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2012 20 Rocío Sarasa Orcástegui Caracterización molecular y fenotípica del agente causal en casos no concluyentes de Encefalopatías espongiformes transmisibles animales Departamento Director/es Patología Animal Monzón Garcés, Marta Badiola Díez, Juan José Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Rocío Sarasa Orcástegui CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FENOTÍPICA DEL AGENTE CAUSAL EN CASOS NO CONCLUYENTES DE ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES ANIMALES Director/es Patología Animal Monzón Garcés, Marta Badiola Díez, Juan José Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA DEPARTAMENTO PATOLOGÍA ANIMAL CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FENOTÍPICA DEL AGENTE CAUSAL EN CASOS NO CONCLUYENTES DE ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES ANIMALES MEMORIA PRESENTADA POR: ROCÍO SARASA ORCASTEGUI PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN VETERINARIA POR LA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA DIRIGIDA POR: DRA. MARTA MONZÓN GARCÉS DR. JUAN JOSÉ BADIOLA DÍEZ ZARAGOZA, 2012 ÍNDICE OBJETIVOS Objetivos OBJETIVOS - Realización de un análisis comparativo sobre la eficacia de todas las técnicas de confirmación establecidas por la OIE para el diagnóstico de la EEB en muestras que han presentado un resultado no concluyente, mediante la aplicación de las técnicas convencionales. - Adaptación y estandarización de las técnicas de confirmación existentes para su aplicación en muestras de similares características a las analizadas en este estudio. - Estudio de las posibles causas que influyen en el diagnóstico de las muestras analizadas para obtener resultados no concluyentes, prestando especial interés al estado autolítico y a la baja concentración de PrPsc en ellas. - Confirmación, mediante la utilización de un modelo in vivo, de la fiabilidad de los resultados obtenidos a través de la técnica de inmunocitoquímica en frotis para muestras con muy avanzado grado de autolisis. - Valoración de la existencia de un nuevo agente causal como posible origen de los resultados obtenidos a partir de estas muestras con las técnicas establecidas para ello a través de la evidencia de una variabilidad fenotípica. 3 4 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión Bibliográfica REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1. Encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) Las EET son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas que afectan tanto a los animales como al hombre, provocando la muerte inevitablemente tras un largo periodo de incubación por una degeneración progresiva del sistema nervioso central. El agente causal es el prión, una proteína celular presente en estado fisiológico que, al sufrir un cambio conformacional, se convierte en patológica. Las vías posibles de transmisión son: hereditaria, adquirida y esporádica, aunque en las EET animales se contempla sólo la forma adquirida. Esta forma parece llevarse a cabo mediante la ingestión, ya que los priones han sido detectados en el tracto intestinal (concretamente en las placas de Peyer; Bergström et al., 2006), aunque no se conoce la vía por la que alcanzan el sistema nervioso central, ni la manera por la cual llegan a invadir todas las áreas del encéfalo. Aunque el Scrapie se conoce desde hace más de 250 años, la existencia de este tipo de enfermedades cobró relevancia con la primera descripción del kuru, enfermedad neurodegenerativa aparecida en Nueva Guinea que afectaba al hombre hasta causarle la muerte (Alpers y Rail, 1971) y que se asoció a la práctica del canibalismo en los ritos funerarios mediante la ingestión del encéfalo de las personas fallecidas. En el hombre han sido descritas la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ; Beck et al., 1969a), enfermedad de Gertsmann-StrausslerScheinker (Bendheim, 1984a; Collinge et al., 1989) y el insomnio familiar fatal (Manetto et al., 1992; Medori et al., 1992), además de la variante de ECJ (vECJ; Hill et al., 1997) relacionada con la EEB. También afectan a varias especies animales, siendo de gran importancia la EEB (Hope et al., 1989), el Scrapie en ganado ovino y caprino (Gordon, 1966), la enfermedad caquectizante de los ciervos (CWD; Williams y Young, 1980) y la encefalopatía transmisible del visón (ETV; Zlotnik y Barlow, 1967). 5 Revisión Bibliográfica La idea más aceptada sobre el origen de la enfermedad es la denominada teoría de la proteína única (Alper et al., 1967), que constituye el único agente patógeno conocido (Prusiner, 1991) y adopta el nombre de prión (Prusiner et al., 1982). Esta teoría asocia el comienzo de la enfermedad a un cambio en la estructura terciaria de la proteína prión normal (PrPc), que sufre un cambio conformacional que la transforma en una proteína prión patológica (PrPsc), con características diferentes. Respecto a la proteína celular (PrPc), se conoce que es una sialoglicoproteína de membrana sintetizada en el sistema nervioso (Fournier et al., 1998) y que está constituida por una copia simple, pequeña y situada en el gen del cromosoma 20, expresada preferentemente en las neuronas (Kretzschmar et al., 1986). Está codificada por el gen PRNP y se encuentra vinculada a un locus que controla el tiempo de incubación (Carlson et al., 1986; Prusiner et al., 1998a). Está presente en la mayoría, si no en todos, los mamíferos, ya que está altamente conservada en las especies (Díaz-San Segundo et al., 2006). Así, se ha encontrado en el ovino, bovino, hámster, ratón, visón y en seres humanos, con un 80-90% de homología entre las secuencias de dicha proteína en las diferentes especies. Su función es hasta ahora desconocida, aunque según diversos estudios, parece que se relaciona con el metabolismo del cobre (Brown et al., 1997) y la transmisión neuronal (Collinge et al., 1994), principalmente con vesículas presinápticas (Fournier et al., 1995). Así, en ratones en los que se ha eliminado dicha proteína, se observan diversas alteraciones tales como activación de linfocitos, neurotransmisión alterada, perturbación de ritmos circadianos, pérdida de las células de Purkinje y alteraciones en la actividad de la superóxido dismutasa (SOD-1; Westaway et al., 1998). Además, parece ser la responsable de los cambios neuropatológicos encontrados en las enfermedades priónicas, ya que la enfermedad parece estar asociada a un aumento de toxicidad por la acumulación de formas PrPsc o a la pérdida de la función normal de PrPc por su eliminación o interferencia con la PrPsc (Jeffrey et al., 2010). Lo que se sabe con certeza es que el tiempo de incubación o la diferente susceptibilidad del animal afectado es 6 Revisión Bibliográfica inversamente proporcional a la cantidad de PrPc expresada (Prusiner, 1996). Por su parte, la PrPsc está codificada por el mismo gen (Basler et al., 1986) y constituida por la misma secuencia de aminoácidos que la PrPc (Stahl et al., 1993). Tiene un peso molecular de 33-35 kDa y presenta distintas características físicas y químicas respecto a la PrPc (González et al., 2003), como una movilidad electroforética y un perfil de la glicoforma distintos y una resistencia parcial a las proteinasas. La transformación de PrPc a PrPsc consiste en un cambio conformacional (Pan et al., 1993) y se realiza por un mecanismo de post-traslación (Borchelt et al., 1990; Caughey y Raymond 1991). Todo el proceso parece ocurrir en la membrana plasmática o en la vía endocítica hacia los lisosomas, con el objetivo de almacenarse en los lisosomas secundarios (Caughey y Chesebro, 1997). Concretamente, esta transformación se basa en que, mientras que la PrPc muestra una alta presencia de α hélice y bajo contenido de ß plegada en su estructura (Collins et al., 2004), tras este cambio, se observa un alto porcentaje de estructura ß y disminución de la estructura α (Pan et al., 1993; Prusiner, 1996), lo que confiere a la PrPsc una patogenicidad elevada (Meyer et al., 1986). Concretamente, la PrPsc tiene un contenido de estructura ß plegada del 43 % y de α hélice de un 30%, en relación con la PrPc que contiene un 3% y 42%, respectivamente (Prusiner, 1996). Este incremento de la estructura ß de la proteína patológica (Nguyen et al., 1995; Legname et al., 2004; Novakofski et al., 2005) es lo que produce una polimerización e insolubilidad de la proteína (Meyer et al., 1986) y una desaparición de algunos epítopos de superficie (Peretz et al., 1997; Wille et al., 2002) que le confiere sus nuevas características. Así, las principales diferencias de la PrPsc con respecto a la PrPc son la resistencia parcial a la proteinasa K (Taraboulos et al., 1990; Parchi et al., 2000) y la insolubilidad (Cordier et al., 2006). Además, su depósito en el sistema nervioso central de los animales afectados, junto a la vacuolización del neuropilo, que tiene como resultado la aparición de espongiosis, es lo más característico de este grupo de enfermedades, que también se suelen acompañar de otras alteraciones como gliosis y muerte de neuronas (pérdida neuronal), aunque nunca de lesiones 7 Revisión Bibliográfica inflamatorias (Fraser, 1993; Jeffrey et al., 1995; Costa et al., 2009). La acumulación de la PrPsc precede a la patología y hay una relación consistente entre dicha proteína y los cambios patológicos. Se sabe que la PrPsc causa los cambios neurodegenerativos, lo que conlleva posteriormente la enfermedad clínica (Jeffrey et al., 2010), y que es responsable directa de la activación de los astrocitos (Lasmézas et al., 1996). Puesto que la PrPsc es el único componente del agente causal, su detección es considerada como un marcador específico de la misma (Bolton et al., 1982). Desde el punto de vista clínico, este grupo de enfermedades presenta unos síntomas variados, siendo los más comunes: trastornos en la conducta, demencia, descoordinación visual-espacial y ataxia cerebelar, aumentando la relevancia de algunos de ellos según las especies afectadas. Por ejemplo, mientras que la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob se presenta como demencia progresiva, en el caso del Scrapie y de la EEB, la enfermedad, en general, se manifiesta principalmente con ataxia (Wells et al., 1987; Prusiner et al., 1998a). El diagnóstico de la enfermedad es complicado pues, a pesar de la sospecha clínica, no existe un método que permita su diagnóstico in vivo (Kimberlin, 1993), exceptuando la biopsia de tejido linfoide en ciertas especies animales que, aunque es totalmente específica, no presenta un 100% de sensibilidad. Ésta es una de las razones, junto a la ausencia de tratamiento y al desenlace siempre fatal de la enfermedad, del creciente interés que ha tenido el estudio de este grupo de enfermedades. Dentro de todas ellas, el presente trabajo se centra en la EEB, enfermedad que afecta al ganado bovino y que posee las mismas características de todas las EET, entre las que destaca su capacidad zoonótica. La demostración de la asociación del origen de la vECJ con la EEB, junto con la descripción de un caso de EEB en cabra (Eurosurveillance, 2005), con la consiguiente preocupación porque la EEB pudiera estar enmascarada por el Scrapie en el ganado ovino y caprino, justifica el interés de la búsqueda de un buen diagnóstico de la EEB, 8 Revisión Bibliográfica La distribución de la PrPsc también es diferente con respecto a la de la cepa clásica, con una mayor presencia en el tálamo, bulbo olfatorio y corteza que en el resto del encéfalo. Este depósito característico de la PrPsc, junto al perfil de glicosilación, ha servido además para relacionar posteriormente a la cepa L-EEB con la ECJ esporádica (Casalone et al., 2004; Capobianco et al., 2007). Respecto al comportamiento adoptado por ambas en la inoculación en ratón, se ha observado que el tiempo de incubación en la H-EEB y L-EEB era menor y mayor, respectivamente, que el de la cepa clásica (Buschmann et al., 2006). A partir del descubrimiento de la variedad de agentes causales, han surgido otras cepas atípicas según el diferente peso molecular o mediante la transmisión a modelo murino, como la descrita por Yokoyama et al. (2007), aunque se ha llegado a asociar posteriormente con las características de la H-EEB. Gracias a los protocolos establecidos para la determinación y diferenciación de los agentes causales de la enfermedad, se ha comprobado que la EEB y la vECJ (Collins et al., 2004), identificada en el Reino Unido en 1996 (Will et al., 1996; Saegerman et al., 2004), tienen el mismo origen, es decir, es el mismo agente causal el que origina ambas enfermedades (Collinge et al., 1996; Bruce et al., 1997; Hill et al., 1997; Lasmézas et al., 2001; Asante et al., 2002). La relación entre la vECJ y la EEB ha sido muy estudiada, debido a la trascendencia de su posible relacion causal. Este nexo se ha demostrado mediante estudios epidemiológicos (Will et al., 1996, 1999), experimentos de caracterización de cepas (Collinge et al., 1996; Hill et al., 1997) y por inoculación en ratón (Brown et al., 2003), logrando encontrar un vínculo etiológico entre ellas. En estos estudios se ha comprobado que los patrones electroforéticos de los pacientes de vECJ son similares a los de la EEB, pero diferentes a los de la ECJ esporádica e iatrogénica (Baron, 2002a). Los mismos resultados se encuentran tras inoculación en ratón (Bruce et al., 1997), con semejantes características respecto a tiempos de incubación y patrón de distribución de la PrPsc (Hill et al., 1997), además del mismo patrón lesional (Ritchie et al., 2009). Incluso en ratones transgénicos (Tg), que expresan la proteína prión bovina (BoPrP; Scott et al., 1999) u otros que expresan la proteína 15 Revisión Bibliográfica humana con metionina en el codón 129 (Asante et al., 2002), el resultado es el mismo, aunque algunos autores no han logrado transmisión de EEB a ratones transgénicos humanos si no se realiza previamente un pase en oveja (Plinston et al., 2011). Posteriormente, hasta se ha logrado demostrar que, estructuralmente, la PrP humana y bovina son idénticas, mediante el estudio de la estructura molecular tridimensional de la proteína por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (Lopez García et al., 2000). Al confirmarse que esta variante de la ECJ se ha desarrollado a partir de la epidemia de EEB, ésta se convierte en una enfermedad zoonótica (Hill et al., 1997; Stack et al., 2009), a pesar de que todavía algunos autores insisten en que no existe evidencia científica de que la vECJ haya sido iniciada por una exposición de los seres humanos a tejidos de animales afectados con la EEB. De todas formas, el aumento del número de casos de EEB debido, según se acepta mayoritariamente, a un cambio en el proceso de fabricación de los piensos destinados al ganado bovino (Wilesmith et al., 1988), ha originado un estado de inquietud de ámbito internacional, especialmente cuando a partir de 1996 empezaron a aparecer los primeros casos de vECJ asociados a consumo de animales afectados que habían pasado a la cadena alimentaria (Taylor y Woodgate, 1997). En España, los tres primeros casos de EEB fueron descritos a finales del año 2000 (Badiola et al., 2002), presentando un pico de incidencia de la enfermedad en el año 2003. A partir de ahí, el número de casos de EEB sufrió una disminución constante y significativa, asociada a la prohibición de alimentar a los animales con derivados de proteínas de rumiantes y por la aparente falta de transmisión vertical de la enfermedad. Además, el éxito de las medidas adoptadas se reflejó también en el incremento de la edad media de los casos detectados, desde 6,4 años en el inicio de la vigilancia hasta 12,3 años en la actualidad. Desde el año 2000 hasta finales de 2011, se habían detectado un total de 783 focos de EEB en España, la mayoría en la mitad norte de la Península, especialmente en Galicia y Castilla y León (http://rasve.mapa.es/Publica/InformacionGeneral/ Enfermedades/ficheros/eeb_acumulado.pdf). 16 Revisión Bibliográfica En relación con la vECJ, el primer caso apareció en Reino Unido en 1996 y, desde entonces, hasta finales del 2010, se han diagnosticado 217 en todo el mundo, 5 de los cuales han sucedido en España (Castellanos et al., 2010). El número de enfermos de vECJ no ha aumentado significativamente, aunque el problema persiste, pues sigue habiendo incertidumbre sobre el futuro del número de víctimas de la vECJ que deriven de casos subclínicos que ya existan y que pueden estar relacionados con la variación en el genotipo de la PrP humana y/o de una posible transmisión de vECJ humano-humano (Bishop et al., 2006). 3. Diagnóstico de la encefalopatía espongiforme bovina Los problemas que surgen en el diagnóstico de las EET se basan principalmente en la naturaleza del agente causal. Debido a que éste es sólo una proteína (hipótesis del prión; Griffith, 1967; Prusiner, 1982) y no posee material genético, es imposible usar herramientas como la PCR. Tampoco pueden usarse técnicas serológicas al no inducir respuesta inmune que permita detectar la presencia de anticuerpos específicos en suero. Como tampoco causa lesiones macroscópicas, el diagnóstico se realiza mediante la demostración del depósito de la proteína prión junto con las lesiones microscópicas específicas de la enfermedad. 