Repositorio Institucional de Documentos

2013 73 Isabel Pajares Bernad Asociación entre mutaciones germinales en BRCA1 y cáncer de mama triple negativo diagnosticado antes de los 50 años y sin historia familiar Departamento Director/es Medicina, Psiquiatría y Dermatología Andrés Conejero, Raquel Tres Sánchez, Alejandro Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Isabel Pajares Bernad ASOCIACIÓN ENTRE MUTACIONES GERMINALES EN BRCA1 Y CÁNCER DE MAMA TRIPLE NEGATIVO DIAGNOSTICADO ANTES DE LOS 50 AÑOS Y SIN HISTORIA FAMILIAR Director/es Medicina, Psiquiatría y Dermatología Andrés Conejero, Raquel Tres Sánchez, Alejandro Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza ASOCIACION ENTRE MUTACIÓNES GERMINALES EN BRCA1 Y CÁNCER DE MAMA TRIPLE NEGATIVO DIAGNOSTICADO ANTES DE LOS 50 AÑOS Y SIN HISTORIA FAMILIAR Memoria Presentada por: Dña. Isabel Pajares Bernad Para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía Dirigida por: Dra. Dña. Raquel Andrés Conejero. Profesora Asociada de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza. Facultativo Especialista de Área del Servicio de Oncología Médica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Profesor D. Alejandro Tres Sánchez. Catedrático de Oncología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza. Jefe de Servicio de Oncología Médica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Ser un rio que fluye es ser silencioso dentro de la noche, capaz de reflejar la felicidad como las estrellas del cielo y de sumergir sin amargura las tinieblas a lo más profundo, porque de otra forma intuyo, que no podría seguir fluyendo. (M. Bandeira) AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Asociación de mutaciones germinales en BRCA1 y cáncer de mama triple negativo diagnosticado antes de los 50 años y sin historia familiar ABREVIATURAS 17 1. INTRODUCCIÓN 25 1.1Generalidades del Cáncer de Mama 27 1.1-1. Epidemiologia ……………………………………….....27 1.1-2. Factores de riesgo…………………………………..…..29 1.1-3. Carcinogenesis………………………….………….…...31 1.1-4. Tipos Histológicos…………………..……………........33 1.1-5. Diagnóstico……………………………………………..34 1.1-6. Estadificación……………………………..…………....35 1.1-7. Biología molecular………………….…………….……40 1.1-8. Factores pronósticos…………………………...…..…..43 1.2Cáncer de Mama hereditario 46 1.2-1. Susceptibilidad genética………………………….….....46 1.2-2. Genes de alta susceptibilidad: BRCA1 y BRCA2….…..47 1.2-3. Mutaciones germinales BRCA1 y BRCA2…………….50 1.2-4. Penetrancia de los genes BRCA1 y BRCA2…….…….52 1.2-5. Métodos de determinación mutacional……….………..53 1.2-6. Criterios de Selección…………………………………..54 1.2-7. Patrón fenotípico del cáncer de mama asociado a BRCA1/2…………………………….…………………57 1.2-8. Justificación de la identificación de mutaciones BRCA1/2……………………………………..…….…..62 2. OBJETIVOS 67 3. MATERIAL Y MÉTODOS 71 3.1Tipo de estudio 73 3.2Material 73 3.2-1. Universo Poblacional……………….…………………73 3.2-2. Población a estudio……………………….……………73 3.2-3. Criterios de inclusión…………………….……………74 3.2-4. Muestra………………………………………………...75 3.3Métodos 76 3.3-1. Consideraciones éticas……………………………….. 76 3.3-2. Recogida de datos………………………………….…..76 3.3-3. Recogida de muestra tumoral…………………….…….77 3.3-4. Recogida de muestra para la determinación de BRCA1…………………………………………………77 3.3-5. Estudio anatomopatológico y de expresión de inmunohistoquimica……………………………………78 3.3-6. Procedimiento e el análisis genético de BRCA1…………………………………………………79 3.3-6.1. Extracción de muestra de sangre periférica……………………………….79 3.3-6.2. Extracción de ADN linfocitario a partir de una muestra de sangre periférica………………….……80 3.3-6.3. Reacción de cadena de polimerasa (PCR)…………………………………..81 3.3-6.4. Cromografía líquida desnaturalizante de alta resolución…....82 3.3-6.5. Secuenciación………………………….84 3.3-6.6. Multiplex ligation dependent probe analysis………………………………...85 3.3-7. Análisis estadístico…………………………………….87 4. RESULTADOS 89 4.1Prevalencia de mutaciones germinales BRCA1 91 4.1-1. Mutaciones Patógenas………………………………….91 4.1-2. Variantes sin clasificar o de significado incierto………92 4.2Análisis descriptivo 93 4.2-1. Edad al diagnóstico……………………………………..93 4.2-2. Tipo de historia familiar…………………….……...…..95 4.2-3. Estadio tumoral…………………………………….......97 4.2-4. Grado histológico…………………………….…….......98 4.2-5. EGFR……………………………………………........100 4.2-6. Citoqueratina 5/6……………………………….….….101 4.2-7. Fenotipo basal……………………………….……......103 4.2-8. Características de las pacientes incluidas en el estudio………………………….……..105 4.2-9. Características de las pacientes con mutación patógena BRCA1 y variantes de significado incierto……………………..111 4.3Análisis Inferencial 112 4.3-1. Edad al diagnóstico…………………………….……..112 4.3-2. Historia familiar………………………………………113 4.3-3. Estadio tumoral……………………………..………...114 4.3-4. Grado histológico………………………………….....115 4.3-5. EGFR…………………………………………………115 4.3-6. Citoqueratina 5/6……………………………….…….116 4.3-7. Fenotipo basal…………………………………….….117 5. DISCUSIÓN 119 6. CONCLUSIONES 131 7. BIBLIOGRAFÍA 137 8. ANEXO 157 9. ARTÍCULO CIENTÍFICO 161 ABREVIATURAS ABREVIATURASABREVIATURAS ABREVIATURAS Asociación de mutaciones germinales en BRCA1 y cáncer de mama triple negativo diagnosticado antes de los 50 años y sin historia familiar El texto de este trabajo contiene una serie de abreviaturas y anglicismos que se han utilizado, dada su frecuencia en la terminología científica. A continuación se exponen las utilizadas en esta tesis. ADN Acido desoxirribonucleico ADNc Acido desoxirribonucleico complementario ARN Acido ribonucleico ARNa Acido ribonucleico ampliado ARNm Acido ribonucleico mensajero Array Término que se utiliza para definir la matriz sobre la que se encuentra impresos los clones de ADN donde se realizan las hibridaciones genómicas o los cilindros tumorales donde se realizan las hibridaciones inmunohistoquímicas o valoraciones histológicas. ATM Ataxia telangiectasia mutated. Proteína capaz de regular el ciclo celular. Su mutación desarrolla la enfermedad denominada Ataxia Telangiectasia, enfermedad neurológica progresiva autosómica recesiva. Autosómico Dominante Un gen en un cromosoma, su presencia provocará casi siempre una enfermedad o rasgo. La probabilidad de trasmisión a la descendencia es de 50:50. BIC Centro de información del Cancer de mama. Breast Cancer information core. BOADICEA Modelo estadístico de cálculo de la probabilidad de ser portador de la mutación BRCA. Brazo p Brazo corto de un cromosoma. Brazo q Brazo largo de un cromosoma. BRCA1 Gen 1 del cáncer familiar de mama y ovario. BRCA2 Gen 2 del cáncer familiar de mama y ovario. BRCAPRO Modelo estadístico de cálculo de la probabilidad de ser portador de la mutación BRCA. Ca 125 Cancer antigen 125. Caretakers Genes encargados del mantenimiento de la integridad del genoma. 19 CDI Carcinoma ductal infiltrante. CAV 1 Caveolin 1. Proteína integral de membrana plasmática que interviene en la regulación celular CAV 2 Caveolin 2. CDIS Carcinoma ductal in situ. Cebadores (primers) Una secuencia corta de oligonucleótidos, se une de forma complementaria a una cadena única de ácido nucleico e inicia la síntesis de esa cadena en presencia de ADN polimerasa y nucleótidos en una reacción de PCR. CEICA Comité ético de investigación clínica de Aragón. CK 5/6 Citoqueratina 5/6. CK 8 Citoqueratina 8. CK 17 Citoqueratina 17. CK 18 Citoqueratina 18. c-Kit Gen relacionado con la proliferación CLI Carcinoma lobulillar infiltrante CLIS Carcinoma lobulillar in situ. c-myc Oncogen que codifica un factor de la trascripción. Interviene en la proliferación tumoral. CM Cáncer de mama. CMTN Cáncer de mama triple negativo. CO Cáncer de Ovario. CHECK 2 Gen encargado de intervenir en el control del ciclo celular, relacionado con el mantenimiento, control de mitosis y apoptosis. del Delección. Mutación que consiste en la pérdida de un fragmento de ADN de un cromosoma. DHPLC Denaturing High-Performance Liquid Chromatography. Cromografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento. DQ Dosis génica EDTA Anticoagulante compuesto por ácido etilen diamino tetracético. Erb B2 Oncogen que codifica para receptores de tirosin kinasa de la familia del factor de crecimiento epidérmico relacionado con la génesis tumoral. 20 EGFR Epidermal growth factor receptor. Factor de crecimiento epidérmico. Exón Región de ADN de un gen que codifica para una parte de la proteína. FISH Fluorescent in situ hybridization. Hibridación in situ por fluoresceína. GATA 4 Proteína asociada a la regulación de genes que intervienen en la embriogénesis. Her2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2. Ver Erb B2 Herceptest Estudio inmohistoquímico para la determinación de la proteína Her2 (c-erb-B2 oncoprotein) sobreexpresada en el cáncer de mama. HPLC High performance liquid cromatography. Cromatografía liquida de alta resolución. HR Hazard ratio. HyE Tinción de Hematoxilina y eosina. IC Intervalo de confianza. IHQ Inmunohistoquimica. ins Insercción. Tipo de mutación consistente en la introducción de un fragmento de ADN al cromosoma. Intrón Secuencia no codificadora de ADN que separa a dos exones. ITC Células tumorales aisladas. Kb Kilobase. KD KiloDalton. Ki 67 Antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal ki 67. Kit Conjunto de reactivos y material para realizar técnicas experimentales de uso común en el laboratorio. Locus (Loci) Posición de un gen dentro del cromosoma. LOH Loss of heterozigosity. Pérdida de heterocigosidad. Mamaprint Técnica basada en microarrays. Se basa en la expresión de 70 genes relacionados con la proliferación tumoral, clasificando a las pacientes en bajo/alto riesgo. Missense Tipo de mutación en la que un cambio de un nucleótido produce un cambio de aminoácido que hace que la proteína pueda no ser funcional. MLH1 Gen implicado en el cáncer colorectal, endometrial y ovárico. MLPA Multiplex Ligation dependent probe amplification. Técnica para el 21 cribado de regiones de DNA utilizando sondas de hibridación. MSH2 Mut S homolog 2, colon cancer, nonpoliposis type 1 gene. Gen homologo 2 de mutS, causante del cáncer de colon no poliposico tipo 1. n Tamaño muestral. Nonsense Mutación puntual en la secuencia de ADN que resulta en un codón de pasada, ue produce una proteína trucada que con frecuencia es no funcional. Oncotype Técnica basada en microarrays. Se basa en la expresión de 21 genes relacionados con la proliferación tumoral, clasificando a las pacientes en bajo/alto riesgo. p pvalue. Nivel de significación empírico. p53 Gen supresor de tumores, desempeñan un papel importante en la inducción de las vías de apoptosis en respuesta a un daño en el DNA. PAAF Punción con aguja fina. PARP PoliADP-ribosa polimerasa. Encima implicada en la reparación de excisión de bases, siendo este el principal mecanismo de reparación de roturas de cadenas de ADN. PCR Reacción en cadena de polimerasa (Polymerase Chain Reaction). Mecanismo utilizado para la amplificación de secuencias concretas de ADN. Pedigree Árbol familiar. PTEN Gen implicado en el Síndrome de Cowen, asociado a hamartomas, gliomas, cáncer de próstata y endometrio. Ratio Relación entre dos datos. RE Receptores de estrógenos. RP Receptores de progesterona. RMN Resonancia Nuclear Magnética. rpm Revoluciones por minuto. RR Riesgo Relativo. RT-PCR Reacción en cadena de la trascriptasa/polimerasa inversa. Salting out Técnica empleada para la extracción del ADN mediante la concentración salínica. 22 En las mujeres españolas se diagnostican cada año unos 16.000 casos nuevos de cáncer de mama y mueren por esta causa 6.000 mujeres 3 . Mientras que la incidencia está aumentando en nuestro país un 2-3% anual, la mortalidad también muestra el cambio de tendencia al inicio de los 90, momento a partir del cual las tasas disminuyen un 2% al año. La tasa ajustada de mortalidad (población estándar europea) en el 2005, fue de 18,6 casos por 100.000 mujeres al año inferior a la estimada para el conjunto de Europa 4 . El estudio El Álamo, desarrollado por el grupo GEICAM, aporta información sobre la supervivencia de las pacientes atendidas en los hospitales españoles participantes con amplia representación geográfica. El Álamo II incluyó más de 10.000 mujeres españolas con cáncer de mama entre 1994 y 1997. La supervivencia a los 5 años fue superior al 80% 5 . La supervivencia a 5 años se sitúa en un 83% significativamente más alta que la media europea. 1.1 1.11.1 1.1- -- -2. 2.2. 2. FACTORES DE RIESGO FACTORES DE RIESGOFACTORES DE RIESGO FACTORES DE RIESGO En el desarrollo del cáncer de mama influyen distintos factores de riesgo genético y ambiental. La menarquía temprana, la menopausia tardía y la nuliparidad o la edad tardía al primer embarazo son los principales factores reproductivos, los cuales están relacionados a una mayor exposición de la glándula mamaria a los estrógenos circulantes 6 . Otros factores de riesgo son el consumo de alcohol y grasas, la obesidad y la vida sedentaria, que han sido investigados pero su implicación no está definida de forma clara. 