Repositorio Institucional de Documentos

2013 85 Beatriz Lagunas Castán Caracterización molecular y celular de la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados en plantas y su relación con la producción de oxilipinas Departamento Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Alfonso Lozano, Miguel Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Beatriz Lagunas Castán CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y CELULAR DE LA BIOSÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS EN PLANTAS Y SU RELACIÓN CON LA PRODUCCIÓN DE OXILIPINAS Director/es Bioquímica y Biología Molecular y Celular Alfonso Lozano, Miguel Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Estación Experimental de Aula Dei Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Tesis Doctoral Caracterización molecular y celular de la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados en plantas y su relación con la producción de oxilipinas Memoria presentada por Dña. Beatriz Lagunas Castán, Licenciada en Bioquímica, para optar al grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza Zaragoza, 2013 i ABREVIATURAS ABA Ácido abscísico ACC Acetil-CoA carboxilasa ACP Proteína transportadora de acilos ADP Difosfato de adenosina ANA Ácido naftalenico AOC Óxido de aleno ciclasa AOS Óxido de aleno sintasa APS Persulfato amónico ATP Trifosfato de adenosina BC Biotina carboxilasa BCCP Proteína portadora de biotina β-MeOH β-mercaptoetanol BSA Albúmina sérica bovina cDNA DNA complementario CDP Difosfato de citosina Chl Clorofila CL Cloroplasto CoA Coenzima A COI Del inglés, CORONATINE INSENSITIVE Ct Ciclo umbral CT Biotina transcarboxilasa CTP Trifosfato de citosina DAG Diacilglicerol DAPI 4´-6-diamidino-2-fenilindol DEPC Dietilpirocarbonato DGDG Digalactosildiacilglicerol DHA Ácido docosahexaenoico DIC Contraste de interferencia diferencial DNA Ácido desoxirribonucleico DNasa Desoxirribonucleasa I dnOPDA Ácido dinor-12-oxo-fitodienoico DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EPA Ácido eicosapentaenoico ERF Factor de respuesta a etileno ET Etileno ii FAD Desaturasa de ácido graso FAS Ácido graso sintasa Fd Ferredoxina FID Detector de ionización de llama G3P Glicerol-3-fosfato GPAT Glicerol-3-fosfato aciltransferasa HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinaetanosulfónico HIK Histidina quinasa ICE1 Del Inglés, Inducer of CBF Expression JA Ácido jasmónico JAZ Del inglés, Jasmonate Zim-Domain KAS -cetoacil-ACP sintasa LB Medio Luria Bertani LHCII Complejo de antena mayoritaria del fotosistema II LOX Lipoxigenasa LPA Ácido lisofosfatídico LPAAT Lisofosfatidil aciltransferasa LTPs Proteínas de transporte de lípidos MCE Del Inglés, Mycobacterial Cell Entry MeJA Metil jasmonato MES Ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico MGDG Monogalactosildiacilglicerol mRNA RNA mensajero MS Medio Murashige-Skoog NAD+ Dinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado NADH Dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido NADP+ 2’-Fosfodinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado NADPH 2’-Fosfodinucleótido de nicotinamida y adenina reducido OPDA Ácido 12-oxo-fitodienoico ORF Marco abierto de lectura PA Ácido fosfatídico PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida PAP Fosfatidato fosfatasa PC Fosfatidilcolina PDH Piruvato deshidrogenasa PE Fosfatidiletanolamina PG Fosfatidilglicerol pI Punto isoeléctrico PI Fosfatidilinositol iii PS Fosfatidilserina PVDF Fluoruro de polivinilideno qRT-PCR PCR cuantitativa en tiempo real RACE Del ingles, Race amplification of cDNA ends RE Retículo endoplasmático RNA Ácido ribonucleico RNasa H Ribonucleasa H r.p.m revoluciones por minuto SA Ácido salicílico SCF Del inglés, SKP-Cullin-F-box SDS Dodecil sulfato de sodio SL Sulfolípido SQDG Sulfoquinovosildiacilglicerol TAG Triacilglicerol TEMED N, N, N’, N’-tetrametil-etil-N-diamina TGDG Trigalactosildiacilglicerol Tm Temperatura de hibridación Tricina N-tris(hidroximetil) metil glicina Tris (tris)-hidroximetil-amino metano UTR Región del mRNA que no se traduce UV Ultravioleta iv v ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1 1.1. LOS LÍPIDOS VEGETALES ................................................................................................................. 1 1.1.1. LÍPIDOS SIMPLES .......................................................................................................................... 1 1.1.1.1. Ácidos grasos ........................................................................................................................... 2 1.1.1.2. Ceras ......................................................................................................................................... 3 1.1.1.3. Triacilgliceroles ........................................................................................................................ 4 1.1.1.4. Oxilipinas ................................................................................................................................. 4 1.1.2. LÍPIDOS COMPLEJOS .................................................................................................................... 5 1.1.2.1. Esfingolípidos ........................................................................................................................... 5 1.1.2.2. Cardiolipina .............................................................................................................................. 6 1.1.2.3. Glicerolípidos ........................................................................................................................... 6 1.1.3. CLASES DE GLICEROLÍPIDOS VEGETALES ............................................................................ 9 1.1.3.1. Galactolípidos ........................................................................................................................... 9 1.1.3.2. Fosfolípidos .............................................................................................................................12 1.2. SÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS EN PLANTAS ...............................................................................15 1.3. SÍNTESIS DE LÍPIDOS DE MEMBRANA EN PLANTAS ................................................................18 1.3.1. DOS RUTAS DE SÍNTESIS ...........................................................................................................18 1.3.1.1. La ruta procariota ....................................................................................................................19 1.3.1.2. La ruta eucariota ......................................................................................................................21 1.3.1.3. Plantas 16:3 y plantas 18:3 ......................................................................................................24 1.4. DESATURASAS DE ÁCIDOS GRASOS ............................................................................................27 1.4.1. Características de las desaturasas de ácidos grasos ..........................................................................27 1.4.1.1. Secuencias conservadas en las desaturasas ..............................................................................33 1.4.1.2. Estructura y topología transmembrana ....................................................................................38 1.4.2. La reacción de desaturación .............................................................................................................45 1.4.3. Regulación de la actividad desaturasa ..............................................................................................47 1.4.3.1. Temperatura.............................................................................................................................47 1.4.3.2. Desarrollo de la planta .............................................................................................................54 1.5. TRANSPORTE DE LÍPIDOS ENTRE MEMBRANAS .......................................................................56 1.5.1. Transporte de ácidos grasos fuera del cloroplasto ............................................................................57 1.5.2. Transporte de lípidos del retículo endoplásmico al cloroplasto .......................................................58 1.5.3. Transporte de lípidos del cloroplasto al retículo endoplásmico .......................................................59 1.5.4. Transporte de lípidos desde la envuelta interna del cloroplasto al tilacoide.....................................60 1.5.5. Otros tipos de transporte ..................................................................................................................60 2. SITUACIÓN ACTUAL Y RETOS ............................................................................... 63 2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS BENEFICIOSOS PARA LA SALUD EN PLANTAS .........63 2.2. PRODUCCIÓN DE MATERIAS PRIMAS DE USO INDUSTRIAL (BIODIESEL) ..........................65 4 estrés (Beisson y col., 2012). Los tejidos con suberina, como la raíz, participan en la resistencia a patógenos, la hidratación y la nutrición mineral. Además de éstos, se han identificado en plantas otros polímeros similares, como la esporopolenina que recubre los granos de polen (Chen y col., 2011) y el cután (poli-hidrocarburo similar a la cutina), pero están mucho menos caracterizados (Villena y col., 1999). 1.1.1.3. Triacilgliceroles En las semillas, los lípidos pueden llegar a suponer el mayor almacén de carbono, conteniendo hasta un 60 % del peso seco (Ohlrogge y Browse, 1995). Los lípidos mayoritarios en este tejido son los triacilgliceroles (TAG), los cuales poseen tres moléculas de ácido graso esterificadas al glicerol, cada una en un átomo de carbono. Los triacilgliceroles (TAG) se denominan lípidos neutros porque carecen de zona polar (Somerville y col., 2000a) y actúan principalmente como moléculas de reserva energética en determinados momentos del desarrollo vegetal, suponiendo hasta un 25 % del aporte energético en la alimentación humana en países desarrollados (Chapman y Ohlrogge, 2012). 1.1.1.4. Oxilipinas Las oxilipinas son productos de oxidación de los ácidos grasos, entre los que se encuentra el ácido jasmónico, sus intermedios de síntesis y sus derivados. Mientras los lípidos más abundantes en plantas tienen función estructural o de reserva energética, otros ejercen una función como moléculas señalizadoras, como las oxilipinas. Una de las principales características de éstos es que se acumulan en baja cantidad en condiciones control y su síntesis se incrementa en determinadas condiciones de estrés (Testerink y Munnik, 2011) en respuesta a estímulos ambientales o endógenos. Su producción permite desencadenar cascadas de señalización que dan lugar a eventos celulares y respuestas fisiológicas. Los ácidos 5 grasos se transforman en oxilipinas en las células vegetales a través de una serie de reacciones que se llevan a cabo gracias a la coordinación de varios orgánulos, éstas son responsables de fenómenos como la elongación de la raíz, o la maduración del polen (McConn y Browse, 1996). Además, las oxilipinas pueden sustituir a los ácidos grasos en los glicerolípidos, formando los compuestos denominados Arabidópsidos (Andersson y col., 2006 ; Kourtchenko y col., 2007 ; Glauser y col., 2008 ; Glauser y col., 2009) que poseen efecto hormonal per se. Las oxilipinas se tratarán con mayor profundidad en el capítulo 4.3 de resultados “La oxilipina dnOPDA como fitohormona precursora del ácido jasmónico”. 1.1.2. LÍPIDOS COMPLEJOS 1.1.2.1. Esfingolípidos Los esfingolípidos componen un amplio grupo de estructuras moleculares en las que los ácidos grasos están unidos mediante un enlace amida a la esfingosina, y su forma más sencilla es la ceramida. Los esfingolípidos, que suponen menos del 5 % de los lípidos totales, se encuentran principalmente en la membrana plasmática celular (Somerville y col., 2000a). En ésta membrana pueden llegar a suponer más de un 40 % de los lípidos que la componen (Sperling y col., 2005). Las especies mayoritarias de esfingolípidos en plantas son los cerebrósidos (glucosilceramidas) y sus derivados más complejos. Éstos se encuentran en todas las membranas celulares excepto la plastidial y la mitocondrial (Sperling y col., 2005) y se relacionan con resistencia de las plantas al estrés oxidativo o al estrés por calor (Van Brocklyn y Williams, 2012). Su cuantificación ha sido frecuentemente subestimada debido a que se localizan en zonas resistentes a la acción de detergentes en la membrana plasmática, que podrían representar las unidades de 6 organización denominadas balsas lipídicas (Mongrand y col., 2004 ; Sperling y col., 2005). 1.1.2.2. Cardiolipina La cardiolipina es un lípido complejo que consta de dos unidades de fosfatidilglicerol (PG) unidas a través de una tercera molécula de glicerol, por eso es también denominada difosfatidilglicerol. En plantas también se ha detectado la presencia de cardiolipina. Del mismo modo que en animales su localización en las células vegetales parece restringirse a las membranas mitocondriales. En éstas puede llegar a suponer hasta un 30 % de los lípidos que componen sus membranas (Darwish y col., 2009). Se ha descrito el descenso de sus niveles en hojas sometidas a estrés salino aunque su función biológica no está todavía aclarada (Darwish y col., 2009). 1.1.2.3. Glicerolípidos Los glicerolípidos constituyen el grupo más abundante de lípidos presentes en las membranas vegetales. Las membranas son las barreras naturales entre células y también entre orgánulos subcelulares. En una célula se producen simultáneamente reacciones de carácter anabólico (de síntesis) y catabólico (de degradación). La diferente compartimentalización de éstas es vital para el funcionamiento celular global. A su vez, existen numerosas reacciones que se desarrollan en el interior de las membranas, como por ejemplo las que tienen lugar durante la fotosíntesis (captación de la luz solar y transferencia electrónica). Las membranas son también el entorno natural de las proteínas de membrana, que realizan funciones básicas para la célula vegetal. Desde un punto de vista fisiológico, la existencia de las membranas biológicas permite la formación del gradiente de protones clave para el mantenimiento de la bioenergética celular 7 (Peter, 1961; 1979), y determina los fenómenos de homeostasis iónica, de gran importancia a nivel celular. La estructura de los glicerolípidos se basa en un esqueleto de glicerol con dos ácidos grasos esterificados en las posiciones sn-1 y sn-2 (ver figura 1.1). Además, en la posición sn-3 tienen unido un tercer grupo de carácter polar, cuya identidad genera la variedad de glicerolípidos vegetales. La presencia en la misma molécula de una zona polar y otra apolar les aporta carácter anfipático y ésta propiedad les permite formar las bicapas celulares. Las principales clases de glicerolípidos que forman las membranas vegetales son los fosfolípidos, los galactolípidos y los sulfolípidos, dependiendo de si el sustituyente en posición sn-3 es un fosfato, una o varias moléculas de galactosa o una unidad de sulfoquinovosa, respectivamente. La estructura de los glicerolípidos y la naturaleza de sus sustituyentes están indicadas en la figura 1.1. Los galactolípidos y sulfolípidos se encuentran principalmente en las membranas de los cloroplastos, y los fosfolípidos en las membranas extraplastidiales (Somerville y col., 2000a). En determinadas condiciones de estrés, como la deficiencia de fosfato, algunos galactolípidos son capaces de sustituir a los fosfolípidos en las membranas extraplastidiales (Nakamura, 2013). 