceptible to being combined with other elements to improve their performance, such as hydrogen peroxide, metallic cations and other catalysts. These new treatments, generally called Advanced Oxidation Processes (AOPs) are based on the generation of highly reactive temporary species with a short life. These species, known as reactive oxygen species (ROS), are able to remove a high proportion of pathogenic microorganisms present in waters and to degrade 0038-092X/$ - see front matter Ó2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.solener.2011.11.007 ⇑ Corresponding author. Tel.: +34 976761877; fax: +34 976764221. E-mail addresses: [email protected] (M. Lanao), [email protected] (M.P. Ormad), [email protected] (R. Mosteo), [email protected] (J.L. Ovelleiro). www.elsevier.com/locate/solener Available online at www.sciencedirect.com Solar Energy 86 (2012) 619–625 Author's personal copy organic compounds into simple products or products more easily oxidisable by other stages of the treatment (Maness et al., 1999; Peyton and Glaze, 1988). Among the various AOPs, photocatalytic water treatment technology is an alternative that could be applied in the near future. Many research works guarantee its effectiveness in the removal of highly persistent compounds in water such as pesticides used in agriculture (Ormad et al., 2010), antibiotics and other medicines (Elmolla and Chaudhuri, 2009, 2010), and microorganisms present in water (Chong et al., 2010). Currently, the most extensively studied semiconductor catalyst is titanium dioxide owing to its characteristics of photoactivity, stability and harmlessness. The effectiveness of this technology lies in the triggering of a group of oxidation and reduction reactions at the TiO 2 surface when activated under certain wavelengths of the solar spectrum (k< 385 nm). As consequence of the activation of the catalyst, dual electron–hole structures are generated on its surface from which redox reactions are initiated and ROS are generated, in particular O 2,HO  2,OHand H 2 O 2 species. These species are capable of producing oxidative stress on the microorganisms, although the external cell wall, composed of peptidoglycans, constitutes the first obstacle to slowing down any type of attack. Once this defence is overcome, the ROS radicals will attack the plasmatic membrane, composed of phospholipids and integral proteins, until they reach the bacterial cytoplasm and release the intracellular contents, upsetting the balance of the vital functions and the death of the bacterium (Huang et al., 2000; Maness et al., 1999). As well as the titanium dioxide and UV range which activate the catalyst, other auxiliary oxidants can be added to photocatalytic treatments, to improve the effectiveness of the process. These include hydrogen peroxide or sodium peroxydisulphate (Na 2 S 2 O 8 )(Kositzi et al., 2004; Rinco ´n and Pulgarin, 2004a). In this case, it is not only the oxygen that acts as an electron acceptor in the redox reactions generated on the catalyst. The H 2 O 2 also participates in the process, avoiding the recombination of electrons with the holes created in the TiO 2 surface which would lead to inferior disinfection results. However, if there is an excess of H 2 O 2 , it can also act as an OH radical scavenger or form peroxo-compounds on the TiO 2 surface, thus prejudicing the photocatalytic process (Kositzi et al., 2004). The UV light which activates TiO 2 represents a small fraction of the solar spectrum, so many photocatalytic studies use solar radiation as a UV source so that it becomes a resource of easier access. In the solar spectrum, the components which can affect the viability of microorganisms are UVB, UVA and visible ranges. UVB directly affects the genetic material of the cell, while UVA and the visible range participate in the activation of agents such as catalysts and oxidants, influencing the ROS generation (Rinco ´n and Pulgarin, 2004b). At present, pilot plants are being designed with the aim of applying photolytic and photocatalytic treatments on a real scale in the near future, either as a stage within a series of water treatments or as a single stage of water processing (Blanco et al., 2009; Chong et al., 2010; Malato et al., 2001). In both cases, the catalyst recovery is an important economic consideration. Numerous research studies in the disinfection field have been carried out with immobilised TiO 2 supports on Escherichia coli populations or else with TiO 2 in suspension, with good results in diverse study conditions (Alrousan et al., 2009; Gumy et al., 2006; Rinco ´n and Pulgarin, 2003). E. coli is one of the most extensively studied faecal pollution indicators in disinfection research (Benabbou et al., 2007; Rinco ´n and Pulgarin, 2003, 2004a,b, 2007). This study is focused on Enterococcus sp., another indicator which has a higher survival rate in the aquatic medium and is more resistant in dry and disinfectant conditions than E. coli. The aims are as follows: 1. To research the disinfectant power of irradiation (290– 800 nm and 320–800 nm) in the presence and absence of TiO 2 and/or H 2 O 2 on a natural water sample fortified with Enterococcus sp. 2. To determine the influence of the UVB range on Enterococcus sp. inactivation. 