29 Introducción La enfermedad mamaria benigna también aumenta la probabilidad de desarrollar cáncer de mama, existiendo un riesgo mayor en las patologías proliferativas y en aquellas lesiones que presentan atipias celulares 7 . A parte de la edad y el sexo, el factor de riesgo más importante es la historia familiar de cáncer de mama que es indicativa de la herencia de variantes genéticas que incrementan de manera sustancial la probabilidad de padecer esta enfermedad 8 . Se ha estimado que un 5-10% de los casos de cáncer de mama son debido a mutaciones de genes de alta penetrancia, de los cuales el 20-25% ocurren en BRCA1 y BRCA2. Estas pacientes portadoras tienen un riesgo acumulado de desarrollar cáncer de mama a los 70 años que varía entre el 40% y el 85% 8 . En la población española este riesgo se ha estimado en un 52% (95% IC, 26-69%) para portadoras de mutación en BRCA1 y 47% (95% IC 29-60%) para BRCA2 9 . Existen identificados otros genes como TP53, ATM o PTEN, considerados de alta penetrancia que determinan un alto riesgo de cáncer de mama en el contexto de diferentes síndromes genéticos como LiFraumeni, Ataxia-telangiectasia o Codwen respectivamente 10 11 12 . Existe el modelo poligénico en el que la susceptibilidad vendría modulada por la contribución de variables de baja penetrancia. Los polimorfismos más estudiados incluyen los genes implicados en las rutas de síntesis y metabolismo de los estrógenos, la reparación del ADN y las principales rutas metabólicas 13 . 30 Introducción 1.1 1.11.1 1.1- -- -3. 3.3. 3. CARCINOGENESIS CARCINOGENESISCARCINOGENESIS CARCINOGENESIS Las características de la carcinogénesis comprenden seis funciones biológicas adquiridas durante el desarrollo de las células tumorales. Estas características constituyen una organización para intentar entender la complejidad de la enfermedad neoplásica. El mantenimiento de la señal de la proliferación, evitando el estimulo de la supresión del crecimiento, que confiere la capacidad de hacerse resistente a la muerte celular, la inmortalidad replicativa, la inducción de la angiogénesis y la activación de la capacidad de invasión y metastatizar a otros niveles configuran las seis características. (Figura 2) 14 . Figura 2: Características implicadas en la carcinogénesis 14 . 31 Introducción El escenario que es capaz de aportar una diversidad de actuación de las características biológicas que permiten la formación tumoral es el genoma que puede facilitar la adquisición de estas. En la última década se ha añadido otras características como son el metabolismo energético, la inflamación y la capacidad de estas células de evitar la reacción inmune del organismo huésped. Además existen células no tumorales que contribuyen a la formación de un ambiente favorable para la proliferación de las células neoplasias. (Figura 3) 14 . Figura 3: Nuevos mecanismos implicados en la carcinogénesis 14 . El conocer esta serie de mecanismos implicados en la formación tumoral permite investigar en nuevas formas terapéuticas. 32 Introducción 1.1 1.11.1 1.1- -- -4. 4.4. 4. TIPOS HISTOLÓGICOS TIPOS HISTOLÓGICOSTIPOS HISTOLÓGICOS TIPOS HISTOLÓGICOS El carcinoma ductal se origina en los ductos mamarios y representa el tipo histológico más frecuente de cáncer de mama. El Carcinoma ductal in situ (CDIS) presenta una proliferación de las células del ducto pero no atraviesa la lámina basal y por lo tanto no invade el estroma circulante. Su clasificación puede atender a un patrón arquitectural (cribiforme, comedo, papilar y sólido) o a el grado de diferenciación nuclear (alto, intermedio o bajo grado). El carcinoma ductal infiltrante (CDI) es la forma invasiva del carcinoma ductal, es la forma más frecuente de cáncer de mama, tiene su origen en las células del epitelio ductal, las cuales, atraviesan la capa basal e invaden los tejidos que rodean al ducto. Histológicamente, las células son irregulares, con núcleos grandes, hipercromáticos y de límites poco netos, nucléolos muy evidentes y numerosas mitosis. Se supone que todo CDI proviene de un CDIS pero se desconoce la proporción de CDIS que se trasforman en CDI. El carcinoma lobulillar deriva de las células del lóbulo o lobulillo de la mama. El carcinoma lobulillar in situ (CLIS) es una lesión no palpable y en la mayoría de los casos se detecta de forma incidental junto a otras lesiones como calcificaciones e hiperplasia. El carcinoma lobulillar infiltrante es un carcinoma con origen en los acinos glandulares, el crecimiento celular rompe la membrana basal e infiltra los tejidos adyacentes. Constituida por células redondeadas u ovales, con citoplasma claro y núcleos hipercromáticos y moderada actividad mitótica. Este tipo de cáncer representa 33 Introducción aproximadamente el 5%. Con frecuencia su comportamiento es multicéntrico y bilateral 15 . La E-cadherina es un marcador relevante para la diferenciación entre CDIS y CLIS, presentando una reactividad positiva inmunohistoquímica en el segundo 16 . Existen otros tipos histológicos menos frecuentes como el carcinoma medular el cual presenta una morfología anaplásica y es poco agresivo, carcinoma tubular caracterizado por ser bien diferenciado y con un buen pronostico, carcinoma mucinoso, neuroendocrino, carcinoma papilar invasivo con clara configuración papilar, apocrino, secretor juvenil con secreciones tanto intra como extracelular, cístico adenoide de baja malignidad y frecuentemente nodular y el carcinoma metaplásico el más heterogéneo (de tipo escamoso, espinocelular, óseo y cartilaginoso y de tipo mixto). 1.1 1.11.1 1.1- -- -5. 5.5. 5. DIAGNÓ DIAGNÓDIAGNÓ DIAGNÓSTICO STICOSTICO STICO La mortalidad por cáncer de mama depende en gran medida del diagnóstico en fases iníciales de la enfermedad. El diagnostico obligado conlleva a una adecuada anamnesis y exploración física dado que en muchas ocasiones el diagnóstico se realiza por la presencia de una masa mamaria palpable. Las pruebas radiológicas mediante mamografía bilateral y ecografía mamaria nos permiten detectar imágenes sospechosas de malignidad las cuales también constituyen una forma común de diagnóstico. De esto se deriva la importancia del cribado poblacional de cáncer de mama mediante la mamografía. La agencia Internacional de Investigación del Cáncer considera que existe 34 Introducción una evidencia en mujeres de entre 50 y 69 años, estimando una reducción de la mortalidad por este tumor de un 20 a un 35% 17 . La realización de la resonancia nuclear magnética (RMN) permite detectar áreas muy específicas de la mama y realizar un diagnóstico histológico dirigido por pruebas de imagen. No está indicada para la realización de cribado salvo algunos casos concretos como en las portadoras de mutación BRCA 18 . El estudio histológico y las pruebas anatomopatológicas son imprescindibles en el diagnóstico, permitiéndonos evaluar la lesión, ya sea mediante una punción con aguja fina (PAAF) menos invasiva, pero sin capacidad de determinar marcadores hormonales, la biopsia con aguja gruesa o trucut la cual si permite la valoración de éstos o la biopsia excisional, la cual nos aporta una histología completa pero con un mayor riesgo dado que se trata de un método invasivo 19 20 . 1.1 1.11.1 1.1- -- -6. 6.6. 6. ESTADIFICACIÓ ESTADIFICACIÓESTADIFICACIÓ ESTADIFICACIÓN NN N La American Joint Commitee on Cancer (AJCC) clasifica los tumores de mama atendiendo a la clasificación TNM. La clasificación refleja tres características tumorales que aportan un valor pronóstico, Tamaño tumoral (T), afectación ganglionar locoregional (N) y metástasis a distancia (M) 21 . (Figura 4). T (Tamaño tumoral): • Tx: El tumor primario no se detecta. 35 Introducción • T0: No existe evidencia de tumor primario. • Tis: Carcinoma in situ. • T1: Tumor de un tamaño inferior a los 2 cm en su diámetro mayor. • T1mic: Microinvasión. Tamaño inferior a 0,1 cm. • T1a: 0,1 a menos de 0,5 cm. • T1b: Tamaño mayor de 0,5 y menor de 1 cm. • T1c: Tamaño mayor de 1 cm y menor de 2 cm. • T2: Tumor mayor a 2 cm y menor a 5 cm en su diámetro mayor. • T3: Tumor mayor de 5 cm en su diámetro mayor. • T4: Tumor con cualquier tamaño pero que presente afectación de pared torácica o/y piel. • T4a: extensión sobre pared torácica sin afectación en musculo pectoral. • T4b: Edema o ulceración en la piel de la mama o presencia de satélites nodulares confinados a la misma. • T4c: T4a + T4b. • T4d: Carcinoma inflamatorio. N (afectación ganglionar clínica): • Nx: Adenopatías regionales no son detectadas. • N0: No afectación ganglionar metastásica. • N1: Metástasis en adenopatías axilares ipsilaterales de los Niveles I y II. • N2: Metástasis ganglionares ipsilaterales en niveles I y II • N2a: Metástasis ganglionares en niveles I y II axilares fijados a estructuras adyacentes. 36 Introducción • N2b: Metástasis clínicamente detectados en ganglios de mamaria interna ipsilaterales en ausencia de axilares en niveles I y II. • N3: Metástasis en adenopatías ipsilaterales infraclavicular (Nivel III axilar) • N3a: Metástasis ganglionares infraclaviculares ipsilaterales. • N3b: Metástasis ganglionares ipsilaterales en mamaria interna y axilares. • N3c: Metástasis ganglionares en adenopatías ipsilaterales supraclaviculares. pN ( afectación ganglionar patológica): • pNx: Sin adenopatías encontradas. • pN0: No adenopatías metastásicas histológicas. • pN0 (i-): No afectación ganglionar metastásica histológica. IHQ negativa. • pN0 (I+): Células malignas detectadas en ganglios regionales no superior a 0,2 mm detectados por HyE o IHQ, incluido ITC). • pN0 (mol-): No afectación ganglionar metastásica histológica. RT-PCR negativo. • pN0 (mol +): Positividad para malignidad por RT-PCR pero no detectada con técnica de IHQ. • pN1: Micrometastasis o metástasis en 1-3 ganglios linfáticos; y/o en mamaria interna detectados por ganglio centinela pero no clínicamente. • pN1 mic: Micrometástasis, mayor de 0,2 mm y menor de 2 mm. • pN1a: Metástasis ganglionares en 1-3 ganglios. • pN1b: Metástasis en ganglios mamarios internos, detectados mediante biopsia del ganglio centinela. • pN1c: pN1a + pN1b. 37 Introducción • pN2: Metástasis en 4-9 ganglios axilares o afectación de mamaria interna clínicamente aparente sin afectación de ganglios axilares. • pN2a: Metástasis en 4-9 ganglios axilares. • pN2b: Metástasis en ganglios de mamaria interna clínicamente aparente y sin afectación axilar. • pN3: Metástasis en 10 o más ganglios axilares o infiltración de los ganglios infraclaviculares o afectación clínicamente aparente de la mamaria interna homolateral en presencia de uno o más ganglios axilares positivos o infiltración de más de tres ganglios axilares y de la mamaria interna con enfermedad microscópica detectada mediante disección del ganglio centinela pero no clínicamente aparente o metástasis en los ganglios supraclaviculares homolaterales. • pN3a: Metástasis en 10 o más ganglios axilares o infiltración de los ganglios infraclaviculares.. • pN3b: Afectación clínicamente aparente de la mamaria interna homolateral en presencia de uno o más ganglios axilares positivos o infiltración de más de tres ganglios axilares y de la mamaria interna con enfermedad microscópica detectada mediante disección del ganglio centinela pero no clínicamente aparente. • pN3c: metástasis en los ganglios supraclaviculares homolaterales. M (Metástasis a distancia): • M0: No afectación clínica ni radiológica de metástasis a distancia. 38 Introducción hormonoterapia adyuvante en tumores con RE +, el metaanálisis de Oxford confirma que el estado del RE es factor predictor de beneficio del tratamiento con Tamoxifeno durante 5 años 35 . El gen Her2 esta sobreexpresado en aproximadamente el 15-25% de todos los canceres de mama 36 . La amplificación de Her2 es un factor pronóstico en ausencia de tratamiento complementario, asociándose a una peor supervivencia libre de enfermedad y peor supervivencia global. Se trata de un factor pronóstico independiente del estado ganglionar, el tamaño tumoral, el grado histológico y el estado del receptor hormonal 37 .Presenta un importante valor predictivo de la respuesta a tratamientos quimioterápicos y de hormonoterapia, y en especial de la respuesta a los agentes antiher-2 con la resistencia a agentes alquilantes 38 . Ki-67 es un antígeno nuclear expresado en células en fase de proliferación, pero no durante la fase de G0. Los niveles de Ki-67 son bajos en las fases G1 y S, adquiriendo un pico en la fase de mitosis. Existe una evidencia acerca del valor pronóstico de Ki-67, existiendo una peor supervivencia en aquellos que presentan un elevado índice proliferativo. En cambio no existe una evidencia científica sobre el valor que predictivo que representa Ki-67 39 . La precisión de los factores individuales es limitada y quizá se precisan modelos más complejos que incluyan nuevos factores moleculares o plataformas de expresión génica, para mejorar el poder pronóstico de los factores clásicos y ayudar en la predicción de la recaída de la enfermedad. En los últimos años ha surgido la tecnología de los microarrays, de estos el MammaPrint y el Oncotype son los más conocidos 40 . 45 Introducción 1. 1.1. 1. 