8 Figura 1.1 Estructura de las principales clases de glicerolípidos de membrana. Adaptada de Somerville y col., (2000a). La regulación de la síntesis de ácidos grasos y glicerolípidos, y del mantenimiento de las propiedades de las membranas (fluidez, composición O P O OO O P O OO Fórmula de Y H OH H H OH OHOH H H OHH OH OH H H OH OHOH H H OHH O HH CH2CH2N(CH3)3 + CH2CH2N(CH3)3 + CH2OCR CH2CHOH CH2O P O OO CH2 RCOCH O O CH2OCR CH2CHOH CH2O P O OO CH2 RCOCH O O CH2CHOH CH2O P O OO CH2 RCOCH O O CH2CHOHCH2OHCH2CHOHCH2OH Fórmula de X Nombre del lípido Nombre de X OH Agua Colina Etanolamina Serina Glicerol Fosfatidilglicerol mio-Inositol Sulfoquinovosa Galactosa Digalactosa Ácido fosfatídico (PA) Fosfatidilcolina (PC) Fosfatidiletanolamina (PE) Fosfatidilglicerol (PG) Fosfatidilserina (PS) Difosfatidilglicerol (cardiolipina) Fosfatidilinositol (PI) Sulfoquinovosildiacilglicerol O sulfolípido (SL) Monogalactosildiacilglicerol (MGDG) Digalactosildiacilglicerol (DGDG) Glicerofosfolípido (estructura general) Ácido graso saturado Ácido graso insaturado CH2O C O CH OC O XCH2Y CH2O C O CH OC O XCH2Y Sin grupo Y CH2CH2NH3 + CH2CH2NH3 + CH2CH COONH3 + CH2CH COONH3 CH2CH COONH3 + OHH OH CH2SO3H H OHH OO OHH OH CH2SO3H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H O OHH OH CH2OH H HH O H OH H OH CH2O H OH H OOOH OHH OH CH2OH H H O OHH OH CH2OH H HH O H OH H OH CH2O H OH H OOOH sn-1 sn-2 sn-3 O P O OO O P O OO Fórmula de Y H OH H H OH OHOH H H OHH OH OH H H OH OHOH H H OHH O HH CH2CH2N(CH3)3 + CH2CH2N(CH3)3 + CH2OCR CH2CHOH CH2O P O OO CH2 RCOCH O O CH2OCR CH2CHOH CH2O P O OO CH2 RCOCH O O CH2CHOH CH2O P O OO CH2 RCOCH O O CH2CHOHCH2OHCH2CHOHCH2OH Fórmula de X Nombre del lípido Nombre de X OH Agua Colina Etanolamina Serina Glicerol Fosfatidilglicerol mio-Inositol Sulfoquinovosa Galactosa Digalactosa Ácido fosfatídico (PA) Fosfatidilcolina (PC) Fosfatidiletanolamina (PE) Fosfatidilglicerol (PG) Fosfatidilserina (PS) Difosfatidilglicerol (cardiolipina) Fosfatidilinositol (PI) Sulfoquinovosildiacilglicerol O sulfolípido (SL) Monogalactosildiacilglicerol (MGDG) Digalactosildiacilglicerol (DGDG) Glicerofosfolípido (estructura general) Ácido graso saturado Ácido graso insaturado CH2O C O CH OC O XCH2Y CH2O C O CH OC O XCH2Y Sin grupo Y CH2CH2NH3 + CH2CH2NH3 + CH2CH COONH3 + CH2CH COONH3 CH2CH COONH3 + OHH OH CH2SO3H H OHH OO OHH OH CH2SO3H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H OHH OO OHH OH CH2OH H H O OHH OH CH2OH H HH O H OH H OH CH2O H OH H OOOH OHH OH CH2OH H H O OHH OH CH2OH H HH O H OH H OH CH2O H OH H OOOH sn-1 sn-2 sn-3 9 lipídica…) es muy importante para el correcto desarrollo celular. La diversidad de clases de lípidos y la conservación de su proporción en cada tipo de membrana a lo largo del reino vegetal hace pensar que éstas diferencias son importantes para la función de cada membrana (Ohlrogge y col., 1991 ; Moreau y col., 1998). De éste modo, el estudio de las rutas de síntesis y los mecanismos de regulación de las mismas es de gran interés en el campo de la biología vegetal. Al ser objeto principal de ésta Tesis Doctoral, se tratará en profundidad la función de los lípidos de membrana mayoritarios (fosfolípidos, glucolípidos y sulfolípidos) así como sus rutas de biosíntesis. El en apartado posterior “Situación actual y retos” de ésta Tesis Doctoral se tratarán las principales aplicaciones de los lípidos vegetales. En cada capítulo de resultados y discusión se expondrá una breve introducción específica del tema. 1.1.3. CLASES DE GLICEROLÍPIDOS VEGETALES 1.1.3.1. Galactolípidos La diferencia fundamental en la composición lipídica de las membranas vegetales respecto a las de animales y hongos, es la presencia de los galactolípidos (Somerville and Browse, 1991). Los principales galactolípidos son el monogalactosildiacilglicerol (MGDG), el digalactosil-diacilglicerol (DGDG) y el sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG). Los galactolípidos pueden llegar a representar un 50% de los lípidos en hojas (Benning y Ohta, 2005) y un 75% de los lípidos cloroplásticos (Dörmann y Benning, 2002). De ellos, los más abundantes son el MGDG y el DGDG. Un galactolípido consta de dos ácidos grasos esterificados al glicerol en posiciones sn-1 y sn-2. En posición sn-3 se encuentran covalentemente unidas una 10 o dos moléculas de galactosa dando lugar a los principales tipos de galactolípidos (ver figura1.1). Se ha descrito también la presencia de otros compuestos derivados de éstos galactolípidos, como el trigalactosil-diacilglicerol (TGDG) y el tetragalactosil-diaclilglicerol. Éstos se han detectado in vivo en determinadas circunstancias, como por ejemplo en los mutantes tgd de Arabidopsis (Xu y col., 2003 ; Roston y col., 2012 ; Wang y col., 2012). Los galactolípidos poseen en su mayoría ácidos grasos con altos niveles de insaturación. En ellos, el ácido - linolénico (18:39,12,15) puede llegar a constituir hasta un 90 % de los ácidos grasos que los componen (Somerville y col., 2000a). La construcción de las membranas tilacoidales a través de galactolípidos permite a las plantas sintetizarlas de un modo independiente a la incorporación de fosfato (Frentzen, 2004). Esto supone una ventaja adaptativa ya que el fósforo es un macronutriente vegetal limitante en el crecimiento de las plantas (Raghothama, 1999). Aunque la presencia de la mayoría de galactolípidos se restringe a las membranas tilacoidales, es cada vez más aparente que, al menos el DGDG, se encuentra también en las membranas extraplastidiales en tejidos no fotosintéticos y en condiciones de deficiencia de fosfato (Dörmann y Benning, 2002 ; Benning y Ohta, 2005). Al ser inusuales en otros tipos de membranas, la elevada abundancia de estos lípidos en las membranas tilacoidales se ha relacionado siempre con la actividad fotosintética llevada a cabo en éstas. Sin embargo, hasta hace pocos años, se desconocía si su función se limitaba a rodear a los complejos fotosintéticos o formaban parte de la estructura de los mismos. El aislamiento de los mutantes mgd1 (Jarvis y col., 2000) y dgd1 (Dörmann y col., 1995), deficientes en la síntesis de MDGD y DGDG respectivamente, la caracterización de sus alteraciones en la ultraestructura del cloroplasto y en su capacidad fotosintética, indicaba un papel más relevante más allá de la mera función estructural en las membranas. La 11 posterior cristalización del fotosistema I (PSI) reveló que cada monómero de PSI contiene tres moléculas de PG y una de MGDG (Jones, 2007). En el caso del fotosistema II (PSII), su cristalización reveló que en su estructura, se englobaban hasta 25 moléculas de lípido (11 de MGDG, 7 de DGDG, 5 de SQDG y 2 de PG) (Guskov y col., 2009). Todos estos lípidos establecen interacciones (principalmente mediante puentes de hidrógeno) con diversas subunidades de los complejos fotosintéticos. En el trabajo de Holzl y col., (2006) la sustitución de la actividad galactosil-transferasa en el mutante dgd1 (deficiente en galactolípidos) por la actividad glucosil-transferasa provocaba la acumulación de glucolípidos en los tilacoides, eliminando los problemas de crecimiento encontrados en este mutante. Sin embargo, esta sustitución sólo conseguía restaurar parcialmente las deficiencias fotosintéticas descritas para el mutante dgd1. Estos hallazgos sugieren que los galactolípidos establecen interacciones con los complejos fotosintéticos a través de su grupo sustituyente. Además éstos estudios revelan que su presencia en las membranas tilacoidales es necesaria para la máxima eficiencia fotosintética en plantas (Holzl y col., 2006). Se han intentado obtener mutantes de Arabidopsis que no sinteticen ningún galactolípido, como el doble mutante tgd1-1/ats1, sin embargo no ha sido posible obtener semillas viables de éste genotipo (Xu y col., 2005). Esto sugiriere que los galactolípidos son necesarios para la viabilidad vegetal, incluso durante el desarrollo de la semilla (Xu y col., 2005). En plantas, sólo se ha detectado la presencia de un tipo de sulfolípido. Éste es el sulfoquinovosil-diacilglicerol (SQDG) y su estructura es muy similar a la del MGDG, pero posee además un grupo sulfurado unido al carbono 6 de la galactosa (ver figura 1.1) (Somerville y col., 2000a). La presencia de SQDG está restringida al cloroplasto y se acumula en bajas cantidades en condiciones normales de crecimiento (aproximadamente un 5 %). Se han encontrado moléculas de SQDG rodeando al fotosistema II (Jones, 2007). Además, éste sulfolípido es indispensable 12 en determinadas situaciones de estrés como la deficiencia de fosfato (Shimojima, 2011). Bajo esta condición, la cantidad de SQDG aumenta considerablemente (como también lo hace el DGDG). El aumento de SQDG parece destinado a sustituir parcialmente la función del fosfatidilglicerol (PG) plastidial (Nakamura, 2013). Esto se debe a que ambos tienen carácter aniónico. La presencia de lípidos con carácter aniónico en los tilacoides se encuentra directamente relacionada con la capacidad fotosintética de los mismos (Yu y Benning, 2003). 1.1.3.2. Fosfolípidos Son glicerolípidos en los cuales el grupo polar está unido a través de un grupo fosfato en la posición sn-3. El origen de éste grupo polar permite diferenciar los tipos de fosfolípidos: ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y fosfatidilinositol (PI) y (ver figura 1.1). De todos ellos, PC y PE son los fosfolípidos vegetales más abundantes, y juntos representan aproximadamente el 50 % de los glicerolípidos extraplastidiales. Tanto el PA, como el PG y la PC se pueden encontrar en las membranas plastidiales y en las extraplastidiales (Browse y col., 1986b ; Dorne y Heinz, 1989 ; Moreau y col., 1998 ; Andersson y col., 2001). El resto de fosfolípidos están presentes exclusivamente en las membranas extraplastidiales. Cada vez se relacionan de manera más evidente los fosfolípidos con la señalización celular. Los eventos de señalización celular suelen desencadenarse tras la identificación de una señal por un receptor que habitualmente es una proteína de membrana. La activación de estos receptores se suele traducir, directa o indirectamente, en la actividad de determinadas enzimas (fosfolipasas o kinasas) que convierten a los fosfolípidos en segundos mensajeros, actuando éstos como moléculas señalizadoras (Meijer y Munnik, 2003). 13 El ácido fosfatídico (PA) es una molécula intermediaria en la síntesis de glicerolípidos que se puede producir tanto en el cloroplasto como en el retículo endoplásmico. Además, el PA es un componente más del mecanismo molecular que provoca el cierre estomático como respuesta de las plantas a la sequía y a la salinidad (Hong y col., 2010), y actúa como molécula señalizadora junto al ácido abscísico (ABA). Los niveles de PA en la mayoría de tejidos no superan el 1 %, sin embargo, éstos cambian rápidamente en diferentes condiciones. La magnitud del cambio es variable dependiendo del tratamiento y del tejido en cuestión (Hong y col., 2010). Por ejemplo, se ha descrito la acumulación de PA durante el desarrollo de tejidos como la raíz o el tubo polínico y también en procesos como la aclimatación al frío o el estrés por patógenos (Testerink y Munnik, 2011). El fosfatidilglicerol (PG) es un fosfolípido aniónico presente en todos los tipos de membrana y siempre se encuentra en bajas cantidades. Su síntesis se lleva a cabo en la envuelta interna cloroplástica, en la membrana interna mitocondrial y en el retículo endoplásmico (Frentzen, 2004). El PG plastidial se encuentra formando parte de las membranas tilacoidales (Moreau y col., 1998) en las cuales establece interacciones con los complejos fotosintéticos (Jones, 2007). Su presencia en los tilacoides es esencial para la función fotosintética (Sato y col., 2000 ; Jones, 2007 ; Guskov y col., 2009). El PG plastidial contiene el único ácido graso de configuración trans; Δ-9 trans-hexadecénico (16:1t) en posición sn-2 (Dubacq y Tremolieres, 1983 ; Dörmann, 2005). La fosfatidilcolina (PC) es el fosfolípido más abundante en las membranas vegetales (Somerville y col., 2000a). Su presencia está vinculada al retículo endoplásmico y a la envuelta externa del cloroplasto. Sin embargo también se ha detectado PC en las membranas tilacoidales de determinadas especies (Andersson y col., 2001). Su principal función es la constitución de las membranas extraplastidiales, aunque también podría estar relacionada con la remodelación de 20 En esta ruta participan las enzimas glicerol-3-fosfato aciltransferasa (ATS1) y 1acilglicerol-3-fosfato aciltransferasa (LPAAT), localizadas en la envuelta interna del cloroplasto (Li Beisson y col., 2010) las cuales se encargan de incorporar sucesivamente dos ácidos grasos al esqueleto de glicerol dando lugar al ácido fosfatídico (PA). El PA puede ser posteriormente transformado a fosfatidilglicerol (PG) o a diacilglicerol (DAG). La transformación a DAG la realiza una fosfatidato fosfatasa (PP) localizada en la envuelta interna del cloroplasto (Ohlrogge y col., 1991). El DAG se puede transformar a su vez en MGDG o en SQDG. El DGDG se sintetiza desde el MGDG bien por galactosilación del MGDG (con UDP-Galactosa) o por transferencia directa de galactosa entre dos moléculas de MGDG (Vanbesouw y Wintermans, 1978 ; Siebertz y col., 1980). Las enzimas que producen MGDG, DGDG o SQDG son, MGDG, DGDG o SQDG sintasas respectivamente, y utilizan UDP-galactosa ó UPD-sulfoquinovosa para su síntesis. Estas enzimas, que pertenecen a familias multigénicas, se han localizado también en las envueltas del cloroplasto (Froehlich y col., 2001a ; Xu y col., 2005 ; Benning, 2008). La transferencia directa de unidades de galactosa entre galactolípidos la realiza una galactolípido-galactolípido galactosil-transferasa (Benning y Ohta, 2005), la cual se relaciona también con la síntesis de derivados galactosilados del DGDG, el trigalactosil-diacilglicerol y el tetragalactosil-diacilglicerol. En una hoja de Arabidopsis, aproximadamente un tercio del fósforo se encuentra formando parte de los fosfolípidos. Como se ha visto en el apartado 1.1.3.1, en condiciones de deficiencia de fosfato el DGDG es exportado a las membranas extraplastidiales (plasmática, mitocondrial y tonoplasto). De este modo se evita el consumo de fosfato destinado a la síntesis de lípidos de membrana (fosfolípidos extraplastidiales) (Shimojima, 2011). La síntesis de DGDG en condiciones de deficiencia de fosfato parece provenir de la actividad de enzimas 21 diferentes (MGD2, MGD3 y DGD2) a las que actúan en condiciones control (MGD1 y DGD1) (Benning y Ohta, 2005). Se ha observado que a pesar de tener la misma función, no son intercambiables. Concretamente, se ha descrito que la enzima MGD1 es capaz de funcionar con igual eficiencia sobre DAG procariota y eucariota, mientras que MGD2 y MGD3 tienen preferencia como sustrato por el diacilglicerol (DAG) proveniente de la ruta eucariota (Benning y Ohta, 2005). Los ácidos grasos que forman parte de los glicerolípidos sintetizados a través de la ruta procariota son desaturados una vez que están esterificados al glicerol fundamentalmente debido a la acción de las desaturasas plastidiales. 