Repositorio Institucional de Documentos

2012 64 Esther Prieto Calvo Farmacocinética, biodisponibilidad y tolerancia ocular de memantina en conejos : Aportaciones al análisis de una nueva formulación oftálmica a base de nanopartículas Departamento Director/es Cirugía, Ginecología y Obstetricia Bregante Ucedo, Miguel Angel Pérez Oliván, Susana Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Esther Prieto Calvo FARMACOCINÉTICA, BIODISPONIBILIDAD Y TOLERANCIA OCULAR DE MEMANTINA EN CONEJOS : APORTACIONES AL ANÁLISIS DE UNA NUEVA FORMULACIÓN OFTÁLMICA A BASE DE NANOPARTÍCULAS Director/es Cirugía, Ginecología y Obstetricia Bregante Ucedo, Miguel Angel Pérez Oliván, Susana Tesis Doctoral Autor 2012 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Farmacología y Fisiología FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Cirugía, Ginecología y Obstetricia Servicio Oftalmología. Hospital Universitario Miguel Servet Farmacocinética, Biodisponibilidad y Tolerancia Ocular de Memantina en Conejos. Aportaciones al Análisis de una Nueva Formulación Oftálmica a base de Nanopartículas Memoria para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza Esther Prieto Calvo 2012 Dra. SUSANA PÉREZ OLIVÁN, Profesora Asociada adscrita al Departamento de Cirugía, Ginecología y Obstetricia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza y el Dr. MIGUEL ANGEL BREGANTE UCEDO, Profesor Titular adscrito al Departamento de Fisiología y Farmacología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza Certifican que la presente memoria de tesis doctoral titulada “Farmacocinética, Biodisponibilidad y Tolerancia Ocular de Memantina en Conejos. Aportaciones al Análisis de una Nueva Formulación Oftálmica a base de Nanopartículas” que presenta Dña. ESTHER PRIETO CALVO, Licenciada en Medicina, para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, ha sido realizada bajo nuestra dirección y reúne las condiciones necesarias para su lectura y defensa. Y para que conste, en cumplimento de la legislación vigente, firman el presente certificado en Zaragoza a 12 de julio de 2012. Fdo. Susana Pérez Oliván Fdo. Miguel Ángel Bregante Ucedo El presente trabajo es el resultado de la colaboración entre la Unidad de Farmacología del Departamento de Farmacología y Fisiología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza, el Servicio de Oftalmología del Hospital Universitario Miguel Servet y el Departamento de Cirugía, Ginecología y Obstetricia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Abreviaturas PBS: tampón fosfato PCP: fenciclidina (contracción del nombre químico fenilciclohexilpiperidina) PEV: potenciales evocados visuales PGs: prostaglandinas PIO: presión intraocular pKa: logaritmo negativo de la constante de disociación ácida PK: parámetro cinético Pl: plasma PLGA: de las siglas en inglés “Poly-lactic-co-glycolic acid” o ácido poliláctico-coglicólico Pm: peso molecular PMN: polimorfonucleares neutrófilos PTFE: politetrafluoroetileno PVP: polivinilpirrolidona Q: cantidad de sustancia RB: retrobulbar RD: retinopatía diabética RLO: radicales libres del oxígeno RMN: resonancia magnética nuclear RNAsi: de las siglas en inglés “Small interfering RNA” o ARN pequeño de interferencia o silenciamiento RPL: porción prelaminar del nervio óptico RRL: porción retrolaminar del nervio óptico RR: riesgo relativo SAEA: Servicio de Apoyo a la Experimentación Animal SC: subconjuntival SEUG: Sociedad Europea del Glaucoma SERV: Sociedad Española de Retina y Vítreo SNC: sistema nervioso central SS: solución salina STP: subtenon posterior TLA: trabeculoplastia láser TNF-2α: factor de necrosis tumoral-2α TS: temporal-superior TSL: trabeculoplastia láser diodo selectivo VAA: vectores virales de adenovirus VCR: vena central de la retina ʎex: longitud de onda de excitación ʎem: longitud de onda de emisión Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Indice I.- INTRODUCCIÓN 1 1.- GLAUCOMA 3 1.1.- DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN 3 1.2.- EPIDEMIOLOGÍA 5 1.2.1.- Factores de Riesgo en el Glaucoma 7 1.3.- FISIOPATOLOGIA 11 1.3.1.- Anatomía y fisiología 11 1.3.2.- Teorías etiopatogénicas 17 1.3.2.1.- Teoría mecánica 17 1.3.2.2.- Teoría vascular 18 1.3.2.3.- Teoría autoinmune 19 1.3.3.- Degeneración y muerte de la célula ganglionar retiniana 21 1.4.- TRATAMIENTO ANTIGLAUCOMATOSO 24 1.4.1.- Tratamiento hipotensor 24 1.4.1.1.- Médico 25 1.4.1.2.- Quirúrgico 37 1.4.2.- Nuevas modalidades de tratamiento 40 1.4.2.1.- Terapias neuroprotectoras 41 1.4.2.2.- Terapias vasoprotectoras 55 1.4.2.3.- Terapia génica 56 2.- MEMANTINA 57 2.1.- CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS 57 2.2.- COMPORTAMIENTO FARMACOCINÉTICO 59 2.3.- TOLERANCIA Y SEGURIDAD DE MEMANTINA 60 2.3.1.- Estudios de toxicidad en animales de experimentación 60 2.3.2.- Estudios de toxicidad en humanos 62 2.4.- MECANISMO DE ACCIÓN 64 2.4.1.- Propiedades farmacodinámicas 67 2.5.- MEMANTINA Y NEUROPROTECCIÓN 68 2.5.1.- Usos clínicos 71 3.- FARMACOCINÉTICA 74 3.1.- FARMACOCINÉTICA GENERAL. ANÁLISIS COMPARTIMENTAL 74 3.2.- FARMACOCINÉTICA OCULAR 84 3.2.1.- Anatomía del globo ocular 84 3.2.2.- Vías de administración en oftalmología 90 3.3.- NUEVAS FORMULACIONES OFTÁLMICAS 99 3.4.- MODELIZACIÓN CINÉTICA OCULAR 111 II.- JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 115 1.- JUSTIFICACIÓN 117 2.- HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 119 Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Indice III.- MATERIAL Y MÉTODOS 123 1.- MATERIAL 125 1.1.- MATERIAL BIOLÓGICO 125 1.2.- REACTIVOS Y DISOLUCIONES 126 1.3.- MATERIAL DE LABORATORIO 127 2.- METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 130 2.1.- ESTUDIO FARMACOCINETICO 130 2.1.1.- Administración periocular-subtenon posterior 130 2.1.2.- Administración intravítrea 132 2.1.3.- Administración endovenosa 132 2.1.3.1.- Dosis única 132 2.1.3.2.- Infusión endovenosa 133 2.1.4.- Obtención de muestras 134 2.1.5.- Metodología analítica 135 2.1.6.- Ajuste de datos y tratamiento cinético 140 2.1.7.- Biodisponibilidad 141 2.1.8.- Características cinéticas globales de la administración periocular subtenon 142 2.1.8.1.- Absorción subtenon 142 2.1.8.2.- Pérdida de sustancia del lugar de la administración 143 2.1.8.3.- Modelo cinético ocular 143 2.2.- ESTUDIO DE TOLERANCIA OCULAR DE MEMANTINA 143 2.2.1.- Administración del fármaco 144 2.2.2.- Evaluación clínica 145 2.2.3.- Examen histológico 146 2.3.- NUEVA FORMULACIÓN OFTÁLMICA 147 2.4.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 147 IV.- RESULTADOS 151 1.- METODOLOGÍA ANALÍTICA 153 2.- FARMACOCINÉTICA PERIOCULAR 155 2.1.- CINÉTICA VÍTREA 155 2.1.1.- Ojos Administrados 155 2.1.2.- Ojos contralaterales 161 2.2.- CINÉTICA PLASMÁTICA 167 3.- FARMACOCINÉTICA INTRAVÍTREA 172 3.1.- CINÉTICA VÍTREA 172 3.2.- CINÉTICA PLASMÁTICA 178 4.- FARMACOCINÉTICA ENDOVENOSA: DOSIS ÚNICA 183 4.1.- CINÉTICA VÍTREA 183 4.2.- CINÉTICA PLASMÁTICA 187 5.- BIODISPONIBILIDAD VÍTREA 189 5.1.- ADMINISTRACIÓN PERIOCULAR 189 5.1.1.- Biodisponibilidad vítrea absoluta 189 5.1.2.- Biodisponibilidad vítrea relativa 190 5.1.2.a.- Frente a la administración intravítrea 190 5.1.2.b.- Frente a la administración endovenosa en dosis única 191 5.2.- ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA ENDOVENOSA 192 5.2.1.- Biodisponibilidad vítrea relativa 192 Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Indice 5.2.1.a.- Frente a la administración intravítrea 192 5.2.1.b.- Respecto a plasma 192 5.2.2.- Infusión endovenosa. Equilibrio estacionario 193 6.- CARACTERÍSTICAS CINÉTICAS GLOBALES DE LA ADMINISTRACIÓN PERIOCULAR 195 6.1.- ABSORCIÓN LOCAL 195 6.2.- PÉRDIDA DE SUSTANCIA DEL LUGAR DE LA ADMINISTRACIÓN 196 6.3.- MODELO CINÉTICO VÍTREO TRAS LA ADMINISTRACIÓN PERIOCULAR 197 7.- TOXICIDAD OCULAR DE MEMANTINA 203 7.1.- ANÁLISIS CLÍNICO 203 7.2.- ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO 205 8.- NUEVA FORMULACIÓN OFTÁLMICA 212 V.- DISCUSIÓN 213 VI.- CONCLUSIONES 257 VII.- RESUMEN 263 VIII.- BIBLIOGRAFÍA 269 IX.- ANEXOS 289 Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 3 1.- GLAUCOMA 1.1.- DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN Frente a la primera definición de glaucoma acuñada por Goldman en el año 1957: “Bajo el término glaucoma, se incluyen las enfermedades que son consecuencia de un aumento en la presión intraocular y en las cuales lo esencial es este aumento de presión intraocular”, hoy sabemos que el glaucoma engloba a un grupo heterogéneo de afecciones oculares las cursan con una pérdida progresiva de los axones y somas de las células ganglionares retinianas (CGRs), y con la aparición de defectos típicos e irreversibles a nivel de la cabeza del nervio óptico y del campo visual (Quigley, 1981); considerando el aumento de la presión intraocular (PIO) como un factor de riesgo de la enfermedad. Por otra parte, la hipertensión ocular (HTO) es un trastorno en el cual, la presión intraocular se encuentra elevada pero en el que no existen daños glaucomatosos a nivel de la papila óptica ni defectos detectables en el campo visual (Tuulonen, 2003). No existe una definición única que permita englobar todas las formas de glaucoma posibles. La fisiopatología, presentación clínica y tratamiento de los diferentes tipos de glaucoma es muy variada, pero de forma práctica se pueden establecer 3 categorías: El glaucoma de ángulo abierto (GAA) es la forma más común de glaucoma. Se trata de una neuropatía óptica crónica, progresiva, de origen multifactorial, en la Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 4 que ocurren cambios morfológicos característicos en la papila óptica y la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR), en ausencia de otra enfermedad ocular o anomalía congénita. En este grupo, la PIO elevada será un factor de riesgo importante y encontraremos un ángulo camerular abierto (Tuulonen, 2003). El glaucoma de tensión normal (GNT) es un subtipo de GAA con entidad clínica propia, caracterizado por un daño en la papila óptica y defectos en el campo visual similares a los que aparecen en el GAA pero con cifras de PIO normales, pudiendo mostrar una evolución clínica diferente respecto al GAA, en cuanto a modelos de daño de la cabeza del nervio óptico y en cuanto a cantidad y calidad de la pérdida del campo visual (Caprioli, 1998). El glaucoma por cierre angular o glaucoma de ángulo cerrado (GAC) es una forma de glaucoma en la que existe una cámara anterior estrecha con un ángulo camerular potencialmente ocluible, en el que por distintos mecanismos, se establece un contacto irido-trabecular (CIT) que bloquea el drenaje del humor acuoso (HA), produciendo la elevación de la presión intraocular (incluso por encima de los 50 mmHg) y daño sobre el nervio óptico. En estos casos, la elevación de la PIO puede ser sintomática (dolor ocular, enrojecimiento, visión borrosa) y puede originar cambios estructurales oculares (pérdida de células endoteliales corneales con edema estromal, daño isquémico en la musculatura iridiana con midriasis arrefléxica o necrosis focal del epitelio cristaliniano dando lugar al llamado “glaukomflecken”) (Tuulonen, 2003). El glaucoma congénito primario (GCP): Es una entidad poco frecuente, que afecta aproximadamente a 1:10000 neonatos. Responde a una disminución en el flujo de salida del HA secundaria a la presencia de una trabeculodisgenesia. La mayoría de los casos de GCP son esporádicos y un 10% son hereditarios, respondiendo a un Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 11 identificados hasta el momento. Por otra parte, se investiga la existencia de un posible determinante genético de la presión intraocular (PIO) que permita identificar a los sujetos de riesgo, posibilitando el diagnóstico precoz de la enfermedad y mejorando los resultados terapéuticos, a través de un tratamiento personalizado basado en la geonómica de cada paciente (Fuse, 2010). 1.3.- FISIOPATOLOGIA  1.3.1.- Anatomía y fisiología El nervio óptico (NO) está formado por millones de fibras nerviosas correspondientes a los axones de las células ganglionares retinianas que discurren conformando la capa más profunda de la retina, la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR). Las fibras nerviosas retinianas abandonan el ojo a través del orificio escleral posterior o canal escleral. A nivel de este orificio, se encuentra la lámina cribosa (LC) constituida por una serie de láminas de tejido conectivo que se disponen formando una estructura fenestrada con múltiples poros a través de los cuales discurren los haces de fibras nerviosas. Las aberturas de estos poros, en la superficie de la lámina cribosa, se identifican en la oftalmoscopía como puntos grisáceos profundos dentro de la excavación de la papila óptica. El tamaño de estos poros varía entre diez y cien micras y su distribución en el área de la LC es desigual, de manera que en las regiones nasal y temporal del NO son más pequeños y hay más densidad de poros, lo que permite que éstos sean más resistentes. Por el contrario, en las regiones superior e inferior del NO hay menos poros, siendo éstos además de mayor diámetro, lo que condiciona una menor resistencia mecánica (Ramírez, 2008). Se ha visto que existe un aumento en el Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 12 número de poros visibles de la lámina cribosa, en aquellos ojos que exhiben progresión en la pérdida del anillo neurorretiniano por el glaucoma (Tezel, 2004). Desde hace años se ha estudiado el papel de la lámina cribosa en la fisiopatología del glaucoma, entendiendo el nervio óptico como una estructura biomecánica. Se ha postulado que la distensibilidad de la LC juega un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad. En el centro de la papila del nervio óptico se identifica una depresión pálida tridimensional, libre de tejido neural, que se conoce como excavación óptica. El color pálido de la excavación se debe a la exposición de la lámina cribosa y a la pérdida de tejido glial a este nivel. Figura 2: Estereofotografía de la papilla óptica en un ojo sano. C/D: cociente entre el tamaño de la excavación y el tamaño del disco óptico. (Reproducida de: Bourne RR. The optic nerve head in glaucoma. Community Eye Health. 2006; 19(59): 44–45). El tamaño de la excavación guarda relación con el diámetro del disco óptico (fig.2), de manera que un disco pequeño tendrá una excavación fisiológica pequeña, pues las fibras nerviosas retinianas tendrán que cruzarse más a su salida del globo Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 13 ocular, mientras que un disco grande tendrá una mayor excavación fisiológica, ya que las fibras nerviosas estarán menos cruzadas y se distribuirán de manera más homogénea por toda la circunferencia papilar (Jonas, 1988). El anillo neurorretiniano (ANR) es la parte del disco óptico comprendida entre el borde externo de la excavación y los márgenes de la papila, y corresponde a la porción preliminar de las fibras nerviosas retinianas que cambian de angulación para introducirse por el canal escleral. El ANR tiene una coloración anaranjada o rosada, y posee una configuración característica, de manera que el borde inferior es el más ancho, seguido por el superior, el nasal y el temporal (regla ISNT) (Jonas, 1988; Bourne, 2006). El glaucoma se caracteriza por un adelgazamiento progresivo del ANR con aumento del tamaño de la excavación óptica. El patrón morfológico de la pérdida del anillo es variable, pudiendo presentarse como una pérdida difusa, localizada (muesca o sacabocados) o mixta, siendo más frecuente que acontezca a nivel de los polos superior e inferior, y de forma más precoz a nivel de este último (Bartz, 1999; Larrosa, 2001). Para poder interpretar los defectos en el campo visual en relación con el aumento de la excavación del nervio óptico, es fundamental conocer la disposición de los casi 1.2 millones de axones de células ganglionares, a nivel de la retina y a su paso a través del canal escleral. Dentro de la retina, las fibras procedentes de la mácula siguen un trayecto recto hasta la papila óptica, conformando un área en forma de huso denominado haz papilo-macular. Las fibras procedentes de la retina nasal siguen también un trayecto relativamente recto hasta el nervio óptico, y las fibras procedentes de la retina temporal siguen un trayecto arqueado alrededor del haz papilo-macular para alcanzar la cabeza del nervio óptico, sin cruzar el rafe horizontal que se extiende desde la fóvea hasta la perifería retiniana temporal formando el límite virtual entre las M em a hem i retin i más mie n ocu p de l a tray e glau c Fi gu retin 1. h a tem p radi a disti n preli m reci b cabe z trav é a ntina, farm i rretinas su p i anas se en c periféricas n tras que la s p arán la por c a s regione s e ctoria arq u c omatosa. u ra 3: Esqu e a, en un oj o a z papilom p orales arc u a les nasales En la p o n guirse cu a m inar (RP L b e un aport e z a del ner v é s de las ar t acocinética y p erior e in f c uentran di s de la reti n s fibras pro c c ión más c e s superote m u eada haci a e ma de la d o izquierdo. m acular; 2. h u atas inferi o inferior. o rción ante r a tro regione L ), la porci ó e sanguíne o v io óptico, e t erias cilia r y tolerancia f erior (fig. 3 s puestas d e n a ocupará n c edentes d e e ntral del n e m poral e i n a la papila , d istribución h az de fibr a o r; 4. haz d e r ior del ne r s: la capa s ó n laminar o diferente e n sus porc i r es posterio ocula r 14 3 ). A nivel e manera q u n la porci ó e l polo post e rvio (Bartz, 1 n ferotempo r , serán po r retinotópi c a s temporal e fibras radi r vio óptic o s uperficial d y la retrol a (Mackenzie, 20 0 i ones preli m res cortas ( del disco ó u e, las fibra s ó n más pe r erior y las p 999) . Las fi b r al de la r r tanto, m á c a de la cap es arcuatas ales nasale s o o cabeza d e fibras n e a minar (RR L 0 8) . El prin c m inar, lami n ( ACPC), bi ó ptico, las f s proceden t r iférica (ex t p roximida d b ras retinia n r etina, que á s vulnerab l a de fibras superior; 3 s superior; 5 del nervio e rviosas (C S L ); cada u n c ipal aporte n ar y retrol en por ra m Introducci f ibras nervi o t es de las z o t erna) del N d es de la pa p n as procede n describen l es a la le s nerviosas d 3 . haz de fi b 5 . haz de fi b óptico pu e S FN), la re g n a de las c u de sangre aminar, lle g m as directas ó n o sas o nas N O, p ila, n tes una s ión d e la b ras b ras e den g ión u ales a la g a a o a Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 15 partir de ramas derivadas del círculo de Zinn-Haller; mientras que la arteria central de la retina (ACR) es la contribuye a la irrigación de la retina y de la capa superficial de fibras nerviosas del nervio óptico (fig. 4). Debemos considerar que el sistema ciliar funciona con una presión de perfusión menor que el sistema de la ACR, lo que condiciona una mayor vulnerabilidad de aquellas estructuras que como la lámina cribosa, solamente son irrigadas por el sistema ciliar (Ramírez, 2008). El drenaje venoso de la cabeza del NO ocurre exclusivamente a través de la vena central de la retina (VCR). Figura 4: Esquema de la vascularización de la cabeza del nervio óptico. (Reproducido de: Mackenzie PJ. et al. Vascular anatomy of the optic nerve head. Can J Ophthalmol. 2008; 43(3): 308-312). El humor acuoso (HA) es producido a nivel del cuerpo ciliar, por el epitelio no pigmentado de los procesos ciliares, a partir de un ultrafiltrado de plasma. Desde allí, se vierte a la cámara posterior del ojo, situada entre el iris y el cristalino, pasando Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 16 después a la cámara anterior a través de la pupila. Una vez en la cámara anterior del ojo, el HA es drenado por dos vías: la vía trabecular o la vía uveo-escleral (fig. 5). La vía trabecular es la vía convencional de evacuación, responsable del drenaje de aproximadamente el 80% del HA. En ella el humor acuoso fluye a través de la malla trabecular, situada a nivel del ángulo irido-corneal, hacia el canal de Schlemm. Una vez en la luz del canal, el HA es evacuado por los vasos colectores, alcanzando a través de las venas del acuoso, el sistema venoso espiescleral. La vía uveo-escleral es la vía no convencional, responsable del drenaje del 10% del HA restante. El humor acuoso es reabsorbido por el cuerpo ciliar pasando directamente al espacio supracoroideo, desde donde es drenado por la circulación venosa del cuerpo ciliar-coroides-esclerótica. Figura 5: Esquema-ilustración circulación del humor acuoso: producción a nivel de los procesos ciliares, paso desde la cámara posterior a la cámara anterior del ojo a través de la pupila, y drenaje a través de la malla trabecular, situada en el ángulo camerular. (Reproducido de: Kanski J. Oftalmología clínica. 5º edición. Ed. ElsevierEspaña. 2006). Trabéculum Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 17 El desequilibrio entre la producción y la eliminación del humor acuoso es la causa principal de aumento de la PIO. En este sentido, las terapias hipotesoras buscan la reducción de la PIO, bien aumentando el flujo de salida uveo-escleral del HA (prostaglandinas y mióticos) o bien disminuyendo su producción (betabloqueantes, alfa-2-agonistas e inhibidores de anhidrasa carbónica). 1.3.2.- Teorías etiopatogénicas La controversia sobre la fisiopatología del glaucoma ha comprendido básicamente dos teorías etiopatogénicas, la mecánica y la vascular, sin embargo, en los últimos años se habla de un tercer mecanismo, de tipo inmune, implicado en la génesis del glaucoma. 1.3.2.1.- Teoría mecánica Aunque el mecanismo exacto del daño glaucomatoso sobre la capa de células ganglionares es desconocido, se ha considerado tradicionalmente el aumento de la presión intraocular (PIO) como la causa esencial del glaucoma. Así, este aumento de la PIO, actuando sobre el tejido conectivo de la lámina cribosa (LC), originaría la compresión de los axones de las CGRs, interrumpiendo el flujo axonal retrógrado, y bloqueando la llegada de factores neurotróficos endógenos al soma de la célula ganglionar retiniana (Weinreb, 2004). Existen evidencias, tanto por estudios retrospectivos (Mao, 1991) como prospectivos (CNTGS, 1998; AGIS, 2000; Kass, 2002; Leske, 2003), de los beneficios del descenso de la PIO sobre el enlentecimiento de la progresión en la pérdida de función visual, en los pacientes con glaucoma. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 18 1.3.2.2.- Teoría vascular Según la teoría vascular, existiría un compromiso en el flujo sanguíneo capilar a nivel de la cabeza del nervio óptico, que originaría la isquemia y alteración funcional de las células ganglionares retinianas. Se ha visto como los descensos nocturnos no fisiológicos de la presión arterial y las amplias fluctuaciones circadianas de la presión de perfusión ocular se relacionan con el desarrollo y la progresión de la enfermedad glacuomatosa (Werne, 2008). Hay datos que sugieren la existencia de una alteración en los mecanismos de autorregulación vascular en el glaucoma, entre los cuales se ha encontrado una reducción en el flujo sanguíneo, tanto coroideo como a nivel de la cabeza del nervio óptico, sus fluctuaciones son mayores, en sujetos con glaucoma y que en ojos con PIO elevada, cuanto mayor es el índice de resistividad en la arteria oftálmica y en las arterias ciliares posteriores cortas, mayor es el riesgo de deterioro del campo visual (Martínez, 2005). Numerosos estudios han permitido evidenciar defectos de perfusión no sólo a nivel de la cabeza del nervio óptico sino también a nivel cerebral y retrobulbar, en los pacientes con glaucoma. Se dispone de distintos instrumentos para el estudio del flujo sanguíneo ocular (FSO), los cuales proporcionan información útil tanto para el diagnóstico como para el pronóstico de la enfermedad (Martínez, 2005). Sin embargo, el estudio del FSO presenta claras limitaciones, ya que no se dispone de un método único que permita evaluar los distintos lechos vasculares en una sola medición (cada instrumento permite determinar el FSO en un área concreta del globo ocular: retina, coroides, vasos retrobulbares, cabeza del NO), y los resultados obtenidos con cada una de las técnicas son difícilmente comparables (Caprioli, 2010). No obstante, los estudios del flujo sanguíneo ocular ayudarán a mejorar el enfoque terapéutico de los pacientes con glaucoma. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 19 1.3.2.3.- Teoría autoinmune Desde que Tezel y Wax en 1998 documentara la presencia de títulos elevados de anticuerpos frente a las proteínas de choque térmico (HSP) en pacientes con GNT, la concepción del glaucoma como una enfermedad autoinmune órgano-específica, está cada vez más extendida. El ojo y el cerebro se conocen como “órganos inmunoprivilegiados” en base a su capacidad para controlar sus reacciones inflamatorias en respuesta a las agresiones externas. A nivel del globo ocular, el humor acuoso y la cámara anterior, son las estructuras capaces de controlar dicha inmunogenicidad. Se ha podido demostrar la existencia de un incremento en la reactividad de anticuerpos frente a la alfa-fodrina (la principal proteína constituyente del citoesqueleto neuronal), en pacientes con GNT de poblaciones alemana y estadounidense, también demostrada en otras enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer (Grus, 2006). Aunque no está claro el mecanismo exacto de autoinmunidad en la enfermedad glaucomatosa, y si ésta es causa o consecuencia, se han podido detectar distintos patrones de autoanticuerpos tipo IgG frente a antígenos del nervio óptico y/o retinianos, en el humor acuoso de pacientes con glaucoma (glaucoma pseudoexfoliativo y primario de ángulo abierto). En algunos casos se habla de una sobreactivación del sistema inmune mientras que en otros se defiende una hipofunción del mismo, como la responsable de la falta de protección y mayor vulnerabilidad frente al glaucoma (Grus, 2008). Esto último, concordaría con la teoría de Schwartz, en la que mediante vacunación con antígenos específicos, se estimularía la respuesta inmune, confiriendo protección frente al glaucoma (Schwartz, 2003). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 20 Aunque son necesarios más estudios para comprender la relevancia de los autoanticuerpos en la patogenia del glaucoma, la posibilidad de demostrar una reactividad inmunológica específica frente a determinados antígenos oculares, en estos pacientes, sería de gran utilidad como test de screening, permitiendo un diagnóstico precoz de la enfermedad. Por uno u otro mecanismo, o lo que es más probable, por efecto combinado todos ellos, acontecerán una serie de cambios a nivel de la cabeza del nervio óptico, con pérdida del tejido nervioso axonal, activación del tejido glial y remodelación tisular, que llevarán en último término a la degeneración y muerte de la célula ganglionar retiniana (Wierzbowska, 2010): - Pérdida de tejido nervioso axonal: Se ha considerado tradicionalmente, que el daño inicial en el glaucoma, acontece a nivel de los axones de las CGRs. Sin embargo, parece que desde fases iniciales de la enfermedad, se produce una afectación de la célula ganglionar retiniana a distintos niveles, y que la degeneración final del soma celular estaría precedida no sólo por el daño axonal sino también por la pérdida de sus conexiones dendríticas con otras neuronas retinianas y de los centros superiores de la visión (Yücel, 2008). - Activación secundaria del tejido glial: La activación del tejido glial - microglía, astrocitos y células de Mülleren respuesta al estrés, mecánico o vascular, llevará a un desequilibrio en la expresión de genes y factores reguladores del ciclo celular, con sobreactivación de mediadores intracelulares como la óxido nítrico sintetasa-2 inducible (NOS-2), la ciclooxigenasa-2 (COX-2) o el factor de necrosis tumoral-2α (TNF-2α); así como a cambios en la morfología de las células, Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 27 comparación con los beta-bloqueantes y los agonistas alfa2-adrenérgicos, que se reducen a episodios de exacerbación del asma y disnea o disminución de la capacidad respiratoria en sujetos afectos de EPOC (Arranz-Márquez, 2002). Los análogos de prostaglandinas pueden usarse solos (en monoterapia - bimatoprost, latanoprost y travoprostparecen ser al menos tan efectivos como el maleato de timolol en el descenso de la PIO) o en combinación con otros fármacos antiglaucomatosos (Van der Valk, 2005). En muchos países europeos hay disponibles combinaciones fijas de análogos de prostaglandinas y maleato de timolol, que administradas una vez al día por la noche, han demostrado ser tan efectivas como los componentes de la combinación administrados juntos pero por separado (Van der Valk, 2005). 1.4.1.1.b.- Agonistas adrenérgicos (simpaticomiméticos) En el tratamiento médico del glaucoma se han utilizado tanto agonistas adrenérgicos no selectivos (epinefrina) como agonistas alfa2-selectivos (clonidina, apraclonidina y brimonidina). La epinefrina ha sido utilizada en el tratamiento del glaucoma durante casi un siglo, pero el desarrollo posterior de los agonistas alfa2adrenérgicos ha relegado su uso en el momento actual. Existen tres agentes alfa2-adrenérgicos de uso tópico ocular -clonidina, apraclonidina y brimonidinaque se diferencian fundamentalmente en su índice terapéutico, grado de selectividad, lipofilia y efectos adversos. Clonidina fue el primer agonista alfa-2 utilizado en el tratamiento del glaucoma. Su alta lipofilia facilita su penetración a nivel ocular pero también condiciona su aplicabilidad clínica por la facilidad para atravesar la barrera hematoencefálica y originar efectos Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 28 secundarios sistémicos como hipotensión arterial, sedación e incluso síncope. La apraclonidina es un derivado hidrofílico de la clonidina, lo que explica su baja penetración corneal y la dificultad para atravesar la barrera hematoencefálica, por lo que no asocia los efectos secundarios sistémicos de la clonidina. Es el menos alfa-2 selectivo de los tres, y debe su efecto hipotensor a un doble mecanismo: reduce la producción de humor acuoso debido a su acción alfa-1-vasoconstrictora sobre los procesos ciliares y reduce la presión venosa epiescleral disminuyendo la resistencia al drenaje del acuoso. En España hay comercializadas dos concentraciones de apraclonidina, al 1% formulada en monodosis, para uso en procesos agudos como profilaxis de picos hipertensivos tras procedimientos oftalmológicos con láser, y apraclonidina al 0,5% para tratamiento antiglaucomatoso crónico, aplicado dos o tres veces al día (Van der Valk, 2005). Prácticamente todos los efectos adversos de apraclonidina son de tipo local, en relación con su actividad alfa1-agonista, pero el efecto adverso que más ha limitado su uso clínico es la reacción de hipersensibilidad ocular inducida en los tratamientos prolongados (blefaroconjuntivitis alérgica y dermatitis), considerándose como tratamiento de segunda línea y fundamentalmente en terapia combinada con otros agentes hipotensores. La brimonidina es un compuesto lipofílico, con una alta penetración ocular a través de la córnea, y de los tres es el que presenta una mayor selectividad por los receptores alfa-2. Actúa fundamentalmente disminuyendo la producción de humor acuoso, aunque también podría tener cierto efecto facilitando el flujo de salida uveo-escleral. La SEUG incluye la brimonidina entre los fármacos de primera línea en el tratamiento del glaucoma en dos aplicaciones al día, especialmente en pacientes en tratamiento con betabloqueantes sistémicos, y en la profilaxis de picos hipertensivos tras tratamientos Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 29 oftalmológicos con láser (Tuulonen, 2003). Es el único fármaco antiglaucomatoso considerado dentro del grupo B de seguridad en el embarazo, no existiendo evidencia de efectos teratógenos en humanos aunque debe evitarse en el último trimestre del embarazo (Coleman, 2005). Debido a la capacidad de brimonidina de atravesar la barrera hematoencefálica, puede producir síntomas por depresión del SNC (astenia, somnolencia, falta de atención e hipotensión sistémica), por lo que no debe utilizarse en pacientes en tratamiento con antidepresivos tricíclicos o inhibidores de la monoaminooxidasa, ni en niños menores de 2 años. 1.4.1.1.c.- Beta-bloqueantes Su introducción a finales de los 70 supuso una verdadera revolución en el tratamiento del glaucoma. El maleato de timolol (1978) fue el primero en utilizarse en el tratamiento del glaucoma, y posteriormente se han ido poniendo a disposición del oftalmólogo otros principios activos de la misma familia, de los cuales los más utilizados en la actualidad son el carteolol, el betaxolol, y el levobunolol. Los bloqueantes beta-adrenérgicos actúan disminuyendo la producción de HA al actuar sobre los receptores beta del cuerpo ciliar. Su posología es de una gota cada 12 horas, con algunas excepciones, como el levobunolol que puede ser administrado una vez al día o el maleato de timolol que formulado en gel (Timogel®) puede utilizarse también en aplicación única diaria (Rouland, 2002). Los beta-bloqueantes tópicos se dividen en dos grupos: selectivos que bloquean únicamente los receptores beta-1 (betaxolol), y no selectivos que actúan sobre los receptores beta-1 y beta-2 (maleato de timolol, carteolol, levobunolol). Poseen una alta eficacia hipotensora y una buena tolerancia local, aunque su uso clínico se ve limitado por los efectos adversos Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 30 sistémicos que presentan. Contraindicados en casos de hiperreactividad bronquial (EPOC o asma), bradicardia sinusal, hipotensión arterial, bloqueos auricoventriculares, insuficiencia cardiaca congestiva, embarazadas durante el segundo y tercer trimestres de la gestación o pacientes con antecedentes de shock anafiláctico o reacciones alérgicas graves a medicamentos. La mayoría de los problemas de intolerancia local a los betabloqueantes tópicos son debidos a la utilización del cloruro de benzalconio (BAK) como conservante en sus formulaciones. Para disminuir la incidencia de efectos adversos locales se han desarrollado formulaciones sin conservantes, de las cuales Timabak® es la única comercializada en nuestro país. Los betabloqueantes son fármacos efectivos en la reducción de la PIO, y se dispone de una amplia experiencia en cuanto a su eficacia, seguridad y tolerabilidad. Sus contraindicaciones son bien conocidas, aunque algunas de ellas no han sido claramente probadas o no se ha demostrado su relación causal. 1.4.1.1.d.- Inhibidores de anhidrasa carbónica (IAC) Los inhibidores de la anhidrasa carbónica han formado parte del tratamiento médico del glaucoma desde mediados de los años 50. En el momento actual son el único tratamiento sistémico empleado como terapia crónica en el glaucoma, pero sus efectos adversos (anorexia, parestesias, litiasis renal y acidosis) han limitado de forma importante su uso en la clínica habitual. Actúan disminuyendo la producción de HA mediante la inhibición de la anhidrasa carbónica (isoenzima II) en los procesos ciliares y pueden ser utilizados en monoterapia o como tratamiento coadyuvante asociados a otros fármacos antiglaucomatosos. Se dividen en dos Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 31 grupos: los IAC sistémicos (acetazolamida) y los IAC tópicos (dorzolamida y brinzolamida). La acetazolamida es un IAC sistémico utilizado en el tratamiento del glaucoma. Los efectos adversos de acetazolamida cuando es administrada por vía oral (nauseas, parestesias, pérdida de peso, malestar general, pirosis, nefrolitiasis, aumento de la frecuencia miccional, hipopotasemia, acidosis metabólica, cefalea e incluso cuadros de anemia hemolítica y/o aplásica) se relacionan con la dosis administrada, por lo que no se recomienda iniciar el tratamiento con dosis muy elevadas. La dosis utilizada normalmente en la clínica oscila entre los 125 mg administrados 2 veces al día hasta los 250 mg administrados cada 8 horas. Dorzolamida se introdujo en el mercado como el primer IAC tópico para el tratamiento del glaucoma en 1995. Presenta una alta afinidad no sólo por la isoforma II sino también por la isoforma IV, lo que podría justificar un cierto efecto sobre el flujo sanguíneo ocular. Se utiliza en el tratamiento del glaucoma a una concentración del 2%, presentando un efecto terapéutico máximo a las 2 horas de su instilación, y una duración de más de 8 horas (Van der Valk, 2005). La brinzolamida se introdujo tres años después, en 1998, y presenta una estructura química similar a la de la dorzolamida pero más liposoluble. Estudios comparativos de eficacia pusieron de manifiesto que el efecto hipotensor de brinzolamida 1% era similar al de dorzolamida 2%, administrada 2 y 3 veces al día. En la práctica se utiliza brinzolamida al 1% porque concentraciones más elevadas no han demostrado mayor potencia hipotensora y sí mayores efectos adversos (Van der Valk, 2005). Los problemas de tolerancia de los IAC tópicos son básicamente locales, produciendo escozor y picor Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 32 ocular, queratitis punctata superficial, visión borrosa, urticaria y angioedema periocular, incluso vértigo, cefalea y/o miopización transitoria. 1.4.1.1.e.- Parasimpaticomiméticos (mióticos) En este grupo se incluyen compuestos capaces de producir respuestas biológicas mediante estimulación directa de los receptores colinérgicos (parasimpaticomiméticos) o bien inhibiendo la acción de la colinesterasa (anticolinesterásicos). Dentro del grupo de fármacos parasimpaticomiméticos que actúan sobre los receptores muscarínicos, la pilocarpina (de origen natural) es el único comercializado en España para el tratamiento del glaucoma. Otros agentes colinérgicos como el carbacol (de origen sintético), la fisostigmina (anticolinesterásico de efecto reversible) o el ecotiofato (anticolinesterásico de efecto irreversible) han encontrado utilidad oftalmológica por el efecto hipotensor derivado su acción constrictora sobre el músculo ciliar y el esfínter del iris (miosis), sin embargo, en el momento actual ninguno de ellos está disponible comercialmente en España para uso oftalmológico. La pilocarpina actúa sobre los receptores colinérgicos muscarínicos de la musculatura lisa ocular produciendo la contracción del esfínter del iris (miosis) y del músculo ciliar (acomodación) y originando una rotación del espolón escleral con la consiguiente dilatación y apertura de los espacios trabeculares, lo que favorece el flujo de salida del HA a su través. Se ha postulado un efecto directo de la pilocarpina sobre la malla trabecular, que no ha sido nunca demostrada. Desde su síntesis en 1876, la pilocarpina ha sido el miótico más utilizado en el tratamiento del glaucoma, tanto de ángulo abierto como de ángulo cerrado. Sin embargo, en nuestro medio se Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 33 encuentra en desuso como tratamiento crónico del glaucoma, en base a la corta duración de su acción y a sus efectos secundarios (cefalea, visión borrosa, hiperemia conjuntival y epífora, iridociclitis, cierre angular paradójico y tracciones vítreoretinianas que pueden aumentar el riesgo de desprendimiento de retina). En el momento actual sus usos terapéuticos son puntuales, utilizándose en el tratamiento del glaucoma agudo por cierre angular, previo a la realización de iridotomías láser. La capacidad de la pilocarpina para alterar la barrera hematoacuosa (BHA) contraindica su uso en los glaucomas neovasculares y/o uveíticos, y en todas aquellas situaciones en las que exista una reacción inflamatoria en la cámara anterior del ojo. Las novedades en el tratamiento médico antiglaucomatoso se centran, en el momento actual, en el perfeccionamiento de principios activos preexistentes para mejorar su tolerancia local, facilitar su administración y cumplimiento terapéutico; y en el descubrimiento de nuevas moléculas. En cuanto a productos ya comercializados, se está intentando mejorar su tolerancia local mediante la introducción de modificaciones en su formulación, como la sustitución de conservantes clásicos como el cloruro de benzalconio (BAK), por otros con menor toxicidad sobre la superficie ocular como el Polyquad (TravatanFree®), o como el diseño de presentaciones libres de conservantes (Saflután®) (Hommer, 2010). En cuanto a los nuevos principios activos podemos destacar las siguientes líneas de trabajo: Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 34 1.4.1.1.f.- Nuevos análogos de prostaglandinas A la lista de análogos de prostaglandinas existentes en el mercado, se unen otros nuevos que pretenden mejorar su potencia farmacológica. Dos análogos de prostaglandinas de segunda generación, el AR-102 y el PF-03187207 se encuentran en fase de investigación. Respecto al AR-102, ha demostrado en ensayos preclínicos una eficacia hipotensora superior a la de latanoprost con resultados de tolerancia óptimos e incluso superiores a los de travoprost. En cuanto al PF-03187207, es un análogo de PGF2α que asocia propiedades de donante de moléculas de óxido nítrico, potenciando el efecto hipotensor del análogo de PGs con el efecto añadido de la relajación del músculo ciliar. Sin embargo, a partir de los resultados de ensayos preclínicos parece que esta molécula no va a ser finalmente comercializada (Wierbowska, 2010). 1.4.1.1.g.- Agonistas de receptores serotoninérgicos Recientemente se ha identificado la presencia de receptores serotoninérgicos 5HT2 a nivel del músculo ciliar y del trabéculum, lo que podría suponer una nueva diana terapéutica. En modelos de glaucoma experimental en monos se ha probado la eficacia de un agonista selectivo 5-HT2, el R-DOI 0.5%, que administrado por vía tópica una vez al día, consigue reducir la PIO aumentando el del flujo de salida uveoescleral (Gabelt, 2005). 1.4.1.1.h.- Derivados cannabinoides Se ha identificado la expresión de receptores cannabinoides (CB1) en células del epitelio no pigmentado del cuerpo ciliar y en la malla trabecular de ojos de rata, oveja y de humanos, así como en el músculo ciliar de ojos humanos, lo que justificaría Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 35 la capacidad potencial de la marihuana y otros derivados cannabinoides (tetrahidrocannabinol (THC)) para reducir la PIO por un doble mecanismo: incrementando el flujo de salida uveo-escleral y disminuyendo la producción de HA. Lo que no se ha podido demostrar todavía, es si el efecto hipotensor de los cannabinoides es producido directamente por su acción sobre el receptor CB1 o indirectamente, al inducir la síntesis de prostaglandinas (PGE2 y PGF2α) (Pinar-Sueiro, 2011). 1.4.1.1.i.- Antagonistas de receptores esteroideos Mifepristona es un antagonista específico de receptores glucocorticoideos, que administrada por vía tópica en ojos de conejo, ha mostrado capacidad para controlar las elevaciones de PIO inducidas por sobreexposición a dexametasona. En ensayos clínicos en fase II, se ha evaluando el papel de una formulación de mifepristona tópica (RU486) en el tratamiento de la HTO secundaria al uso de corticoides y del glaucoma corticoideo con buenos resultados (Novack, 2007). 1.4.1.1.j.- Inhibidores de la Rho-kinasa y estatinas Se investiga el uso en el tratamiento del glaucoma de agentes capaces de disminuir la PIO mediante modulación del drenaje del HA a través de la malla trabecular (“mecanismo trabecular”). En este grupo estarían, por una parte, aquellos agentes capaces de modificar el volumen y la forma de las células endoteliales trabeculares así como sus uniones intercelulares, produciendo lo que en el año 1979, Kaufman denominó “trabeculocanalotomía farmacológica”; y por otra, aquellas sustancias capaces de modular la contractilidad de la malla trabecular mediante inhibición de sistemas enzimáticos específicos implicados en la interacción de fibras de actina y miosina del citoesqueleto de las células trabeculares. En este sentido, se Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 36 ha demostrado la capacidad in vitro de los inhibidores de la Rho-kinasa, como el Y27632, de inducir cambios en la morfología de las células endoteliales trabeculares y en sus uniones intercelulares, facilitando el drenaje del HA a través de la malla trabecular (Koga, 2006). También se han sugerido propiedades adicionales de los inhibidores de la Rho-kinasa, como el aumento del flujo sanguíneo ocular, la protección de las CGRs y la regeneración axonal, que potenciarían su eficacia terapéutica en el glaucoma desde la perspectiva de la neuroprotección (Rao, 2007). Por otra parte, las estatinas, habitualmente utilizadas como fármacos hipolipemiantes, han demostrado capacidad para inducir cambios en la morfología y contractilidad de las células de la malla trabecular mediante la inducción de modificaciones en su citoesqueleto. Dentro de esta familia, lovastatina ha mostrado su eficacia hipotensora en condiciones experimentales in vitro, al facilitar el drenaje del HA por vía trabecular (Song, 2005). En cualquier caso, la decisión de tratar o no a un paciente, así como la decisión del fármaco con el que iniciar el tratamiento, debe hacerse de manera individualizada, considerando en cada caso: el estadio del daño glaucomatoso, el nivel de PIO, la edad y la esperanza de vida del paciente, y la existencia de otros factores de riesgo asociados (Vass, 2007). La ineficacia de las terapias médicas hipotensoras es debida, en parte, a la baja adhesividad y falta de cumplimiento terapéutico de los pacientes, lo que hace necesaria la búsqueda de nuevas fórmulas que mejoren la tolerancia y simplifiquen las posologías de administración. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 43 en una estrategia que se ha venido a denominar “terapia completa del glaucoma” (Cheung, 2008). 1.4.2.1.a.- Bloqueantes de canales de calcio Se ha sugerido el efecto neuroprotector de los bloqueantes de canales de calcio (BCC), en base a su capacidad para neutralizar las corrientes de Ca2+ inducidas por la sobreactivación de los receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) del glutamato. De hecho, uno de los primeros ensayos clínicos sobre neuroprotección fue el llevado a cabo por Sawada en 1996, sobre la eficacia neuroprotectora del fumarato de brovincamida por vía oral en pacientes con glaucoma normotensivo (GNT), en el que mostró los efectos beneficiosos del tratamiento sobre el campo visual, aunque con resultados no significativos. Más tarde, Koseki y colaboradores (1999) diseñaron un estudio similar, cuyos resultados sugerían también la capacidad de brovincamida para retrasar el deterioro campimétrico en pacientes con GNT, aunque finalmente, sus autores atribuyeron este resultado, más a una posible mejoría en la función cerebral derivada del efecto vasodilatador del fármaco que al efecto neuroprotector del fármaco en sí mismo (Koseki, 1999). También se ha probado la eficacia neuroprotectora de flupirtina en modelos animales de HTO transitoria, en los que ha conseguido frenar la pérdida de células ganglionares retinianas (Nash, 2000). Otros BCC, como nimodipino o nifedipino, han sido probados como agentes neuroprotectores con resultados diversos. Mientras que en ensayos clínicos hospitalarios unicéntricos han demostrado un efecto beneficioso sobre la función visual en pacientes con GAA, éste hecho no ha sido confirmado en estudios caso-control (Araie, 2011). Por su parte, verapamilo aunque ha sido capaz de lograr reducciones significativas de la PIO, con una potencia Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 44 comparable a la del maleato de timolol tanto en modelos animales de glaucoma como en humanos, sólo ha mostrado capacidad neuroprotectora teórica en modelos de glaucoma experimental en conejos. A pesar de los alentadores resultados alcanzados con los BCC en ensayos clínicos de isquemia cerebral aguda, éstos no son directamente extrapolables a otras enfermedades neurodegenerativas de curso crónico como el glaucoma (Araie, 2011). 1.4.2.1.b.- Bloqueantes beta-adrenérgicos Los beta-bloqueantes (BB) deben su efecto neuroprotector a la capacidad añadida de bloquear canales de sodio y calcio (tipo L), reduciendo de esta manera, la entrada masiva de Ca2+ a la célula, en condiciones de sobreexcitación. Betaxolol, utilizado habitualmente como hipotensor tópico en humanos, ha demostrado en cultivos de células neuronales capacidad para frenar las corrientes de Ca2+ inducidas por glutamato, y ha mostrado efecto neuroprotector frente a la isquemia retiniana en conejos y frente a la citotoxicidad NMDA-inducida en ratas, tras su administración tópica (Osborne, 1999); lo que justificaría su potencial uso como terapia neuroprotectora en el glaucoma. Sin embargo, la potencia con la que betaxolol bloquea dichas corrientes de Ca2+ parece que no es suficiente como para poder ser utilizado como un verdadero neuroprotector en la práctica clínica (García-Campos, 2007). Por su parte, la aplicación tópica de maleato de timolol ha mostrado capacidad para frenar la pérdida de CGRs tanto en modelos experimentales in vitro de neurotoxicidad inducida por glutamato como en modelos in vivo de isquemia retiniana en ratas (Goto, 2002). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 45 1.4.2.1.c.- Agonistas alfa-adrenérgicos El efecto neuroprotector de los agonistas alfa-adrenérgicos es bien conocido a nivel del SNC. Se ha demostrado la capacidad de la clonidina para al estimular la producción de factores neurotróficos como el BDNF, y del factor de crecimiento fibroblástico (FGF-b), los cuales actuarían promoviendo la trascripción de genes de supervivencia y bloqueando la síntesis de proteínas pro-apoptóticas en la célula neuronal (Chao, 2000). Brimonidina ha conseguido mejorar la supervivencia de CGRs en modelos experimentales de daño neuronal retiniano por isquemia (Vidal-Sanz, 2001), compresión el nervio óptico y/o hipertensión ocular (WoldeMussie, 2001). Frente a clonidina, los agonistas alfa2-adrenérgicos más selectivos como brimonidina, no tienen efecto vasoconstrictor asociado, lo que los hace más útiles en la práctica clínica. Existen datos de niveles de brimonidina en vítreo tras su administración tópica (brimonidina 0.2 y 0.5%) en animales (Acheampong, 2002) y en humanos (Kent, 2001), alcanzando concentraciones superiores al valor de la CE50 de activación de receptores alfa2adrenérgicos retinianos (Concentración eficaz-50), aunque se desconoce la concentración a la cuál esta molécula tiene efecto neuroprotector sobre la célula ganglionar retiniana. 1.4.2.1.d.- Antagonistas de receptores NMDA del glutamato El concepto de excitotoxicidad neuronal, al que cada vez se le concede un papel más importante en la patogenia del glaucoma, hace referencia al fenómeno de muerte celular programada (apoptosis), inducida por la presencia de niveles excesivos de glutamato en el medio extracelular. El glutamato es el principal neurotransmisor excitador del SNC y la retina (Thoreson, 1999), y su sobreexpresión ha sido identificada Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 46 como uno de los mecanismos implicados en la degeneración secundaria de las CGRs en el glaucoma. Aunque hay distintos tipos de células retinianas que expresan receptores NMDA, las CGRs presentan una mayor vulnerabilidad a los efectos citotóxicos del glutamato, lo que podría justificar en parte, la pérdida selectiva de este tipo celular en el glaucoma, tal y como han demostrado las experiencias in vitro (Luo, 2001). Por esta razón, el bloqueo de la excitotoxicidad mediada por la liberación masiva de glutamato, en respuesta a la degeneración primaria de la célula ganglionar, constituye una estrategia terapéutica muy interesante en el glaucoma (Lipton, 2004). Se ha probado la eficacia de distintos antagonistas de los receptores NMDA del glutamato para frenar la pérdida de CGRs en distintos modelos experimentales de daño retiniano en ratas (WoldeMussie, 2002). Entre ellas, el MK801 (5-methyl-10,11-dihidro5H-dibenzociclohepteno-5,10-imina), un antagonista no competitivo de los receptores NMDA, posiblemente el mejor conocido, ha mostrado propiedades neuroprotectoras en modelos experimentales de HTO en ratas, tras su administración intraperitoneal (Chaudhary, 1998). Sin embargo, su aplicación clínica se ha visto limitada en la práctica, por el efecto neurotóxico derivado de su alta afinidad por el receptor, interfiriendo en las sinapsis fisiológicas del glutamato. Por su parte, memantina (derivado de amantadina) es un antagonista de receptores NMDA del glutamato, aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, que se diferencia de otros antagonistas NMDA en su moderada-baja afinidad por el receptor y en una rápida cinética de unión al mismo. Estas propiedades hacen de memantina un agente eficaz en el bloqueo de la actividad glutamatérgica excesiva sin interferir en el funcionamiento normal del SNC, mejorando así su tolerancia frente a otros antagonistas NMDA (Chen, 2006). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 47 1.4.2.1.e.