2 22 2- -- - CÁ CÁCÁ CÁNCER DE MAMA HEREDITARIO NCER DE MAMA HEREDITARIONCER DE MAMA HEREDITARIO NCER DE MAMA HEREDITARIO 1.2 1.21.2 1.2- -- -1 11 1. . . . SUSCEPTIBILIDAD GENÉ SUSCEPTIBILIDAD GENÉSUSCEPTIBILIDAD GENÉ SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA TICATICA TICA La presencia de una historia familiar de cáncer de mama constituye un factor de riesgo. En estudios epidemiológicos se ha demostrado que el riesgo de padecer cáncer de mama se duplica en pacientes con un antecedente de primer grado de cáncer de mama 41 . Diversos estudios han estimado que entre un 5 y un 10 % de todos los tumores de mama diagnosticados presentan un componente hereditario relacionado con mutaciones germinales en genes de susceptibilidad 42 . Aproximadamente la mitad de estos casos son debidos a mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2. La frecuencia poblacional de estas mutaciones es 1/4001/800 y el riesgo de cáncer de mama es superior a 10 veces con respecto a las no portadoras. Por ahora, BRCA1 y BRCA2 son los genes de alta penetrancia mas frecuentes asociados al cáncer de mama hereditario 43 . Existen otros genes de alta penetrancia que se asocian al cáncer de mama hereditario, se incluyen dentro de síndromes hereditarios, como el TP53 en el Síndrome de LiFraumeni o PTEN en el síndrome de Codwen o MSH2/MLH1 en el síndrome de Muir Torre o STK en el Síndrome de Peutz-Jehger, se trata de casos muy infrecuentes que suponen menos de un 1% de los casos de cáncer de mama hereditario 11 12 44 . 46 Introducción Otros genes que intervienen en la aparición del cáncer de mama hereditario serían CHECK 2, ATM, PALB2, los cuales no alcanzan un porcentaje mayor a un 5%, interviniendo en la reparación d Aumentan el riesgo en portadoras de forma moderada, siendo de 2 a 4 veces más que el resto de la población 45 46 . Existen genes candidatos desconocidos con susceptibil entre un 50-60 % de los genes responsables del cáncer de mama Figura 6 : Genes de su 1.2 1.21.2 1.2- -- -2 22 2. . . . GENES DE ALTA GENES DE ALTAGENES DE ALTA GENES DE ALTA El gen BRCA1 es un gen de gran tamaño. Se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21). Su secuencia contiene 5592 nucleótidos, repartidos en 24 exones y se extiende a lo largo de 100Kb de ADN genómico. Se trascribe en numerosos tejidos, en 90% Esporádico Hereditario Otros genes que intervienen en la aparición del cáncer de mama hereditario serían CHECK 2, ATM, PALB2, los cuales no alcanzan un porcentaje mayor a un 5%, interviniendo en la reparación d el ADN o en la interacción con BRCA1 y BRCA2. Aumentan el riesgo en portadoras de forma moderada, siendo de 2 a 4 veces más que el Existen genes candidatos desconocidos con susceptibil idad poligénica que corresponde % de los genes responsables del cáncer de mama hereditario : Genes de su sceptibilidad al cáncer de mama. GENES DE ALTA GENES DE ALTAGENES DE ALTA GENES DE ALTA SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2 SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2 SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2 El gen BRCA1 es un gen de gran tamaño. Se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21). Su secuencia contiene 5592 nucleótidos, repartidos en 24 exones y se extiende a lo largo de 100Kb de ADN genómico. Se trascribe en numerosos tejidos, en 10% 20% 20% 5% 1% 1% 53% Otros genes que intervienen en la aparición del cáncer de mama hereditario serían CHECK 2, ATM, PALB2, los cuales no alcanzan un porcentaje mayor a un 5%, el ADN o en la interacción con BRCA1 y BRCA2. Aumentan el riesgo en portadoras de forma moderada, siendo de 2 a 4 veces más que el idad poligénica que corresponde hereditario 47 . (Figura 6). SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2 SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2 SUSCEPTIBILIDAD: BRCA1 Y BRCA2 El gen BRCA1 es un gen de gran tamaño. Se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21). Su secuencia contiene 5592 nucleótidos, repartidos en 24 exones y se extiende a lo largo de 100Kb de ADN genómico. Se trascribe en numerosos tejidos, en BRCA1 BRCA2 CHEK2 TP53 pTEN, ATM, STK1 1(LKBI Poligenico 47 Introducción los que destacan mama y ovario. Se conocen diversos trascritos del gen, aunque el más completo es de unas 7,2 Kb, y se traduce en una proteína de 220 kD compuesta por 1863 aminoácidos 48 49 . (Figura 7). El gen BRCA2 es aun más grande que el gen BRCA1. Se localiza en el brazo largo del cromosoma 13 (13q12). Se compone de 11.385 nucleótidos, repartidos en 27 exones, a lo largo de 70 Kb de DNA genómico. Aparece en tejidos como mama, placenta, testículo, ovario y timo. La trascripción de 12 Kb, se compone de 3418 aminoácidos 50 51 . (Figura 7). BRCA1 BRCA2 Figura 7: Estructura génica de los genes BRCA1 y BRCA2. La proteína BRCA1 interactúa con muchas otras proteínas correspondientes a genes supresores de tumores, oncogenes, activadores y represores de la trascripción del DNA, ubiquitinación de proteínas, remodelación de la cromatina, reparación y transcripción del DNA y control del ciclo celular. La finalidad es mantener la estabilidad genómica y por tanto el control de la aparición de tumores de mama y de ovario 52 . 48 Introducción Las funciones de BRCA2 parecen ser más limitadas que las de BRCA1. BRCA2 participa en la regulación del ciclo celular y especialmente en la reparación del DNA mediante recombinación homologa Esto sugiere que ambas proteínas actúan en las vías d inactivación mediante mutaciones origina inestabilidad genética, provocando indirectamente la aparición del tumor por acumulo de mutaciones en otros genes, reguladores directos del ciclo celular. Debido a este tipo de funciones en mantenimiento de la integridad del genoma BRCA1 y BRCA2 se consideran genes supresores de tumores del tipo Las funciones de BRCA2 parecen ser más limitadas que las de BRCA1. BRCA2 participa en la regulación del ciclo celular y especialmente en la reparación del DNA mediante recombinación homologa 53 . Esto sugiere que ambas proteínas actúan en las vías d e reparación del DNA y su inactivación mediante mutaciones origina inestabilidad genética, provocando indirectamente la aparición del tumor por acumulo de mutaciones en otros genes, reguladores directos del ciclo celular. Debido a este tipo de funciones en mantenimiento de la integridad del genoma BRCA1 y BRCA2 se consideran genes supresores de tumores del tipo caretakers. 54 . (Figura 8). Figura 8: Biología de BRCA1. Las funciones de BRCA2 parecen ser más limitadas que las de BRCA1. BRCA2 participa en la regulación del ciclo celular y especialmente en la reparación del DNA e reparación del DNA y su inactivación mediante mutaciones origina inestabilidad genética, provocando indirectamente la aparición del tumor por acumulo de mutaciones en otros genes, reguladores directos del ciclo celular. Debido a este tipo de funciones en el mantenimiento de la integridad del genoma BRCA1 y BRCA2 se consideran genes 49 Introducción 1. 1.1. 1. 2 22 2- -- -3. 3. 3. 3. MUTACIONES GERMINALES BRCA1 Y BRCA2 MUTACIONES GERMINALES BRCA1 Y BRCA2MUTACIONES GERMINALES BRCA1 Y BRCA2 MUTACIONES GERMINALES BRCA1 Y BRCA2 Se han registrado más de mil mutaciones distintas tanto de BRCA1 y BRCA2, recogidas en la base de datos BIC 55 . La mayoría de las mutaciones consiste en insercciones o delecciones que provocan un cambio en la trascripción del ADN, dando lugar a la aparición de un codón de stop o parada en la lectura del genoma. También se han descrito sustituciones que originan la aparición de un codón de parada, denominado estas mutaciones como nonsense. Ambas alteraciones provocan la formación de proteínas no funcionantes o la degradación de los mRNA formados. En ocasiones variantes generalmente localizadas en los lugares de corte y empalme de exones, alteran el proceso de eliminación de intrones (splicing), causando la perdida de exones o la inserción de intrones en el fragmento trascrito. También grandes delecciones o duplicaciones se pueden dar, suponiendo una frecuencia inferior a 10% de todas las mutaciones detectadas. Algunas mutaciones se observan de forma repetida en familias no emparentadas y en ciertas poblaciones unas pocas mutaciones se presentan con una frecuencia alta. Se ha demostrado que estas mutaciones recurrentes provienen de un mismo antecesor portador. Estas mutaciones se denominan “fundadoras” y aparecen en individuos de poblaciones pequeñas y tras generaciones sucesivas de endogamia. Así pues una mutación pasa a ser altamente recurrente o incluso característica de un área geográfica o grupo étnico. Por ejemplo las mutaciones 185delAG y 5382insC en BRCA1 y 6174delT 50 Introducción en BRCA2 son características de la población judía azquenazi, apareciendo en un 2,5% de la población general 56 57 . (Figura 9). Población BRCA1 BRCA2 Origen africano 1832del5 Judíos ashkenazi 185delAG; 5832insC 6174delT Británicos 4184del4 6503delTT Finlandia L2776X Hungría 5282insC Islandia 999del5 Italia 1499insA Países Bajos 2804delAA Noruega 1136insA Suecia 3166insTGAGA 4486delG Rusia 5382insC Figura 9: Principales mutaciones fundadoras. Según la base de datos BIC aproximadamente un 30% de los cambios de secuencia corresponden a sustituciones de nucleótidos que producen cambios de aminoácidos en la proteína (missense). Según la localización y las características, estos cambios pueden provocar alteraciones en la funcionalidad de la proteína, conllevando un riesgo de apariciones de tumores o ser un cambio sin relevancia. El termino variables de significado incierto, describe a la perfección este problema. El conocer este dato resulta 51 Introducción difícil a nivel de la práctica médica habitual, debido a que las técnicas de detección para conocer la patogenicidad resultan complejas. La cosegregación de la mutación con la enfermedad dentro de una familia, la localización de la lesión, la funcionalidad de la proteína obtenida, serían los datos evaluables para determinar el grado de daño provocado 58 . 1.2 1.21.2 1.2- -- -4 44 4. . . . PENETRA PENETRAPENETRA PENETRANCIA DE LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 NCIA DE LOS GENES BRCA1 Y BRCA2NCIA DE LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 NCIA DE LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 Las personas portadoras de mutaciones germinales en BRCA1 y BRCA2 tienen un riesgo aumentado de desarrollar cáncer de mama y ovario. Aproximadamente las personas portadoras de esta mutación tienen un riesgo de desarrollar cáncer a lo largo de su vida de un 87% 59 60 . Se ha estimado que el riesgo acumulado de aparición a los 70 años de cáncer de mama es del 65% (IC 95%=44-78%) en BRCA1 y del 45% (IC 95%=18-54%) para BRCA2, y en el caso del cáncer de ovario del 39% (IC 95%=18-54%) para BRCA1 y del 11% (IC 95%=2-19%) para BRCA2 8 61 . En familias españolas portadoras de la mutación BRCA1 y BRCA2, se estima que el riesgo acumulado de aparición a los 70 años de cáncer de mama es del 52% (IC 95%=26-69%) en BRCA1 y del 47% (IC 95%=29-60%) para BRCA2. Y para cáncer de ovario del 22% (IC 95%=0-40%) para BRCA1 y del 18% (IC 95%=0-35%) para BRCA2. En este estudio el riesgo relativo para cáncer de mama presentaba un pico máximo de 35-40 años (HR=32 y 51 para edades de 20-29 y 30-39 respectivamente) y 52 Introducción posteriormente desciende a medida que aumentaba la edad. En el caso del cáncer de ovario el riesgo relativo se encontraba antes de los 50 años (HR= 32 y 51 para edades 20-29 y 30-39 respectivamente). El riesgo relativo empieza a incrementarse a partir de los 40 años para BRCA1 y de los 50 para BRCA2 y se mantiene hasta los 70 años 9 . Otros tumores que pueden aparecer en pacientes portadoras de BRCA serían, para BRCA1 el carcinoma de trompas de Falopio (RR 50-100), peritoneo (RR 45-100), carcinoma uterino (RR 2), cáncer de cérvix (RR 3,8), páncreas (RR 2.0) y próstata (RR 1,8) 62 . Mientras que para BRCA2 se ve una aparición de cáncer de mama en varón de un 6%. El cáncer de próstata también se ve aumentado con un RR de 4,7-7. Y otros como el carcinoma gástrico, cavidad oral, faringe, vesícula biliar y trompas de Falopio 63 . 1.2 1.21.2 1.2- -- -5. 5. 5. 5. MÉ MÉMÉ MÉTO TOTO TODOS DE DETERMINACIÓ DOS DE DETERMINACIÓDOS DE DETERMINACIÓ DOS DE DETERMINACIÓN MUTACIONAL N MUTACIONALN MUTACIONAL N MUTACIONAL El estudio de mutaciones germinales de BRCA1 y BRCA2 puede realizarse a partir de DNA obtenido de linfocitos de sangre periférica, células epiteliales bucales, la médula ósea, los ganglios, tejidos tumorales, el líquido amniótico, las vellosidades corionicas y las blastomera. Existen diversos métodos para la detección de alteraciones en el ADN. La cromografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC, Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) puede detectar diferencias de secuencia tanto de un solo par de bases, como también las inserciones y deleciones. La DHPLC está basada en la emulsión diferencial del ADN homoduplex y heteroduplex cuando migran a través de 53 Introducción una columna cromatográfica. La ventaja, respecto a otros métodos de análisis de mutaciones, es su mayor sensibilidad aunque se trata de una técnica costosa y de cuidada interpretación 64 . El estudio de grandes deleciones, duplicaciones o reordenamientos complejos del gen debe realizarse por otras técnicas más sensibles para la detección de estas alteraciones como MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). La cual se basa en la hibridación del DNA con dos oligonucleotidos o sondas, seguida por la unión de ambas sondas y amplificación por PCR de los productos obtenidos 65 66 . 1.2 1.21.2 1.2- -- -6. 6. 6. 