1.3.1.2. La ruta eucariota En la ruta eucariota los ácidos grasos sintetizados de novo en el cloroplasto abandonan el orgánulo en forma de derivados de acil-CoA debido a la acción de una enzima tioesterasa. Estos ácidos grasos son transportados principalmente hasta el retículo (Slack y Roughan, 1975 ; Slack y col., 1976 ; Simpson y Williams, 1979 ; Dubacq y Tremolieres, 1983) a través de un mecanismo molecular que a día de hoy es en su mayoría desconocido. En la figura 1.4 se muestra un esquema de las reacciones que se dan en la ruta eucariota. 22 Figura 1.4. Ruta eucariota de síntesis de glicerolípidos en plantas. Los ácidos grasos unidos a acil-CoA que son transportados al retículo endoplásmico se incorporan al glicerol, para dar lugar a PA en modo idéntico al descrito anteriormente para los lípidos de la ruta procariota. La única diferencia en este proceso es que las enzimas aciltransferasas del retículo endoplásmico utilizan ácidos grasos unidos a acil-CoA en lugar de los sustratos acil-ACP que procesan las del cloroplasto. En el retículo, el PA es transformado en DAG que es precursor de la fosfatidilcolina (PC), la fosfatidiletanolamina (PE) y la fosfatidilserina (PS) (Wallis y Browse, 2002). Los fosfolípidos que se sintetizan en el retículo, lo hacen desde el DAG y su derivado, la citidina-difosfato-colina (CDP-colina) (Wallis y Browse, 2002). PE y PS se pueden interconvertir. Así, PE se transforma en PS cuando una serina 23 desplaza la etanolamina (Yamaoka y col., 2011), y la reacción contraria ocurre mediante una descarboxilación de la serina (Nerlich y col., 2007). Por otro lado, a través de la ruta eucariota también se sintetizan galactolípidos. Algunas especies lipídicas que se sintetizan en el retículo posteriormente retornan al cloroplasto transformándose en galactolípidos y sulfolípidos, pero su naturaleza todavía no está totalmente aclarada, aunque se han descrito varias posibilidades (Li Beisson y col., 2010). Una de las posibilidades es que la molécula precursora del DAG cloroplástico penetre a través de las proteínas TGD. Esta molécula podría ser el PA, ya que se ha descrito que la proteína TGD4 une PA de manera específica (Wang y col., 2012). Otra posibilidad es que sea PC la molécula que se transporta del retículo al cloroplasto. Para ser transformada en DAG cloroplástico, la molécula de PC debe ser defosforilada por una fosfolipasa C no específica (nsPLC) o bien por la acción consecutiva de una fosfolipasa D y una fosfatidato fosfatasa (Li Beisson y col., 2010). De ésta forma, dependiendo de si los ácidos grasos sintetizados en el cloroplasto son liberados de la proteína ACP por una aciltransferasa (forman ácido lisofosfatídico, LPA) o por una tioesterasa (forman acil-CoA), serán incluidos en la ruta procariota o en la eucariota, respectivamente (Ohlrogge y col., 1991). Desde este punto de vista, existen dos tipos de plantas, las denominadas 16:3 y las 18:3. En la figura 1.5 se muestra un esquema de las dos rutas de síntesis de glicerolípidos en plantas. 24 Figura 1.5. Esquema de las dos rutas principales de síntesis de glicerolípidos en plantas. 1.3.1.3. Plantas 16:3 y plantas 18:3 En las plantas denominadas 16:3, tales como Arabidopsis thaliana (tale cress), Lycopersicum esculentum (tomate), Spinacia oleracea (espinaca) o Solanum tuberosum (patata) (Mongrand y col., 1998) la síntesis de MGDG, DGDG y SQDG ocurre simultáneamente gracias a las dos rutas (procariota y eucariota) (Browse y col., 1986b). En estas especies existen galactolípidos con 16:3 y 18:3 en el esqueleto de glicerol, aunque la presencia de 16:3 en estos galactolípidos se restringe a la posición sn-2 (Browse y col., 1986b). En Arabidopsis la contribución de ambas rutas a la síntesis de galactolípidos es similar (Browse y col., 1986b). Sin embargo, los flujos relativos de lípidos entre rutas varían entre especies, y dependen en cierta 25 manera del tipo de tejido y el desarrollo de la hoja (Awai y col., 2001). A pesar de que el DGDG se sintetiza a partir del MGDG, en Arabidopsis el contenido en ácidos grasos de ambos galactolípidos es diferente. Mientras en el MGDG coexisten las especies 18:3/18:3 y 18:3/16:3 en proporciones similares, en DGDG las especies mayoritarias son 18:3/18:3 y 18:3/16:0 (Siebertz y col., 1980). Esto sugiere que, en Arabidopsis, el origen mayoritario del DGDG es eucariótico y el del MGDG es tanto procariótico como eucariótico (Dörmann y Benning, 2002 ; Xu y col., 2005). Por otro lado, la mayoría de las plantas superiores como Glycine max (soja), Pisum sativum (guisante) ó Helianthus annuus (girasol) son 18:3. En ellas, la síntesis de MGDG, DGDG y SQDG se debe exclusivamente a la ruta eucariota y por lo tanto el 18:3 es el ácido graso mayoritario en esos lípidos (especialmente en posición sn-2). En estas plantas, el único lípido sintetizado por la ruta procariota es PG (Roughan y Slack, 1982). La presencia de 16:3 en algunos glicerolípidos depende de la especie vegetal. Entre las plantas que sí tienen 16:3, se encuentra una gran variedad de especies cuyos niveles de 16:3 varían desde las que tienen bajos porcentajes como Cannabis sativa L. (cáñamo) que tiene un 1 %, a las que tienen porcentajes mayores como Ranunculas acris L. (botón de oro) tiene un 17.5 % (Mongrand y col., 1998). Una muestra de la variedad en la composición total de 16:3 en diferentes especies vegetales se muestra en la tabla 1.2. 26 Especie % 16:3 total Ranunculas acris L. 17.5 Brassica oleacera L. 15.9 Ranunculus ficaria L. 13.9 Arabidopsis thaliana L. Heyn 13.8 Lycopersicon esculentum Mill. 13.8 Spinacia oleacera L. 11.8 Solanum tuberosum L. 11.6 Valeriana officinalis L. 9.7 Rubia tinctorum L. 7.8 Geranium sanguineum L. 7.6 Knautia dipsacifolia (Schrank) Kreuzer 5.4 Sorbus aucuparia L. 3.5 Gladiolus sp. 2.2 Magnolia denudata Desrouss. 1.2 Cannabis sativa L. 1 Linum usitatissimum L. 1 Tamarix gallica L. 0.7 Silene vulgaris (Moench) Garcke tr. Cucurbita pepo L. tr. Glycine max L. (Merr) tr. Vitis vinifera L. tr. Tabla 1.2 Contenido en ácido graso 16:3 de algunas plantas. Extraída y adaptada de (Mongrand y col., 1998). La presencia de 16:3 es común en determinadas familias completas de plantas (Mongrand y col., 1998), siendo más raro encontrar plantas 16:3 y 18:3 dentro de una misma familia. En general, parece que las especies que pertenecen a los grupos taxonómicos más primitivos, son plantas 16:3. Sin embargo entre las plantas 18:3 parece que la pérdida de la ruta procariótica ocurrió de manera independiente y en diferentes etapas de la evolución (Mongrand y col., 1998). Parece que la presión evolutiva no ha sido extremadamente severa con la pérdida de la ruta procariota. La única diferencia entre las plantas 18:3 y las 16:3 parece ser la presencia de la 27 actividad fosfatidato fosfatasa cloroplástica (Heinz y Roughan, 1983). En el particular caso de Atriplex lentiformis, se detecta 16:3 solamente si la planta se crece a temperaturas de 23/18 ºC, por debajo de las habituales en su hábitat 40/30ºC (Mongrand y col., 1998). Los estudios más recientes en Arabidopsis muestran 16:2 y 16:3 en bajas cantidades, en lípidos como PC, PE, PI, PG y SQDG (Burgos y col., 2011), algunos de ellos considerados productos específicos de la ruta eucariota. Esto pone de manifiesto que ambas rutas de síntesis están conectadas de un modo complejo, a pesar del desconocimiento actual de los mecanismos moleculares que permiten la coordinación de la dinámica de las dos rutas, y de las implicaciones biológicas de cada una de ellas. 1.4. DESATURASAS DE ÁCIDOS GRASOS 1.4.1. Características de las desaturasas de ácidos grasos Las desaturasas son las enzimas que introducen dobles enlaces en la cadena alquílica de los ácidos grasos. La posición de los dobles enlaces insertados por estas enzimas se puede designar mediante el uso de varias nomenclaturas. Así la nomenclatura - se refiere a la posición del doble enlace con respecto al grupo metilo (-CH3) de un extremo del ácido graso (ej. -3), mientras que la nomenclatura nó - se refiere a la posición desde el grupo carboxilo (-COOH) en el otro extremo (ej. -3 o n-3). Todas las desaturasas de plantas están codificadas por genes nucleares y según su localización utilizan diferentes donadores de electrones, actuando sobre distintos sustratos. En la tabla 1.3 se resumen algunas de las características de las desaturasas de ácidos grasos más comunes de Arabidopsis. 28 Código Atg Gen Sustrato Sustrato (A. graso) Producto (A. graso) At2g43710 fab2 Acil-ACP 18:0 18:1 At3g12120 fad2 PL 18:19 18:29,12 At2g29980 fad3 PL 18:29,12 18:39,12,15 At4g27030 fad4 PG 16:0 16:1t At3g15850 fad5 GL, SL 16:0 16:1c At4g30950 fad6 GL, SL, PG 16:17 18:19 16:27,10 18:29,12 At3g11170 fad7 GL, SL, PG 16:27,10 18:29,12 16:37,10,13 18:29,12,15 At5g05580 fad8 GL, SL, PG 16:27,10 18:29,12 16:37,10,13 18:29,12,15 Tabla 1.3 Desaturasas en Arabidopsis, localización, sustratos específicos y reacción que llevan a cabo. Sobre fondo verde se encuentran las localizadas en el cloroplasto y sobre fondo rosa, las del retículo. Como se observa en la tabla 1.3, en Arabidopsis se han descrito 8 genes que codifican para desaturasas de ácidos grasos (fab2, fad2, fad3, fad4, fad5, fad6, fad7 y fad8). Sin embargo en soja, se han identificado diferentes genes que codifican para cada desaturasa. Así, las desaturasas FAD3 (Bilyeu y col., 2003 ; Anai y col., 2005 ; Torres Franklin y col., 2009), FAD7 (Andreu y col., 2010) y FAD8 (Chi y col., 2011 ; Román y col., 2012) existen como familias de genes en esta especie. De entre las desaturasas más comunes en Arabidopsis, la única desaturasa soluble es FAB2 que actúa sobre sustratos acil-ACP. Las demás desaturasas son de membrana y actúan sobre ácidos grasos esterificados al glicerol (Somerville y col., 2000a). FAB2 se ha localizado en el estroma cloroplástico y se encarga de introducir el primer doble enlace en posición -9 sobre el ácido esteárico (18:0) produciendo ácido oleico (18:1) (Somerville y col., 2000a). Esta enzima se 29 purificó por primera vez desde semillas de Carthamus tinctorius (cártamo) y se observó que su actividad precisaba de la presencia de oxígeno y que formaba un homodímero en vivo (McKeon y Stumpf, 1982). En otro trabajo posterior se observó que la desaturasa poseía 4 átomos de Fe3+ por homodímero (2 por monómero) que se reducían a Fe2+ al añadir ditionito y retornaban al estado oxidado tras la adición de O2 y estearoil-CoA (Fox y col., 1993). Se observó que la secuencia de la desaturasa soluble contenía dos motivos de unión a hierro (-D/EX2H-) (Shanklin y Cahoon, 1998b) y, además, su secuencia completa era muy diferente a las descritas previamente en otros organismos, lo cual sugería que este tipo de enzimas había evolucionado de manera independiente (Shanklin y Somerville, 1991). Sin embargo, la mayoría de las desaturasas de ácidos grasos son proteínas de membrana, y por lo tanto el estudio de sus características bioquímicas, actividad, localización y purificación es extremadamente dificultoso. Gran parte del conocimiento sobre las desaturasas de membrana proviene del aislamiento de una colección de mutantes de Arabidopsis en los años 80 y la identificación de los genes que las codifican en los 90 (Browse y col., 1991 ; Somerville y col., 2000a ; Wallis y Browse, 2002 ; Heilmann y col., 2004a ; Gao y col., 2009). Se ha demostrado la existencia de la actividad desaturasa en diferentes tejidos de distintas especies (Stymne y Appelqvist, 1980 ; Browse y Slack, 1981). Sin embargo, en general, no se ha podido mantener la actividad de estas enzimas en preparaciones solubilizadas con detergente (Ohlrogge y col., 1991). De esto se deduce que el ambiente lipídico de la membrana es crucial para su correcto funcionamiento. Las desaturasas FAD2 y FAD3 se han localizado en el retículo endoplásmico (Dyer y Mullen, 2001), y generalmente insertan dobles enlaces sobre los ácidos grasos esterificados a PC, aunque no se puede descartar la participación de estas enzimas en la desaturación de ácidos grasos en otras clases de fosfolípidos (Ohlrogge y col., 1991). La -6 desaturasa FAD2 (Miquel y Browse, 1992) introduce 36 Otra de las observaciones realizadas sobre el análisis de las secuencias de las desaturasas de membrana de Arabidopsis (planta 16:3) y soja (planta 18:3) realizado durante esta Tesis Doctoral fue que la caja de histidinas Ia tiene la estructura de -HX3Hen todas las desaturasas de membrana excepto en las de tipo FAD5, donde la estructura es -HX4H-. Un alineamiento adicional de las secuencias de desaturasas de ambas especies que producen el mismo tipo de reacción (-6 y - 3), mostró que las cajas de histidina alineadas de este modo también tenían similitudes, esto se muestra en la tabla 1.5. Desaturasas Cajas de histidinas conservadas Ia Ib II -6 (FAD2, FAD6) H(E/D)C(G/A)H H(R/D)RHH H(V/I)(A/P)HH -3 (FAD3, FAD7, FAD8) HDCGH HRTHH HVIHH Tabla 1.5 Secuencias de aminoácidos de las cajas de histidina conservadas de las desaturasas de membrana de Arabidopsis y soja. En negro se indican los residuos que son iguales, en azul los que poseen un cambio conservativo y en naranja los diferentes. Como se observa en la tabla 1.5, las secuencias de aminoácidos de las cajas de histidina conservadas para las -3 desaturasas son idénticas, y en el caso de las - 6 desaturasas, es menos parecida, aunque algunos de los cambios observados son conservativos. En el alineamiento de las secuencias completas también se observaba una mayor homología entre las secuencias de las -3 desaturasas que entre las de las -6. En el caso de las cajas de histidina de las -6 desaturasas de Arabidopsis y soja se observó que la caja Ia de las -6 desaturasas tipo FAD2 tiene la secuencia -HX3HHy la de las de tipo FAD6 tiene la secuencia -HX3H-. En la figura 1.7 se muestra un alineamiento de las secuencias de proteína de las -3 desaturasas de Arabidopsis y soja. 37 Figura 1.7 Alineamiento de las secuencias de las  -3 desaturasas de Arabidopsis y Soja. Recuadradas en negro están las cajas de histidina descritas para todas las enzimas desaturasas y en rosa las conservadas de modo adicional. 