3. To analyse the influence of the mode of application of irradiation (intermittent or continuous) on the bacterium in all of the treatments studied. 4. To evaluate the capacity of bacterial recovery after the application of the treatments in darkness conditions (for 3 h). 2. Methods 2.1. Sample preparation All treatments conducted in this study have been carried out with natural water from the Ebro River, collected at a point previous to the entrance of the drinking water treatment plant in Zaragoza (Spain). A sample of 25 L was distributed in ISO collection bottles with a volume of 1 L. Samples were conserved at 20 °C for a perfect support. The quality of the surface water is shown in Table 1. Table 1 Water quality obtained from Ebro River. pH Tª (°C) TOC (mg L 1 ) Conductivity (lscm 1 ) Turbidity (NTU) Enterococcus sp. (CFU 100 mL 1 ) 8.16 22 3.3 550 144 1–5 10 2 620 M. Lanao et al. / Solar Energy 86 (2012) 619–625 Author's personal copy Natural water from the Ebro River has a low concentration of Enterococcus sp. (see Table 1), hindering the effective evaluation of treatments. For this reason, the bacterial population was artificially increased using an Enterococcus sp. strain isolated from the same river and confirmed by biochemical tests. The preparation of the concentrated suspension involved incubation from a stock culture of Enterococcus sp. on nutritive agar (Scharlab). After 48 h at 37 °C in aerobic conditions, a cell suspension in sterile saline solution was prepared. Before the irradiation inactivation experiments were carried out, the water sample was sterilized at 121 °C/15 min to remove any endogen microorganism. Natural water was then inoculated with this bacterial suspension to give an approximate final concentration of 10 8 CFU 100 mL 1 . 2.2. Enumeration of Enterococcus sp. The culture and enumeration of Enterococcus sp.was carried out according to the procedure set out in ISO 7899-2:2000. Measured volumes from each sampling point were filtered through a sterilized 0.45 lm-pore size cellulose nitrate membrane (Millipore) using a membrane filtration apparatus. Cultured Enterococcus sp. organisms were detected by incubation after 48 h at 37 °C using Slanetz & Bartley agar (Scharlab) as the selective medium. After this period, the colonies with a pink–purple colour were counted and some of them submitted to confirmation tests by Gram stain. From each sample taken in the experiments, several different volumes were filtered to ensure a reliable count in each sampling time. Dilutions were made where necessary. The enumeration of colonies was carried out in terms of colony-forming units (CFUs) per 100 mL of sample in each contact time. These concentrations were transformed to log 10 and the killing efficiency determined by log (N t /N 0 ) where N 0 and N t are the Enterococcus sp. before and after disinfection. All zero counts were replaced by the lowest possible count. Replicates of the experiments were performed and a medium value was calculated for each sampling point. 2.3. Material, reagents and instrumentation All the glassware used was autoclaved at 121 °C for 15 min to ensure it was sterile, an indispensable condition in microbiological research. All the solutions and culture mediums were prepared with MilliQ Ò water and analyticalreagent-grade chemicals were used throughout. The irradiation was performed with an Atlas Suntest CPS+/XLS+ solar chamber located in the laboratory with a xenon lamp which light intensity ranges from 250 to 765 W m 2 . This system enables reproduction in the laboratory of natural sunlight conditions with a quartz filter (290– 800 nm) and an additional filter made of window glass (Xenochrome 320) which cuts off wavelengths below 320 nm, removing the UVB range. The solar chamber was equipped with a magnetic agitator (500 rpm) and a regulator of intensity and exposure time, aswellasatemperaturecontrol. In the photocatalytic experiments, the catalyst used in this study was treated TiO 2 obtained from commercial TiO 2 (100% anatase, Panreac). The commercial TiO 2 was transformed by thermal treatment into a mixture of 20% rutile – 80% anatase with a particle size of 500 lm, described in detail in previous works (Lanao et al., 2010). This is applied in dissolution but after use it can be eliminated by sedimentation (Ferna ´ndez-Iba ´n ˜ez et al., 2003; Ljubas, 2005; Miguel, 2010). The solution of hydrogen peroxide used was prepared from a concentrated H 2 O 2 solution at 30% by weight (Carlo Erba, quality for analysis). 