- Inhibidores de la agregación de proteína β-amiloide Enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la corea de Huntington, se han caracterizado desde el punto de vista histopatológico por la presencia a nivel cerebral de placas seniles formadas por agregación de proteína amiloide-β (Aβ), resultante de un procesamiento anómalo del precursor de proteína amiloide (APP) en las células nerviosas. Se ha demostrado, en pacientes con glaucoma y en modelos de glaucoma experimental en ratas, que existe un aumento de los niveles de Aβ en las CGRs, coincidiendo con un fallo en el procesamiento del APP, inducido por la activación de las caspasas (McKinnon, 2002). De esta manera, la implicación de la proteína Aβ en la apoptosis de la célula ganglionar retiniana en el glaucoma, proporciona una nueva diana terapéutica para el control de la enfermedad. Se ha probado la eficacia de tres agentes capaces de inhibir la agregación de proteína Aβ en la célula ganglionar: el rojo Congo, un anticuerpo anti-A (A-ab) y un inhibidor de secretasa, cuya combinación consiguió reducir de manera importante (> 80%) la apoptosis de CGRs en modelos de HTO inducida, mostrando cierta superioridad del anticuerpo anti-A respecto a los otros dos (Guo, 2007). Se ha reconocido la implicación de las proteínas de choque térmico (HSP, de las siglas en inglés “Heat Shock Proteins”) en la fisiopatología de distintos procesos neurodegenerativos y entre ellos del glaucoma (Tezel, 2000). Constituyen una familia de proteínas, clasificadas según su peso molecular (HSP-90, HSP-72, HSP-70, HSP-60, HSP-25) capaces de prevenir la agregación intracelular de proteínas desnaturalizadas. Se ha demostrado en modelos de glaucoma experimental en ratas, como el tratamiento con geranil-geranil-acetona induce la expresión de HSP-72 en las CGRs, Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 48 protegiéndolas frente al daño glaucomatoso (Ishii, 2003). Aunque todavía no se han desarrollado ensayos clínicos que prueben la eficacia de este compuesto en pacientes con glaucoma, se prevé una buena eficacia y tolerancia tras su administración por vía oral. 1.4.2.1.f.- Factores neurotróficos No se conoce exactamente el papel de los factores neurotróficos endógenos o neurotrofinas (NT), en la supervivencia de la célula ganglionar retiniana tras la lesión del nervio óptico. Las neurotrofinas son una familia de moléculas peptídicas (entre las que se incluyen factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), las neurotrofinas NT-3, NT-4/5 y NT-6, responsables de promover el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de las células neuronales, mediante interacción con receptores específicos (TrkA, TrkB, TrkC y p75NTR). La privación de factores neurotróficos puede inducir a la apoptosis de las células nerviosas, y de hecho, las experiencias de diversos autores como Anderson (1974), Quigley (1976), Mansour-Robaey (1994) o Meyer-Frank (1995) avalan su implicación en la apoptosis de las CGRs en el glaucoma (Johnson, 2009). La administración del BDNF mediante inyección intravítrea ha mostrado capacidad para mejorar la supervivencia de las CGRs en modelos de glaucoma experimental, tras sección del nervio óptico y/o isquemia retiniana, tanto en ojos de rata como de mamíferos superiores (Chen, 2001). El factor neurotrófico ciliar (CNTF) es una citoquina con función trófica (estructuralmente no relacionado con las neurotrofinas), implicada en la supervivencia neuronal, que ha demostrado la protección de las CGRs en modelos animales de hipertensión ocular en ratas, aunque Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 49 con menor eficacia que el BDNF (Ji, 2004). Sin embargo, la aplicación clínica de NTs se ha visto condicionada por su baja especificidad (unión a ambos subtipos de receptores Trk y p75), provocando la activación de múltiples vías de señalización intracelular, con efectos pro-apoptóticos no deseados. Por su baja biodisponibilidad y dificultad para alcanzar concentraciones eficaces en el segmento posterior del ojo, dada su naturaleza polipeptídica (rápida degradación proteolítica y dificultad para atravesar las barreras hematoa-cuosa y hemato-retiniana por su elevado peso molecular), se está probando la administración de moléculas no peptídicas capaces de estimular la actividad trófica en el tejido retiniano dañado, como la idebenona (1994) y/o el clenbuterol (1998), entre otras, que han demostrado ser eficaces en modelos de daño cerebral isquémico y en algunas neuropatías ópticas (Barnils, 2007), sin embargo, no se ha divulgado su uso específico en el tratamiento del glaucoma. 1.4.2.1.g.- Inhibidores de caspasas La terapia antiapoptótica mediante inhibidores de caspasas, ha sido probada con resultados modestos en el campo de la neuroprotección. El BIRC4, es un inhibidor de caspasas (caspasas 3, 7 y 9), que ha demostrado capacidad para reducir la pérdida axonal, en modelos de glaucoma experimental en ratas (McKinnon, 2002). Sin embargo, la disfunción mitocondrial que acontece en el proceso de muerte de la célula ganglionar, con liberación masiva de RLO, puede continuar aún en caso de bloqueo de la actividad de las caspasas. Por otro lado, se ha demostrado la capacidad de IQACRG, un inhibidor de la caspasa-1, de proteger la célula ganglionar retiniana frente al daño inducido por la excitotoxidad del glutamato, mediante bloqueo de la producción de la interleucinaβ (IL-β) e inhibición de la metaloproteinasa-9 (MMP-9). La ventaja del Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 50 IQACRG frente a otros agentes inhibidores de caspasas reside en la reversibilidad de su efecto (Seki, 2010). 1.4.2.1.h.- Activadores de PI3 kinasa/Akt kinasa La eritropoyetina (EPO) es un factor de crecimiento hematopoyético que regula y promueve la proliferación, diferenciación y supervivencia de los progenitores de los eritrocitos. La unión de la EPO a su receptor específico (EPOR), identificado en la superficie de las CGRs así como de otras células retinianas, induce la activación de una cascada de señalización intracelular en la que se encuentran implicadas, entre otros mediadores, la PI3-kinasa/Akt-kinasa. Se ha podido comprobar cómo la EPO promueve la regeneración de neuronas del SNC al inhibir la apoptosis neuronal por activación de la vía de la PI3kinasa/Akt. La administración sistémica de EPO ha mostrado efecto neuroprotector en distintos modelos de daño neuronal cerebral, accidente vascular cerebral, trauma mecánico o excitotoxicidad mediada por glutamato (Kretz, 2005). Además, se ha comprobado en condiciones in vitro, la capacidad de la EPO para prevenir la muerte de las CGRs inducida por efecto tóxico del glutamato y del óxido nítrico (Yamasaki, 2005). El tratamiento sistémico con EPO es capaz de reducir la pérdida de CGRs en modelos de glaucoma-genéticamente inducido en ratones (DBA/2J), con una eficacia similar a la mostrada por memantina. Además, la EPO posee propiedades angiogénicas añadidas, que mejorando el aporte sanguíneo y la oxigenación de la retina, favorecerían la supervivencia de las CGRs por un mecanismo vascular añadido (Zhong, 2007). De cualquier manera, directa (mediante inhibición de mediadores de apoptosis) o indirectamente (incrementando del flujo sanguíneo), la EPO es capaz de prevenir la Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 51 pérdida de CGRs y se presenta como un potencial complemento a las terapias hipotensoras tópicas en el tratamiento del glaucoma. 1.4.2.1.i.- Estabilizadores de la función mitocondrial La disfunción mitocondrial que acontece en el glaucoma, en respuesta a distintos mediadores (hipoxia, aumento del TNF-α extracelular, entrada masiva de Ca2+ en la célula), se asocia con un incremento del estrés oxidativo y sobreproducción de radicales libres del oxígeno (RLO), activándose los mecanismos de apoptosis de la célula ganglionar. En este sentido la coenzima Q10 (Coq10) ejerce un efecto neuroprotector de tres maneras: aumentando la función del complejo-I en la cadena de transporte de electrones mitocondrial, inhibiendo la acción del factor nuclear-B (NFB) (factor de trascripción implicado en procesos inflamatorios, autoinmunes y en procesos neoplásicos) y modulando la permeabilidad de los transportadores de membrana mitocondriales. La aplicación intraocular de CoQ10 ha mostrado efecto neuroprotector en modelos experimentales de isquemia retiniana e hipertensión ocular, en ratas, al frenar la muerte de CGRs (Nucci, 2007). 1.4.2.1.j.- Antioxidantes y secuestradores de RLO Se cree que el estrés oxidativo juega un papel importante en la degeneración de la célula ganglionar retiniana en el glaucoma. En modelos de glaucoma experimental, así como en el humor acuoso de pacientes con GAA, se ha constatado una producción excesiva de RLO y productos de peroxidación lipídica, junto a una reducción en los niveles de glutation reducido (Ferreira, 2004). La vitamina E y sus derivados (tocoferoles) son la principal fuente de antioxidantes liposolubles para la célula, actuando como secuestradores de radicales peróxido. Algunos estudios han probado con éxito la Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 52 eficacia neuroprotectora de la vitamina E y de otros agentes antioxidantes, en modelos experimentales de daño isquémico retiniano en ratas (Dilsiz, 2006). El extracto de Ginkgo biloba (EGb 761) ha demostrado capacidad para incrementar la supervivencia de las CGRs en modelos experimentales de glaucoma crónico en ratas. Se creía que el efecto de este compuesto derivaba de su poder antioxidante como secuestrador de RLO, pero recientemente se ha sugerido también su actuación a nivel de los receptores NMDA del glutamato (Hirooka, 2004). 1.4.2.1.k.- Inhibidores de óxido nítrico sintetasa La oxido nítrico sintetasa-2 inducible (NOS-2) juega un papel importante en la degeneración axonal de la célula ganglionar retiniana. El bloqueo de la actividad de esta enzima podría representar una potencial estrategia terapéutica en el glaucoma y en otras neuropatías. La inhibición de la NOS-2 mediante la utilización de 2aminoguanidina en un modelo de hipertensión ocular en ratas, redujo la pérdida de células ganglionares, en alrededor de un 70% (Neufeld, 2004). Sin embargo estos resultados no han podido ser reproducidos en otros modelos de glaucoma experimental ni se han publicado hasta el momento ensayos clínicos en humanos que confirmen estos resultados. 1.4.2.1.l.- Inmunoactivadores Las nuevas líneas de trabajo estudian el posible efecto neuroprotector de la activación local del sistema inmune en respuesta al daño axonal. La activación de células T frente a antígenos del nervio óptico dañado, como la proteína básica de la mielina, conduciría a la liberación de neurotrofinas a ese nivel, favoreciendo la supervivencia de las CGRs (Schwartz, 2003). Este efecto neuroprotector inmunomediado, Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 59      MemNH HNMemH Ka    3 2 Por tanto, en base a su carácter anfipático, memantina puede atravesar fácilmente las membranas biológicas cuando se presenta en su forma neutra (H2NMem) mientras que su forma ionizada (H3N+Mem) es altamente retenida en los compartimentos y organelas intracelulares, justificando así que memantina pueda alcanzar concentraciones intracelulares por encima de las concentraciones extracelulares observadas, a pH fisiológico (Kornhuber, 1995). 2.2.- COMPORTAMIENTO FARMACOCINÉTICO Memantina tiene una biodisponibilidad absoluta cuando se administra por vía oral de aproximadamente el 100% (McKeage, 2009), alcanzando concentraciones plasmáticas máximas (Tmax) entre las 3-8 horas, no habiendo indicios de la influencia de la ingesta de alimentos en la velocidad de absorción de memantina tras su administración por vía oral. Dosis diarias de memantina de 20 mg por vía oral, producen concentraciones plasmáticas estables que oscilan entre los 70-150 ng/mL (0.5 - 1 µM) a los 21 días del inicio del tratamiento, aunque con importantes variaciones interindividuales (Kornhuber, 2005; McKeage, 2009). Al administrar dosis diarias de memantina de 5-30 mg por vía oral se obtiene un índice medio de concentraciones LCR/plasma de 0.52. El volumen de distribución tras su administración por vía oral es de aproximadamente 10 L/kg y aproximadamente el 45% de la memantina en sangre se encuentra unida a proteínas plasmáticas (Kornhuber, 1995). Memantina ha Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 60 mostrado alta afinidad por proteínas titulares, como la melanina, con una capacidad máxima de unión de 140 nmoles/mg y una constante de disociación relativamente baja (Hughes, 2005). Los principales metabolitos de degradación de memantina en humanos son el N-3,5-dimetil-gludantano, y la mezcla isomérica de 4y 6-hidroxi-memantine y 1nitroso-3,5-dimetil-adamantano, y ninguno de estos metabolitos muestra actividad antagonista NMDA. No se ha detectado in vitro metabolismo catalizado por la citocromo P450. Memantina se excreta en más del 90% por vía renal, de manera monoexponencial, con una T½-terminal de 60-100 horas. En voluntarios, con función renal normal, el aclaramiento total (CL) asciende a 170 mL/min/1.73 m2 y parte del aclaramiento total renal se logra por secreción tubular (McKeage, 2009). Estudios en voluntarios sanos han demostrado una farmacocinética lineal para memantina en el intervalo de dosis de 10 a 40 mg/día, siendo éstas las dosis consideradas teóricamente terapéuticas (McKeage, 2009). Para una dosis de memantina por vía oral de 20 mg/día, los niveles de fármaco alcanzados en LCR concuerdan con el valor de la constante de inhibición (Ki) de los receptores NMDA postsinápticos de neuronas del cortex frontal humano (Ki= 0.5 µM) (Kornhuber, 1995). 2.3.- TOLERANCIA Y SEGURIDAD DE MEMANTINA 2.3.1.- Estudios de toxicidad en animales de experimentación Estudios preclínicos de toxicidad aguda con memantina en roedores, tras administración oral y endovenosa, demostraron una baja toxicidad de la sustancia, con una dosis letal ≥ 300 mg/kg/día, y síntomas de ataxia y bradipnea precediendo el Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 61 momento de la muerte (Forest Pharmaceuticals, 2003). En estudios de toxicidad crónica, memantina ha mostrado signos de toxicidad a nivel del SNC, con fenómenos de vacuolización (lesiones de Olney) y necrosis de neuronas del sistema piramidal, similares a los documentados tras la administración de otros antagonistas NMDA, produciendo síntomas de ataxia, inestabilidad, bradipnea, temblor, agresividad e hiperexcitabilidad en ratas, y de apatía y estupor en perros (Forest Pharmaceuticals, 2003). Sin embargo, la dosis de memantina libre de efecto, en cuanto a toxicidad neurológica, se sitúa seis veces por encima de las dosis máximas terapéuticas recomendadas en humanos (20 mg/día). Solamente tras la administración de memantina en dosis altas (suficientemente altas como para producir la muerte del animal) se han documentado efectos tóxicos a nivel ocular en algunas especies animales (ratas y perros) (López-Pousa, 2007), en forma de opacidades corneales, edema corneal y/o degeneraciones del endotelio corneal; siendo la dosis de memantina libre de efecto, en cuanto a toxicidad ocular, de 8 a 44 veces superior a las dosis máximas recomendadas clínicamente en humanos, de lo que se deduce la existencia de un amplio margen de seguridad ocular para memantina (Physicians Desk Referente, 2004). La administración oral de 4 mg/Kg/día de memantina, durante 15 días en monos, alcanzando concentraciones plasmáticas por debajo de 2 µM, no mostró signos de toxicidad retiniana en el análisis histológico ni interferencia en el procesamiento retiniano de la señal visual, evaluado mediante electrorretinografía (ERG) y potenciales evocados visuales (PEV) (Hare, 2004(I)). Memantina no ha mostrado potencial mutagénico en las pruebas estándar de genotoxicidad (Forest Pharmaceuticals, 2003). En ratones, el tratamiento con memantina a dosis de 40 mg/Kg/día durante 113 semanas no mostró indicios de carcinogenicidad Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 62 ni tampoco en ratas, tras 71 semanas de tratamiento con dosis de 40-20 mg/kg/día (Thakur, 2002). Estudios en conejos han demostrado que existe paso de memantina a través de la placenta. La administración oral de memantina en ratas (18 mg/Kg/día) y en conejos (30 mg/Kg/día), en periodo de gestación, indujo problemas de bajo peso y retraso en el crecimiento intrauterino de las crías, sin embargo, no provocó efectos teratógenos, situándose estas dosis por encima de las recomendadas en humanos (Forest Pharmaceuticals, 2003). 2.3.2.- Estudios de toxicidad en humanos No hay evidencias clínicas de que el tratamiento con memantina en mujeres embarazadas incremente el riesgo de malformaciones fetales, ni de si existe paso del fármaco a la leche materna, pero se aconseja tener precaución en la utilización del mismo en estos casos (Forest Pharmaceuticals, 2003). Aunque no se dispone de datos farmacocinéticos suficientes de memantina en pacientes con insuficiencia renal o hepática, es de esperar un modesto efecto sobre el aclaramiento de la sustancia en estos casos que podría incrementar el tiempo de exposición, recomendándose una reducción de la dosis diaria administrada (5 mg/12 horas) pacientes con insuficiencia renal severa (Periclou, 2006). Condiciones de incremento del pH urinario, por ejemplo por dietas estrictas (vegetarianas o carnívoras), por infecciones graves del tracto urinario o por la toma de medicaciones concomitantes como los inhibidores de anhidrasa carbónica o el bicarbonato sódico, pueden disminuir la eliminación renal de memantina incrementado sus niveles en Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 63 plasma, debiéndose usar con precaución en estos casos (McKeage, 2009). No se ha estudiado el efecto de los trastornos hepáticos en la farmacocinética de memantina, pero ya que memantina se metaboliza en una baja proporción en el hígado y sus metabolitos resultantes son inactivos, no se prevén en principio, cambios clínicos relevantes en pacientes con insuficiencia hepática leve-moderada (McKeage, 2009). No hay ensayos clínicos controlados sobre seguridad y eficacia de memantina en niños. Los efectos adversos documentados en ensayos clínicos-controlados en humanos, incluyen como frecuentes: vértigos y mareos (7%), estreñimiento (5%), vómitos (3%), hipertensión arterial (4%), dolor de cabeza (6%), fatiga (2%), somnolencia (3%), confusión (6%) y alucinaciones (3%), principalmente en pacientes con enfermedad de Alzheimer grave; y como poco frecuentes: insuficiencia cardiaca (1/100 pacientes), alteraciones de la marcha, ataxia e hipoquinesia (1/100 pacientes), ACV (1/100), trombosis venosa y fenómenos tromboembólicos (1/100 pacientes), con una incidencia similar a la del grupo placebo. Se han notificado solamente casos aislados de pancreatitis y reacciones psicóticas postcomercialización (Forest Pharmaceuticals, 2003). El tratamiento con memantina a dosis de 5-30 mg/día por vía oral, en pacientes con demencia leve-moderada (alcanzando concentraciones plasmáticas próximas a 1 µM) no ha revelado efectos secundarios a nivel ocular ni interferencias en la función visual (Kornhuber, 1995). Hay pocos datos sobre intoxicación o sobredosis de memantina en humanos. La ingesta de más de 400 mg de memantina se ha relacionado con la aparición de inquietud, psicosis, alucinaciones visuales, convulsiones, somnolencia, estupor y coma. No existe un antídoto específico para revertir sus efectos en caso de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 64 sobredosificación, debiendo realizar un tratamiento sintomático en estos casos (Physicians Desk Referente, 2004). 2.4.- MECANISMO DE ACCIÓN Memantina es un derivado de la amantadina, perteneciente a la familia de los antagonistas del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) del glutamato, que actúa como bloqueador del canal iónico asociado a dicho receptor. Existen distintos tipos de receptores del glutamato (tres de ellos son ionotrópicos: los receptores AMPA, los receptores NMDA y los receptores kainato; y un cuarto que es metabotrópico, y que se asocia al sistema del segundo mensajero mediante proteínas de fijación al nucleótido de guanina), siendo los receptores NMDA de tipo ionotrópico, los implicados en el daño glaucomatoso. El receptor NMDA, está constituido por distintas subunidades -2 subunidades NR1 y 2 subunidades NR2que se disponen formando un complejo receptor-canal iónico. En condiciones fisiológicas el ión Mg2+ regula la conductancia del canal iónico Na+- Ca2+ por un mecanismo voltaje dependiente. De manera que, en condiciones de potencial de membrana en reposo (-), el poro del canal se encuentra bloqueado por la presencia de un ión Mg2+. Cuando el glutamato se une al receptor, induce la despolarización de la célula (potencial de membrana (+)), produciendo un cambio transitorio en la configuración del canal, de manera que el ión Mg2+ es desplazado y el canal queda abierto, permitiendo la entrada de Ca2+ y Na+ dentro de la célula (Lipton, 2004). En condiciones fisiológicas, el glutamato y la glicina (co-agonista del glutamato) se unen al receptor NMDA induciendo un cambio de conformación en el Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 65 mismo con liberación del ión Mg2+, que normalmente se encuentra bloqueando el poro del canal, permitiendo la entrada de Ca2+ y Na+ a la célula (Lipton, 2004). En condiciones patológicas de sobreexcitación, el exceso de glutamato en el espacio intersináptico (por sobreproducción o por defecto de recaptación) induce la apertura permanente del canal iónico, con la entrada masiva de Ca2+ dentro de la célula (Cheung, 2008). Las altas concentraciones de Ca2+ intracelular interferirán en la función mitocondrial, disparando la producción de RLO y la activación de proteasas y fosfolipasas, induciendo la entrada de la célula en apoptosis (fig. 7). Figura 7: Esquema del receptor-canal NMDA del glutamato, representando el lugar de unión de memantina a dicho receptor y de otros antagonistas NMDA, que coincide con el lugar habitualmente ocupado por el ión Mg2+en el poro del canal. (Reproducido de: Lipton SA. et al. Failures and Successes of NMDA Receptor Antagonists: Molecular basis for the Use of Open blockers like Memantine in the treatment of Acute and Chronic Neurologic Insults. Journal of the American Society for experimental Neurotherapeutics. 2004; 1: 101-110). Memantina es un antagonista de los receptores NMDA de tipo “bloqueador de canal abierto”, ya que se une al canal en el lugar habitualmente ocupado por el ión Mg2+, lugar que no resulta accesible a menos que dicho canal se encuentre abierto, al Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 66 haber sido previamente activado por la unión del glutamato al receptor (Chen, 1992). De esta manera, memantina ocupará su lugar en el poro del canal, bloqueando la conductancia del mismo para el Ca2+ y Na+. La eficacia de memantina en el bloqueo del receptor NMDA, es mayor cuando la célula se encuentra despolarizada (potencial de membrana (+)) y/o cuando los niveles de glutamato en el espacio extracelular son patológicamente elevados, ya que estas condiciones favorecen que el canal iónico permanezca más tiempo abierto y por tanto accesible a la memantina (Lipton, 2004). A diferencia de otros antagonistas NMDA, memantina posee moderada-baja afinidad por el receptor y presenta una rápida cinética de unión al mismo, produciendo un bloqueo reversible del receptor, que además es concentración y voltaje-dependiente (Chen, 1997; Parsons, 1999). En condiciones de potenciales de membrana negativos, memantina produce un bloqueo de los receptores NMDA extrasinápticos 100 veces más potente que el de los receptores NMDA sinápticos, revirtiéndose dicho bloqueo cuando la célula se despolariza (potencial de membrana positivo) (Zhao, 2006). Estas propiedades hacen que memantina sea eficaz en el bloqueo de la actividad glutamatérgica excesiva, a concentraciones para las cuales no posee ningún efecto sobre la función normal del sistema nervioso, sugiriéndose además, una actuación selectiva de memantina sobre los receptores NMDA extrasinápticos respetando la actividad de los receptores NMDA sinápticos. Por esta razón, memantina, a diferencia de otros antagonistas NMDA de alta afinidad, como el MK801 o la fenciclidina (PCP), es un neuroprotector eficaz y bien tolerado, clínicamente (Lipton, 2004, Chen, 2006). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 67 2.4.1.- Propiedades farmacodinámicas Manipulaciones experimentales diseñadas para aumentar la actividad de los receptores NMDA del glutamato, se han asociado con un incremento de la actividad tónica de las CGRs y una interferencia en la generación de sus potenciales de acción. En dichas condiciones, la aplicación de memantina ha demostrado capacidad para revertir las corrientes tónicas y la amplitud de los potenciales de acción a niveles normales, siendo las concentraciones de memantina requeridas (10-30 µM) para revertir dicha toxicidad, suficientemente bajas como para no interferir en el procesamiento de la señal visual a nivel retiniano (Zhao, 2006; Hare, 2009). Estudios experimentales in vitro en cultivos de CGRs y neuronas de cortex cerebral de rata incubadas bajo distintas concentraciones de NMDA y memantina, han mostrado que la constante del equilibrio de disociación de memantina de su lugar de unión en el receptor NMDA, es un parámetro voltaje-dependiente, cuyo valor se sitúa entre 1-2 µM para un potencial de membrana en reposo negativo de -60 mV (Chen, 1992). Memantina actúa como un bloqueador de canal abierto, por un mecanismo no competitivo, de manera que, el grado de bloqueo del receptor, para una concentración fija de memantina, se incrementa proporcionalmente respecto a los niveles de agonista (glutamato/NMDA), siendo suficiente una concentración de 6 µM de memantina para bloquear aproximadamente el 85% de las corrientes inducidas por 200 µM de NMDA, a un potencial de membrana de -60 mV, mientras que para esta misma concentración de memantina serán inhibidas menos del 58% de las corrientes inducidas por concentraciones 5 µM de NMDA (Chen, 1992). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 68 Disponemos de pocos datos sobre las concentraciones de memantina alcanzadas en plasma y/o LCR, tras su administración sistémica por vía oral en humanos. Wesemann en 1980 determina postmorten, las concentraciones plasmáticas de memantina alcanzadas en una paciente con enfermedad de Parkinson que recibía tratamiento con memantina a dosis consideradas terapéuticas (aunque sin especificar el valor de éstas), situando dichas concentraciones entorno a los 0.32 µM. Más tarde, Kornhuber (1995) estudia las concentraciones de memantina alcanzadas en plasma y LCR, tras su administración oral, en pacientes con demencia leve-moderada, situándolas entre los 0.1-1 µM, y encontrando una buena correlación LCR/plasma, siendo en todos los casos las concentraciones en LCR inferiores a las plasmáticas. Sin embargo, Kornhuber no encuentra relaciones significativas entre los niveles de memantina en LCR (que en todos los casos fueron inferiores a 1 µM) y la duración del tratamiento, pero sí entre éstos y la dosis diaria recibida (Kornhuber, 1995). 2.5.- MEMANTINA Y NEUROPROTECCIÓN El glutamato es el principal neurotransmisor excitador del SNC y de la retina (Thoreson, 1999), sin embargo, su presencia en cantidades excesivas en el espacio extracelular, conlleva un daño irreversible a nivel neuronal, hablándose de fenómenos de degeneración neuronal secundarios a una sobreexcitación provocada por la liberación masiva de glutamato. Los efectos neurotóxicos del glutamato, son debidos a la entrada masiva de Ca2+ en la célula como consecuencia de la Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 75 a nivel de plasma. Los estudios farmacocinéticos se basan, por tanto, en la determinación y representación gráfica de las concentraciones del fármaco en plasma u otros fluidos/tejidos biológicos, obtenidos tras su administración. Los seres vivos constituyen sistemas complejos, en los que resulta difícil establecer relaciones cuantitativas entre la dosis de fármaco administrada, la vía de administración, la concentración del fármaco en los distintos tejidos y el tiempo transcurrido. Por lo que, para describir la evolución en el tiempo, de los niveles de fármaco administrado, en el organismo, se recurre a modelos farmacocinéticos, en los que mediante ecuaciones matemáticas se relacionan las velocidades de los procesos de absorción, distribución y eliminación. Los modelos farmacocinéticos compartimentales son los más utilizados. En este sentido, el concepto de compartimento es un concepto cinético y no anatómico, que engloba a todas aquellas zonas del organismo con propiedades cinéticas semejantes, y en las que se supone una distribución uniforme del fármaco (Doménech Berrozpe, 1997). Un compartimento estará definido, por tanto, por sectores acuosos con un volumen determinado (Vd), que contienen una determinada cantidad de fármaco (Q), de manera que la concentración del fármaco en dicho compartimento (C) vendrá dada por el cociente entre la cantidad de fármaco y el volumen de distribución del mismo: C= Q/Vd. Las cinéticas de entrada y salida del fármaco, en un compartimento determinado, pueden responder a una cinética de primer orden, a una cinética de orden cero o a una cinética de Michaelis-Menten. El organismo vivo es muy complejo y teóricamente podría dividirse en gran número de compartimentos, sin embargo, ello llevaría a expresiones matemáticas del modelo muy complejas. Por ello, en la práctica se tiende a simplificar y a considerar al organismo constituido por Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 76 el menor número de compartimentos posibles que permitan una adecuada descripción del comportamiento cinético de la sustancia (Doménech Berrozpe, 1997). A la hora de elaborar un modelo farmacocinético, lo primero es plantear si se trata de un modelo cinético lineal o no lineal. Aquellos casos en los que existe una proporcionalidad directa entre la concentración del fármaco en los distintos compartimentos y sus velocidades de transferencia, se consideran modelos lineales, y en ellos, los procesos cinéticos responderán a una cinética de primer orden, y los valores de los parámetros farmacocinéticos no variarán al variar la dosis administrada. De esta manera, la concentración del fármaco a un determinado tiempo, es directamente proporcional a la dosis administrada, y el área bajo la curva concentración-tiempo (AUC) es función lineal de la dosis administrada. Por otra parte, hablamos de modelos no lineales en aquellos casos en los que, al variar la dosis se modifica el valor de uno o más de los parámetros farmacocinéticos. En estos casos la concentración del fármaco a un determinado tiempo no es directamente proporcional a la dosis administrada. Son situaciones en las que los procesos de absorción, distribución y eliminación no responden a una cinética de primer orden, sino que son procesos saturables, con cinética de Michaelis-Menten. Dentro de la farmacocinética compartimental lineal, pueden establecerse dos modelos cinéticos fundamentales: el monocompartimental y el bicompartimental. El modelo cinético monocompartimental es el más sencillo, y en él se representa al organismo o a la fracción del mismo a la que es capaz de acceder el fármaco, como un compartimento único. Según este modelo existiría una Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 77 distribución instantánea y uniforme del fármaco tras su administración, con una eliminación del mismo desde tiempo cero, según un proceso cinético de primer orden. La representación esquemática y la ecuación del modelo, suponiendo una administración intravenosa rápida en dosis única, serán las siguientes: Donde Kel es la constante de eliminación del fármaco. Qk dt dQ el  Suponiendo una administración extravasal, deberá considerarse en el modelo el proceso de absorción del fármaco, que tendrá lugar también según una cinética de primer orden, y estará regido por una constante de absorción (Kab): QkQk dt dQ elaab  Dada la complejidad anatomo-fisiológica de los organismos vivos, en el modelo monocompartimental se simplifica al máximo la evolución temporal del fármaco en el organismo, pero en la práctica, casi ningún fármaco presenta una distribución instantánea y uniforme tras su administración. Para describir el comportamiento cinético de la mayoría de los fármacos suele ser necesario un Q Vd C Qel Qa kel kab Q Vd C Qel Div kel Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 78 modelo algo más complejo que el monocompartimental. En este sentido, el modelo bicompartimental asume el hecho de que la distribución del fármaco tras su administración no es instantánea y que aquellos tejidos con un mayor aporte sanguíneo, alcanzarán más rápidamente el equilibrio en la distribución que aquellos con un menor aporte sanguíneo relativo. De acuerdo con esto, se podrán distinguir dos compartimentos en este modelo, un compartimento central que representa aquellos tejidos en los que el equilibrio en la distribución se alcanza rápidamente (pudiendo considerarse una distribución casi instantánea) y un compartimento periférico, representado por aquellos tejidos en los que tarda más tiempo en alcanzarse el equilibrio (Doménech-Berrozpe, 1997). El esquema de este modelo, si consideramos una administración endovenosa, será el siguiente: Donde K12 es la constante de distribución o transferencia del fármaco desde el compartimento central (1) al compartimento periférico (2), y K21 la constante de retorno desde el compartimento periférico al central. La ecuación del modelo que describe las variaciones en la cantidad de fármaco en el compartimento central respecto al tiempo será la siguiente: Qc Vc C 1 Qel Div kel Qp Vp 2 k12 k21 Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 79 celcp cQkQkQk dt dQ  1221 Si suponemos una administración extravasal del fármaco, entonces el modelo y su ecuación serán las siguientes (considerando un proceso de absorción de primer orden): celcpaab cQkQkQkQk dt dQ  1221 El interés del modelo monocompartimental reside en el hecho de que un modelo tan simple permite comprender más fácilmente el concepto, los parámetros y las constantes farmacocinéticas utilizadas en modelos compartimentales más complejos. El modelo monocompartimental tiene por tanto un interés didáctico. Además, hay que tener en cuenta, que ningún modelo farmacocinético compartimental, por complejo que sea, es capaz de cuantificar de forma absoluta la evolución temporal del fármaco en los distintos tejidos tras su administración. Suponiendo un fármaco de comportamiento lineal monocompartimental, se puede considerar que la cantidad de fármaco existente en el organismo a un tiempo dado (Q) vendrá dado por la siguiente ecuación: Qc Vc C 1 Qel Qa kel Qp Vp 2 k12 k21 kab Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 80 etkel Q Q    0 Y si consideramos una administración endovenosa en dosis única, entonces la cantidad de fármaco en el organismo a tiempo 0 (Q0) será igual a la dosis administrada (D), y entonces, la ecuación anterior podría escribirse como: etkel DQ    En el modelo monocompartimental, la concentración del fármaco en el organismo (C), para cualquier tiempo, se puede conocer a partir del cociente entre la cantidad de fármaco en ese instante (Q), y el volumen acuoso en el que se encuentra distribuido (Vd):   etkel Vd D C    Respecto a las consideraciones generales sobre el modelo monocompartimental, en relación a la significación de sus principales parámetros cinéticos, podemos decir en primer lugar, que al aumentar la dosis administrada (D), aumenta proporcionalmente el valor de C0, pero no se modifica el valor de la constante de velocidad de eliminación (Kel), es decir, si consideramos una representación gráfica semilogarítmica de las concentraciones respecto al tiempo, se obtendrán rectas paralelas con la misma pendiente. En segundo lugar, el volumen de distribución (Vd) representa el volumen acuoso del organismo en el cual es capaz de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 81 distribuirse el fármaco, y la sangre se considera una parte alícuota del mismo. En tercer lugar, cuanto menor es el valor de la semivida biológica (T½) mayor es la pendiente de la curva concentración-tiempo, ya que la semivida es inversamente proporcional a la constante de eliminación (Kel). Finalmente, en este tipo de modelo cinético, si se asume un volumen de distribución (Vd) constante, entonces a mayor aclaramiento (CL) mayor será la pendiente de la curva y por tanto, el valor de la constante de eliminación (Kel). En el modelo bicompartimental por su parte, se asume que existe un desfase en la distribución del fármaco en el organismo tras su administración. Se considera que el organismo o la parte de él a la que es capaz de acceder el fármaco, está constituido por dos compartimentos intercomunicados, uno central (1), de fácil acceso, y otro periférico (2), al que tarda más en llegar el medicamento. En el tratamiento cinético en este tipo de modelos, hay que tener en cuenta una serie de consideraciones aparte, respecto al modelo monocompartimental. En primer lugar, que tras la administración intravenosa, el fármaco se distribuye instantáneamente en el compartimento central, desde el cual pasa al compartimento periférico, de acuerdo con un proceso cinético de primer orden, regido por una constante denominada constante de transferencia (K12); y al mismo tiempo, el fármaco retorna desde el compartimento periférico al compartimento central, también de acuerdo a una cinética de orden uno, regida por la constante de redistribución o retorno (K21). En segundo lugar, la eliminación del fármaco se produce fundamentalmente desde el compartimento central, de acuerdo con una cinética de primer orden, estando regido dicho proceso por la constante de eliminación (Kel). Se considera por tanto, que en el Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 82 modelo bicompartimental, tras la administración, el fármaco desaparece del compartimento central por dos mecanismos, el de eliminación (Kel) y el de transferencia o distribución al compartimento periférico (K12), a los que se denomina en conjunto, proceso de disposición (Doménech Berrozpe, 1997). En tercer lugar, la gráfica que se obtiene de la representación de las concentraciones respecto al tiempo en el modelo bicompartimental, presenta un tramo inicial-curvo, seguido de una fracción terminal-recta. La fracción inicial-curva de la gráfica corresponde a los procesos de eliminación y distribución del fármaco tras su administración, pero una vez alcanzado el equilibrio de distribución, momento en el que se igualan los procesos de distribución y retorno, prácticamente sólo se produce la eliminación del fármaco, correspondiendo ésta a la fracción terminal-recta de la gráfica. La gráfica concentración-tiempo es representativa del tránsito del fármaco en el compartimento central, que viene definida por una ecuación matemática bi-exponencial, del tipo: A= A0 . e –  t +B0. e -  t Donde α y β se denominan macroconstantes -rápida y lentade disposición, respectivamente, asumiendo que α rige mayoritariamente el proceso inicial de distribución y en menor grado el proceso de eliminación, y que β rige el proceso de eliminación fundamentalmente y en menor medida el proceso de distribución; por esa razón, a ambas constantes se las conoce también como constantes híbridas. Finalmente, debemos tener cuenta que en el modelo bicompartimental se consideran dos volúmenes de distribución, el del compartimento central (V1) y el del Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 83 compartimento periférico (V2), cuya suma representa el volumen de distribución total del fármaco en el organismo (Vd); tratándose en todos los casos de volúmenes aparentes, no reales. Aunque se pueden emplear modelos cinéticos más complejos, en la práctica, el modelo bicompartimental permite la adecuada descripción del comportamiento cinético de la mayoría de los fármacos utilizados. La FDA la define la biodisponibilidad como “la velocidad y cantidad, a la cual un fármaco es absorbido a partir de la dosificación que lo contiene y se hace disponible en su lugar de acción”. De ello se deduce, que el concepto de biodisponibilidad hace referencia al acceso y permanencia del fármaco en la biofase. En general, para que un fármaco pueda absorberse debe liberarse de la forma farmacéutica que lo contiene, disolverse en el lugar anatómico de la administración y acceder por difusión al lugar de absorción. La biodisponibilidad es un parámetro biofarmacéutico que cuantifica la disponibilidad fisiológica de un determinado fármaco o principio activo, y depende de factores inherentes a la propia sustancia (propiedades físico-químicas y características farmacocinéticas del principio activo) y a la forma de dosificación que lo contiene, y de las características del sustrato biológico al que va destinado. Desde el punto de vista de la farmacología ocular, Baños (1994) establece la importancia del concepto de biodisponibilidad en los preparados oftálmicos, haciendo referencia a la capacidad de penetración del fármaco a través de las distintas estructuras oculares, para aquellas drogas cuyo lugar de acción se sitúa en el interior del globo ocular, estableciendo además, su relevancia en aspectos Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 84 relacionados con la rapidez y eficacia de la acción farmacológica. De manera que, la biodisponibilidad ocular depende, entre otros aspectos, de la velocidad de absorción y del tiempo de eliminación del fármaco, y sobre ella podrán influir distintos factores de tipo fisiológico como el parpadeo, el drenaje lagrimal o las características de los tejidos a penetrar; y factores relacionados con las propiedades físico-químicas del fármaco y de la formulación que lo contiene, como el coeficiente de reparto o partición, las características del excipiente, el pH de la formulación, el pKa de la sustancia y/o el tiempo de contacto de la sustancia con la superficie de absorción, entre otros. Por tanto, la biodisponibilidad ocular de una sustancia será distinta si se estudia en condiciones fisiológicas o de enfermedad (Doménech-Berrozpe, 1998). 3.2.- FARMACOCINÉTICA OCULAR 3.2.1.- Anatomía del globo ocular El globo ocular se encuentra protegido por los párpados, por la grasa y la estructura ósea de la órbita, y su superficie es continuamente lavada por la película lagrimal. Desde el punto de vista farmacocinético, a nivel ocular hay que distinguir dos grandes compartimentos: el segmento anterior, que constituye el tercio anterior del globo ocular, formado por la córnea, el humor acuoso, el iris, la pupila, el cuerpo ciliar y el cristalino; y el segmento posterior, que constituye los dos tercios posteriores del ojo, y que incluye el humor vítreo, la retina, la esclera, la coroides y el nervio óptico (fig. 8). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 91 oftalmología, ya que estas patologías son una causa importante de ceguera en millones de personas en todo el mundo. Existen cuatro vías de administración encaminadas a la consecución de concentraciones eficaces del fármaco en el segmento posterior del ojo: la vía tópica, la sistémica, la intravítrea y la periocular. La vía tópica ha sido la preferida para la administración de fármacos en oftalmología, dada la simplicidad de la técnica y su bajo coste económico. Más del 90% de las formulaciones oftálmicas comercializadas existen en forma de gotas para uso tópico, pero éstas son consideradas ineficaces para el tratamiento de las enfermedades del segmento posterior. Cuando un fármaco es administrado por vía tópica en el ojo (en forma de gotas, suspensiones o pomadas), se estimulan distintos mecanismos como el lagrimeo, el parpadeo, la dilución y el recambio de la película lagrimal, que contribuyen al aclaramiento y/o lavado de la sustancia de la superficie ocular, de manera que la cantidad de fármaco susceptible de atravesar la córnea es muy inferior a la dosis administrada (Urtti, 2006). Se estima que menos de un 5% de la dosis total administrada por vía tópica ocular llega al humor acuoso (Herrero-Vanrell, 2007). La penetración ocular de los fármacos administrados por vía tópica, puede suceder por dos vías: corneal y no corneal, englobando esta última, el paso de la sustancia a través de conjuntiva y esclera (Hughes, 2005) (fig. 10). La preferencia por una u otra vía de penetración dependerá de las propiedades físico-químicas de la sustancia (Gaudana, 2009). La vía corneal es la mayoritaria, y supone paso de la sustancia a través de la córnea (vía transcelular o paracelular) al HA, desde donde se distribuye a los distintos tejidos intraoculares. Una vez que la sustancia ha alcanzado el humor Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 92 acuoso, podrá difundir hacia el vítreo y resto de tejidos intraoculares, a favor de gradiente de concentración. Sin embargo, el gradiente de concentración creado tras la administración tópica es débil y transitorio, ya que la concentración de la sustancia en el humor acuoso cae rápidamente, en base a los mecanismos de “turn over” y drenaje del acuoso (Geroski, 2000). Figura 10: Vías de absorción de fármacos administrados por vía tópica. (Traducido de: Hughes PM. et al. Topical and systemic drug delivery to the posterior segments. Adv Drug Deliv Rev. 2005; 57(14): 2010-2032). Si se recurre a la administración por vía sistémica, las dosis necesarias para alcanzar niveles terapéuticos en el segmento posterior del ojo son muy altas, lo que supone un mayor riesgo de generar efectos adversos no deseados a nivel sistémico (Geroski, 2001). Tras la administración sistémica, la barrera hemato-acuosa (BHA), (constituida por el endotelio de los vasos sanguíneos del iris y del cuerpo ciliar, y por Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 93 el epitelio no pigmentado de los procesos ciliares) y la barrera hemato-retiana (BHR) (constituida por el endotelio de los capilares retinianos (BHR-interna) y por la banda del epitelio pigmentario retiniano (BHR-externa)) limitan la penetración de fármacos en el segmento anterior y posterior del ojo respectivamente. Las sustancias administradas por vía sistémica -oral o endovenosaalcanzan y se distribuyen fácilmente por la coroides, debido a la gran vascularización de esta capa y al carácter fenestrado de los capilares coroideos, pero el EPR constituye una barrera altamente selectiva que restringe el paso de las mismas a la retina neurosensorial. Solamente del 1 al 2% de la dosis total administrada por vía sistémica alcanza el compartimento vítreo (Gaudana, 2010). Frente a la vía sistémica, el depósito directo del fármaco en el compartimento posterior del ojo mediante inyección intravítrea, constituye una alternativa útil, ya que desde el primer momento, se consiguen concentraciones eficaces del principio activo en humor vítreo con mínimos efectos secundarios a nivel sistémico (HerreroVanrell, 2007). Así, la administración intravítrea, ha adquirido popularidad en los últimos años gracias a la aplicación de los fármacos anti-VEGF en el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) de tipo exudativo. Sin embargo, las inyecciones intravítreas constituyen un método invasivo, no exento de riesgos a nivel ocular, como la formación de cataratas, desprendimientos de retina, hemorragias vítreas, endoftalmitis y/o elevación de la presión intraocular (Raghava, 2004). Otro inconveniente de la vía intravítrea, es que la administración del fármaco se realiza en forma de bolo, lo que resulta ineficaz en el tratamiento de enfermedades crónicas como el glaucoma, siendo necesarias inyecciones repetidas para lograr Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 94 concentraciones mantenidas del principio activo en vítreo, que no siempre son bien toleradas por el paciente (Ruiz-Moreno, 2007). En estos momentos, la dosificación de medicamentos al segmento posterior del ojo está demandando la búsqueda de vías de administración menos lesivas. En este sentido, la vía periocular presenta una serie de ventajas frente a las otras vías. A diferencia de la vía sistémica, permite alcanzar altas concentraciones del fármaco en vítreo, ya que la esclera al ser un tejido fibroso, ofrece menor resistencia que las barreras hemato-acuosa y hemato-retiniana, a la penetración de las sustancias (Raghava, 2004), siendo permeable incluso a moléculas de gran tamaño (con un Pm de más de 70 KDa) (Ambati, 2000). Además, la vía periocular proporciona un espacio virtual donde “almacenar” el principio activo, a modo de depot, para su liberación progresiva (Raghava, 2004). Dentro de la vía periocular podemos diferenciar distintas modalidades de inyección, según criterios anatómicos: peribulbar, retrobulbar, yuxtaescleral posterior, subtenon (anterior y posterior) y subconjuntival (fig. 11) (Gaudana, 2009). Estudios farmacocinéticos con fluoresceína sódica en conejos, han mostrado como tras la administración subtenon posterior (STP) se alcanzan concentraciones más altas y sostenidas en vítreo que tras la inyección retrobulbar o subconjuntival, con una menor absorción sistémica de la sustancia y menor riesgo de efectos secundarios, ya que teóricamente, la administración STP permite el emplazamiento de la sustancia cerca de la esclera y relativamente más alejada de la circulación orbitaria (Ghate, 2007). Además las inyecciones perioculares han mostrado mayor confort y tolerancia para el paciente respecto a las inyecciones intravítreas (Raghava, 2004). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 95 Figura 11: Esquema que ilustra la anatomía y distintas modalidades de administración periocular (Reproducido de: Gaudana R. et al. Ocular drug delivery. AAPS J. 2010; 12(3): 348-360. Review). La administración periocular supone el emplazamiento de la sustancia o de la formulación que la contiene, en el espacio periocular, desde el cual el fármaco puede penetrar en vítreo por una de las siguientes vías: vía hemática, vía transescleral o través de la cámara anterior del ojo (fig. 12). Penetración a través de la cámara anterior: la sustancia administrada periocularmente podrá penetrar en la cámara anterior del ojo, bien directamente, difundiendo a través de la esclera y del cuerpo ciliar y secretándose con el humor acuoso; o indirectamente, por reflujo a través de la conjuntiva y dilución en la película lagrimal, penetrando a través de la córnea. Desde la cámara anterior el fármaco puede difundir a la cámara posterior, y desde allí al humor vítreo superando la barrera del cristalino a través de la zónula. M em a abso r pasa n sang u sust a coro i Este EPR men o Fi gu peri o deli v a ntina, farm Penetra c r bida a ni v n do a la cir c u íneo retin i Penetra c a ncia admi n i des, mem b proceso de será el pri n o r resistenc i u ra 12: Es q o cula r (Tra v ery. Exper t acocinética y c ión por ví a v el de los v c ulación si s i ano. c ión direct a n istrada, de b b rana de B r absorción s n cipal cond i i a para mol q uema que ducido de: t Opin Dru g y tolerancia a hemática: v asos sang u s témica y r e a vía tran s b iendo atra v r uch-EPR y s e denomi n i cionante d e éculas lipo s ilustra las Raghava g Deliv. 