3.1. Utilidad de la proteína prión celular y patológica La detección de PrPsc, que confirma el diagnóstico positivo de la enfermedad, es posible gracias a las diferentes características que adquiere tras el cambio conformacional que la diferencian de la PrPc. Una de esas características es la resistencia a enzimas. Mientras que la PrPc es soluble en detergentes medios y sensible a las proteasas (Oesch et al., 1985; Meyer et al., 1986), la PrPsc es sólo soluble moderadamente en detergentes no iónicos. En cuanto a la resistencia parcial a la digestión con proteinasa K de la PrPsc, aunque 17 Revisión Bibliográfica puede variar entre los diferentes agentes de las EET (Bessen y Marsh, 1994; Kuczius y Groschup, 1999), sienta la base de todas las técnicas diagnósticas aplicables, permitiendo reconocer exclusivamente la PrPsc y no la PrPc. Según Collins et al. (2004), las variaciones en la estructura terciaria de PrPsc probablemente se correlacionan con diferentes exposiciones de superficie de la proteína, lo que puede explicar las diferencias en los sitios de unión de la proteasa. Así, mientras que la PrPc es rápidamente digerida por proteinasa K, la PrPsc es parcialmente digerida, produciendo fragmentos de 27 a 30 kDa (Oesch et al., 1985). Desde un primer momento, el diferente comportamiento ante la digestión con proteinasa K se ha utilizado para detectar, por métodos diagnósticos tales como inmunohistoquímica o Western blot, la PrPsc, y no la PrPc, para diagnosticar las muestras como positivas. Este comportamiento también permite evidenciar diferencias en el perfil glicosilado, base para la distinción de agentes causales mediante los Western blot de diferenciación, al presentar una resistencia de la PrPsc a la proteinasa K más baja en EEB y EEB en oveja que en el Scrapie (Espinosa et al., 2007). Este perfil, junto con el hecho de que la PrPc se solubiliza mientras PrPsc se concentra formando depósitos (Meyer et al., 1986) o fibrillas amiloides (Prusiner et al., 1983; McKinley et al., 1991), son y han sido las principales propiedades aprovechadas frecuentemente en estudios diagnósticos y experimentales. La idea expuesta por Muramoto et al. (1992), que consiste en que una cantidad similar de PrPc aparece en todos los animales pero la PrPsc se encuentra sólo en el encéfalo afectado, es la base del diagnóstico de la enfermedad. Respecto a la localización de ambas isoformas también se han visto diferencias. Mediante los exámenes inmunohistoquímicos, se ha demostrado que la PrPc se encuentra en las células nerviosas de los encéfalos de los animales control y la PrPsc se acumula masivamente en el neuropilo de los encéfalos de los animales enfermos (DeArmond et al., 1987; Bruce et al., 1989). Anatómicamente, aunque ambas se pueden llegar a encontrar en todo el sistema nervioso, también se pueden hallar diferencias. Concretamente, la PrPc se encuentra por todo el 18 Revisión Bibliográfica encéfalo y médula espinal, principalmente en la membrana neuronal y en las sinapsis, con una mayor abundancia en zonas rostrales que en caudales del SNC en el caso de la EEB como corteza cerebral o hipocampo (Velavos et al., 2006). En cuanto a la PrPsc, su localización exacta, al igual que su expansión por el sistema nervioso, no está del todo claro. Aunque ha sido un aspecto muy estudiado (Sisó et al., 2004), llegándose a observar en todas las regiones del encéfalo (Iwata et al., 2006), su búsqueda ha estado más orientada al diagnóstico inmunoquímico de las EET. En el caso de la EEB, parece que los niveles más altos de PrPsc son detectados en la médula oblongada, cordón espinal y puente (Vidal et al., 2005), pero, aun así, se ha descubierto acumulación de PrPsc en ganado afectado con EEB en encéfalo, médula espinal, ganglios espinales, retina (Iwamaru et al., 2005), médula ósea (Wells et al., 1999) e íleon distal (Wells et al., 1994a, 1998), además de en nervios periféricos (Buschmann y Groschup, 2005; Iwata et al., 2006). Desde el principio, el descubrimiento de que el tronco parecía la parte más afectada (Vidal et al., 2006) y, dentro de él, principalmente el obex (Polak y Zmudzinski, 2012), es la observación que llevó a determinar esa zona como la recomendada para el diagnóstico de rutina en los casos clásicos de EEB (Prusiner et al., 1993; Scott et al., 1997). Además, el hecho de que la PrPsc ya se encontrara en esa zona incluso en estadíos tempranos de la enfermedad (Hoffmann et al., 2007), suponía una gran ventaja. Gracias a las técnicas inmunohistoquímicas posteriormente aplicadas a los modelos experimentales, se describieron, además, los diferentes patrones de depósito que podía adoptar la PrPsc en el sistema nervioso. En el caso de la EEB clásica, la PrPsc aparece en forma de finos depósitos granulares y no se encuentran placas amiloides en tejidos dañados (Novakofski et al., 2005). Lo contrario ocurre en el caso de la cepa atípica L-EEB (Casalone et al., 2004), que se caracteriza precisamente por presentar siempre placas amiloides. Estas placas están compuestas mayoritariamente por PrPsc (DeArmond et al., 1985) y parece que su acumulación puede depender tanto del hospedador como del agente causal (Comoy et al., 2008). Por el contrario, se ha observado que, al inocular la 19 Revisión Bibliográfica EEB clásica en ratón, las placas son características, incluso en ratones transgénicos bovinos inoculados con EEB o vECJ (Scott et al., 1999, 2005). Esta ausencia/presencia de placas fue incluso utilizada en su momento como una parte del diagnóstico de diferenciación entre los agentes causales de EEB y del de la EEB con el Scrapie, cuya inoculación en ratón no presentaba placas (Scott et al., 1999; Cordier et al., 2006). En los ratones inoculados con EEB, la presencia de estas placas ha llegado a considerarse como uno de los datos más importantes para el reconocimiento de la enfermedad junto con la vacuolización, proliferación de los astrocitos y la pérdida neuronal (Collinge, 1997). 4. Técnicas diagnósticas Las técnicas utilizadas para el diagnóstico de la EEB, al igual que en el resto de las EET, han venido determinadas por las características propias de la enfermedad. Esto conlleva la necesidad de aplicar en algunas ocasiones varias de ellas con el fin de llegar a un diagnóstico fiable. Las técnicas se centran en la detección de: • Las alteraciones histopatológicas producidas por la enfermedad. • La isoforma infectiva de la proteína prión (PrPsc) mediante inmunohistoquímica (IHQ), Western blot (WB) o microscopía electrónica (ME). • La infectividad mediante bioensayo en ratón. De entre todas ellas, el diagnóstico se ha basado principalmente en la detección, mediante diferentes procedimientos, de la PrPsc, aunque a veces esa tarea no resulte tan fácil (Lasmézas et al., 1997). Las técnicas utilizadas para esta detección en el sistema de vigilancia de la EEB han sido las técnicas de confirmación y las técnicas rápidas. Las técnicas de confirmación, que establece la OIE para el diagnóstico de EEB son más sensibles, aunque son más laboriosas y su realización necesita más tiempo. En España, 20 Revisión Bibliográfica hasta el año 1999, el diagnóstico de la EEB se llevaba a cabo por vigilancia pasiva y sólo se analizaban animales que presentaban síntomas sospechosos (Smith y Bradley, 2003). Pero, a partir de 2000, la Unión Europea puso en marcha un intenso programa de vigilancia activa de la enfermedad obligando a analizar a todos los animales cuyo rango de edad era compatible con el padecimiento de la enfermedad. Este aumento en el número de muestras a analizar es lo que provocó la necesidad de aplicar técnicas rápidas que disminuyeran el tiempo de realización de la técnica de una manera efectiva, aunque conllevara una menor sensibilidad. Aun así, siempre que se obtiene un resultado positivo o dudoso con ellas, éste tiene que ser corroborado con las técnicas de confirmación. Desde la aplicación de los tests rápidos, se diagnosticaron muchos más animales positivos que los que hasta entonces se habían detectado mediante la vigilancia pasiva. Entre el 1 de enero de 2001 y 31 de diciembre de 2006, casi 60 millones de pruebas en el ganado se realizaron dentro de la Unión Europea (casi el 90% en el matadero), detectando más de 4.800 casos de EEB, aproximadamente 1.170 en matadero y 3.700 en los animales de riesgo recogidos en la plantas de transformación (Grassi et al., 2008). Durante ese periodo, la diferencia entre los casos detectados por vigilancia activa y pasiva era notable, pues con esta última sólo habían podido ser detectados 2.361 casos de EEB. Posteriormente, tras la evidencia de la relación entre la vECJ y la EEB, estas técnicas rápidas aún cobraron mayor importancia ya que permitieron retirar un gran número de canales afectadas dirigidas al consumo humano (Grassi et al., 2008), contribuyendo a la protección del consumidor y dando una base de confianza en la seguridad del consumo de carne bovina. La detección precoz de la PrPsc mediante estos análisis fue muy importante para evitar contaminaciones posteriores y la aparición de casos de vECJ en la especie humana, aportando, además, datos más fiables respecto al número de casos de EEB existentes. Por el contrario, a pesar de que algunos estudios defendían que algunas técnicas rápidas como Bio-Rad podían detectar PrPsc en estados iniciales (Grassi, 2003) y otras, como Prionics-Check Western y Prionics-Check LIA, llegaban a presentar una 21 Revisión Bibliográfica correspondencia del 100% con IHQ (Vidal et al., 2005), había sido ampliamente demostrado en la práctica que en ocasiones podían obtenerse falsos negativos con dichos tests, que por IHQ eran confirmados como positivos. En el año 1999 fueron validados 3 tests rápidos para el diagnóstico de EEB, de los cuales 2 posteriormente fueron excluidos (European Commission, 1999). Todos ellos fueron evaluados en bovinos clínicos que ya habían sido diagnosticados por histopatología y se basaban en la detección inmunológica y la movilidad de la porción resitente de la PrPsc en el SNC (Grassi et al., 2008). A partir del año 2001 (European Commission, 2001), momento en que se implantó la vigilancia activa, la importancia de estas técnicas fue mayor, por lo que se validaron dos tests más y se valoró la autolisis de las muestras como un posible factor presente en campo (European Commission, 2004). Por último, en el año 2004, 7 tests nuevos fueron validados. Actualmente, son nueve las técnicas rápidas que, basadas en protocolos de ELISA y Western blot, están admitidas por la Comunidad Europea para el diagnóstico de la EEB (Gavier-Widén et al., 2005). Todas ellas han sido evaluadas en cuanto a su sensibilidad, especificidad y límite de detección. Son: Prionics-Check Western test, Enfer test y Enfer TSE Kit versión 2.0, Enfer TSE versión 3, Bio-Rad TeSeE test, Prionics-Check LIA test, IDEXX HerdCheck BSE Antigen Test Kit (EIA), Prionics Check PrioSTRIP, Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit y Roche Applied Science PrionScreen. De las nueve técnicas rápidas oficiales de diagnóstico de la EEB, se desarrollan brevemente a continuación las técnicas aplicadas en el presente trabajo, tanto la empleada en las muestras bovinas como las aplicadas en las muestras murinas: - Prionics®-Check WESTERN test. El WB de Prionics es una de las técnicas rápidas utilizadas de rutina para el diagnóstico de la enfermedad debido a su alta sensibilidad y temprana detección de PrPsc que, según lo publicado en algunos estudios, es incluso anterior al cambio espongiforme (Cooley et 22 Revisión Bibliográfica al., 2001). El diagnóstico se basa en la diferente susceptibilidad de la PrPc y la PrPsc frente al tratamiento de la proteasa, que permite eliminar la primera y sólo detectar la patológica mediante la migración en una electroforesis en gel de poliacrilamida y la identificación de los fragmentos resultantes por un anticuerpo monoclonal. La presencia de 3 bandas determina la consiguiente presencia de PrPsc en la muestra, confirmando la positividad de la misma. Los protocolos de WB de confirmación son muy lentos, con numerosas centrifugaciones que posibilitan la purificación y centrifugación de la proteína (Stack et al., 1996). Pero los utilizados para técnicas rápidas fueron adaptados sustituyendo estas ultracentrifugaciones con buffers de homogeneización, que no alcanzan la concentración de la proteína lograda en el WB de confirmación, pero aceleran la obtención del resultado (Gavier-Widén et al., 2005). Aun así, es posible determinar los animales con EEB antes de la aparición de los signos clínicos (Schaller et al., 1999) e, incluso, se pueden confirmar resultados no concluyentes obtenidos en la histología (Katz et al., 1992) o en muestras autolíticas (Schaller et al., 1999). En su momento, se describió esta técnica como la más fiable de las técnicas rápidas (Polak et al., 2003), utilizándose para el análisis rutinario de todos los animales destinados a consumo, logrando el diagnóstico de muchos casos positivos y evitando que éstos llegaran a la cadena alimentaria (Oesch et al., 2000). Sin embargo, con el aumento de casos de Scrapie atípico, el uso de esta técnica disminuyó drásticamente. - Bio-Rad Platelia BSE. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada porque su sensibilidad para la detección de PrPsc en los casos de EEB es, según algunos autores, equivalente a la de los bioensayos en ratón afectados con EEB (Grassi et al., 2001). Consiste en un inmunoanálisis de doble anticuerpo (método sandwich) para la detección de PrPsc, efectuado tras una fase de desnaturalización y otra de concentración. 23 Revisión Bibliográfica - BetaPrion BSE EIA Test Kit de Roboscreen. Consta de un primer proceso de purificación de la PrPsc y otro de detección. Se basa en un inmunoanálisis que utiliza dos anticuerpos monoclonales diferentes dirigidos contra dos epítopos presentes en la PrPsc bovina en estado muy desplegado. Las técnicas de confirmación son aquéllas que han demostrado la mayor fiabilidad de resultados ofrecidos en el diagnóstico de la EEB y de las EET en general. A pesar de ser más laboriosas y necesitar más tiempo hasta la obtención de un resultado en comparación con los tests rápidos, destacan por su mayor sensibilidad y especificidad para el reconocimiento de la enfermedad. Por esta razón, de forma rutinaria todas las muestras que han dado un resultado positivo o dudoso en los tests rápidos son sometidas a estas técnicas para confirmar el diagnóstico en los Centros de Referencia. La técnica histológica tiene como objetivo el hallazgo de vacuolización en determinadas áreas del SNC. En caso de que tras su aplicación se obtenga un resultado dudoso o negativo, se debe recurrir a cualquiera de las siguientes técnicas: inmunohistoquímica, Western blot, microscopía electrónica o bioensayo. Poco a poco, esta técnica ha dejado de utilizarse exclusivamente, complementándose casi siempre con otras debido a la posible ausencia de alteraciones histopatológicas antes de la aparición de los signos clínicos. Los métodos discriminatorios para el diagnóstico, utilizados de forma adicional a la valoración histológica, son el Western blot o la inmunohistoquímica. También la microscopía electrónica, aunque mucho menos aplicada ya que, a pesar de presentar la misma especificidad y fiabilidad que las anteriores, al tener un protocolo más laborioso, no se utiliza para el diagnóstico de rutina. En resumen, con la implantación de la vigilancia activa, se instauró el protocolo basado en que las muestras de EEB tenían que ser sometidas a las técnicas rápidas, y sólo las positivas o dudosas, a los métodos de confirmación que figuran en el manual de la OIE: examen histológico, análisis 24 Revisión Bibliográfica confirmación de que la vECJ y la EEB tenían el mismo origen y se correspondían con un único agente, ya que el patrón de glicosilación era el mismo (Collinge et al., 1996; Ironside et al., 2002). Por todas estas razones, la técnica de Western blot ha tenido y tiene tanta importancia en el diagnóstico de la EEB. La constatación de que es una técnica que no presenta ninguno, o muy pocos, falsos positivos y que puede diagnosticar muestras de pobre calidad (Carra et al., 2009), la convierte en una de las de elección como técnica de confirmación, además de ser indispensable en la diferenciación de cepas. Al igual que en la inmunohistoquímica, hay diversos protocolos de Western blot que se utilizan en los diferentes laboratorios (Lloyd et al., 2004), a pesar de que todos se basan en la evidencia de diferentes patrones de glicosilación que parecen depender no sólo del agente, sino también del hospedador (Somerville, 1999). 4.4. Microscopía electrónica La microscopía electrónica se ha utilizado desde siempre para el diagnóstico de las EET mediante la observación de un tipo de fibrillas presentes exclusivamente en individuos afectados por la enfermedad. Estas fibrillas fueron descritas por primera vez por Merz et al. (1981), eran diferentes morfológicamente a otros tipos de fibrillas observadas hasta entonces y fueron denominadas fibrillas asociadas a Scrapie (SAF). Se han observado en el ratón (Merz et al., 1981), oveja (Scott et al., 1987), humanos (Narang y Perry, 1990) y también en bovino donde han sido descritas en varios estudios (Scott et al., 1990, 1992; Wells et al., 1994b). En su momento, estas fibrillas fueron el primer hallazgo morfológico asociado a las EET observado por microscopía electrónica. En un principio, incluso se llegó a decir que las SAF eran las únicas estructuras características de este grupo de enfermedades (Hope et al., 1986) y que estas fibrillas podían estar 31 Revisión Bibliográfica formadas por el agente etiológico (Merz et al., 1984). En estudios posteriores, se comprobó que esto no era del todo cierto. Se vio que el mayor componente de las fibrillas era una glicoproteína resistente a proteasas que tenía un peso molecular de 27000 a 30000 D (PrP27-30 kDa), obtenido por la proteolisis parcial de la PrPsc (33-35 kDa; Bolton et al., 1984, 1985). Esto convertía a las fibrillas en formas automultiplicativas fibrilares, con un componente amiloide, y su fragmentación podía provocar el aumento exponencial en el título del agente causal (Collinge y Clarke, 2007). Posteriormente, mediante la microscopía electrónica (Merz et al., 1981; Prusiner et al., 1983), se descubrió que estas fibrillas contenían proteínas amiloides, como las típicas de otras enfermedades neurodegenerativas del SNC (Multhaup et al., 1985; Roberts et al., 1988), como el Alzheimer. En ambos casos, las proteínas, que eran parte del agente, derivaban de proteínas codificadas por el hospedador y las fibrillas resultantes parecían similares, viendo coincidencias ultraestructurales entre las SAF y las estructuras filamentosas anormales encontradas en el Alzheimer, PHF (Paired Helical Filaments) y amiloide. Aunque más tarde se descubriría que no eran del todo idénticas (Merz et al., 1984, 1987), porque parecían no estar compuestas de las mismas proteínas al no unirse los mismos anticuerpos (Kascsak et al., 1986), esta relación entre las dos enfermedades quedó patente. Finalmente, parece haberse llegado a la conclusión de que estas fibrillas proceden de la proteolisis parcial de vesículas membranosas ricas en PrPsc observadas en el tejido encefálico de los individuos afectados. Suelen tener una media de 11 nm de diámetro, una longitud media de 165 nm y unas características independientes del hospedador y del genotipo (Kascsak et al., 1986). Aun así, existe una gran variabilidad en las medidas observadas en las fibrillas. Su tamaño viene además determinado por el tratamiento previo con SDS, que acorta el tamaño de las mismas, como se describe en el trabajo de Narang y Perry (1990). En él, se demuestra una diferencia en el diámetro de las fibrillas desde 50 nm sin SDS hasta 16-20 nm en muestras tratadas con SDS. Aunque al principio parecía que existían sólo dos clases de fibrillas (Merz et al., 32 Revisión Bibliográfica 1981), posteriores estudios han sugerido que la estructura de las SAF puede ser más diversa y que las pequeñas diferencias en la morfología (Liberski et al., 1991) y la frecuencia de agregación de los filamentos aparecen dependiendo de la cepa del agente causal, del tipo de enfermedad y, probablemente, también del procedimiento de aislamiento que se realice en el laboratorio. Lo que sí se ha demostrado es una asociación entre la