2.4. Operational conditions In all the experiments, 1 L of water sample in a Schott reaction vessel was placed inside the solar chamber. An aired environment and a perfect mix were provided by a magnetic stirrer, avoiding the settling of TiO 2 particles at the bottom of the reactor when this reactive was used. The same experiments were carried out with and without a window filter. With the window filter, the range of irradiation emitted covered wavelengths between 320 and 800 nm. Without the filter, the range was extended from 290 to 800 nm. The intensity of the irradiation selected for all experiments was 500 W m 2 . The maximum irradiation time was 30 min for all experiments. Samples were taken at different times. After the radiation period, the suspension was kept in darkness for 180 min with the aim of assessing the capacity of the damaged population to recover. The temperature of the samples did not exceed 31 °C at the end of the process. Control assays were carried out with the lamp switched off using identical operational conditions. The dose of TiO 2 added in this study was 1 g L 1 and the H 2 O 2 concentration utilised was 0.04 mM. The TiO 2 dose had previously been selected by other researchers (Cho et al., 2004; Miguel et al., 2010; Rinco ´n and Pulgarin, 2003). The H 2 O 2 dose had also been used in previous works in which it was established that it showed hardly any inactivation by itself at such a concentration. Its effect can thus be studied when it is added to solar radiation or to TiO 2 (Lanao et al., 2008, 2010). At the end of the experiments, the residual H 2 O 2 was quenched with sodium thiosulphate (Panreac) to cut its bactericidal effect. 2.5. Statistical analyses From the results of inactivation obtained in the microbiological analysis of the samples treated with advanced oxidation treatments, a statistical study was carried out using the software GraphPad Prism Ò (version 4.03). A one-way ANOVA analysis using the Bonferroni test was applied to determine whether or not significant differences existed between the different treatments studied. A significance level M. Lanao et al. / Solar Energy 86 (2012) 619–625 621 Author's personal copy of 95% was used in all the statistical analyses. When the “p” (p-value) is higher than the significance level (p> 0.05), the difference between the treatments compared is not considered significant while if the “p”is lower than the significance level, the difference between the treatments is considered significant (p< 0.05) or highly significant (p< 0.01). 3. Results and discussion 3.1. Treatments with UVA and visible radiation (k= 320– 800 nm) Fig. 1 shows the inactivation curves of Enterococcus sp. during the photolysis, photolysis/H 2 O 2 , photocatalysis and photocatalysis/H 2 O 2 processes, with a microbiological count every 5 min. In addition, by way of reference some experiments were carried out with only H 2 O 2 , TiO 2 or TiO 2 /H 2 O 2 on Enterococcus sp. populations. It was noted that these reactives when used individually do not show any disinfection power under the operational conditions used. In the Fig. 1 it can be verified that the application of irradiation by itself on the sample, photolysis, has practically no any effect on Enterococcus sp., achieving a disinfection of 0.3 logarithmic units after 30 min of treatment. It is well known that the addition of photoactive substances such as hydrogen peroxide and certain catalysts provides conditions in the medium under which the levels of inactivation are higher. When titanium dioxide is combined with solar radiation, photocatalysis, an activation of the catalyst is produced, promoting its bactericidal action. In Fig. 1, a final logarithmic reduction of 2.3 units is observed with this treatment, showing highly significant differences (p< 0.01) with regard to the photolysis. After adding the H 2 O 2 dose of 0.04 mM to the sample and combining it with irradiation, hardly any bacterial inactivation was observed, the maximum being 0.4 units log at 30 min. No significant difference was noticed between photolysis/H 2 O 2 and photolysis (p> 0.05). So, the poor disinfectant ability of photolysis/H 2 O 2 is observed in this experiment. This result seems logical given the basis of the H 2 O 2 breakdown, which is produced under wavelengths <320 nm and as a consequence outside the radiation range used in these experiments. However, on sporulated structures of Clostridium perfringens, the photolysis/H 2 O 2 treatment reached significantly higher levels of inactivation compared to the photolysis (Lanao et al., 2010). It is a well known fact that microorganisms actively respond to alterations in the medium until the stress produced reaches high levels. The responses to these attacks are self-defence mechanisms developed by bacteria; these mechanisms allow them to thwart the attack for a variable period of time depending on the aggressiveness of the attack (Hoerter et al., 2005). It is therefore possible that the conditions of the matrix in photolysis