20 0 ocula r 96 la sustan c u íneos con j e tornando a s esclera l : s v esar los t e y retina ne u n a difusión l e la penetr a s olubles (A m 3 vías de S. et al. P 0 4; 1(1): 99 - c ia adminis t j untivales, los tejidos s upone la a e jidos ocul a u rosensorial , l atera l , y e n a ción de la s m bati, 2000) . penetració P eriocula r - 114). t rada perio c epiescleral e intraocular e a bsorción d a res subyac e , para alca n n él, la per m s ustancia; o n tras la a routes f or Introducci c ularmente e s, coroide o e s con el fl u d irecta de e ntes, escle n zar el vítr e m eabilidad d freciendo u a dministrac i retinal d r ó n es o s, u jo la ra, e o. d el u na i ón r ug Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 97 La importancia relativa de cada una de estas vías en la penetración de fármacos administrados periocularmente, ha sido estudiada in vivo en animales de experimentación, para distintas sustancias: prednisolona (Tsuji, 1988) y manitol (Lee, 2001) administrados por vía subconjuntival en conejos, y celecoxib administrado por vía subconjuntival en ratas (Ayalasomayajula, 2004); concluyendo que la penetración directa desde el espacio periocular, a través de la esclera y los tejidos subyacentes, es la vía preferente. Weijtens y colaboradores llevaron a cabo un ensayo clínico comparativo sobre liberación vítreo-retiniana de dexametasona tras administración subconjuntival, peribulbar y oral, en pacientes que iban a ser vitrectomizados, llegando a la conclusión de que tras la administración subconjuntival y peribulbar, la penetración directa transescleral es la vía fundamental en la consecución de niveles vítreos (Weijtens, 2000). Estos autores describieron, además, un fenómeno de redistribución del fármaco, como resultado de su paso a sangre, al ser absorbido a nivel de la circulación sanguínea conjuntival y epiescleral, que justificaría la presencia de niveles detectables en el ojo contralateral tras la administración local (Weijtens, 2000). Así mismo, se ha visto que cuando un fármaco se inyecta periocularmente, puede producirse cierto reflujo de la sustancia a través del punto de inyección, con redistribución de la misma en la película lagrimal y posibilidad de penetración a través de la córnea (Amrite, 2008). Ahmed (1985) propuso la vía transescleral como alternativa frente a la administración sistémica, la vía tópica y las inyecciones intravítreas, en la administración de fármacos al segmento posterior de ojo. La esclera presenta un área de superficie extensa y un alto grado de hidratación, lo que facilita el paso de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 98 sustancias hidrofílicas a su través. Además, es un tejido hipocelular, que posee escasos enzimas proteolíticos, y su permeabilidad no parece disminuir con la edad; características por las que el tejido escleral presenta una permeabilidad superior a la de la córnea (Ahmed, 1985). En base a las características ultraestructurales de la matriz de colágeno del estroma eslceral, el paso de moléculas vía transescleral se produce por difusión a través de poros. Ambati (2000) demostró “in vitro”, trabajando con esclera de conejo, que la permeabilidad del tejido escleral disminuye exponencialmente con el radio y peso molecular de la sustancia, siendo por su parte, el radio molecular mejor predictor de la permeabilidad escleral que el Pm de la sustancia. Para dos sustancias con Pm similar, la permeabilidad del tejido escleral dependerá del radio molecular, siendo mayor para proteínas globulares (tipo inmunoglobulina, seroalbumina) que para moléculas de estructura lineal (tipo dextrano), en base al menor radio molecular de las primeras y a la mayor interacción de las moléculas lineales con las fibras de colágeno del estroma escleral (Ambati, 2000). Por otra parte, en el caso de sustancias de peso y radio molecular similar, el paso transescleral estará condicionado por su carga iónica y grado de hidrofilia (Cheruvu, 2006). El tejido escleral es más permeable a compuestos hidrosolubles y moléculas cargadas negativamente, ya que la matriz escleral contiene proteoglicanos y glicosaminoglicanos que presentan cargas negativas a pH fisiológico, de manera que las moléculas aniónicas serán menos retenidas (Cheruvu, 2006; Ranta, 2006). Por todo ello, la vía transescleral puede considerarse válida para la liberación de fármacos al segmento posterior del ojo, de hecho, se han ensayado distintos sistemas de liberación sostenida transescleral a base de nanoy micropartículas (Kompella, 2003), implantes epiesclerales (Kato, 2004) o matrices colágenas (Gilbert, 2003). Sin Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 99 embargo, no podemos olvidar el obstáculo interpuesto por los tejidos y estructuras circundantes a la esclera, como la presión intraocular, el flujo acuoso uveo-escleral, el flujo sanguíneo coroideo y/o la interfase coroides-membrana de Bruch-EPR. La permeabilidad escleral se encuentra limitada en gran medida por la interfase membrana de Bruch-EPR, considerada una barrera ocular altamente restrictiva, tal y como demuestran los estudios desarrollados por Cheruvu (2006). Según este autor, el paso de moléculas a través de la membrana de Bruch-EPR se ve más condicionado por la lipofilia y carga iónica de la sustancia que el paso transescleral, presentando alta resistencia al paso de moléculas hidrosolubles y moléculas polares (Cheruvu, 2006). Los resultados de los estudios de administración subtenon de triamcinolona, llevados a cabo por Robinson (2006) en conejos, con creación de un tapete conjuntival para aislar la zona de la inoculación de la circulación sanguínea conjuntival o con aplicación de crioterapia para bloqueo de la circulación coroidea, sugieren que la circulación sanguínea conjuntival constituye un obstáculo más potente que la circulación coroidea en la penetración transescleral de las sustancias administradas periocularmente (Robinson, 2006). 3.3.- NUEVAS FORMULACIONES OFTÁLMICAS La administración de fármacos en solución hace que la duración del efecto sea corta, ya que depende directamente de la semivida del principio activo, siendo difícil mantener concentraciones locales dentro del rango terapéutico. Por esta razón, desde los años 80, las líneas de investigación se centran en el diseño y análisis de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 100 nuevas formulaciones y sistemas, encaminados a mejorar la biodisponibilidad del principio activo, bien aumentando el tiempo de contacto de la formulación con la superficie ocular, bien facilitando la penetración del fármaco en su forma libre o bien permitiendo una liberación sostenida y controlada del fármaco al incluirlo en algún vehículo o dispositivo (Herrero-Vanrell, 2007). 3.3.1.- Pro-fármacos La denominación de profármaco hace referencia a aquellos “derivados biorreversibles” que experimentan una biotransformación en el organismo en cual son administrados antes producir el efecto terapéutico esperado. En general, un profármaco no es activo "per se", sino que se activa en el organismo como resultado de un proceso metabólico en el que se regenera el producto de partida. La mayoría de los pro-fármacos se obtienen por esterificación del principio activo, confiriéndole mediante modificación sus características físico-químicas, mayor estabilidad, posibilidad de administración por distintas vías, mayor velocidad de absorción, menor metabolismo por efecto primer paso e incluso menores efectos secundarios. En el campo de la oftalmología, la utilización de pro-fármacos ha permitido aumentar la permeabilidad y penetración ocular de principios activos, mejorando su biodisponibilidad y tolerancia. Entre ellos podemos nombrar dos profármacos lipídicos, el ODG-PFA pro-fármaco de foscarnet (Cheng, 1999) y el HDP-P-GCV profármaco de ganciclovir (Cheng, 2000), los cuales, formulados como liposomas para administración intravítrea, se han ensayado en modelos animales como sistemas de liberación sostenida en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus (CMV), Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 107 Los ciclodextranos (CDs) son un grupo de oligosacáridos cíclicos (hidroxipropil β-ciclodextranos: HP-β-CD) capaces de formar complejos de inclusión con moléculas lipofílicas de baja solubilidad en agua (Sahoo, 2008). Estos complejos permiten aumentar la permeabilidad corneal de sustancias hidrofóbicas, mejorando la biodisponibilidad ocular de éstas tras su administración tópica en gotas. Se han probado complejos HP-β-CD de dexametasona y dorzolamida que han demostrado una biodisponibilidad superior a la de las formulaciones convencionales en solución, sin los problemas de irritabilidad ocular y toxicidad corneal de las formulaciones convencionales que asocian el cloruro de benzalconio (BAK) como conservante (Loftsson, 2008). 3.3.4.- Iontoforesis ocular La iontoforesis ocular ha ganado interés en el campo de la oftalmología, por ser un método no invasivo, que permite la liberación eficaz de fármacos tanto al segmento anterior (iontoforesis transcorneal) como al segmento posterior del ojo (iontoforesis transescleral), sin los efectos adversos asociados a las inyecciones intravítreas y/o a los implantes intraoculares. Aunque las primeras aplicaciones de la técnica datan de principios del siglo XX, es a finales de los años 80, cuando se desarrollan estudios controlados y reglados. En la iontoforesis ocular, mediante la aplicación de una corriente eléctrica se consigue la penetración de moléculas ionizadas (fármacos ionizados) en los tejidos oculares, colocando en contacto con el ojo, un electrodo donante que contiene el fármaco a administrar, y en otro punto de la superficie corporal el electrodo de retorno que cierra el circuito eléctrico. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 108 La iontoforesis transescleral presenta una serie de ventajas frente a la iontoforesis transcorneal. Por una parte, evita la barrera del cristalino permitiendo alcanzar altas concentraciones del fármaco en humor vítreo, por otra, permite una mayor superficie de aplicación pudiendo disminuir el tiempo y la dosis aplicadas, y por último, el tejido escleral ofrece una mayor tolerancia a la corriente y cualquier alteración en su estructura no afectaría a la visión (Maurice, 2001). A pesar de que la técnica de la liberación iontoforética ha sido ampliamente estudiada para la administración transdérmica, su aplicación en el terreno de la farmacología ocular sigue siendo un reto, ya que la estructura de la esclera no es comparable a la de la piel, el tiempo de aplicación está limitado por la tolerancia ocular a la corriente y existe la necesidad de diseñar dispositivos y sondas adaptados para su aplicación ocular. Algunos de los sistemas diseñados para iontoforesis transescleral tratan de superar dichas limitaciones, incorporando un aplicador con un electrodo dispersivo y un controlador de dosis. La técnica de la iontoforesis ocular ha sido ensayada con éxito en la liberación de antibióticos (ciprofloxacino, gentaminicina, amikacina, vancomicina) y corticoides (dexametasona y metilprednisolona) (Gaudana, 2010). El inconveniente fundamental de la administración intraocular de las formulaciones convencionales reside en la imposibilidad de su empleo en tratamientos prolongados, en los que serían necesarios inyecciones repetidas para conseguir mantener concentraciones del fármaco dentro del rango terapéutico, con el consiguiente riesgo de complicaciones oculares (hemorragias conjuntivales, induración escleral en el punto de la inyección, aumentos de la PIO, cataratas, hemorragias vítreas, desprendimientos de retina y endoftalmitis). Además, si Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 109 tenemos en cuenta el bajo índice terapéutico de algunos de los fármacos empleados en el tratamiento de las enfermedades del segmento posterior, no sería improbable alcanzar concentraciones tóxicas para la retina. Por todo ello, se trabaja en el desarrollo de nuevos sistemas, adaptados para la administración intraocular a modo de implantes intravítreos, capaces de lograr una liberación sostenida del fármaco durante periodos de tiempo prolongados, evitando la problemática de las reinyecciones sucesivas. Estos sistemas se pueden preparar a partir de polímeros no biodegradables o de polímeros biodegradables. Dentro de los implantes intravítreos no biodegradables, podemos encontrar: Vitrasert® (1996) un dispositivo de ganciclovir empleado en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus, Retisert® (2005) un dispositivo de acetónido de fluocinolona aprobado para el tratamiento de las uveítis intermedias y posteriores no infecciosas, Iluvien® (2010) un dispositivo de acetónido de fluocinolona probado en ensayos clínicos en fase III para el tratamiento del edema macular diabético y del edema macular secundario a oclusiones venosas retinianas, y el implante NT-501 un dispositivo de células epiteliales retinianas humanas modificadas liberadoras de CNTF que ha sido probado en ensayos clínicos en fase II para el tratamiento de la DMAE atrófica y de la retinosis pigmentaria (Kuno, 2010). Los polímeros no biodegradables empleados con mayor frecuencia en la elaboración de estos sistemas son la silicona, el alcohol polivinílico y el acetato de etilvinilo. La principal desventaja de los implantes no biodegradables, es que deben ser extraídos quirúrgicamente una vez que se ha agotado su efecto, por el riesgo de producir reacciones de rechazo tipo cuerpo extraño, lo que conlleva un mayor riesgo de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 110 complicaciones locales tipo hemorragias vítreas, desprendimiento de retina, endoftalmitis y edema macular quístico (Kuno, 2010). Se ha diseñado un implante intraescleral no biodegradable, preparado a partir de un copolímero de acetato de etileno y vinilo para la liberación de betametasona, que funciona a modo de reservorio, y con posibilidad de recarga (Kato, 2004). Entre los dispositivos intraoculares biodegradables se encuentra Ozurdex® (2011), un implante intravítreo de liberación sostenida de dexametasona que ha sido aprobado para el tratamiento del edema macular secundario a obstrucciones venosas retinianas y de las uveítis intermedias o posteriores no infecciosas (London, 2011). Los polímeros biodegradables empleados en la elaboración de estos sistemas se clasifican en hidrofóbicos de origen sintético e hidrofílicos de origen natural. Dentro de los polímeros hidrofóbicos sintéticos los más empleados son el ácido poli-láctico, el ácido poli-glicólico y sus copolímeros, siendo el ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) el material más empleado en la elaboración de implantes intraoculares biodegradables. En todos ellos, las cadenas poliméricas se rompen por hidrólisis y los productos resultantes son metabolizados mediante el ciclo de Krebs. Gracias a la maleabilidad de estos polímeros, han sido utilizados en la fabricación de implantes biodegradables con formas diversas (varillas, clavos esclerales, pellets, discos, láminas). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 111 3.4.- MODELIZACIÓN CINÉTICA OCULAR Para la administración subconjuntival, Lee y Robinson (2004) propusieron un modelo cinético simple de paso directo de la sustancia desde el espacio periocular al compartimento vítreo, con dos constantes de eliminación independientes, una desde el compartimento vítreo (K20) y otra desde el propio espacio periocular (K10): En el que K12 representa la constante de transferencia o distribución de la sustancia a vítreo, K20 representa la constante de eliminación del fármaco desde el compartimento vítreo y K10 la constante de eliminación desde el espacio periocular. Según este modelo, la biodisponibilidad vítrea de la sustancia (FHv), es decir, la fracción de dosis administrada que alcanza el compartimento vítreo desde el espacio periocular, vendrá dada por la siguiente ecuación:    100 Espacio periocular (1) Humor vítreo (2) k 12 k 20 k 10 Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 112 Siendo los valores de biodisponibilidad vítrea resultantes demasiado bajos, como consecuencia de la pérdida adicional de sustancia desde el lugar de la administración (K10), que reduciría la cantidad de fármaco disponible para alcanzar el vítreo (Lee, 2004(II)). En consecuencia, existirían dos formas de incrementar la biodisponibilidad de la sustancia administrada, bien aumentando la penetración de la sustancia (K12) o bien reduciendo el aclaramiento de la sustancia del lugar de la inyección (K10). La pérdida de sustancia del lugar de la inyección (K10) es un factor limitante de la eficacia de la vía transescleral en la liberación de fármacos al segmento posterior del ojo. Los mecanismos implicados en esta pérdida, como el reflujo postinyección o el aclaramiento sanguíneo y linfático conjuntival, han sido analizados por varios autores. Conrad y Robinson (1980) estudiaron el comportamiento cinético de la pilocarpina tras su administración subconjuntival, llegando a la conclusión de que cuando inyectaban volúmenes altos, por encima de los 200 µL, se producía reflujo de la solución a través de la zona de punción, con la consiguiente pérdida de dosis administrada (Conrad, 1980). Kim y colaboradores desarrollaron estudios de liberación “in vivo” de Gd-DTPA a partir un implante epiescleral, y mediante técnicas de RMN pudieron identificar la acumulación gradual de la sustancia en ganglios linfáticos de la cadena peribucal, lo que confirmaría el papel determinante del drenaje linfático conjuntival y orbitario en el aclaramiento de sustancias administradas periocularmente (Kim, 2004). Por su parte, Robinson y colaboradores estudiaron las barreras oculares en la penetración transescleral del acetónido de triamcinolona tras su administración subtenon, analizando el papel de la circulación sanguínea conjuntival, epiescleral y coroidea; deduciéndose de sus Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 113 experiencias la importante contribución de la circulación conjuntival al lavado de la sustancia del lugar de la administración, al constatar niveles vítreos inferiores cuando no se controlaba este factor (Robinson, 2006). Cuando una sustancia es administrada periocularmente en forma de solución, el tiempo de permanencia en el lugar de la inyección es muy corto y no se puede esperar una liberación sostenida de la misma (Li, 2004). Por esta razón, se han ensayado distintos métodos dirigidos a reducir el aclaramiento de la sustancia del lugar de la inyección, bien minimizando el reflujo de la formulación a través de la zona de punción mediante la aplicación de técnicas y volúmenes de inyección apropiados (Robinson, 2006) o bien incrementando el tiempo de contacto del fármaco con la superficie escleral mediante la utilización de formulaciones en suspensión o de medios viscosos-semisólidos (Gilbert, 2003) o bien minimizando el aclaramiento sanguíneo de la formulación mediante la utilización de formulaciones a base de microy/o nanopartículas (Kompella, 2003, Ayalasomayajula, 2004), de implantes oculares (Yasukawa, 2004) o de bombas osmóticas. El modelo farmacocinético inicial, propuesto por Lee y Robinson podría ser utilizado para describir la cinética de sustancias administradas en solución. Sin embargo, cuando se trabaja con formulaciones retardantes que buscan una liberación sostenida del principio activo la situación se hace más compleja. En estos casos, sólo el fármaco disuelto y liberado desde la formulación, podrá absorberse, y en consecuencia, el modelo cinético anterior deberá incluir un nuevo compartimento, el compartimento disolución: Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Introducción 114 En el que Krel representa la constante de liberación del fármaco desde la formulación que lo contiene y Kp la constante de eliminación de la formulación del lugar de la inyección. Considerando este modelo, la mayor biodisponibilidad del fármaco en vítreo, es debida a una mayor retención de la sustancia en el lugar de la administración y a una liberación más lenta de ésta desde su formulación, siendo que Kp es menor que Krel (Ranta, 2006). Fármaco en formulación en espacio periocular Fármaco disuelto en espacio periocular (1) Humor vítreo (2) Kr e lK1 0 K2 0 K12 Kp Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 125 1.- MATERIAL 1.1.- MATERIAL BIOLÓGICO El estudio se ha realizado en conejos albinos de raza Neo-zelandesa, hembras adultas, con pesos comprendidos entre los 2-3 Kg, a los que diversos controles analíticos y clínicos permitieron asegurar su idoneidad para la inclusión en este proyecto. Los animales fueron proporcionados por el Servicio de Apoyo a la Experimentación Animal (SAEA) de la Universidad de Zaragoza. El cuidado y manipulación de los animales se realizó de acuerdo con la resolución 86/609 de la ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology), sobre la regulación del uso de animales de experimentación. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Zaragoza (PI 07/07). Se utilizaron un total de 129 animales, de los cuales 123 fueron empleados en el estudio farmacocinético y los otros 6 en el estudio de toxicidad ocular de memantina. Las experiencias y actividades de este proyecto se desarrollaron en las instalaciones del Laboratorio del Departamento de Farmacología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 126 1.2.- REACTIVOS Y DISOLUCIONES Hemos trabajado con memantina (1-amino-3,5-cloruro de dimetiladamantina) en forma de clorhidrato, al 98.8%, subministrada por los laboratorios Sigma Aldrich (St Louis, MO). Como estándar interno en el análisis cromatográfico se utilizó rimantadina, también en su forma clorhidrato, al 97%, proporcionada también por los laboratorios Sigma Aldrich (St Louis, MO). Se utilizaron distintas formulaciones de memantina obtenidas a partir de la disolución de ésta en solución salina de ClNa al 0.9%, solución de metilcelulosa al 0.5% (p/v) (Sigma Aldrich St Louis, MO, USA) y solución de polivinilpirrolidona al 1% (p/v) (Sigma Aldrich St Louis, MO, USA); obteniendo concentraciones de memantina de 15 mg/mL. En la fase de extracción y cuantificación de las muestras, se utilizaron los siguientes reactivos: 9-fluoroenilmetil cloroformiato (FMOC-Cl) como agente derivatizante proporcionado por los laboratorios Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA), acetonitrilo calidad HPLC de los laboratorios Scharlau Chemie S.A. (Barcelona, España), metanol y otros solventes calidad HPLC, como ácido acético glacial, ácido fórmico 99% y ácido fosfórico 99.99% (85 w/v) de los laboratorios Scharlau Chemie S.A. (Barcelona, España) y N2 gas-Alphagaz™ de los laboratorios Air Liquide (Zaragoza, España). Las soluciones de almacenamiento de memantina y del estándar interno (rimantadina) se prepararon mediante disolución de los compuestos en agua purificada Mili-Q, hasta una concentración de 100 g/mL. De la misma manera se obtuvieron las soluciones de trabajo, mediante dilución de las soluciones madre, Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 127 hasta alcanzar concentraciones entre los 0.2-20 g/mL en el caso de memantina, y 1 g/mL para rimantadina. Se preparó una solución de FMOC-Cl 90 mM, mediante adición de acetonitrilo, en condiciones de oscuridad, y una solución de glicina 0.1M en agua purificada. Todas las soluciones fueron almacenadas a -20º C hasta su posterior utilización. En las fases de administración del fármaco y extracción de muestras biológicas, se utilizaron los siguientes fármacos: Ketamina (Imalgene 500®) de los laboratorios Merial (Barcelona, España) y Xilacina (Xilagesic® 2%) de los laboratorios Calier SA (Barcelona, España) para la sedación-anestesia del animal; colirio Colircusí Anestésico Doble® de tetracaína 0.1% y oxibuprocaína 0.4% de los laboratorios Alcon Cusi SA (Barcelona, España) para la anestesia tópica en gotas, colirio Colircusí Cicloplégico® de los laboratorios Alcon Cusi SA (Barcelona, España) como midriático para el estudio fundoscópico, Pentobarbital sódico (Dolehtal®) de los laboratorios Vetoquinol (Madrid, España) para el sacrificio de los animales, anticoagulante de Heparina de los laboratorios Analema (Vigo, España) para las muestras de sangre, y formaldehido al 10% como solución de fijación en la preparación de las muestras de tejido para el análisis histopatológico. 1.3.- MATERIAL DE LABORATORIO 1.3.1 – Material general - Agitador magnético SBD A-06. - Agitador vibrador de tubos Vibra Mix Ovan. - Agitador de balanceo. Rotabit. JP SELECTA, SA. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 128 - Balanza analítica de precisión. Modelo GMBH. Sartorius. - Baño termostatizado con agitación. Modelo Unitronic-320. P-SELECTA, SA. - Centrífuga refrigerada X-22R, Beckman Allegra. - Centrifuga Centromix-II BL. P SELECTA, SA. - Bomba de infusión. Modelo M312. Wilson. - Bomba de vacío. Modelo ST-21-SD. - Bombona de nitrógeno N45. Air Liquide. - Estufa P Selecta. - Frigorífico Eco Tropic. Edesa. - Congelador –20ºC. Whirpool - Congelador –20ºC. Zanussi. - pH metro digital. Modelo HI 9021. Hana. - Purificador de agua. Millipore Simplicity. - Vortex-Genie 2 Digital. Scientific Industries, Inc. 1.3.2.- Equipo de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) - Columna Nova-Pak C-18, 4 μm (3.9 x 150 mm). - Precolumna Nova-Pak C-18, (3.9 x 20 mm ID, 4 μm tamaño de partícula). - Columna Nova-Pak C-18, fase reversa (3.9 x 150 mm ID, 4 μm) - Bombas de alta presión. Modelo 515. Waters Associates. - Inyector automático. Modelo 717. Waters Associates. - Programador de gradientes. Waters Associates. - Detector de fluorescencia de onda variable. Modelo 474. Waters Associates. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 129 - Equipo informático de control del sistema cromatográfico. Ordenador IBM (Millennium Integration, System 2000) con software de integración Em Power Waters Associates (Milford, MA, USA). 1.3.3.- Material para la administración del fármaco y toma de muestras biológicas - Microscopio quirúrgico. Zeiss®. West Germany. - Sistemas de contención de conejos Letica. - Cánulas Valu-Set 25G ¾. Becton Dickinson, SA (tipo mariposa). - Cánulas Venofix 21G x 10-20mm. Braun. - PTFE Radiopaque catheter 22G x 1mm. NITRO. - Agujas estériles desechables 20G 0.9x25mm, 21G 0.8x40mm, 25G 0.5x16mm, 30G 0.3x13mm. - Jeringas estériles desechables de 2 mL, 5 mL y 10 mL. Becton Dickinson, SA. - Jeringas estériles desechables de insulina 1 mL con aguja y jeringas de 1 mL BD con aguja Microfine. - Pipetas automáticas GILSON P5000 (1-5 µL), P10 (1-10 L); P200 (2001000 L); y Biohit Proline pipette (5-50 L) y (50-200L). - Puntas de pipeta 200-1000 L. Daslab®. - Gradillas de almacenamiento de tubos de ensayo. - Tubos Eppendorf. Daslab®. - Tubos de ensayo de plástico de fondo redondo, 15 mL. - Frascos lavadores PE, 50 mL y frascos-contenedores de orina, 125 mL. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 130 1.3.4.- Material para obtención de muestras de estudio de toxicidad ocular - Instrumental de microcirugía ocular. Moria®. - Microscopio quirúrgico. Zeiss, West Germany. - Oftalmoscopio indirecto binocular. Zeiss®. - Lente de 20D (Volk®, double aspheric AG081620). - Tonómetro de rebote Tonovet, Tiolat-Oy®. - Material fungible diverso. 2.- METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 2.1.- ESTUDIO FARMACOCINETICO 2.1.1.