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2013 3 José Carlos Roche Bueno Vias inmunológicas en pacientes con Miastenia Gravis de novo Departamento Director/es Medicina, Psiquiatría y Dermatología Ara Callizo, José Ramón Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es José Carlos Roche Bueno VIAS INMUNOLÓGICAS EN PACIENTES CON MIASTENIA GRAVIS DE NOVO Director/es Medicina, Psiquiatría y Dermatología Ara Callizo, José Ramón Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Universidad de Zaragoza Facultad de Medicina Departamento de Medicina y Psiquiatría VÍAS INMUNOLÓGICAS EN PACIENTES CON MIASTENIA GRAVIS DE NOVO Memoria presentada para optar al grado de Doctor. Zaragoza. Septiembre 2012. JOSÉ CARLOS ROCHE BUENO 2 3 El Doctor D. José Ramón Ara Callizo, Médico Jefe del Servicio de Neurología del Hospital Universitario Miguel Servet de Zaragoza y Profesor asociado de la Universidad de Zaragoza hace constar que: Que el trabajo “Vías inmunológicas en pacientes con Miastenia Gravis de novo” presentado por D. José Carlos Roche Bueno ha sido realizado bajo mi dirección y se considera adecuado para ser defendido como tesis para la obtención del grado de Doctor en Medicina de la Universidad de Zaragoza, ante el tribunal que se designe. Zaragoza, Julio 2012. Dr. D. José Ramón Ara Callizo 4 5 A mis padres 6 13 TAC: tomografía axial computarizada TPMT: tiopurina metiltransferasa, del inglés thiopurine methyltransferase SFEMG: electromiograma de fibra aislada (del inglés single-fibre electromyography) UNM: unión neuromuscular VGKC: canales de potasio voltaje dependientes (del inglés voltaje-gated potassium channels) VGCC: canales de calcio voltaje dependientes (del inglés voltage-gated calcium channels) 14 15 Contenido 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 25 1.1. Introducción ....................................................................................................... 27 1.2. Epidemiología ..................................................................................................... 28 1.3. Clínica ................................................................................................................. 29 1.4. Diagnóstico ......................................................................................................... 30 1.4.1. Farmacológicos ................................................................................................ 30 1.4.1.1. Test de edrofonio .......................................................................................... 30 1.4.1.2. Test de hielo .................................................................................................. 31 1.4.2. Electrofisiológicos ............................................................................................ 32 1.4.2.1. Estimulación nerviosa repetitiva .................................................................. 32 16 1.4.2.2. Electromiograma de fibra aislada ................................................................ 32 1.4.3. Inmunológicos.................................................................................................. 33 1.4.4. Otras pruebas diagnósticas ............................................................................. 34 1.5. Diagnóstico Diferencial ...................................................................................... 34 1.5.1. Miastenia gravis ocular ................................................................................... 34 1.5.2. Miastenia gravis generalizada......................................................................... 35 1.6. Tratamiento ........................................................................................................ 37 1.6.1. Sintomáticos: inhibidores de la colinesterasa ................................................. 37 1.6.2. Inmunomodulares de corto alcance ................................................................ 37 1.6.2.1. Inmunoglobulinas IV .................................................................................... 38 1.6.2.2. Plasmaféresis ................................................................................................ 38 1.6.3. Inmunomoduladores de mantenimiento ......................................................... 39 1.6.3.1. Corticoesteroides .......................................................................................... 39 1.6.3.2. Azatioprina ................................................................................................... 40 1.6.3.3. Metotrexate ................................................................................................... 41 1.6.3.4. Micofenolato mofetil. .................................................................................... 41 1.6.3.5. Ciclosporina .................................................................................................. 42 1.6.3.6. Tacrolimus (FK506) ..................................................................................... 42 1.6.3.7. Ciclofosfamida .............................................................................................. 43 1.6.3.8. Rituximab ..................................................................................................... 43 1.6.3.9. Otros inmunomoduladores .......................................................................... 43 1.6.4. Timectomía ...................................................................................................... 44 2. INMUNOPATOGENIA EN MIASTENIA GRAVIS .......................................... 45 2.1. Unión neuromuscular......................................................................................... 47 2.2. Miastenia gravis como enfermedad autoinmune .............................................. 50 2.3. Miastenia gravis seronegativa ............................................................................ 51 2.4. Otros autoanticuerpos ........................................................................................ 52 17 2.5. Anticuerpos frente al AChR .............................................................................. 54 2.6. Linfocitos B ......................................................................................................... 55 2.7. Subpoblaciones de Linfocitos T helper .............................................................. 57 2.7.1. LTh1................................................................................................................. 58 2.7.2. LTh2................................................................................................................. 58 2.7.3. LTh17. .............................................................................................................. 60 2.7.4. LT reguladores ................................................................................................ 61 2.7.5. Equilibrio entre subpoblaciones de LTh ........................................................ 63 2.8. Citocinas ............................................................................................................. 64 2.9. Citocinas estudiadas ........................................................................................... 64 2.9.1. TNF-α............................................................................................................... 64 2.9.2. IL-17................................................................................................................. 66 2.9.3. sCD40L ............................................................................................................ 67 2.9.4. IFN-γ ................................................................................................................ 69 2.9.5. IL-6 .................................................................................................................. 70 2.9.6. IL-10................................................................................................................. 71 2.10. Complemento .................................................................................................... 73 2.11. Timo .................................................................................................................. 74 2.12. Inmunogenética ................................................................................................ 76 3. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ................................................ 79 3.1. Justificación ........................................................................................................ 81 3.2. Hipótesis ............................................................................................................. 82 3.2.1. Hipótesis inmunológicas .................................................................................. 82 3.3. Objetivos ............................................................................................................. 83 3.3.2. Objetivos clínico-epidemiológicos ................................................................... 83 3.3.1. Objetivos inmunológicos ................................................................................. 83 4. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................. 85 18 4.1. Tipo de estudio ................................................................................................... 87 4.2. Población de estudio ........................................................................................... 87 4.3. Tiempo de estudio .............................................................................................. 88 4.4. Población diana .................................................................................................. 88 4.5. Criterios de inclusión ......................................................................................... 88 4.6. Criterios de exclusión ......................................................................................... 88 4.7. Variables de estudio ........................................................................................... 89 4.7.1. Clínicas ............................................................................................................ 89 4.7.2. Inmunológicas.................................................................................................. 94 4.8. Controles............................................................................................................. 94 4.9. Procesamiento de muestras ................................................................................ 95 4.10. Tecnología Multiplex ........................................................................................ 96 4.11. Análisis estadístico............................................................................................ 97 4.11.1. Estadística descriptiva ................................................................................... 97 4.11.2. Estadística analítica ....................................................................................... 97 4.11.2.1. Análisis univariante .................................................................................... 97 4.11.2.2. Análisis bivariante ...................................................................................... 97 5. RESULTADOS ..................................................................................................... 99 5.1. Sección I: epidemiología ................................................................................... 101 5.1.1. Casos registrados de MG .............................................................................. 101 5.1.1.1. Tasas de incidencia brutas ......................................................................... 101 5.1.1.2. Incidencia ajustada a la población aragonesa ........................................... 103 5.1.1.3. Incidencia ajustada a la población española............................................. 103 5.1.1.4. Incidencia ajustada europea ...................................................................... 103 5.1.1.5. Incidencia ajustada a la población mundial .............................................. 103 5.1.1.6. Comparativa de incidencias ....................................................................... 104 5.1.1.7. Incidencia temporal .................................................................................... 105 19 5.1.1.8. Incidencia y edad de debut ......................................................................... 106 5.1.1.9. Incidencia y senectud.................................................................................. 107 5.1.2. Edad de presentación .................................................................................... 107 5.1.2.1. Edad de presentación y forma clínica ........................................................ 110 5.1.3. Sexo ................................................................................................................ 111 5.1.3.1. Sexo y edad de presentación ....................................................................... 112 5.1.3.2. Sexo y forma clínica de presentación ......................................................... 112 5.1.4. Gravedad de la enfermedad .......................................................................... 113 5.1.5.1. Seropositividad y edad de debut ................................................................ 116 5.1.5.2. Seropositividad y forma de MG ................................................................. 117 5.1.5.3. Seropositividad y sexo ................................................................................ 118 5.1.5.4. Seropositividad y autoanticuerpos nucleares ............................................ 119 5.1.5.5. Título de anti-AChR y forma de MG......................................................... 119 5.1.5.6. Título de anti-AChR y edad de debut de MG ........................................... 120 5.1.5.7. Título de anti-AChR y sexo ........................................................................ 121 5.1.5.8. Título de anti-AChR y autoanticuerpos nucleares .................................... 122 5.1.6. Timoma .......................................................................................................... 