visualización de SAF y la presencia de la PrPsc del Scrapie (Bolton et al., 1982; Diringer et al., 1983; Hilmert y Diringer, 1984), aunque no se ha conseguido confirmar si SAF y la proteína son la manifestación estructural del agente o simplemente estructuras que copurifican con la infectividad (Kascsak et al., 1985). Lo que sí parece cierto es que esa estructura típica de las SAF podría ser lo que confiere al agente patógeno su inusual estabilidad a la inactivación química y física (Kascsak et al., 1986). En estudios realizados en modelos murinos, las SAF ya se demostraban por microscopía electrónica a los 60-70 días post-inoculación, al mismo tiempo que empezaban a aparecer los cambios bioquímicos y de comportamiento del animal (Merz et al., 1981). En otros estudios, esta aparición ocurría más tarde, pues se observaban a los 86 días post-inoculación (Rubenstein et al., 1986). A pesar de la variación en el tiempo, sí se comprobaba en todos los casos que un aumento en el número de SAF, a medida que la enfermedad progresaba, coincidía con el aumento de la infectividad de la muestra (Diringer et al., 1983; Merz et al., 1983; Hilmert y Diringer, 1984). Respecto a la presencia en tejido normal, se había observado que la proteína que componía las fibrillas no se agregaba para formar SAF (Narang y Perry, 1990). De hecho, se comprobó, mediante estudios sobre pacientes control (Narang y Perry, 1990), que las fibrillas no estaban presentes en encéfalos normales o en encefalopatías no espongiformes (Merz et al., 1984), confirmándose que estas partículas tubulofilamentosas (SAF) podían ser usadas como una característica de identificación de las EET. La utilización de estas fibrillas como una herramienta más para el diagnóstico ya se había descrito por Gibson et al. (1987) como una 33 Revisión Bibliográfica aplicación de la microscopía electrónica al diagnóstico del Scrapie en encéfalos de ovejas afectadas. A veces, la presencia de estas fibrillas no conllevaba vacuolización neuronal, pero su hallazgo sí que indicaba la existencia del proceso patológico de las EET (Hope et al., 1988). Respecto al caso concreto de la EEB, ya se enunciaba en Hope et al. (1988) que el descubrimiento de fibrillas similares a las asociadas al Scrapie en extractos tratados con detergente de encéfalos afectados por EEB permite el diagnóstico clínico y patológico de la enfermedad, siendo considerado además un método muy sensible (Scott et al., 1992). En este caso, tras haber estudiado y comparado su tamaño, resistencia a la proteasa, inmunorreactividad, unión a la lectina y secuencia parcial de la proteína N-terminal (Hope et al., 1988), se sabe que la mayor proporción de proteína de las fibrillas evidenciadas en casos de EEB es el homólogo bovino de PrP. Las fibrillas bovinas pueden encontrarse en todo el encéfalo, aunque varía su distribución entre diferentes áreas del mismo, y se asemejan a las fibrillas encontradas en la oveja con Scrapie en tamaño y forma. Además, al igual que ellas, presentan una aparente masa molecular de 33-35 kDa y son parcialmente resistentes a la proteolisis con proteinasa K, formando fragmentos de peso molecular de 27-30 kDa (Hope et al., 1988). Gracias a los avances conseguidos con la microscopía electrónica junto con la técnica de IHQ con oro coloidal, aplicada a estudios ultraestructurales (Jeffrey et al., 1995), se ha logrado investigar acerca de la formación de estas fibrillas y a identificar la presencia de estas fibrillas como base para el diagnóstico de la enfermedad (Cho, 1986; Wiley, et al., 1987). En el trabajo que se presenta aquí, la IHQ con oro coloidal se utiliza para confirmar que las fibrillas observadas en las muestras constituyen las denominadas fibrillas SAF. A pesar de su sensibilidad y efectividad, actualmente esta técnica se encuentra en desuso debido probablemente a la dificultad en el acceso al microscopio y a la laboriosidad del protocolo. 34 Revisión Bibliográfica 4.5. Inoculación en modelo murino El bioensayo en ratón se emplea para estudiar el comportamiento de la enfermedad en un modelo vivo, tras transmitir el agente causal de la enfermedad por diferentes vías. La ventaja que presenta es que se puede conseguir un mayor control sobre las variables que afectan a la evolución de la enfermedad. Aun así, no se suele utilizar como técnica de confirmación debido al tiempo y medios necesarios que se requieren, pero sí como una herramienta muy útil para investigación y para la obtención de resultados definitivos. Es la única forma de comprobar directamente la presencia del agente causal (Kübler et al., 2003) y se ha considerado como el método más sensible para la detección de la PrPsc (Novakofski et al., 2005). Utilizando varias líneas celulares, se podía detectar PrPsc, pero no se podía medir con otras técnicas bioquímicas (Weissmann et al., 2002; Vorberg et al., 2004). Además, se convierte en una de las técnicas de elección para la caracterización del agente causal, al ofrecer mucha más información sobre el desarrollo, comportamiento y progreso de la enfermedad en el animal respecto a las otras técnicas ya descritas. En el estudio de las EET en general (Scott et al., 1999; Crozet et al., 2001; Vilotte et al., 2001) y de la EEB en particular (Beck y Daniel, 1969b; Buschmann et al., 2000), el método de la inoculación en modelo murino ha sido muy importante al permitir demostrar la infectividad de la proteína prión (Yokoyama et al., 2007). Al principio, esta técnica se utilizaba especialmente para el estudio del origen del agente etiológico de la enfermedad (Prusiner, 1982) pero, posteriormente, la inoculación en modelo murino se ha utilizado también en los estudios de caracterización de las propiedades biológicas del agente causal. No se ha podido aclarar los mecanismos precisos en que basan su aparente diversidad (Baron, 2002b), pero permite distinguir diferentes agentes. Esta caracterización se fundamenta en parámetros controlados genéticamente como el periodo de incubación (Dickinson y Meikle, 1969) y el estudio histopatológico (Fraser y Dickinson, 1973). También la neuropatología y propiedades bioquímicas de los 35 Revisión Bibliográfica agentes causales han sido estudiadas de este modo (Lloyd et al., 2004). Uno de los aspectos claves que regulan la transmisión en el modelo murino es la barrera de especie. Como ya se ha comentado anteriormente, en el caso de la EEB, el agente causal posee una gran capacidad para afectar a otras especies (Dawson et al., 1990; Foster et al., 1993; Bruce et al., 1994). Por ello, además de facilitarse la transmisión de la enfermedad, se mantienen las características propias de cada agente causal de origen bovino, incluso tras pasar por varias especies (Bruce et al., 1994), incluyendo humanos (Collinge et al., 1996), lo que convierte al bioensayo en una técnica muy efectiva para el estudio de la EEB. Por esta razón, esta transmisibilidad del agente causal (Fraser et al., 1992; Green et al., 2005) se ha convertido en una herramienta muy útil para el diagnóstico y para el estudio de la enfermedad, por su mayor sensibilidad respecto a otras técnicas y por ofrecer un diagnóstico fiable. Sin embargo, a pesar de que la especificidad de la técnica es muy alta, pues no se han detectado falsos positivos, un resultado negativo no puede descartar la presencia de la enfermedad. En algunos casos, un resultado negativo puede no tratarse de un diagnóstico definitivo porque se ha demostrado que el número de ratones afectados, después de la inoculación con algunos agentes causales de las EET naturales, suele ser baja (Baron, 2002b). A pesar de todas las ventajas ofrecidas por el bioensayo en ratón, se ha observado que varios factores pueden influir en la transmisión del agente presente en una muestra positiva y, por lo tanto, en la detección del agente causal en el animal afectado. En algunos animales, aunque esta transmisión ocurre, el periodo de incubación es largo y la susceptibilidad es baja en el primer pase (Hill et al., 2000). Además, pueden emerger nuevas características en los nuevos hospedadores, sugiriendo una relación entre la barrera de especie, cambios en la conformación de la PrPsc y la identificación de nuevos agentes causales (Peretz et al., 2002). El factor que más varía es el tiempo de incubación, controlado por el gen Sinc (Scrapie Incubation), con los dos alelos s7 y p7, resultando ser el mayor determinante de la duración del periodo de incubación en el ratón (Dickinson et 36 Revisión Bibliográfica al., 1968). El principal problema que se plantea es que, al existir esta barrera de especie, a veces este periodo se alarga en exceso. Sólo con sucesivos pases, este tiempo se va acortando, al mismo tiempo que el agente se adapta a los hospedadores y se estabilizan sus características patológicas (Kimberlin y Walter, 1977). Por ejemplo, en el caso de la EEB, la transmisión a los ratones requiere una dosis infectiva mil veces superior a la requerida para su transmisión al ganado bovino (Bradley, 1999). Por todas estas razones, los ratones transgénicos y knock out han supuesto un gran avance en la investigación de las enfermedades priónicas (Raeber et al., 1998). La ventaja es que los periodos de incubación se acortan sustancialmente, variando desde 1 año (Lasmézas et al., 1997) hasta 250 días (Scott et al., 2000) en los casos de inoculación con el agente de la EEB. Estos ratones, que presentan una PrPc homóloga a la de la especie de origen, ya se habían usado con la enfermedad del Scrapie (Vilotte, 2001) y se han aplicado también al estudio de la EEB para facilitar la transmisión experimental y disminuir el tiempo de incubación respecto a los ratones convencionales (wild type). En el caso de la EEB, los más utilizados han sido los ratones transgénicos bovinizados (Buschmann et al., 2000; Castilla et al., 2003), que son más sensibles a los priones bovinos (Prusiner, 1997) y con los que se consigue disminuir el periodo de incubación respecto a otros modelos murinos (Baron, 2002b). Así, se llegan a obtener periodos de incubación de 250 a 400 días con estos ratones transgénicos bovinizados, con respecto a los 450 días necesarios en ratones wild-type (Buschmann et al., 2000). Además, no sólo se acorta el tiempo de incubación, sino que se ha comprobado que la expresión de PrP bovina en estos ratones elimina la barrera de especie para la transmisión de la EEB (Scott et al., 1999). Esta innovación ha facilitado la realización de estudios posteriores, ya que estos ratones transgénicos que sobreexpresan PrP (TgBoPrP) pueden llegar a ser diez veces más sensibles que el bovino y 10.000 veces más sensibles que los ratones wild-type (Safar et al., 37 Revisión Bibliográfica 2002). Concretamente, se ha determinado que los títulos de PrPsc son aproximadamente de 107ID50 unidades por gramo de encéfalo bovino cuando son medidos en ratones bovinizados (TgBoPrP). Aun así, era necesario valorar si tras este paso por ratones TgBoPrP, las características del agente de la EEB se mantenían, lo que quedó ampliamente demostrado con la preservación de sus características bioquímicas (Espinosa et al., 2007) y las lesiones típicas de la EEB (Scott et al., 2005). Así, se comprobó que el agente causal no se altera (Scott et al., 1999), incluso tras varios pases seriados en ratones bovinizados. Todas estas ventajas del uso del bioensayo en ratón han sido muy útiles para el estudio de la enfermedad y han servido como una valiosa herramienta para discriminar el Scrapie y la EEB en el ganado ovino (Espinosa et al., 2007). Existen muchos tipos de ratones transgénicos, todos ellos perfectamente detallados en los diferentes trabajos donde se describen por primera vez. Concretamente, los ratones TgbovXV, que son los que han sido usados en este experimento, han sido elegidos porque aportan una disminución en el tiempo de incubación y una mayor sensibilidad respecto a los ratones no transgénicos. Estos ratones transgénicos son 10.000 veces más sensibles a la infección de EEB que los ratones convencionales y diez veces más sensibles que los bovinos (Buschmann y Groschup, 2005). Aunque en otros trabajos se han obtenido los mismos resultados que con los TgBoPrP (Masujin et al., 2008), parece que el uso de estos animales tiene la ventaja de permitir la detección de bajas dosis de infectividad (Buschmann et al., 2000), con un título de 107.67 ID50/g (Buschmann y Groschup, 2005). Por esta razón, este tipo de ratones ha sido ampliamente utilizado en muchos trabajos, tanto para estudiar el comportamiento y acumulación de la PrPsc en estados terminales de EEB (Buschmann y Groschup, 2005) como en las cepas atípicas (Yokoyama et al., 2007) para demostrar la conversión de la BASE en EEB tras varios pases (Capobianco et al., 2007). 38 Revisión Bibliográfica A pesar de todas las posibilidades que ofrece el amplio número de técnicas aplicables para el diagnóstico de las EET, hay que tener en cuenta ciertos factores que pueden interferir en el éxito de la obtención de un diagnóstico definitivo. Los principales problemas suelen derivar de las características y estado de la muestra, pero también del origen de la misma, que puede identificar un diferente agente causal. La conservación de las muestras es muy importante para garantizar la calidad y fiabilidad de los resultados de las técnicas. Normalmente, cuando las muestras están frescas y no ha pasado mucho tiempo desde el sacrificio o muerte y la llegada de la misma al laboratorio, es muy probable que el diagnóstico sea satisfactorio. El problema surge cuando ese tiempo se alarga y las muestras comienzan a sufrir un cierto grado de autolisis, lo que puede dificultar un diagnóstico fiable y definitivo. Esto es especialmente manifiesto en el caso de la histopatología, que proporciona numerosos falsos diagnósticos negativos debido a la autolisis (Wells et al., 1994b). El otro problema que puede surgir derivado de la naturaleza de la muestra es la baja concentración de la PrPsc existente en la misma, lo que puede determinar que las técnicas aplicadas no sean capaces de detectarla, dando lugar a un resultado negativo a pesar de que ésta sea positiva (falsos negativos). Este dato hay que tenerlo en cuenta tanto al valorar en cada caso la positividad o negatividad de la muestra como al estandarizar las técnicas que tendrán que ser capaces de solventar ese problema. Respecto al origen de la enfermedad, diferentes agentes causales pueden provocar distintos resultados en el diagnóstico. Tanto en la EEB clásica como en las cepas atípicas encontradas hasta el momento, las características bioquímicas y las propiedades que presentan respecto a las técnicas diagnósticas utilizadas de rutina, han sido bien descritas. El problema puede aparecer cuando, debido a esta diversidad de agentes causales, aparecen resultados no esperados asociados a 39 Revisión Bibliográfica 40 nuevos orígenes no bien descritos o no contemplados aún en la bibliografía, no pudiendo obtenerse un diagnóstico positivo fiable. Se han realizado numerosos estudios al respecto de lo que parecen nuevas cepas con comportamientos diferentes a los ya establecidos o de resultados que no encajan con los parámetros conocidos, algunos de los cuales han permitido identificar nuevos agentes causales con fenotipos moleculares determinados. Material y Métodos adición a la solución de 3 ml de 15% Kl-HSB, se realiza una incubación de 30 minutos en las mismas condiciones anteriores de temperatura y agitación. De la misma manera que en los pasos anteriores, las muestras son sometidas a una nueva incubación de 1 hora tras la adición de 1 mg/ml de proteinasa K (Roche, Suiza). Previamente a la última centrifugación, se añaden 4,5 ml de KI-HSB al 10% y se transfiere la solución a un nuevo tubo de ultracentrífuga en el que se depositan 2 ml de sacarosa al 20%. Tras llenar el tubo con KI-HSB al 10%, se vuelve a centrifugar (189.000g, durante 1 hora a 10°C). El sobrenadante es desechado y el pellet obtenido se resuspende en 40 µl de tampón de muestra. El proceso de concentración de las muestras finaliza con una breve sonicación (50-60 Hz durante 30 segundos) y una corta centrifugación para concentrar la muestra en el fondo del tubo. Una vez procesada la muestra, la técnica de Western blot consiste en una electroforesis en gel de poliacrilamida y la consiguiente inmunotransferencia. Los geles, previamente preparados, consisten en un gel de separación al que, tras una hora para permitir que se polimerice, se añade el gel de concentración. Este gel de concentración, similar al de separación en su composición, se deja secar 5 minutos hasta que polimerice completamente. Las muestras, previamente preparadas, son incubadas (durante 5 minutos a 95ºC) y cargadas en el gel (30μl). La electroforesis se realiza a 100V hasta que las muestras alcanzan el gel de separación, entonces se continúa a 200V durante unos 30-40 minutos. En cuanto a la transferencia, ésta se realiza en cámara semiseca, donde entra en contacto el gel con una membrana immobilon-P-Transferencia (previamente equilibrada durante 5 minutos en metanol y tampón de transferencia). Para la transferencia se requiere la colocación de papel Whatman. La corriente aplicada es 15V durante 50 minutos. Tras este tiempo, la membrana se bloquea con la solución de bloqueo (durante 30 minutos a temperatura ambiente y en agitación) y se incuba con el anticuerpo primario (6H4, 1:2500; Prionics, Zurich, Suiza) durante toda la noche a 4ºC en agitación. Tras 3 lavados con PBS/Tween, se incuba con el conjugado GAM-AP (1/2000, Jackson Immunoresearch, Reino Unido; durante 1 hora en 45 Material y Métodos agitación). Se repite el ciclo de lavados y la membrana se incuba con tampón de ensayo durante 2 minutos en las mismas condiciones. Para visualizar la unión de los anticuerpos, se añade el sustrato quimioluminiscente CDP-Star (Tropix, Inc, Estados Unidos) durante 5 minutos antes del revelado de la membrana. Con el objetivo de aumentar la sensibilidad de la técnica y solventar los problemas de detección de la PrPsc presente en las muestras, se añade un protocolo de purificación y concentración previo a la técnica de Western blot que se acaba de detallar, elaborado en base a varios protocolos previamente descritos para tal fin (Hilmert y Diringer, 1984; Hope et al., 1986; Stack et al., 1995), con el propósito de asegurar una concentración suficiente en la muestra para su detección. La técnica de concentración finalmente aplicada consiste en una homogeneización del encéfalo en 45 ml de sarcosil al 10% (pH 7,4 ajustado con NaH2PO4) durante 30 segundos en el homogeneizador. La solución se deja reposar (durante 30 minutos a temperatura ambiente) y, a continuación, se añaden 3 gotas de N-octanol para eliminar la espuma. Posteriormente, se realiza una centrifugación (22.000 g, durante 30 minutos), eliminándose el sobrenadante y diluyendo el pellet en una solución de 1% sarcosil y 10% NaCl. El mismo proceso se repite a continuación: una centrifugación (215.000g, durante 30 minutos) tras la cual se elimina de nuevo el sobrenadante y se diluye el pellet en 1 ml de la misma solución de 1% sarcosil y 10% NaCl en la que será incubado (durante 1 hora a 37ºC y en agitación). La solución resultante se transfiere a un vial adecuado y se centrifuga nuevamente (9100 g, durante 15 minutos). El pellet que se obtiene es diluido en el mismo buffer y digerido con 5μg de proteinasa K (Roche, Suiza) durante una incubación de 2 horas a 37ºC. Una centrifugación (9100 g, durante 5 minutos) se realiza como último paso antes de obtener el pellet, sobre el que se aplicarán los protocolos anteriormente descritos sobre preparación de la muestra (concentración y purificación), electroforesis e inmunotransferencia. 