- Administración periocular-subtenon posterior Para estudiar el comportamiento cinético de memantina tras la administración periocular STP, se utilizaron 54 animales, distribuidos en tres grupos de 18 individuos, uno para cada una de las formulaciones ensayadas (salina, metilcelulosa 0.5% y polivinilpirrolidona 1%). Se obtuvieron muestras de humor vítreo a los 10, 60, 120, 240, 480 y 1440 minutos postadministración del ojo administrado y del ojo contralateral. Así mismo, se obtuvieron muestras de plasma a los 5, 10, 60, 120, 240, 360 y 480 minutos postadministración. Todas las experiencias se realizaron por triplicado. La técnica utilizada para la administración en el espacio subtenon posterior (STP) fue la descrita por Pradeep-Venkatesh para la inyección de corticoides, en la Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 131 que utilizando un catéter intravenoso flexible de politetrafluoroetileno (PTFE), se consigue el correcto emplazamiento del fármaco en dicho espacio virtual (Venkatesh, 2002). La administración se realizó en todo los casos bajo sedación-anestesia del animal, mediante inyección intramuscular de 10-20 mg/Kg de ketamina (Imalgene500®) y 2 mg/Kg de xilacina al 2% (Xilagesic®), y anestesia tópica en gotas, mediante instilación de colirio Colircusí Anestésico Doble® (tetracaína 0,1% y oxibuprocaína 0,4%. Alcon Cusí S.A. Barcelona). Con ayuda de un blefarostato, para conseguir la adecuada exposición del ojo, y bajo control microscópico, se procedió a realizar la inyección. Con ayuda de una pinza levantamos un pellizco de conjuntiva, aproximadamente a 3 mm del limbo esclero-corneal, lateralmente al músculo recto superior, y penetrando por el cuadrante temporal-superior en el espacio subtenon, introducimos un catéter de PTFE de 23Gs, deslizándolo unos milímetros dentro del espacio subtenon. Después, avanzamos el catéter unos 3-5 mm al tiempo que se retira lentamente la guía hacia atrás, y finalmente deslizamos el catéter, con un suave movimiento de rotación, unos 12-15 mm superando el ecuador del globo ocular; siempre con cuidado de no presionar con fuerza la cánula para evitar que ésta pueda doblarse. La dosis de memantina administrada por esta vía fue de 4.5mg/animal (en dosis única), en un volumen de 0.3 mL de la correspondiente formulación de memantina 15 mg/mL. Dicho volumen había sido fijado en pruebas preliminares como el volumen máximo capaz de ser emplazado en el espacio subtenon posterior sin problemas de reflujo tras la inyección. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Material y métodos 132 2.1.2.- Administración intravítrea Para estudiar el comportamiento cinético tras la administración intravítrea se utilizaron 45 animales, distribuidos en tres grupos de 15 animales, correspondientes a cada una de las formulaciones. Se tomaron muestras de humor vítreo del ojo administrado a los 120, 240, 480, 1440 y 2880 minutos y muestras de sangre a los 5, 10, 60, 120, 240, 360 y 480 minutos postadministración. La administración intravítrea se realizó también bajo sedación-anestesia (ketamina + xilacina) del animal y cobertura anestésica tópica en gotas. Previa a la inyección se realizó una paracentesis con aguja de 30Gs, para la evacuación de humor acuoso de la cámara anterior del ojo, con el objeto de evitar problemas de reflujo por hiperpresión. La inyección intravítrea se realizó con aguja de 30Gs en el cuadrante temporal-superior, a 2.5-3 mm del limbo esclero-corneal según la técnica descrita por Barza en sus experiencias (Barza, 1993). La dosis de memantina administrada por esta vía fue de 1.5 mg/animal (en dosis única) en un volumen de 0.1 mL de la correspondiente formulación de memantina 15 mg/mL. Volumen establecido a partir de pruebas preliminares, como el máximo volumen inyectable en cavidad vítrea sin problemas de reflujo. 2.1.3.- Administración endovenosa 2.1.3.1.- Dosis única Para el estudio cinético de memantina tras la administración sistémica por vía endovenosa, en dosis única, se utilizaron 21 animales. Se administraron 0.3 mL de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 235 niveles vítreos alcanzados tras la administración subtenon de memantina, ya que como sugirieran Robinson (2006), Pontes de Carvalho (2006) y Ghate (2007) a partir de sus experiencias, las circulaciones linfática y sanguínea, conjuntival y epiescleral, constituyen una barrera dinámica importante en la penetración directa de sustancias administradas periocularmente (Robinson, 2006; Pontes de Carvalho, 2006; Ghate,2007). En este sentido, nosotros encontramos niveles de memantina en vítreo del ojo administrado en los animales muertos muy superiores a los alcanzados en conejos vivos (27.97 versus 0.21 µg/mL, respectivamente, a los 120 minutos), coincidiendo esto, con lo observado por Carcaboso tras la administración retrobulbar de fluoresceína sódica (NaFl), que encuentra en condiciones ex vivo niveles de NaFl en vítreo superiores a los alcanzados in vivo, con un Tmax también mayor (Carcaboso, 2007). Los mayores niveles alcanzados en vítreo en los animales muertos podrían justificarse por el bloqueo de los mecanismos de aclaramiento sanguíneo (conjuntival, epiescleral y coroideo) y linfático, así como por una posible ruptura de la integridad funcional del EPR en condiciones ex vivo, como dedujeran de sus experiencias algunos autores (Robinson, 2006; Carcaboso, 2007). Además, en las experiencias ex vivo, quedarían anulados otros mecanismos como el aclaramiento precorneal, relacionado con la dilución y renovación de la película lagrimal. De hecho, estudios de disposición ocular mediante resonancia magnética nuclear (RMN) han demostrado como en condiciones ex vivo la difusión transescleral de las sustancias administradas periocularmente aumenta (Kim, 2004). En cualquiera de los casos, los estudios preliminares de Lee y Robinson concluyen que la recirculación sistémica y el movimiento de la sustancia desde el humor acuoso, no contribuyen de forma significativa en la consecución de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 236 los niveles vítreos tras la administración periocular, siendo predominante la penetración directa a través de la esclera (Lee, 2001). El comportamiento vítreo de memantina tras la administración intravítrea respondió a una cinética monocompartimental, que no mostró diferencias significativas entre las tres formulaciones en cuanto a los parámetros cinéticos básicos. Los tiempos de vida media de eliminación de memantina (T1/2-el) fueron cortos, próximos a los 110 minutos para la formulación Ss, a los 60 minutos para la formulación Pvp y a los 50 minutos para la formulación Mc, no encontrando significación estadística para esta diferencia debido probablemente a la variabilidad de los datos experimentales para las formulaciones Ss y Pvp, que hizo que los valores medios de dicho parámetro se viesen arrastrados por los valores extremos tomados por el sujeto 2 en el caso del Pvp, y por el sujeto 1 en el caso de la formulación Ss. En este sentido, se ha visto como las moléculas administradas en solución, son eliminadas del compartimento vítreo en pocas horas, frente a las moléculas administradas en suspensión, las cuales presentan mayor vida media en vítreo, pudiendo permanecer activas en los tejidos intraoculares durante mayor tiempo (Okabe, 2003). Tras la administración intravítrea de memantina observamos una caída rápida de sus concentraciones en vítreo hasta los 120 minutos y una rápida eliminación vítrea de la sustancia, con posible redistribución a otros tejidos oculares: humor acuoso, cristalino, cuerpo ciliar, retina, coroides y/o esclera; tal y como concluyera Koeberle (2006) en sus experiencias in vitro con ojos de oveja perfundidos, en las Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 237 que observa como los niveles de memantina en dichos tejidos oculares se incrementan de forma inversamente proporcional a como lo hacen sus concentraciones en humor vítreo. Koeberle describe una eliminación de memantina de humor vítreo fundamentalmente por vía posterior, a partir de los altos niveles de memantina encontrados en la interfase coroides-EPR y en esclera tras su administración intravítrea, considerando menor la contribución de la vía anterior en la eliminación vítrea de la sustancia, en base a las bajas concentraciones de memantina alcanzadas en córnea y humor acuoso (Koeberle, 2006). En nuestro caso, la ausencia de cuantificación de niveles de memantina en otras estructuras oculares, no ha permitido llegar a esta conclusión, aunque si consideramos la corta vida media de memantina en vítreo, menor de 2 horas en los tres casos, es posible pensar que ésta sea eliminada del humor vítreo mayoritariamente por vía posterior. De hecho, Marice (2001) y Barza (1993) defienden esta posibilidad para otras sustancias con comportamientos cinéticos similares, bajos cocientes de concentración HA/HV y tiempos de vida media en vítreo cortos, del orden de los que nosotros hemos encontrado para memantina (Maurice, 2001; Barza, 1993). Por otra parte, las bajas cifras de aclaramiento vítreo de memantina tras la administración intravítrea, del orden de los 30 µL/min, estuvieron probablemente condicionadas por los bajos volúmenes de distribución encontrados para esta vía, los cuales no alcanzaron los 10 mL en ninguno de los casos. Estos volúmenes de distribución dan una idea de la estanqueidad del compartimento vítreo. Koerbele (2006) establece que tras la administración intravítrea de memantina existe una rápida difusión de la sustancia hacia la retina, como muestran los resultados de sus experiencias in vitro en ojos de oveja perfundidos, alcanzándose Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 238 rápidamente el equilibrio estacionario entre ambos compartimentos (Koeberle, 2006). Además, parece existir cierta correspondencia entre las bombas de transporte activo de aniones orgánicos del túbulo renal y las existentes a nivel de la retina (Barza, 1993; Hughes, 2005). De manera que, si como se ha visto, memantina tras su administración sistémica por vía oral, sufre parte de su aclaramiento renal por secreción tubular, entonces es de esperar que sea eliminada desde vítreo, al menos en parte, por transporte activo retiniano, respondiendo éste a una cinética de Michaelis-Menten potencialmente saturable. Los resultados han mostrado una eliminación de memantina del compartimento vítreo más lenta tras la administración intravítrea que tras la administración subtenon, encontrando diferencias estadísticamente significativas entre ambas vías en cuanto a las constantes de eliminación (Kel), los tiempos de vida media (T1/2-el) y las cifras de aclaramiento (considerando los aclaramientos normalizados por la dosis (CL_n)). Creemos que este hecho podría justificarse, bien porque los altos niveles vítreos alcanzados tras la administración intravítrea pudieran llevar a una saturación de los mecanismos de transporte activo retiniano o bien por una alteración en las bombas de transporte retiniano inducida por la inflamación de los ojos administrados mediante inyección intravítrea. Tras la administración intravítrea detectamos niveles de memantina en plasma a los 5 minutos de la inyección, niveles que fueron cuantificables hasta los 240 minutos en el caso de la formulación Ss y hasta los 360 minutos en el caso de las formulaciones Mc y Pvp. El paso de memantina a la circulación general desde el compartimento vítreo supondría, un mecanismo adicional de eliminación de la sustancia desde vítreo, junto a la eliminación por vía anterior y posterior, Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 239 mencionadas anteriormente. En nuestra opinión la contribución de la vía hemática a la eliminación de memantina desde vítreo no parece muy importante, si tenemos en cuenta que los niveles de memantina en plasma tras la administración intravítrea fueron bajos, con datos de Cmax que no alcanzaron los 50 ng/mL con ninguna de las formulaciones. Las características de absorción plasmática de memantina tras la administración intravítrea fueron similares para las tres formulaciones, aunque con tendencia a una absorción más rápida para la formulación Mc que por su parte fue la que presentó la cinética de eliminación más lenta, con un tiempo de vida media de eliminación (T½-el) próximo a las 10 horas y un aclaramiento de unos 90 mL/min, no existiendo significación estadística en esta diferencia respecto a las otras dos formulaciones, posiblemente por la variabilidad de los datos experimentales para la formulación Mc, que hizo que los valores medios de dichos parámetros se vieran arrastrados por los valores extremos del primer individuo de la tripleta. La cinética plasmática de memantina tras la administración intravítrea fue más lenta que tras la administración subtenon, si bien no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ambas vías, ni en los parámetros de absorción (Kab y T½-ab) ni en los parámetros de eliminación (Kel y T½-el). El perfil farmacocinético vítreo de memantina tras la administración endovenosa mostró un comportamiento monocompartimental con una rápida absorción. Los tiempos de vida media de absorción (T½-ab) próximos a los 7 minutos, no se alejaron mucho de los encontrados para la administración subtenon, los cuales no superaron los 2 minutos. De hecho, la comparación de las cinéticas de absorción Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 240 vítrea de memantina tras la administración subtenon y endovenosa, no arrojó diferencias estadísticamente significativas entre ellas en cuanto a los parámetros básicos de absorción (Kab y T½-ab). Sin embargo, el tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima de memantina en humor vítreo (Tmax) fue menor tras la administración STP (4.0 minutos) que tras la administración endovenosa (29.7 minutos), siendo esta diferencia estadísticamente significativa, lo que podría dar una idea de la velocidad de difusión de memantina a través de la esclera frente a la velocidad de penetración a través de la barrera hematorretiniana interna. La concentración máxima (Cmax) de memantina en vítreo tras la administración endovenosa (0.10 µg/mL) resultó muy inferior a la alcanzada tras la inyección subtenon (35.09 µg/mL), coincidiendo con lo observado para otras sustancias al comparar su administración periocular y sistémica (Ayalasomayajula, 2004; Gilbert, 2003), y que da una idea de la importancia de la permeabilidad selectiva de la barrera hematorretiniana interna en la administración sistémica y de la necesidad de administrar altas dosis del fármaco por esta vía para alcanzar niveles eficaces en el segmento posterior del ojo. Koeberle en sus experiencias in vitro con ojos de oveja perfundidos, encuentra que tras la administración endovenosa el humor vítreo es el tejido ocular en el que se alcanzan las menores concentraciones de memantina, alcanzándose los mayores niveles en los tejidos con alto contenido en melanina, como el cuerpo ciliar y la coroides; y sitúa estos niveles próximos a los alcanzados en los ojos contralaterales tras la administración subtenon (Koeberle, 2006). En nuestro caso, no encontramos diferencias significativas en los valores de los AUC´s de niveles vítreos obtenidos tras la administración subtenon en los ojos contralaterales (11.3 µg*min/mL) y tras la administración endovenosa (26.4 µg*min/mL). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 241 La cinética de eliminación vítrea de memantina fue más rápida tras la administración periocular-subtenon que tras la administración endovenosa, encontrando diferencias significativas en los valores de la constante de eliminación (Kel) y en los valores de semivida biológica (T½-el) entre ambas vías, próxima a las 3 horas en el caso de la administración endovenosa y menor de 15 minutos tras la administración subtenon. Por su parte, el valor de la constante de eliminación vítrea de memantina (Kel) tras la administración endovenosa (0.0043 minutos-1) fue similar al encontrado en los ojos contralaterales tras la administración subtenon (0.0066 minutos-1), hecho que apoya la idea de una cinética vítrea de memantina en el caso de los ojos contralaterales dependiente de la absorción sistémica. Se obtuvieron cifras de aclaramiento vítreo de memantina significativamente mayores tras la administración endovenosa (173.4 mL/minuto frente a los 6.11 mL/minuto de la administración subtenon), condicionadas posiblemente por los altos valores de los AUC´s calculados para la vía subtenon respecto a la vía endovenosa. Encontramos diferencias significativas en la cinética plasmática de memantina entre la administración subtenon y la endovenosa, en cuanto a los parámetros cinéticos de eliminación Kel y T1/2-el, siendo ésta más lenta tras la administración periocular. Ayalasomayajula en sus experiencias con celecoxib no encuentra diferencias en las características cinéticas plasmáticas de la sustancia tras la administración subconjuntival (periocular) e intraperitoneal (sistémica), debido probablemente a que por ambas vías existe un proceso de absorción, y esto hace que el comportamiento de la sustancia sea similar (Ayalasomayajula, 2004). Pese a lo señalado anteriormente, los niveles de memantina en plasma tras la administración subtenon, a los 60 y 120 minutos postinyección, fueron del orden de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 242 los encontrados tras la administración endovenosa, para esos mismos tiempos cinéticos, dando una idea del grado de absorción sistémica de memantina tras su administración periocular subtenon, como también se ha visto tras la administración subconjuntival y peribulbar de otras sustancias con las que se han llegado a alcanzar niveles en plasma próximos a los encontrados tras su administración sistémica por vía oral (Weijtens, 2000). En nuestro caso, el paso de memantina a vítreo en relación a su absorción plasmática desde el espacio subtenon, ha tomado valores superiores a la unidad, indicando un predominio de la absorción de memantina a vítreo respecto a su paso a sangre desde el espacio periocular. Hemos analizado la biodisponibilidad vítrea de memantina desde distintos puntos de vista. En primer lugar, la biodisponibilidad vítrea absoluta tras la administración periocular-subtenon ha mostrado valores altos, próximos al 100%, con las tres formulaciones. Por su parte, la biodisponibilidad vítrea relativa de memantina tras la administración subtenon (respecto a la intravítrea) fue baja, tomando valores del 0.52%, 0.53 % y 0.58% para cada una de las formulaciones Ss, Mc y Pvp respectivamente, aunque superiores a los señalados por ejemplo, por Tsuji, que tras la administración subconjuntival de prednisolona en conejos obtiene una biodisponibilidad vítrea relativa del 0.2% (Tsuji, 1988) o por Kim, que encuentra una biodisponibilidad vítrea del 0.06% tras la aplicación de un implante escleral de DTPA (Kim, 2004). En cualquier caso, la biodisponibilidad vítrea de memantina tras la administración subtenon fue mayor que tras la administración sistémica endovenosa, a pesar de la capacidad de memantina para alcanzar el vítreo tras la administración Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 243 endovenosa, como demuestran los resultados de biodisponibilidad vítrea respecto a niveles plasmáticos, con una relación de AUC´s humor vítreo/plasma de 3.6. La biodisponibilidad vítrea de una sustancia tras su administración periocular se encuentra altamente condicionada por el grado de eliminación de la sustancia del lugar de la administración (vía de eliminación paralela), siendo ésta mayor para moléculas que se administran en solución (Gilbert, 2003). Según distintos autores existen una serie de mecanismos implicados en la eliminación periocular de la sustancia, con la consiguiente pérdida de dosis administrada. Por una parte, el aclaramiento linfático-sanguíneo conjuntival y epiescleral (Kim, 2004; Robinson, 2006) y por otra, la pérdida de dosis adicional por dispersión del volumen inyectado en el espacio y tejidos perioculares, con posibilidad incluso de reflujo del volumen inyectado y dilución en la película lagrimal (Conrad, 1980). Esta diferente dispersión-distribución del volumen inyectado en el espacio periocular, podría incluso justificar, la variabilidad interindividual de los datos experimentales en nuestro estudio. Para disminuir esta eliminación de la sustancia del lugar de la administración se han probado distintas estrategias, encaminadas a incrementar el tiempo de residencia del fármaco en el espacio periocular mediante la administración de fármacos en suspensión (Augustin, 2005) o en soluciones viscosas (Sasaki, 1999), mediante la asociación de epinefrina y otros agentes vasoconstrictores tópicos en la administración o mediante el empleo de formulaciones a base de nanoy micropartículas (Amrite, 2005); otros como Kim y Okabe han intentado mantener aislado el inóculo mediante el emplazamiento del fármaco o de la formulación que lo contiene, en bolsillos esclerales (Okabe, 2003; Kim, 2004). Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 244 Puesto que la mayoría de los estudios de farmacocinética ocular del segmento posterior, miden concentraciones del fármaco en humor vítreo, como concentraciones representativas de las alcanzadas a nivel retiniano (Lee, 2004(II)), nosotros hemos intentado teorizar sobre la cinética vítrea de memantina tras su administración periocular-subtenon posterior. A partir de los resultados obtenidos de nuestras experiencias cinéticas hemos desarrollado un modelo cinético teórico. Probablemente nuestro modelo no sea lo suficientemente preciso, pero permite hacernos una idea general de la disposición de memantina cuando ésta es administrada periocularmente por vía subtenon. El modelo cinético que hemos propuesto para la administración periocularSTP de memantina, ha sido similar para las tres formulaciones ensayadas, considerando un modelo de cuatro compartimentos: espacio periocular (C1), plasma (C2), humor vítreo (C3) y un cuarto compartimento, denominado compartimento distribución (C4); siendo K12 la constante de transferencia de memantina desde plasma al compartimento distribución y K21 la constante de retorno desde el compartimento distribución al compartimento plasmático. El análisis de los modelos cinéticos propuestos con anterioridad por otros autores, respecto a la administración periocular, se inicia con un modelo simple de dos compartimentos, como el propuesto por Tsuji (1988) y/o Lee (2004), para describir la liberación de prednisolona al segmento posterior tras su administración subconjuntival, en el que incluyen el espacio periocular y el compartimento vítreo, considerando el paso directo de la sustancia a vítreo y una vía de eliminación paralela a la eliminación vítrea, desde el propio espacio periocular, que supondría Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 251 La medición de la presión intraocular (PIO) se realizó mediante tonometría dinámica de impacto, con la utilización de un tonómetro de rebote tipo Tono-Vet®, muy utilizado en clínica-veterinaria, en base a la simplicidad de la técnica y a que no precisa para su realización de anestesia tópica en gotas. Obtuvimos una variación media de la PIO prey postinyección de aproximadamente 2.5 mmHg en el grupo de 24 horas, y de 2 mmHg en el grupo de 7 días, no encontrando significación estadística respecto a esta variación entre los grupos. Se ha descrito como uno de los efectos adversos más frecuentes de las inyecciones intravítreas la elevación de la presión intraocular, derivada de la introducción de un volumen adicional en el compartimento vítreo, y que en cualquier caso suele ser transitoria o de fácil control mediante tratamiento hipotensor tópico (Arias, 2009). Debemos precisar que la estimación de la PIO se hizo en todos los casos con el animal despierto y sin necesidad de anestesia tópica. No está claro en qué medida el empleo de medicaciones de tipo anestésico-sedante puede influir en la medición de la PIO, sin embargo, nosotros consideramos oportuno realizar la toma de la PIO sin premedicación del animal para no introducir posibles variables de confusión en el proceso. Los resultados publicados al respecto, establecen diferencias en el efecto de los fármacos sedantes y anestésicos sobre la PIO, en función del tipo de medicación empleada y de la especie animal en la que se aplican, pero lo que está claro es que bajo su efecto aumenta la variabilidad interindividual en la medición de la PIO (Jia, 2000). En el caso de xilacina, por ejemplo, su efecto sobre la PIO es distinto si se administra sola (reduce las cifras de PIO) o en combinación con ketamina (no produce cambios significativos en la PIO), y por su parte, ketamina cuando se utiliza de manera aislada produce un aumento de las cifras de presión intraocular. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 252 Tras la administración intravítrea de memantina, no observamos en ningún caso erosiones o úlceras corneales ni signos inflamatorios a nivel del polo anterior, considerando éstos como la presencia de hiperemia-congestión venosa conjuntival o quemosis. Tampoco encontramos ningún caso de hemorragia subconjuntival, a pesar de ser ésta una de las complicaciones más frecuentemente observadas con las inyecciones intravítreas, y que por otra parte, deriva del propio procedimiento de inyección (Jager, 2004). En uno de los ojos administrados con memantina, en el examen a los 7 días postinyección, pudimos observar la presencia de una membrana de fibrina en el borde pupilar del iris, probablemente motivada por la atalamia generada tras una paracentesis excesiva, en la que se evacuaron más de 0.1 mL de humor acuoso. En ningún caso, este hallazgo fue considerado como clínicamente significativo, puesto que no produjo compromiso de la transparencia corneal ni asoció signos de actividad inflamatoria a nivel de otras estructuras oculares. En todos los ojos administrados con memantina, tanto en el grupo de 24 horas como en el de 7 días, se evidenciaron opacidades en el cristalino, que en ninguno de los casos fueron corroboradas en el análisis histopatológico. Gillies justifica la aparición de catarata subcapsular posterior tras la inyección intravítrea, como un efecto derivado del aumento de la presión intraocular tras la inyección, más que por efecto cataratógeno de la sustancia, a diferencia de lo que ocurre en el caso de los corticoides intravítreos, capaces de inducir daño en el cristalino por efecto oxidativo. En otros casos se justifica la aparición de catarata por el efecto traumático de la inyección (Gillies, 2005), de hecho, la formación de cataratas se describe como una de las complicaciones más frecuentes asociadas a las inyecciones intravítreas, y que deriva Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 253 de la propia técnica de inyección (Jager, 2004; Arias, 2009). Sin embargo, ¿cómo se explicaría en nuestro caso, el hecho de haber encontrado catarata solamente en los ojos administrados con memantina y no en los ojos control, si tenemos en cuenta que la técnica y procedimiento de inyección fueron los mismos en ambos grupos? Esto nos hace pensar que o bien no se trataba realmente de cataratas, de hecho en el estudio anatomo-patológico no se encontraron signos de esclerosis ni desnaturalización de las proteínas del cristalino, o bien que dichas opacidades del cristalino, corresponden a depósitos de la medicación administrada, en la cara posterior del cristalino, justificando así su localización capsular posterior en todos los casos y la ausencia de alteraciones histológicas a nivel de la capsula y/o del epitelio subcapsular cristaliniano. Frente a lo observado con otras medicaciones como el acetónido de triamcinolona que administrada por vía intravítrea en dosis altas, puede interferir en la claridad vítrea, formando incluso precipitados en el humor vítreo (Ruiz Moreno, 2007), en nuestro caso, memantina presentó una buena dispersión en vítreo tras su administración, no interfiriendo en la claridad vítrea. Este hecho supondría una ventaja desde el punto de vista de su administración en humanos por cuanto no produciría alteración en la visión (visión borrosa). Respecto a la aparición de hemorragia vítrea en uno de los ojos administrados en el grupo de 7 días, creemos que ésta puede justificarse más por el efecto traumático de la inyección que por un posible efecto de la medicación sobre la permeabilidad de los vasos retinianos, ya que no se ha documentado la presencia de receptores NMDA a nivel de los vasos retinianos. En el análisis histopatológico de alguno de los ojos, pudo identificarse la presencia de una sustancia extraña en la luz de los grandes vasos retinianos, que por Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 254 sus características tintoriales basófilas podría responder a un compuesto ácido, como el pentobarbital. La presencia de células de estirpe inflamatoria de tipo polimorfonucleares neutrófilos en los ojos de 24 horas y mononucleares en los ojos de 7 días, observadas a nivel del cuerpo ciliar y del compartimento vítreo, carece en principio de significación clínica y responde básicamente a un mecanismo intrínseco y fisiológico de defensa del ojo, en respuesta al procedimiento invasivo de la inyección. En ningún caso, dicha reacción inflamatoria comprometió la integridad de los tejidos ni afectó a estructuras críticas como la retina o el nervio óptico. El edema de papila (cabeza del nervio óptico) es analizado en muchos trabajos como un marcador de toxicidad, aunque éste puede aparecer en respuesta a procesos de hipoo hiperpresión ocular bruscos. En nuestro caso, el aspecto de la papila fue normal en todos los ojos administrados, tanto en el grupo de 24 horas como en el de 7 días. No se evidenciaron signos de toxicidad a nivel retiniano, encontrando una buena conservación de la citoarquitectura y proporciones de las distintas capas celulares retinianas (capa de células ganglionares, nuclear interna y nuclear externa) sin observar signos de adelgazamiento. Tampoco se documentaron alteraciones en la transición entre la capa de los fotorreceptores y la retina neurosensorial. Por su parte, los fenómenos de disrupción del EPR observados en algunos de los cortes histológicos, pueden deberse más a un artefacto relacionado con el exceso de fijación de la muestra que a un efecto tóxico de la memantina, en cuyo caso, el análisis histopatológico habría puesto de manifiesto la presencia de zonas localizadas de pérdida de fotorreceptores y agregación de células pigmentadas, con concentración de pigmento intrarretiniano, como las que se pueden observar en los casos de Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Discusión 255 toxicidad retiniana por antipalúdicos (Tzekov, 2005). En el examen histológico evidenciamos la presencia de un desprendimiento de retina asociado a edema coroideo localizado subyacente, en dos ojos, uno de los cuales pertenecía al grupo control. Dado que en ninguno de los casos identificamos la presencia de líquido subretiniano asociado ni signos degenerativos en la capa de los fotorreceptores, sospechamos un desprendimiento de retina artificial, resultante de un artefacto en la fijación de los tejidos (Ruiz-Moreno, 2007). De nuestros resultados podemos deducir que la administración intravítrea de memantina es segura. Muchos estudios de toxicidad retiniana emplean test electrofisiológicos, como el electrorretinograma (ERG), para evaluar el efecto potencial de la sustancia sobre la función de las células retinianas, aunque se ha visto que los test funcionales son menos sensibles que las pruebas histopatológicas, y en ningún caso deben sustituir a éstas, sino completarlas. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Conclusiones 259 1. La farmacocinética vítrea de memantina en conejos tras las administración periocular-subtenon respondió a un modelo monocompartimental con absorción, mostrando un paso muy rápido de la sustancia a vítreo desde el espacio periocular y una vida media de memantina en vítreo corta (alrededor de los 15 minutos), no encontrando diferencias significativas entre las tres formulaciones en cuanto a los parámetros cinéticos de absorción y eliminación vítrea. 2. Nuestros resultados muestran una absorción local transescleral predominante para memantina tras su administración periocular-subtenon frente a la contribución de la vía hemática, con valores de los AUC´s de niveles vítreos claramente superiores para la administración subtenon frente a la vía endovenosa. Se ha estimado que tras la administración periocular STP de memantina la proporción de sustancia administrada que penetra en el ojo mediante absorción local es aproximadamente de un 99%. 3. Tras la administración periocular-subtenon de memantina se detectaron niveles de la sustancia en vítreo de los ojos contralaterales. La cinética vítrea de memantina en los ojos contralaterales puede darnos una idea de la contribución de la vía hemática en la consecución de niveles vítreos tras la administración periocular. 4. La cinética plasmática de memantina tras la administración periocular-subtenon evidencia un paso rápido de la sustancia a sangre, y representa la pérdida de dosis Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Conclusiones 260 tras la administración periocular debida al aclaramiento sanguíneo de la sustancia del lugar de la inyección. 5. Los resultados de nuestro estudio muestran una importante biodisponibilidad absoluta de memantina tras la administración periocular-subtenon muy superior a la de la administración sistémica endovenosa. La biodisponibilidad vítrea relativa de memantina tras la administración subtenon fue baja, con un valor medio aproximado del 0.54% aunque superior a la de la vía sistémica endovenosa (0.02%). 6. La cinética vítrea de memantina tras la administración intravítrea estuvo caracterizada por elevadas áreas bajo la curva, bajos volúmenes de distribución, caída rápida de los niveles vítreos hasta los 120 minutos y semividas de eliminación de entre 50 y 100 minutos; no mostrando diferencias significativas entre las formulaciones ensayadas. 7. La cinética plasmática de memantina tras la administración sistémica endovenosa mostró un perfil monocompartimental, con una semivida de eliminación de 40 minutos, bajos valores de las áreas bajo la curva y altos volúmenes de distribución. 8. El análisis de la cinética vítrea de memantina tras su administración sistémica endovenosa en dosis única mostró una rápida absorción vítrea, con tiempos de vida media de absorción similares a los de la administración periocular, pero con Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Resumen 267 No se detectaron signos de toxicidad retiniana tras la administración intravítrea de memantina, y por su parte, la administración subtenon e intravítrea de las nanopartículas de Gantrez fue segura. Memantina, farmacocinética y tolerancia ocular Bibliografía 271 1. Acheampong AA, Shackleton M, John B, Burke J, Wheeler L, Tang-Liu D. Distribution of brimonidine into anterior and posterior tissues of monkey, rabbit, and rat eyes. Drug Metab Dispos. 2002; 30(4): 421-429. 2. Ahmed I, Patton TF. Importance of the noncorneal absorption route in topical ophthalmic drug delivery. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1985; 26(4): 584-587. 3. Ambati J, Adamis AP. 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Optimal conditions for derivatization were an FMOC-Cl concentration of 1.5 mM, a reaction time of 20 min, the temperature at 30°C, the borate buffer pH 8.5, and a borate buffer–acetonitrile ratio of 1:1. The derivatives were analyzed by isocratic HPLC with the fluorescence detector λex 260 nm λem 315 nm on a Novapack C18 reversed-phase column with a mobile phase of acetonitrile–water (73:27, v/v), 40°C, and a flow rate of 1.2 mL/min. The linear range was 10–1000 ng/mL with a quantification limit of ~ 10 ng/mL for both types of samples. This analytical method may be suitable for using in ocular availability studies. Introduction Memantine (1-amino-3, 5-dimethyladamantane hydrochloride) is a novel, low-to-moderate affinity, noncompetitive Nmethyl-D-aspartate receptor antagonist of the open channel blocker type (Figure 1). Memantine is used in the treatment of Parkinson’s disease, some types of movement disorders (1), some dementia syndromes (2), and has recently been described as a potential treatment for glaucoma (3). Memantine may rescue neurons by blocking excessive glutamate receptor activation and has been tested as a treatment for glaucoma (4–6). Analysis of memantine concentrations in tissues is complicated because the molecule has no ultraviolet, visible, or fluorescent absorption, and cannot be directly quantified by chromatographic methods using spectrophotometric or fluorescence detection. Methods to determine the concentrations of memantinerelated compounds (amantadine, rimantadine, aminoacids, and polyamines) in biological samples include extraction and derivatization techniques coupled with gas chromatography (GC) or high-performance liquid chromatography (HPLC). A number of different derivatization reagents have been used in most of these determinations: pentafluorobenzoyl chloride (7), trichloroacetyl chloride (8, 9), 9-fluorene acetate (10), 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzene (11), o-phthaldiadehyde and 1-thio-β-glucose (12), dansyl chloride (13), and 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (14). A new HPLC method for the determination of amantadine and its analogues in rat plasma derivatized with anthraquinone-2-sulfonyl chloride (ASC) with UV detection has recently been described (15). A number of methods to measure memantine concentrations in plasma have been developed using LC methods with fluorescence detection and dansyl chloride as the derivatization agent (16) or, alternatively, using (2-naphthoxy) acetyl chloride as the fluorescent reagent (17). These methods have shown high quantification limits (LOQ) for biological samples and pharmaceutical formulations (17) although none of them have been used to assay vitreous humour samples. Other studies, in which memantine concentrations were quantified in plasma, cerebrospinal fluid, urine, blood, and other tissues, used instruments that are not always readily available in laboratories, such as gas and liquid chromatography-mass spectrometry (18–22). 745 Abstract Determination of Memantine in Plasma and Vitreous Humour by HPLC with Precolumn Derivatization and Fluorescence Detection Belen Puente1, Esther Hernandez2, Susana Perez3, Luis Pablo3, Esther Prieto3, Maria Angeles Garcia1,and Miguel Angel Bregante2,* 1Department of Analytical Chemistry, School of Veterinary Science, University of Zaragoza, Miguel Servet 177, 50013 Zaragoza (Spain); 2Department of Pharmacology and Physiology, School of Veterinary Science, University of Zaragoza, Miguel Servet 177, 50013 Zaragoza (Spain); 3Department of Ophthalmology, Miguel Servet University Hospital, University of Zaragoza (Spain) Reproduction (photocopying) of editorial content of this journal is prohibited without publisher’s permission. Journal of Chromatographic Science, Vol. 49, November/December 2011 *Author to whom correspondence should be addressed: email [email protected]. Figure 1. The structure of memantine. Journal of Chromatographic Science, Vol. 49, November/December 2011 746 FMOC-Cl (9-fluorenylmethyl chloroformate chloride) has been shown to be a suitable reagent for fluorescence labelling of polyamines and primary and secondary amines (23–25). FMOC-Cl has been used for the analysis of amino acids (26–28) and for assays of aminoglycoside antibiotics and other compounds containing amino groups (29–34). A method has been described by Hare et al. (6) for the quantification of memantine in serum and vitreous humor by HPLC and derivatization with FMOC-Cl in a study of glaucoma in monkeys. This study did not optimize the analytical conditions and no information was given on the internal standard (IS) used or the LOQ. As memantine was eluted at 40 min, it is assumed that the LOQ were high. The aim of the present study was, firstly, to develop and validate a simple, specific, and rapid method of determining memantine concentrations in the vitreous humour and plasma by HPLC with fluorescence detection using FMOC-Cl as a derivatizing reagent, and, secondly, to test this method after subtenon (periocular) administration of a saline formulation of memantine. Experimental Reagents and standard solutions Memantine hydrochloride, amantadine hydrochloride, rimantadine hydrochloride, and neomycin hydrochloride were purchased from Sigma (St. Louis, MO). Apramycin hydrochloride and glycine were obtained from Lab Maymo (Barcelona, Spain) and Serva (Barcelona, Spain), respectively. The derivatizing agent, FMOC-Cl, was supplied by Sigma. Acetonitrile, methanol, and other solvents used were HPLC-grade and purchased from Scharlau (Barcelona, Spain). Water was purified using a Milli-Q system (Millipore, MA). Stock solutions of memantine, the IS (100 µg/mL), and glycine (0.1 M) were prepared in purified water, aliquoted to eppendorfs, and stored at –20°C to minimize their potential degradation. Working solutions were obtained daily by diluting these stock solutions with purified water. Memantine working solutions were prepared in the range of concentrations of 0.2–20 µg/mL and IS was prepared at 1 µg/mL. FMOC-Cl solution (90 mM) was prepared in acetonitrile protected from light with aluminum foil and kept at 4°C until used. Chromatographic instrumentation and conditions The analysis was performed with a Waters (Barcelona, Spain) HPLC system equipped with two 515 HPLC pumps, a Gecko-2000 column heater (CIL Cluzeau Info Labo, Paris, France), a M-717 autosampler with the injection volume set to 10 µL, and a 474 fluorescence detector (λex/em: 260/315 nm). The chromatograms were processed by Millennium Integration System 2000 from Waters Corporation (Milford, MA). Two types of columns from Waters were assayed: a Nova-Pak C18 reversed-phase column (150 mm × 3.9 mm i.d., 4 µm) protected by a guard column cartridge (20 mm × 3.9 mm i.d.) of the same material; and a Spherisorb ODS (250 mm × 4.6 mm i.d., 5 µm). Both columns were heated at 25°C, 30°C, and 40°C during the analysis. Likewise, different mobile phases were assayed, starting in isocratic mode with diverse proportions of an acetonitrile–water mixture (90:10, 80:20, 75:25, 73:27, and 65:35, v/v), as well as using gradient mode in a range of concentrations from 65:35 to 90:10 at different times. In addition, a methanol–water mixture was assayed in an isocratic mode at different proportions (90:10, 85:15, and 83:17, v/v). The mobile phase was filtered, degassed, and pumped at a flow rate of 1.0 and 1.2 mL/min. The IS was chosen by testing different compounds with physico-chemical characteristics similar to those of memantine hydrochloride, such as amantadine hydrochloride, neomycin hydrochloride, apramycin hydrochloride, and rimantadine hydrochloride. Optimization derivatization and extraction conditions The reaction of FMOC-Cl with amines is shown in Figure 2. This reaction of memantine with FMOC-Cl was optimized using a working solution of memantine at 1 µg/mL as a model. Several parameters were assayed: the FMOC-Cl concentration (0.1–5 mM); the borate buffer–acetonitrile ratios (1:1–2:1, pH 5–10); the borate buffer concentration (0.025–0.2 M); temperature (25–55°C); and reaction time (5–50 min). The FMOC-Cl reaction was stopped using different methods (glycine, methanol, or rapidly lowering temperature to 4°C). Plasma and vitreous humour samples were frozen at –20°C until used. All samples were thawed to ambient temperature and centrifuged at 4000 rpm for 10 min. The upper layer was collected, filtered through a 0.2 µm pore nylon membrane, and aliquots (250 µL) with alkaline solution to control the amino group protonation were obtained to be derivatizated, extracted, and analyzed later. Different solvents were assayed by liquid–liquid extraction [e.g., dichloromethane, diethyl ether-chloroform mixture (7:3, v/v), and n-hexane]. Other variations assayed were different proportions of extraction solvent: 1:1, 1:2, 1:3, and 1:5 (v/v); extraction in one or two stages; and verification of extraction before or after the derivatization reaction. After the derivatization reaction, the samples were extracted and agitated for 60 s on a vortex mixer. The samples were shaken at 224 oscillations/min for 30 min and centrifuged at 4000 rpm for 10 min. The organic phase then was removed and evaporated to dryness in a thermostatic bath (40°C) under nitrogen stream. The residue was reconstituted with 50 µL of acetonitrile and agitated in a vortex for 2 min; 10 µL of the solution was used for HPLC analysis. The recovery of memantine was determined by comparing peak heights ratios obtained from the spiked vitreous humour and plasma samples and the standard aqueous samples. The assay was determined at seven concentration levels in all dynamic range (10–1000 ng/mL) using three replicates per concentration. Figure 2. Simplified reaction scheme for the derivatization of memantine with 9-fluoroenylmethyl chloroformate chloride (FMOC-Cl). R = C12H19 (Tricycle of memantine). Fax +41 61 306 12 34 E-Mail [email protected] www.karger.com Original Paper Ophthalmic Res DOI: 10.1159/000337136 Gantrez AN Nanoparticles for Ocular Delivery of Memantine: In vitro Release Evaluation in Albino Rabbits E. Prieto a B. Puente b A. Uixera c J.A. Garcia de Jalon c S. Perez a L. Pablo a J.M. Irache e M.A. Garcia b M.A. Bregante d a Department of Ophthalmology, Miguel Servet University Hospital, and Departments of b Analytical Chemistry, c Animal Pathology and d Pharmacology and Physiology, Veterinary Faculty, University of Zaragoza, Zaragoza , and e Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, University of Navarra, Pamplona , Spain Introduction Glaucoma affects 65 million people in the world and is the second main cause of blindness. Nearly 10% of ophthalmological disorders are related to this pathology. This ocular disease is a neurodegenerative disease characterized by progressive degeneration of retinal ganglion cells [1] . It is characterized by structural changes in the optic disc and retinal fibre layer, as well as irreversible visual field loss. Reducing intraocular pressure helps to prevent the appearance of glaucoma and its progression in some patients; however, the reduction of intraocular pressure alone is not always effective. Neuroprotection refers to the use of any treatment modality that prevents, retards or reverses neuronal cell death resulting from primary neuronal lesions [2, 3] . The concept of ocular neuroprotection has been advanced to treat the primary problem of glaucoma and/or neuronal death and is the name given to treatments directed at the loss of neurons. This address is the mechanism by which cell injury results in cell death or dysfunction, while lowering intraocular pressure, thus addressing the process responsible for cell injury. Excessive activity of NMDA-type (N-methylD -aspartate) glutamatergic channels has been pointed to as a Key Words Memantine ⴢ Retina ⴢ Nanoparticles ⴢ Gantrez Abstract Aim: To prepare and evaluate the in vitro release of memantine-loaded poly(anhydride) (Gantrez 쏐 ) nanoparticles (NPs). The clinical safety and retinal toxicity caused by unloaded NPs after sub-Tenon and intravitreal ocular injections were also evaluated. Methods: Preparation and characterization of this type of NP as well as the in vitro release study are described. Twenty-three healthy New Zealand rabbits were used for clinical and histological assessment after sub-Tenon and intravitreal ocular injections of unloaded NPs. Results: The amount of drug associated with NPs was 55 ␮ g of memantine/mg of NP. The release profile of memantine from this type of NPs was characterized by an initial burst effect, followed by continuous release of the drug for at least 15 days. No relevant complications were found during the clinical follow-up. The histological evaluation suggested that Gantrez NPs are well tolerated after sub-Tenon ocular injection and that signs of inflammation during the first days after intravitreal ocular injections can be considered a normal reaction of the eye’s defence mechanism. Copyright © 2012 S. Karger AG, Basel Received: June 17, 2011 Accepted after revision: January 20, 2012 Published online: $ $ $ M.A. Bregante Department of Pharmacology and Physiology Faculty of Veterinary Medicine. Miguel Servet 177 ES–50013 Zaragoza (Spain) Tel. +34 976 761 627, E-Mail bregante  @  unizar.es © 2012 S. Karger AG, Basel 0030–3747/12/0000–0000$38.00/0 Accessible online at: www.karger.com/ore ore337136.indd 1ore337136.indd 1 03.04.2012 14:04:2503.04.2012 14:04:25 Prieto  /Puente  /Uixera  /GarciadeJalon  / Perez  /Pablo  /Irache  /Garcia  /Bregante  Ophthalmic Res 2 mechanism for neuronal injury in neurological disorders, including glaucoma and retinal disease. So memantine, an NMDA-type glutamatergic channel blocker, could be effective in reversing experimental excitotoxicity [4] . Memantine (1-amino-3,5-dimethyladamantane) is a low-affinity voltage-dependent uncompetitive antagonist to glutamatergic NMDA receptors. This drug is able to inhibit the prolonged flow of Ca 2+ ions which represents the basis of neuronal excitotoxicity. Therefore, memantine may rescue neurons by its blockade of excessive glutamate receptor activation and can prevent ganglion cell death mediated by NMDA activation. Currently, studies have shown that treatment with memantine protected retinal ganglion cells in monkey models of glaucoma, reducing ganglion cell loss during treatment with this drug, measured by multifocal electroretinography and visual evoked responses [5] . So far, clinical applications of these neuroprotective therapies have been conditional upon the highly systemic doses needed to achieve treatment concentrations in target tissue, such as the retinal ganglion cell layer. An important goal is the development of a safe and effective means of chronic delivery of memantine to the posterior pole [6–8] . At present, eye medications are given in different ways including topical, systemic, intraocular and periocular. When a systemic route (i.e. parenteral or oral) is used, the main concern is that drug doses are usually too high and side effects are exacerbated. On the other hand, when a drug is delivered topically (e.g. as eye drops), the fraction of dose remaining on the corneal surface is usually too low to achieve effective drug concentrations in the vitreous or other internal tissues [9, 10] . Therefore, in many cases, only ‘invasive’ forms of delivery (i.e. intravitreal or sub-Tenon routes) are capable of offering sufficient drug concentrations to the inner parts of the eye. Specifically, nanoparticles (NPs) have been proven to come in useful in increasing the bioavailability of some active molecules in ophthalmology [11–14] . In our case we selected a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (Gantrez 쏐 AN) as material for the preparation of NPs. This copolymer is widely used for pharmaceutical and medical purposes. In addition, the resulting NPs have demonstrated adequate abilities to control the release of the loaded drug and its biocompatibility [11–13] . The objectives of this study were the preparation, characterization and in vitro evaluation of memantineloaded NPs. In addition, the clinical safety and retinal toxic response induced by these NPs after sub-Tenon and intravitreal administration were also evaluated. Materials and Methods Chemicals Gantrez AN 119 [poly(methyl vinyl ether-comaleic anhydride) or poly(anhydride); MW 200,000] was a kindlgift by ISP (Barcelona, Spain). Memantine hydrochloride (grade 1 98% GC) was provided by Sigma-Aldrich (Barcelona, Spain). Acetone and ethanol were obtained from VWR Prolabo (Fontenay-sous-Bois, France) and phosphate-buffered saline from Gibco (Spain). o - Phthalaldehyde was supplied by Molecular Probes (USA). All other chemicals used were of analytical grade and obtained from Merck (Madrid, Spain): methanol, 2-mercaptoethanol, boric acid, potassium hydroxide. Preparation of Poly(anhydride) NPs Poly(anhydride) NPs were prepared by a solvent displacement method [15] . Memantine was then added to the NPs by simple incubation in an aqueous medium at room temperature. Briefly, 10 ml of an ethanol-water mixture (1: 1, v/v) was dripped slowly into 5 ml of previously dissolved acetone containing 100 mg Gantrez AN. The organic solvents were removed under reduced pressure (Büchi R-144, Switzerland) and 10 mg of memantine hydrochloride, previously dissolved in 1 ml of water, was dispersed in the freshly prepared NPs and incubated for 30 min under magnetic stirring at room temperature. After this time, the resulting carriers were purified by centrifugation at 20,000 rpm for 20 min (sigma 3K30, Germany). The supernatants produced at the purification stage were collected and stored at –20  °  C in order to quantify the unloaded memantine. Finally, the pellets were resuspended in water, and the formulations were frozen and freeze-dried (Genesis 12EL, Virtis, USA) using sucrose (5% w/v) as a cryoprotector. The resulting formulation was termed memantine-loaded NPs. Control NPs were prepared in the same way, in the absence of memantine and all batches of lyophilized NPs were stored at room temperature until use. That period was less than 3 months after fabrication. During this period of time, and when the NPs are stored as dry powder under room temperature, the stability is higher than 1 year. Physicochemical Characterization of NPs The particle size and the ␨ -potential of NPs were determined by photon correlation spectroscopy and electrophoretic laser Doppler anemometry, respectively, using a Zetamaster analyser system (Malvern Instruments, UK). Samples were diluted with double distilled water (measure of size) or 1 m M KCl (quantification of ␨ -potential) and examined at room temperature. All measurements were performed in triplicate. The morphological characteristics of the NPs were examined by scanning electron microscopy (Zeiss DSM 940A SEM; Oberkochen, Germany) with a digital imaging capture system (Point Electronic GmbH, Halle, Germany). For this purpose, freeze-dried NPs were resuspended in ultrapure water and centrifuged at 20,000 rpm for 20 min at 4  °  C. Supernatants were then rejected and the pellets were mounted on a glass plate on metal stubs, using double-sided adhesive tape, and dried under hot flow air. Finally, the particles were coated with a thin layer of 12 nm of gold using an Emitech K550 sputtering device (Emitech, UK). The yield of the NP preparation process was determined by gravimetry as described previously [16] . Briefly, Gantrez AN NPs, freshly prepared, were freeze-dried in the absence of the cryoproore337136.indd 2ore337136.indd 2 03.04.2012 14:04:4403.04.2012 14:04:44 Properties of Memantine NPs Ophthalmic Res 3 tector. The yield was then calculated as the difference between the initial amount of polymer used to prepare NPs and the weight of the freeze-dried carriers. Memantine Quantification The amount of memantine added to the NPs was estimated by quantification of free memantine in the supernatants obtained during the purification phase using a fluorometric method with o -phthaldialdehyde, previously described [17] and validated [18] in terms of accuracy precision, specificity, linearity and detection limits. A stock standard solution of o-phthalaldehyde was prepared by dissolving it in methanol (125 mg in 1.5 ml); 200 ␮ l of 2-mercaptoethanol was then added and the mixture taken up to a volume of 100 ml with borate buffer 0.4 M , titrated to pH 10.4 with KOH. This solution was stored in the dark at 4  °  C for not more than 1 week. A stock standard solution of memantine was prepared by directly dissolving commercially available reagent in doubly distilled water at a concentration of 100 ␮ g/ml. Working solutions were prepared by diluting the stock solution in water within a range of 0–50 ␮ g/ml. In a set of 96 microtiter plates (Thermo Lab Systems, Vantaa, Finland) a volume of 50 ␮ l of working solution of memantine and 100 ␮ l of stock o -phthalaldehyde standard solution were added per well. After shaking the mixture for 60 s, fluorescence measurements were performed in a spectrophotometer at ␭ ex 340 nm and ␭ em 450 nm (Labsystems iEMS Reader MF, Finland). For analysis, the supernatants (obtained from control NPs and memantine NPs) were defrosted at room temperature and diluted with ultrapure water (1: 60, v/v). Each sample was assayed in triplicate and no interferences from the presence of poly(anhydride) were found in the memantine analysis. The amount of memantine associated with the NPs was calculated as the difference between the initial amount of memantine added and the amount of memantine determined in the supernatants. Thus, memantine loading was expressed as the amount of memantine (in micrograms) per milligram of NPs, whereas the association efficiency was determined as follows: association efficiency (%) = (Q associated /Q initial ) ! 