6. CRI CRICRI CRIT TT TERIOS DE SELECCIÓN ERIOS DE SELECCIÓNERIOS DE SELECCIÓN ERIOS DE SELECCIÓN A nivel del Síndrome de Cáncer de Mama y Ovario hereditario (SMOH) no existen unos criterios aprobados por consenso de forma internacional. Existen guías publicadas para recomendar la realización del test genético en BRCA y los criterios de selección de las familias candidatas para la detección de mutaciones BRCA1 y BRCA2 suelen ser similares en los distintos grupos de trabajo, hallando unas tasas superiores al 10%. Se basan en datos clínicos que incluye el número de casos de cáncer mama y/o ovario familiares, edad de diagnostico y la presencia de cáncer de mama bilateral 67 68 . Los criterios para determinar un estudio genético en cáncer de mama y/u ovario familiar hereditario, se exponen a continuación (Guía clínica SEOM de cáncer hereditario) 69 : 54 Introducción Gonzalez Angulo et al. 2011. (University of Texas) 96 . Cm triple negativo Retrospectivo (1997-2006). 77 15/77 (19,5%). Evans et al. 2011. 97 . Cm triple negativo < 41 años 63 8/63 (12,7%). Comen et al. 2011. (Sloan Kettering) 98 . Cm Ashhkenazi. Unidades de Consejo Genético. Retrospectivo (2000-2004). 451(64 CMTN) 25/64(39,1%). Mutaciones fundadores. 48% CM < 50 años. Robertson et al. 2012. UK 99 . Cm triple negativo Retrospectivo 308 (149 seleccionadas por Hª familiar o edad). 45/308 (15%). Seleccionadas 30/149 (20%). Hartman et al. 2012. 100 Cm triple negativo Retrospectivo 199 (153 sin historia familiar positiva) (66<50 años) 21/199 (10,6%) 8/153 (5,2%). 6/66 (9,1). Figura 13: Principales estudios que determinan frecuencia de BRCA en CMTN. Estos estudios difieren en cuanto al tipo de estudio, el número de pacientes incluidas y los criterios de selección. En algunos de ellos se incluyen pacientes con historia familiar de riesgo y pacientes con ascendencia Askhenazi. En cualquier caso, independientemente de esta variabilidad, tanto analizándolo conjuntamente como por separado, se concluye que existe una asociación entre mutaciones germinales en BRCA1 y cáncer de mama triple negativo (CMTN). 61 Introducción 1.2 1.21.2 1.2- -- -7 77 7. . . . JUSTIFICACION DE LA IDENTIFICACION DE JUSTIFICACION DE LA IDENTIFICACION DE JUSTIFICACION DE LA IDENTIFICACION DE JUSTIFICACION DE LA IDENTIFICACION DE MUTACIONES BRCA1/2 MUTACIONES BRCA1/2MUTACIONES BRCA1/2 MUTACIONES BRCA1/2 Las pacientes que presentan la mutación BRCA1 presentan un riesgo elevado de padecer cáncer de mama y/u ovario a lo largo de su vida. Se estima que una mujer portadora de mutación germinal en BRCA1 tiene un riesgo de padecer cáncer a lo largo de su vida del 87% 59 60 , un riesgo acumulado a los 70 años de cáncer de mama del 65% y de cáncer de ovario del 39% 61 . Detectar a las portadoras permite poner en marcha medidas preventivas y/o terapéuticas que disminuyen la incidencia y la mortalidad en este subgrupo de pacientes. Existen dos tipos de estrategias que se recomiendan a los portadores de mutación en estos genes, que conducen a un diagnóstico precoz o a una reducción del riesgo de cáncer. La primera estrategia es el cribado de cáncer de mama y ovario, el cual se basa en la realización de autoexploración mamaria mensual a partir de los 18 años, exploración física por un especialista cada seis meses a partir de los 25 años, mamografía o RMN mamaria anual a partir de los 25 años y determinación de Ca 125 cada 6 meses y ecografía trasvaginal cada 6 meses a partir de los 35 años 101 . La segunda estrategia es la cirugía reductora de riesgo mediante la mastectomía bilateral profiláctica y la salpingooforectomía bilateral. La mastectomía bilateral reduce el riesgo de cáncer de mama en portadoras en un 90% 102 103 . .La salpingooforectomía bilateral profiláctica, consigue una reducción de riesgo de cáncer de ovario 71-96%. Esta ha 62 Introducción demostrado además una reducción del 53-68% de riesgo de presentar cáncer de mama 104 105 106 107 . Existen diferencias con respecto al abordaje terapéutico de estas pacientes portadoras de mutación germinal BRCA, tanto desde el punto de vista quirúrgico como sistémico. En pacientes diagnosticadas de cáncer de mama, la presencia de mutación patogénica en BRCA1 o BRCA2 puede modificar la decisión del tratamiento quirúrgico. Las pacientes que se someten a cirugía conservadora tiene un riesgo cuatro veces superior de cáncer de mama ipsilateral respecto a las que se realizaron mastectomía. El 70% de las pacientes presentaron un tumor en otro cuadrante, por lo que se trataría de segundos cánceres de mama más que de recidivas 108 . Estudios caso-control también ponen de manifiesto un mayor riesgo de cáncer de mama contralateral. Según Pierce et al, la tasa de aparición de cáncer de mama contralateral en pacientes portadoras de mutación BRCA (n=160) frente a controles (n=445) a diez años es 26% (IC 95%, 22-30%) y a 15 años de 39% (IC 95%, 31-47%) 109 . El estudio de Malone et al, pone de manifiesto que una paciente con cáncer de mama antes de los 55 años portadora de mutación BRCA1 tiene una probabilidad de desarrollar un cáncer de mama contralateral del 20% y si es portadora de mutación BRCA2 del 15% 110 . Por todo ello, estas pacientes en el momento de la cirugía del cáncer de mama, si se conoce su estado de portadoras, debería ofrecérseles la realización de mastectomía bilateral. Con respecto al tratamiento sistémico, actualmente las pacientes portadoras reciben el mismo tipo de tratamiento y con los mismos fármacos que las no portadoras. Pero cada vez se sabe más sobre el comportamiento biológico diferente de estos tumores a distintos fármacos. Se conoce que los tumores de mama asociados a mutaciones germinales en BRCA1 y BRCA2 son más sensibles a ciertos esquemas, como es el caso 63 Introducción de aquellos basados en platinos 111 112 y se conoce que las mutaciones en BRCA2 son un factor predictivo de respuesta al tratamiento quimioterápico en pacientes con cáncer de ovario 113 . Pero sin duda los inhibidores de PARP han generado una gran expectación en los últimos años, mostrando su eficacia en mutaciones germinales BRCA1 y BRCA2 siendo su diana terapéutica los mecanismos de reparación celular 114 115 116 . En el momento actual los criterios para la selección de las pacientes candidatas a la realización de un test genético están basados en la historia familiar, básicamente en la edad temprana de aparición de la enfermedad neoplasia y la presencia de antecedentes familiares de cáncer de mama y/o ovario. La dificultad en identificar estas familias se encuentra en que los varones son en general portadores asintomáticos y en múltiples portadores la penetrancia no es completa. El concepto de “historia familiar no informativa” lo definió Weitzel 74 como aquella que en al menos una de las ramas, paterna o materna, presenta menos de dos mujeres (familiares de primer o segundo grado) mayores de 45 años. Son historias familiares por tanto que carecen de suficientes elementos informativos. Los elementos informativos serían mujeres que han llegado a una edad de riesgo suficiente como para desarrollar un cáncer. En estas familias, la presencia de un número pequeño de casos de cáncer no debería ser motivo para excluirlas de la realización de estudio genético. Las muertes a edades tempranas, las adopciones, el desarraigo familiar, la tendencia actual a tener un menor número de hijos, son factores que determinan que este tipo de familias no sean infrecuentes. Numerosos estudios asocian el cáncer de mama en pacientes portadoras de mutación germinal BRCA1 a la ausencia de expresión de receptores de estrógenos y progesterona y her2, lo que se denomina cáncer de mama triple negativo. 64 Introducción Teniendo en cuenta que aproximadamente del global de cánceres de mama el 15-20% son tumores triple negativo, Atchley et al 117 , examinaron 491 pacientes, detectando que un 57,1% de las pacientes portadoras de mutación germinal BRCA1 eran triple negativo, frente al 23,3% de la BRCA2 mutadas y frente al 13,8% de las pacientes sin mutación en BRCA. También en el estudio de Xu et al 118 , se observo que más de la mitad de los casos de cáncer de mama portadoras de mutación BRCA1 eran triple negativo (53,85%), encontrando unas diferencias estadísticamente significativas con respecto a las portadoras de mutación en BRCA2 o a las pacientes no portadoras de mutación BRCA, presentando también un grado nuclear superior y un mayor número de metástasis ganglionares. Los modelos de selección de las pacientes para determinar la presencia de mutación germinal BRCA publicados hasta la fecha incluyen variables clínicas como son el numero, naturaleza y edad al diagnostico de los tumores presentes en cada familia. La búsqueda de características que mejoren esta selección y permitan una mayor especificidad de la pruebas diagnosticas nos lleva a pensar que las características intrínsecas tumorales, es decir las características anatomopatológicas, pueden ser incorporadas en estos modelos de selección. 65 Introducción 2 22 2 - -- - OBJETIVOS OBJETIVOSOBJETIVOS OBJETIVOS Asociación de mutaciones germinales en BRCA1 y cáncer de mama triple negativo diagnosticado antes de los 50 años y sin historia familiar Objetivos • Objetivo principal: • Determinar la prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en pacientes diagnosticadas antes de los 50 años de edad de cáncer de mama triple negativo y sin historia familiar de riesgo. • Objetivo secundario: • Determinar la asociación de mutaciones germinales BRCA1 en función de la edad (menor e igual o mayor a 35 años). • Determinar la asociación de mutaciones germinales en BRCA1 en función del tipo de historia familiar informativa o no. • Determinar la asociación de mutaciones germinales en BRCA1 en función de la expresión de fenotipo basal. • Determinar la asociación de mutaciones germinales en BRCA1 atendiendo al estadiaje tumoral al diagnóstico (Estadio I-II o III-IV). • Determinar la asociación de mutaciones germinales en BRCA1 atendiendo al grado histológico de malignidad tumoral (bajo y moderado o alto grado). 69 de al menos dos mujeres (familiares de primer o segundo grado) mayores de 45 años). La historia familiar no informativa es aquella que no cumpla estos criterios. 3.3 3.33.3 3.3- -- -3. 3.3. 3. RECOGIDA DE MUESTRA TUMORAL RECOGIDA DE MUESTRA TUMORALRECOGIDA DE MUESTRA TUMORAL RECOGIDA DE MUESTRA TUMORAL Se obtuvo una muestra tumoral en bloque de parafina a partir de la cual se llegó al diagnóstico tumoral de cáncer de mama triple negativo mediante estudio de inmunohistoquímica (IHQ). Dicho estudio anatomopatológico se completó con el estudio de marcadores de inmunohistoquímica con el objetivo de identificar el fenotipo basal, EGFR y Citoqueratina 5/6, que se realizó en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza. 3.3 3.33.3 3.3- -- -4. 4.4. 4. RECOGIDA DE MUESTRA PARA RECOGIDA DE MUESTRA PARA RECOGIDA DE MUESTRA PARA RECOGIDA DE MUESTRA PARA DETERMINACION BRCA1 DETERMINACION BRCA1DETERMINACION BRCA1 DETERMINACION BRCA1 Se procedió a la extracción de 12-20 ml de sangre venosa periférica en EDTA para la realización del estudio de mutaciones germinales, a partir de la cual se realizará la determinación de las mutaciones BRCA1. 77 Material y Métodos 3.3 3.33.3 3.3- -- -5. 5.5. 5. ESTUDIO ESTUDIOESTUDIO ESTUDIO DE MARCADORES DE DE MARCADORES DE DE MARCADORES DE DE MARCADORES DE INMUNOHOSTOQUÍ INMUNOHOSTOQUÍINMUNOHOSTOQUÍ INMUNOHOSTOQUÍMICA MICAMICA MICA De las muestras de tumor de las participantes en el estudio se realizó la inmunohistoquimica de EGFR y citoqueratina 5/6. La inmunohistoquímica de EGFR y Citoqueratina 5/6 se realizó a partir de las muestras embebidas en parafina mediante una inmunotinción automática, seguida de la incubación con formalina en un kit de detección mediante el método estándar de estreptavidina biotina que pone de manifiesto la actividad peroxidasa de 33´diaminobencidina. La tinción de EGFR se realizó utilizando el kit EGFR pharmDx (Dako) con una recuperación de antígeno encimático por proteinasa K durante 5 minutos. Para la Citoqueratina 5/6 (Clon D5/16B4, Zymed Laboratories) se utilizó el anticuerpo siguiendo el protocolo automatizado Ventana CC1 con tinción leve a dilución de 1:100. Se definió en el estudio como casos fenotipo basal, aquellos que presentaban positividad en citoqueratina 5/6 o en EGFR. Siendo dada como positivo aquellos casos en los que existiera tinción en citoplasma o membrana aunque fuera de manera focal 119 120 121 122 . 78 Material y Métodos 3.3 3.33.3 3.3- -- -6. 6.6. 6. PROCEDIMIENTO EN EL ANÁLISIS PROCEDIMIENTO EN EL ANÁLISIS PROCEDIMIENTO EN EL ANÁLISIS PROCEDIMIENTO EN EL ANÁLISIS GENÉ GENÉGENÉ GENÉTICO DE BRCA1 TICO DE BRCA1TICO DE BRCA1 TICO DE BRCA1 Se aisló ADN genómico a partir de sangre periférica usando el procedimientos estándar. El análisis de la mutación se realizó mediante PCR, DHPLC (desnaturalización cromatografía líquida de alto rendimiento) y la secuenciación de todos los exones, así como los intrónes del gen BRCA1, utilizando el método empleado previamente por Simard et al 123 . 3.3 3.33.3 3.3- -- -6.1. 6.1.6.1. 