combined with H 2 O 2 are not very aggressive for Enterococcus sp. and it is capable of maintaining its defensive mechanisms during this time. The radical ROS, when they reach a certain concentration, manage to destabilize the defensive arts of the cell and to alter its functionality. Some authors have established that after the release of iron ions (II and III) into the medium, hitherto retained inside the bacteria, photo-Fenton reactions take place at the same time and accelerate the process of cellular death begun by the oxidative radical species (Benabbou et al., 2007). The last treatment represented in Fig. 1 corresponds to the photocatalysis/H 2 O 2 process. This manages to reduce the initial populations of Enterococcus sp. by 1.9 logarithmic units, with a similar tendency to that of photocatalysis. Photocatalysis/H 2 O 2 improves in a significant way (p< 0.05) the disinfectant capacity obtained with the photolysis and photolysis/H 2 O 2 processes. On the other hand, in the Fig. 1 the photocatalysis/H 2 O 2 remains slightly below the photocatalytic treatment and analysing the results in statistical terms, this difference is not significant (p> 0.05). It is possible that the molecules of hydrogen peroxide present in the aqueous colloidal suspension have filled spaces in the TiO 2 surface and thus the effectiveness of the treatment is less than that of the photocatalytic treatment. Hartmann and Eisenstark (1978) established that the addition of hydrogen peroxide (with doses between 0.6 and 0.006 mM) to TiO 2 photocatalysis enhanced the photodegradation of anE. coli population. However, the same does not occur in the case of Enterococcus, just as this study shows. The same response was also observed on cells and spores of C. perfringens under the same experimental conditions (Lanao et al., 2010). One explanation could be the low dose used in the experiments, unable to generate enough oxidative stress on Enterococcus sp. If, on the other hand, the addition of peroxide to photocatalysis generates a high concentration of active radicals, Kositzi et al. (2004) established that the peroxide, in presence of light, can participate as an OH radicals scavenger, forming hydroperoxide radicals, HO 2, or generating peroxocompounds on the TiO 2 surface, damaging the activity of -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0 5 10 15 20 25 30 90 150 210 time (min) Log (Nt/No) light light/TiO2 light/H2O2 light/TiO2/H2O2 Fig. 1. Curves of Enterococcus sp. population removal during photolysis, photocatalysis, photolysis/H 2 O 2 and photocatalysis/H 2 O 2 treatments during 30 min and curves of bacterial recovery during 180 min in darkness. Range of k: 320–800 nm. Intermittent illumination (stops every 5 min). [TiO 2 ] = 1 g/L. [H 2 O 2 ] = 0.04 mM. Initial concentration 10 8 CFU 100 mL 1 . 622 M. Lanao et al. / Solar Energy 86 (2012) 619–625 Author's personal copy the photocatalytic process. These hydroperoxide radicals are less active as regards disinfection (Legrini et al., 1993). This demonstrates the importance of establishing the appropriate dose when combining treatments so as not to obtain an opposite effect to that being sought. Maness et al. (1999) established the importance of the catalyst surface-microorganism interaction in order that the ROS radicals generated can act directly on the bacterium. If instead of a radical joining to the microorganism, two radicals join each other because their number is greater and the probability of joining between radicals increases, the bactericidal effectiveness of the treatment decreases and longer exposure times are required. It has also been recorded that organic and inorganic species naturally present in the sample and increased in a collateral fashion by the lysis of bacteria during treatment compete with the active bacteria for the radicals, reducing the disinfection effect of the treatments applied. The natural composition of water is thus another conditioning factor in the effectiveness of the treatment (Rinco ´n and Pulgarin, 2007). In a real photoreactor, the irradiation applied is not continuous on the sample because after treatment the water passes to areas of darkness. Even in the natural medium, clouds hinder continuous solar radiation during the hours of daylight (Rinco ´n and Pulgarin, 2003). In order to evaluate the effect of the intermittent stops on the disinfection when carrying out the microbiological counts in relation to the time, the experiments were repeated making only one stop after 15 min (Fig. 2). It was observed that the continuous photolysis resulted in a higher bactericidal effect, with 0.63 logarithmic units of inactivation, compared to the intermittent photolysis (Fig. 1). The continuous photocatalysis obtained a lower disinfection compared to intermittent photocatalysis (1.6 log vs. 2.3 log) and the continuous photolysis/H 2 O 2 and photocatalysis/H 2 O 2 obtained levels of inactivation similar