46 Material y Métodos 3.1. Western blot de diferenciación de Bio-Rad (Ref.: 35 51177) Es una adaptación de la técnica de Western blot antes descrita que permite diferenciar si el agente causal es el de la EEB, del Scrapie o del Scrapie atípico, mediante la comparación de la altura, intensidad y localización de las bandas glicosiladas y su presencia/ausencia con determinados anticuerpos en relación con el perfil característico que presenta cada uno. Se basa en las diferencias de sensibilidad a la proteolisis de la región N-terminal de la PrPsc en función del agente causal que se trate. Así, dependiendo de las condiciones de proteolisis, esta región de la PrPsc puede ser digerida en el caso de la EEB, pero persistir en los casos de Scrapie clásico (Tabla 1). Por esta razón, no es una técnica de confirmación, pero es de gran utilidad para la caracterización de agentes causales, que es para lo que fue aplicada en este estudio. La técnica incluye dos protocolos de purificación, que difieren en la concentración de proteinasa K a la que se expone la muestra (LOW y HIGH), y se combina con otros dos protocolos de detección mediante Western blot usando dos anticuerpos monoclonales (TEST y CONTROL), que reconocen dos regiones proteicas distintas. Para la realización de esta técnica se obtienen 0.35 gr de tejido nervioso procedente de la muestra, preferentemente del obex, que son homogeneizados con un buffer adecuado. Además, se utilizan un control de EEB y otro de Scrapie clásico que serán sometidos al mismo protocolo posterior que las muestras de estudio. La solución resultante tras la homogeneización es transferida (por duplicado, 20% peso/volumen) y se digiere con dos soluciones de concentraciones diferentes de proteinasa K. Una de las digestiones se realiza con una solución compuesta de 40 μl/ml y otra menos concentrada de 2 μl/ml en la misma solución (1:20 de la solución más concentrada). Tras la incubación de dicha mezcla (durante 30 minutos a 37ºC), se lleva a cabo la precipitación de PrPsc mediante la adición del reactivo adecuado. Tras una nueva centrifugación (15000g, durante 7 minutos a 20ºC), el sobrenadante es desechado y el pellet es diluido en solución Laemmli e incubado (durante 5 minutos a temperatura 47 Material y Métodos ambiente). Tras una nueva incubación del pellet resuspendido (durante 5 minutos a 100ºC +/- 5ºC), las muestras se someten a centrifugación (15000g, durante 15 minutos a 20ºC) para seleccionar el sobrenadante que será cargado en el gel y desechar el pellet. Para la electroforesis (200V durante 50 minutos a temperatura ambiente) se cargan las muestras por duplicado (dos pocillos por muestra con mayor y menor concentración de digestión respectivamente) junto a los correspondientes marcadores. Los geles también son por duplicado, pues posteriormente las membranas son incubadas con dos diferentes anticuerpos primarios. Previamente a la transferencia (115V durante 60 minutos), las membranas son equilibradas mediante lavados con etanol, agua destilada y tampón de transferencia (TRIS/CAPS-Etanol al 1%). Posteriormente, la membrana transferida es de nuevo equilibrada (con PBS, etanol y agua destilada, durante 5 minutos). La primera incubación a la que es sometida la membrana son 30 minutos en agitación moderada en solución de saturación (1/10 en solución de lavado) y, después, con el anticuerpo primario suministrado comercialmente (1/10, durante 30 minutos a temperatura ambiente y con agitación moderada). Cada una de las dos membranas se incuba con un anticuerpo primario diferente (CONTROL y TEST), que reconocen la región central de la proteína PrPsc y la región del octapéptido de la proteína, respectivamente. La membrana, entonces, es incubada con el anticuerpo secundario (1/10, durante 20 minutos a temperatura ambiente y agitación moderada). Tras los lavados, se lleva a cabo el revelado (Amersham Film ECL) con el sustrato ECL (Amersham, Reino Unido; 15 minutos). 48 Material y Métodos Tabla 1: Diagrama esquemático de la clasificación de las muestras a partir de los resultados obtenidos mediante la técnica del Western blot de diferenciación de BioRad. Condiciones de purificación Negativo Scrapie EEB pK sensible (atípicas) Condiciones de detección LOW HIGH LOW HIGH LOW HIGH LOW HIGH TEST - - + + + - + - CONTROL - - + + + + + - Para tratar de aumentar la sensibilidad de la técnica y solventar los posibles problemas de concentración de PrPsc en las muestras, se añade previamente el mismo protocolo de purificación y concentración de PrPsc que fue incluido anteriormente a la aplicación del Western blot de confirmación. 4. Microscopía electrónica La técnica de microscopía electrónica empleada para la observación de fibrillas se basa en los protocolos descritos por Hilmert y Diringer (1984) y Narang y Perry (1990). Se elige una combinación de ambos con el fin de lograr una mayor eficacia y sensibilidad en las muestras con baja concentración de PrPsc. Debido a la dificultad de evidenciar las fibrillas, se lleva a cabo, previo a la técnica de microscopía electrónica, el mismo protocolo de purificación y concentración de PrPsc realizado previamente a las técnicas anteriores. Tras este protocolo de concentración, la muestra es recogida en las rejillas (Carbon-formvar 200-mesh grids, Ted Pella, Inc, Estados Unidos) por medio del método touch grid descrito por Narang y Perry (1990). Posteriormente, las rejillas se sumergen en SDS al 1% durante 1 minuto y son lavadas con agua destilada durante 5 minutos. Para su visualización, se utiliza la tinción con ácido potásico 49 Material y Métodos fosfotúngstico (pH 6,6 al 2%), tras la cual se valoran las muestras con el microsocopio electrónico de transmisión. Adicionalmente, para confirmar que las fibrillas observadas están asociadas a la enfermedad, se aplica una técnica inmunohistoquímica que utiliza el oro coloidal para marcar la PrPsc constituyente de las fibrillas. Esta técnica de microscopía electrónica con oro coloidal, basada en la descrita por Merz et al. (1987), se detalla a continuación. Partiendo de las muestras procesadas para visualización con el microscopio electrónico convencional, las muestras son capturadas también mediante la técnica de touch grid. Las rejillas son lavadas en agua destilada (4x) e incubadas en albúmina sérica bovina, BSA (0.1%, durante 10 minutos), para bloquear señales inespecíficas. Posteriormente, el anticuerpo primario diluido en BSA se incuba durante toda la noche a 4º C (L42, 1/500; R-Biopharm, Darmstadt, Alemania). Tras 4 lavados con PBS (durante 8 minutos), se lleva a cabo la incubación con el anticuerpo secundario (goat anti-mouse immunoglobulin, 10 nm colloidal gold-conjugated, Ted Pella, Inc, Estados Unidos) a dilución 1/100 en BSA (durante 1 hora). Por último, se realizan varios lavados en PBS (4x, durante 8 minutos) y en agua destilada (2x) antes de la tinción de la muestra con ácido fosfotúngstico al 2% (ph 7,2). En ambos casos, el microscopio utilizado para la visualización de las fibrillas es un Jeol JEM-1200 EX II aplicando un voltaje de 80.000 voltios. 5. Bioensayo en ratón Para llevar a cabo el bioensayo, las 5 muestras son inoculadas en ratones. La infección experimental se llevó a cabo en Alemania, concretamente en Micromun Privates Institut für Mikrobiologische Forschung GmbH (Greifswald, Alemania), debido a que entonces no se disponía de las instalaciones necesarias que 50 Material y Métodos cumplieran con los niveles de seguridad imprescindibles y exigidos por la legislación vigente para efectuar en el Centro todo el ensayo. En Micromum es donde se realizan tanto las inoculaciones como todo el seguimiento clínico, eutanasia, toma de muestras y valoración mediante técnicas rápidas. La línea transgénica de TgbovXV empleada fue generada, como se ha adelantado en el capítulo de Revisión Bibliográfica, por Buschmann et al. (2000) y se caracteriza por ser ratones transgénicos que sobreexpresan el gen bovino de PrP (Buschmann y Groschup, 2005). Concretamente, esta línea transgénica ha sido realizada insertando el transgen bovino PrP (6OR) por microinyección mediante un vector transgénico phgPrP, logrando un índice de expresión 8 veces superior al wild-type. Lo que se consigue así es un aumento significativo de la sensibilidad al agente causal de la EEB y una disminución del tiempo de incubación de la enfermedad tras la inoculación experimental. Anteriormente a la inoculación, se realizaron varias pruebas en los inóculos para comprobar su toxicidad y la contaminación microbiana, con el objetivo de optimizar el éxito de la inoculación. Se llevaron a cabo inoculaciones en un reducido número de ratones para comprobar dichas variables en los inóculos correspondientes a las muestras objeto de estudio y reducir así su influencia sobre la supervivencia de los animales inoculados. 5.1. Pruebas preliminares 5.1.1. Contaminación microbiana. La contaminación microbiana se valoró realizando el recuento de unidades formadoras de colonias (ufc) en las placas de agar Luria sembradas previamente con el inóculo. Para ello, se llevó a cabo una siembra en placa de 125 μl de cada inóculo durante 48 horas a 37ºC. Si transcurrido este tiempo, el resultado era mayor de 3 ufc, los inóculos se sometían a un proceso basado en dos incubaciones (durante 15 min a 70ºC), con un intervalo de 24 horas entre ambas, previo a la inoculación en el animal. 51 Material y Métodos 5.1.2. Toxicidad. Para valorar la toxicidad presente en los inóculos de las muestras del estudio, se inocularon 20 μl por vía intraperitoneal junto con 100 μl por vía intracerebral de cada muestra a un número limitado de ratones (animales/muestra: 54/439, 45/440, 41/441, 38/442, 51/447). Estos animales, aislados en las jaulas UNIProtect-Laminar-Air-Stream Board que aseguran un ambiente libre de gérmenes, se mantuvieron durante diez días, con inspección de los animales dos veces al día. Si tras 10 días post-infección la mortalidad de los ratones era de más del 20%, la toxicidad se consideraba inaceptable, por lo que se probaron sucesivas diluciones de cada muestra hasta alcanzar una toxicidad tolerable. Al mismo tiempo, la toxicidad de los inóculos se valoró también comprobando la existencia de efectos citotóxicos en cultivos monocapa de células Vero con la ayuda de un microscopio inverso. 5.2. Inoculación en ratón Un número total de 229 ratones Tgbov XV fueron inoculados intracerebral e intraperitonealmente con 20 μl y 100 μl del inóculo, respectivamente. La concentración de cada uno de ellos varió ostensiblemente debido a los diferentes valores obtenidos en los estudios de toxicidad y contaminación microbiana, dependiendo de las diluciones que fueron necesarias en cada caso. Tras la inoculación y hasta la muerte o sacrificio de los animales, los ratones se mantuvieron estabulados en jaulas Macrolon (tipo III), con unas condiciones ambientales controladas de temperatura (20-23ºC) y humedad (50-60%) y con ciclo de día/noche (12 h/ciclo). Además, los animales se mantuvieron en condiciones SPF, esterilizando todo el material que entraba en contacto con los animales: material de anidación ("Allspan", INTRAVET), pienso (V1126-000, ssniff M-extrudet Zucht) y agua de bebida. 52 Material y Métodos Durante el periodo de incubación, los animales fueron valorados clínicamente una vez al día durante el primer mes y dos veces por semana desde el día 31 al 700, con el fin de detectar precozmente cualquier síntoma clínico. Cuando esto ocurría, se recuperaba la frecuencia del examen clínico (1 vez/día) de todos los animales de esa jaula, además de separar a los animales que presentaban esos signos clínicos siguiendo el protocolo ya aplicado por Cordier et al. (2006). Aparte, de modo rutinario, se inspeccionaban diversos parámetros relacionados con la función vital para aplicar, en caso de que fuera necesario, los criterios de punto final establecidos por los expertos en bienestar animal de la empresa alemana. El tiempo de incubación máximo que se estableció para la aparición de los síntomas clínicos fue de 24 meses, tras los cuales los animales fueron sacrificados. De todas formas, antes de ese tiempo, la mayoría de los animales murieron por causas naturales y otros fueron sometidos a eutanasia (CO2) al cumplir con uno o más criterios de punto final. Tras la muerte de los animales, de forma natural o por eutanasia, se extrajo el encéfalo completo. Un hemiencéfalo se mantuvo en fresco y fue utilizado para la ejecución de las técnicas rápidas en las instalaciones de Micromum: BetaPrion BSE EIA Test Kit de Roboscreen y Kit de detección de Bio-Rad Platelia BSE; y el otro hemiencéfalo, fijado en formol por inmersión (10%), fue enviado, junto a toda la información relativa a cada animal, para la realización del resto de pruebas de detección de PrPsc y posteriores estudios al Centro de Investigación en Encefalopatías y Enfermedades Transmisibles Emergentes. Las técnicas rápidas a las que fueron sometidos todos los encéfalos murinos en Alemania fueron las siguientes: - BetaPrion BSE EIA Test Kit de Roboscreen. La técnica, ya descrita en el capítulo de Revisión Bibliográfica, consiste en una homogeneización de la 53 Material y Métodos muestra procedente del encéfalo de los ratones inoculados y una posterior digestión con proteinasa K (durante 15 minutos a 37ºC en agitación) para eliminar la PrPc. Tras una incubación con la solución de precipitación (durante 15 minutos), una centrifugación (16000g, durante 5 minutos) y la solubilización de la PrPsc (durante 5 minutos a 99ºC), la proteína resistente es detectada mediante la incubación con dos anticuerpos monoclonales (durante 45 minutos). El anticuerpo secundario utilizado es conjugado con peroxidasa, uniéndose al sustrato colorimétrico (durante 10 minutos en oscuridad) añadido posteriormente. Tras el bloqueo de la reacción, la absorbancia se mide a una longitud de onda entre 450nm y 620nm. - Bio-Rad PLATELIA BSE Detection Kit. Esta técnica fue empleada como alternativa para valorar las muestras que resultaban positivas en la técnica anterior. Es un enzimoinmunoensayo que consiste en una homogeneización del tejido que, tras la digestión con proteinasa K, es incubado a 37ºC durante 10 minutos. Posteriormente, se realiza una centrifugación (20000g, durante 5 minutos) y el pellet resuspendido es nuevamente incubado (a 100ºC durante 5 minutos), para después mezclarlo vigorosamente. Entonces, la muestra es diluida de nuevo con el buffer adecuado y preparada para el proceso del ELISA que comprende: 3 pasos de incubación (a 37ºC, a 4ºC y el último paso en oscuridad a temperatura ambiente) con dos anticuerpos (uno de captura y otro de detección), 2 ciclos de lavado y la lectura final de los resultados que se lleva a cabo en un fotómetro a una longitud de onda entre 450 nm y 620nm. Con respecto a la parte del encéfalo que se envía para el resto de pruebas diagnósticas, éste se destina para las técnicas de confirmación que a continuación se citan, principalmente para la realización de técnicas inmunohistoquímicas, aunque también para realizar técnicas de microscopía electrónica y de microscopía confocal. 54 Resultados RESULTADOS 1. Técnica rápida La primera técnica de diagnóstico aplicada a las muestras procedentes de tejido nervioso bovino fue la técnica rápida, tal y como se hace de rutina en el sistema de la vigilancia activa. Según el resultado obtenido con la técnica aplicada, se seleccionaron las muestras incluidas en el estudio en base a los resultados no concluyentes que presentaban todas ellas. Tras la aplicación del Prionics®-Check WESTERN test, se obtuvo un resultado que no permitía confirmar ni descartar la presencia de PrPsc. El diagnóstico era confuso porque se evidenciaba señal compatible con la presencia de PrPsc, pero el problema era que la intensidad, el tamaño y la posición de las bandas no se correspondían claramente con lo descrito. La razón podría haber sido que las muestras presentaban un avanzado estado de autolisis que podía influir en la distorsión de las bandas pero, por otro lado, el resultado tampoco coincidía con el patrón observado hasta entonces en muestras de similares características. 2. Técnicas de confirmación en las muestras autolíticas bovinas: 2.1. Inmunohistoquímica En todos los frotis en los que se llevó a cabo el protocolo de inmunohistoquímica descrito para detectar la PrPsc, se observó, diseminada por toda la muestra, una tinción que parecía corresponder con depósitos de PrPsc (Fig. 3A, B, C, D, E). Dicha tinción no se encontró en ninguno de los frotis realizados a partir de muestras control procedentes de animales sanos (Fig. 3F). 59 Resultados A B C D E F Fig. 3: Inmunomarcaje en frotis de la muestra bovina 439 (A), 440 (B), 441 (C), 442 (D) y 447 (E), así como de una muestra negativa procedente de un animal sano (F; 200x). La positividad de la señal sobre todos los frotis procedentes de las muestras autolíticas bovinas se repitió con los 3 anticuerpos testados en el análisis inmunohistoquímico: L42, R145 y F89 (Fig. 4). B C A Fig. 4: Imagen comparativa de inmunomarcaje en frotis bovinos de la muestra 442 con el anticuerpo L42 (A), R145 (B) y F89 (C; 200x). 60 Resultados La inclusión del linker que fue añadido al protocolo inmunohistoquímico para amplificar la señal de PrPsc, no amplificó significativamente la señal (Fig. 5). B A Fig. 5: Inmunomarcaje en un frotis bovino realizado a partir de la muestra 441 mediante una inmunohistoquímica convencional (A; 200x) y con la adición del linker (B; 200x). 2.2. Western blot de confirmación (OIE) En todas las muestras incluidas en el estudio tras la aplicación del Western blot especificado por la OIE como técnica de confirmación (inmunotransferencia SAF), se llegó a observar una señal muy débil que clasificaba a las muestras nuevamente como no concluyentes. A pesar de todo el protocolo previo de purificación-concentración (tal y como se detalla en el capítulo de Material y Métodos) para concentrar más la PrPsc y aumentar la señal, no se logró una mejora significativa de la misma, por lo que el resultado resultó ser de nuevo no concluyente al no corresponderse con los patrones observables de forma rutinaria (Fig. 6). 