6.1. EXTRACCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE EXTRACCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE EXTRACCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE EXTRACCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE PERIFÉRICA PERIFÉRICAPERIFÉRICA PERIFÉRICA La extracción de sangre periférica se realizó mediante venopunción en el Servicio de Oncología Médica de los hospitales que participaron en este estudio. La recogida fue de 12-20 ml en EDTA. Las muestras se conservaron en nevera a una temperatura de 4 Cº. El trasporte de las muestras fue a temperatura ambiente en un plazo de tiempo no superior a 48 horas desde su extracción, al servicio de Oncología Médica del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza. 79 Material y Métodos 3.3 3.33.3 3.3- -- -6.2 6.26.2 6.2- -- - EXTRACCIÓN DE ADN LINFOCITA EXTRACCIÓN DE ADN LINFOCITAEXTRACCIÓN DE ADN LINFOCITA EXTRACCIÓN DE ADN LINFOCITARIO A PARTIR RIO A PARTIR RIO A PARTIR RIO A PARTIR DE UNA MUESTRA DE SANGRE PERIFÉRICA DE UNA MUESTRA DE SANGRE PERIFÉRICADE UNA MUESTRA DE SANGRE PERIFÉRICA DE UNA MUESTRA DE SANGRE PERIFÉRICA La extracción del DNA se realizó en el Servicio de Inmunología del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza manualmente utilizando el método de “Salting out” 124 . Se inició a partir de una muestra de 10 ml de sangre periférica, recogida en tubo EDTA. Para la lisis celular y mezcla de sus componentes, se realizó mediante métodos químicos, con la adición de 40 ml de STMT, compuesto formado por sacarosa 0,32M, tris HCL 1 mM ph 7,05, MgCL2, Triton X-100 1%), dejando reposar 5 minutos y centrifugando a 3500 rpm durante 30 minutos a 4 Cº. Posteriormente se procedió a decantar el sobrante y lavar el sedimento con la misma solución hasta eliminar los restos. A continuación se añadió un tampón de lisis de leucocitos, un detergente, 120 microlitros de SDS o dodecil sulfato de sodio al 10% y 50 microlitros de proteinasa K (20 mg/ml). El fin era separar el DNA de las proteínas a las que se encuentra asociado. Se incubó durante toda la noche a 37 Cº de temperatura y a la mañana siguiente, el ADN se sometió a precipitación y dilución. Para precipitar los péptidos se añadió 1,76 ml de NaCl 6M, agitando en vortex fuertemente durante 15 segundos y centrifugando a 3500 rpm durante 30 minutos a 45Cº. En el caso de permanecer partículas en suspensión se volvió a centrifugar. 80 Material y Métodos Se recogió el sobrante y se precipitó el ADN con un volumen de isopropanol, se mezcló por inversión. Si quedaron pequeñas cantidades se centrifugó a 3500 rpm durante 30 minutos a 4 Cº. Se lavó el sedimento (ADN) con etanol al 70%, se secó al aire y se volvió a suspender en un volumen adecuado al precipitado obtenido de tampón TE (tris HCL 10 mM ph 7,5, EDTA 0,1 mM). Posteriormente se cuantificó el ADN mediante la lectura de absorbancia a 260 nm. Su pureza se estimó hallando el cociente ABs260/Abs280, si este era mayor de 1,8, la muestra se consideró adecuada. La cuantificación de ADN se cuantificó teniendo en cuenta que la unidad de D.O. se corresponde con 50 nanogramos/microlitro. Una vez cuantificado el ADN, se preparó una dilución de trabajo a una concentración de 50 nanogramos/microlitros. Se comprobó el estado y la cuantificación de ADN por electroforesis en agarosa al 0,8%. 3.3 3.33.3 3.3- -- -6.3. 6.3.6.3. 6.3. REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASAREACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR) (PCR)(PCR) (PCR) Para el posterior análisis de mutaciones en BRCA1 es necesario amplificar el ADN correspondiente al mismo, esto se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El contenido de los 22 exones codificantes y de las regiones intrónicas adyacentes se amplificaron en 37 reacciones de PCR diferentes (debido a su gran tamaño, el exón 11 se dividió en varios fragmentos). Los Primers usados fueron los descritos en: Van Orsouw NJ et al 125. 81 Material y Métodos La reacción de PCR constó de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos seguida de 35 ciclos de 95º durante 30 segundos, un paso de hibridación cuya temperatura dependió de la secuencia del fragmento a amplificar durante 30 segundos y 72º durante 1 minuto seguidos de un paso de elongación final a 72º durante 10 minutos. Para cada reacción de secuenciación se partió de 100 ng de ADN. La amplificación correcta de los fragmentos se comprobó por electroforesis en un gel agarosa al 2%. 3.3 3.33.3 3.3- -- -6.4. 6.4.6.4. 6.4. CROMATOGRAFÍ CROMATOGRAFÍCROMATOGRAFÍ CROMATOGRAFÍA LÍ A LÍA LÍ A LÍQUIDA QUIDA QUIDA QUIDA DESNATURAL DESNATURALDESNATURAL DESNATURALIZANT IZANTIZANT IZANTE DE ALTA RESOLUCIÓN E DE ALTA RESOLUCIÓNE DE ALTA RESOLUCIÓN E DE ALTA RESOLUCIÓN La técnica de DHPLC permite detectar alteraciones en la secuencia de ADN (cambios puntuales e inserciones o delecciones de unas pocas bases) debido al cambio de temperatura de desnaturalización que se produce en las moléculas de ADN homoduplex y heteroduplex que se separan por una cromotografía liquida de fase reversa a través de una matriz que utiliza el gradiente de concentración de acetanonitrilo. El producto obtenido de las PCR se utiliza directamente. A lo largo del proceso de la PCR se forman compuestos homoduplex y hetroduplex a partir de fragmentos amplificados de ADN con presencia de mutaciones o polimorfismos. Estos fragmentos al migrar a través de la columna de la DHPLC y debido a la temperatura y al acetonitrilo se desnaturalizan formándose estructuras “en horquilla” (combinan DNA separado y de doble cadena) que varia la retención en la columna. La presencia de heteroduplex desestabiliza la molécula de ADN haciendo que se desnaturalicen antes 82 Material y Métodos que los homoduplex pudiéndose separar de estos. Es necesario analizar cada amplicón a diversas temperaturas para que todas las posibles mutaciones se puedan detectar. Para analizar BRCA1 fue necesario realizar 79 inyecciones en el DHPLC. (Figura 14). Se utilizó una instrumentación automática tal y como se describe en Underhill et al 126 . A partir de 4 a 7 µl del producto de la PCR que contiene aproximadamente de 50 a 100 ng de DNA, se desnaturalizó a una temperatura de 95 Cº durante tres minutos. Posteriormente y de forma gradual se realizó el descenso de temperatura en la muestra de 95Cº a 65Cº durante 30 minutos. Los productos fueron separados a una velocidad de flujo de 0,9 ml/min a través del gradiente lineal de acetonitrilo. La columna de fase móvil consistió en la mezcla de 0,1 M de acetato de trietilamina con (tampón A) o sin (tampón B) acetonitrilo al 25%. Se trata de una técnica compleja y de difícil interpretación pero que alcanza el 100% de sensibilidad al utilizar cada fragmento de PCR frente a los diferentes gradientes de temperatura. 83 Material y Métodos Figura 14: Representación gráfica del análisis de DHPLC. Dos (PCR amplificados) cadenas de ADN que difieren en un único nucleótido son desnaturalizados y anelados, formando heteroduplex, el cual puede ser distinguido de un homoduplex mediante HPLC. Adaptado de www.transgenomic.com 127 . 3.3 3.33.3 3.3- -- -6.5. 6.5.6.5. 6.5. SECU SECUSECU SECUE EE ENCIACIÓN NCIACIÓNNCIACIÓN NCIACIÓN De aquellas muestras en las que se detectó un patrón de cromatografía alterado se realizó la secuenciación del fragmento en las dos direcciones para confirmar la presencia de mutaciones patógenas. La secuenciación se llevó a cabo mediante el secuenciador (Megabace, AmershanPharmacia) del servicio de secuenciación de la universidad de Zaragoza. El producto obtenido tras la realización de la PCR se mezcló con 100 microlitros de tampón purificador y 1 ml de resina. Se agitó y se dejó reposar un minuto. La mezcla se 84 Material y Métodos pasó a través de la columna con ayuda de una jeringa. Se lavó la columna con 2 ml de isopropanolol al 80% y se trasfirió la columna a un tubo de 1,5 ml. Posteriormente se procedió a la centrifugación durante dos minutos a 10000 g. Se añadió 50 picolitros de TE a la columna para diluir el ADN y se dejó reposar un minuto de tiempo y tras trasferir la columna a un tubo de 1,5 ml se centrifugó 20 segundos a 10000 g. Se realizó la reacción de la secuenciación donde se mezcló 4 microlitros de compuesto formado por el tampón, Taq polimerasa y la mezcla de nucleótidos con 10 moles del primer y 5,5 microlitros del producto de la PCR amplificada. La reacción de desnaturalización constó de una desnaturalización inicial a 94Cº durante un tiempo de cinco minutos seguido de 25 ciclos de 94º durante 10 segundos, 60º si el primer usado incluía una cola de 40/50 GCs o 50º en caso de utilizar un primer sin colas de GCs durante 10 segundos, y 60º durante dos minutos y un paso final a 60º durante 7 minutos y por último a 4ºC indefinidamente. Los productos obtenidos una vez realizada la secuenciación se analizaron mediante electroforesis capilar a 15 KW, durante 36 minutos en un secuenciador automático ABI 310 (Applied Biosystems). Los resultados obtenidos se analizaron posteriormente mediante el programa sequencing Analisis. 3.3 3.33.3 3.3- -- -6.6. 6.6.6.6. 6.6. MULTIPLEX LIGATION MULTIPLEX LIGATIONMULTIPLEX LIGATION MULTIPLEX LIGATION DEPENDENT PROBE DEPENDENT PROBE DEPENDENT PROBE DEPENDENT PROBE ANALYSIS ANALYSISANALYSIS ANALYSIS Para el estudio de presencia de grandes delecciones, duplicaciones o reordenamientos complejos del gen BRCA1 se utilizó la técnica de MLPA. Esta técnica se realizó en el 85 Material y Métodos laboratorio de la unidad de análisis genéticos del Hospital Universitario Miguel Servet de Zaragoza. El DNA de los pacientes (50-500 mg, 5 microl) y tres controles se desnaturalizaron 5 minutos a 98 Cº, y se añadió 3 microl de la mezcla con la sonda. Se calentó a 95Cº durante un minuto y se incubó a 60 Cº durante toda la noche (16 horas). La ligación se realizó con la enzima termoestable Ligasa-65 (32 microl mezcla de Ligasa-65) durante 15 minutos a 54 Cº. Tras la inactivación de la ligasa (5 minutos a 98 Cº) los productos de ligación se amplificaron por PCR, mediante un oligonucleótido marcado con 6-FAM. La PCR consistió en 35 ciclos (30 segundos a 60 Cº y 60 segundos a 72 Cº). Preparándose una mezcla de 0,75 microl de los fragmentos resultantes, 0,5 microl de standard ROX GS-500, 0,75 microl de agua desionizada y 12 microl de formamida altamente desionizada y se incubó durante 2 minutos a 94 Cº. Tras enfriar a 4Cº en hielo, la muestra se analizó en un secuenciador capilar ABI PRISM 310 mediante el software Genescan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los tamaños de los picos específicos para cada exón se identificaron de acuerdo con su migración relativa a los del standard GS-500. Los datos correspondientes al área se exportaron a una hoja de Excel (Microsoft, Rodmond, USA) y se calculó el área media de los tres controles para cada sonda. Se aplicó una normalización interna de la muestra y la media de los controles mediante el cociente entre cada área y todos los controles internos. Posteriormente se realizó una normalización externa que calculó el cociente entre la muestra normalizada y la media de los controles normalizados, la cual proporcionó la medida de la dosis génica (DQ) 128 . La DQ esperada para los pacientes no portadores fue de 1 y para los portadores de una delección/duplicaión 0,5 y 1 respectivamente. Se consideró como en la literatura, que 86 Material y Métodos Resultados Las tres mutaciones detectadas fueron mutaciones missence o sin sentido. (Tabla 4). N Mutación Tipo de mutaciones 1 G3238A/S1040N Missence 2 G4251A/V1378I Missence 3 A4158G/R1347G Missence Tabla 4: Variantes sin clasificar detectadas. 4.2 4.24.2 4.2- -- - ANÁ ANÁANÁ ANÁLISIS DESCRIPTIVO LISIS DESCRIPTIVOLISIS DESCRIPTIVO LISIS DESCRIPTIVO Las principales características muestrales de las pacientes recogidas en el estudio se detallan de la siguiente manera. 4.2-1. EDAD AL EDAD AL EDAD AL EDAD AL DIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICODIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICO La mediana de edad de diagnostico del cáncer de mama triple negativo entre las 92 pacientes reclutadas fue de 41 años, con un intervalo de 23 a 50 años. La moda fue de 47 años. 93 La edad es una variable cualitativa que se convierte en una variable cuantitativa dicotómica, tomando como valores de referencia la edad inferior a 35 años o igual/superior a 35 años de edad. Del computo total de pacientes (n=92), 19 presentaron una edad inferior a 35 años (20,65%) al diagnostico y 73 (79,35%) igual o superior a los 35. (Tabla 5). Edad N= 92 % < 35 años 19 20,65 ≥ 35 años 73 79,35 Tabla 5: Edad de diagnostico. La población de pacientes mutadas (n=7), presentaron una edad inferior a 35 años en 2 pacientes (28,58%) y 5 (71,42%) igual o superior a 35 años. (Tabla 6). Edad N=7 % < 35 años 2 28,58 ≥ 35 años 5 71,42 Tabla 6: Edad al diagnostico en pacientes con mutación germinal BRCA1. Las variables de significado incierto (n=3) presentaron una edad de diagnostico igual o superior a 35 años en la totalidad de los casos (100%). 94 Resultados Resultados En el subgrupo de 19 pacientes con edad inferior a 35 años, 2 presentaban mutación en BRCA1 (10,52%) y en el subgrupo de 73 de 35 años o más, 5 pacientes presentaron mutación en BRCA1 (6,84%). (Tabla 7). Edad al diagnóstico N=92 Mutación BRCA1 (N=7) % <35 años 19 2 10,52 ≥ 35 años 73 5 6,84 Tabla 7: Mutación BRCA1 en los subgrupos de edad. 4.2 4.24.2 4.2- -- -2. 2.2. 2. TIPO DE HISTORIA FAMILIAR TIPO DE HISTORIA FAMILIARTIPO DE HISTORIA FAMILIAR TIPO DE HISTORIA FAMILIAR La historia familiar es una variable cualitativa dicotómica, siendo informativa o no informativa. De las 92 pacientes, 54 de ellas presentaron una historia familiar informativa (58,69%) frente a 38 no informativa (41,31%). (Tabla 8). Historia Familiar N= 92 % Informativa 54 58,69 No informativa 38 41,31 Tabla 8: Tipo de historia familiar. 