to that obtained with intermittent radiation. It is possible to conclude that the mode of application of >320 nm irradiation (intermittent or continuous) does not have a determining influence on the process of bacterial inactivation under the conditions applied. However, Rinco ´n and Pulgarin (2003) observed a clear difference between the results of the continuous and discontinuous photocatalysis applied to E. coli. Thirty minutes of continuous photocatalysis produced the same results, total inactivation, as intermittent photocatalysis after 90 min of treatment. However, under the study conditions of this research, the results observed are not conclusive. Longer treatments are necessary to obtain a total inactivation of Enterococcus sp. populations, both with the application of intermittent and continuous processes. These authors establish that during the stoppage periods, the bacterial auto-defence mechanisms are favoured, allowing the bacterium to stabilize in the presence of the aggression suffered and thus to withstand a possible new attack. On the other hand, some studies defend the effectiveness of interrupted treatments. Pham et al. (1995) observed that intermittent illumination reduced the number of spores of Bacillus pumilus more effectively than continuous exposure. The results obtained in this research and the diversity of results published in the scientific literature suggest that it is necessary to investigate the effect of interruptions in treatment involving solar radiation for each type of microorganism, as Rinco ´n and Pulgarin (2003) also propose. Finally, Figs. 1 and 2 illustrate the treatments applied followed by a dark period of 3 h in which the tendency of populations to recover after the stress suffered is observed. In Fig. 1, only the photocatalysis and photocatalysis/H 2 O 2 treatments manage to obtain disinfection of the sample, and a subsequent slight recovery of the populations is observed. In Fig. 2, where the illumination is continuous and as a consequence lower recounts would be expected because of the longer period of aggression, it is also observed a slight recovery in the photocatalysis and photocatalysis/H 2 O 2 treatments. 3.2. Treatments with UVB, UVA and visible radiation (k= 290–800 nm) Fig. 3 represents the inactivation curves of Enterococcus sp. during the treatments of photolysis, photocatalysis, photolysis/H 2 O 2 and photocatalysis/H 2 O 2 , all of them irradiated with a solar spectrum between 290 and 800 nm, which includes the UVB range. The results show a high level of disinfection in all the processes studied. The photolysis obtains an inactivation of 7.6 logarithmic units, the photolysis/H 2 O 2 treatment achieves 8.2 log and finally the photocatalysis and the photocatalysis/H 2 O 2 obtain reductions of 5.5 and 5.9 units log, respectively. The interval of irradiation between 290 and 320 nm (UVB range) results much more effective in the Enterococcus sp. removal (see Fig. 1 (k> 320 nm) and Fig. 2 (k> 290 nm)). This range of irradiation shows a high level of decomposition of hydrogen peroxide molecules, adding a higher number -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,00153090150210 time (min) Log (Nt/No) light light/TiO2 light/H2O2 light/TiO2/H2O2 Fig. 2. Curves of Enterococcus sp. population removal during photolysis, photocatalysis, photolysis/H 2 O 2 and photocatalysis/H 2 O 2 treatments during 30 min and curves of bacterial recovery during 180 min in darkness. Range of k: 320–800 nm. Continuous illumination (only one stop at 15 min). [TiO 2 ] = 1 g/L. [H 2 O 2 ] = 0.04 mM. Initial concentration 10 8 CFU 100 mL 1 . M. Lanao et al. / Solar Energy 86 (2012) 619–625 623 Author's personal copy of OH radicals to the medium and participating in the disinfection phenomenon of the sample. The addition of H 2 O 2 thus improves the level of inactivation obtained by photolysis and photocatalysis. On a statistical level, there are no significant differences (p> 0.05) between the four treatments applied under the study conditions described. These results highlight the limited relevance of the addition of TiO 2 and H 2 O 2 , individually, on the individual effect of irradiation when this radiation includes the UVB range. The high bactericidal capacity of this range produces serious injuries to the genetic cellular material, preventing DNA replication and producing genetic mutations, as Benabbou et al. (2007) indicates. Under the conditions studied, the addition of substances which promote the generation of hydroxyl radicals is not necessary because the photolytic treatment by itself achieves a high disinfection level. However, Benabbou et al. (2007) obtained better results with the UVB/TiO 2 system than the UVB system on E. coli populations. During the period of darkness after the treatments applied, the populations recover slightly except for those subjected to the photolysis/H 2 O 2 process, which remain constant. It