123 5.1.7. Otras enfermedades autoinmunes ................................................................ 124 5.1.7.1. Enfermedades autoinmunes y forma de MG ............................................. 124 5.1.7.2. Enfermedades autoinmunes y edad de presentación................................. 125 5.1.7.3. Enfermedades autoinmunes y sexo ............................................................ 125 5.1.7.4. Enfermedades autoinmunes y seropositividad .......................................... 126 5.1.7.5. Coexistencia de varias condiciones autoinmunes ...................................... 127 5.1.8. Neoplasias asociadas ...................................................................................... 127 5.1.8.1. Linfoma no Hodgkin. Caso nº.25. .............................................................. 127 5.1.8.2. Adenocarcinoma gástrico. Caso nº.15. ....................................................... 128 5.1.9. Autoanticuerpos ............................................................................................ 130 20 5.1.9.1. Autoanticuerpos y forma de MG ............................................................... 130 5.1.9.2. Autoanticuerpos nucleares y edad de presentación .................................. 131 5.1.9.3. Autoanticuerpos nucleares y sexo .............................................................. 131 5.1.10. Respuesta al tratamiento ............................................................................. 132 5.1.11. Diagnóstico................................................................................................... 133 5.1.11.1 Aperistalsis esofágico. Caso nº.22.............................................................. 134 5.2. Sección II: inmunología ................................................................................... 136 5.2.1. Interferon-γ.................................................................................................... 136 5.2.1.1. Interferon-γ en pacientes y controles ......................................................... 136 5.2.1.2. Interferon-γ y edad de presentación .......................................................... 136 5.2.1.3. Interferon-γ y sexo ...................................................................................... 136 5.2.1.5. Interferon-γ y timo ..................................................................................... 138 5.2.1.6. Interferon-γ y seropositividad .................................................................... 138 5.2.1.7. Interferon-γ y anti-AChR en suero ............................................................ 138 5.2.1.8. Interferon-γ y otras condiciones autoinmunes .......................................... 139 5.2.1.9. Interferon-γ y autoanticuerpos nucleares en suero ................................... 139 5.2.1.10. Interferon-γ y complemento ..................................................................... 139 5.2.1.11. Interferon-γ y citocinas............................................................................. 140 5.2.2. TNF-α ............................................................................................................. 140 5.2.2.1. TNF-α en pacientes y controles .................................................................. 140 5.2.2.2. TNF-α y edad de presentación ................................................................... 140 5.2.2.3. TNF-α y sexo ............................................................................................... 141 5.2.2.4. TNF-α y forma clínica ............................................................................... 141 5.2.2.5. TNF-α y timo .............................................................................................. 142 5.2.2.6. TNF-α y seropositividad ............................................................................. 142 5.2.2.7. TNF-α y anti-AChR en suero ..................................................................... 142 5.2.2.8. TNF-α y otras condiciones autoinmunes ................................................... 143 21 5.2.2.9. TNF-α y autoanticuerpos nucleares en suero ............................................ 143 5.2.2.10. TNF-α y complemento .............................................................................. 144 5.2.2.11. TNF-α y citocinas ...................................................................................... 144 5.2.3. IL-17............................................................................................................... 145 5.2.3.1. IL-17 en pacientes y controles .................................................................... 145 5.2.3.2. IL-17 y edad de presentación ..................................................................... 145 5.2.3.3. IL-17 y sexo ................................................................................................. 145 5.2.3.4. IL-17 y forma clínica .................................................................................. 146 5.2.3.5. IL-17 y timo ................................................................................................ 147 5.2.3.6. IL-17 y seropositividad ............................................................................... 147 5.2.3.7. IL-17 y anti-AChR en suero ....................................................................... 147 5.2.3.8. IL-17 y otras condiciones autoinmunes ..................................................... 147 5.2.3.9. IL-17 y autoanticuerpos nucleares en suero .............................................. 148 5.2.3.10. IL-17 y complemento ................................................................................ 148 5.2.3.11. IL-17 y citocinas........................................................................................ 149 5.2.4. sCD40L .......................................................................................................... 149 5.2.4.1. sCD40L en pacientes y controles ................................................................ 149 5.2.4.2. sCD40L y edad de presentación ................................................................. 149 5.2.4.3. sCD40L y sexo ............................................................................................ 150 5.2.4.4. sCD40L y forma clínica .............................................................................. 150 5.2.4.5. sCD40L y timo ............................................................................................ 151 5.2.4.6. sCD40L y seropositividad........................................................................... 152 5.2.4.7. sCD40L y anti-AChR en suero ................................................................... 152 5.2.4.8. sCD40L y otras condiciones autoinmunes ................................................. 152 5.2.4.9. sCD40L y autoanticuerpos nucleares en suero .......................................... 152 5.2.4.10. sCD40L y complemento ............................................................................ 153 5.2.4.11. sCD40L y citocinas ................................................................................... 153 22 5.2.5. Interleucina-6 ................................................................................................ 154 5.2.6. Interleucina-10 .............................................................................................. 154 5.2.7. Complemento ................................................................................................. 154 5.2.7.1. Complemento en pacientes y controles ...................................................... 154 5.2.7.2. Complemento y edad de presentación ....................................................... 155 5.2.7.3. Complemento y sexo ................................................................................... 156 5.2.7.4. Complemento y forma clínica .................................................................... 156 5.2.7.5. Complemento y timo .................................................................................. 158 5.2.7.6. Complemento y seropositividad ................................................................. 159 5.2.7.7. Complemento y anti-AChR en suero ......................................................... 159 5.2.7.8. Complemento y otras condiciones autoinmunes ....................................... 160 5.2.7.9. Complemento y autoanticuerpos nucleares en suero ................................ 160 5.2.7.10. Correlaciones entre componentes de complemento ................................ 161 5.2.7.11. Correlaciones en controles ....................................................................... 162 6. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 163 6.1. Sección I: epidemiología ................................................................................... 165 6.1.1. Incidencia ....................................................................................................... 165 6.1.2. Edad de presentación .................................................................................... 167 6.1.3. Sexo ................................................................................................................ 167 6.1.4. Gravedad de los síntomas ............................................................................. 168 6.1.5. Seropositividad .............................................................................................. 169 6.1.6. Seropositividad anti-MuSK........................................................................... 170 6.1.7. Patología tímica ............................................................................................. 171 6.1.8. Neoplasias asociadas ...................................................................................... 171 6.1.9. Otras enfermedades autoinmunes ................................................................ 172 6.1.10. Aperistalsis esofágica ................................................................................... 174 6.2.1. IFN-γ .............................................................................................................. 176 Introducción 29 predisposición hacia los varones apareciendo entre la quinta y sexta década de la vida. En este último subgrupo, los pacientes suelen tener anticuerpos anti-AChR y la presencia de timoma, especialmente en los pacientes mayores de 60 años, es mucho menor (Meyer et al., 2010). La MG ocular (ver apartado 1.3. Clínica) es más prevalente en Asia donde generalmente aparece en niños. En los países asiáticos el 50% de los pacientes con MG debuta antes de los 15 años (Zhang et al., 2007). En los países occidentales la MG ocular afecta sólo a un 15% de los pacientes con esta enfermedad y con un 10% de los pacientes debutando antes de los 18 años. 1.3. Clínica Los pacientes con MG presentan debilidad fluctuante, no dolorosa, que característicamente empeora con el ejercicio y mejora con el reposo. Puede afectar a los músculos respiratorios, bulbares, de extremidades y oculares. El 85% de los pacientes debuta con síntomas oculares, como ptosis y diplopía. En los siguientes dos años, muchos de ellos evolucionarán a la forma generalizada de la enfermedad con síntomas como disfagia, disartria, disfonía, debilidad masticatoria, debilidad cervical, de cinturas o extremidades, y síntomas respiratorios (disnea, taquipnea, ortopnea). En el 15% de los pacientes, los síntomas no progresan constituyendo el subgrupo conocido como MG ocular. La debilidad muscular se alivia con el tratamiento con inhibidores de la acetilcolinesterasa y con tratamientos inmunosupresores como los corticoides, Introducción 30 inmunoglobulinas IV, plasmaféresis, azatioprina, metotrexate, ciclosporina A, ciclofosfamida, tacrolimus, micofenolato mofetil o rituximab entre otros. La evolución clínica es variable. La mayoría de ellos presentan episodios de empeoramiento que pueden ser desencadenados por infecciones, estrés, trastornos hidroeléctricos (hipocalemia, hipofosfatemia), introducción o incremento rápido de corticoesteroides, anemia, cirugías o medicaciones (ej., aminoglicósidos, penicilamina, succinilcolina, toxina botulínica y cloroquina). Como hemos mencionado antes, la progresión hacia la máxima gravedad de la enfermedad suele ocurrir en los primeros dos años desde el debut de los síntomas. Las remisiones a largo plazo ocurren en un 15% de los pacientes (Grob et al., 2008). 1.4. Diagnóstico Los test diagnósticos en la MG autoinmune pueden clasificarse en tres grupos: test farmacológicos, que pueden realizarse a pie de cama del paciente, electrofisiológicos y serológicos mediante la búsqueda de autoanticuerpos (Meriggioli et al., 2009; Jacob et al., 2009). El diagnóstico de MG está basado en una clínica sugestiva (ver apartado 1.3.Clínica) y compatible asociado a uno o más test diagnósticos de los siguientes: 1.4.1. Farmacológicos 1.4.1.1. Test de edrofonio El edrofonio (cloruro de edrofonio, test Tensilon®; bromuro de edrofonio, Test Anticude®) es un inhibidor de la acetilcolinesterasa de vida media corta. Dificulta la Introducción 31 degradación de ACh en la unión neuromuscular (UNM), por lo que se incrementa la amplitud y duración del potencial postsináptico (EPP, del inglés endplate potential). El fármaco se administra intravenosamente y permite objetivar la mejora transitoria de signos clínicos de la enfermedad como ptosis, oftalmoplejía o disartria. El empleo de síntomas para evaluar la respuesta puede conllevar falsos positivos. La prueba es recomendable realizarse con doble ciego (evaluador y administrador del fármaco y/o placebo). La sensibilidad del test oscila entre el 70 y el 85% en la MG generalizada. La especificidad no es del 100% pudiendo ser positiva en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica, neuropatía periférica o el síndrome de Eaton-Lambert. Los efectos adversos de la droga son bradicardia y síncopes, aunque habitualmente su aparición no es frecuente. Sin embargo, este test debe realizarse con una adecuada monitorización cardiaca, preparación de atropina y un equipo de reanimación. Debe evitar realizarse en pacientes de edad avanzada. 