61 Resultados Fig. 6: Imagen obtenida mediante el Western blot de la OIE realizado en muestras autolíticas bovinas. 2.2.1. Western blot de diferenciación de Bio-Rad (Ref.: 35 51177) Las muestras fueron sometidas al Western blot de diferenciación de Bio-Rad que distingue entre los agentes causales de la EEB, el Scrapie clásico y el Scrapie atípico con el fin de comprobar si los resultados no concluyentes podían deberse a una posible variación del agente causal. La presencia de bandas no fue clara. Las muestras parecían negativas en ambas membranas, aunque se intuía ligeramente una presencia de inmunomarcaje, especialmente en la membrana incubada con el anticuerpo TEST, que reiteraba este resultado no concluyente de las técnicas anteriores. Incluso con el protocolo previo de purificación de la muestra, el resultado no concluyente no variaba de manera significativa (Fig. 7). 62 Resultados A B Fig. 7: Patrón de glicosilación de una muestra de EEB, otra de Scrapie y una de las muestras estudiadas (447) mediante el Western blot de diferenciación con el anticuerpo CONTROL (A) y TEST (B). 2.3. Microscopía electrónica La técnica de microscopía electrónica ofreció resultados concluyentes en todas las muestras gracias a la aplicación del protocolo de purificación y concentración previo al touch grid. En todas las muestras se visualizaron unas fibrillas (Fig. 8) de morfología similar a las descritas en muestras de EEB por otros autores (Narang y Perry, 1990). Cabe mencionar que las fibrillas que se encontraban en todas ellas siempre estaban presentes en un número muy escaso y con una longitud ligeramente menor que la descrita en otros estudios. Fig. 8: Imagen de una fibrilla procedente de una de las muestras de tejido nervioso bovino objeto de este estudio procesada para su visualización con el microscopio electrónico (A; 60.000x). 63 Resultados Posteriormente, con la incorporación del oro coloidal como inmunomarcador de las SAF, se pudo demostrar que el anticuerpo reconocía de forma específica la PrPsc que formaba las fibrillas (Fig. 9). Su tamaño era el mismo que el encontrado anteriormente, corroborando que se trataban del mismo tipo de fibrillas. A B Fig. 9: Imagen de fibrillas procedentes de las muestras de tejido nervioso bovino objeto de este estudio procesadas para su visualización mediante la técnica de microscopía electrónica con oro coloidal a 120.000x (A); así como las visualizadas en el estudio de Merz et al. (1987; B: 143.000x). Además del oro coloidal asociado a fibrillas, también se visualizaron partículas de oro pareadas (Fig. 10A) con una localización que no parecía aleatoria, sino específica, y que parecía corresponderse a dímeros de PrPsc similares a los descritos por Dourmashkin et al. (2004; Fig. 10B). B A Fig. 10: Imagen comparativa de partículas de oro visualizadas en las muestras bovinas estudiadas (250.000x, diámetro de partículas de oro = 10 nm, 10A) y de las visualizadas en el estudio de Dourmashkin et al. (2004) con la misma técnica (416.000x, diámetro de partículas de oro = 5 nm, 10B). 64 Resultados 3. Bioensayo en ratón 3.1. Pruebas preliminares En las pruebas previamente realizadas a la inoculación experimental se evidenció que tanto la contaminación microbiana como la citotoxicidad eran muy elevadas. Como ambas podían comprometer el éxito posterior de la inoculación, se realizaron diversas pruebas con el objetivo de reducir sus efectos adversos. 3.1.1. Contaminación microbiana Inicialmente, la contaminación microbiana era altísima, evidenciada por el gran número de unidades formadoras de colonias (ufc >1000) que crecían a partir de homogeneizados de todas las muestras cuando éstas eran sembradas en agar Luria. Un análisis realizado después de los dos tratamientos de calor (15 minutos a 70ºC cada 24 horas), aplicado a diversas diluciones de los inóculos correspondientes a las muestras estudiadas, demostraron que el tratamiento térmico era suficiente para hacer disminuir e, incluso, hacer desaparecer completamente la contaminación (Tabla 2). Tabla 2: Recuento de ufc en cada uno de los inóculos correspondientes a cada una de las muestras, a diferentes concentraciones probadas, antes y después del tratamiento térmico. Concentración 10% Concentración 1.0% Concentración 0.1% Concentración 0.01% Muestra Antes trat. Después trat. Antes trat. Después trat. Antes trat. Después trat. Antes trat. Después trat. 439 >1000 3 >1000 0 >1000 0 >1000 - 440 >1000 0 >1000 0 >1000 0 >100 - 441 >1000 1 >1000 0 >1000 0 >1000 - 442 >1000 0 >1000 0 >1000 0 >100 - 447 >1000 0 >1000 0 >1000 0 >100 - 65 Resultados 3.1.2. Toxicidad Los homogeneizados procedentes de todas las muestras objeto de este estudio presentaban también una alta toxicidad que resultaba inapropiada para el éxito de la inoculación experimental. Esta alta toxicidad era demostrada porque, tras una inoculación realizada en las mismas condiciones que la inoculación definitiva, un elevado número de animales moría entre las primeras 24 horas hasta los diez días post-inoculación. Este factor se intentó minimizar con el doble tratamiento de calor descrito para reducir la contaminación microbiana, pero la mejoría fue insuficiente porque sólo se incrementó 10 días la media de supervivencia de los animales (Tabla 3). Debido a que el tratamiento térmico en este caso no tuvo el efecto deseado y la toxicidad no se eliminaba completamente, se tuvo que asumir la presencia de endotoxinas bacterianas en cada uno de los inóculos que iban a ser utilizados para la infección experimental. De hecho, se demostró, mediante las diferentes pruebas llevadas a cabo, que la única variable que parecía disminuir la toxicidad en los inóculos en todos los casos era una menor concentración del mismo. Al mismo tiempo, el efecto citopático que estos homogeneizados producían en cultivos monocapa de células Vero se mostró también elevado (citotoxicidad). De la misma manera que antes, con sucesivas diluciones del inóculo, concretamente a partir de una concentración de 10-3, la citotoxicidad se lograba reducir ostensiblemente (Tabla 3). 66 Resultados Tabla 3: Efecto citopático demostrado sobre las células Vero en función de si habían recibido tratamiento térmico o no y en función de la concentración del inóculo. Concentración 10% Concentración 10-1 Concentración 10-2 Concentración 10-3 Muestra Antes trat. Después trat. Antes trat. Después trat. Antes trat. Después trat. Antes trat. Después trat. 439 - - - - - - + + 440 - - - - - - + + 441 - - - - - - + + 442 - - - - - - + + 447 - - - - - - + + “-” = células no intactas (tóxico) y “+” = células intactas (dilución no tóxica del homogeneizado del encéfalo para las células) Como el tratamiento térmico no era suficiente para reducir la toxicidad, se optó por aumentar adicionalmente la dilución de las muestras en los inóculos con el fin de disminuir los valores de esta variable y así aumentar las probabilidades de éxito en la inoculación. La variabilidad en la dilución final de cada inóculo vino determinada por el efecto que causaba cada concentración en la supervivencia de un número reducido de animales inoculados, buscando la menor dilución posible que pudiera asegurar el éxito en el desarrollo de la infección experimental. En estos estudios, también se realizó un segundo tratamiento de calor para asegurar la supervivencia de los animales mediante la eliminación de la contaminación microbiana. Por tanto, los resultados conjuntos, obtenidos a partir de los estudios de contaminación microbiana y toxicidad, fueron los que determinaron la concentración elegida en cada una de las muestras para la inoculación final. La dilución final en cada una resultó ser de: 1,25% para la muestra 439, 5% para la 440, 441, y 442 y 4% para la 447 (Tabla 4). 67 Resultados Tabla 4: Efecto de cada dilución del inóculo testada para cada una de las muestras sobre la mortalidad en 48 horas y supervivencia tras 10 días en ratones inoculados para los estudios preliminares realizados. Muestra Concentración Número de ratones inoculados Número de ratones muertos en 48 horas Número de ratones vivos tras 10 días 10% 5 5 0 5.0%* 5 5 0 2.5%* 7 5 2 1.25%* 10 0 8 1.25%* 15 1 14 439 1.25%* 12 0 12 10% 6 2 4 5.0%* 19 3 11 440 5.0%* 20 2 18 10%* 7 4 3 5.0% 25 6 17 441 5.0%* 9 2 7 10% 7 7 0 10%* 10 4 6 5.0% 10 2 8 442 5.0%* 11 0 11 10% 7 7 0 10%* 7 5 2 5.0% 7 2 0 4.0% 9 2 7 447 4.0%* 21 0 19 * = muestra sometida a un segundo tratamiento de calor 3.2. Inoculación experimental A pesar de todas las pruebas previas realizadas para optimizar la concentración del inóculo, el número de animales que sobrevivieron a los primeros diez días post-inoculación se redujo considerablemente en todos los casos. Por esta razón, el número de animales que finalmente fueron analizados para cada muestra resultó diferente dependiendo de las bajas aparecidas en cada 68 Resultados Tabla 8: Listado de animales que presentaron inmunomarcaje de PrPsc mediante el análisis inmunohistoquímico con 2 ó 3 anticuerpos y, por lo tanto, fueron considerados positivos. Nº muestra Nº ratón 6H4 R145 F89 2 X X X 5 X X X 7 X X 8 X X 12 X X 17 X X 18 X X 22 X X 28 X X 30 X X X 439 36 X X X 3 X X X 10 X X X 440 13 X X 2 X X 19 X X X 21 X X X 22 X X 441 23 X X X 6 X X X 8 X X X 13 X X 15 X X X 21 X X X 442 23 X X X 1 X X X 3 X X X 16 X X X 21 X X 447 23 X X X Ante la escasa inmunotinción observada en todos estos animales y con el fin de poder amplificar la señal, como se ha indicado en la sección de Material y Métodos, se llevó a cabo una variación del protocolo inmunohistoquímico orientada a ampliar la sensibilidad de la técnica con la adición del paso del linker. Esta incubación añadida, a pesar de ofrecer teóricamente una mayor sensibilidad, no aportó mayor información relativa a la presencia de PrPsc, siendo los resultados similares a los encontrados con la inmunohistoquímica convencional (Fig. 13). 75 Resultados B A Fig. 13: Imagen comparativa de una muestra perteneciente al animal positivo en el test de Roboscreen mediante la aplicación del protocolo de la IHQ convencional (A; 100x) y con la adición del linker (B; 100x). Con el mismo objetivo de aumentar la sensibilidad, se incorporó una modificación en relación con los protocolos anteriores consistente en la aplicación de la inmunohistoquímica ultrasensible. Con esta técnica tampoco se pudieron detectar más animales positivos de los ya descritos, pues no se logró un aumento de la señal de PrPsc en ninguno de ellos (Fig. 14). A B Fig. 14: Imagen comparativa de una muestra perteneciente al animal positivo en el test de Roboscreen mediante la aplicación de la IHQ convencional (A; 100x) y la IHQ ultrasensible (B; 100x). Respecto a la distribución de la PrPsc en los animales que finalmente fueron considerados como positivos, no pareció que hubiera un área encefálica más afectada. En todas las secciones se llegó a encontrar depósito y, aunque parecía que la sección central correspondiente al área del tálamo podría estar menos afectada, la diferencia no fue muy acusada. Comparando todos los animales que habían presentado depósito de PrPsc, no se pudo establecer una correspondencia entre las secciones afectadas en cada uno de ellos, distribuyéndose los depósitos de manera heterogénea (Tabla 9). 76 Resultados Tabla 9: Comparativa de los animales que presentaron inmunomarcaje de PrPsc en relación con las secciones analizadas en el análisis inmunohistoquímico con cada uno de los 3 anticuerpos. 6H4 R145 F89 Nº sección Nº sección Nº sección Nº muestra inoculada Nº ratón 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 2 x x x x x x 5 x x x x x x x x x x 7 x x x x x 8 x x x x x x x x x x 12 x x x x 17 x x x x x x x x x x 18 x x x 19 x x x x 21 x x x 22 x x x x x 23 x x x x No muestra 26 x x x x 28 x x x x x x 30 x x x x x x x 34 x x x x 439 36 x x x x x x Nº sección Nº sección Nº sección 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 2 x x x x x 3 x x x x x x x x x x x x x x x 6 x x x x x x 10 x x x x x x 440 13 x x Nº sección Nº sección Nº sección 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 2 x x x x x x x x x 18 x x x x x x x 19 x x x x x x x x x x x x 21 x x x x x x x x 22 x x x x x x x 441 23 x x x x x x x x x Nº sección Nº sección Nº sección 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 6 x x x x x x x x 8 x x x x 13 x x x x x x x x 14 x x x x 15 x x x x x x x x x x x x 16 x x x 20 x x x x x x x x 21 x x x x x x x 23 x x x x x x x x x x x 442 24 x x x x x No muestra Nº sección Nº sección Nº sección 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 x x x x x x x x x x 3 x x x x x x x x x x x x 16 x x x x x 21 x x x x x x x 447 23 x x x x 77 Resultados Respecto a los patrones de depósito observados, como ya se ha especificado, el patrón en placa sólo fue encontrado en uno de los ratones inoculados, coincidiendo con el único animal que había proporcionado un resultado positivo con la técnica rápida de Roboscreen (Fig. 15A). En cuanto al resto de animales que fueron finalmente considerados como positivos por inmunohistoquímica, el depósito presentaba una apariencia granular en todos los casos de forma heterogénea por toda la sección de la muestra que no llegaba a agregarse en placas en ninguna de las muestras analizadas (Fig. 15B). En algunos animales también se encontró un depósito difuso (Fig. 15C), similar al descrito en otros estudios como el de Capobianco et al. (2007; Fig. 15D). A B D C Fig. 15: Inmunomarcaje de PrPsc en placa (A; 100x), en patrón granular (B; 200x) y en patrón difuso (C; 100x) evidenciado por IHQ respecto al patrón difuso observado en el estudio de Capobianco et al. (2007; D: 100x). Respecto a la localización de la PrPsc, se observó que era heterogénea pero había que destacar una de ellas que, en muchos casos, parecía asociarse a una población celular específica, probablemente de naturaleza glial (Fig. 16). 78 Resultados A B D C Fig. 16: Localización del inmunomarcaje de PrPsc evidenciado en muchos casos, que parece sugerir una relación con células gliales mediante la inmunohistoquímica convencional (A y B: 50x; C: 200x; D: 400x). Este depósito de la PrPsc permanecía siempre constante con independencia del anticuerpo testado, coincidiendo tanto en el patrón de depósito como en su localización (Fig. 17). A C B Fig. 17: Imagen comparativa del inmunomarcaje de PrPsc que parece sugerir una posible relación con las células de la glía, en un mismo animal inoculado con la muestra 441, mediante la técnica inmunohistoquímica con los 3 anticuerpos testados: 6H4 (A), R145 (B) y F89 (C; 200x). Con el fin de identificar cuáles eran las células asociadas a estos depósitos que podrían estar implicadas en el transporte de la PrPsc hacia el tejido nervioso, se utilizó la técnica de microscopía confocal. El objetivo era confirmar, mediante 79 Resultados estudios de co-localización, que estas células se correspondían con células de la glía y que contenían depósitos de PrPsc mediante estudios de co-localización. Y en efecto, con esta técnica microscópica, la relación quedó demostrada, al observarse depósitos de PrPsc que co-localizaban con células gliales en las mismas zonas (Fig. 18). Fig. 18: Co-localización de los depósitos de PrPsc en relación con las células de la glía mediante la microscopía confocal. En rojo la proteína PrPsc, en verde las células de la glía y en amarillo la co-localización (100x). Al igual que en las muestras autolíticas bovinas, en las secciones del encéfalo del ratón positivo a la técnica rápida y en algunos de los que habían sido clasificados como positivos mediante la immunohistoquímica, se realizó la técnica de microscopía electrónica con el objetivo de visualizar las fibrillas SAF. Los resultados obtenidos con esta técnica confirmaron el diagnóstico positivo de los ratones inoculados al encontrar fibrillas en estas muestras, no sólo en el animal positivo con el test de Roboscreen, sino también en los animales que, a pesar de haber resultado negativos por la técnica rápida, habían sido clasificados como positivos finalmente por IHQ. Este hallazgo confirmaba el diagnóstico realizado con la inmunohistoquímica convencional y corroboraba la transmisión de la enfermedad a los ratones y la consiguiente positividad de las muestras inoculadas, así como el fallo de las técnicas rápidas para detectar positividad en ciertos casos. El tamaño de las fibrillas encontradas se correspondía con el de las descritas en las muestras bovinas, con una longitud algo menor que las anteriormente encontradas (Fig. 19). 80 Resultados B A Fig. 19: Imagen de fibrillas SAF evidenciadas en muestras procedentes de ratones inoculados con las muestras bovinas del estudio mediante la técnica de detección de fibrillas SAF por microscopía electrónica (A: 100.000x; B: 150.000x). Aunque estas fibrillas observadas en las imágenes coincidían en morfología y tamaño con lo descrito en estudios anteriores de microscopía electrónica, en el caso del ratón positivo, además de encontrar fibrillas aisladas como las ilustradas en la Fig. 19, aparecieron también grandes acúmulos de ellas, en relación con una mayor cantidad de PrPsc presente en la muestra (Fig. 20). B A Fig. 20: Imagen de fibrillas SAF en el ratón positivo por el test de Roboscreen mediante la técnica de detección de fibrillas SAF por microscopía electrónica (A: 100.000x), semejantes a las visualizadas en el estudio de Liberski et al. (1991; B: 100.000x). Al igual que lo realizado en las muestras bovinas, para confirmar que estas fibrillas se correspondían con presencia de PrPsc, se recurrió a la IHQ con oro coloidal. En esta técnica, las partículas de oro se unen a la PrPsc presente en las fibrillas (Fig. 21), lo que corroboraba que estas fibrillas estaban asociadas a la EEB y, por consiguiente, que el diagnóstico de estos animales era positivo. 81 Resultados B A Fig. 21: Imagen de fibrilla SAF evidenciada en una muestra procedente de un ratón inoculado con una de las muestras bovinas del estudio mediante la técnica de microscopía electrónica con oro coloidal a 250.000x (A); en comparación con las visualizadas en el estudio de Merz et al. (1987; B: 143.000x). Por último, resulta relevante mencionar que, tras realizar todas las técnicas de confirmación aplicadas sobre los encéfalos extraídos de los ratones inoculados inicialmente, se procedió a una segunda inoculación con tejido procedente del encéfalo del animal positivo. El modelo murino utilizado fue el mismo que en la inoculación inicial. Tras dos años de incubación, este segundo pase resultó positivo para la muestra procedente del animal diagnosticado como positivo en la inoculación inicial, confirmándose de nuevo la presencia de la enfermedad de la EEB en la muestra correspondiente. Finalmente, recopilando todos los datos obtenidos a partir de la IHQ aplicada sobre las muestras del bioensayo, se trató de establecer una relación entre los animales que habían presentado síntomas durante el periodo de incubación y los resultados obtenidos con esta técnica de confirmación (Tabla 10). 