100 w h e r e Q associated is the total weight of memantine entrapped in the batch of NPs and Q initial is the initial weight of memantine added. In vitro Release Study In order to obtain the memantine release profile from poly(anhydride) NPs, 10 mg of lyophilized memantine NPs was dispersed in 1 ml phosphate-buffered saline (from Gibco TM , pH 7.4, containing 0.1% sodium azide as preservative) in Eppendorf tubes. The samples were incubated at 37 8 1  °  C under agitation in a VorTemp 56 TM Shaking Incubator (Labnet International Inc.) for specified periods of time. At each time interval, samples were assayed in triplicate and blank Gantrez AN NPs were used as a control. After the incubation, formulations were centrifuged at 17,000 rpm (Allegra TM X-22R Centrifuge, Beckman Coulter) for 20 min at 4  °  C. The memantine released was quantified in the supernatants, which were frozen at –80  °  C to be analysed later by the fluorometric method as described above. The release profile was expressed in terms of cumulative release in percentages, and plotted versus time. Intravitreal and Sub-Tenon Administration All injections were performed under general anaesthesia and aseptic conditions. General anaesthesia was achieved by intramuscular injection of 20 mg/kg of ketamine and 2 mg/kg of xylazine. All formulations were prepared under aseptic conditions Sub-Tenon and Intravitreal Injection of NPs The ocular sub-Tenon injection was carried out in the posterior space; the ocular surface was anaesthetized using topical 4% lidocaine drops. Adequate exposure was obtained by placing an eyelid speculum. The episcleral layer was entered using a 22-gauge trocar, with a 0.85 ! 25-mm intravenous cannula made of polytetrafluorethylene. The trocar was advanced approximately 12– 15 mm into the episcleral space using a Zeiss Omi 99 microscope for visualization (Germany). Intravitreous injections (0.1 ml) were given (in both eyes) in the approximate centre of the vitreous humour through a 27gauge needle inserted below the superior rectus muscle, 2–3 mm from the corneal limbus. Previously, 0.1 ml of aqueous humour had been removed through a 27-gauge needle. Eventually, 23 healthy New Zealand white rabbits, weighing 2–3 kg and aged 2–3 months, were selected and divided into two lots (1 and 2). In lot 1 thirteen animals were injected intravitreally with 1.6 mg of NPs in 0.1 ml of saline solution. This group of animals underwent bilateral enucleation at 24 h and 1, 2, 3 and 6 weeks after injection. In lot 2 ten animals received 4 mg of NPs in 0.3 ml of saline solution through the sub-Tenon space. This group of animals underwent bilateral enucleation at 1, 2 and 3 weeks after treatment. One animal from each lot, intravitreally and via the sub-Tenon space, was used as a control and received only 0.1 ml and 0.3 ml of saline solution, respectively. Clinical Evaluation All rabbits from both the sub-Tenon and intravitreal groups were examined by slit lamp and indirect ophthalmoscopy before injection and at each successive predetermined time point (24 h, 1, 2, 3 and 6 weeks after injection for the intravitreal group, and 1, 2, 3 weeks after injection for the sub-Tenon group). The aim of the visual inspection was to look for signs of inflammation at the anterior pole of the eye. The frequency and severity of conjunctival hyperaemia and chemosis, subconjunctival haemorrhage, iris vessel engorgement and cataract formation were evaluated using a scale of 0–3 for grading: grade 0 for normal; 1 for slight conjunctiva and iris congestion; 2 for moderate, and 3 for severe congestion or hyperaemia. Cataract formation was analysed and encoded in terms of cataract type (nuclear, cortical or subcapsular), extension (focal or diffuse) and density (grade 1 corresponded to a slight opacity that provided a clear view of the details of the fundus; grade 2 indicated moderate opacity; grade 3 was total opacity, making observing details of the retina difficult). Vitreous clarity was evaluated by indirect ophthalmoscopic examination, and a scale of 0–4 was used for assessing this. Briefly, grade 0 indicated a clear view of retinal details, grade 1 corresponded to slight obscuration of retinal details; mild obscuration of retinal details with a clearer view of small retinal vessels was grade 2; moderate obscuration of retinal details with visibility of only large vessels corresponded to grade 3, while grade 4 indicated that only a faint view of the retina could be observed, only ore337136.indd 3ore337136.indd 3 03.04.2012 14:04:4403.04.2012 14:04:44 Prieto  /Puente  /Uixera  /GarciadeJalon  / Perez  /Pablo  /Irache  /Garcia  /Bregante  Ophthalmic Res 4 intuitively detecting the optic nerve papilla. Other findings such as vitreous haemorrhage, areas of local retinal inflammation, retinal detachment, retinal fibrosis or retinal haemorrhages were analysed in the fundus examination. H i s t o p a t h o l o g y After the macroscopic analysis, all rabbits that had been injected through the sub-Tenon space and intravitreally were euthanized by intravenous injection of 20% sodium pentobarbital (30 mg/kg) and the eyes immediately enucleated. Previously, the globes had been marked off at the 12-o’clock position with a scleral silk 6-0 suture. Then the globes of periocular tissues were removed (muscle, Tenon capsule and conjunctiva) and washed with 0.9% saline solution. An aqueous paracentesis with a 27-gauge needle was undertaken to decrease intraocular pressure before the injection of 0.1 ml of fixative solution into the vitreous cavity. Afterwards, the globes were immersed in 10% formaldehyde fixative solution and sent to the Histology and Pathology Department of Veterinary Science, University of Zaragoza, for analysis. The samples were processed and dyed with haematoxylin-eosin for light-microscopic examination and assessment of the following parameters: preservation of the architecture and normal proportions of the different eye structures, specifically the retinal layers (retinal pigment epithelium, inner and outer segments of photoreceptors, external nuclear layer, internal nuclear layer and ganglion cell layer). The presence of degeneration or necrotic processes, inflammatory signs and abnormal cell growths, such as atrophy, hyperplasia, neoplasia or neovascularization, was evaluated. A retinal morphometric analysis was performed using the Image Analysis System NIS-Elements ver. 3.07 (Nikon), to determine the neurosensory mean retinal thickness and both external and internal nuclear layers and ganglion cell layer thickness. Other parameters such as optic disc oedema or retinal detachment were also analysed. All procedures were carried out under Project License PI 07/07 approved by the in-house Ethics Committee for Animal Experiments from the University of Zaragoza (Spain). The care and use of animals was compliant with the Spanish Policy for Animal Protection RD1201/05, which meets the European Union Directive 86/609 on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. R e s u l t s Characterization of Gantrez NPs The main physicochemical properties of poly(anhydride) NP formulations are summarized in table1 . Overall, the memantine-loaded NPs displayed a similar mean size to that of control NPs (186 vs. 179 nm, respectively). Furthermore, both control and memantine-loaded NPs displayed a quite homogeneous aspect as indicated by the low polydispersity index. The morphological analysis by SEM confirmed that memantine-loaded NPs consisted of a homogeneous population of almost spherical and rough particles ( fig.1 ). On the other hand, slight differences in the negative surface charge were found for both types of NPs. Finally, the amount of drug associated with NPs was Table 1. Characterization of NPs (means 8 SD, n = 10) Size nm Polydispersity index ␨-Potential mV Yield % Memantine content ␮g/mg NP Encapsulation efficiency % NP 186826 0.08180.010 –48.382.5 8182 –– Mem-NP 179825 0.15480.032 –51.282.1 7882 54.6816.0 38.7811.8 N P = Gantrez AN control NPs; Mem-NP = memantine-loaded NPs. Size and polydispersity index of the NP batches were assessed by photon correlation spectroscopy, the ␨-potential by electrophoretic laser Doppler anemometry; yield of the polymer was transformed into NPs; memantine content indicates the amount of memantine loaded into NPs. Fig. 1. SEM for lyophilized NPs loaded with memantine. Scale bar = 1 ␮ m. ore337136.indd 4ore337136.indd 4 03.04.2012 14:04:4403.04.2012 14:04:44 Properties of Memantine NPs Ophthalmic Res 5 calculated to be about 55 ␮ g memantine per milligram of NPs, with an association efficiency of about 40%. In vitro Release Study Figure 2 shows the release profile of memantine from poly(anhydride) NPs under physiological conditions (phosphate-buffered saline, pH 7.4) over 15 days. These NPs displayed a biphasic release pattern characterized by an initial burst effect, followed by a continuous release of the drug over the course of at least 15 days. Initially, the amount of memantine released increased rapidly during the first 2 h. At this point about 35% of the loaded memantine had been released from the NPs. Levels of released memantine were then maintained constant for at least 7 days. On day 15, the amount of released memantine was slightly lower than on day 7, due probably to degrading. C l i n i c a l S a f e t y Ophthalmoscopic and Clinical Observations Tables 2 and 3 show the results of clinical examination after intravitreal and sub-Tenon administration of NPs. One and 2 weeks after treatment, variable degrees of conjunctival hyperaemia and chemosis – slight or mild – were found in all eyes in the sub-Tenon group; however, these had disappeared at the 3-week control. In 10 of 18 sub-Tenon-injected eyes, conjunctival haemorrhage was observed, coinciding with the injection site, around the superior rectus muscle insertion. Only 1 eye in the subTenon group showed vascular engorgement of the iris at week 2 after injection. Variable grades of cataract were observed in some eyes in the intravitreal group; however, this was not observed in the sub-Tenon group. In most cases, this manifested itself as a focal lens opacity located in the lower quadrants, in the posterior lens capsule, with higher density cataracts in eyes at the 3-week control but without this causing any difficulty for fundus examination. Immediately after the intravitreal injection, the formulation was visible as a whitish film in the vitreous. During the 6 weeks of follow-up, this film remained floating in the anterior vitreous next to the posterior surface of the lens and in the inferior vitreous forming whitish lumps. Four eyes that had received more traumatic NP intravitreal injections showed a vitreous haemorrhage, slightly obscuring the view of retinal details. Indirect ophthalmoscopy did not reveal any retinal lesion, such as retinal detachment or haemorrhage. None of the eyes showed optic disc inflammation or oedema. No signs of local retinal inflammation or retinal fibrosis were observed in either group. H i s t o p a t h o l o g y The histological analysis of eyes after NP sub-Tenon injection showed a certain degree of distortion in the cytoarchitecture of the outer retina, with disruption of the retinal epithelium and outer segments of the photoreceptors. This phenomenon was also observed in the control group. Morphometric analysis of the retina revealed no 0 Memantine release (%) 024 Time (h)a 68 10 20 30 40 50 0 0510 Time (days) b 15 Memantine release (%) 10 20 30 40 50 Fig. 2. Release profiles from memantine-loaded Gantrez NPs after incubation under physiological conditions: phosphate-buffered saline, pH 7.4 (0–15 days) at 37  °  C. Data are represented as means 8 SD (n = 3). a To 8 h. b To 15 days. ore337136.indd 5ore337136.indd 5 03.04.2012 14:04:4503.04.2012 14:04:45 Prieto  /Puente  /Uixera  /GarciadeJalon  / Perez  /Pablo  /Irache  /Garcia  /Bregante  Ophthalmic Res 6 significant differences between the intravitreal NP group and the control group as regards the thickness of the neural retina or outer nuclear layer, indicating no degeneration or atrophy of the retinal tissue. Figure 3 a–c shows the retinal appearance 1, 2 and 3 weeks after administration of unloaded sub-Tenon NPs. The architecture of the retinal layers was preserved in 5 of the 6 sub-Tenon eyes studied 3 weeks after administration. Only 1 eye showed a focus of retinal distortion, affecting mainly the ganglion cell layer, associated with oedema of the choroid; however, this fact was also observed in 1 of the control eyes. Inflammatory signs were present in the corneoscleral layer and ciliary body during the first 2 weeks after administration, reduced to minimal degrees 3 weeks after administration. No signs of degeneration were found in the retina 24 h, 1, 3 or 6 weeks after intravitreal injection of NPs. A focus of choroid oedema and swelling of the retinal nerve fibre layer was detected in only 1 eye 24 h after the intravitreal injection, and in this eye the ciliary body presented mild inflammatory infiltration. Unlike the sub-Tenon group, intravitreally injected eyes reveal inflammatory cells in the vitreous cavity. These inflammatory cells are composed mainly of monoand polynuclear cells at 24 h, and macrophages and giant multinuclear cells at 1 and 3 weeks, practically disappearing at 6 weeks ( fig.4 ). In only 1 case was the presence of cataract confirmed histologically. Discussion Memantine (1-amino-3,5-dimethyladamantane hydrochloride) is a novel, low-to-moderate-affinity, noncompetitive NMDA receptor antagonist of the open channel blocker type. Memantine is used in the treatment of Parkinson’s disease, some types of movement disorders [19] and some dementia syndromes [20] , and has recently been described as a potential treatment for glaucoma [21] . Different studies determining the presence of memantine in vitreous humour and plasma [22] , and the bioTable 2. Clinical safety after intravitreal injection of unloaded Gantrez AN NPs Analysis time Eyes Conjunctiva CH Iris Cataract VCS Fundus 1 day after injection 6 0.1.1.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 1.0.0.0.0.0 0.0.0.0.1.0 NL.NL.NL.NL.VH.NL 1 week after injection 6 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.2.1 1.1.1.1.1.1 VH.VH.NL.NL.VH.NL 3 weeks after injection 6 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 1.1.0.1.2.1 1.1.0.0.1.1 NL.NL.NL.NL.NL.NL 6 weeks after injection 6 0.0.0.0.1.1 0.0.0.0.0.0 1.1.0.0.0.0 0.0.0.1.2.1 0.1.0.1.1.1 NL.NL.NL.NL.NL.NL C onjunctiva: grade of conjunctival hyperaemia and chemosis (0 for normal; 1 for slight; 2 for moderate, and 3 for severe). CH: grade of conjunctival haemorrhage (0 for normal or absent; 1 for slight; 2 for moderate, and 3 for severe). Iris: grade of vascular engorgement of the iris (0 for normal or absent; 1 for slight; 2 for moderate, and 3 for severe). Cataract: 0 for clear lens; 1 for slight lens opacity with permission of clear view of fundus; 2 for moderate lens opacity, obscuring details of fundus; 3 for complete lens opacification with no view of fundus. VCS = Vitreous Clarity Score, see text. Fundus: NL = no lesions; VH = vitreous haemorrhage. Each column shows the individual score for each eye. Table 3. Clinical safety after sub-Tenon injection of unloaded Gantrez AN NPs Analysis time Eyes Conjunctiva CH Iris Cataract VCS Fundus 1 week after injection 6 2.1.1.1.2.2 0.1.2.1.2.1 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0. 0.0.0.0.0.0 NL.NL.NL.NL.NL.NL 2 weeks after injection 6 2.2.2.1.2.1 0.0.1.0.0.1 1.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 NL.NL.NL.NL.NL.NL 3 weeks after injection 6 1.1.1.0.0.0 0.1.1.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 0.0.0.0.0.0 NL.NL.NL.NL.NL.NL C onjunctiva: grade of conjunctival hyperaemia and chemosis (0 for normal; 1 for slight; 2 for moderate, and 3 for severe). CH: grade of conjunctival haemorrhage (0 for normal or absent; 1 for slight; 2 for moderate, and 3 for severe). Iris: grade of iris vascular engorgement (0 for normal or absent; 1 for slight; 2 for moderate, and 3 for severe). Cataract: 0 for clear lens; 1 for slight lens opacity, enabling clear view of fundus; 2 for moderate lens opacity, obscuring details of fundus; 3 for complete lens opacification with no view of fundus. VCS = Vitreous Clarity Score, see text. Fundus: NL = no lesions. Each column shows the individual score for each eye. ore337136.indd 6ore337136.indd 6 03.04.2012 14:04:4503.04.2012 14:04:45 Properties of Memantine NPs Ophthalmic Res 7 availability of memantine after sub-Tenon and intravitreous administration are being carried out by our research group [unpubl. data]. Further experimental studies to determine the possibility of using a drug delivery system to maintain an efficient level of intravitreal memantine for a longer period of time in order to improve its use in treatment are now also being carried out by our research group. Here we can point to our initial experimental studies using Gantrez AN NPs as carriers of memantine by different ocular treatment pathways. Memantine-loaded NPs were prepared by simple incubation of freshly prepared Gantrez AN NPs with memantine. After this incubation, the fraction of free drug was eliminated by purification and the resulting NPs dried by lyophilization. NPs displayed a homogeneous mean size of about 180 nm. The preparative process enabled us to yield highly homogeneous NPs as corroborated by measuring the polydispersity index (lower than 0.2–0.3) and the SEM photographs ( fig.1 ). Interestingly, the ␨ -potential of memantine-loaded NPs was not significantly different from that observed for empty NPs. This fact can be explained by a combination of two phenomena: physical entrapment in the matrix and covalent link to the surface of NPs. In the former, at least a fraction of free memantine would be entrapped in the matrix of Gantrez AN NPs, which could be due to the swelling of the particles in ab c Fig. 3. Histology of the retina on days 7, 14 and 21 after sub-Tenon i n j e c t i o n ( a–c ). The architecture of the retina layers was preserved. Vitreous cavity (V), ganglion cell layer (G), inner nuclear layer (IN), outer nuclear layer (OT), photoreceptor layer (rods and cones, RC) and retinal pigment epithelium (R). The disruption between the photoreceptor layer and the retinal epithelium is due to actual histological manipulation (D). HE stain. Original magnification ! 4 0 0 . Color version available online ore337136.indd 7ore337136.indd 7 03.04.2012 14:04:4503.04.2012 14:04:45 Prieto  /Puente  /Uixera  /GarciadeJalon  / Perez  /Pablo  /Irache  /Garcia  /Bregante  Ophthalmic Res 8 aqueous media forming a ‘sponge’ structure [23] . In the latter, memantine would be bound to the surface of Gantrez AN NPs after reaction between amino groups of the drug with the anhydride residues of the polymer, as has been described previously for the coating of these NPs with albumin [24] or flagellin [25] . The in vitro release kinetics of memantine would be a consequence of this bimodal distribution of the drug within the NPs. In fact, in vitro release experiments of memantine were characterized by a very rapid burst effect of about 20%, followed by a continuous release of the drug over the course of at least 8 h. In this study Gantrez NPs were administered by intravitreous and sub-Tenon routes, and both clinical safety and histological evaluations were carried out. The visual inspection of the eyes’ anterior segment revealed more inflammation, including conjunctival hyperaemia and chemosis in the sub-Tenon-injected eyes, probably due to greater manipulation of the periocular tissues in this route of administration. Nevertheless, signs of inflammation were mild to moderate and at the 3-week control had already disappeared. Cataract formation was observed in some eyes after intravitreal NP injection. In most cases, it was possible to observe focal lens opacity located in the lower quadrants at the posterior lens capsule. However, histological evidence of cataract, with fragmentation of cortical lens fibres and globules of denatured proteins were found in only 1 eye, suggesting that the lens opacities observed clinically – and interpreted as cataracts – were probably artefacts caused by the formulation of masses floating in the anterior vitreous in contact with the posterior surface of the lens, producing a false image of cataract. The formation of cataracts after intravitreal injections, as described above, suggests a traumatic origin associated with the injection technique. Moreover, posterior subcapsular cataract has been suggested to be more likely associated with elevated intra-ocular pressure after intravitreal injection of certain drugs [26] than with oxidative toxic damage induced by the NPs – an effect similar to the mechanism described for steroid-induced cataract. The NPs administered intravitreally as a suspension appeared floating as whitish films and lumps in the vitreous, whereas the eyes injected with saline solution or via the subTenon route appeared clear. The position of precipitates in the vitreous could be a key factor in the appearance of vitritis or local retinal damage [27] ; however, in our case indirect ophthalmoscopy did not reveal any sign of retinal damage such as fibrosis, haemorrhages, infiltrates or vascular proliferation. Only 1 of the eyes receiving NPs via the sub-Tenon space developed a focus of retinal distortion, affecting the ganglion cell layer and associated with oedema of the choroids. This was also observed in a control eye injected with saline solution, suggesting mechanical damage more than a chemical insult. The histological assessment of the different ocular tissues suggested that Gantrez NPs were well tolerated after sub-Tenon administration. The injuries observed are typical of physical trauma and tend to disappear with the passage of time. We observed a few inflammatory cells (lymphocytes) in the periocular tissue at the injection site but not in the retina or other ocular tissues. The intravitreal route could also be considered tolerable in most cases, since signs of inflammation observed in the vitreous cavity and ciliary body during the first days tend to disappear 6 weeks later without affecting the retina layers. This can be considered as a normal self-defence mechanism of the eye. The retina appeared normal with no apparent structural changes. The disruption in the outer segments of the photoreceptors observed in histopathological sections of some eyes was probably produced by histological handling itself. Our results suggest that rabbit eyes receiving poly(anhydride) NPs intravitreally or via the sub-Tenon route did not manifest any notable structural changes. It should be kept in mind that after intravitreal injection, NPs remain floating in the vitreous, and so this may interfere with patients’ visual clarity. The advantage of sub-Tenon administration is that NPs are retained at the site of injection without penetrating the vitreous [28] . Fig. 4. Macrophages (M) in the intravitreal cavity (V) 1 week after intravitreal administration. Retinal layers were preserved (RL). HE stain. Original magnification ! 4 0 0 . Color version available online ore337136.indd 8ore337136.indd 8 03.04.2012 14:04:4703.04.2012 14:04:47 Properties of Memantine NPs Ophthalmic Res 9 References 1 Weinreb RN, Khaw PT: Primary open-angle glaucoma. Lancet 2004; 363: 1711–1720. 2 Barkana Y, Belkin M: Neuroprotection in ophthalmology: a review. Brain Res Bull 2004; 62: 447–453. 3 Levin LA, Peeples P: History of neuroprotection and rationale as a therapy for glaucoma. 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