38 El alineamiento de las secuencias de las -3 desaturasas de Arabidopsis y soja mostró que, además de las cajas de histidina descritas hasta el momento (enmarcadas en negro en la figura 1.7), existían otras cajas de histidina adicionales conservadas a lo largo de la secuencia (enmarcadas en rosa en la figura 1.7), el posible sentido biológico de la presencia de estas histidinas adicionales en la secuencia de las -3 desaturasas requeriría la realización de experimentos de mutagénesis dirigida. El análisis de las secuencias completas de las desaturasas del retículo permitió encontrar el motivo de retención en el retículo endoplásmico localizado en el extremo C-terminal de las proteínas tipo FAD2 en ambas especies (el motivo - YXXL/Yrico en aminoácidos aromáticos) (McCartney y col., 2004). Por otro lado, las secuencias de proteína de FAD3 en Glycine max (soja) no contenían los dos residuos de lisina situados a -3 y -5 del extremo C-terminal que se han descrito necesarios para la retención de este tipo de proteínas en el retículo endoplásmico (McCartney y col., 2004). Sin embargo, en el trabajo de McCartney y col., (2004) se utilizan muchas más secuencias de desaturasas tipo FAD2 que del tipo FAD3 para llegar a las secuencias consenso en cada caso, y además, la secuencia consenso de las desaturasas tipo FAD2 es contrastada con otras proteínas que realizan actividades enzimáticas muy diversas que también conservan ese motivo. La menor cantidad de secuencias utilizadas para llegar a la secuencia consenso de retención en el retículo endoplásmico para las desaturasas tipo FAD3 (McCartney y col., 2004), puede ser la explicación de que esta secuencia consenso no se encuentre en las FAD3 de Glycine max (soja). 1.4.1.2. Estructura y topología transmembrana La única desaturasa de plantas que ha sido cristalizada es la -9 estearoil ACP desaturasa soluble (FAB2) de Ricinus communis, que inserta un doble enlace en la 39 posición Δ-9 del 18:0-ACP para formar ácido oleico (18:1). Su estructura se muestra en la figura 1.8. Figura 1.8 (A) Estructura del homodímero de la  -9 estearoil ACP desaturasa de Ricinus comunnis (1AFR) (Lindqvist y col., 1996). (B) Estructura del homodímero de la  -9 estearoil ACP desaturasa de Ricinus comunnis unido a la proteína transportadora de acilos (ACP) (2XZO) (Guy y col., 2011). Extraídas del Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Como se observa en la figura 1.8, la estructura de la -9 estearoil ACP desaturasa soluble de Ricinus communis es un homodímero en el que cada uno de los monómeros consta de 11 –hélices, 9 de las cuales forman un fardo de hélices antiparalelas (Lindqvist y col., 1996). En el interior de cada fardo de hélices se localizan los dos átomos de hierro (de color gris en la figura) que están coordinados por varios residuos localizados en cuatro hélices del fardo (Lindqvist y col., 1996). En la desaturasa soluble de Ricinus communis (y de modo similar en otras desaturasas solubles de otros organismos), uno de los átomos de hierro está coordinado por un residuo de glutámico (Glu105) de manera bidentada y por un residuo de histidina (His146) mediante interacción simple, y el otro está coordinado 40 por otro residuo de glutámico (Glu196) y por otro de histidina (His232) a través del mismo tipo de interacciones (Lindqvist y col., 1996 ; Shanklin y col., 2009). Además, ambos átomos de hierro están estabilizados a su vez por dos residuos adicionales de glutámico (Glu143 y Glu229) (Lindqvist y col., 1996 ; Shanklin y col., 2009). En las desaturasas solubles, la presencia de un centro dihierro es un hecho que corresponde a evidencias experimentales, sin embargo, en el caso de las desaturasas de membrana la presencia de un centro activo de características similares, es hasta la fecha hipotética, y corresponde a la asunción de que los 8 residuos de histidina conservados en 3 motivos a lo largo de la estructura podrían estar uniendo un centro activo formado también por átomos de hierro (Shanklin y col., 2009). Sin embargo, sí se han encontrado evidencias experimentales de la presencia de un centro dihierro en la proteína alcano--hidroxilasa de Pseudomonas oleovorans, que es una proteína de membrana similar a las desaturasas y que también requiere hierro y oxígeno para su actividad (Shanklin y col., 1997). Los estudios de mutagénesis dirigida de los 8 residuos de histidina en la alcano--hidroxilasa (conservados del mismo modo que en las desaturasas de membrana) demostraron que también son esenciales para su actividad (Shanklin y Whittle, 2003). Así pues, por homología con la alcano--hidroxilasa, se supone que las cajas de histidina de las desaturasas de membrana son relevantes para la coordinación del centro activo y su correcta funcionalidad. A pesar de que en la estructura cristalina de la -9 estearoil ACP desaturasa soluble la disposición del centro activo así como de los residuos que lo coordinan está localizada en un bolsillo interior que forman las 9 hélices antiparalelas que forman el fardo (Cahoon y col., 1997), la topología propuesta para las desaturasas de membrana en plantas hasta el momento sitúa las cajas de histidina y el centro 41 activo de éstas enzimas fuera de la membrana (Shanklin y col., 1994 ; Dyer y Mullen, 2001 ; Dyer y col., 2002 ; Tang y col., 2005). El modelo propuesto para las desaturasas de membrana de plantas está claramente inspirado en el propuesto en 1990 para la desaturasa OLE1 de levaduras (Stukey y col., 1990). Además el descubrimiento de un tipo especial de desaturasas “front-end” que tienen fusionado en su secuencia (principalmente en el extremo C-terminal) un motivo de secuencia similar al citocromo b5 en levaduras (Mitchell y Martin, 1995) como en plantas (Sperling y col., 1995) y que son funcionales per se aportaba más evidencias para esta hipótesis. En este tipo de desaturasas, la localización de las cajas de histidina coincidía al mismo lado de la membrana que el citocromo b5, lo cual llevó a la hipótesis de que la desaturación se producía fuera de la membrana (Shanklin y Cahoon, 1998b). En la figura 1.9 se muestran dos ejemplos de la topología transmembrana propuesta para las desaturasas de membrana de plantas. 42 Figura 1.9 Topología transmembrana propuesta para las enzimas desaturasas de plantas. Extraídas y adaptadas de (Dyer y Mullen, 2001) y (Tang y col., 2005). La topología observada en estos modelos se debe a la localización de las tres cajas de histidina conservadas, hacia el mismo lado de la membrana, sin embargo un análisis de las secuencias de las diferentes desaturasas de ácidos grasos de membrana en Arabidopsis y soja realizado durante esta Tesis Doctoral, utilizando programas de predicción de topología transmembrana, mostró que las cajas de histidina no se localizaban al mismo lado de la membrana en la amplia mayoría de los casos. Estos datos se ilustran en la figura 1.10. 43 Figura 1.10 Topología transmembrana de las desaturasas de membrana de Arabidopsis obtenidas con dos programas diferentes, SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/) y PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/). El programa PSIPRED predice dos topologías diferentes para cada proteína mediante el uso de dos programas de predicción de manera 44 simultánea. Las cajas negras indican la ubicación aproximada de las tres cajas de histidina conservadas en todas las enzimas desaturasas. Como se observa en la figura 1.10, la topología transmembrana es diferente para cada desaturasa de membrana. La utilización durante éste análisis de dos programas de predicción diferentes (SOSUI http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/ y PSIPRED http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) que ofrecen en total 3 predicciones posibles para cada una de las desaturasas permite decir que quizá, las 3 cajas de histidina conservadas en todas las desaturasas no estén localizadas en el mismo lado de la membrana. Al ser las desaturasas proteínas de membrana (proteínas hidrofóbicas) que utilizan glicerolípidos (moléculas hidrofóbicas que forman parte de las bicapas lipídicas) como sustrato, no es extraño pensar que la reacción de desaturación se pudiera producir en el interior de la membrana. Si esta hipótesis fuera cierta, la localización en una hipotética configuración tridimensional de las cajas de histidina (aunque situadas en los segmentos solubles de la proteína) y del centro activo, podría ser intramembranal donde las hélices transmembrana podrían estar formando una cavidad que permitiría desarrollar la actividad desaturasa en el interior de la membrana. Esta hipótesis a priori, dificultaría la interacción del donador de electrones (citocromo b5 ó ferredoxina) con la desaturasa para el traspaso de electrones, pero este mecanismo es desconocido incluso para el caso de la -9 estearoil ACP desaturasa cristalizada hasta el momento (Shanklin y Cahoon, 1998b). Lo cierto es que los estudios sobre la topología transmembrana de las desaturasas son escasos y no existe ningún modelo sobre la topología 3D de las desaturasas de membrana. Además de que existe un gran desconocimiento sobre cómo ocurre la interacción entre las desaturasas de ácidos grasos y sus donadores de electrones, o incluso la interacción con otras proteínas. Todas estas lagunas dejan un amplio margen para la elaboración de hipótesis. La ausencia de 45 información de este tipo se debe a la dificultad de trabajo con proteínas de membrana como las desaturasas, debido a su alto grado de hidrofobicidad, propiedad que dificulta también su purificación y caracterización bioquímica mediante la utilización de técnicas tradicionales (Somerville y col., 2000a). 1.4.2. La reacción de desaturación En una reacción de desaturación intervienen además del ácido graso y la desaturasa, una molécula de oxígeno y un donador de electrones. En la figura 1.11 se muestra un esquema de los pasos de esta reacción. b Figura 1.11 Esquema de los pasos llevados a cabo en la reacción de desaturación de los ácidos grasos en plantas. Extraída y adaptada de (Somerville y col., 2000a). 52 col., 1994). En el trabajo de nuestro grupo, tras la exposición al frío de plantas de soja, se observó un aumento en los mRNAs de GmFAD3A y GmFAD7-2, que sin embargo, no se traducía en un gran aumento de los niveles de 18:3 (en torno al 5 %), que son ya de por sí muy elevados en este tejido (Román y col., 2012). Adicionalmente, el mayor aumento en ácidos grasos trienoicos se ha observado en raíces de trigo tras la exposición a 10 ºC (Horiguchi y col., 2000), la raíz es un tejido no fotosintético donde se ha descrito que la principal actividad -3 desaturasa es la de FAD3 (Lemieux y col., 1990) ya que la ruta eucariota es la predominante en este tejido (Xu y col., 2005). De modo adicional, en el trabajo de McConn y col., (1994) la composición de ácidos grasos de los mutantes fad7 y fad8 a 12 ºC y 28 ºC muestra que, a 12 ºC, el mutante fad8 produce más ácidos grasos trienoicos que el mutante fad7 (McConn y col., 1994), lo cual indicaría que la eficiencia de la actividad desaturasa AtFAD7 en frío es mayor que la de AtFAD8. Estos datos serían coherentes con los aportados por trabajos anteriores, donde la sobreexpresión de AtFAD7 producía una mayor tolerancia al frío en plantas de tabaco (Kodama y col., 1994 ; Kodama y col., 1995). Un trabajo posterior identificó que la abundancia de la proteína AtFAD8 es mayor a temperaturas normales de crecimiento de Arabidopsis (22ºC) que a temperaturas más altas (27ºC) y que la secuencia C-terminal de la proteína AtFAD8 es la responsable de su estabilidad en frío, o mejor dicho, de su desaparición en calor, lo cual significa que su regulación por temperatura en Arabidopsis es a nivel post-transcripcional (Matsuda y col., 2005). Estos datos serían coherentes con los presentados por McConn y col., (1994) donde, a la temperatura de 28 ºC, el mutante fad7 de Arabidopsis tiene niveles mucho menores de ácidos grasos trienoicos que el mutante fad8 (FAD8 sería menos funcional que FAD7 a 28 ºC) pero no implican que esta desaturasa tenga un patrón exclusivo de expresión y función en frío. A este respecto, se han publicado varios trabajos en otras especies 53 que apuntan hacia la misma conclusión. Por ejemplo en soja se observa que el mRNA de GmFAD8-1 y GmFAD8-2 está presente a temperaturas normales de crecimiento (Andreu y col., 2010 ; Román y col., 2012), y durante esta Tesis Doctoral se ha podido comprobar que también ocurre lo mismo en Arabidopsis. Aunque en otras especies como maíz, se ha descrito un aumento del mRNA ZmFAD8 en frío acompañado de un descenso del mRNA ZmFAD7 (Berberich y col., 1998), sin embargo los datos de la expresión diferencial de estos dos genes presentados en este trabajo con maíz son poco claros a este respecto. Todos estos resultados presentan evidencias de que el aumento en ácidos grasos trienoicos produce una mayor tolerancia al frío, sin embargo este aumento es menor del esperado y podría limitarse a determinados tejidos de determinadas especies vegetales (Iba, 2002). Sin embargo, el concepto contrario, la disminución de la insaturación de los ácidos grasos y la tolerancia a las altas temperaturas sí parecen estar íntimamente relacionadas (Iba, 2002). Por ejemplo el trabajo de (Matsuda y col., 2005), sobre la pérdida de estabilidad de la proteína AtFAD8 en calor, o la disminución de la producción de ácidos grasos trienoicos en el mutante fad7 a elevadas temperaturas (McConn y col., 1994) serían ejemplos claros sobre la relación de las altas temperaturas y la disminución de la actividad -3 desaturasa. En otros trabajos se obtuvieron similares resultados, por ejemplo el silenciamiento de la -3 desaturasa plastidial de tabaco producía plantas más tolerantes a las altas temperaturas (Murakami y col., 2000). Adicionalmente, la tolerancia a la temperatura de diversos mutantes descritos en la literatura, se debe a la disminución en la insaturación de los ácidos grasos, como en el caso del mutante str7 de soja (Alfonso y col., 2001) o los mutantes fad5 y fad6 de Arabidopsis (Hugly y col., 1989 ; Kunst y col., 1989a). 