82 Resultados Tabla 10.1: Relación de animales inoculados con la muestra 439 en función de la presencia de síntomas clínicos y los resultados obtenidos en la IHQ. Identificación de la muestra Mes de la muerte del animal con síntomas IHQ 439/2 23 + 439/5 18 (otras causas) + 439/7 21 (otras causas) + 439/8 24 + 439/12 15 (hallado muerto) + 439/16 22 - 439/17 22 + 439/18 24 (sacrificado) + 439/19 13 (otras causas) + 439/21 16 (apatía) + 439/22 21 (otras causas) + 439/23 24 (sacrificado) + 439/26 24 (sacrificado) + 439/28 24 (sacrificado) + 439/29 24 - 439/30 24 + 439/31 15 - 439/34 24 (sacrificado) + 439/36 24 + 83 Resultados Tabla 10.2: Relación de animales inoculados con la muestra 440 en función de la presencia de síntomas clínicos y los resultados obtenidos en la IHQ. Identificación de la muestra Mes de la muerte del animal con síntomas IHQ 440/2 18 (otras causas) + 440/3 17 + 440/5 19 - 440/6 19 + 440/10 18 (otras causas) + 440/13 22 (hallado muerto) + 440/16 13 - 440/26 21 - 440/31 17 - 440/33 19 - Tabla 10.3: Relación de animales inoculados con la muestra 441 en función de la presencia de síntomas clínicos y los resultados obtenidos en la IHQ. Identificación de la muestra Mes de la muerte del animal con síntomas IHQ 441/1 2 - 441/2 15 (otras causas) + 441/6 19 - 441/10 15 - 441/17 24 - 441/18 24 (sacrificado) + 441/19 24 (sacrificado) + 441/21 24 (sacrificado) + 441/22 16 (hallado muerto) + 441/23 16 (otras causas) + 441/24 18 - 84 Discusión asociar más a la inviabilidad para elegir el área de tejido a analizar (por el alto grado de autolisis que impide diferenciar las partes de la muestra) más que al estado autolítico en sí mismo. Este hecho está relacionado con lo que ya se había demostrado respecto a la diferente distribución y concentración de la PrPsc en el sistema nervioso bovino, lo que había señalado al obex como la zona de elección para el diagnóstico frente a otras áreas menos afectadas, que podían ser las causantes de esos falsos negativos obtenidos en muestras autolíticas (Schaller et al., 1999). Si a la imposibilidad de elección de la zona del tejido a analizar se une la supuesta baja concentración de PrPsc en las muestras analizadas, se podrían entender los resultados no concluyentes obtenidos con las técnicas rápidas, como ya habían sido descritos en estudios anteriores (Bolea et al., 2005). Sin embargo, a pesar de no ofrecer un resultado definitivo, la aplicación de las técnicas rápidas resulta de gran utilidad como método de screening al revelar posibles muestras positivas que tienen que ser confirmadas posteriormente, por lo que desempeñan un papel decisivo para la detección de casos de EEB (Polak et al., 2003). Una de las principales conclusiones que se extrae a partir de este estudio es la posibilidad de confirmación de la fiabilidad de la técnica inmunocitoquímica desarrollada en Monleón et al. (2003). El hecho de que, en todos los casos, los depósitos de PrPsc sean detectados con 4 diferentes anticuerpos ya utilizados en estudios anteriores, 6H4 (Salguero et al., 2006), R145 (Arnold et al., 2007; Manning et al., 2008), F89 (Koo et al., 2001) y L42 (Salguero et al., 2006), junto con la ausencia de señal en todos los controles negativos, permite descartar la posibilidad de que la señal se deba a inespecificidades. Pero, la especial relevancia de la positividad mediante la técnica demostrada en este estudio, confirmada posteriormente con otras técnicas de confirmación (microscopía electrónica y bioensayo en ratón), se basa en que se demuestra la eficacia de la inmunocitoquímica para muestras autolíticas de modelos naturales de infección. Dicha técnica había sido estandarizada (Monleón et al., 2003), pero no había sido corroborada con otras técnicas de confirmación. Al igual que lo que sucede en los tests rápidos, la heterogénea distribución de la PrPsc en el tejido, además de la 89 Discusión imposibilidad de elegir la zona de estudio, también puede provocar en algunos casos falsos negativos que deriven de un fallo en la toma de muestras, pero no de la técnica. Aun así, la alta sensibilidad de la inmunocitoquímica queda demostrada al obtener resultados positivos en todas las muestras analizadas, a pesar de la baja concentración de PrPsc de la que se parece partir y de la autolisis, que dificulta la toma del área correcta, pero pone en evidencia una vez más la gran resistencia que posee la PrPsc frente a la degradación (Taylor, 2000). Al demostrar esta alta sensibilidad, mayor incluso que la que presentan otras técnicas (Arnold et al., 2007), se confirma la inmunocitoquímica como una herramienta muy útil en el diagnóstico de la enfermedad en situaciones extremas, como son el estado de autolisis tan avanzado que presentaban las muestras estudiadas en este trabajo. Al mismo tiempo, no sólo se demuestra que el resultado de la técnica no está afectado por la autolisis, sino que también es capaz de detectar concentraciones extremadamente bajas de PrPsc (Bolea et al., 2005), como las que se supone en las muestras valoradas en este trabajo. Respecto al Western blot de confirmación establecido por la OIE, otra de las técnicas aplicadas sobre las muestras de estudio, no logra confirmar el diagnóstico positivo de las mismas. Ninguno de los protocolos probados de concentración y purificación de la muestra realizados previamente al protocolo de Western blot han servido, pues sólo se consigue obtener una ligera señal de positividad, pero no lo suficientemente evidente como para confirmar la enfermedad y, aún menos, su patrón característico. Como en el caso de las técnicas rápidas, la señal no concluyente que se obtiene con estas técnicas puede deberse a varias causas. En principio, la autolisis no debería ser la causa responsable, pues en estudios anteriores, con autolisis inducidas, se habían encontrado señales asociadas claramente a positividad (Katz et al., 1992; Chaplin et al., 2002; Hayashi et al., 2004), incluso tras someter las muestras durante 10 días a 65ºC (Race et al., 1994). Si la autolisis no parece afectar a la detección de la PrPsc por la técnica, este resultado no definitivo parece señalar a la supuesta baja concentración de PrPsc de las muestras como única causa de su débil positividad 90 Discusión (Debeer et al., 2002; Iwata et al., 2006). Lo que parece evidente es que la falta de un patrón glicosilado más claro puede ser justificado por esta baja concentración proteica, ya que unas bandas no convencionales ya habían sido relacionadas con dicha problemática (Gray et al., 2011). Si comparamos la sensibilidad encontrada en este trabajo con la técnica de Western blot utilizando las muestras analizadas en relación con el resto de técnicas de confirmación, se observa que ésta es claramente menor porque sólo proporciona indicios de positividad, pero no logra confirmar el diagnóstico. Este resultado no es el que habían descrito otros autores (Buschmann et al., 2004; Iwata et al., 2006) que justificaban el uso de la técnica de Western blot debido a su mayor sensibilidad. Incluso respecto a la histología, técnica de confirmación más utilizada en los comienzos del estudio de la enfermedad, se afirmaba que la técnica de Western blot tenía una mayor sensibilidad al detectar PrPsc en animales sospechosos clínicamente de EEB, sin que éstos presentaran cambio espongiforme (Cooley et al., 2001). Seguramente, esto se debía a la falta de relación de la presencia de PrPsc con los signos neuropatológicos y la infectividad en algunos casos. Lo que sí se había descrito eran resultados negativos con la técnica de Western blot en ratones inoculados con bajas dosis de PrPsc que sufrían una enfermedad subclínica crónica, sin llegar a enfermedad terminal, y que presentaban una alta infectividad y presencia de PrPsc (Thackray et al., 2002). Por lo tanto, aunque ha sido descrita una gran eficacia de la técnica de Western blot, incluso en estudios recientes (Gray et al., 2011), en este trabajo se demuestra la necesidad, en este tipo de muestras, de aplicarla junto a otras técnicas diagnósticas. Un resultado similar se obtiene mediante el Western blot de diferenciación, en el que no es posible evidenciar el patrón de glicosilación correspondiente al agente causal en dichas muestras por la señal tan leve obtenida. 91 Discusión Otra de las técnicas de confirmación probadas es la microscopía electrónica. Esta técnica fue una de las que más se utilizaron en un principio como técnica de diagnóstico cuando se empezó a estudiar la enfermedad, aunque actualmente no sea una de las de elección, probablemente, por la dificultad en el acceso al equipamiento necesario para realizar todo el proceso y a la falta de experiencia en las técnicas de microscopía electrónica. Una de las ventajas que ofrece esta técnica es la alta sensibilidad y, especialmente, alta especificidad, basada en que la presencia de fibrillas SAF evidencia, sin ningún tipo de duda, la positividad de la muestra, ya que no se encuentran nunca en animales sanos (Bode et al., 1985). En este estudio, la sensibilidad de esta técnica queda definitivamente confirmada pues se demuestra, claramente, la positividad de todas las muestras al detectarse fibrillas en cada una de ellas. Además, se elimina la subjetividad en la valoración del diagnóstico, que podía llegar a ponerse en duda en relación con los resultados de la inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica aplicada en el bioensayo. De nuevo, se corrobora la importancia de esta técnica que, a pesar de estar cada vez más en desuso como técnica en el diagnóstico de las EET, ha demostrado ser una de las más sensibles y de las que más información aporta. En este trabajo se pone de manifiesto el papel tan decisivo que puede tener la técnica de microscopía electrónica en el diagnóstico de la EEB, no sólo por su alta sensibilidad y especificidad, sino por todas las posibilidades que puede ofrecer, permitiendo, al ampliar el desarrollo de esta técnica, observar a nivel ultraestructural características que sólo pueden ser apreciadas por el microscopio electrónico y pudiendo incluso llegar a aportar conocimientos sobre la caracterización del agente causal de la EEB (Jeffrey et al., 2010). A pesar de la alta sensibilidad de esta técnica corroborada en éste y otros trabajos, algunos autores discrepan al hallar una baja correspondencia de los resultados del diagnóstico obtenidos con esta técnica respecto al Western blot (Scott et al., 1990). Al contrario que en este trabajo en el que la técnica de Western blot no permite obtener un diagnóstico confirmativo como el demostrado por la 92 Discusión microscopía electrónica, algunos estudios han obtenido un mayor porcentaje de resultados positivos por WB que por microscopía electrónica (Cooley et al., 1998), lo que les hacía considerar a la primera como más sensible que la segunda. Esta menor sensibilidad de la técnica de microscopía electrónica observada en algunos casos, con la consiguiente falta de detección de muestras positivas, se había considerado que podía depender de la zona del encéfalo analizada (Scott et al., 1990). Según esta hipótesis, el no poder escoger la zona a analizar en cada caso, al igual que en las otras técnicas descritas, puede disminuir la posibilidad de obtener un diagnóstico correcto, situación probable especialmente en muestras autolíticas. Por esta razón, se reafirma de nuevo la importancia de una toma de muestras adecuada (Wells et al., 1994b). Aunque desde el principio se había descrito la buena relación que existía entre la técnica de la detección de SAF con la presencia del agente de la EEB en el hospedador natural (Hope et al., 1988; Scott et al., 1990; Wells et al., 1994b), también se había visto que, a veces, era difícil encontrar estas fibrillas o, si aparecían, era de una forma mucho menos frecuente que en animales de experimentación (Dawson et al., 1987). A pesar de la dificultad añadida de la supuesta baja concentración de PrPsc en las muestras a analizar, en este caso, se demuestra que el protocolo previo de concentración y purificación de la muestra es adecuado para aumentar la posibilidad de hallar las fibrillas que confirman el diagnóstico. Respecto a la forma de presentación de las fibrillas, ésta es similar a la descrita en otros trabajos publicados. Las fibrillas que aparecen suelen presentarse aisladas y en forma de filamentos, como ya había sido referido por Multhaup et al. (1985). Aunque el número de fibrillas parece ser menor que el encontrado en casos convencionales de EEB, este hecho se podría correlacionar con la baja concentración de PrPsc de partida. En cuanto al tamaño de estas fibrillas, la diversidad de protocolos utilizados en los diferentes laboratorios podría ser la causa de que éste varíe un poco según los diferentes estudios. En comparación con trabajos ya realizados, el tamaño de las fibrillas observadas en este trabajo es ligeramente menor, tanto en longitud como en diámetro (Kascsak 93 Discusión et al., 1986). En concreto, es inferior a lo descrito en el estudio de Narang y Perry (1990), en el que las fibrillas presentan una longitud aproximada de 1μm y un diámetro de 50 nm en las no tratadas con SDS y de 16-20 nm en las tratadas con SDS. La mayor acción de las proteasas atribuible al propio proceso de autolisis, justificaría cierta diferencia en las dimensiones encontradas. Aunque no existe un acuerdo sobre las medidas exactas de estas fibrillas, lo que sí parece es que las medidas observadas en este estudio son constantes y coinciden con el rango proporcionado por Somerville (1985) en cuanto al diámetro de las fibrillas. Según el tamaño, y teniendo en cuenta las variaciones citadas entre los diferentes trabajos publicados, parece que estas fibrillas de las muestras analizadas se pueden corresponder con las de tipo 1, ya que las medidas están dentro del rango especificado por Merz et al., 1981 y Stack et al., 1995 para este tipo de fibrillas, con un diámetro de 12 a 16 nm y una longitud que varía de 100 a 500 nm hasta 1 μm. Aunque, en principio, se descarta la relación con las fibrillas tipo 2, por su diámetro mayor (27-34 nm), no puede serlo por completo ya que Merz et al. (1981) encontró fibrillas de este tipo con un diámetro más pequeño (9-12 nm), similar al observado en este caso. A pesar de que se acepta que las fibrillas SAF están formadas por PrPsc (Jeffrey y Halliday, 1994), una de las formas de verificar que las fibrillas observadas en las muestras de este estudio son específicas de la enfermedad, es la inmunohistoquímica con oro coloidal (Liberski et al., 1997). Esta técnica, basada en la utilización de anticuerpos específicos para la proteína prión, tanto frente al extremo amino-terminal como al carboxi-terminal (Jeffrey et al., 1996), evidencia fibrillas amiloides y ha sido usada en el estudio de las EET animales y humanas (DeArmond et al., 1985; Doerr-Schott et al., 1990; Jeffrey et al., 1994). Las fibrillas encontradas en las muestras del estudio se revelan como fibrillas SAF, al unirse a ellas las partículas de oro que reconocen los anticuerpos específicos frente a la PrPsc. Las partículas de oro asociadas a las fibrillas SAF encontradas en este trabajo son escasas en comparación con otros estudios (Merz et al., 1987). De nuevo, se considera que es debido al efecto de las proteasas, que podría haber 94 Discusión alterado los epítopos que reconocen los anticuerpos. Respecto a la localización de las partículas de oro, es similar a la observada en estudios anteriores, concretamente a lo largo y alrededor de las fibrillas (Di Fede et al., 2007), con preferencia en el final de las mismas (Merz et al., 1987). Gracias a esta técnica de IHQ con oro coloidal, ha sido posible también detectar con bastante frecuencia unos depósitos de oro pareados. Las imágenes son similares a las halladas por Dourmashkin et al. (2004), que relacionaba esta localización característica de las partículas de oro con un dímero de PrPsc cubierto por una capa de lipoproteína sin una membrana delimitante. Según lo descrito en ese estudio, esas partículas sólo habían sido encontradas en ratones positivos, y no en los controles, por lo que su presencia confirmaría el diagnóstico de la enfermedad. Ersdal et al. (2003) sugirió que se trataba de áreas de formación potencial de fibrillas. En el estudio presentado, la presencia de este tipo de partículas pareadas también es menor, de nuevo en consonancia con la menor cantidad de PrPsc encontrada en las muestras demostrada en todas las técnicas realizadas. En relación con la técnica de bioensayo en ratón, se acepta que es la que posee mayor sensibilidad. La sola transmisión de la enfermedad al modelo murino es sinónimo de la positividad de la muestra, pudiéndose considerar el diagnóstico como definitivo. La transmisión de la enfermedad a los ratones inoculados en el presente estudio se ha llevado a cabo en todos los grupos correspondientes a cada uno de los inóculos, por lo que esta técnica corrobora el diagnóstico positivo de las muestras bovinas ya demostrado con la técnica de microscopía electrónica y la inmunocitoquímica. Aun así, a pesar de confirmarse el diagnóstico, al producirse la transmisión sólo en un reducido número de animales respecto al inicial de ratones inoculados, la sensibilidad de la misma, tan aceptada hasta este momento, se replantea para muestras de características similares a las usadas en este trabajo. Esta ineficiencia del bioensayo en ratón, aunque fuera en casos puntuales, ya se había descrito en otros estudios como el de Ozawa (2007), en 95 Discusión Japón, en el que algunas muestras positivas no lograban transmitir la enfermedad a los ratones, incluso en un periodo superior a dos años. El fallo en la sensibilidad de esta técnica para las muestras incluidas en este estudio queda demostrada porque la transmisión se produce, pero no de una forma tan clara como sería de esperar en ratones especialmente sensibles a la EEB como son los Tgbov XV (Scott et al., 1999), capaces de ser afectados incluso con bajas concentraciones de PrPsc (Buschmann y Groschup, 2005). A pesar de usar el modelo correcto, las sucesivas diluciones y tratamientos térmicos previos realizados en los inóculos para garantizar el éxito de la inoculación, parecen haber sido la causa de una disminución aún mayor de la concentración de la proteína que, de partida, se pensaba ya escasa. De nuevo, se confirma esta hipótesis sobre la bajísima concentración de PrPsc en las muestras como la causante del fallo de las técnicas probadas inicialmente. Además, el hecho de que el único animal claramente positivo se