95 La población de pacientes mutadas (n=7), presentó una historia familiar no informativa en 5 (71,42) casos mientras que informativa en 2 (28,58%). (Tabla 9). Historia Familiar N= 7 % Informativa 2 28,58 No informativa 5 71,42 Tabla 9: Tipo de historia familiar en pacientes con mutación germinal BRCA1. Las variables de significado incierto (n=3) presentaron una historia familiar no informativa en 2 (66,6%) mientras en un caso fue informativa (33,3%). De 38 pacientes con historia familiar no informativa, 5 presentaban mutación en BRCA1 (13,15%) y de 54 con historia familiar informativa, 2 (3,70%). (Tabla 10). Historia Familiar N=92 Mutación BRCA1 (N=7) % No Informativa 38 5 13,15 Informativa 54 2 3,70 Tabla 10: Mutación BRCA1 en los subgrupos de historia familiar. 96 Resultados Resultados 4.2 4.24.2 4.2- -- -3. 3.3. 3. ESTADIO TUMORAL ESTADIO TUMORALESTADIO TUMORAL ESTADIO TUMORAL El estadio tumoral es una variable cuantitativa no dicotómica, que se trasforma en dicotómica al agrupar los estadios en iníciales (estadio I y II) y localmente avanzado o metastásico (III-IV). De 73 pacientes, 56 presentaron un diagnostico precoz en estadios I y II (76,71%) frente a 17 avanzados en III y IV (23,29%). (Tabla 11). Estadio N=73 % Inicial (I-II) 56 76,71 Avanzado (III-IV) 17 23,29 Tabla 11: Estadio tumoral al diagnostico. La población de pacientes mutadas en las que se conoció el estadio tumoral (n=5) reveló 3 estadio localmente avanzado/metastásico (60%) y 2 iníciales (40%). (Tabla 12). Estadio N=5 % Inicial (I-II) 2 40 Avanzado (III-IV) 3 60 Tabla 12: Estadio tumoral al diagnostico en pacientes con mutación germinal BRCA1. 97 La totalidad de la población que presentaron variables de significado incierto (n=3) presentaron un estadio inicial (100%). En el subgrupo de 56 pacientes con estadio inicial (I-II), 2 presentaban mutación en BRCA1 (3,5%) y en el subgrupo de 17 con estadio avanzado (III-IV), 3 pacientes presentaron mutación en BRCA1 (17,64%). (Tabla 13). Estadio tumoral N=73 Mutación BRCA1 (N=5) % Inicial (I-II) 56 2 3,50 Avanzado (III-IV) 17 3 17,64 Tabla 13: Mutación BRCA1 en los subgrupos estadio tumoral. 4.2 4.24.2 4.2- -- -4. 4.4. 4. GRADO HISTOLÓGICO GRADO HISTOLÓGICOGRADO HISTOLÓGICO GRADO HISTOLÓGICO El grado histológico es una variable cuantitativa, que se define como dicotómica al dividir en grado bajo/moderado o alto grado histológico. De 48 pacientes, 7 presentaban un grado histológico bajo/moderado (14,54%) frente a 41 de alto grado (85,16%). (Tabla 14). 98 Resultados Resultados Grado Histológico N=48 % Bajo/Moderado 7 14,54 Alto 41 85,16 Tabla 14: Grado Histológico. El grado histológico se recogió en 3 pacientes con presencia de mutación germinal BRCA1 de las 7 detectadas en la muestra, de las cuales 2 presentaron un alto grado histológico (66.66%) y 1 un grado histológico bajo/moderado (33,33%). (Tabla 15). Grado Histológico N=3 % Bajo/Moderado 1 33,3 Alto 2 66,6 Tabla 15: Grado histológico en pacientes con mutación germinal BRCA1. En el subgrupo de 7 pacientes con grado histológico bajo/moderado, 1 presentaba mutación en BRCA1 (14,28%) y en el subgrupo de 41 con grado histológico alto, 2 pacientes presentaron mutación en BRCA1 (4,87%). (Tabla 16). Grado Histológico N=48 Mutación BRCA1 (N=3) % Bajo/Moderado 7 1 14,28 Alto 41 2 4,87 Tabla 16: Mutación BRCA1 en los subgrupos grado histológico. 99 4.2 4.24.2 4.2- -- -5. 5.5. 5. EGFR EGFREGFR EGFR La determinación de EGFR es una variable cualitativa dicotómica, presencia o ausencia de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico. De 59 pacientes, la determinación de EGFR fue positiva en 17 de ellos (28,81%) y negativa en 42 pacientes (71,19%). (Tabla 17). EGFR N=59 % Positivo 17 28,81 Negativo 42 71,19 Tabla 17: Determinación de EGFR. De la población de pacientes mutadas se obtuvo negatividad en los 3 casos en los que se realizó la determinación de EGFR (100%). (Tabla 18). EGFR N=3 % Positivo 0 0 Negativo 3 100 Tabla 18: Determinación EGFR en pacientes con mutación germinal BRCA1. 100 Resultados Resultados En el subgrupo de 17 pacientes con EGFR positivo, 0 presentaban mutación en BRCA1 (0%) y en el subgrupo de 42 con EGFR negativo, 3 pacientes presentaron mutación en BRCA1 (7,14%). (Tabla 19). EGFR N=59 Mutación BRCA1 (N=3) % Positivo 17 0 0 Negativo 42 3 7,14 Tabla 19: Mutación BRCA1 en los subgrupos de EGFR. 4.2 4.24.2 4.2- -- -6. 6.6. 6. CITOQUERATINA 5/6 CITOQUERATINA 5/6CITOQUERATINA 5/6 CITOQUERATINA 5/6 La ausencia o presencia de positividad para la citoqueratina 5/6 es una variable cualitativa dicotómica. De 68 pacientes, presentaron positividad para citoqueratina 5/6 41 (60,29%) y negatividad 27 (39,71%). (Tabla 20). Citoqueratina 5/6 N=68 % Positiva 41 60,29 Negativa 27 39,71 Tabla 20: Determinación de Citoqueratina 5/6. 101 La determinación de la citoqueratina 5/6 en la población de pacientes con mutación germinal BRCA1 se consiguió determinar en 4 (n=4), con la expresión de la totalidad de los casos. (Tabla 21). Citoqueratina 5/6 N=4 % Positiva 4 100 Negativa 0 0 Tabla 21: Determinación de Citoqueratina 5/6 en pacientes con mutación germinal BRCA1. En el subgrupo de 41 con citoqueratina 5/6 positiva, 4 presentaban mutación en BRCA1 (9,75%) y 27 en el subgrupo de citoqueratina 5/6 negativa, 0 pacientes presentaron mutación en BRCA1 (0%). (Tabla 22). Citoqueratina 5/6 N=68 Mutación BRCA1 (N=4) % Positivo 41 4 9,75 Negativo 27 0 0 Tabla 22: Mutación BRCA1 en los subgrupos de citoqueratina 5/6. 102 Resultados 61 H.C.U. Lozano Blesa 37 No No CDI II III - - - Informativa Patógena 62 H.C.U. Lozano Blesa 47 No Ca. de Cérvix CDI II I Negativo - - No informativa No 63 H.C.U. Lozano Blesa 23 No No CDI III II - - - No informativa Patógena 64 H.C.U. Lozano Blesa 44 No No CDI III II - - - Informativa No 65 H.C.U. Lozano Blesa 47 No No CDI - I - - - Informativa No 66 H.C.U. Lozano Blesa 37 No No CDI II II - - - Informativa No 67 Hospital Arnau de Vilanova 38 No No CDI - - - - - Informativa No 68 Hospital Arnau de Vilanova 35 No No CDI - II - - - No informativa No 69 Hospital Vall d´Hebron 42 - No CDI - I - - - Informativa No 70 Hospital Vall d´Hebron 36 - No CDI - IV - Negativo - Informativa No 71 Hospital Vall d´Hebron 37 - No CDI - III - - - Informativa No 72 Hospital Vall d´Hebron 34 - No CDI - II - - - Informativa No 73 Hospital Vall d´Hebron 32 - No CDI - II - - - No informativa No 74 Hospital Vall d´Hebron 38 - No CDI - I - - - Informativa No 75 Hospital Vall d´Hebron 36 - No CDI - III - Positivo Si No informativa No 76 Hospital Vall 41 - No CDI - II - - - Informativa No d´Hebron 109 Resultados 77 Hospital Vall d´Hebron 50 - No CDI - I - - - Informativa No 78 Hospital Vall d´Hebron 35 - No CDI - II - Negativo - Informativa No 79 Hospital Vall d´Hebron 37 - No CDI - II - - - No informativa VUS 80 Hospital Vall d´Hebron 39 - No CDI - I - - - No informativa VUS 81 Hospital Vall d´Hebron 30 - No CDI - III - Positivo Si No informativa No 82 Hospital Vall d´Hebron 33 - No CDI - II - Negativo - Informativa No 83 Hospital Vall d´Hebron 38 - No CDI - I - - - Informativa No 84 Hospital Vall d´Hebron 34 - No CDI - I - - - Informativa No 85 Hospital Vall d´Hebron 31 - No CDI - II - Positivo Si No informativa No 86 Hospital Vall d´Hebron 31 - No CDI - III - - - No informativa Patógena 87 Hospital Vall d´Hebron 37 - No CDI - II - - - Informativa No 88 IOV 49 No No CDI II III - Positivo Si No informativa Patógena 89 IOV 41 No No CDI III II - Positivo Si Informativa No 90 IOV 47 No No CDI III I - Negativo - Informativa No 91 IOV 43 No No CDI - II - Negativo - Informativa No 92 IOV 35 No No CDI - II Negativo - - No informativa No 110 Resultados 4.2 4.24.2 4.2- -- -9 99 9 . CARACTERÍSTICAS DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS PACIENTES CON MUTACIÓN PATÓGENA PACIENTES CON MUTACIÓN PATÓGENA PACIENTES CON MUTACIÓN PATÓGENA PACIENTES CON MUTACIÓN PATÓGENA BRCA1 BRCA1BRCA1 BRCA1 Y VARIANTES DE SIGNIFICADO INCIERTO Y VARIANTES DE SIGNIFICADO INCIERTOY VARIANTES DE SIGNIFICADO INCIERTO Y VARIANTES DE SIGNIFICADO INCIERTO n Edad Estadio GH Historia Familiar VUS Tipo EGFR Cit 5/6 Epìtelio Basal 1 47 IIA III Informativa G3238A/S1040N Missence Negativo Negativo Negativo 2 37 IIA - No Informativa G4251A/V1378I Missence - - - 3 39 I - No Informativa A4158G/R1347G Missence - - - n Edad Estadio GH Historia Familiar Mutación Patógena Tipo EGFR Cit 5/6 Epitelio basal 1 37 IIIB - Informativa G4643A/ W1508X Nosence - - - 2 23 IIA III No Informativa 4286insAG;stop 1392 Insección - - - 3 31 IIIB - No Informativa C4966T/ A1616V Missence - - - 4 41 x - No Informativa 3019insCT Insección Negativo Positiva Positivo 5 43 x - Informativa C5242A/ A1708E Missence Negativo Positivo Positivo 6 49 IIIA II No Informativa 3748 del TT;stop1217 Delección Positivo Positivo 7 38 IIA III No Informativa 3886 del CA;stop1264 Delección Negativa Positiva Positiva 111 Resultados 4. 4.4. 4.3 33 3- -- - ANÁLISIS INFERENCIAL ANÁLISIS INFERENCIALANÁLISIS INFERENCIAL ANÁLISIS INFERENCIAL 4.3 4.34.3 4.3- -- -1. 1. 1. 1. EDAD AL EDAD AL EDAD AL EDAD AL DIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICODIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICO El estudio estadístico que comparó la presencia de mutación germinal BRCA1 y la edad al diagnostico de cáncer de mama triple negativo, detectó un valor de p= 0,631 (>0,05) en la prueba exacta de Fisher, por lo tanto se observó que no existe una asociación estadísticamente significativa entre estas dos variables. (Tabla 26). Mutación BRCA1 Edad al diagnóstico Significación Fisher Menor de 35 años Mayor o igual de 35 años Total Sí 2 5 7 0,631 28,6% 71,4% 100,0% No 17 68 85 20,0% 80,0% 100,0% Total 19 73 92 Tabla 26: Asociación estadística entre la mutación BRCA1 y la edad al diagnóstico. 112 Resultados Resultados 4.3 4.34.3 4.3- -- -2. 2. 2. 2. HISTORIA FAMILIAR HISTORIA FAMILIARHISTORIA FAMILIAR HISTORIA FAMILIAR Realizando la prueba exacta de Fisher se observa un valor p= 0,121 (>0,05) lo que se traduce en que no existe una asociación estadísticamente significativa entre la variable historia familiar informativa y la determinación de la mutación BRCA1. (Tabla 27). Mutación BRCA1 Historia familiar Significación Fisher Informativa No informativa Total Sí 2 5 7 0,121 28,6% 71,4% 100,0% No 52 33 85 61,2% 38,8% 100,0% Total 54 38 92 Tabla 27: Asociación estadística entre mutación BRCA1 e historia familiar. 113 4.3 4.34.3 4.3- -- -3. 3. 3. 3. ESTADIO TUMORAL ESTADIO TUMORALESTADIO TUMORAL ESTADIO TUMORAL Atendiendo al grupo de estadio tumoral al diagnóstico, se detecto un valor de p= 0,079 (>0,05), por lo tanto no se observo significación estadística entre las variables mutación BRCA1 y estadio tumoral. (Tabla 28). Mutación BRCA1 Grupo de estadio Significación Fisher Incluye I y II Incluye III y IV Total Sí 2 3 5 0,079 40,0% 60,0% 100,0% No 54 14 68 79,4% 20,6% 100,0% Total 56 17 73 Tabla 28: Asociación estadística entre mutación BRCA1 y estadio tumoral. 114 Resultados Resultados 4.3 4.34.3 4.3- -- -4. 4. 4. 4. GRADO HISTOLÓ GRADO HISTOLÓGRADO HISTOLÓ GRADO HISTOLÓGICO GICOGICO GICO Se hallo un valor de p = 0,384 (>0,05) realizándose la prueba exacta de Fisher, con los que se deduce que no existe asociación estadísticamente significativa entre la variable presencia de mutación BRCA1 y grado histológico. (Tabla 29). Mutación BRCA1 Grado histológico Significación Fisher I y II III Total Sí 1 2 3 0,384 33,3% 66,7% 100,0% No 6 39 45 13,3% 86,7% 100,0% Total 7 41 48 Tabla 29: Asociación estadística entre mutación BRCA1 y Grado histológico. 4.3 4.34.3 4.3- -- -5. 5. 5. 5. EFGR EFGREFGR EFGR La presencia de EGFR frente a la mutación de BRCA1, hallo un valor de p= 0,550 (>0,05) por la prueba de significación de Fisher por lo que no fue no se detectó una asociación estadísticamente significativa entre las dos variables. (Tabla 30). 115 Mutación BRCA1 EFGR Significación Fisher Positivo Negativo Total Sí - 3 3 0,550 - 100,0% 100,0% No 17 39 56 30,4% 69,6% 100,0% Total 17 42 59 Tabla 30: Asociación estadística entre mutación BRCA1 y determinación de EGFR. 4.3 4.34.3 4.3- -- -6. 6. 6. 6. CITOQUERATINA 5/6 CITOQUERATINA 5/6CITOQUERATINA 5/6 CITOQUERATINA 5/6 La presencia de la citoqueratina 5/6 en la muestra en relación estadística frente a la mutación de BRCA1 detecta un valor de p=0,146 (>0,05), al realizar la prueba exacta de Fisher, por lo tanto no se encontró un valor estadísticamente significativo, sin asociación pues entre la variable mutación BRCA1 y citoqueratina 5/6. (Tabla 31). 116 Resultados Resultados Mutación BRCA1 Citoqueratina 5/6 Significación Fisher Positiva Negativa Total Sí 4 - 4 0,146 100,0% - 100,0% No 37 27 64 57,8% 42,2% 100,0% Total 41 27 68 Tabla 31: Asociación estadística entre mutación BRCA1 y Citoqueratina 5/6. 4.3 4.34.3 4.3- -- -7. 7. 7. 7. FENOTIPO BASAL FENOTIPO BASALFENOTIPO BASAL FENOTIPO BASAL Enfrentando las variables de fenotipo basal y mutación germinal patógena BRCA1, se observó un valor de p= 0,567 (>0,05) en la prueba exacta de Fisher, por lo tanto se observa que no existe asociación estadísticamente significativa entre estas dos variables. (Tabla 32). 