54 1.4.3.2. Desarrollo de la planta El desarrollo de una planta es un proceso extremadamente complejo durante el cual, a partir de la semilla y utilizando diversos programas específicos de desarrollo se genera una amplia diversidad de tejidos que maduran con el tiempo. Cada tejido posee unos requerimientos nutricionales y una composición metabólica diferente. En cuanto a la composición de ácidos grasos en tejidos, en las semillas el ácido graso mayoritario es el linoleico (18:2) (Heppard y col., 1996 ; Andreu y col., 2010) y sin embargo, en las hojas es el linolénico (18:3) (Horiguchi y col., 1996a ; Horiguchi y col., 1996b ; Horiguchi y col., 1998 ; Andreu y col., 2010). Dada la diferente composición de ácidos grasos de los tejidos vegetales es evidente que debe existir una regulación sobre la síntesis de ácidos grasos y su desaturación a través de mecanismos específicos de tejido. Un ejemplo de la regulación de las desaturasas con el desarrollo es la expresión de la desaturasa soluble de Ricinus comunnis (ricino). Esta desaturasa es una enzima fundamental en la biosíntesis de ácidos grasos, y parece estar regulada de manera diferencial en los diferentes tejidos de la planta. La clonación de este gen en Ricinus communis (ricino) permitió observar que los niveles de mRNA eran mayores en semillas en desarrollo que en hojas o raíces (Shanklin y Somerville, 1991). Esta observación fue comprobada posteriormente mediante la expresión del promotor de la -9 estearoil-ACP desaturasa de Brassica napus (colza) en Nicotiana tabacum (tabaco), aunque en este caso también se detectó la expresión en otros tejidos de marcado carácter oleosintético, como las semillas en desarrollo o los granos de polen (Slocombe y col., 1994). Un estudio más reciente que utiliza también la expresión del promotor del gen de palma en Lycopersicum esculentum (tomate) únicamente detecta su expresión en frutos maduros (Taha y col., 2012). Parece ser que existe regulación a nivel transcripcional de esta enzima en tejidos claramente 55 responsables de la síntesis de ácidos grasos y lípidos como son las semillas. Sin embargo la síntesis de novo de ácidos grasos en plantas que ocurre en los plastidios durante la mayoría de los estadíos de desarrollo de la planta, requiere de la actividad de esta enzima. Esto sugiere que quizá exista un control posttranscripcional que regula su actividad en el resto de tejidos vegetales. Otro caso de regulación de las desaturasas por desarrollo es el de las -6 desaturasas del retículo endoplásmico. Por ejemplo, para las desaturasas reticulares de tipo FAD2 se ha descrito que los niveles de expresión más altos se encuentran en semillas (Heppard y col., 1996 ; Martinez Rivas y col., 2001 ; Tang y col., 2005). En el trabajo de Heppard y col., (1996), el aislamiento de dos genes FAD2 en soja (GmFAD2-1 y GmFAD2-2) y el estudio de su expresión relativa permitió observar sus diferencias en cuanto al patrón de expresión. El gen GmFAD2-2 se expresaba de modo constitutivo y sin embargo, el gen GmFAD2-1 presentaba una elevada expresión en semillas en desarrollo, relacionando a esta isoforma con la conversión de 18:1 a 18:2 en este tejido (Heppard y col., 1996). Posteriormente el aislamiento de isoformas del gen FAD2 en Helianthus annuus (girasol) permitió confirmar la observación de que únicamente algunas de estas isoformas (tipo FAD2-1) poseen un patrón de expresión claro en semillas (Martinez Rivas y col., 2001). En este trabajo se mostraba que la expresión de dos isoformas del gen en girasol (HaFAD2-2 y HaFAD2-3) era constitutiva, y sin embargo la del gen HaFAD2-1 era específica de embriones en desarrollo. La alta expresión del gen HaFAD2-1 en este tejido, ocurría en plantas de fenotipo normal y sin embargo estaba inhibida en plantas con fenotipo alto-oleico (con elevados niveles de 18:1), lo cual evidenciaba la dependencia de la expresión de este gen con la presencia de la mutación (Martinez Rivas y col., 2001). Un trabajo posterior mostraba el aislamiento de otro gen tipo FAD2-1 en soja GmFAD2-1B (adicionalmente al aislado por Heppard y col., (1996) GmFAD2-1 o GmFAD2-1A) y proponía que la fosforilación 56 del residuo Serina-185 de las desaturasas tipo FAD2-1 podría ser un mecanismo de regulación de estas enzimas que provocaría la disminución de su actividad (Tang y col., 2005). El caso de las -3 desaturasas se tratará de manera más ampliada en el capítulo 1 de resultados “Estudio de la regulación de las -3 desaturasas durante el desarrollo de la hoja”. 1.5. TRANSPORTE DE LÍPIDOS ENTRE MEMBRANAS La composición de lípidos de membrana de una planta es variable y se ve afectada por factores como el desarrollo del tejido, la sequía, la salinidad o el frío. Además de éstos, la deficiencia de fosfato es uno de los condicionantes ambientales más comunes que también provoca variaciones en la composición de lípidos de membrana (Shimojima, 2011). El intercambio dinámico de lípidos entre membranas de una célula vegetal debe ser un proceso natural e indispensable para el correcto desarrollo de la planta. De hecho, algunos estudios recientes han demostrado que sin el transporte de lípidos entre membranas la viabilidad de las semillas está impedida (Xu y col., 2005 ; Xu y col., 2008). Los coeficientes de permeabilidad de los ácidos grasos de cadena larga en membranas sintéticas compuestas únicamente por lípidos son relativamente altos, lo cual sugiere que la difusión simple podría ser un método de transporte de lípidos entre membranas (Kamp y Hamilton, 2006). Sin embargo, la composición lipídica es diferente entre tejidos vegetales y característica de cada tipo de membrana celular. Así los galactolípidos se encuentran principalmente en los cloroplastos y únicamente se hallan en las membranas extraplastidiales en condiciones de deficiencia de fosfato (Dörmann y Benning, 2002 ; Benning y Ohta, 2005). La 57 particular localización de determinados glicerolípidos en las membranas celulares vegetales sugiere que existe un control sobre su movimiento; lo cual sería incoherente con un movimiento de éstos únicamente debido a la difusión. En cualquier caso, la actividad de ciertas enzimas como las tioesterasas o las acil-CoA sintetasas de cadena larga debe estar implicada (Benning, 2009). De las evidencias experimentales extraídas de los numerosos experimentos de marcaje radiactivo y de los mutantes de Arabidopsis, se deduce que deben existir diferentes tipos de transporte de lípidos entre membranas que se detallarán a continuación. 1.5.1. Transporte de ácidos grasos fuera del cloroplasto Durante su síntesis, los ácidos grasos que se incorporan a la ruta eucariota, abandonan el cloroplasto como derivados acil-CoA y se incorporan a los lípidos en el retículo endoplásmico. Esto hace evidente que debe existir un mecanismo de transporte de éstos lípidos del cloroplasto al retículo. Para éste proceso es necesaria la actividad acil-CoA sintetasa (ACS), implicada en la formación de un enlace tioéster entre el ácido graso y el Coenzima A. La existencia de actividad ACS en envueltas de cloroplasto se conoce hace tiempo (Roughan y Slack, 1977 ; Joyard y Stumpf, 1981). Ésta se ha localizado en la envuelta externa del cloroplasto (Andrews y Keegstra, 1983 ; Block y col., 1983a). Se han realizado estudios con una familia concreta, las acil-CoA sintetasas de cadena larga (LACS). Éstas se han relacionado tradicionalmente con el transporte de lípidos en otras especies como bacterias (Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) ó mamíferos (Homo sapiens) revisado en Black y DiRusso, (2003). En Arabidopsis, se han encontrado 9 homólogos de éstas proteínas (LACS 1-9) y todas ellas eran funcionales en lisados de levaduras (Shockey y col., 2002). Los patrones de expresión de los diferentes genes LACS en tejidos Arabidopsis y la localización de estas enzimas llevó a pensar en LACS9 como candidata para la 58 actividad plastidial (Schnurr y col., 2002). De hecho, los ensayos con cloroplastos aislados del mutante lacs9-1 demostraron que LACS9 es la enzima que más contribuye a la actividad LACS en cloroplastos. Sin embargo, la línea mutante lacs9-1 no presenta alteraciones en los lípidos totales de las hojas con respecto a la línea silvestre (Schnurr y col., 2002). Así pues, no se puede descartar la actividad de otras enzimas (LACS o no) que participen en éste proceso. 1.5.2. Transporte de lípidos del retículo endoplásmico al cloroplasto La identificación a lo largo de los últimos años de los mutantes trigalactosildiacilglicerol (tgd) en Arabidopsis, ha esclarecido un mecanismo de transporte de lípidos del retículo endoplásmico al cloroplasto (Xu y col., 2005 ; Awai y col., 2006 ; Lu y col., 2007 ; Xu y col., 2008). Todos los mutantes tgd poseen fenotipos similares, crecimiento reducido y acumulación de lípidos como PA, oligogalactolípidos o TAG (en gotas lipídicas en el citoplasma). Según estos estudios, las proteínas TGD1-3 formarían un complejo multiproteico encargado de transportar PA desde la envuelta interna al estroma del cloroplasto. Sin embargo, la interacción entre estas tres proteínas no ha sido demostrada. La acumulación de PA se debe a la incapacidad de éstos mutantes de incorporarlo al cloroplasto para la síntesis de galactolípidos (Xu y col., 2005). Se ha demostrado que TGD4 une PA in vitro y se localiza en la envuelta externa del cloroplasto, allí probablemente facilita su incorporación al cloroplasto (Wang y col., 2012). La baja viabilidad de las semillas obtenidas de éstos mutantes hace pensar que éste transporte es necesario e insustituible para el correcto desarrollo vegetal (Xu y col., 2005). 59 1.5.3. Transporte de lípidos del cloroplasto al retículo endoplásmico Este tipo de transporte de lípidos entre membranas se hace evidente en mutantes de Arabidopsis como el mutante fad2 (deficiente en la -6 desaturasa reticular) (Miquel y Browse, 1992). En este mutante, el análisis de ácidos grasos muestra que la cantidad de 18:3 en lípidos extraplastidiales es bastante parecida a la de la línea silvestre. Sin embargo, el nivel de 18:1 total en este mutante es muy elevado y el de 18:2 muy bajo, datos que son consistentes con la mutación. El mantenimiento de los niveles de 18:3 en lípidos extracloroplásticos sugiere la transferencia de éstos desde el cloroplasto hacia las membranas extraplastidiales mediante un mecanismo totalmente desconocido. Este tráfico de lípidos entre membranas puede existir en condiciones normales en una planta de la línea silvestre, pero se pone de manifiesto en este mutante. Otra situación en la que hay evidencia de transporte de lípidos fuera del cloroplasto es la deficiencia de fosfato (Dörmann y Benning, 2002). Esta deficiencia provoca la salida de galactolípidos del cloroplasto a las membranas extraplastidiales, permitiendo el uso más eficiente del fósforo por las células vegetales. En deficiencia de fosfato se observa un descenso de los niveles de fosfolípidos y un aumento en los niveles de DGDG y SQDG. El aumento en los niveles de SQDG parece destinado a sustituir parcialmente la función del PG cloroplástico (Nakamura, 2013). El DGDG sintetizado en la deficiencia de fosfato es transportado a las membranas extraplastidiales para sustituir a los fosfolípidos (Nakamura, 2013). También se ha descrito la presencia del ácido graso 16:3 (típicamente de la ruta procariota) en lípidos extracloroplásticos (sintetizados enteramente por la ruta eucariota) en el mutante tgd1 (Xu y col., 2005). Todos estos hechos ponen de 60 manifiesto que existe un flujo de lípidos (o ácidos grasos) desde el cloroplasto hacia las membranas extraplastidiales, aunque actualmente se desconoce su mecanismo molecular. 1.5.4. Transporte de lípidos desde la envuelta interna del cloroplasto al tilacoide Los tilacoides son las membranas más abundantes en las células vegetales fotosintéticas. Las envueltas del cloroplasto son el lugar donde se han localizado la mayoría de enzimas responsables de la biosíntesis de galactolípidos. Por tanto, la formación de membranas tilacoidales funcionales requiere la existencia de un flujo de galactolípidos desde la envuelta hacia el tilacoide, así como el importe de proteínas al interior del cloroplasto (Dörmann y Benning, 2002). Algunas evidencias sugieren que este proceso ocurre a través de la formación y transporte de vesículas (Morre y col., 1991) y de un modo dependiente de la temperatura (Andersson y col., 2001). La obtención de un mutante de Arabidopsis denominado vipp1 (vesicleinducing protein in plastids) (Kroll y col., 2001) que carece de la formación de éstas vesículas y también del desarrollo de membranas tilacoidales apoya la hipótesis de la participación de ésta proteína en la formación de éstas membranas. La existencia de un mutante análogo en Synechocystis (Westphal y col., 2001) confirma que éste proceso es común en la naturaleza, y aporta una prueba más a la teoría endosimbionte de los cloroplastos (Margulis, 1996). 1.5.5. Otros tipos de transporte Las proteínas de transporte de lípidos (LTPs) constituyen una familia de pequeñas proteínas que son capaces de unir ácidos grasos y realizar in vitro el intercambio de fosfolípidos entre membranas (Kader, 1985). Hasta el momento se han descrito 15 miembros de esta familia de proteínas en Arabidopsis (Arondel y 61 col., 2000) y la mayoría se han localizado en el espacio extracelular. Las LTPs se han relacionado con diferentes procesos que se desarrollan en la planta como el ensamblaje y deposición de las ceras (Hollenbach y col., 1997 ; DeBono y col., 2009), la adhesión del tubo polínico (Park y Lord, 2003 ; Chae y col., 2009), la movilización de lípidos de almacenamiento en semillas (Tsuboi y col., 1992) o la señalización celular (Buhot y col., 2001). Algunos trabajos también las localizan en el interior de la célula (Carvalho y col., 2004 ; Diz y col., 2011) pero se desconoce la función que podrían desarrollar allí. La presencia de PC (lípido derivado de la ruta eucariota), en las envueltas del cloroplasto planteó la hipótesis de que ésta fuera la molécula que se intercambia entre el retículo y el cloroplasto. Se ha descrito que la forma monoacilada de PC (lyso-PC) es capaz de abandonar el retículo y llegar al cloroplasto donde se transforma en PC. Las enzimas responsables de éste tráfico han sido localizadas en las membranas adecuadas haciendo factible ésta hipótesis (Bessoule y col., 1995). Adicionalmente, los experimentos de marcaje radiactivo también confirmarían ésta hipótesis (Mongrand y col., 2000). En Arabidopsis, una planta 16:3, se ha identificado una molécula transportada entre membranas, el PA (Wang y col., 2012). A su vez en Allium porrum (puerro), una planta 18:3, se ha visto que la molécula transportada es PC (Mongrand y col., 2000). El PA es producido por ambas rutas de biosíntesis que son funcionales al 50 % en Arabidopsis y la PC es producida por la ruta eucariota, la principal y mayoritaria en plantas 18:3 como el puerro. Dada la posición de estas dos moléculas en los dos tipos de rutas de síntesis de lípidos en plantas, tanto PA como PC son excelentes candidatas para el intercambio al menos en condiciones control. Por otro lado el descubrimiento de zonas de contacto entre las membranas de los diferentes orgánulos de la célula vegetal abre una nueva perspectiva en cuanto 68 3. OBJETIVOS 3.1. ESTUDIO DE LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS w-3 DESATURASAS DURANTE EL DESARROLLO DE LA HOJA EN SOJA 3.2. LOCALIZACIÓN, ORGANIZACIÓN Y REGULACIÓN DE LAS w-6 y w-3 DESATURASAS PLASTIDIALES 3.3. ESTUDIO DE LA OXILIPINA dnOPDA COMO FITOHORMONA PRECURSORA DEL ÁCIDO JASMÓNICO 69 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS  -3 DESATURASAS DURANTE EL DESARROLLO DE LA HOJA EN SOJA Tal y como se menciona en la introducción la composición de lípidos de membrana en plantas es variable y se ve afectada por diversos factores como el desarrollo vegetal (Horiguchi y col., 1998 ; Yamaoka y col., 2011 ; Coulon y col., 2012), el estrés osmótico (Heilmann, 2009 ; Hong y col., 2010), la temperatura (O'Quin y col., 2010), el estrés por patógenos (Testerink y Munnik, 2011) o la deficiencia de fosfato (Shimojima, 2011). Un primer objetivo de esta Tesis Doctoral consistió en analizar la contribución de las -3 desaturasas reticulares y plastidiales a la producción de ácido graso linolénico (18:3) durante el desarrollo de la planta en soja. Concretamente, se estudió la expresión durante la germinación de las semillas y principalmente durante el desarrollo de las hojas en plantas, ya que en ambos tejidos la síntesis de ácidos grasos es muy relevante. Dados los resultados obtenidos, se decidió utilizar también cultivos líquidos de células fotosintéticas de soja para poder así comprar los resultados con los de hojas en desarrollo. 