corresponda con el inóculo del animal 440, que casualmente tiene una concentración mayor que el resto de los inoculados, apoyaría esta hipótesis. Por lo tanto, esta baja concentración de PrPsc inicial en los inóculos procedentes de las muestras bovinas parece haber sido la responsable de la baja transmisión de la enfermedad en el bioensayo. Aun así, gracias al refinamiento y adaptación de los protocolos aplicados, ha sido posible detectar muchos animales en cada uno de los grupos con signos compatibles con la positividad, tales como síntomas durante la incubación y depósitos de PrPsc en el análisis inmunohistoquímico. En principio, la baja concentración de PrPsc también podría ser la causa principal de la ampliación del periodo de incubación observado en relación con el tiempo descrito en otros estudios, tanto en el animal positivo como en el resto de animales que presentan síntomas compatibles con la enfermedad. En este trabajo, la media del periodo de incubación en los animales hasta la presentación de síntomas, coincide con el baremo establecido por Fraser et al. (1992), que hallaba en el 100% de los ratones inoculados con EEB un intervalo de 265 a 700 días. Aun 96 Discusión así, la mayoría de los estudios manejan datos bien diferentes y normalmente inferiores, desde alrededor de 148,4 días (Dell’Omo et al., 2002) hasta 230 días (Castilla et al., 2003) ó 287 (Tortosa et al., 2008) en ratones transgénicos bovinizados. A pesar de esta coincidencia de datos de la mayoría de los estudios, otros señalan un retraso en la aparición de los síntomas, similar a lo observado en este trabajo, como el caso de Bautista et al. (2006), en el que sólo el 20% de los ratones bovinizados afectados con EEB presentaban síntomas específicos a los 302 días post-inoculación. Lo mismo ocurría con el momento de la muerte del animal que, utilizando los mismos tipos de ratones transgénicos bovinizados, estaba descrito desde los 250 días aproximadamente (Baron, 2002b; Scott et al., 1999) hasta 303-313 días (Espinosa et al., 2007). En el presente trabajo, este periodo está más próximo a los 368-719 días de incubación que presentaban los ratones C57BL/6 inoculados con encéfalo de bovino afectado con EEB en el estudio de Lasmézas et al. (1997), aunque, al tratarse de ratones menos sensibles que los transgénicos bovinizados usados en los demás estudios, los datos no sean comparables. La conclusión a la que se llega es que el periodo de incubación presentado por los ratones inoculados en este trabajo es bastante mayor que el descrito en otros estudios, incluido en el animal positivo, por lo que se plantea la posibilidad de que algunos de los animales sacrificados a los 24 meses no tuvieran el tiempo necesario para desarrollar síntomas. Este tiempo se estableció porque a partir de entonces comenzaban a observarse síntomas neurológicos asociados a la edad, pero, a pesar de que parecía ser el adecuado para el desarrollo de la enfermedad según lo visto en otros ratones inoculados con EEB, este tiempo pudo haber sido demasiado corto debido a la baja concentración, lo que podría haber hecho perder un número de animales que hubieran desarrollado la enfermedad o muerto a causa de ella en periodos posteriores. A pesar de que la concentración de PrPsc parece ser la causa más probable que explicaría esta alteración en el periodo de incubación, otra posibilidad que hay que valorar, como se ha planteado al principio del estudio, es que un nuevo agente causal pudiera haber sido el responsable de la enfermedad en los animales de los que procedían las muestras estudiadas. Esta idea se basaría en el 97 Discusión conocimiento de que el periodo de incubación de la enfermedad depende del genotipo PRNP del ratón (Moore et al., 1998), pero también del agente causal (Bruce et al., 1991). De todas formas, esta hipótesis se plantea de manera teórica, ya que al no poderse realizar experimentos para la caracterización del agente, no puede ser demostrada. Por lo tanto, parece que la menor carga infectiva de las muestras bovinas estudiadas, agravada por la necesaria dilución de los inóculos, que ha provocado la baja y lenta transmisión de la enfermedad, ha originado también los problemas y la diversidad de resultados en las técnicas aplicadas posteriormente en los encéfalos murinos. Sería lógico pensar que partiendo de una escasa concentración de PrPsc es esperable que la transmisión de la enfermedad a los ratones también se haya caracterizado por una escasa presencia de PrPsc. Teniendo en cuenta los resultados observados tras la aplicación de la técnica inmunohistoquímica a las secciones de los encéfalos murinos, permitiendo detectar depósitos de PrPsc con los 3 anticuerpos utilizados, un alto número de animales demuestra de nuevo la relevancia de esta técnica. La dificultad para detectar señal con ella podría atribuirse al tratamiento previo de los encéfalos con ácido fórmico, que podía disminuir la intensidad de la señal (Brown et al., 2003). Sin embargo, este paso aumenta la accesibilidad a los epítopos y su eliminación no influye en gran medida en el resultado de la técnica (Hardt et al., 2000). Dado que la técnica inmunohistoquímica aplicada está estandarizada desde hace mucho tiempo, sorprende que no todos los ratones bovinizados (o una gran mayoría) presenten depósito de PrPsc tras la inoculación, lo que era de esperar según estudios similares en los que se encontraba PrPsc en el 100% de los animales tras 300 días post-inoculación (Bautista et al., 2006). Partiendo de la base de que los depósitos de PrPsc aparecen antes de los signos clínicos (Arnold et al., 2007) y que los animales del presente estudio han tenido un tiempo de incubación casi el doble que el de los ratones del estudio de Bautista et al. (2006), se debe pensar de nuevo que la concentración de proteína PrPsc presente en el 98 Discusión presentarse sin manifestaciones clínicas (Frigg et al., 1999), asociadas en tal caso a la falta de células B y cursando la enfermedad como subclínica. Un estado latente de la enfermedad o infección subclínica ya había sido propuesto por Collins et al. (2004) y demostrado en diversos estudios realizados en ratones (Race et al., 2001; Asante et al., 2002; Thackray et al., 2002) en los que se encontraban animales asintomáticos a pesar de tener altos títulos de infección, incluso similares a los de los enfermos terminales, en encéfalo y otros tejidos (Hill et al., 2000). Se había planteado que la causa de este comportamiento podía relacionarse con una posible infección cruzada, como la descrita en Race et al. (2002) entre ratones y hámsters, o con una adaptación de la infección a nuevas especies. Al considerar ambas opciones en el presente trabajo en concreto, la posibilidad planteada en un principio sobre la existencia de una nueva cepa que fuera la causa del diferente comportamiento de las muestras, podría ser sustituida por la sospecha de la posible adaptación de alguna de las ya existentes. De cualquier forma, el problema que se plantea es que, si se demuestra que la infectividad subclínica está presente en gran medida en la naturaleza, podrían estar pasando desapercibidos algunos casos, con todo lo que acarrearía este hipotético hecho para la salud pública. Al no presentar síntomas, estos animales afectados podrían no estar siendo detectados en los mataderos si no se realiza en ellos ninguna técnica diagnóstica. Un estudio realizado en mataderos de Japón, en el que animales diagnosticados como positivos tras la aplicación de un test rápido para la EEB (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) y, posteriormente, una inmunohistoquímica y Western blot, no habían mostrado signos clínicos o síntomas relevantes de la enfermedad, fue publicado por Iwata et al. (2006). Un segundo grupo de animales cuyos resultados requerían ser discutidos a partir del estudio de relación entre presencia de PrPsc y síntomas nerviosos, son los animales que desarrollaron síntomas durante la incubación, pero posteriormente no presentaron depósitos de PrPsc en el análisis inmunohistoquímico. Este hecho también había sido mencionado en animales inoculados con Scrapie o EEB que desarrollaban signos clínicos de enfermedad 105 Discusión con ausencia de patología (Konold et al., 2008). Se ha demostrado que la enfermedad puede ser transmitida en ausencia de PrPsc detectable (Lasmézas et al., 1997) sin perder infectividad e, incluso, con altos títulos (Barron et al., 2007). Parece por ello que la infectividad y la neurodegeneración pueden tener mecanismos separados (Collins et al., 2004), por lo que, además del desarrollo de la enfermedad sin depósitos de PrPsc, también pueden existir agregados de PrPsc sin una infectividad asociada (Riesner et al., 1996). Todo esto obligaría a reconsiderar el verdadero papel de la PrPsc en la transmisión de la enfermedad. Aunque se había comprobado que la PrPsc estaba involucrada en el proceso patogénico de las EET, se puede poner en duda que sea el componente transmisible del agente causal o, incluso, el agente causal (Jeffrey et al., 2010). Por un lado, se explicaría el comportamiento de este grupo de animales que han presentado síntomas, pero no depósito de PrPsc, pudiendo presentar incluso alta infectividad (Barron et al., 2007). Aunque se ha demostrado que la PrPc es necesaria para desarrollar la enfermedad, puesto que ratones sin esa proteína (knock-out) son resistentes a infecciones experimentales (Sailer et al., 1994; Baron, 2002b; Weissmann y Flechsig, 2003), la PrPsc no necesariamente tiene que ser el agente transmisible. En relación con esta hipótesis se han formulado varias teorías. Una de las posibilidades era la existencia de una forma de PrPsc sensible a la proteinasa K (sPrPsc) que no era detectada al ser totalmente digerida, como se ha sugerido en relación a la enfermedad de Gerstmann– Straüssler-Scheinker (Nazor et al., 2005). Pero también podía ocurrir que el agente causal fuera sólo una parte de la PrPsc (Barron et al., 2007). Finalmente, la falta de detección de los depósitos de PrPsc podría deberse a la diferente sensibilidad que parece presentar la PrPsc frente a las proteasas, que es cada vez mayor conforme se alarga el periodo de incubación (Safar et al., 1998), siendo, en este caso, superior al observado en inoculaciones similares. En estudios previos, se había visto que posteriores pases sucesivos en ratón permitían una adaptación mayor de la cepa utilizada y, por consiguiente, un 106 Discusión acortamiento y estabilidad del tiempo de incubación (Kimberlin y Walker, 1977), una presencia más manifiesta de los signos clínicos neurodegenerativos, una mayor detección de PrPsc (Piccardo et al., 2007) y, en definitiva, una expresión más clara de la enfermedad en general. De esta forma, con pases seriados se conseguía detectar la infectividad de forma más evidente. Al igual que en otros estudios anteriores en los que un sólo pase a un ratón receptivo había posibilitado la demostración de pequeñas cantidades de agente y, por consiguiente, la enfermedad subclínica (Hill et al., 2000; Race et al., 2001; Race et al., 2002), en el trabajo presentado, con este segundo pase a partir del animal positivo, se confirma este hecho. Los resultados de este estudio apoyan la existencia de un umbral de concentración de PrPsc en relación con su infectividad en la transmisión. Al igual que con las muestras bovinas, la técnica de confirmación de microscopía electrónica es aplicada a estas muestras murinas con el objetivo de verificar los resultados obtenidos en el análisis inmunohistoquímico y descartar la posibilidad de que las señales fueran inespecíficas. De nuevo, la técnica de microscopía electrónica se confirma como una herramienta fiable y precisa que posibilita la obtención de un resultado definitivo, ya que, al revelar la presencia de fibrillas SAF en las muestras murinas, corrobora el diagnóstico positivo de los ratones y, por consiguiente, de las muestras bovinas utilizadas en el estudio. El uso de estas fibrillas para la demostración de la transmisión de la enfermedad en el modelo murino ya había sido descrito en estudios anteriores, aunque principalmente en relación con el Scrapie (Kascsak et al., 1986; Merz et al., 1987) y no tanto en ratones inoculados con la enfermedad de la EEB, en la que apenas existen estudios al respecto. En este trabajo, el diámetro de las fibrillas es sólo comparable al de las fibras tipo 1, en su parte estrecha, descritas por Merz et al. (1981) y similar al observado en las muestras de origen bovino analizadas anteriormente. Además, aunque en el animal que había presentado placas en el análisis inmunohistoquímico se observan asociaciones de fibrillas, en el resto generalmente las fibrillas se localizan de forma aislada. La alta concentración de 107 Discusión PrPsc presente en dicho animal, respecto al resto de ratones inoculados, explicaría esta acumulación de fibrillas, que es semejante a la de estudios anteriores realizados en Scrapie y ECJ (Bode et al., 1985; Merz et al., 1987; Scott et al., 1987; Stack et al., 1995). El objetivo de este trabajo ha sido tratar de explicar los resultados no concluyentes obtenidos tras los análisis efectuados mediante las técnicas de confirmación acerca de la presencia de infectividad en las muestras bovinas estudiadas. Como ya ha sido señalado, la propia naturaleza de las muestras parece ser la responsable principal de todos los resultados obtenidos, ya que se sabía previamente que podía influir mucho más en el diagnóstico que las características concretas de cada técnica (Kübler et al., 2003). La primera dificultad encontrada ha sido la autolisis tan marcada que presentaban todas las muestras bovinas utilizadas, que ha podido dificultar la selección de las áreas con mayor probabilidad de depósito de PrPsc y ser responsable de la disminución de concentración presente, junto a la acción de las proteasas. No obstante, a pesar del avanzado estado de autolisis que presentaban todas las muestras del estudio, no parece ser ésta la causa principal que justifique los resultados no concluyentes obtenidos en algunas de las técnicas aplicadas en este trabajo. Como ya se había visto en estudios anteriores, la autolisis no está necesariamente asociada a la degradación de la PrPsc (Debeer et al., 2001; Chaplin et al., 2002; Wear et al., 2005), que puede ser detectada en encéfalos congelados y fijados (Debeer et al., 2002), incluso cuando no se reconoce ni el tejido ni la zona donde puede estar situada esa proteína (Lasmézas et al., 1996). Por esta razón, aunque en este trabajo no se hayan obtenido resultados concluyentes en algunas de las técnicas, no puede atribuirse a la autolisis, ya que en estudios anteriores no se había visto interferencia ni en técnicas rápidas (Meloni et al., 2010) ni de confirmación, tales como la inmunohistoquímica (Debeer et al., 2001; Chaplin et al., 2002; Monleón et al., 2003), Western blot (Schaller et al., 1999) y visualización de fibrillas SAF (Scott et al., 1992). De hecho, a pesar de ella, en este trabajo, se logran 108 Discusión resultados definitivos con la técnica inmunocitoquímica y la de microscopía electrónica. A pesar de que se había propuesto que con la inmunohistoquímica se podía perder sensibilidad (Novakofski et al., 2005) y que, además, la acción de la proteinasa K podía dar origen a resultados inesperados (Lezmi et al., 2004), en este trabajo, la inmunocitoquímica en frotis ofrece resultados concluyentes en todas las muestras. Ésta es una de las razones que permiten considerar a la inmunocitoquímica en frotis como una herramienta muy sensible y útil para el diagnóstico de la EEB en muestras autolíticas, al corroborar en modelos in vivo los resultados que hasta ahora sólo se habían probado en el laboratorio (Monleón et al., 2003). Respecto a la microscopía electrónica, para obtener un resultado definitivo no influye el estado autolítico de las muestras, como ya se había descrito anteriormente (Scott et al., 1992; Race et al., 1994; Chaplin et al., 2002). Por ello, los resultados no concluyentes no parecen ser provocados por la autolisis, sino por otra de las razones que se exponen con posterioridad. Aun así, la defectuosa toma de muestras, al no poder diferenciar la zona de tejido que debe analizarse debido al estado autolítico de las mismas, sí podría aumentar indirectamente la dificultad para la obtención de un diagnóstico definitivo. Un muestreo correcto es clave para un buen diagnóstico y para evitar falsos negativos, incluso por encima de la calidad del tejido (Meloni et al., 2010). Además, la distribución heterogénea de la PrPsc en el tejido, junto con posibles bajas concentraciones del agente, como parece suceder en las muestras de estudio, aún habría dificultado más la correcta toma de muestras en estos casos, provocando unos resultados no concluyentes como los ya descritos en algunos trabajos (Schaller et al., 1999; Cooley et al., 2001; Chaplin et al., 2002; Vidal et al., 2005; Arsac et al., 2007). En estudios recientes, se indicaba que, en la EEB, zonas como cerebelo o regiones cerebrales caudales, que no eran recomendadas para el diagnóstico por la distribución no uniforme de la PrPsc (Polak y Zmudzinski, 2012), podían ofrecer falsos resultados. A pesar de todo, como se comprueba en este trabajo, la autolisis por sí misma no se considera un problema para la obtención de un diagnóstico y, en ningún caso, una razón suficiente como para que las muestras autolíticas sean eliminadas (Stack et al., 2009) o ignoradas 109 Discusión (Hayashi et al., 2004), lo que supone un sesgo en los análisis epidemiológicos de la enfermedad. Sin embargo, la supuesta baja concentración inicial de PrPsc de las muestras bovinas sí parece ser el factor clave que puede explicar los resultados no concluyentes obtenidos en este trabajo. No resulta ser un impedimento para poder obtener un diagnóstico definitivo con la inmunocitoquímica y la microscopía electrónica, pero sí parece haber influido en la sensibilidad de otras, como las técnicas rápidas, el Western blot y el bioensayo en ratón, que no son capaces de detectarla o la detectan en proporción menor a la esperada. Aunque con las técnicas rápidas y el Western blot de confirmación los resultados no han sido concluyentes, la débil señal que detectan apoya el diagnóstico positivo de las muestras, ofreciendo un resultado compatible con una baja concentración de PrPsc en las muestras bovinas que puede estar cercana al límite de detección de estas técnicas. En el caso del bioensayo en ratón, la situación sería diferente, pues esta técnica confirma el diagnóstico de la enfermedad pero presentando un comportamiento diferente al esperado en cuanto a tiempo de incubación, presentación de síntomas y resultados en técnica de confirmación de los encéfalos murinos. Como ya se ha comentado, todos ellos pueden ser explicados también por la baja