117 Mutación BRCA1 Fenotipo basal Significación Fisher Positivo Negativo Total Sí 4 - 4 0,567 100,0% - 100,0% No 42 17 59 71,2% 28,8% 100,0% Total 46 17 63 Tabla 32: Asociación estadística entre mutación BRCA1 y fenotipo basal 118 Resultados Discusión Hartmann 100 evaluó una cohorte de 199 mujeres diagnosticadas con cáncer de mama triple negativo. La prevalencia de mutaciones detectadas entre pacientes con cáncer de mama triple negativo fue significativamente más alto que la prevalencia entre pacientes no seleccionadas por las características anatomopatológicas de su cáncer de mama (P < 0.0005). En el grupo de 66 pacientes menores de 50 años, se detectaron 6 mutaciones (9.1%), casi dos veces lo esperado según las tablas de prevalencia de Myriad. El estudio realizado por Mavaddat y colaboradores 75 pone de manifiesto la necesidad de incorporar el patrón fenotípico del cáncer de mama a los modelos actuales de predicción de mutación germinal BRCA1 y BRCA2. En este estudio incorporan al método BOADICEA la expresión de receptores de estrógenos, el estadio triple negativo y marcadores de fenotipo basal, demostrando que existe una mejora en la predicción de aquellas pacientes con mutación BRCA1, no siendo tan clara la ventaja en BRCA2. A pesar del coste de la realización del estudio de mutaciones germinales en BRCA1, un estudio demuestra que realizar el test en mujeres menores de 50 años con cáncer de mana triple negativo resulta coste-efectivo y puede reducir el riesgo de aparición de cáncer de mama y ovario hasta un 40% 133 . Los tumores asociados a BRCA1 además de presentar en un elevado porcentaje un inmunofenotipo triple negativo, con frecuencia expresan marcadores del epitelio basal, como son la citoqueratina 5/6 y el EGFR. Los estudios realizados por Foulkes et al 81 y Lakhani et al 82 confirmaron que la expresión de marcadores basales es frecuente en el cáncer de mama asociado a BRCA1. Pero la expresión de citoqueratina 5/6 y/o EGFR no es suficiente para distinguir aquellas pacientes con tumores triple negativo asociados a mutación en la línea germinal de BRCA1. (Collins et al) 87 . 125 Discusión Nuestro estudio incluye el mayor número de pacientes diagnosticadas de cáncer de mama triple negativo antes de la edad de 50 años y sin historia familiar de riesgo (ausencia de antecedentes de cáncer de mama y/o ovario entre familiares de primer y segundo grado). La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 detectadas en este estudio (7.3%) es superior a la que presenta la misma cohorte de pacientes no seleccionadas por las características histopatológicas del cáncer de mama de laboratorios Myriad (cáncer de mama antes de los 50 años sin antecedentes familiares, prevalencia: 4.7%). En este estudio el análisis univariante de los subgrupos en función de la edad, expresión de CK 5/6 o EGFR y el tipo de historia familiar no ha demostrado diferencias en cuanto a la probabilidad de detectar una mutación patogénica. En cuanto a la edad, los dos subgrupos (menores de 35 años y mayor o igual a 35 años) se distribuyen de manera muy similar entre los pacientes con y sin mutaciones. Hay que resaltar que 73 de 92 pacientes tenían 35 años o más y que no habían sido candidatos a la realización del estudio de mutación germinal BRCA1 de no haber participado en este estudio. Con respecto al fenotipo basal, no tener datos disponibles de 29 pacientes hace que sea difícil la valoración. Se analizaron sólo 63 casos, de los cuales, en 4 se había detectado mutación patogénica. En estos 4 casos portadoras de mutación, hubo expresión de CK 5/6 o de EGFR, por tanto todas ellas presentaban un fenotipo basal. Entre las 59 pacientes que no eran portadoras y se dispuso de muestra de tumor para el análisis de CK 5/6 y EGFR, la mayoría presentaban un fenotipo basal (42 pacientes, 71.2% vs 17 pacientes,28.8%). 126 Discusión Esta es la primera serie que la prevalencia de mutaciones es analizada en función de la historia familiar (informativa/no informativa). A pesar de que no se obtuvieron diferencias significativas, la mayoría de las pacientes con mutación (5 de 7, 71.4%) tenían una historia familiar no informativa. Por el contrario, la mayoría de las pacientes sin mutación patogénica tenían una historia familiar informativa (52 pacientes de 85, 61.2%). Aunque no las diferencias no sean estadísticamente significativas, estos datos sugieren que la presencia de historia familiar no informativa, aumentaría la probabilidad de detectar una mutación y podría incluso ser utilizado como criterio adicional para indicar la realización del test. Las limitaciones de nuestro estudio son las siguientes: 1. Carácter retrospectivo del estudio. 2. Selección de casos desde unidades de consejo genético. 3. Estudio anatomopatológico de cáncer de mama triple negativo no centralizado. 4. No se reporta la realización de estudio de mutaciones germinales en BRCA2. 5. La sensibilidad de los métodos de estudio de mutaciones en BRCA1. 1. Carácter retrospectivo del estudio. La selección retrospectiva de los casos determina que hayan sido elegidas para el estudio pacientes que han sobrevivido a su cáncer de mama, durante tiempo variable e indefinido. Esto implica que las pacientes participantes puedan tener mejor pronóstico que otras diagnosticadas en periodos de tiempo equivalente pero, que por haber fallecido no han tenido opción de participar en este estudio. Con respecto al pronóstico 127 Discusión del cáncer de mama asociado a BRCA1 existen datos en la literatura contradictorios, dado que los estudios realizados son retrospectivos y con un número poco amplio de pacientes. El estudio de Stoppa-Lyonnet et al 134 y Foulkes et al 135 encuentran diferencias significativas en cuanto a supervivencia, siendo peor en portadoras de la mutación BRCA con respecto a controles. Otros estudios como Johannsson et al 136 y Rennert et al 137 no encuentran diferencias entre ambos grupos y otros como el de Marcus et al 138 encuentran una mayor supervivencia en las pacientes portadoras de la mutación. Existe un metaanalisis realizado por Lee et al 139 , el cual concluye que existe una diferencia significativa con respecto a una peor supervivencia global y peor supervivencia libre de progresión en las pacientes con cáncer de mama portadoras de mutación germinal BRCA1. Esta diferencia no se encontró en pacientes portadoras de mutación BRCA2. 2. Selección de casos desde unidades de consejo genético. Los casos fueron derivados desde Unidades de Consejo Genético pertenecientes a la sección de Cáncer Hereditario de la Sociedad Española de Oncología Médica. Esto determina que a pesar de los criterios de inclusión estrictos, en estas pacientes se consideró en los centros en los que se les atendió su valoración por una Unidad de Consejo Genético. En este sentido, se hubiera evitado el sesgo de selección si se hubiera llevado a cabo un estudio de tipo poblacional. 3. Estudio anatomopatológico de cáncer de mama triple negativo no centralizado. 128 Discusión El diagnostico de cáncer de mama triple negativo se realizó en cada uno de los hospitales de referencia que intervinieron en el estudio. No se realizó una determinación centralizada, lo que hubiera aportado mayor calidad al diagnostico. 4. No se reporta la realización de estudio de mutaciones germinales en BRCA2. En este estudio no se realizó la determinación de mutaciones germinales de BRCA2. Hartmann 100 detecta en su cohorte una prevalencia de mutaciones germinales en BRCA2 que es mayor de lo esperado. Young et al 93 identificaron una mutación patogénica en BRCA2 en su cohorte de 54 pacientes diagnosticadas antes de los 40 años y sin historia familiar de riesgo. En nuestra cohorte el estudio de mutaciones germinales debería ofrecerse a las pacientes menores de 30 años y a las que tengan una historia familiar no-informativa y no sean portadoras de mutación patogénica en BRCA1. 5. La sensibilidad de los métodos de estudio de mutaciones en BRCA1. Las técnicas empleadas (DHLPA, secuenciación y MLPA) en el estudio de mutaciones germinales en BRCA1 proporcionan en conjunto una elevada sensibilidad (en torno al 99%), pero no es del 100%. En cualquier caso, esta limitación de la sensibilidad es asumida en el resto de trabajos publicados sobre cáncer de mama hereditario. Se observaron 3 variantes de significado incierto de BRCA1, de las cuales desconocemos su valor patógeno. Existen diversos métodos que permiten determinar el carácter patógeno o no de estas variantes como son los estudios de cosegregación o estudios de funcionalidad de la proteína entre otros. Ninguno de estos métodos se aplicó en estas variantes detectadas por lo que no han sido reclasificadas. 129 6 66 6 - -- - CONCLUSIONES CONCLUSIONESCONCLUSIONES CONCLUSIONES Asociación de mutaciones germinales en BRCA1 y cáncer de mama triple negativo diagnosticado antes de los 50 años y sin historia familiar Conclusiones 1. La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en 92 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama triple negativo antes de los 50 años y sin historia familiar de riesgo es de 7,3%. 2. A las pacientes diagnosticadas de cáncer de mama triple negativo antes de los 50 años, incluso en ausencia de historia familiar de riesgo, se les debe ofrecer la realización de estudio de mutaciones germinales en BRCA1. 3. En la cohorte estudiada no existe una asociación entre las variables tipo de historia familiar y presencia de mutación germinal en BRCA1 estadísticamente significativa (Test de Fisher, p= 0,121). La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en el subgrupo de 38 pacientes con historia familiar no informativa fue de 13,15% y en el subgrupo de 54 con historia familiar informativa fue 3,70%. 4. En la cohorte estudiada no existe una asociación entre las variables edad al diagnóstico y presencia de mutación germinal en BRCA1 estadísticamente significativa (Test de Fisher, p= 0,631). La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en el subgrupo de 19 pacientes con edad inferior a 35 años fue de 10,52% y en el subgrupo de 73 de 35 años o más fue de 6,84%. 5. En la cohorte estudiada no existe una asociación entre las variables estadio tumoral y presencia de mutación germinal en BRCA1 estadísticamente significativa (Test de Fisher, p= 0,079). La prevalencia de mutaciones 133 Conclusiones germinales en BRCA1 en el subgrupo de 56 pacientes con estadio inicial (I-II) fue de 3,5% y en el subgrupo de 17 con estadio avanzado (III-IV) fue de 17,64%. 6. En la cohorte estudiada no existe una asociación entre las variables grado histológico y presencia de mutación germinal en BRCA1 estadísticamente significativa (Test de Fisher, p= 0,384). La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en el subgrupo de 7 pacientes con grado histológico bajo/moderado fue de 14,28% y en el subgrupo de 41 con grado histológico alto, fue de 4,8%. 7. En la cohorte estudiada no existe una asociación entre las variables EGFR y presencia de mutación germinal en BRCA1 estadísticamente significativa (Test de Fisher, p= 0,550). La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en el subgrupo de 17 pacientes con EGFR positivo fue de 0% y en el subgrupo de 42 con EGFR negativo fue de 7,14%. 8. En la cohorte estudiada no existe una asociación entre las variables citoqueratina 5/6 y presencia de mutación germinal en BRCA1 estadísticamente significativa (Test de Fisher, p= 0,146). La prevalencia de mutaciones germinales en BRCA1 en el subgrupo de 41 pacientes con citoqueratina 5/6 positiva fue 9,75% y en el subgrupo de 27 con citoqueratina 5/6 negativa fue de 0%. 134 Bibliografía 18 Saslow D, Boetes C, Burke W, et al. American Cancer Society Guidelines for Breast Screening with MRI as an adjunct to mamography. CA Cancer J Clin 2007;57(2):75. 19 Hammon S, Keyhai-Rofagha S, O´Toole R. Statistical analysis of fine needle aspiration of the breast: a review of 678 cases plus 4265 cases from the literature. Acta Cytol 1987;31:276. 20 Morrow M, Venta L, Stinson T, Bennett C. Prospective comparation of sterotactic core biopsy and surgical excision as diagnostic proceduces for breast patients. Ann Surg 2001;233(4):537. 21 Edge SB, Byrd DR, Comptton CC, et al., eds. AJCC Cancer Staging Manual, 7 th Edition. New York: Springer, 2010. 22 D´Eredita G., Giardina C., Martellotta M., et al. Prognosic factors in breast cancer: The predictive value of the Nottingham Prognostic Index in patients with a long-term follow-up that were treated in a single institution. Eur J Cancer, 2001; 37:591-6. 23 Perou Ch., S.T., Elsen M., et al. Molecular portraits of human breast tumors. Nature 2000. 406: p. 747-752. 24 Van´tVeer L.J., D.H., van de Vivjer et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cáncer. Nature 2002. 415:p.530-536. 25 Nielsen T., H.F.D., P.C., Jensen K., et al. Inmunohistochemical and clinical characterization of the basal like subtype of invasive breast carcinoma. Clinical Cancer Research, 2004. 10:p. 5367-5374. 26 CharafeJauffret E., G.C., Monville F et al., Gene expression profiling of breast cancer cell lines identifies potential news basal markers. Oncogene, 2006. 25: p 22732284. 141 Bibliografía 27 Livasy C.A., K.G., Nanda R., et al., Phenotipic evaluation of the basal likesubtype of invasive breast cancinoma. Modern Pathology, 2006. 19:p. 530-536. 28 Turner N., R.-F.J.,Rusell et al. BRCA1 dysfunctionin sporadic basal like breast cancer. Oncogene, 2007. 