70 Figura 4.1 Diferentes tejidos vegetales en plantas de soja. En la figura 4.2 se muestran varias imágenes de diferentes etapas del desarrollo de las hojas en soja. Figura 4.2 Imágenes de hojas de soja en desarrollo. (A) Recién abiertas (RA). (B) 3 días de desarrollo. (C) 7 días de desarrollo. (D) 14 días de desarrollo. (E) 18 días de desarrollo. Sabemos que, de forma general, el nivel de ácido linolénico (18:3) aumenta durante el desarrollo de las hojas en la mayoría de las especies vegetales. Este es el 71 caso del maíz (Leech y col., 1973), el trigo (Horiguchi y col., 1996a ; Horiguchi y col., 1998) o de Arabidopsis (Horiguchi y col., 1996b). En otras especies tales como la alfalfa (Klopfenstein y Shigley, 1967) o el tabaco (Koiwai y col., 1981), se detectó una disminución de los niveles de 18:3, aunque en estos casos esta disminución podría estar relacionada con la senescencia de la hoja (Koiwai y col., 1981). El incremento de los niveles de 18:3 durante el desarrollo de la hoja se ha relacionado con la producción de membranas tilacoidales. Esto se debe a que el 18:3 se encuentra preferencialmente en los galactolípidos cloroplásticos MGDG y DGDG en todas las etapas del desarrollo de la hoja (Horiguchi y col., 1996b). La acumulación de 18:3 implica que existe actividad -3 desaturasa (reticular y/o plastidial) en todas las etapas del desarrollo de la hoja. Sin embargo, a pesar de la relevancia del proceso, los mecanismos moleculares de regulación de esta actividad no han sido estudiados en detalle hasta el momento. El único trabajo que recoge la expresión de las -3 desaturasas FAD3 y FAD7 (reticular y plastidial, respectivamente) durante el desarrollo de la hoja es el realizado en trigo, una planta monocotiledónea por Horiguchi y col., (1998). Merece la pena mencionar que en este trabajo, no se analiza la expresión relativa de TaFAD8 ya que se ha considerado siempre una desaturasa inducible por frío que no es funcional a temperatura ambiente (Gibson y col., 1994 ; McConn y col., 1994). Desafortunadamente, no hay más datos de expresión de las -3 desaturasas durante el desarrollo de la hoja en otras especies y, particularmente en dicotiledóneas, no se ha realizado ningún estudio experimental probablemente porque el patrón de desarrollo de sus hojas es más complicado. En las hojas de las plantas dicotiledóneas ocurre simultáneamente la división y la elongación celular en diferentes áreas de las mismas (Tsukaya, 1995) mientras que en monocotiledóneas, la división celular ocurre en el meristemo basal de la hoja, 72 generándose un gradiente lineal de edad celular desde la base hasta el ápice de la misma (Leech y col., 1973 ; Mullet, 1988). En el trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral se ha estudiado la acumulación de ácidos grasos poliinsaturados (especialmente 18:2 y 18:3) y los perfiles de expresión de los genes de las -3 desaturasas en soja [Glycine max (cv. Volania)], una especie dicotiledónea. 4.1.1. Composición de ácidos grasos totales durante el desarrollo de la hoja en soja Como primer paso en este estudio, analizamos la composición de ácidos grasos procedentes de lípidos totales en hojas de soja durante el desarrollo de la hoja. Los resultados se muestran en la figura 4.3. Figura 4.3 Composición de ácidos grasos de lípidos totales durante el desarrollo de hojas trifoliares de soja. Las barras azul oscuro indican los ácidos grasos de hojas recién abiertas (RA). Las rojas se corresponden con las hojas de 3 días, las verdes con las de 7 días, las moradas con las de 14 días y las azul claro con las de 18 días. Para cada ácido graso, letras diferentes indican diferencias significativas entre puntos de muestra (P< 0.05). 73 Como se observa en la figura 4.3, el perfil de ácidos grasos totales en hojas de soja es el característico de una planta 18:3, con ausencia de 16:3 y altos niveles de ácidos grasos de 18 átomos de carbono. Los ácidos grasos poliinsaturados fueron mayoritarios durante todos los estadios de desarrollo y de ellos, la especie más abundante fue el ácido linolénico (18:3). Cabe destacar que el nivel de 18:3 en hojas recién abiertas (RA) era aproximadamente de un 40%, indicando que la actividad desaturasa está presente en los estadios más tempranos de desarrollo de la hoja. Como también se puede observar en la figura 4.3, los niveles de 18:3 aumentaron con el desarrollo de la hoja. Desde un 40 % en hojas recién abiertas (RA) hasta un 70 % en hojas de 18 días (Figura 4.5). Un análisis por cromatografía de capa fina (TLC) demostró que el 18:3 se encontraba principalmente esterificado a MGDG y DGDG tal y como se ha demostrado en muchas otras especies, lo que sugiere que gran parte del 18:3 sintetizado durante el desarrollo de la hoja se incorpora a los glicerolípidos cloroplásticos para formar las membranas tilacoidales. 4.1.2. Análisis de clorofila total y proteína D1 durante el desarrollo de las hojas de soja Con objeto de establecer una mayor correlación entre el aumento de 18:3 y la formación de membranas tilacoidales, decidimos estudiar la acumulación de pigmentos y de proteínas relacionados con la actividad fotosintética. Concretamente se estudió la acumulación de clorofila total y de proteína D1 durante el desarrollo de las hojas trifoliares. El análisis de clorofila total en hojas de soja en desarrollo se muestra en la figura 4.4. 74 Figura 4.4 Análisis de clorofila total en hojas de soja recién abiertas (RA), de 3 días, 7 días, 14 días y 18 días. Como se puede observar en la figura 4.4, la clorofila total aumentó durante el desarrollo de la hoja, aunque en el estadio de 18 días se observa un ligero pero significativo descenso con respecto a los 14 días. Éste podría corresponderse con un inicio de la senescencia foliar. Para correlacionar el incremento de 18:3 con la formación de membranas tilacoidales durante el desarrollo de la hoja, también se analizó la acumulación de proteína D1 a lo largo de este proceso. D1 es una de las subunidades proteicas del centro de reacción del fotosistema II (Mattoo y col., 1984) que se localiza en los tilacoides y se correlaciona directamente con la síntesis de membranas tilacoidales. En la figura 4.5 se muestra la acumulación de proteína D1 (respecto a proteína total) observada durante el desarrollo de las hojas trifoliares en soja. Figura 4.5 Acumulación de proteína D1 en hojas trifoliares de soja recién abiertas (RA), de 3 días, 7 días, 14 días y 18 días. La proteína D1 se detectó mediante western blot y 75 quimioluminiscencia con el anticuerpo comercial AntiPsbA de Agrisera utilizando extractos de proteína total de hojas trifoliares de soja. Para este experimento se cargaron 3  g de proteína total en cada carril. Tal y como se observa en la figura 4.5, el análisis por western blot de D1 mostró una banda de peso molecular (35-36 kDa) correspondiente al monómero de D1. En la figura 4.5 se puede observar que se encuentra proteína D1 incluso en los estadios más tempranos de desarrollo de la hoja, lo cual es coherente con el alto reemplazo de esta proteína con la luz (Mattoo y col., 1984 ; Alfonso y col., 2004). Como se observa en la figura 4.5, la cantidad relativa de proteína D1 aumentó durante el desarrollo de la hoja, indicando junto al resto de información aportada en este aspecto, que el aumento de 18:3 durante el desarrollo de la hoja en soja se correlaciona directamente con la biosíntesis de membranas tilacoidales. 4.1.3. Expresión de las  -3 desaturasas durante el desarrollo de las hojas de soja La expresión de las -3 desaturasas se analizó mediante PCR semicuantitativa. La utilización de otra técnica como la PCR cuantitativa (qPCR) en este caso se vió limitada por el número de genes de cada una de ellas (cuatro genes FAD3, dos genes FAD7 y dos genes FAD8), así como la elevada homología a nivel de secuencia entre todas ellas (>76 % entre miembros de la misma familia), todo lo cual dificultaba el diseño de cebadores específicos para cada gen en las condiciones de la qPCR, que requiere temperaturas de hibridación más restrictivas además de la limitación en cuanto al tamaño del amplicón. En la figura 4.6 se muestra la expresión de los genes que codifican las -3 desaturasas de soja durante el desarrollo de la hoja. 76 Figura 4.6 Expresión de los genes que codifican para las  -3 desaturasas en hojas recién abiertas (RA), de 3 días, 7 días, 14 días y 18 días de soja. Los genes de la actina y EF1  se utilizaron como genes de referencia. (A) RT-PCR semicuantitativa de uno de los experimentos de desarrollo en hojas de soja. (B) Representación de la media y desviación estándar de la expresión relativa de las bandas de PCR obtenidas en las diferentes réplicas biológicas. Para cada gen, letras diferentes indican diferencias significativas entre los puntos (P< 0.05). Como se observa en la figura 4.6, los genes correspondientes a las -3 desaturasas reticulares GmFAD3A y GmFAD3B se expresaban en todos los estadios de desarrollo de la hoja (figura 4.6-A). Sin embargo, los niveles de ambos transcritos decrecían con el desarrollo de la hoja, llegando casi a desaparecer a los 18 días. El 77 análisis por digestión de los productos de PCR con Van91I que permite diferenciar GmFAD3A de GmFAD3B, reveló que el transcrito correspondiente a GmFAD3A decrecía más rápidamente que el correspondiente a GmFAD3B (Figura 4.6-B). Con respecto a los genes de las -3 desaturasas plastidiales hay que señalar que todos se expresaban en los diferentes estadios de desarrollo de la hoja, aunque los perfiles de expresión de cada una mostraban diferencias entre sí. Como se puede observar en la figura 4.6-B, los niveles de expresión de las -3 desaturasas GmFAD7-1 y GmFAD7-2 no variaban de manera significativa durante el desarrollo de la hoja. Sin embargo, los transcritos correspondientes a las dos isoformas de FAD8 mostraron un comportamiento contrario, mientras el nivel de transcrito de GmFAD8-1 disminuía secuencialmente con el desarrollo de la hoja, el del transcrito GmFAD8-2 aumentaba a los 3 días de desarrollo, manteniéndose a esos niveles durante el resto de estadios analizados (figura 4.6-B). Una vez que obtuvimos el patrón de expresión de los genes de las -3 desaturasas y la acumulación de ácidos grasos trienoicos durante el estudio del desarrollo de la hoja, decidimos analizar los mismos parámetros en cultivos líquidos de células fotosintéticas de soja [Glycine max (cv. Corsoy)]. En estos cultivos celulares fotosintéticos las células crecen en suspensión en un medio de cultivo líquido, duplicándose de manera indiferenciada. El comportamiento de estas células se asemeja al de las células jóvenes del mesófilo de hojas (Rogers y col., 1987). Estos cultivos celulares fotosintéticos utilizados para el estudio de la síntesis de lípidos y su reemplazo presentan niveles de fosfolípidos y galactolípidos similares a los de las hojas jóvenes (MacCarthy y Stumpf, 1980 ; Martin y col., 1984). En la figura 4.7 se muestran varias imágenes de cultivos líquidos de células fotosintéticas de soja. 84 llevar a cabo la cuantificación y normalización de los datos de expresión, se eliminaron del análisis los datos de semillas secas, tomándose como referencia el punto de 3 días. Es interesante señalar que el nivel de RNA mensajero de las -3 desaturasas reticulares (GmFAD3A y GmFAD3B) decrecía a los 12 días de germinación, coincidiendo con el desarrollo de tejido foliar. Los niveles de transcrito de las -3 desaturasas plastidiales (GmFAD7-1 y GmFAD7-2) no presentaban variaciones significativas durante los diferentes estadios de germinación de las semillas, a pesar incluso de que el nivel de transcrito GmFAD7-1 mostraba una alta variabilidad en las diferentes repeticiones biológicas (figura 4.10). De un modo similar, el transcrito de la -3 desaturasa plastidial GmFAD8-2 no presentaba variaciones significativas durante la germinación de las semillas. Por el contrario, el nivel de mRNA de GmFAD8-1 disminuía significativamente a los 12 días de germinación (figura 4.10). La acumulación de transcritos de las -3 desaturasas de soja en semillas en germinación no provocaba la aparición de altos niveles de 18:3, pues éstos se mantenían en torno al 20 % durante todos los estadios de la germinación (datos no mostrados), lo que sugiere que toda la actividad -3 desaturasa en las semillas está fuertemente controlada. Esta observación ya ha sido descrita para diferentes especies (Lemieux y col., 1990 ; Heppard y col., 1996 ; Andreu y col., 2010). 