concentración inicial de las muestras bovinas y, por consiguiente, del inóculo aplicado a los ratones, en el que la concentración de PrPsc es aún menor por las diluciones sucesivas que han tenido que ser realizadas. Así, tanto el aumento en el tiempo de incubación como la presentación de la PrPsc en forma de depósitos granulares, y no en placa, además del menor número de ratones inoculados afectados en relación al esperado, parecen ser debidos a la baja concentración de PrPsc inicial y a la consiguiente disminución en el nivel de sensibilidad de cada una de las técnicas. Incluso, ésta puede ser la causa de la falta de correlación encontrada en algunos casos entre los animales que han desarrollado síntomas y los que han presentado depósito de PrPsc en la inmunohistoquímica. La diferente distribución de la PrPsc y el defecto en la toma de muestras derivado de la autolisis justifica aún más cómo afecta de manera 110 Discusión diferente cada inóculo en los ratones del estudio. Aunque el bioensayo se considera una técnica de confirmación de gran sensibilidad, ya se había visto que era limitada, fijando el nivel de detección en 103 LD50/g. Este límite podría ser uno de los motivos por los que, en este trabajo, algunos de los ratones inoculados pasaran desapercibidos, a pesar de ser positivos, al no llegar a la cantidad de PrPsc necesaria para ser captada por la técnica, detectando sólo los animales que recibieron una cantidad mayor a la referida anteriormente. Estos problemas en la captación debido a las bajas cantidades de PrPsc presentes en los ratones inoculados ya habían sido descritos en esta técnica. Estos animales podían no presentar signos neurológicos (Yokoyama et al., 2007), pero también desarrollar síntomas preclínicos, durante muchos meses, que podían ser reversibles y no llevar al animal a un estado terminal a menos que apareciera la ataxia (Baron, 2002b; Thackray et al., 2002). Como se ha tratado de justificar a lo largo de este capítulo, la baja concentración de PrPsc en las muestras parece la causa más probable de los resultados no concluyentes descritos en este trabajo. Sin embargo, la hipótesis planteada desde el principio de la posible presencia de una nueva cepa no puede ser del todo descartada, a pesar de no haber obtenido resultados significativos que la avalen. El problema es que los dos principales métodos que pueden caracterizar la nueva cepa, el patrón de depósito de la PrPsc en la inmunohistoquímica (Vidal et al., 2006) y el perfil de glicosilación en el Western blot, son imposibles de valorar. La inmunocitoquímica en frotis, debido al estado autolítico de las muestras, impide ese estudio, al igual que la falta de bandas diferenciadas en el Western blot que no permite analizar el patrón de glicosilación. Aun así, los diferentes comportamientos encontrados en las diversas técnicas aplicadas podrían atribuirse a un nuevo agente causal no conocido hasta ahora. En este caso, podría estar sucediendo lo mismo que ocurrió en su momento con las cepas atípicas que se descubrieron por presentar débil señal en el ELISA y una 111 Discusión acumulación de inusuales pequeñas cantidades de PrPsc detectadas por WB (Yokoyama et al., 2007), características que pueden compararse en cierto modo con lo encontrado en este trabajo. De esta forma, además, podría explicarse la variabilidad de los resultados encontrados en todas las técnicas, incluso en el bioensayo en ratón, en el que la menor sensibilidad evidenciada podría corresponderse con la menor sensibilidad de los ratones transgénicos bovinizados frente a una hipotética cepa atípica respecto a la de la cepa clásica. En tal caso, algunas de las características descritas, como mayores tiempos de incubación en el bioensayo en ratón o la diferente susceptibilidad genética en cada caso, podrían ser explicadas por la presencia de una nueva cepa en la que las nuevas caracerísticas derivan de alteraciones del gen PRNP (Sander et al., 2005). Si una nueva cepa fuera descrita, las hipótesis que podrían explicar esta aparición serían las mismas que las de las cepas atípicas: que el agente causal de la EEB en algún momento ha transformado su estructura dentro de las células afectadas, que varias cepas de Scrapie al infectar al ganado bovino han formado una nueva cepa atípica o que ha surgido alguna forma esporádica de EEB, como había ocurrido con la ECJ en humanos (Ozawa, 2007). Lo que parece claro y queda evidenciado en este trabajo, es que en el curso de la aplicación del plan de vigilancia puede haber animales que no son diagnosticados en un principio y hasta pueden pasar desapercibidos, a pesar de ser capaces de transmitir la enfermedad. En este trabajo, se demuestra que la técnica de microscopía electrónica, a pesar de estar un poco en desuso, posee mayor sensibilidad para la detección de la positividad de muestras con resultado no concluyente por otras técnicas, incluso mayor que el bioensayo en ratón, que era hasta ahora una técnica considerada como determinante. Junto a ella, la inmunocitoquímica en muestras autolíticas se considera como una técnica eficaz para el diagnóstico de este tipo de muestras, ya que ha permitido conseguir resultados concluyentes y definitivos. A pesar de la sensibilidad mostrada por ambas, la microscopía electrónica resulta esencial porque confirma la objetividad de la técnica inmunocitoquímica, con la demostración de la existencia de fibrillas 112 Discusión específicas de la enfermedad. Por su parte, el bioensayo en ratón ha puesto de manifiesto la existencia de diversos problemas que han surgido en relación con la naturaleza y el estado de las muestras analizadas en este estudio, así como de la concentración de la PrPsc presente en dichas muestras. Por otro lado, la comprobación en este trabajo de que, incluso con bajas concentraciones de PrPsc, la enfermedad puede ser transmitida, como ya se había visto por Wells et al. (2007), corrobora la importancia de disponer de métodos de diagnóstico eficaces de la enfermedad. Y es que un cierto control sobre la enfermedad es necesario desde el momento en el que se demuestra que la contaminación de los piensos, a pesar de haberse reducido considerablemente, nunca ha llegado a desaparecer (EFSA, 2005). Estudios previos han demostrado que muchos casos de EEB siguen sin diagnosticarse clínicamente y pueden terminar como ganado muerto o animales sacrificados de urgencia (Doherr et al., 2001; Morignat et al., 2002). Aunque esta enfermedad siempre ha tenido una baja prevalencia, que puede llegar a aproximarse a cero cuando están establecidas las medidas de prevención y erradicación (Anderson et al., 1996), es importante conocer la situación real de la misma porque puede haber un estado de prevalencia esporádica (Stack et al., 2009) que puede suponer un bajo, pero posible, riesgo para la salud pública. Además, puesto que el aumento del número de casos de EEB a partir de 1985 se correspondió, según varios estudios, con una baja exposición a la enfermedad (aunque larga en el tiempo) que llegó a afectar a un altísimo número de animales, el control sobre la misma debería de mantenerse (Kimberlin, 1993). No obstante, es preciso tener en cuenta que, debido al largo periodo de incubación, los animales son sacrificados en su mayoría antes de alcanzar los niveles suficientes de infectividad que afectan al hombre y que, gracias a la eliminación de los materiales especificados de riesgo, hay muy pocas posibilidades de infección al hombre a través de la cadena alimentaria (Tsutsui y Kasuga, 2006). Aun así, aspectos tales como la especial habilidad de la EEB para 113 Discusión 114 cruzar las barreras de especie y las diferentes manifestaciones que puede adoptar (nuevas cepas que puedan aparecer), hacen que resulte prudente mantener un cierto nivel de análisis basado en un correcto diagnóstico de la enfermedad. El riesgo de que el agente de la EEB pueda llegar a alterarse en esa transmisión (Asante et al., 2002; Baron, 2002a), siendo difícil su reconocimiento, o que pueda confundirse en la oveja con el Scrapie (Foster et al., 2001), exige la necesidad de que no haya muestras que puedan pasar desapercibidas para evitar la posibilidad de contaminación a humanos (Collinge et al., 1996; Will et al., 1996; Lasmézas et al., 1997). Hay que tener en cuenta que los casos de EEB que puedan no ser diagnosticados podrían estar causando un índice mayor de vECJ subclínica y preclínica de lo previsto en los diferentes genotipos de PrP humana (Hilton et al., 2004; Peden et al., 2004; Bishop et al., 2006; Barron et al., 2007) e incluso podrían ser la causa de algunos casos de ECJ esporádica (Asante et al., 2002). Por todas esas razones, toda aportación realizada en la búsqueda de un diagnóstico exacto y fiable de la EEB resulta necesaria para conseguir un control sobre la enfermedad y evitar cualquier riesgo posible sobre futuras contaminaciones y transmisiones a otros animales y, especialmente, a la especie humana. Conclusions CONCLUSIONS - By applying the different standardized techniques in the present study on the samples analyzed, a conclusive and positive BSE diagnosis is determined in all cases. - Among all BSE confirmatory techniques which are assessed in the present study, immunocytochemistry and electron microscopy are confirmed as the most sensitive techniques for the diagnosis of these samples, even higher than the mouse bioassay. Electron microscopy is confirmed as a technique capable to provide an objective and reliable diagnosis in all cases. - The reliability of immunocytochemistry for BSE diagnosis in samples with a very advanced state of autolysis (even in liquid state), is confirmed by an in vivo model, corroborating the results provided in vitro by the transmission of the disease to mice. - The application of all diagnostic techniques tested here shows that autolysis does not prevent from establishing BSE diagnosis, although it can be actually hampered when PrPsc concentration is not enough in the samples. - The results of this study show the failure of rapid tests on the samples analyzed to provide a conclusive diagnosis, which should make to question whether the current rules, which not require the use of confirmatory techniques to determine the positive or negative diagnosis of a sample, are really appropiate. - Difficulties about the experimental assay in mice, which are not usually mentioned in the reviewed bibliography, are described in this work. 117 118 RESUMEN Resumen RESUMEN Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que, tras un largo periodo de incubación, provocan la muerte. El origen de la enfermedad reside en el cambio conformacional de una proteína localizada fisiológicamente en el tejido nervioso (proteína prión celular, PrPc) que adquiere características patológicas (PrPsc), siendo el único agente causal conocido y denominado prión. La identificación de los depósitos de PrPsc en el tejido nervioso central se considera específica de la enfermedad y en ello se basan la mayoría de las técnicas diagnósticas. Aunque estas enfermedades afectan a varias especies animales, además de a la humana, las más importantes son la enfermedad bovina (Encefalopatía espongiforme bovina), ovina y caprina (Scrapie), la del visón (Encefalopatía transmisible del visón) y la que afecta a cérvidos (enfermedad crónica caquectizante). El presente trabajo se ha centrado en la primera de ellas, la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB). Tras la aparición de la EEB y el incremento progresivo en el número de casos de la enfermedad bovina desde 1987 y, particularmente, tras la demostración de la transmisión de ésta a humanos (variante de la enfermedad de CreutzfeldtJakob, vECJ), se consideró absolutamente necesario disponer de métodos de diagnóstico sensibles y específicos. Por otra parte, el elevado número de animales a analizar obligó a disponer de técnicas de diagnóstico rápido, aunque ello supusiera una cierta pérdida en su sensibilidad. En el curso del programa de vigilancia de la EEB establecido para la identificación de los casos de la enfermedad y la aplicación de las correspondientes medidas de control de la misma, uno de los problemas que surgió fue la existencia de muestras que ofrecían resultados no concluyentes. En este trabajo se han estudiado varias muestras que no presentaron un 119 Resumen resultado concluyente con las técnicas de confirmación aplicadas de rutina, inmunohistoquímica (IHQ) y Western blot (WB), y que además presentaban un estado muy avanzado de autolisis. El objetivo planteado era analizar estas muestras mediante la aplicación de las técnicas de confirmación establecidas por la OIE, adaptándolas a las características que presentaban. Pero, además, se planteó realizar por primera vez una comparación exhaustiva sobre la capacidad de cada una de ellas para llevar a cabo el diagnóstico de este tipo de muestras. Para el estudio, se han seleccionado 5 muestras de tejido encefálico bovino que presentaban un avanzado estado de autolisis y que habían sido diagnosticadas como muestras no concluyentes. Con la técnica rápida utilizada (Prionics-Check Western test) estas muestras evidenciaron una señal, pero no lo suficientemente evidente como para ser consideradas como positivas, por lo que se aplicaron todas las técnicas de confirmación establecidas por la OIE, todas ellas con modificaciones debido al carácter autolítico que presentaban y, también, teniendo en consideración la hipótesis de que se pudiera partir de una cantidad muy baja de PrPsc. Las técnicas diagnósticas de confirmación fueron la inmunohistoquímica (IHQ), el Western blot (WB; SAF Immunoblot), la visualización de las fibrillas asociadas a Scrapie (SAF) mediante microscopía electrónica y el bioensayo en ratón. No fue posible utilizar la histología en estas muestras a causa de su autolisis. Por otra parte, se llevó a cabo también una técnica de diferenciación (WB) para intentar determinar el agente causal involucrado en estas muestras y evaluar la posibilidad de que una nueva cepa, diferente a la convencional, pudiera estar presente en ellas. Respecto al resultado obtenido con las técnicas de confirmación aplicadas en este trabajo, se ha observado que la inmunohistoquímica y la microscopía electrónica han sido capaces de confirmar el resultado positivo de las muestras, 120 Resumen mientras que el Western blot sólo ha mostrado algunos signos de positividad, pero sin lograr confirmar el diagnóstico. El bioensayo en ratón ha mostrado eficacia, pero no total, al transmitir la enfermedad sólo en un número limitado de ratones. La inmunohistoquímica ha permitido confirmar la positividad de las muestras al revelar depósitos de PrPsc en todas ellas, aunque fue preciso previamente realizar una adaptación del protocolo convencional debido al estado autolítico de las mismas. Dicha adaptación de la técnica para muestras con avanzado estado de autolisis había sido establecida con anterioridad en el Centro de Investigación en Encefalopatías y Enfermedades Transmisibles Emergentes, pero en este trabajo se ha corroborado por primera vez en modelo in vivo la eficacia de la técnica y su alta sensibilidad, lo que la convierte en una técnica adecuada y fiable para el diagnóstico de la EEB, a pesar del estado autolítico de las muestras analizadas. Del mismo modo, la microscopía electrónica se ha revelado como una técnica muy sensible y objetiva para diagnosticar esta clase de muestras, ya que ha permitido confirmar los resultados observados en la inmunocitoquímica mediante la visualización de SAF, estructuras formadas por PrPsc que sólo aparecen en animales afectados por la enfermedad. A pesar de que la sola observación de las fibrillas es suficiente para realizar un diagnóstico definitivo, este hallazgo ha sido corroborado con la aplicación de la inmunohistoquímica con oro coloidal, al unirse las partículas de oro a la PrPsc localizada en las fibrillas. La aplicación del Western blot de la OIE no ha ofrecido un resultado concluyente porque, a pesar de realizar previamente todos los protocolos de concentración y purificación, sólo se ha obtenido una señal muy débil. Con el WB de diferenciación se ha podido observar una señal sugestiva de positividad, pero también débil, por lo que no ha sido suficiente para determinar el patrón de glicosilación correspondiente al agente causal presente en las muestras 121 Resumen analizadas. Respecto al bioensayo, en este trabajo se evidencia que esta técnica puede presentar en algunas ocasiones problemas para obtener un diagnóstico concluyente en este tipo de muestras. Aunque se ha confirmado la positividad de las muestras bovinas, ya que en cada uno de los grupos inoculados con las diferentes muestras se han detectado ratones positivos, el número de éstos ha sido muy reducido. Por otra parte, el depósito de PrPsc en placa, característico de la inoculación de EEB en la especie murina, sólo se ha observado en un ratón, a diferencia del resto de animales que han presentado depósitos de PrPsc con un patrón granular. Los resultados obtenidos por inmunohistoquímica en este modelo in vivo se han corroborado al detectarse SAF mediante la técnica de la microscopía electrónica. El conjunto de los resultados obtenidos en este estudio, mediante la aplicación de todas las técnicas utilizadas, puede ser explicado por la naturaleza y características de las muestras estudiadas. Así, parece que la autolisis no afecta en gran medida al diagnóstico de las muestras, ya que no logra impedir la obtención de un resultado concluyente en ellas. Por otro lado, la posibilidad de la presencia de una cepa con nuevas características no ha podido ser descartada. La explicación más probable para todos los resultados obtenidos con las técnicas aplicadas parece ser la baja concentración de PrPsc de partida presente en las muestras bovinas, que justificaría los resultados obtenidos en este estudio. Esta hipótesis se reforzaría si se tiene en cuenta la digestión enzimática que está asociada a los procesos de autolisis y que implicaría una disminución adicional de esa concentración de partida. Ello podría explicar el mayor tiempo de incubación de los animales inoculados respecto al observado en otros estudios similares, la presencia del depósito de PrPsc granular (no en placa) visto en la 122 Resumen 123 mayoría de los animales inoculados, así como el menor número y tamaño de las SAF visualizadas por microscopía electrónica. Por otra parte, la falta de concordancia entre los animales con signos clínicos y su respuesta en técnicas de confirmación observada en algunos casos, podría ser explicada por la posibilidad de requerir periodos más largos de incubación asociados a la baja concentración de PrPsc, aunque también podría deberse a una relación no exclusiva entre la presencia de PrPsc y la infectividad, como ya ha sido sugerida por algunos autores. 124