1.4.1.2. Test de hielo Es un test exclusivamente indicado para evaluar la mejora (al menos de 2 mm) de la ptosis ocular. No es un test farmacológico. Desde un punto de vista fisiopatológico se considera que el frío (por debajo de los 28ºC) mejora la transmisión neuromuscular al disminuir la actividad de la acetilcolinesterasa. Algunos autores apuntan a una mejora en la ptosis como consecuencia del reposo requerido durante la aplicación del frío. Consiste en colocar hielo sobre el ojo durante 2-5 minutos y evaluar la desaparición de la ptosis. Está indicado en pacientes con ptosis ocular en los que está contraindicado el Introducción 32 uso del test de edrofonio. La sensibilidad del test es del 80-90% con una especificidad cercana al 100%. No hay riesgos asociados al mismo. Cabe mencionar que aunque el frío es capaz de mejorar la fuerza muscular en pacientes miasténicos, no se recomienda bajar a temperaturas musculares por debajo de 22ºC porque conlleva un empeoramiento de la contracción de la fibra muscular, a pesar de que se mejora la transmisión neuromuscular (Simpson, 1960). Además, recientemente esta técnica se ha sugerido como una herramienta útil con una alta especificidad (95%) y una sensibilidad aceptable (76%) en el diagnóstico de diplopía miasténica (Chatzistefanou et al., 2009). No obstante, la subjetividad de la prueba pone en dudas la utilidad de la misma en la diplopía miasténica, a diferencia de la ptosis ocular (Almeida et al., 2008). 1.4.2. Electrofisiológicos 1.4.2.1. Estimulación nerviosa repetitiva La estimulación del nervio a baja frecuencia (2-5 Hz) produce un decremento progresivo en la amplitud del potencial de acción muscular. Es considerado positivo cuando el decremento es mayor del 10%. Su sensibilidad es del 75% al 90% en MG generalizada y del 50% en MG ocular. Los músculos más frecuentemente estudiados son el músculo trapecio, deltoides, orbicularis oculis y bíceps. 1.4.2.2. Electromiograma de fibra aislada La electromiografía de fibra aislada (SFEMG, del inglés single-fibre electromyography) consiste en identificar potenciales de acción de fibras musculares individuales. El jitter Introducción 33 neuromuscular mide las fluctuaciones en el tiempo transcurrido para que el PPE (potencial postsináptico exceitador, ver apartado 2.1. Unión neuromuscular) alcance el potencial de acción muscular, o de otra forma mide la latencia entre el estímulo y la respuesta. Como consecuencia del fracaso de la transmisión neuromuscular en la MG, este tiempo está incrementado. Su sensibilidad es mayor al 95%. Sin embargo, su especificidad es menor debido a que puede aparecer incrementado en otras enfermedades nerviosas o musculares. Además, hay que considerar que la realización de la prueba require un mayor habilidad del neurofisiólogo y de la colaboración del paciente, por lo que habitualmente es menos empleada que la estimulación repetitiva. 1.4.3. Inmunológicos Anti-AChR: los autoanticuerpos frente al receptor de acetilcolina son detectados en el 85% de los pacientes con MG generalizada y en el 50% de los pacientes con MG ocular. Las concentraciones varían entre los pacientes, y no se correlacionan con la gravedad de la enfermedad. En cambio, los niveles de anti-AChR en pacientes con MG generalizada son mayores comparados con los niveles de los pacientes con MG ocular. La especificidad del test es muy alta, considerándose para muchos autores diagnóstica per se. Anti-MuSK: dependiendo de la zona geográfica, entre el 25 y el 40% de los pacientes seronegativos para anti-AChR presentan en suero anticuerpos frente a MuSK (tirosina kinasa específica del músculo). Es decir, aparecen en un 5-8% de todos los pacientes con MG. Es excepcional su presencia en la MG ocular (Bennett et al., 2006). Introducción 34 Otros anticuerpos frente al músculo estriado (titina, actina, miosina, receptor de ryanodina, Kv1.4) tienen hasta la fecha una utilidad diagnóstica limitada. Suelen estar asociados con formas más graves de MG (ver apartado 2.2. Otros autoanticuerpos). Cabe resaltar que el tratamiento inmunosupresor puede seronegativizar todos estos autoanticuerpos. 1.4.4. Otras pruebas diagnósticas Aunque no diagnósticas de la enfermedad, las siguientes pruebas deben ser realizadas en todos los pacientes con sospecha o diagnóstico de MG autoinmune: RMN o TAC torácico para descartar la presencia de un timoma y screening de enfermedad tiroidea. Se recomienda solicitar serologías para el virus varicela zoster, citomegalovirus (especialmente si se considera tratamiento con ciclofosfamida) y un screening para tuberculosis previo al inicio de tratamiento inmunosupresor (Houssiau et al., 2002). 1.5. Diagnóstico Diferencial En el diagnóstico diferencial de MG, hay que considerar: 1.5.1. Miastenia gravis ocular  Miopatía mitocondrial. Aparición de ptosis gradual. No hay fluctuaciones. La ptosis suele ser simétrica con excepcional presencia de diplopía. Introducción 35  Distrofia muscular oculofaríngea. Caracterizada por ptosis bilateral de lenta evolución y de inicio tardío (mayores de 45 años). La disfagia y cambios en la voz son síntomas frecuentes. Presenta una herencia autosómica dominante.  Neoplasia intracraneal. La realización de una prueba de imagen cerebral confirma el diagnóstico.  Ptosis senil. Causada por desinserción o dehiscencia de la aponeurosis del elevador del párpado.  Oftalmopatía exoftálmica (oftalmopatía de Graves). Exoftalmos y debilidad de musculatura extraocular asociado en ocasiones a dolor ocular. Síntomas hipertiroideos sugieren y las hormonas tiroideas confirman el diagnóstico.  Disfunción nerviosa simpática. Consecuencia de la denervación del músculo de Müller. La respuesta con nitrato de nafazolina, una droga simpática, orienta el diagnóstico junto con la ausencia de otros signos neurológicos y descartadas otras patologías (Tomelleri et al., 2007). 1.5.2. Miastenia gravis generalizada  Enfermedad de motoneurona. La presencia de signos de primera motoneurona como reflejos de estiramiento muscular vivos junto con signos de segunda motoneurona como atrofia muscular y fasciculaciones sugieren esta posibilidad. El EMG puede orientar el diagnóstico.  Mielopatía cervical. Habitualmente la clínica es subaguda. La alteración esfintereana y la presencia de un nivel sensitivo orientan al diagnóstico. La realización de RMN cervical confirma el diagnóstico. Introducción 36  Distrofia muscular oculofaríngea. (Ver apartado 1.5.1. Miastenia gravis ocular).  Síndrome de Guillain-Barré. Clínicamente se manifiesta como debilidad progresiva ascendente con síntomas sensitivos distales y ausencia de reflejos de estiramiento muscular. La disociación albuminocitológica en el LCR y los hallazgos de desmielinización en los estudios de conducción nerviosa confirman el diagnóstico.  Miopatías. Diferentes enfermedades musculares deben considerarse en el diagnóstico diferencial de MG (ej., deficiencia de mioadenilato que puede producir fatiga pero no afecta a músculos bucofaríngeos, polimiopatía por nemalina causando paresia ocular, polimiositis y miopatías por cuerpos de inclusión, en los que no hay afectación ocular). La determinación de CK orienta el diagnóstico, pese que hay que considerar que hasta en un 10% de los pacientes con MG pueden estar elevados de forma leve.  Botulismo. Debilidad progresiva descendente con afectación pupilar y autonómica.  Síndrome miasténico de Eaton-Lambert. Afecta fundamentalmente a musculatura proximal de extremidades inferiores junto con disfunción del sistema nervioso autónomo con rara afectación de musculatura extraocular, facial y bulbar. La presencia de anticuerpos contra los canales de calcio voltaje dependientes confirma el diagnóstico.  Síndromes miasténicos congénitos. Debut en la infancia o juventud. No hay respuesta al tratamiento inmunosupresor. Introducción 37  Intoxicación con organofosforados. Algunos insecticidas se unen irreversiblemente a la acetilcolinesterasa que conduce a una despolarización permanente de la placa motora, haciéndose refractaria al estímulo nervioso. 1.6. Tratamiento 1.6.1. Sintomáticos: inhibidores de la colinesterasa La piridostigmina es el más utilizado. Al inhibir la acción de la acetilcolinesteresa, se aumenta la disponibilidad de la ACh en la placa motora. No se deben sobrepasar dosis de 450 mg/día por riesgo de crisis muscarínica. La dosis eficaz en la mayoría de los pacientes oscila entre 180 y 240 mg/día. Sus efectos adversos más frecuentes son la diarrea, los espasmos abdominales, urgencia de esfínteres, bradicardia, bloque A-V, hipersalivación, lacrimeo y sudoración. Todos estos efectos son muscarínicos. Sin embargo, los efectos nicotínicos como calambres musculares o las fasciculaciones son menos frecuentes. Está indicada en pacientes con síntomas leves o con MG ocular. Su administración no modifica el curso evolutivo de la enfermedad. Como consecuencia de consideraciones éticas la eficacia de este fármaco está sólo avalada por estudios observacionales (Skeie et al., 2010). El empleo de estos fármacos en la MG con antiMuSK debería realizarse con precaución como consecuencia de la hipersensibilidad a la ACh en estos pacientes (Punga et al., 2006). Otros inhibidores de la colinesterasa como la neostigmina (Prostigmina®) son menos utilizados debido a su peor farmacodinamia y tolerancia. 1.6.2. Inmunomodulares de corto alcance Se deben considerar en las exacerbaciones, crisis miasténicas, como medicación pretimectomía y en casos refractorios a tratamientos inmunosupresores. Tanto las Introducción 38 inmunoglobulinas como la plasmaféresis tienen una eficacia similar (Gajdos et al., 2008). 1.6.2.1. Inmunoglobulinas IV Su mecanismo de acción no está claro (probablemente al competir con los autoanticuerpos y al unirse a la fracción Fc de los mismos). La dosis habitual es de 0.4g/Kg/día durante 5 días. El efecto aparece entre la primera y segunda semana y puede durar hasta 3 meses. Es el tratamiento más frecuentemente empleado en las exacerbaciones. Otras indicaciones son la preparación prequirúrgica previa a la timectomía o en casos de MG refractaria al tratamiento inmunosupresor. Otra posible indicación sería la de prevenir la exacerbación secundaria a corticoides en pacientes con debilidad orofaríngea o de musculatura respiratoria. Suelen ser bien toleradas y la cefalea, fiebre o rash son los efectos adversos más frecuentes relacionados con la infusión. Complicaciones más excepcionales son la meningitis aséptica, fracaso renal o fenómenos trombóticos (Skeie et al., 2010). 1.6.2.2. Plasmaféresis Su acción consiste en eliminar los autoanticuerpos presentes en el suero del paciente. La pauta habitual es el intercambio de 2-5 litros de plasma al día durante 4-6 días, desarrollados en días seguidos o alternos. La eficacia es similar a las inmunoglobulinas IV (IgIV), pero con una mayor rapidez de acción. Las indicaciones son similares a las de la IgIV. Sus efectos adversos más frecuentes son las parestesias y la hipotensión. Los potenciales efectos adversos (especialmente complicaciones trombóticas, infecciones y Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 2. INMUNOPATOGENIA EN MIASTENIA GRAVIS Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 46 Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 47 2.1. Unión neuromuscular La unión neuromuscular o placa motora es una sinapsis especializada diseñada para transmitir el impulso nervioso procedente del nervio motor al músculo. La acetilcolina (ACh) es el neurotransmisor fundamental en esta transmisión. Los axones de las neuronas motoras α procedentes de las astas ventrales de la médula espinal y del tronco del encéfalo terminan ramificándose distalmente para alcanzar las fibras musculares individuales, formando estructuras conocidas como unión neuromuscular. Inicialmente, los axones están recubiertos de mielina formando los nervios periféricos, y conforme se alejan distalmente el grosor del nervio disminuye y la envoltura de mielina va desapareciendo. Finalmente, el terminal nervioso presináptico es amielínico. En los botones presinápticos se encuentran las vesículas sinápticas cargadas de ACh. Entre el botón presináptico axonal y la superficie muscular existe un espacio, la hendidura sináptica, de unos 20nm que contiene acetilcolinestarasa encargada de escindir la ACh. La membrana muscular, o postsináptica, tiene profundos pliegues en los que numerosos receptores de ACh (AChR) están inmersos (12.000 moléculas de AChR/µm2). En el anclaje de estos receptores es fundamental la presencia de otras proteínas como MuSK, rapsina y DOK-7 (Contil-Fine et al., 2006). Cuando el potencial de acción nervioso alcanza el botón nervioso, se abren canales de Ca2+ voltaje dependientes (VGCC, del inglés voltage-gated calcium channels), conduciendo a un incremento transitorio de la concentración de calcio intracelular, que desencadena la fusión de las vesículas presinápticas con la membrana presináptica. De esta forma, se libera el contenido de las vesículas (ACh) a la hendidura sináptica. La Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 48 ACh, que puede ser hidrolizada por acetilcolinesterasa, alcanza finalmente el AChR de la membrana postsináptica (muscular) que desencadena la entrada de Na+ en la fibra muscular. Cuando el umbral de despolarización es alcanzado (potencial de placa terminal, PPE) se activan los canales de Na+ voltaje dependientes conduciendo a más influjo de Na+ y diseminando el potencial de acción a través de la fibra muscular. Este potencial de acción muscular conlleva la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico que se une a la troponina C con la consiguiente contracción muscular mediada por los filamentos de actina y miosina. El PPE es mucho mayor que el umbral necesario para desencadenar un potencial muscular de acción positivo. Esto es considerado un mecanismo protector. De hecho, se considera que se necesita una pérdida del 60% de los AChR para producir un fallo de la neurotransmisión, tanto en la MG autoinmune como congénita. Mientras todo esto ocurre, en el terminal presináptico, los canales de potasio voltaje dependientes (VGKC, del inglés voltaje-gated potassium channels), se abren para restaurar el potencial de membrana de reposo (Lange et al., 2003). La acción de la acetilcolinesterasa también contribuye para que esto suceda. En la membrana postsináptica, además del AChR, existen otras proteínas implicadas en la correcta transmisión neuromuscular como la rapsina, MuSK y agrina. Tanto la agrina como la proteína MuSK son imprescindibles para el correcto funcionamiento de la transmisión neuromuscular. Así, ratones genéticamente ausentes de alguna de estas dos proteínas mueren al nacimiento por grave debilidad muscular aunque los AChR y otras proteínas estén correctamente desarrollados (Sanes, Lichtman, 2001; Gautam et al., 1996). Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 49 El receptor de ACh (AChR) es una proteína formada por 5 subunidades: α2, β, γ y δ en el músculo denervado y en el embrión; α2, β, δ y ε en el adulto (Vincent, 2006). De manera interesante, músculos adultos como la musculatura extraocular todavía expresan AChR de tipo embriónico. La mayoría de los anti-AChR están dirigidos frente a la región inmunogénica principal (MIR, del inglés main immunogenic region) en las subnidades α. Sin embargo, muchos pacientes tienen anticuerpos dirigidos específicos para la forma fetal del AChR, por lo que deben unirse a la subunidad γ. Estos antígenos con AChR fetales tendrían que expresarse también en las células mioides (ver sección 2.11. Timo) (Vincent, 2006). Los anti-AChR son muy variables en sus cadenas ligeras y subclases de IgGs. En cambio, son muy específicos y tienen una alta afinidad para el AChR. Esto sugiere que alguna molécula nativa AChR induce estos anticuerpos (Vincent et al., 1998). La mayoría de estos autoanticuerpos son de clase IgG1 o IgG3, capaces de activar el sistema del complemento de manera eficaz. Cualquier factor que afecte a alguno de los pasos descritos anteriormente conduce a un fracaso en la eficiencia de la transmisión entre el nervio y el músculo. Pueden existir defectos genéticos (ej. síndromes miasténicos congénitos), factores ambientales (ej.tóxicos), pero el objetivo de este trabajo es el estudio del fracaso de la unión neuromuscular causada por autoanticuerpos circulantes. Anticuerpos contra diferentes componentes del músculo estriado (componentes citoplasmáticos), como la titina, miosina, el receptor de ryanodina son detectados en muchos pacientes con MG (alrededor del 80% de los pacientes) asociado con timoma (Romi et al., 2002). Sin embargo, el significado patogénico de estos autoanticuerpos dirigidos contra proteínas intracelulares es cuestionable, aunque parece que tengan Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 50 alguna utilidad como indicador de presencia de timoma. Pero también muchos pacientes mayores con MG sin timoma tienen también estos anticuerpos (Buckley et al., 2001). Estos autoanticuerpos están asociados a formas más graves de MG (ver apartado 2.4. Otros autoanticuerpos). 2.2. Miastenia gravis como enfermedad autoinmune La MG es un prototipo de enfermedad mediada por autoanticuerpos. El 85% de los pacientes con MG generalizada presenta en sangre anticuerpos frente al receptor nicotínico de ACh (anti-AChR) de los músculos estriados. En los pacientes con MG ocular, el porcentaje baja al 50% (Vincent, 2006). Además, estos pacientes con MG ocular suelen tener títulos de anticuerpos no tan elevados comparados con pacientes con MG generalizada. Los anti-AChR son, fundamentalmente, IgG1 e IgG3 capaces de activar el complemento. La MG cumple los criterios de enfermedad autoinmune: 1) Los anticuerpos se han encontrado en el lugar de la lesión (la unión neuromuscular). 2) Las inmunoglobulinas de pacientes con MG o los anti-AChR de animales de experimentación producen síntomas miasténicos al ser inoculados en roedores. 3) La inmunización en animales con AChR reproduce los síntomas de la enfermedad. 4) Las terapias que disminuyen los niveles de anticuerpos en sangre (ej. plasmaféresis) disminuyen la sintomatología (Conti-Fine et al., 2006). Los anti-AChR en la MG alteran la transmisión neuromuscular por tres mecanismos: Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 51 1) Bloqueo funcional de los receptores de ACh. 2) Uniéndose al antígeno y activando al complemento que conduce a la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC) y la posterior destrucción de receptores. Esto produce una distorsión de la membrana postsináptica reduciendo el número de pliegues (disminuyendo también el número de canales de Na+ voltaje dependientes). 3) Aceleran la degradación de los AChR uniéndose a dos antígenos (AChR) conduciendo a una lesión celular que activa la degradación del mismo que sobrepasa la capacidad de síntesis, en un mecanismo conocido como modulación antigénica. De estos tres mecanismos, el daño tisular secundario a la activación del complemento es considerado la lesión primaria en la MG. 2.3. Miastenia gravis seronegativa El 15% de los pacientes con MG generalizada y el 50% con MG ocular no presentan en suero anti-AChR detectables. Sin embargo, estos pacientes responden bien al tratamiento con plasmaféresis, y la inoculación de las inmunoglobulinas de estos pacientes a animales de experimentación induce en ellos sintomatología miasténica. Esto sugiere la implicación de factores humorales en la patogénesis de la MG seronegativa (Vincent, 2006). Recientemente, se ha detectado en un 66% de los pacientes con MG seronegativa la presencia de anti-AChR de baja afinidad que no son capaces de detectarse en los análisis actuales pero sí son capaces de unirse al AChR anclado en cultivos celulares (Leite et al., 2008). Por otra parte, hasta el 40% de los pacientes seronegativos para anti-AChR presentan en suero anti-MuSK (Hoch et al., 2001). Estos anticuerpos son predominantemente de tipo Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 52 IgG4, que no son capaces de activar el complemento. Histológicamente no se detecta la formación del complejo de ataque de membrana del complemento, ni fagocitosis de los AChR. Clínicamente, estos pacientes suelen tener una frecuencia más alta de afectación bulbar y crisis respiratoria. Además, suelen tener algunas características atípicas como una más marcada atrofia facial. Estos pacientes suelen tener un debut más precoz, con predominancia hacia las mujeres. La alteración del timo es normal o casi normal comparada con controles (Meyer et al., 2010). Desde un punto de vista geoepidemiológico, países con latitudes más altas como Noruega, Reino Unido, Holanda o Dinamarca presentan una proporción de pacientes relativamente baja, del 0 al 25% dependiendo de las series, de pacientes serogenativos (para anti-AChR) con antiMuSK en suero. En cambio, regiones mediterráneas como España presentan tasas de hasta el 40% de pacientes con anti-MuSK entre el subgrupo de pacientes seronegativos (para anti-AChR) (Vincent et al., 2005). En cambio, los pacientes seronegativos para ambos anticuerpos presentan un comportamiento más benigno con respecto al grupo anti-MuSK positivo y anti-AChR positivo (Deymeer et al., 2007). Probablemente, su prevalencia real es mayor que la informada en estudios. 2.4. Otros autoanticuerpos Muchos pacientes con MG presentan autoanticuerpos capaces de unirse mediante un mecanismo de reacción cruzada con tejidos musculares cardíacos y esqueléticos. Son conocidos como autoanticuerpos contra el músculo estriado (intrigante considerando la MG una enfermedad de placa motora). Son autoanticuerpos frente a la actina, miosina, ryanodina, titina o Kv1.4 y otros menos estudiados como actinina o filamina. Aparecen Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 53 en un 80% de los pacientes con MG asociado a timoma y en un 30% de los pacientes con MG no asociado a timoma (Conti-Fine et al., 2006). Su implicación patogénica no está clara. En concreto, pacientes con anticuerpos contra la titina, el receptor de ryanodina (RyR, del inglés ryanodine receptor) y Kv1.4 aparecen en suero de pacientes con timoma, debut tardío y formas más graves de MG. El receptor de ryanodina (565 kD) es un canal liberador de calcio del retículo sarcoplásmico. Así, los anticuerpos RyR reconocen la región N-terminal de RyR encargada de la regulación del canal, e inhiben la liberación de Ca2+ in vitro. Sin embargo en vivo no existe evidencia suficiente (Huang, Tan, 2010). Molecularmente son diferentes en el músculo cardiaco (RyR2) que esquelético (RyR1). Sin embargo, se ha demostrado reacción cruzada con autoanticuerpos de pacientes con anti-RyR. 4 subunidades forman el canal mencionado anteriormente. Existe asociación de miositis y miocarditis. Aparece en pacientes con MG ocular de debut tardío. El tacrolimus presenta un beneficio clínico precoz en estos pacientes. Además, la presencia de anticuerpos frente al receptor de ryanodina se relaciona con debilidad cervical, bulbar y de musculatura respiratoria, distribución de síntomas de MG sin afectar a extremidades (Romi et al., 2007). Los canales de potasio voltaje dependientes (VGKC) están formados por cuatro subunidades α transmembrana que se combinan en forma de homo o hetero-tetrámeros. Kv1.4 es una subunidad α (73 kD) que se expresa en cerebro, nervios periféricos, músculo esquelético y cardiaco (Suzuki et al., 2011). Está asociado a riesgo de arritmias letales y miocarditis autoinmune. Se recomienda tratamiento con inhibidores de la calcineurina (Suzuki et al., 2011) como ciclosporina o tacrolimus. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 54 La titina es una proteína de gran peso molecular (3000 kD) que se encuentra en el sarcómero muscular cardiaco o esquelético. Es un muelle molecular dependiente del Ca2+ que se adapta al estado fisiológico de la célula muscular, encargada de la estabilidad celular. ¿Cuál es la utilidad de estos autoanticuerpos en MG? En una fase pre-diagnóstica la utilidad es casi nula, considerando que todos ellos aparecen en pacientes seropositivos (para anti-AChR). En cambio, podrían existir dos utilidades prácticas en la fase postdiagnóstica: i) screening para timomas: el uso de la determinación de titina y ryanodina presentan conjuntamente una sensibilidad y especificidad del 95%, con un valor predictivo negativo para timoma del 99% en pacientes con MG de debut precoz. El uso del TAC torácico presenta una sensibilidad sólo del 73% con un valor predictivo negativo del 65%; ii) selección de inmunosupresores: como hemos visto antes los inhibidores de calcineurina (tacrolimus, ciclosporina) podrían presentar un beneficio mayor en pacientes seropositivos para anti-RyR y anti-Kv1.4 (Romi et al., 2005). 2.5. Anticuerpos frente al AChR La α-Bungarotoxina (α-BuTx) es una toxina derivada del veneno de serpiente. Es capaz de unirse irreversiblemente al AChR. Esta toxina puede etiquetarse mediante elementos radiactivos como el 125I y usarse para detectar la presencia de anticuerpos anti-AChR. Los AChR, extraídos de músculos de mamíferos, son etiquetados con 125I-α-BuTx. Posteriormente, suero del paciente es añadido produciéndose con las IgG un inmunoprecipitado capaz de detectarse y medirse. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 61 La combinación de IL-6 y TGF-β induce el receptor nuclear orphan, el receptor orphan relacionado con el retinoide (ROR)γt y RORα, que son los factores de transcripción fundamentales en determinar la diferenciación del linaje Th17 (Ivanov et al., 2006; Yang et al., 2008). Existen evidencias de que el desarrollo de Th17 en el timo de pacientes con MG no está incrementado. Esto está basado en que el RNAm que codifica RORC es expresado de manera similar en el timo de pacientes con o sin MG (Ivanov et al., 2006; Matsui et al., 2010). 2.7.4. LT reguladores Son las células T CD4+ que expresan el marcador CD25 y el factor de transcripción Foxp3. Este factor Foxp3 es esencial para el desarrollo y la actividad funcional de las células T reguladoras (LTreg) tanto en humanos como en animales de experimentación (Sakaguchi et al., 2008). Recientemente, diferentes estudios apuntan un papel independiente e importante de esta nueva subpoblación de células T en la MG (Balandina et al., 2005). El número de células Treg en sangre periférica se incrementa después de las timectomías realizadas en pacientes con MG, y este incremento se correlaciona con la mejoría sintomática (Sun et al., 2004). La función de estas células es fundamentalmente anti-inflamatoria y están encargadas del mantenimiento de la homeostasis inmune controlando los fenómenos de autotolerancia (Sakaguchi et al., 2004), evitando el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 62 Existen varios tipos de Treg: las nTreg son generadas en el timo y adquieren la expresión del factor de transcripción Foxp3; las iTreg son generadas por las células T naïve en la periferia o in vitro, después de la estimulación con antígenos y TGF-β (Chen et al., 2003). Es decir, aunque la activación de las células T autorreactivas causan varias enfermedades autoinmunes como la MG, son controladas por mecanismos de tolerancia inmune periférica como las células Treg. En el timo, las células Treg se encuentran fundamentalmente en la médula (Matsui et al., 2010). Algunos autores informan un número disminuido de células Treg en pacientes con MG (Balandina et al., 2005; Ströbel et al., 2004; Fattorossi et al., 2005). Sin embargo, un trabajo reciente informaba que el número de células Treg no está disminuida en el timo o en la sangre periférica de pacientes con MG (Matsui et al., 2010). Sin embargo, los timocitos CD4+ CD25+ aislados en pacientes con MG presentan una expresión disminuida de RNAm para Foxp3 y un defecto en la función de supresión (Balandina et al., 2005; Chen et al., 2003; Wing and Sakaguchi, 2010). En niños con MG, informes recientes señalan que las células T reg (CD4+ CD25+) en la sangre periférica están incrementadas aunque sus funciones no están incrementadas, indicando que la patogénesis en niños podría estar relacionada con una disminución de la inmunotoleracia mediada por las células Treg en sangre periférica (He et al., 2008). El equilibrio entre las células Th17 y Treg comienza a entenderse con estudios recientes. TGF-beta es requerido para la diferenciación tanto de Th17 y Treg, y puede inducir la expresión para Foxp3 (clave en las Treg) y RORγt (clave en las Th17) (Zhou et al., 2008). Sin embargo, el tratamiento con TGF-β conduce exclusivamente al desarrollo de Treg ya que Foxp3 es capaz de unirse a RORγt e inhibir la activación Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 63 transcripcional de este último, RORγt (Zhou et al., 2008). Ahora bien, con la presencia de IL-6, esta inhibición es desactivada y por tanto la diferenciación de las células Th17 transcurre con normalidad (Bettelli et al., 2006; Mangan et al., 2006). Por tanto, IL-6 es capaz de actuar como potente citocina pro-inflamatoria a través de la promoción de las células Th17 e inhibición de las células Treg, indicando que IL-6 regula el equilibrio entre las células Th17 y las células Treg con un importante papel en controlar las enfermedades autoinmunes. 