4.1.7. Análisis in silico de los promotores de las  -3 desaturasas de soja Con el objetivo de identificar posibles elementos reguladores relacionados con el patrón de desarrollo que presentan algunas de las -3 desaturasas en hojas de soja, se realizó un análisis in silico de las regiones promotoras de los genes que las codifican. Este estudio se realizó con dos plataformas de análisis disponibles en la 85 red, PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) y PLANTCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/). Para este estudio se analizaron de 1500 a 2000 pb en dirección 5’ con respecto al ATG para cada gen, dependiendo de los requerimientos de cada software. Las secuencias analizadas se obtuvieron directamente de las secuencias genómicas de las -3 desaturasas en la base de datos de anotación del genoma de soja (http://www.phytozome.net/ v8.0). Los dos programas mostraban elementos reguladores comunes para todas las -3 desaturasas, como los relacionados con la regulación por la luz, el ritmo circadiano o las hormonas vegetales. La tabla 4.1 muestra los diferentes elementos reguladores y su frecuencia de aparición en las secuencias promotoras de los genes de las -3 desaturasas en soja. 86 -3 desaturasas de soja GmFAD3A GmFAD3B GmFAD7-1 GmFAD7-2 GmFAD8-1 GmFAD8-2 Luz 21 19 7 12 15 21 Anaerobiosis 2 1 Calor 2 3 2 2 3 Sequía 1 1 1 Frío 1 Herida 1 Ritmo circadiano 4 2 1 1 1 Plántula 1 1 1 Raíz 1 Meristemo 1 1 Hongos 1 1 1 1 Defensa y estrés 4 2 1 1 Metil Jasmonato 4 4 4 Ácido salicílico 2 2 4 4 Giberelinas 1 1 2 1 3 2 Ácido abscísico 1 1 1 Auxinas 1 Etileno 1 HD-Zip 3 1 Tabla 4.1 Elementos reguladores que se encuentran en los promotores de las  -3 desaturasas en el estudio in silico según el software PLANTCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/). Los números en la tabla indican la cantidad de elementos reguladores de cada tipo que se identifican para cada gen. Como se puede observar en la tabla 4.1, se encuentran algunos elementos reguladores relacionados con la anaerobiosis o la expresión en raíces para las desaturasas GmFAD3A y GmFAD3B. Estas predicciones serían consistentes con datos experimentales publicados con anterioridad en los que se relaciona la mayor 87 actividad de FAD3 en tejidos anaeróbicos o raíces (Lemieux y col., 1990 ; Andreu y col., 2010). Del mismo modo, se encontraron una serie de elementos en el caso de las -3 desaturasas plastidiales relacionados con la sequía, el frío o la herida (tabla 4.1). No obstante, uno de los resultados más significativos obtenidos en este estudio, fue la identificación de elementos reguladores de tipo HD-Zip en las regiones promotoras de los genes GmFAD3A y GmFAD3B. La familia de factores de transcripción tipo HD-Zip se caracteriza por la presencia en su estructura proteica de un homeodominio (o motivo de unión a DNA) próximo a un motivo de “dedos de cinc”. Este tipo de factores de transcripción sólo se han identificado en plantas, pero están relacionados con otras proteínas tipo HD en eucariotas. En plantas, los factores de transcripción tipo HD-Zip se han relacionado con las respuestas de adaptación al medio durante el crecimiento (Harris y col., 2011). Estas respuestas pueden ocurrir en relación a diversos factores como el desarrollo de la hoja, la formación de los pelos radiculares o el efecto sombra (Aoyama y col., 1995 ; Steindler y col., 1999). En Arabidopsis se han identificado hasta 47 genes de la familia HD-Zip, y se han clasificado en grupos del 1 al 4 según criterios de similitud de secuencia o de distribución de intrones y exones. La familia HD-Zip en Arabidopsis incluye tanto activadores como represores de la transcripción (Aoyama y col., 1995 ; Steindler y col., 1999). En soja, se ha identificado GmHZ1, un homólogo de la clase 1 de factores de transcripción HD-Zip de Arabidopsis. En un trabajo reciente, se ha observado que GmHZ1 es un activador de la respuesta de soja a la infección por SMV (Wang y col., 2005). Sin embargo, se desconoce si GmHZ1 podría desarrollar otro tipo de funciones como la diferenciación o el desarrollo de tejido. 88 La figura 4.12 muestra un alineamiento de las regiones promotoras de los genes GmFAD3A y GmFAD3B y la localización de las secuencias de reconocimiento para los factores de transcripción tipo HD-Zip. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1 ---TTTACGGTTATAAAAGTGATTGCATGGAATCCCCACATTAAGAATAAAATATATAAATCAGATAATTAAACAAAATATAAGTAAAAAAAAAATGGAT 97 GmFAD3B 1 CACTGTTCCATTATGATCTTGGTTGCGATAATAATAAATAAATATTTTGATTTACATAAACTATATTAT-AGTTAAGGAATTTTTTAAGCATTTTCATAT 99 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 98 CAAATAATTAAATCAAATAATTAATCTGCAGTTGCTTTTTGACTGCTAGCAATCTTGTTCTCAAACTTACCCCTGTATTATACGAATTGATAACGGTGTA 197 GmFAD3B 100 AGAAGAAGTATG-CTAACAAGTTATATTTAAGTACTCTTT--CTAAAAGAATTAATAGGC-CAAAGTTAACGATTTCCACAAGTATTTAATAATGTATGT 195 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 198 AAACTCAATGTAGAGCTTATTTTCTCTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTTTATGTAAAACTAGTCATTTTTTCTAAAAAAAAGCACTATATAATAGTTT 297 GmFAD3B 196 TCACTTATTTTTTAGGATAAGTACATTAATAAGTTATACATAATTTTAACTGGT-TAACA-----TATTCTTTCTAAAAAAAATAAGTAGATG-TACCTT 288 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 298 AATTGGGTCATTGAAATTTTTTCGTTATTGTCTTATAGTTTTTTTTATCATTTGTATTATAAATAATATATCATTGATAAAAATAATTCTTAGTCAAATT 397 GmFAD3B 289 AT---AATTATCAATCTATTATAATTATCA--ATATAGGTTGTTTTA---CATAGAAAAAAACTTATAAATAGATGGAAGAGAATATAAATTTTACAAAA 380 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 398 TTAACTTTATTTTTCTTTTAGTCAAACTTTAAATTAGTTAAGAGTTCATTTTTCCTGAAAGATTAAGACTAAAAAAATATTACAAATAATAT--AAATAA 495 GmFAD3B 381 TTAACATTAATTATCATTTATTCATTTTTAGTTTTTGTTA----CTCATATCACTAATATATATAAATACAAAAGTATAATTAATATTACATTGAAAAGA 476 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 496 AAAAACAATTAATACTACACTAAAAAAGGTTAAAATAATAATTATTTAAGAATTTATTTTCTTCTTATACAACA-ATAATTATAGGACACAAGGAGTAAT 594 GmFAD3B 477 TAAAATAATAATTATTTTGGGGGAAAAATTTTC--TTACACCATATGAAAAGGGTGGAGGATTTAAATTTAATAGATCATTAAAAAATATTTATTATTGT 574 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 595 AATTTAATGTTGTTCAATTCTTGT-TTCAATAATTG--AGTT--GTTATGAGCACATTAAATAATTATTGTAAATAGAATGGCATTAATTACAATAATAA 689 GmFAD3B 575 AATT-AATGCCTTTCTATTAAAAAACTTAATGAGTGTGAGTTAAGTTTAATGGACATTGAAAAGTCTTTATTGCTGTAATTAATGTCATTTTATTGTCAA 673 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 690 AAACTTTTTAAGG-ATCCATTG-AACTTAATTCCCGGCTACTAAGTTTTTTAATAGAATGACA--TTAATTACAAGAATAAAGACTTTTTAATGATCCAT 785 GmFAD3B 674 TAATCATTTAATGTGTTCATAGCAGCTCAATTATTGA-TACAAGAATTCAAAGGTGATTTACTGCCTGCGTCCTACGATTATTGTGGTATAAGAATAAAA 772 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 786 TAAACTTAAATAATAAAATTCAATTAACTAATTTACA--GTAATTAAGAAAATTAGTTAATTTAGATAATAACATTAAAGTTGTGCTAAATTATATGTTT 883 GmFAD3B 773 TAAGTTTCAA-AATAATTTTTATTTTAGTTTTTTTTAATGTAATATTAATTTTTTATTTATATTACTTATAATATTAATGAAAACAAAAATTATAAATGA 871 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 884 TTCTCAAAATTACGTATAACATTAATTAGACATACTTTTATTTTTTAAAATTTTTTTATCGCCTTAATTCTTTTAATCTCTCCTCATAATATGTTCATTG 983 GmFAD3B 872 ATT----AATGATA-ATAAAATTAATTTTATGAAATTG-ATATTTTTTCATCTATTTATTA----ATTTTTCTTGGTATATATAAAAAATA-ACTTAAGA 960 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 984 CTTTAATTTTTATTAGCTTTGCATGCTAGGAAGCAATTTG-CATGCTAGGAAGCAAAGTAAAATTCTCAA--ACTGTATAACTTATTTTC---TCTTGTT 1077 GmFAD3B 961 CAATAATTATTATGAAATAAAAAAATATTAAAATAGAATGACATTAATCACAATAATAAAAAAATTTCAATGACCCATTAAATTATTATACAATATTTTT 1060 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1078 GTATATAAAACTAGTCATTTTTCATTAAAAAGCATTGTATAATAGTTTAATGGGTCA--TTGAAATTATTATAATT-----AATGTCATTCTATTTTTAA 1170 GmFAD3B 1061 TTATGGAAAACCACTAGTTTT--ACTTAAAAACAAGAGAAAATAAATTACAAAGTGAGTTTTACACTGTATCTATTCATAAAACACCATGATAAGTTTGA 1158 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1171 TACTCCTTTTGTTTGATAATGATTATCGTTTCATGTTATTTTCTATACATATCAAGACAAATTAATAAATGGATAAAAAAGTATCAATTTTATAAAATTA 1270 GmFAD3B 1159 GATCATGACTGTCT-ACAGTGGAAAAGCAACCGCAGGGTCCTACAGTCACAATCCAA-AGGTTGATTTTTTTTTTCACTTATATTTTGTTTAATTATTTA 1256 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1271 ATATTATTATTATTAATTTAT-----TTATAATTTTTTGTTATCATTTATATTATAAGTAATATATTATTGGCAAAAATAATTTTTGATCAATTATATTT 1365 GmFAD3B 1257 ATTTTTATATT-TTACTTTTTAAAGGTGGAAATTTCATGCTATCACTTTTGTGACGATAAAGAATTCATTTTATAAGTTTATTAATTTTTA-TAATAATT 1354 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1366 ACCTGTCGGTCGAACTCTAGATTATGCTGGGTATCTTCTCCAAATGAA-----TCCAAAGATTAAAA---TAAAATAAAATTATAAGTAATATAAATAAA 1457 GmFAD3B 1355 ATCTAAAAAATTACATCAATAATAATTTTTGTTTTTTTAGAGAAAAATAATTTTCTATTAGCTGATAGCTTAAAATAATTTTATACATAATATAA-TATA 1453 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1458 AAACAATTAATACTAGATTAACAAGACTAAAATAATAATTATTTTATAATTTATTTTCTTCAATAATTGTAGAATACAAGGAGTAATATTTA--ATGTTG 1555 GmFAD3B 1454 TGACTATTAAATTTTAAAAAATAAACACATTTCAATA--TCTTCTAAAGTACTAGAGAAATAATTCGAATTGAATTTAACGAAAAAGTTTTATAATTTTT 1551 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1556 TTTAATTCTTGTTTCAATAATTGAGATGTTTTGAACAAATTAAATAATTATTGTAAATAGAATAACATTAATTACAATAATAAAATCATTTTAACGATCC 1655 GmFAD3B 1552 TTTAGTGCATACTCTCACAATTGTTTCATTATTTTTGTTGGAAGCAATTA--ATTACTTGCACAATTTTTATTTGGGGGTCATAGTTAATT-ACCACTAC 1648 89 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1656 ATTAAACTTAAATGATAAAATTCAACTAACTAATTTGGAGTAATTAAGAA-AAATAGTTAATTTAGACAACAATATTAAATTTTTGCTAAATTATATGTT 1754 GmFAD3B 1649 AACCAACCGTAATTGGGTTGTTCCATTCCGTGACT-AAAGTACTAAATAATAAATAAATAAATAAAACAAAACAAGATAATTCAACTTCAATTATTAATT 1747 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1755 TTTCTCAAAATTACCTATAACATTAATAAGACATACTTTTATTTTTCAAAGATTTCTACTTAATTAACCGCCACAAATTCATCCTCGCTGGTTTGTCCTA 1854 GmFAD3B 1748 TAGTTCTTAGTAAAACTTAAGAGCTCAAGATCAAATTAAAATAATTTTGATATTTTTGTTTAATTATATGATAGGGATTTAATTTTTCTG-TCTAAGATA 1846 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1855 CAC-CGTATGTTTTTTGACGTCAGCTAGGCAAACCAACATAAATAGGAAGCAGTAGAAGTAAAAGTAG----AATGTGGTAGTGTTATTATTATTTACTA 1949 GmFAD3B 1847 TATTCCTGATTCTTTTTTTGTGACGTTAAATAGGAAATAGGGGGAGGAAGCAGTAGAAGTAAAACAAACTCTAATGTGGTAGTGTTGTTATTATTTACTG 1946 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GmFAD3A 1950 C---TGTTTCACCTTGGTGTTATATAAATGCACTACCCCATAATTGAATTTTTCAAAGATTTCATTCTTCCTCTTCTAGGTTATTACGCACCACCCACCA 2046 GmFAD3B 1947 CCAGTGTTTCACCCTGCGGTTATATAAATGCACTATCCCATAAGAGTATTTTTCGAAGATTTCCTTCTTCCTATTCTAGGTTTTTACG-------CACCA 2039 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. GmFAD3A 2047 CGTATCCCTGAAAAGAGAGAAAAAC-ACACT----AAGCCAAAGCCAAAGCAGCAATG--------- 2099 GmFAD3B 2040 CGTATCCCTGAGAAAAGAGAGGAACCACACTCTCTAAGCCAAAGCAAAAGCAGCAGCAGCAGCAATG 2106 Figura 4.12 Alineamiento de las regiones promotoras de los genes GmFAD3A y GmFAD3B de soja. Con fondo rojo se indican las secuencias de unión para HD-Zip en GmFAD3A. Con fondo verde se indica la secuencia de unión para HD-Zip en GmFAD3B. Para el alineamiento se utilizaron 2000 pb en dirección 5’ del ATG. Como se puede observar en la figura 4.12, en el análisis in silico se encontró 3 veces la secuencia consenso de reconocimiento para los factores de transcripción HD-Zip de clase 1 en la región promotora de GmFAD3A (CAAT(A/T)ATTG, en las posiciones -1476, -579 y -529 delante del ATG). Este mismo tipo de secuencia consenso se encontró solamente una vez en el caso de la región promotora de GmFAD3B (en la posición -1403 delante del ATG). Estas secuencias de reconocimiento no se detectaron en ninguna de las regiones promotoras de los genes GmFAD7-1, GmFAD7-2, GmFAD8-1 y GmFAD8-2, sugiriendo un posible papel de regulación específico de las -3 desaturasas reticulares. 90 4.1.8. Análisis de los datos de expresión de las  -3 desaturasas disponibles en otras especies (Arabidopsis y Trigo) Uno de los objetivos posteriores del trabajo fue también el de comparar los datos obtenidos en nuestro trabajo con los presentes en la literatura o en determinadas bases de datos en relación a otras especies vegetales. Para esta parte, se realizó un análisis comparado con los datos obtenidos durante este trabajo y los disponibles en la base de datos eFP Browser (http://bar.utoronto.ca/efp/cgibin/efpWeb.cgi) sobre Arabidopsis (Schmid y col., 2005), y los presentes en la literatura sobre trigo (Horiguchi y col., 1998). El análisis comparativo de las tres especies permite evaluar los mecanismos de regulación que participan en la síntesis de ácidos grasos trienoicos durante el desarrollo de la hoja. Estas tres especies vegetales, permiten el análisis relativo de una planta 18:3 dicotiledónea (soja), una planta 16:3 dicotiledónea (Arabidopsis) y una planta 18:3 monocotiledónea (trigo). Los datos correspondientes a las dos especies adicionales se presentan a continuación en sendas figuras para facilitar la discusión del capítulo. Los datos de Arabidopsis se corresponden con los experimentos de desarrollo hechos con el chip ATH1. Los códigos TAIR de los genes de las -3 desaturasas de Arabidopsis son: AtFAD3 (At2g29980), AtFAD7 (At3g11170) y AtFAD8 (At5g05580). Los datos de expresión se muestran en la figura 4.13. 91 Figura 4.13 Expresión de los genes de las  -3 desaturasas de Arabidopsis durante el desarrollo de la hoja. Expresión relativa extraída de los experimentos de microarrays depositados en la base de datos eFP Browser. Es importante resaltar que el chip ATH1 utilizado para los análisis representados en la figura 4.13, no permite la diferenciación entre los transcritos AtFAD7 y AtFAD8, lo cual impide la comparación de manera individual, de estos datos con los obtenidos durante este trabajo en soja. Los datos representados en la figura 4.13 muestran que todas las -3 desaturasas de Arabidopsis, AtFAD3 y AtFAD7+AtFAD8 se expresan en todos los estadios de desarrollo de la hoja, además de que su expresión no presentó ninguna variación con el desarrollo de este tejido. Cabe destacar sin embargo, que los valores absolutos de expresión de los genes de las -3 desaturasas plastidiales eran mayores que los de la -3 desaturasa reticular. 92 En el caso de los datos de trigo presentes en la literatura, éstos se extrajeron del trabajo de Horiguchi y col., (1998). Adicionalmente se realizó una cuantificación relativa en base a la imagen del northern blot mostrado en ese artículo. La figura 4.14 muestra estos datos. Figura 4.14 Expresión de los genes de dos  -3 desaturasas de trigo durante el desarrollo de la hoja. (A) Imagen extraída y adaptada de Horiguchi y col., (1998). (B) Cuantificación relativa de los datos de (A) tomando como gen de referencia el mostrado en el artículo (tRNA-Gly). Los datos publicados por Horiguchi y col., (1998) mostraban la ausencia de del mRNA TaFAD3 en hojas de trigo en desarrollo, sin embargo éste sí se detectaba en tejidos de alta proliferación como los meristemos, y en tejidos no fotosintéticos como las raíces. A su vez, el mRNA TaFAD7 se detectaba en niveles altos en hojas sin mostrar variaciones durante el desarrollo de las mismas (Horiguchi y col., 1998). En el trabajo de Horiguchi y col., (1998) no se mostraban datos sobre TaFAD8, citando que se ha ligado anteriormente el papel de esta desaturasa a la respuesta de las plantas al frío (Gibson y col., 1994). 93 4.1.9. Discusión En la literatura existen numerosos estudios que describen la acumulación del ácido graso 18:3 durante el desarrollo del tejido foliar en plantas (Leech y col., 1973 ; Horiguchi y col., 1996a ; Horiguchi y col., 1996b ; Horiguchi y col., 1998). Sin embargo, los estudios que valoran de la contribución de las -3 desaturasas a la síntesis de 18:3 durante el desarrollo de las hojas a nivel molecular, son poco frecuentes y se centran principalmente en plantas monocotiledóneas (Horiguchi y col., 1996a ; Horiguchi y col., 1998), probablemente porque su patrón de desarrollo de tejido es más sencillo que el de dicotiledóneas (Tsukaya, 1995). El objetivo de este estudio llevado a cabo durante esta Tesis Doctoral era el de analizar la contribución a nivel molecular de las -3 desaturasas reticulares y plastidiales, a la producción de ácidos graso linolénico (18:3) durante el desarrollo en soja. La primera conclusión que se extrae del análisis comparativo de las tres especies es que en las dos plantas dicotiledóneas (soja y Arabidopsis) se detectaba la expresión de los genes FAD3 y FAD7+FAD8 en hojas, sugiriendo la participación de ambos tipos de enzimas en la biosíntesis de 18:3 en plantas dicotiledóneas. Es importante remarcar además, que en soja se detectaron tanto los dos genes GmFAD7 como los dos GmFAD8 en todos los estadios de desarrollo de la hoja. Sin embargo en trigo (planta monocotiledónea), actúa un mecanismo espacial de regulación de la expresión de ambos genes separando la expresión de TaFAD3 en tejidos no fotosintéticos y la de TaFAD7 en hojas (Horiguchi y col., 1998). La hipótesis de que este patrón de expresión se pudiera relacionar con el distinto modelo de desarrollo de las hojas en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, requeriría un análisis exhaustivo en otras especies vegetales. No obstante, los patrones de expresión de las -3 desaturasas en trigo sugieren que el ácido graso 18:3 presente en lípidos cloroplásticos y extracloroplásticos en las hojas de esta 100 Tabla 4.1 Resumen de los trabajos de identificación de la función y localización de las desaturasas de ácidos grasos de plantas. Los datos fueron extraídos de la literatura indicada en cada caso y de las bases de datos AT_CHLORO (http://www.grenoble.prabi.fr/at_chloro/) y SUBA3 (http://suba.plantenergy.uwa.edu.au/). Con fondo marrón se destacan las desaturasas localizadas en el retículo endoplásmico y con fondo verde las localizadas en el cloroplasto. Con fuente amarilla se resaltan las localizaciones llevadas a cabo mediante estudios de proteómica. 