26: p. 2126-2132. 29 Fisher B, Bauer M, Wickerham DL et al. Relation of the number of positive axillary nodes to the prognosis of patients with primary breast cancer. An NSABP update. Cancer 1983;52:1551-1557. 30 Fant JS, Grant MD, Knox SM et al. Preliminary outcome analysis in patients with breast cancer an a positive sentinel lymph node who declined axillary dissection Ann SurgOncol 2003;10:126-130. 31 Rosen PP, Groshen S, Kinne DW et al. Factors influencing prognosis in node negative breast cancinoma: analysis of 767 T1N0M0/T2N0M0 patients with long term follow-up. J ClinOncol 1993;11:2090-2100. 32 Mohammed RA, Martín SG, Gill MS et all. Improved methods of detection of lymphovascular invasion demonstrate that it is the predominant method of vacular invasion in breast cancer and as important clinical consequences. Ann Surg Pathol 2007; 31:1825-1833. 33 Fisher B, Redmond C, Fisher ER et al. Relative worth of estrogen or progesterone receptor and pathologic characteristics of differenciation as indicators of prognosis in node-negative breast cancer patients. Findings from National Surgical Adjuvant Breast Cancer and Bowel Project Protocol B-06. J Clin Oncol 1988; 6:176-187. 34 Lower EE, Glass EL, Bradley DA et all. Impact of metastatic estrogen receptor and progesterone receptor status on survival. Breast Cancer Res Treat 2005;90:65-70. 142 Bibliografía 35 Early Breast Cancer Trialists´Colaboratie Group (EBCTCG). Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15years survival: an overwiew of randomiced trials. Lancet 2005;365:1687-1717. 36 Slamon DJ, Clark GM, Wong SG et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER2/neu oncogene. Sciencie 1987;235:177-182. 37 Slamon DJ, Godolphin W, Jones SG et al. Studies of the Her2/neu proto-oncogen in human breast and ovarian cancer. Science 1989;244.707-712. 38 Gusterson BA, Gelber RD, Goldhirsch et al. Prognostic importance of c-erbB2 expression of breas cancer. International Breast Cancer Study Gruop. J. Clin Oncol 1992;10:1049-1056. 39 Stuart-Harris R, Caldas C, Pinder SE, Pharoah P. Proliferation markers and survival in early breast cancer: a systematic review and meta-analysis of 85 studies in 32825. Breast 2008;17:323-34. 40 Albain KS, Barlow WE, Shak S et al. Prognostic and predictive value of the 21-gene recurrence score assay in postmenopausal women with node positive, estrogen receptor positive breast cancer on chemotherapy: a retrospective analysis of a randomized trial. Lanced Oncol 2010;11(1):55-65. 41 Goldgar DE, Easton DF, CannotAlbright LA et al. Systematic population based assesment of cancer risk in fist degree relatives of cancer probands. J Natl Cancer Inst 1994;86:1600-8. 42 Claus EB, Schildkraut JM, Thompson WD, Risch NJ. The genetic atributable risk of breast cancer and ovarian cancer. Cancer 1996;77(11):2318-2324. 43 Ford D, Easton DF, Stratton M, Narod S, Goldgar D, Devilee P, Bishop DT, Weber B, Lenoir G, ChangClaude J, Sobol H, Teare MD, Struewing J, Arason A, Scherneck S, Peto J, Rebbeck TR, Tonin P, Neuhausen S, Barkardottir R, Eyfjord J, Lynch H, 143 Bibliografía Ponder BA, Gayther SA, Zelada-Hedman M, et al. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cáncer families. The Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Hum Genet. 1998 Mar;62(3):676-89. 44 Spiegelman AD, Murday V, Phillips RK et al. Cancer and the Peutz-Jehgers Syndrome. Gut 1989;30:1588-1590. 45 Johnson N,Fletcher O,Palles C et al.Counting potentially functional variants in BRCA1, BRCA2 and ATM predicts breast cancer susceptibility. Hum Mol Genet 2007;16:1051-7. 46 Vahteristo P,Bartkova J, Eerola H et al. A CHEK2 genetic variant contributing to a substantial fraction of familiar breast cancer. Am J Hum Genet 2002;71:432-8. 47 Ghoussaini G, Pharoah PDP. Polygenic susceptibility to breast cáncer: current state of the art. FutureOncol 2009;5689-701. 48 Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science 1994;266:66-71. 49 Easton D, Bishop D, Ford D et al. Breast cancer linkage consortium. Genetic linkage analysis in familial breast and ovarian cancer:Results from 214 families. Am J HumGenet 1993;52:678-701. 50 Wooster R, Bignell G, Lancaster J, et al.Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature 1995;378:789-92. 51 Pluta RM, Golub RM (2011) JAMA patient page. BRCA genes and breast cancer. JAMA 305(21):224. 52 Huen MS, Sy SM, Chen J. BRCA1 and its toolbox for the maintenance of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:138-48. 144 Bibliografía 53 Thorslund T, West SC. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 2007;26:7720-30. 54 Elledge SJ, Amon A. The BRCA1 suppressor hypothesis: an explanation for the tissue-specific tumor development in BRCA1 patients. Cancer Cell 2002;1:129-32. 55 BIC: http://research.nhgri.nih.gov/bic. 56 Simard J, Tonin P, Durocher F, Morgan K, Rommens J, Gingras S, Samson C, Leblanc JF, Belanger C, Dion F et al. Common origins of BRCA1 mutation in Canadian breast and ovarian cancer families. Nat Genet 1998; 8:392-8. 57 Oddoux C, Struewing JP,Clayton CM, Neuhausen S, Brody LC, Kaback M, Haas B, Norton L, Borgen P, Jhanwar S, Goldgar D, Ostrer H and Offit K. The carrier frequency of the BRCA2 6174delT mutation among Ashkenazi Jewish individuals is approximately 1%. Nat Genet 1996;12:188-90. 58 Goldgar DE, Easton DF, Deffenbaugh AM et al. Breast cancer information Core (BIC)Steering Committee. Integrated evaluation of DNA sequence variants of unknown clinical significance: application to BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet 2004;75:535-44. 59 Ford D, Easton DF, Bishop DT, Narod SA, Goldgar DE (1994) Risks of cancer in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. Lancet 343:692–695. 60 Guillem JG, Wood WC, Moley JF, Berchunck A, Karlan BY, Mutch DG, Gagel RF, Weitzel J, Morrow M, Weber BL, Giardiello F, Rodriguez-Bigas MA, Church J, Gruber S, Offit K; ASCO; SSO. ASCO/SSO review of current role of risk-reducing surgery in common hereditary cancer syndromes. J. Clin Oncol 2006 Oct 1;24(28):4642-60. 61 Antoniou A, Pharoah PD, Narod S et al. Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case. Series unselected for 145 Bibliografía family history: a combined analysis of 22 studies. Am J Hum Genet.2003;72:11171130. 62 Thompson D,Easton DF. Cancer Incidence in BRCA1 mutation carriers, J Natl Cancer Inst.2002;94:1358-1365. 63 Cancer risk in BRCA2 mutation carriers. The Breast Cancer Linkage Consortium. J Natl Cancer Inst. 1999;91:1310-1316. 64 Gerhardus A, Schleberger H, Schlegelberger B and Gadzicki D. Diagnostic accuracy of methods for the detection of BRCA1 and BRCA2 mutations: a systematic review. Eur J Hum Genet 2007;15:619-627. 65 Tejada I, Martinez C. Técnicas de diagnostico molecular. En: Cáncer hereditario, Madrid, Dispublic: 2006. 66 Yoshikawa K, Honda K, Inamoto T, Shinohara H, Yamauchi A, Suga K, Okuyama T, Shimada T, Kodama H, Noguchi S, Gazdar AF, Yamaoka Y, Takahashi R. Clin Cancer Res. Reduction of BRCA1 protein expression in Japanese sporadic breast carcinomas and its frequent loss in BRCA1 associatec cases. 1999 Jun;5(6):1249-61. 67 Hoya MDI. Documento de consenso sobre cáncer de mama hereditario. Documentos de consenso en cáncer hereditario. Madrid: Dispublic, 2004:13-5. 68 Eccles DM, Evans DG, Mackay J. Guidelines for a genetic risk based approach to advising women which a family history of breast cancer. UK Cancer Family Study Group (UKCFSG). J Med Genet 2000; 37:203-9. 69 Guía clínica SEOM cáncer hereditario. Clin Transl Oncol (En prensa). 70 Evans DG. J Med Genet 2005;41:474-80. 146 Bibliografía 71 www.swed.edu/home_pages/cancergene 72 www.srl.cam.ac.uk./genepi/boadicea_home.html 73 James PA, Doherty R, Harris M, Mukesh BN, Milner A, Young MA, Scott C. Optimal selection of individuals for BRCA mutation testing: a comparison of available methods. J Clin Oncol. 2006 Feb 1;24(4):707-15. 74 Weitzel JN et al. Limited family structure and BRCA gene mutation status in single cases of breast cancer. JAMA. 2007 Jun 20;297 (23):2587-95. 75 Mavaddat N, Rebbeck TR, Lakhani SR, Easton DF and Antonis C Antoniou AC. Incorporating tumour pathology information into breast cancer risk prediction algorithm. Breasy cancer Research 2010,12:R28. 76 Lynch BJ, Holden JA, Buys SS, Neuhausen SL, Gaffney DK. Pathobiologic characteristics of hereditary breast cancer. Hum Pathol. 1998;29:1140-1144. 77 Ford D et al. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cáncer families. The Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Hum Genet. 1998 Mar;62(3):676-89. 78 Palacios J et al. Phenotypic characterization of BRCA1 y BRCA2 tumors based in a tissue microarray study with 37 immunohistochemical markers. Breast Cancer Res Treat. 2005Mar;90(1):5-14. 79 Eerola et al. Histopathological features of breast tumor in BRCA1, BRCA2 and mutation-negative breast cancer families. Breast Cancer Res 2005;7(1):R93-100. 147 Bibliografía 80 Atchley DP, Albarracin CT, Lopez A, Valero V, Amos CI, Gonzalez-Angulo AM, Hortobagyi GN, Arun BK (2008) Clinical and pathologic characteristics of patients with BRCA-positive and BRCA-negative breast cancer. J Clin Oncol 26:4282–4288. 81 Foulkes WD et al. Germinale BRCA1 mutations and basal epithelial phenotype breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003 Oct 1;95(19):º482-5. 82 Lakhani SR et al. Prediction of BRCA1 status in patients with breast cancer using estrogen receptor and basal phenotype.Clin Cancer Res 2005 July; 11(14)5175-80. 83 Foulkes WD et al. Estrogen receptor status in BRCA1 and BRCA2 related breast cancer: the influence of age and histological type. Clin Cancer Res 2004 Mar 15; 10(6):2029-34. 84 Eerola HP, Heikkilä P, Tamminen A, Aittomäki K, Blomqvist C, Nevanlinna H. Relationship of patients' age to histopathological features of breast tumours in BRCA1 and BRCA2 and mutation-negative breast cancer families. Breast Cancer Res. 2005;7(4):R465-9 85 Vaziri SA, Krumroy LM, Elson P, Budd GT, Darlington G, Myles J, Tubbs RR, Casey G. Breast tumor immunophenotype of BRCA1-mutation carriers is influenced by age at diagnosis. Clin Cancer Res. 2001 Jul;7(7):1937-45. 86 Eisinger F, Nogues C, Guinebretiere JM et al (1999) Novel indications for BRCA1 screening using individual clinical and morphological features. Int J Cancer 84(3):263–267. 148 Bibliografía 87 Collins LC, Martyniak A, Kandel MJ et al (2009) Basal cytokeratin and epidermal growth factor receptor expression are not predictive of BRCA1 mutation status in women with triple-negative breast cancers. Am J Surg. 88 Farshid G, Balleine RL, Cummings M, Waring P (2006) Morphology of breast cancer as a means of triage of patients for BRCA1 genetic testing. Am J Surg Pathol 30(11):1357–1366 89 Lidereau R, Eisinge , Champeme MH, Nogues C, Bieche I, Birnbaum D, Pallud C, Jacquemier J, Sobol H. Major improvement in the efficacy of BRCA1 mutation screening using morphoclinical features of breast cancer. Cancer Res. 2000 Mar 1;60(5):1206-10. 90 Chang J, Hilsenbeck SG, Sng JH, Wong J, Ragu GC. Pathological features and BRCA1 mutation screening in premenopausal breast cancer patients. Clin Cancer Res. 2001 Jun;7(6):1739-1. 91 Foulkes WD, Stefansson IM, Chappuis PO, Begin LR, Goffin JR, Wong N, Trudel M, Akslen LA. Germline BRCA1 mutations and a basal epithelial phenotype in brast cancer. JNatl Cancer Inst. 2003 Oct 1;95(19):1482-5. 92 Kadel MJ. Prevalence of BRCA1 mutations in triple negative breast cancer. Proc Annual Meeting ASCO 2006, Abs. 508. 93 Young SR, Pilarski RT, Donenberg T, Shapiro C, Hammond LS, Miller J, Brooks KA, Cohen S, Tenenholz B, DeSai D, Zandvakili I, Royer R, Li S and Narod SA. The prevalence of BRCA1 mutations among young women with triple-negative breast cancer. BMC Cancer 2009, 9:86. 149 Bibliografía 94 F. Fostira, M. Tsitlaidou, H. Gogas, M. Pertesi, D. Yannoukakos, E. Bournakis, V. Karavassilis, P. Skarlos, I. Konstantopoulou and G. Fountzilasv. Prevalence of BRCA1 mutations among 284 women with triple negative breast cancer.Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition).Vol 28, No 15_suppl (May 20 Supplement), 2010: 1511. 95 C. Saura, G. Sánchez-Ollé, N. Bosch, N. Gadea, M. Masas, A. Tenes, S. GutierrezEnríquez, O. Díez, J. Baselga, J. Balmaña. High prevalence of BRCA1/2 germline mutations in female breast cancer patients with triple-negative phenotype. J Clin Oncol 28:15s, 2010 (suppl; abstr 1534). 96 Gonzalez-Angulo AM, Timms KM, Liu S, Chen H, Litton JK, Potter J, Lanchbury JS, Stemke-Hale KA, Hennessy B, Arun BK, Hortobagyi GN, Do KA, Mills GB, MericBernstam F. Incidence and outcome of BRCA mutations in unselected patients with triple receptor-negative breast cancer. Clin Cancer Res 2011;17:1082-9. 97 Evans DG, Howell A, Ward D, Lalloo F, Jones JL, Eccles DM. Prevalence of BRCA1 and BRCA2 mutations in triple negative breast cancer. J Med Genet 48:520-522. 98 Comen E, Davids M, Kirchhoff T, Hudis C, Offit K, Robson M. Relative contributions of BRCA1 and BRCA2 mutations to "triple-negative" breast cancer in Ashkenazi Women. Breast Cancer Res Treat. 2011 Aug;129(1):185-90. Epub 2011 Mar 11. 99 L Robertson, H Hanson, S Seal ET AL. BRCA1 testing should be offered to individuals with triple-negative breast cancer diagnosed below 50 year. British Journal of Cancer 106, 1234-1238. 150