2.7.5. Equilibrio entre subpoblaciones de LTh En resumen, el equilibrio entre estas cuatro poblaciones: LTh1, LTh2, LTreg, y LTh17 es determinante en el desarrollo de la MG experimental en animales (Mu et al., 2009). Para entender esto hay que ir a modelos animales de MG. En la EAMG existen dos fases de la enfermedad: la primera es mediada por macrófagos infiltrando la membrana postsináptica de la UNM. Posteriormente, se produce una fase mediada por células T auro-reactivas contra el AChR y la estimulación por medio de citocinas de células B productoras de anti-AChR. Mu et al., demostró que en la fase inicial de la enfermedad la proporción de células Th1, Th2, Th17 y Treg permanecía estable. Sin embargo, en fases tardías las poblaciones de Th1 y Th17 se incrementaban mientras las otras dos poblaciones, Th2 y Treg permanecían estables. Además, el incremento más significativo era debido a las células Th17 (Mu et al., 2009). Hay que recordar, que las poblaciones Th1 y Th17 son eminentemente pro-inflamatorias. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 64 2.8. Citocinas Las citocinas incluyen interleucinas, linfocinas, monocinas, interferones, factor de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonias y factores transformadores de crecimiento. Son producidas por macrófagos, células T, células B, monocitos, neutrófilos, células dendríticas pero también plaquetas, células endoteliales, hepatocitos y células musculares lisas vasculares (Sprague and Khalil, 2009). Las citocinas son pequeñas proteínas solubles de bajo peso molecular, con una vida media muy corta. Las citocinas circulantes actúan sobre receptores específicos de diferentes líneas celulares, activando vías de señalización que conducen a diferentes procesos inflamatorios como adhesión celular, permeabilidad y apoptosis (Sprague and Khalil, 2009). El papel que desempeñan las diferentes citocinas puede estudiarse en la EAMG consiguiendo animales de experimentación que congénitamente expresan en exceso o son deficientes de la citocina a estudio. En estos estudios, numerosos informes señalan que las células Th1 y sus citocinas son imprescindibles para el desarrollo de la EAMG, a través de la síntesis de anti-AChR capaces de activar el complemento produciendo la lesión local en la unión neuromuscular. Esto es considerado la lesión primaria en la MG. 2.9. Citocinas estudiadas 2.9.1. TNF-α El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) es una citocina producida por células T, monocitos y macrófagos (Zhang,Navikas and Link, 1997). Tiene dos formas biológicas activas: la forma transmembranal y la forma soluble. La forma transmembranal se corta por TACE o ADAM17 (matrix metalloprotease TNF alpha converting enzyme) Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 65 produciendo la forma soluble de este mediador. Es considerada un citocina Th1 dependiente. Está implicada en el desarrollo de la EAMG (Christadoss and Goluszko, 2002). El bloqueo de este mediador con anticuerpos monoclonales suprime la EAMG (Duan et al., 2002). En humanos, en una serie de 11 pacientes con MG, el tratamiento con etanercept (receptor soluble de TNF-α) producía mejoría en 6 de ellos, y empeoramiento en 2. Los niveles séricos de TNF-α ni los anti-AChR se veían modificados con el tratamiento. Sólo en un paciente se incrementaban los niveles séricos de este mediador, correlacionados con las fases de empeoramiento clínico (Rowin et al., 2004; Rowin , 2008). Resultados similares han sido descritos por otros investigadores (Tüzün, Meriggioli and Rowin, 2005). Además, infliximab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra TNF-α, mejoró la función muscular y el título de anticuerpos disminuyó en un paciente con MG (Kakoulidou et al., 2007). Recientemente, un trabajo no encontró relación entre los niveles séricos de TNF-α con la gravedad de la enfermedad ni con los niveles de anti-AChR (Lee, Joo and Seok, 2009), aunque dos tercios de los pacientes estaban en tratamiento inmunosupresor, lo que puede conducir a conclusiones erróneas. En otro estudio se encontró una correlación entre la producción de TNF-α y la condición de MG usando cultivos celulares mononucleares (Ahlberg, Pirskanen and Lefvert, 1991). En conclusión, a pesar de que hay informes sobre el beneficio moderado de tratamientos que bloquen al TNF-α en MG y evidencias de la implicación de este mediador en EAMG, la utilidad en la medición de los niveles séricos de TNF-α en pacientes con MG no está aclarada. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 66 2.9.2. IL-17 La IL-17 es producida por células T de memoria activadas. También es producida por células NK y neutrófilos. Es considerada un citocina pro-inflamatoria (induciendo otras citocinas pro-inflamatorias como IL-6 y TNF-α). Participa en la defensa contra diversos patógenos, como bacterias y hongos (Korn et al., 2007). Otra función de esta citocina consiste en el reclutamiento de monocitos y neutrófilos a través del incremento de la producción local de quimiocinas (IL-8, la proteína 1 quimiotáctica de los monocitos o MCP-1, oncogén de crecimiento regulado alfa) (Witowski J et al., 2000; Ruddy MJ et al., 2004). IL-17 dirige la acumulación de linfocitos B en los centros germinales del timo gracias a la expresión de proteínas de señal G, Rgs13 y Rgs16. Además, la ausencia de esta citocina conduce a una reducción de la formación de centros germinales con un menor número de células B (Hsu et al., 2008). Mu et al., demostraron que las células B específicas para AChR se estimulaban como consecuencia del tratamiento con IL-17, sugiriendo que IL-17 podría agravar la enfermedad en animales de experimentación (Mu et al., 2009). Recientemente, ha sido relacionada en la patogénesis de otras enfermedades autoinmunes experimentales o humanas como la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide o el lupus eritematoso sistémico (Tzartos et al., 2008; Wong et al., 2000; Aggarwal et al., 2002; Veldhoe et al., 2006). Baggi et al. estudiaron el efecto de la inmunoadsorción (IA) IgG sobre las citocinas en un número muy reducido de pacientes con MG y el síndrome miasténico de LambertEaton. A diferencia de la MG, en el LEMS los autoanticuerpos dirigidos a los VGCC no activan el complemento sino que la patogenia se debe al bloqueo de la transmisión al interferir con los canales de calcio (Lang et al., 2003). Encontró que los niveles basales Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 67 de IL-17 eran significativamente mayores en los 5 pacientes con MG comparadas con los pacientes con síndrome de Eaton-Lambert. Sin embargo, los niveles no se veían modificados con el tratamiento, al igual que ocurría con otras citocinas proinflamatorias como IL-6 o IFN-γ (Baggi F et al., 2008). No hay estudios precedentes que estudien los niveles séricos de IL-17 en pacientes miasténicos comparados con controles sanos ni su posible relación con la gravedad de la enfermedad. 2.9.3. sCD40L El ligando CD40L, también llamado sCD154, es una proteína transmembrana, perteneciente a la superfamilia del TNF. Se expresa en células T helper CD4+ activadas, plaquetas y células musculares lisas vasculares. Participa en la diferenciación y proliferación de las células B (Saeland et al., 1993) y en los intercambios de isotopos de los anticuerpos (Lederman et al., 1994). La activación de las células T requiere dos señales. Una señal es proporcionada por la interacción TCR/MHC. La otra es proporcionada por la coestimulación CD28/B7 (Sperling and Bluestone, 1996). El marcador CD28 es expresado en todas las células T, mientras que su receptorB7-1(CD80) y B7-2(CD86) es expresado en las células presentadoras de antígenos (CPA). Además de estas dos coestimulaciones, la vía CD40/CD40L es requerida para la secreción de citocinas por parte de las células T activadas (Grewal et al., 1996). En concreto, las células Th activan a las células B en reposo a través del reconocimiento TCR de las moléculas MHC de clase II y de la interacción CD40/CD40L. El CD40L es una proteína de membrana expresada fundamentalmente en las células CD4+ activadas, mientras que su receptor, CD40, es Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 68 expresado en las CPA, como células B, células dendríticas y macrófagos (Grewal et al., 1996). En la EAMG, Shi et al. informaron que ratones deficitarios de CD28 (CD28-/-) eran menos susceptibles a la inducción de la enfermedad, pero los ratones deficitarios de CD40L (CD40L-/-) eran completamente resistentes a la enfermedad (Shi et al., 1998). Esto indica que los requerimientos de estas dos interacciones son diferentes, pero mucho más importante la CD40/CD40L en la patogénesis de EAMG. Esta interacción induce la proliferación en las células B, potenciada por la IL-4 e IL-10 en humanos, y por IL-4 e IL-5 en animales. La interacción CD40/CD40L también activa a los macrófagos para producir citocinas inflamatorias (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, molécula de adhesión intercelular-1) (Schönbeck, Mach and Libby, 2000), y para activar y producir la expansión clonal de células T antígeno-específicas (Stout et al., 1996). Algunos estudios, además, sugieren que CD40L es crucial para la formación del centro germinal en el timo. Vista la importancia del marcador, fundamentalmente en la actividad de las células B, ha sido implicado en otras enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico, donde ya ha sido demostrado que los pacientes presentan niveles elevados de CD40L en sangre periférica comparado con controles sanos (Lee et al., 2006; Vakkalanka et al., 1999), y el marcador CD40 se expresa en las células T en exceso en estos pacientes (Yazdany and Davis, 2004). En animales, se ha demostrado que el tratamiento anti-CD40L es una manera efectiva para suprimir la EAMG cuando es dado a los animales, incluso en estadios crónicos de la enfermedad. El perfil de citocinas en estas ratas sugiere un efecto sobre las células Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 69 Th1, pero no en las Th2 o Th3 ni inducción en las células T reguladoras (Im et al., 2001). En humanos, algunos fármacos empleados en pacientes con MG, los inhibidores de la calcineurina (ej. tacrolimus o ciclosporina) disminuyen la expresión del CD40 ligando en las células T y evita que las células B en reposo sean activadas (Masuda et al., 2010). Esto abre vías inexploradas sobre la función que puede desempeñar este marcador en la MG con implicaciones terapéuticas. 2.9.4. IFN-γ IFN-γ es la citocina más representativa de las células Th1. Es considerada un citocina pro-inflamatoria. En pacientes con esclerosis múltiple los niveles de esta citocina se correlacionan con la fase de la enfermedad, incrementándose en los brotes y disminuyendo en las fases de remisión. Apoyando a esto, existen informes demostrando un empeoramiento clínico en aquellos pacientes tratados con IFN-gamma (Merrill et al., 1992, Panitch, 1992). En la EAMG, ratones deficitarios del receptor para IFN-γ, ratones IFN-γR-/-, la incidencia y severidad de la enfermedad está disminuida mientras que ratones deficitarios de IFN-γ, IFN-γ-/-, la inducción de la EAMG está incluso completamente bloqueada (Balasa et al., 1997; Balasa and Sarvetnick, 2000). Esto sugiere el requerimiento de IFN-γ para la inducción de la enfermedad. Sin embargo, para nuestro conocimiento no existen datos sobre si los niveles séricos de pacientes con MG se relacionan con las diferentes formas clínicas y la gravedad de la enfermedad. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 70 2.9.5. IL-6 La IL-6 es sintetizada fundamentalmente por linfocitos, fibroblastos y células endoteliales (Hirano, 1998). En cuanto a las poblaciones de células T y B, sólo son sintetizadas por aquellas células que se han diferenciado en Th2 y Be2, respectivamente (Mosmann et al., 1986; Harris et al., 2000). La IL-6 es una citocina con un amplio rango de actividades biológicas implicadas en procesos de regulación inmune e inflamación (Hirano et al., 1986). IL-6 es uno de los factores estimulantes de las células B más importantes. Además, IL-6 está implicada en el reclutamiento de células inflamatorias (López-Pedrera et al., 2010). Otra de las funciones más importantes de IL-6 es inducir la generación de células Th17 a partir de las células T naïve, junto con TGF-β, e inhibe la diferenciación de las células T reg inducidas por TGF-β (Bettelli et al., Mangan et al., 2006; Velhoen et al., 2006). Por tanto, IL-6 es capaz de actuar como potente citocina pro-inflamatoria a través de la promoción de las células Th17 y la inhibición de las células Treg, indicando que IL-6 regula el equilibrio entre las células Th17 y las células Treg con un importante papel en controlar las enfermedades autoinmunes. Considerando sus funciones sobre las células Th17 y Treg y su papel estimulador de células B, IL-6 ha sido sugerida como una potencial diana terapéutica para diferentes enfermedades autoinmunes Así, ha sido efectiva en el tratamiento de algunas condiciones autoinmunes como la artritis reumatoide y la enfermedad de Castleman (Nishimoto et al., 2008; Yokota et al., 2008) y relacionada en la patogénesis de la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico (Youinou and Jamin, 2009). Inmunopatogenia en Miastenia Gravis 77 tímica. En cambio, la MG con debut tardío se asocia, aunque débilmente, con el HLADR2 y B7. En esta línea, los haplotipos del sistema HLA pueden presentar además asociación negativa con subtipos de MG: DR3 con MG de debut tardío y DR7 con MG de debut precoz. La MG ocular está asociada con el HLA-BW46 (Uono, 1980). En países asiáticos como China o Japón los pacientes presentan alta frecuencia del HLA-DR9. Además, pacientes con debut precoz tienen más riesgo de presentar otras enfermedades autoinmunes y los hermanos gemelos monozigotos presentan un incremento de riesgo para desarrollar la enfermedad (Oosterhuis, 1989). Los pacientes con anti-MuSK presentan una asociación con el HLA DR14-DQ5 Otros genes diferentes del sistema HLA también se han asociado con la MG, como PTPN22, FCGR2 y CHRNA1. Interesantemente, el gen CHRNA1 codifica la subunidad alfa del AChR (Giraud, Vandiedonck, Garchon, 2008). Estos hallazgos apoyan la base genética en la inducción y desarrollo de la MG en humanos. El grado de influencia de la carga genética deberá ser aclarado en el futuro. Inmunopatogenia en Miastenia Gravis Justificación, hipótesis y objetivos 79 3. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Justificación, hipótesis y objetivos 80 Justificación, hipótesis y objetivos 81 3.1. Justificación Como hemos visto en los capítulos previos, la gran mayoría de pacientes (hasta un 85%) presentan la forma generalizada de la enfermedad a lo largo de la evolución, requiriendo tratamientos inmunosupresores para el control de los síntomas. Los inmunomoduladores son potentes agentes farmacológicos capaces de inhibir el sistema inmune humano disminuyendo o remitiendo la enfermedad autoinmune pero con reacciones adversas indirectas no deseables y potenciales serias complicaciones. Esto se debe a que la mayoría de estos fármacos son poco selectivos a la hora de bloquear las diferentes vías inmunitarias. Por todo esto, es de vital importancia focalizar los estudios en el conocimiento exhaustivo de los mecanismos, células, y vías de señal implicadas en la patogenia de la MG autoinmune (y en cada uno de los subgrupos de la enfermedad) con el fin de controlar el desorden inmunológico de una forma mucho más selectiva que hasta la fecha. El presente trabajo tiene como principal objetivo discernir cuál o cuáles de entre las diferentes vías inmunológicas en el ser humano tiene una mayor relevancia en la patogénesis de la MG autoinmune y en sus diferentes subgrupos. El sistema inmune es una red compleja con múltiples elementos e interacciones no triviales gobernadas por dinámicas no lineales. Justificación, hipótesis y objetivos 82 3.2. Hipótesis 3.2.1. Hipótesis inmunológicas Dado que la subpoblación LTh17 es la población de células T helper CD4+ con mayor relevancia entre los distintos subgrupos de LT helper en la patogénesis de MG, su citocina más representativa, IL-17, debe estar incrementada en pacientes con MG. Puesto que en la EAMG el tratamiento con IL-17 agrava la enfermedad, los niveles de esta citocina deben relacionarse con la gravedad de la enfermedad en humanos. IFN-γ es una citocina LTh1 dependiente. Dado que es una citocina pro-inflamatoria y con la población LTh1 incrementada en la EAMG, los pacientes con MG deben presentar niveles incrementados de IFN-γ y además deben estar correlacionados con la gravedad de la enfermedad. IL-10, citocina LTh2, presenta un comportamiento complejo y pleiotrópico: antiinflamatorio inhibiendo las citocinas Th1 dependientes, y por otro lado, proinflamatorio, induciendo la proliferación y diferenciación de células B. Esto presupone que sus niveles en pacientes con MG no deben diferir al de los controles. IL-6. Considerando su papel estimulador sobre las células Th17, su función inhibitoria de las células Treg, además de ser considerada uno de los principales estimuladores de las células B, esperamos encontrar niveles incrementados de esta citocina en suero de pacientes con MG y correlacionados con la gravedad de la enfermedad. TNF-α. Considerando que es una citocina LTh1 dependiente, su implicación en el desarrollo de EAMG y el beneficio clínico que producen los fármacos que inhiben su función (infliximab, etanercept), esperamos encontrar niveles de TNF-α incrementados en el suero de los pacientes con MG. Justificación, hipótesis y objetivos 83 sCD40L. Considerando que i) CD40L participa en la proliferación y diferenciación de las células B, y que ii) los niveles de este mediador han sido encontrados elevado en otras enfermedad autoinmunes, esperamos encontrar niveles séricos incrementados en pacientes con MG. La activación del complemento conlleva incrementos de la síntesis de los componentes del complemento traducido por un incremento sérico de estas proteínas. 3.3. Objetivos 3.3.2. Objetivos clínico-epidemiológicos Conocer la incidencia de MG autoinmune en nuestro medio Conocer las características clínicas de presentación en nuestro medio de pacientes con MG. Conocer las características epidemiológicas en pacientes con MG de novo en nuestro medio. Conocer comorbilidades, incluidas condiciones autoinmunes, asociadas a pacientes con MG de reciente diagnóstico 3.3.1. Objetivos inmunológicos Evaluar los niveles séricos de citocinas dependientes de la vía Th1 (IFN-γ, TNF-α) en pacientes con reciente diagnóstico Evaluar los niveles séricos de citocinas dependientes de la vía Th2 (IL-10, IL-6) en pacientes con MG de reciente diagnóstico Justificación, hipótesis y objetivos 84 Evaluar los niveles séricos de IL-17, citocina Th17 dependiente, en pacientes con MG de reciente diagnóstico Evaluar los niveles séricos de sCD40 L en pacientes con MG de reciente diagnóstico Evaluar los niveles séricos de componentes de complemento, C3, C4, C5 y C9, en pacientes con MG de reciente diagnóstico y establecer posibles relaciones con el título de anticuerpos y con la gravedad de la enfermedad. Material y métodos 85 4. MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 86 Material y métodos 93  Enfermedad de Graves: hiperplasia difusa de la glándula tiroides que conduce a la presencia de bocio e hipertiroidismo.  Tiroiditis crónica de Hashimoto: trastorno de la glándula tiroiditis asociado a hipotiroidismo.  Hipotiroidismo e hipertiroidismo: o TSH (normal: 0.34-5.60 µUI/mL). o T4 libre ó tiroxina (normal: 0.58-1.64 ng/dL).  Alteración de anticuerpos tiroideos: los antígenos se encuentran en la célula epitelial del folículo tiroideo. o Antireceptor de TSH: Confirma la enfermedad de Graves en pacientes con hipertiroidismo. o Antiperoxidasa: Sugieren origen autoinmune de la disunción tiroidea, fundamentalmente tiroiditis de Hashimoto. o Antitiroglobulina: Menor utilidad clínica en la valoración de enfermedad autoinmune tiroidea dado que suelen ser positivos cuando los antiperoxidasa lo son también.  Presencia de autoanticuerpos contra antígenos de la unión neuromuscular:  Seropositivos para anti-AChR (patológico > 0.20 nmol/L)  Seropositivos para anti-MuSK (patológico > 0.05 nmol/L)  Seronegativos  Presencia de autoanticuerpos dirgidos contra antígenos nucleares:  Antinucleares  Antimitocondriales Material y métodos 94  Ant-nDNA  Antimúsculo-liso  Anti células parietales  Anti-Ro  Anti-La  Neoplasias asociadas:  Linfomas  Otras 4.7.2. Inmunológicas  Niveles séricos de IL-10 (pg/ml)  Niveles séricos de IL-6 (pg/ml)  Niveles séricos de IFN-γ (pg/ml)  Niveles séricos de TNF-α (pg/ml)  Niveles séricos de sCD40L (pg/ml)  Niveles séricos de IL-17 (pg/ml)  Niveles séricos de C3 (pg/ml)  Niveles séricos de C4 (pg/ml)  Niveles séricos de C5 (pg/ml)  Niveles séricos de C9 (pg/ml) 4.8. Controles El grupo control consistió de 15 sujetos sanos sin enfermedades inflamatorias, de edades y sexo similares a los pacientes. Material y métodos 95 Los participantes fueron reclutados del personal médico, de enfermería y auxiliares de enfermería del Departamento de Neurología, cónyuges de pacientes con MG y familiares de los investigadores del proyecto. El tiempo de extracción de las muestras de los sujetos control fue realizado a primera hora de la mañana, preferiblemente en ayunas. El consentimiento informado fue obtenido de todos los participantes. 4.9. Procesamiento de muestras Las muestras de sangre fueron obtenidas por venopunción e inmediatamente centrifugadas durante 15 minutos a 3000 rpm. El tiempo de extracción de las muestras, tanto de controles como casos, fue realizado entre las 8 y 11 horas de la mañana, preferiblemente en ayunas. Las muestras fueron conservadas a -80ºC. No se realizó ningún ciclo de descongelación de las muestras. Todas las muestras fueron medidas en duplicado y analizadas simultáneamente. Fueron analizadas al final del reclutamiento y de forma ciega para los datos clínicos. El análisis de las muestras fue realizado en el Departamento de Inmunología del Hospital Universitario Lozano Blesa de Zaragoza. El análisis del complemento fue realizado por técnicas de inmunoprecipitado y la detección de citocinas mediante tecnología Luminex® xMAP® con los reactivos Milliplex de Millipore para citocinas de alta sensibilidad (ver apartado 4.10. Tecnología Multiplex). El rango de detección para las citocinas estudiadas oscilaba entre 3.2 pg/mL y 10,000 pg/mL. Material y métodos 96 Todas las muestras fueron recogidas en el momento de la manifestación de la enfermedad y ninguno de los participantes había tomado corticosteroides o cualquier otro inmunosupresor en los 3 meses previos. La concentración de anti-AChR fue realizada por un laboratorio comercial en diferentes tiempos, por razones diagnósticas y terapéuticas. El método empleado fue por radioinmunoanálisis. 4.10. Tecnología Multiplex La tecnología Luminex® xMAP® permite analizar diferentes citocinas y mediadores inmunológicos con una pequeña cantidad de suero (50 µL) de manera simultánea. La tecnología Multiplex es un citómetro de flujo especial que trabaja con diferentes colores. La tecnología consiste de micropartículas o microesferas de látex teñidas con fluoróforos de dos colorantes en diferentes proporciones generando diversos juegos de microesferas. Se pueden distinguir hasta 100 combinaciones. Cada juego de gotas se cubre con la captura de anticuerpos específicos para un analito. El analito capturado, procedente de la muestra a estudio, se detecta mediante un anticuerpo de detección biotinilado y estreptavidina-ficoeritrina (S-PE). Al incidir un rayo láser se excitan los colorantes internos de cada microesfera. Un segundo láser excite el PE, el colorante fluorescente. Finalmente, procesadores digitales de alta velocidad identifican cada microesfera individual y cuantifica el resultado de este inmunoensayo basado en las señales fluorescentes. El sistema requiere realizar una curva de calibración con cantidades de citocina conocidas (Blanco et al., 2007). El empleo de microesferas permite una superficie de Material y métodos 97 contacto antígeno-anticuerpo superior al ELISA convencional conduciendo una mayor sensibilidad en la detección de los analitos estudiados. 4.11. Análisis estadístico 4.11.1. Estadística descriptiva En el análisis descriptivo del proyecto, el uso de histogramas fue requerido para la representación gráfica de algunos resultados. Para contrastar la normalidad de los datos fueron empleados los test de KolmogorovSmirnov y Shapiro-Wilk. 4.11.2. Estadística analítica 4.11.2.1. Análisis univariante En el análisis univariante, los datos son expresados, preferiblemente, con la media ± desviación estándar (DS, del inglés deviation standard), cuando el conjunto de los mismos seguían un comportamiento gaussiano. En los datos con distribución no paramétrica los datos eran expresados con la mediana y el rango. 4.11.2.2. Análisis bivariante En el análisis bivariante diferentes test fueron empleados: En las variables cuantitativas con comportamiento no normal, el test de Mann-Whitney fue empleado para analizar las diferencias de las variables entre dos grupos. El test de Kruskal-Wallis fue empleado para la comparación de los niveles séricos entre 3 grupos. Material y métodos 98 El test t-student fue empleado para comparar variables con comportamiento normal entre dos grupos. El test ANOVA fue requerido cuando se analizaban 3 o más grupos. Finalmente, variables cualitativas fueron comparadas con el test de Chi-cuadrado y cuando era requerido por limitaciones del anterior, el test de Fisher. Correlaciones entre las variables cuantitativas fueron analizadas por el coeficiente de correlación empleando el método de Pearson para variables paramétricas y el método de Spearman para las variables no paramétricas. Las diferencias eran consideradas significativas con P < 0.05. Todos los contrastes fueron bilaterales. Resultados 99 5. RESULTADOS Resultados 100 Resultados 101 5.1. Sección I: epidemiología 5.1.1. Casos registrados de MG En el tiempo de estudio de 24 meses fueron registrados 29 pacientes con diagnóstico de novo de MG. 3 pacientes no fueron considerados en el cálculo de incidencia, pero sí en el resto de secciones del estudio, al pertenecer a un Sector Sanitario médico diferente del estudiado (Sector Sanitario II). 5.1.1.1. Tasas de incidencia brutas Considerando que el Sector Sanitario II de Aragón comprende una población de 400.245 habitantes, la incidencia anual es de 3,25 pacientes por 100.000 habitantes. El siguiente gráfico muestra la incidencia anual de MG específica por estrato de edad (figura 1). Figura 1. Incidencia anual de MG por grupo edad. Datos mostrados por cada 100.000 habitantes. La incidencia anual específica en varones es de 3,91 nuevos casos de MG por 100.000 habitantes. La incidencia anual específica en mujeres es de 2,64 por 100.000 habitantes. Resultados 102 El siguiente gráfico muestra la incidencia específica anual para cada rango de edad y sexo en el Sector Sanitario II (figura 2). Figura 2. Incidencia anual de MG por grupo edad y sexo. Los datos de incidencia son mostrados por cada 100.000 habitantes y año. Resultados 109 Figura 4. Gráfico Q-Q de la edad de aparición de síntomas en la cohorte de pacientes (n=29). Al clasificar a los pacientes de acuerdo con el sexo, la edad media de presentación en los varones era de de 66,1 ± 14,4 años (mediana 67 años; rango 29-87 años) (figura x). En las mujeres la edad media de presentación era de 59,1 ± 20,8 años (mediana 69 años; rango 21-81 años) (figura 5). Resultados 110 Figura 5. Edad de debut de la enfermedad de acuerdo con el sexo en la cohorte de pacientes. 