would be expected, as the research of Rinco ´n and Pulgarin (2003) shows, that in the treatments where the highest disinfections are obtained and where the level of cellular aggression is apparently high, a recovery of the cellular functions and thus of the populations would be difficult. Benabbou et al. (2007) did not observe bacterial development after the disinfection processes applied on E. coli populations with UVA, UVB or UVC radiation with or without TiO 2 .Dunlop et al. (2002) indicated that bacteria, after a stress period, can enter a non-growth state. After a period of darkness, they can recover their capacity to grow and return to their initial balance (dark repair). This behaviour could explain the results observed in darkness after the photolysis, photocatalysis and photocatalysis/ H 2 O 2 treatments. Regarding the photolysis/H 2 O 2 treatment, it is probable that the damage produced by the quantity of OH radicals generated was so severe that the auto reparation mechanisms of the bacteria were not able to overcome the attack suffered under the conditions studied. Wist et al. (2002) defends the activation of microorganisms under stress conditions, arguing that they are simply inactivated before the treatment (photoreactivation). It is also important to take into account the type of bacterium studied. It would be of interest to extend the disinfection studies with other bacterial indicators, including viruses and parasites frequently present in waters and more resistant than faecal indicators, and to obtain in this way results closer to reality. In order to avoid posterior regrowths in treated water, it would be advisable to obtain total inactivation of the microorganisms present in such water. Rinco ´n and Pulgarin (2004b, 2007) suggest analysing the EDT parameter (effective disinfection time) to ensure the complete disinfection of the water treated. With this parameter it is hoped to determine the duration of the disinfection treatment to make sure of bacterial death and thus the end of the treatment. Another possible option is to use a secondary disinfectant, such as chlorine, to avoid regrowth from bacteria surviving the treatment. In this case, the generation of dangerous halogenated by-products will be substantially reduced because of the important reduction of organic matter levels present in water produced by the advanced oxidation treatments applied (Chong et al., 2010). 4. Conclusions The conclusions of this research work are summarized in the following points: – The disinfectant power of UVA and visible irradiation is statistically improved by the presence of TiO 2 in the process, this not being the case with the addition of H 2 O 2 . When the UVB range is present in irradiation (290–800 nm), neither the addition of TiO 2 nor of H 2 O 2 produces any significant improvement in Enterococcus sp. inactivation compared with the action of light by itself. Photolytic treatment is sufficient to obtain complete inactivation. – The manner of application of irradiation (intermittent or continuous) does not have an influence on the inactivation process of Enterococcus sp. under the working conditions considered here. – No bacterial inactivation or only a slight population recovery is observed during the period of darkness following all the treatments studied. – The effectiveness of the process depends mainly on the type of bacterium on which the experimentation is carried out. Enterococcus sp. is more sensitive to the treatments studied than C. perfringens spores; however, it is less sensitive than the vegetative cells of this sporulated bacterium. It is considered of interest to extend knowledge of the effectiveness of AOPs on other microorganisms present in water, such as viruses and parasites, -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 2 5 101520253090150210 time (min) Log (Nt/No) light light/TiO2 light/H2O2 light/TiO2/H2O2 Fig. 3. Curves of Enterococcus sp. population removal during photolysis, photocatalysis, photolysis/H 2 O 2 and photocatalysis/H 2 O 2 treatments during 30 min and curves of bacterial recovery during 180 min in darkness. Range of k: 290–800 nm. Intermittent illumination. [TiO 2 ]=1 g/L. [H 2 O 2 ] = 0.04 mM. Initial concentration 10 8 CFU 100 mL 1 . 624 M. Lanao et al. / Solar Energy 86 (2012) 619–625 Author's personal copy given that their resistance is higher than that of the current reference indicators. Acknowledgements This work is framed in the research projects “Aplicacio ´n de Te ´cnicas de Oxidacio ´n Avanzada en la Potabilizacio ´nde Aguas Naturales de la Cuenca del Rı ´o Ebro”(CTM200504585/TECNO) and “Regeneracio ´n de aguas depuradas mediante procesos de oxidacio ´n avanzada”(CTM200801876/TECNO) funded by the Ministerio de Ciencia e Innovacio ´n, FEDER and Aragon Government-Caixa Catalunya. The authors thank the Aragon Government the PhD grant to Munia Lanao. 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