5.1.2.1. Edad de presentación y forma clínica Los pacientes con MG ocular tenían una edad media de presentación de 62,2±18,1 años (mediana 66 años, rango 21-87 años). Los pacientes con MG generalizada tenían una edad media de presentación de 64,5 ± 17,3 años (mediana 70 años, rango 26-81 años). La distribución de los años de acuerdo con la forma clínica de presentación presentaba un comportamiento no normal (MG ocular: 0,008 Kolmogorov-Smirnov; 0,030 Shapiro-Wilk; MG generalizada: 0,044 Kolmogorov-Smirnov; 0,031 Shapiro-Wilk; MG generalizada). Resultados 111 No existían diferencias significativas entre la edad media de presentación entre la MG ocular y MG generalizada (P=0,630). Los datos son mostrados en el siguiente diagrama (figura 6). Figura 6. Edad media de presentación de los pacientes de acuerdo con la forma clínica de presentación. 5.1.3. Sexo De los 29 pacientes con MG de novo, 16 pacientes (55%) eran varones y 13 pacientes (45%) eran mujeres. Resultados 112 5.1.3.1. Sexo y edad de presentación En el subgrupo de pacientes con debut precoz (antes de los 50 años), la proporción era favorable hacia las mujeres con 4 mujeres frente a 2 varones. En los pacientes con debut tardío (después de los 50 años), la proporción se veía invertida con 14 varones frente a 9 mujeres. No existían diferencias significativas en la distribución por sexo de acuerdo con la edad de aparición de MG (P=0,364) (tabla 5). Hombres Mujeres Total MG de inicio precoz 2 4 6 MG de inicio tardío 14 9 23 Total 16 13 29 P=0,364 Tabla 5. Distribución por sexo de acuerdo con el inicio de síntomas de MG. P evaluado con el test exacto de Fisher. 5.1.3.2. Sexo y forma clínica de presentación En el subgrupo de MG ocular, 14 (74%) de 19 pacientes son varones y 5 (26%) de 19 mujeres. En el subgrupo de MG generalizada, 2 (20%) de 10 pacientes son hombres y 8 (80%) de 10 pacientes mujeres. Resultados 113 Inversamente, de los 16 varones, 14 pacientes (88%) se presentaron con síntomas oculares y 2 pacientes (12%) se presentaron con síntomas generales. De las 13 mujeres, 5 pacientes (38%) se presentaron con síntomas oculares y 8 pacientes (62%) se presentaron con síntomas generales. Existían diferencias significativas en la distribución por sexo de acuerdo con la forma clínica de MG (P=0,016) (tabla 6). Hombres Mujeres Total MG ocular 14 5 19 MG generalizada 2 8 10 Total 16 13 29 P=0,016 Tabla 6. Distribución por sexo de acuerdo con la forma clínica de MG. P evaluado con el test exacto de Fisher. 5.1.4. Gravedad de la enfermedad Diecinueve (66%) de los 29 pacientes tenían MG ocular (Clase I de la escala MGFA). Diez de los 29 pacientes (33%) tenían MG generalizada (Clase II, III, IV y V de la escala MGFA) (tabla 7). Resultados 114 Clase MGFA N % MGFA I 19 66 MGFA II 5 17 MGFA III 3 10 MGFA IV 2 7 MGFA V 0 0 Tabla 7. Distribución de los pacientes de acuerdo con la clase de la MGFA. N: número de pacientes. MGFA: Myasthenia Gravis Foundation of America. Cuatro pacientes fueron clasificados con II-B, 1 paciente con II-A, 2 pacientes con IIIB, 1 paciente con estadio IVA y 1 un paciente con IVB. En los pacientes con MG generalizada, la mayoría de ellos tenían sintomatología bulbar predominante (80%) (tabla 8). A, N (%) B, N (%) Total, N (%) MGFA II 1 (10) 4 (40) 5 (50) MGFA III 0 (0) 3 (30) 3 (30) MGFA IV 1 (10) 1 (10) 1 (20) MGFA V 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 2 (20) 8 (80) 10 (100) Tabla 8. Distribución de los pacientes con MG generalizada de acuerdo con la clase de la escala de la MGFA y su sintomatología predominante. A: axial y extremidades. B: bulbar. N: número de pacientes. MGFA: Myasthenia Gravis Foundation of America. Resultados 115 5.1.5. Seropositividad anti-AChR Veinticuatro (83%) de 29 pacientes presentaban en suero autoanticuerpos anti-AChR. Cinco (17%) de 29 pacientes no presentaban en suero autoanticuerpos anti-AChR ni anti-MuSK clasificándose como seronegativos. Los datos de los valores del título de anti-AChR no seguían una distribución normal (P=0,133, test de Kolmogorov-Smirnov). Se muestra a continuación el gráfico Q-Q para los valores de anti-AChR séricos en los pacientes seropositivos (figura 7). Figura 7. Gráfico Q-Q de los niveles séricos de anti-AChR en los 24 pacientes seropositivos. Los valores son expresados en nmol/l. Resultados 116 La mediana era de 5,9 nmol/l. La amplitud intercuartil era de 13,4 nmol/l. El rango era 0,2 nmol-30,2 nmol/l. La distribución del título de anticuerpos es mostrado en el siguiente gráfico (figura 8). Figura 8. Niveles de anti-AChR en pacientes con MG. Las concentraciones séricas son expresadas en nmol/l en el eje X. El eje Y representa el número de pacientes. 5.1.5.1. Seropositividad y edad de debut No existían diferencias significativas (P=0,108) entre la seropositividad para anti-AChR y la edad de inicio de síntomas de MG (tabla 9). Seis (25%) de 24 pacientes seropositivos presentaban un debut precoz frente a los 18 pacientes (75%) que presentaban un debut tardío. De los 5 pacientes seronegativos, Resultados 117 todos ellos presentaron un debut tardío. Todos los pacientes con debut precoz eran seropositivos. Dieciocho (78%) de 23 pacientes con debut tardío eran seropositivos. Debut precoz Debut tardío Total Anti-AChR (+) 6 18 24 Anti-AChR (-) 0 5 5 Total 6 23 29 P=0,108 Tabla 9. Seropositividad de acuerdo con la edad de debut en la cohorte de pacientes. Debut precoz (antes de los 50 años). Debut tardío (después de los 50 años). P evaluada con el test de Fisher. 5.1.5.2. Seropositividad y forma de MG No existían diferencias significativas (P=1,000) entre la presencia de anti-AChR en suero y la forma clínica de MG (ocular y generalizada) (tabla 10). Dieciséis (84%) de 19 pacientes con MG ocular eran seropositivos frente al 16% de pacientes (n=3) con MG ocular seronegativos. Ocho (80%) de 10 pacientes con MG generalizada eran seropositivos frente a 2 (20%) de 10 pacientes con MG generalizada que eran seronegativos. Resultados 118 MG ocular MG generalizada Total Anti-AChR (+) 16 8 24 Anti-AChR (-) 3 2 5 Total 19 10 29 P=1,000 Tabla 10. Seropositividad de acuerdo con forma de presentación en la cohorte de pacientes. P evaluada con el test de Fisher. 5.1.5.3. Seropositividad y sexo No existen diferencias significativas entre la presencia en suero de anti-AChR y el género (P=1,000) (tabla 11). En hombres, 13 (81%) de 16 pacientes eran seropositivos. En mujeres, 11 (19%) de 13 pacientes eran seropositivos. La proporción hombre:mujer en pacientes seronegativos es 13:11=1,18. La proporción hombre:mujer en pacientes seronegativos es 3:2=1,50. Hombres Mujeres Total Anti-AChR (+) 13 11 24 Anti-AChR (-) 3 2 5 Total 16 13 29 P=1,000 Tabla 11. Seropositividad de acuerdo con el sexo en la cohorte de pacientes. P evaluada con el test de Fisher. Resultados 125 5.1.7.2. Enfermedades autoinmunes y edad de presentación No existían diferencias significativas (P=0,180) entre la presencia de aparición de otras condiciones autoinmunes y la edad de presentación clínica: MG de debut precoz (antes de los 50 años) y MG de debut tardío (después de los 50 años). Entre los pacientes con debut precoz, 2 (33%) de 6 casos presentaba otras enfermedades autoinmunes. Entre los pacientes con debut tardío, 1 (8%) de 23 pacientes presentaba otras condiciones autoinmunes. Los datos son mostrados en la tabla 14. Autoinmunes (+) Autoinmunes (-) Total MG debut precoz 2 4 6 MG debut tardío 2 21 23 Total 4 25 29 P=0,180 Tabla 14. Frecuencia de pacientes con enfermedades autoinmunes de acuerdo con la edad de presentación de la enfermedad. 5.1.7.3. Enfermedades autoinmunes y sexo No existían diferencias significativas (P=1,000) entre la presencia de aparición de otras condiciones autoinmunes y el sexo. Entre los pacientes varones, 2 pacientes (13%) de 16 casos presentaba otras enfermedades autoinmunes. Entre las mujeres, 2 (15%) de 13 pacientes presentaba otras condiciones autoinmunes. Los datos son mostrados en la tabla 15. Resultados 126 Autoinmunes (+) Autoinmunes (-) Total Hombres 2 14 16 Mujeres 2 11 13 Total 4 25 29 P=1,000 Tabla 15. Frecuencia de pacientes con enfermedades autoinmunes distribuidos en función del sexo. 5.1.7.4. Enfermedades autoinmunes y seropositividad No existían diferencias significativas (P=1,000) entre la presencia de aparición de otras condiciones autoinmunes y la presencia en suero de anti-AChR. Entre los pacientes seropositivos, 4 pacientes (17%) de 24 casos presentaba otras enfermedades autoinmunes. Entre los pacientes seronegativos ninguno de los pacientes (n=5) presentaba otras condiciones autoinmunes. Los datos son mostrados en la tabla 16. Autoinmunes (+) Autoinmunes (-) Total Seropositivos 4 20 24 Seronegativos 0 5 5 Total 4 25 29 P=1,000 Tabla 16. Frecuencia de pacientes con enfermedades autoinmunes distribuidos en función de la presencia o no de anticuerpos anti-AChR. Resultados 127 5.1.7.5. Coexistencia de varias condiciones autoinmunes Una paciente (3%) de entre los 29 fue diagnosticada de forma síncrona de lupus eritematoso sistémico y MG. Esta era la única paciente que cumplía la suma de estas características: mujer, debut precoz, MG generalizada. 5.1.8. Neoplasias asociadas Tres pacientes (Anexo V. Casos nº.4, nº.15 y nº.25) presentaron una neoplasia previa o simultánea al diagnóstico de MG: una mujer previamente diagnosticada hacía más de 10 años de neoplasia de mama, un varón con antecedente de Linfoma no Hodgkin extratímico y un varón en el que se diagnosticó un adenocarcinoma gástrico en el ingreso del debut sintomático de la MG. No consideramos en este apartado a la paciente que presentó un timoma (Anexo V. Caso nº.5). 5.1.8.1. Linfoma no Hodgkin. Caso nº.25. El caso nº.25 (Anexo V) fue diagnosticado de linfoma no Hodgkin folicular de bajo grado hace más de 15 años al presentar un síndrome adenopático generalizado. Las exploraciones iniciales constataron adenomegalias en todas las localizaciones (laterocervicales, axilares e inguinales) sin grandes masas, esplenomegalia ni hepatomegalia. Las pruebas de imagen mostraban adenopatías axilares bilaterales (la mayor de 2 cm), adenopatías retroperitoneales de menos de 5mm, y pequeñas adenopatías en cadena paratraqueal derecha. El hígado estaba moderadamente aumentado de tamño por esteatosis. Dada la estabilidad clínica y radiológica se ha mantenido sin tratamiento hasta la fecha actual. Resultados 128 Desde un punto de vista neurológico, el paciente presentó sintomatología compatible con MG ocular, clase I de la MGFA con buena respuesta a piridostigmina (240 mg/día). Los anti-AChR no estaban presentes en suero. Meses después del inicio del diagnóstico, presentó episodio de ptosis total y debilidad masticatoria propiciando el inicio de tratamiento con dosis bajas de prednisona con buena tolerancia y eficacia. No se ha constatado timoma en ninguna de las pruebas de imagen solicitadas durante el seguimiento. 5.1.8.2. Adenocarcinoma gástrico. Caso nº.15. El paciente nº.15 (Anexo V) ingresó de forma urgente por pérdida de fuerza progresiva en extremidades, sin sintomatología bulbar u ocular. No había síndrome constitucional ni dolor. En el ingreso se detectó rabdomiólisis y debilidad proximal en extremidades superiores e inferiores 3/5, así como debilidad en musculatura flexora cervical 2/5 con fatigabilidad evidente. Se inició tratamiento con Inmunoglobulinas IV y piridostigmina con recuperación en fuerza que permite al paciente volver a deambular. El TAC cerebral era normal y la electromiografía de fibra única (realizada con tratamiento anticolinesterásico) fue normal. Los anti-AchR fueron positivos con un título de 14,50 nmol /l confirmándose el diagnóstico de Miastenia Gravis Autoinmune, clase IV-A. En el ingreso apareció una hemorragia digestiva alta encontrándose en la gastroscopia en cara posterior de cuerpo bajo gástrico una úlcera de aspecto neoplásico que afectaba a curvatura menor e incisura, recogiéndose muestra para biopsia. El estudio anatomopatológico era compatible con adenocarcinoma gástrico de tipo intestinal. El PET-TAC mostró adenopatías en el ligamento gastrohepático de hasta 1,43 cm de Resultados 129 diaámtetro, con refuerzao en la fijación de glucosa, SUV mx. 2.32. Adenopatías mesentéricas subcentimétricas, que no captan glucosa, SUV máx. 1.44, comportándose metabólicamente como reactivas. Como consecuencia del estudio de extensión se definió a la enfermedad como un estadío T2-3 N+ (adenopatías en el ligamento gastrohepático-pericelíacas). Fue intervenido quirúrgicamente realizándose una gastrectomía subtotal, con reconstrucción en Y de Roux. En el acto quirúrgico se objetivó una neoplasia a nivel del antro pilórico, resecable, sin identificar macroscópicamente la presencia de lesiones ocupantes de espacio ni en hígado ni en el resto de la cavidad peritoneal. El estudio de la pieza anatómica mostró un adenocarcinoma gástrico enteroide de 3 x 2 cm con márgenes libres. Grado histológico 3, poco diferenciado. Invadía localmente el epiplón menor. Número de ganglios aislados: 12; número de ganglios metastatizados :6. No había invasión venosa ni invasión de linfáticos perineurales. La clasificación pTNM correspondía a un pT3-N2. El estudio de la valoración de inmunorreactividad para Hercep-test fue positivo 2+ sin amplificación por FISH. A los 19 meses de seguimiento el paciente se encuentra estable con buen estado general con buena tolerancia al tratamiento con capecitabina (Xeloda®), pero presentando en pruebas de imagen una lesión ocupante de espacio hepática de 14 mm en segmento VII del lóbulo hepátido derecho de nueva aparición y múltiples nódulos (el mayor mide 23 mm, adyacente al borde hepático izquierdo) sugestivos de implantes tumorales o adenopatías. El tratamiento actual para la enfermedad autoinmune consiste en piridostigmina. Resultados 130 5.1.9. Autoanticuerpos 7 (24%) de los 29 pacientes presentaban en suero positividad para al menos alguno de los autoanticuerpos nucleares estudiados: ANAs, ASMA, ANA, PACA, DNA, Ro, La, Sm, Jo, RNP, Scl 70. 5.1.9.1. Autoanticuerpos y forma de MG Existen diferencias significativas (P=0,030) entre la presencia de aparición de otras condiciones autoinmunes y la forma clínica de MG. Entre los pacientes con MG ocular, 2 pacientes (11%) de 19 casos presenta autoanticuerpos nucleares en suero. Entre los pacientes con MG generalizada, 5 (50%) de 10 pacientes presenta autoanticuerpos nucleares en suero. Los datos son mostrados en la tabla 17. AAN (+) AAN (-) Total MG ocular 2 17 19 MG generalizada 5 5 10 Total 7 25 29 P=0,030 Tabla 17. Frecuencia de pacientes con autoanticuerpos nucleares de acuerdo con la forma clínica de MG: MG ocular y MG generalizada. AAN: autoanticuerpos nucleares. P evaluada con el test exacto de Fisher. Resultados 131 5.1.9.2. Autoanticuerpos nucleares y edad de presentación No existen diferencias significativas (P=0,612) entre la presencia de de autoanticuerpos nucleares en suero y la edad de presentación clínica: MG de debut precoz (antes de los 50 años) y MG de debut tardío (después de los 50 años). AAN (+) AAN (-) Total MG debut precoz 4 2 6 Mg debut tardío 3 20 23 Total 7 22 29 P=0,612 Tabla 18. Autoanticuerpos nucleares de acuerdo con la edad de presentación de la enfermedad: MG debut precoz (antes de los 50 años). MG debut tardío (después de los 50 años). AAN: autoanticuerpos nucleares. P evaluado con el test exacto de Fisher. Entre los pacientes con debut precoz, el porcentaje de pacientes con presencia en suero de autoanticuerpos nucleares es del 67%, con 4 de 6 pacientes con debut precoz. Entre los pacientes con debut tardío, 3 de 23 (13%) pacientes presenta autoanticuerpos nucleares. 5.1.9.3. Autoanticuerpos nucleares y sexo Existen diferencias significativas (P=0,026) entre la presencia de aparición de otras condiciones autoinmunes y el sexo. Resultados 132 Entre los pacientes varones, 1 pacientes (6%) de 16 casos presenta autoanticuerpos nucleares en suero. Entre las mujeres, 6 (46%) de 13 pacientes presenta otras condiciones autoinmunes. Los datos son mostrados en la tabla 19. AAN (+) AAN (-) Total Hombres 1 15 16 Mujeres 6 7 13 Total 7 22 29 P=0,026 Tabla 19. Frecuencia de pacientes con autoanticuerpos nucleares en suero distribuidos en función del sexo. AAN: autoanticuerpos nucleares. P evaluada con el test exacto de Fisher. 5.1.10. Respuesta al tratamiento A los 6 meses de evolución desde el diagnóstico de la enfermedad, los fármacos empleados son: 2 pacientes (7%) estaban libres de medicación, piridostigmina era empleada en 27 pacientes (93%), prednisona era empleada en 11 pacientes (38%), azatioprina era empleada en 3 pacientes (10%), metotrexate era empleada en 1 paciente (3%), inmunoglobulina IV era empleada en 4 pacientes (14%). Los datos referentes a los fármacos empleados son detallados en la siguiente tabla (tabla 20). Resultados 133 Fármaco N, (%) Dosis empleada Ninguno 2 (7) - Piridostigmina 27 (93) 60-240 mg Prednisona 11 (38) 5-60 mg Azatioprina 3 (10) 150-200 mg Metotrexate 1 (3) X IVIg 4 (14) 2g/Kg Tabla 20. Empleo de fármacos en la cohorte entera con MG. 5.1.11. Diagnóstico Veinticuatro (83%) de 29 pacientes fueron diagnosticados con una clínica compatible y una serología positiva en sangre. De los 5 pacientes seronegativos, 2 (7%) fueron diagnosticados con una respuesta positiva al test de Anticude® (mediante la evaluación doble ciego de la ptosis palpebral) y 3 (10%) pacientes fueron diagnosticados con electrofisiología (estimulación nerviosa repetitiva). Los datos son mostrados en la siguiente tabla (tabla 21). Resultados 134 Criterio diagnóstico empleado N % Serológico 24 83 Anticude® 2 7 Electrofisiológico 3 10 Tabla 21. Criterio empleado en el diagnóstico de MG. N: número de pacientes. 5.1.11.1 Aperistalsis esofágico. Caso nº.22. Paciente mujer de 79 años de edad (Anexo V. Caso nº.22), sin antecedentes personales ni familiares de interés, con una historia desde hacía 2 meses de disfagia mantenida y progresiva, fundamentalmente para líquidos. No relataba fatigabilidad. Inicialmente, ingresó en el servicio de digestivo donde se había descartado patología local, mediante gastroscopia, laringoscopia y TC toraco-abdominal. La afectación era grave, habiendo perdido más de 10 kg desde el inicio del cuadro. No presentaba trastorno del lenguaje ni disnea. No refería ningún otro síntoma. En la exploración, los pares craneales eran normales. El reflejo nauseoso estaba presente. El arco paladar era normal y simétrico. No había diplopía ni ptosis. Tampoco había atrofia ni fasciculaciones en la lengua. Existía una leve debilidad en la flexión cervical, 4/5, sin clara fatigabilidad, y la musculatura de cinturas era normal. No había trastorno sensitivo ni de la coordinación. Los reflejos de estiramiento muscular eran normales y los reflejos cutaneoplantares eran flexores. La bioquímica que incluía hormonas tiroideas, lactato, creatincinasa, mioglobina, cortisol, proteinograma, marcadores tumorales fue normal. En el estudio electrofisiológico, realizando estimulación repetitiva del nervio espinal derecho con Resultados 141 5.2.2.3. TNF-α y sexo No existen diferencias entre los valores séricos de TNF-α y el sexo de los pacientes con MG (P=0,165) (tabla 30). Hombres (n=12) Mujeres (n=13) P TNF-α (pg/ml) 7,30 ± 2,89 5,84 ± 2,42 0,165 Tabla 30. Niveles de TNF-α en el grupo de pacientes distribuidos en función del sexo. P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.2.4. TNF-α y forma clínica Al clasificar a los sujetos en tres grupos: MG generalizada, MG ocular y controles, no encontramos diferencias significativas en los niveles de TNF-α (P=0,907) (tabla 31). MG generalizada MG ocular Controles P TNF-α (pg/ml) 6,70 ± 2,46 6,45 ± 2,91 6,22 ± 2,65 0,907 Tabla 31. Niveles de TNF-α en el grupo de pacientes y controles. P evaluada con el test de Kruskal-Wallis. La concentración de TNF-α era similar en pacientes con MG generalizada (6,70 ± 2,46 pg/ml) en comparación con la de los controles (6,22 ± 2,65, P=0,591). No había diferencia entre los niveles séricos de los pacientes con MG ocular (6,45 ± 2,91pg/ml) en comparación con los de los controles (6,22 ± 2,65, P=0,984). Resultados 142 No existían diferencias al comparar niveles entre el grupo con MG ocular y MG generalizada (P=0,799). MG generalizada MG ocular P TNF-α (pg/ml) 6,70 ± 2,46 6,45 ± 2,91 0,799 Tabla 32. Comparación de niveles séricos de TNF-α entre el grupo de pacientes con MG generalizada y pacientes con MG ocular. P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.2.5. TNF-α y timo Pacientes con anormalidades tímicas presentaron valores en suero de TNF-α (7,04 ± 5,42 pg/ml) no diferentes a los de los pacientes sin anormalidades tímicas (6,50 ± 2,57 pg/ml, P=0,960). 5.2.2.6. TNF-α y seropositividad Los pacientes con anti-AChR positivos tenían niveles no significativamente diferentes (6,04 ± 2,43 pg/ml) comparados con los de los pacientes seronegativos (8,54 ± 3,11 pg/ml, P=0,134). 5.2.2.7. TNF-α y anti-AChR en suero Existía una correlación positiva (r=0.413), aunque sin llegar a la significación estadística (P=0.070) entre los niveles de TNF-α en suero y los niveles séricos de antiAChR en pacientes seropositivos. Resultados 143 5.2.2.8. TNF-α y otras condiciones autoinmunes No existían diferencias entre los valores séricos de TNF-α y la presencia o no de enfermedades autoinmunes (P=0,900) (tabla 33). Autoinmunes (+) (n=3) Autoinmunes (+) (n=22) P TNF-α (pg/ml) 6,78 ± 3,86 6,51 ± 2,63 0,900 Tabla 33. Niveles de TNF-α entre el grupo de pacientes con otras enfermedades autoinmunes y pacientes sin otras enfermedades autoinmunes. P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.2.9. TNF-α y autoanticuerpos nucleares en suero Tampoco había diferencias en los niveles de TNF-α entre los pacientes con MG y anticuerpos nucleares (6,35 ± 2,67 pg/ml) y los pacientes con MG sin anticuerpos nucleares (6,44 ± 2,82 pg/ml) (tabla 34). AAN (+) (n=7) AAN (-) (n=18) P TNF-α (pg/ml) 6,35 ± 2,67 6,62 ± 2,79 0,952 Tabla 34. Niveles de TNF-α entre el grupo de pacientes con anticuerpos antinucleares en suero o no. AAN: autoanticuerpos antinucleares. P evaluada con el test de MannWhitney. Resultados 144 5.2.2.10. TNF-α y complemento No existen relaciones entre los niveles de TNF-α y los niveles de C3, C4, C5 y C9. Se muestran los datos en la siguiente tabla (tabla 35). C3 C4 C5 C9 Coeficiente correlación (Rho de Spearman) 0,113 -0,027 0,197 -0,086 P 0.499 0,873 0327 0,608 Tabla 35. Correlaciones entre los niveles de TNF-α y componente séricos de complemento. 5.2.2.11. TNF-α y citocinas No existían relaciones entre los niveles séricos de TNF-α y el resto de citocinas estudiadas (tabla 36). sCD40L IFN-γ IL-17 Coeficiente correlación (Rho de Spearman) 0,134 -0,049 0,062 P 0,422 0,763 0,703 Tabla 36. Correlaciones entre los niveles de TNF-α y otras citocinas estudiadas. Resultados 145 5.2.3. IL-17 5.2.3.1. IL-17 en pacientes y controles Había una tendencia hacia niveles séricos de IL-17 incrementados en los pacientes con MG comparados con los controles, aunque no alcanzó la significación estadística (tabla 37). MG Controles P IL-17 (pg/ml) 6,16 ± 7,48 3,2 ± 0,0 0,060 Tabla 37. Niveles de IL-17 en el grupo de pacientes y controles. P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.3.2. IL-17 y edad de presentación No había diferencias en los niveles de IL-17 entre la MG de debut precoz (10,64 ± 14,88 pg/ml) y la MG de debut tardío (5,17 ± 5,10pg/ml, P=0,633). 5.2.3.3. IL-17 y sexo No existían diferencias entre los valores séricos de TNF-α y el sexo de los pacientes con MG (P=0,129) (tabla 38). Hombres (n=12) Mujeres (n=13) P IL-17 (pg/ml) 3,49 ± 0,99 8,41 ± 9,67 0,129 Tabla 38. Niveles de IL-17 en el grupo de pacientes distribuidos en función del sexo. P evaluada con el test de Mann-Whitney. Resultados 146 5.2.3.4. IL-17 y forma clínica La concentración de IL-17 estaba elevada en los pacientes con MG generalizada (10,7 ± 10,9 pg/ml) comparada con la concentración con los pacientes con MG ocular (3,4 ± 0,9 pg/ml, P=0,017) y los controles sanos (3,2 ± 0,0 pg/ml P=0,013). Al clasificar a los sujetos en tres grupos: MG generalizada, MG ocular y controles, encontramos diferencias significativas en los niveles de IL-17 (P=0,004). La concentración de IL-17 eran significativamente mayor en pacientes con MG generalizada (10,7 ± 10,9pg/ml) en comparación con la de los controles (3,2 ± 0,0, P=0,013). No había diferencia entre los niveles séricos de los pacientes con MG ocular en comparación con los controles (tabla 39). MG ocular Controles P IL-17 (pg/ml) 3,4 ± 0,9 3,2 ± 0,0 0,386 Tabla 39. Comparación de niveles séricos de IL-17 entre el grupo de pacientes con MG ocular y controles. P evaluada con el test de Mann-Whitney. Existen diferencias al comparar niveles entre el grupo con MG ocular y MG generalizada (P=0,017). MG generalizada MG ocular P IL-17 (pg/ml) 10,7 ± 10,9 3,4 ± 0,9 0,017 Tabla 40. Comparación de niveles séricos de IL-17 entre el grupo de pacientes con MG generalizada y pacientes con MG ocular. P evaluada con el test de Mann-Whitney. Resultados 147 5.2.3.5. IL-17 y timo En la población entera, un significativo incremento en los niveles séricos de IL-17 fue observado en los pacientes con patología tímica (28,6 ± 6,2 pg/ml): un paciente con timoma (35,1 pg/ml) y el otro paciente con hiperplasia tímica (27,1 pg/ml). Pacientes sin anormalidades tímicas tenían niveles más bajos de IL-17 (4,1 ± 2,5 pg/ml, P=0,001). 5.2.3.6. IL-17 y seropositividad Los pacientes con anti-AChR positivos tenían niveles no significativamente diferentes (6,77 ± 8,06 pg/ml) comparados con los de los pacientes seronegativos (3,20 ± 0,00 pg/ml, P=0,224). 5.2.3.7. IL-17 y anti-AChR en suero La concentración de IL-17 en suero se correlacionaba con el título de anticuerpos antiAChR. El coeficiente de correlación era de r=0,242 (P=0,027). Además, la concentración de anti-AChR por encima de la mediana (5,72 nmol/l) tenía niveles incrementados de IL-17 (9,97 ± 10,60 pg/ml) comparados con aquellos con un título de anti-AChR por debajo de la mediana (3,42 ± 0,88 pg/ml, P=0,032). 5.2.3.8. IL-17 y otras condiciones autoinmunes Existían diferencias significativas entre los valores séricos de IL-17 y la presencia o no de enfermedades autoinmunes (P=0,014) (tabla 41). Resultados 148 Autoinmunes (-) (n=22) Autoinmunes (+) (n=3) P IL-17 (pg/ml) 4,12 ± 2,57 20,14 ± 15,30 0,014 Tabla 41. Niveles de IL-17 entre el grupo de pacientes con otras enfermedades autoinmunes y pacientes sin otras enfermedades autoinmunes. P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.3.9. IL-17 y autoanticuerpos nucleares en suero Existía diferencia en los niveles de IL-17 entre los pacientes con MG y anticuerpos nucleares (11,48 ± 12,25 pg/ml) y los pacientes con MG sin anticuerpos nucleares (3,93 ± 2,38 pg/ml), aunque no llegaba a la significación estadística (P=0,057). 5.2.3.10. IL-17 y complemento Existían relaciones entre los niveles de IL-17 y los niveles de C3, C5 y C9. La correlación entre IL-17 y C4 no llegaba a la significación estadística. Se muestran los datos en la siguiente tabla (tabla 42). C3 C4 C5 C9 Coeficiente correlación (Rho de Spearman) -0,544 -0,274 -0,333 0,587 P 0,001 0,096 0,041 0,001 Tabla 42. Correlaciones entre los niveles de IL-17 y componente séricos de complemento. Resultados 149 5.2.3.11. IL-17 y citocinas Existía una fuerte correlación positiva entre los niveles séricos de IFN-γ e IL-17 en los pacientes con MG (r=0,838; P<0,001) (tabla 43). sCD40L IFN-γ TNF-α Coeficiente correlación (Rho de Spearman) -0,363 0,838 0,062 P 0,023 0,001 0,703 Tabla 43. Correlaciones entre los niveles de IL-17 y otras citocinas estudiadas. 5.2.4. sCD40L 5.2.4.1. sCD40L en pacientes y controles Los niveles séricos de CD40L estaban disminuidos en los pacientes con MG (8562 ± 3123 pg/ml) comparados con los de los controles (9526 ± 473 pg/ml), pero sin llegar a la significación estadística (P=0,197) . 5.2.4.2. sCD40L y edad de presentación No existían diferencias entre los valores séricos de sCD40L entre la presencia o no en suero de anti-AChR (P=0,138) (tabla 44). Resultados 150 Debut precoz (n=4) Debut tardío (n=21) P sCD40L (pg/ml) 6121 ± 4794 9027 ± 2615 0,138 Tabla 44. Niveles de sCD40L entre el grupo de pacientes con debut precoz (menores de 50 años) y el grupo de pacientes con debut tardío (mayores de 50 años). P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.4.3. sCD40L y sexo No existen diferencias entre los valores séricos de sCD40L y el sexo de los pacientes AChR (P=0,885) (tabla 45). Hombres (n=12) Mujeres (n=13) P sCD40L (pg/ml) 8336 ± 3347 8772 ± 3024 0,885 Tabla 45. Niveles de sCD40L entre el grupo de pacientes con otras enfermedades autoinmunes y pacientes sin otras enfermedades autoinmunes. P evaluada con el test de Mann-Whitney. 5.2.4.4. sCD40L y forma clínica Al clasificar a los participantes en tres grupos: MG ocular, MG generalizada y controles no encontramos diferencias significativas entre los niveles séricos de sCD40L (P=0,477) (tabla 46).