101 Como se indica en la tabla 4.1, las desaturasas FAD2 y FAD3 de Arabidopsis se han localizado en el retículo endoplásmico mediante la detección directa de su actividad (Slack y col., 1976 ; Stymne y Appelqvist, 1978 ; Miquel y Browse, 1992). Las desaturasas de membrana FAD2 y FAD3, también se han localizado en el retículo endoplásmico mediante sobreexpresión en suspensiones de células BY-2 de tabaco, utilizando fusiones en N-terminal con los epítopos “myc” (myelocytomatosis) o “HA” (human influenza hemagglutinin) y anticuerpos específicos para éstos (Dyer y Mullen, 2001). Aunque los datos de identificación por masas de Mitra y col., (2009) detectan FAD2 en la membrana plasmática, esta localización no es necesariamente extraña, ya que se han detectado zonas de contacto entre membranas de diferentes orgánulos como las que existen entre la envuelta externa del cloroplasto y el retículo endoplásmico, denominadas PLAMs (Plastid Associated Microsomes) (Andersson y col., 2007). El caso de la desaturasa FAD4 (que produce trans-16:1) es algo más particular, pues aunque la hipótesis de su existencia está presente en la literatura desde el aislamiento del mutante fad4 (McCourt y col., 1985), ésta ha sido la desaturasa que más tarde se ha identificado debido a sus diferencias con el resto de desaturasas que introducen los dobles enlaces en posición cis. El aislamiento del gen que la codifica se realizó en el año 2009, y se localizó en el cloroplasto mediante expresión transitoria (Gao y col., 2009). Sin embargo no existen datos de proteómica que confirmen su localización. En el caso de la 9 desaturasa FAD5, la identificación del gen que la codifica también tardó en realizarse, debido a su similitud con otras desaturasas extraplastidiales (Heilmann y col., 2004a ; Heilmann y col., 2004b). Los estudios de proteómica localizan esta desaturasa en la envuelta interna cloroplástica. No obstante, la base de datos AT_CHLORO (http://www.grenoble.prabi.fr/at_chloro/) indica que su identificación aún está por confirmar. 102 En el caso particular de la -6 desaturasa FAD6, su actividad se detectó en envueltas del cloroplasto mediante ensayos enzimáticos directos (Schmidt y Heinz, 1990a), llegando más adelante incluso a purificar la enzima partiendo de envueltas del cloroplasto de Spinacia oleacera (espinaca) que permitieron un análisis posterior de actividad (Schmidt y Heinz, 1993). Además la localización de esta enzima en la envuelta del cloroplasto fue comprobada gracias a los estudios de proteómica del cloroplasto (Ferro y col., 2003 ; Froehlich y col., 2003 ; Ferro y col., 2010). Estos estudios de proteómica permitieron localizar también las -3 desaturasas plastidiales, FAD7 y FAD8, en la envuelta cloroplástica. Sin embargo, no existen datos sobre la organización de estas enzimas en la membrana. Estos datos podrían aportar información necesaria para la comprensión de su funcionamiento. 4.2.1. Fraccionamientos subcelulares de soja: cloroplastos y envueltas del cloroplasto Una primera aproximación para estudiar la localización de las -3 desaturasas de soja es estudiar su distribución en diferentes fracciones subcelulares, en nuestro caso principalmente cloroplastos y fracciones subcloroplásticas. Los protocolos de aislamiento de cloroplastos y otras fracciones subcloroplásticas utilizados en esta Tesis Doctoral se describen en el apartado de materiales y métodos. El aislamiento de cloroplastos intactos se realizaba partiendo de aproximadamente 100 g de hojas de soja, que eran troceadas, lavadas, homogeneizadas con tampón y filtradas. El filtrado se sedimentaba por centrifugación y se resuspendía en un volumen menor, sometiendo posteriormente a la separación de sus componentes mediante la centrifugación en un gradiente de percoll. Del gradiente se aislaba la banda correspondiente a los cloroplastos. La figura 4.1 muestra una imagen de microscopía óptica representativa de la fracción de cloroplastos obtenidos mediante este aislamiento. 103 Figura 4.1 Imagen de microscopía óptica de la fracción de cloroplastos aislada por el método utilizado en esta Tesis Doctoral. Los cloroplastos intactos presentan una forma elíptica y condensada, los rotos presentan una forma más redondeada. Como se observa en la figura 4.1, las muestras de cloroplastos eran homogéneas y contenían principalmente cloroplastos tanto rotos como intactos. En ocasiones, estas muestras de cloroplastos contenían células del parénquima en empalizada que no se habían roto durante el proceso y que migraban junto a los cloroplastos en el gradiente de percoll. El aislamiento de envueltas del cloroplasto se realizaba partiendo de 250 g de hojas de soja, que eran también lavadas, troceadas, homogeneizadas con tampón y filtradas. El filtrado, enriquecido en cloroplastos, se sedimentaba por centrifugación y se lavaba, resuspendiéndolo posteriormente en un tampón con sacarosa. El homogeneizado se sometía a tres ciclos de congelación y descongelación a -20 ºC, para proceder a la ruptura de las envueltas cloroplásticas y se dejaba reposar a 4ºC durante una hora para facilitar la separación de las envueltas y los tilacoides. Más 104 tarde se procedía a la sedimentación de la fracción tilacoidal y la purificación de las envueltas en un gradiente de sacarosa. La banda amarillenta obtenida en el gradiente era lavada con tampón, congelada en nitrógeno líquido y conservada a -80 C. El grado de purificación de este fraccionamiento se observa por la coloración de la banda tal y como se observa en la figura 4.2. Las envueltas del cloroplasto carecen de clorofila (verde), que es un pigmento tilacoidal, y sus principales pigmentos son los carotenoides, de entre ellos el mayoritario es la violaxantina de color anaranjado (Douce y Joyard, 1981). Figura 4.2 Imagen del aspecto del gradiente de sacarosa tras la ultracentrifugación. La banda superior (amarilla) corresponde a las envueltas y el sedimento situado en la parte inferior del tubo (verde) son los tilacoides. 4.2.2. Valoración de los fraccionamientos con el anticuerpo antiTic40 La valoración de las fracciones subcelulares de soja obtenidas por los diversos protocolos detallados se realizó con el anticuerpo antiTic40 (Agrisera) como se puede observar en la figura 4.3. Tic40 es una proteína que participa en el sistema 105 de importe de proteínas al cloroplasto. Además se utiliza como marcador de envuelta interna cloroplástica. Este anticuerpo comercial se obtuvo para la proteína de Arabidopsis y no había sido testeado hasta el momento en soja. Figura 4.3 Detección mediante western blot de la proteína Tic40 en las diferentes fracciones subcelulares obtenidas de plantas de soja. El anticuerpo primario utilizado fue el antiTic40 de Agrisera (AS10 709). * Banda inespecífica de cloroplastos. El peso molecular de la proteína Tic40 se estima que es de unos 45-48 kDa en Arabidopsis. En consecuencia, la banda de la proteína Tic40 en la figura 4.3 podría corresponder a la de mayor intensidad en cloroplastos, que también se observa en la muestra de envueltas. El resto de bandas observadas en el carril correspondiente a las envueltas podrían ser productos de degradación de Tic40. La banda inferior de cloroplastos podría corresponderse con una banda inespecífica propia del anticuerpo secundario que se explicará en un apartado posterior. El resultado más 106 relevante de este experimento fue que el anticuerpo antiTic40 no detectó ninguna banda en las muestras de tilacoides purificados, lo que sugiere que el fraccionamiento utilizado es correcto. 4.2.3. Detección de GmFAD7 en fracciones subcelulares y tejidos de soja Una vez que los protocolos de obtención de fracciones subcelulares de soja estuvieron puestos a punto, se procedió a evaluar la presencia de la proteína FAD7 en cada una de ellas, además de en otros tejidos. Uno de los objetivos principales de esta Tesis Doctoral, era el de caracterizar los perfiles de proteína asociados a la utilización del anticuerpo antiGmFAD7 obtenido en nuestro grupo de investigación. Para llevar a cabo este objetivo, se realizó un trabajo exhaustivo de identificación de bandas en geles monodimensionales. Esto permitiría relacionar estos perfiles con los que obtuviéramos posteriormente en geles bidimensionales, donde realizaríamos la identificación de las proteínas por masas. Las bandas observadas con este anticuerpo en los diferentes tejidos y fracciones subcelulares estudiados en esta Tesis Doctoral se muestran en la figura 4.4. 107 Figura 4.4 Bandas observadas mediante western blot sobre los diferentes tejidos y fracciones subcelulares obtenidos con el anticuerpo antiGmFAD7 (dilución 1:200). El anticuerpo secundario utilizado fue el goat anti-rabbit de Agrisera (dilución 1:25000). Para la realización de este western blot se cargaron 15  g de proteína de cada fracción. Los perfiles de bandas obtenidos durante esta Tesis Doctoral eran similares a los obtenidos en los trabajos anteriores del grupo. Como se observa en la figura 4.4, existen dos tipos de bandas detectadas con este anticuerpo, que se diferencian por la intensidad de su señal. Las bandas más intensas fueron las de 39 y 42 kDa en cloroplastos y tilacoides sin purificar; la de 80 kDa observada en semillas y la de 30 kDa detectada en cloroplastos, tilacoides (purificados o no) y membranas BBY. El resto de bandas observadas, menos intensas, variaban de intensidad dependiendo del estado de los reactivos de revelado y en ocasiones ni siquiera aparecían, así que se consideraron bandas inespecíficas o ruido de fondo. 108 4.2.4. Revelado con el suero preinmune Para descartar la presencia de bandas inespecíficas y detectar estas en los revelados de geles bidimensionales llevamos a cabo varios controles; el primero de ellos consistió en el revelado de las mismas muestras con el suero preinmune. El suero preinmune es el suero extraído del conejo antes de realizar el proceso de inmunización que da lugar a la síntesis del anticuerpo. Los resultados se observan en la figura 4.5. Figura 4.5 Control realizado con el suero preinmune para la identificación de bandas específicas. (A) Bandas detectadas con el anticuerpo antiGmFAD7 (dilución 1:200). (B) Bandas detectadas con el suero preinmune (dilución 1:200). El anticuerpo secundario utilizado en ambos casos fue el goat anti-rabbit de Agrisera (dilución 1:25000). Para la realización de este western blot se cargaron 15  g de proteína de cada fracción. Como se observa en la figura 4.5-B, los anticuerpos propios del suero preinmune detectaban proteínas en las muestras analizadas. La intensidad de 109 algunas de estas bandas era menor que la de las bandas detectadas por el anticuerpo antiGmFAD7. Como se observa en la figura 4.5-B, el suero preinmune reconocía las dos bandas de 42 y 39 kDa en cloroplastos y tilacoides sin purificar, así como las de 30 kDa observadas en estas mismas muestras. Además, el suero preinmune reconocía diversas bandas inespecíficas de menor intensidad en varias muestras. Por otro lado, el suero preinmune no reconocía la banda de aproximadamente 80 kDa detectada en semillas. 4.2.5. Revelados con anticuerpos secundarios En segundo lugar, se llevó a cabo un control revelando exclusivamente con el anticuerpo secundario. El objetivo de este control era el de descartar que éste estuviera reaccionando por sí mismo con alguna proteína de la muestra y por lo tanto, revelando bandas inespecíficas. Los resultados se muestran en la figura 4.6. 116 Los estudios realizados con el anticuerpo antiGmFAD7 realizados durante esta Tesis Doctoral presentan datos que generan dudas razonables sobre el reconocimiento específico de la proteína en alguna de las muestras analizadas. La única banda que superó los controles realizados, y por lo tanto la única que se hubiera podido considerar específica bajo estos controles, fue la de 80 kDa de semillas. Sin embargo el análisis por masas no identificó la proteína FAD7 en esa zona del gel (como tampoco fue identificada en tilacoides). Adicionalmente a estos datos, la proteína FAD7 sería a priori, más abundante en muestras de cloroplastos o envueltas, que en semillas, ya que los datos de proteómica en Arabidopsis la localizan allí (Ferro y col., 2003). En semillas, la principal -3 desaturasa que se ha relacionado con la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados es FAD3 (Lemieux y col., 1990). Todos estos datos desaconsejan el uso del anticuerpo para la localización de la proteína FAD7. 4.2.7. Clonación de los genes de las  -3 desaturasas plastidiales (FAD7) de soja y Arabidopsis y la  -6 desaturasa plastidial (FAD6) de Arabidopsis en vectores de destino para la transformación de plantas A la vista de los problemas para utilizar anticuerpos específicos contra la proteína GmFAD7 y tras la identificación de un segundo gen FAD7 en soja en un trabajo anterior del grupo (Andreu y col., 2010), se decidió utilizar otra aproximación experimental para el estudio de su localización subcelular. Para ello, decidimos realizar la localización de las proteínas FAD7 mediante la fusión de sus secuencias codificantes con un gen reportero y la generación (por transformación con Agrobacterium tumefaciens) de líneas transgénicas estables. Debido a la facilidad de trabajo con la tecnología Gateway, decidimos ampliar el estudio también a las proteínas FAD6 y FAD7 de Arabidopsis. 117 Las construcciones realizadas en el vector de entrada pENTR™/D-TOPO se muestran en la figura 4.11. Figura 4.11 Esquema de los vectores de entrada pENTR™/D-TOPO generados mediante la inserción de los genes amplificados por PCR. Como se muestra en la figura 4.11 se generaron cuatro vectores de entrada distintos mediante el clonaje de los genes AtFAD6, AtFAD7, GmFAD7-1 y GmFAD72. La amplificación de estos genes por PCR y su posterior clonación se describe en el apartado 5.2.5.1 de materiales y métodos. Los cuatro insertos se trasladaron a los vectores de destino mediante la reacción LR clonasa descrita en el apartado 5.2.5.2 de materiales y métodos. Los vectores de destino generados mediante esta técnica se muestran en la figura 4.12. 118 Figura 4.12 Esquema de los vectores de destino generados mediante las reacciones LR clonasa realizadas durante esta Tesis Doctoral. Como se observa en la figura 4.12 se generaron cuatro vectores de destino para la transformación de Arabidopsis y la generación de líneas estables. Además de éstos, las plantas de Arabidopsis se transformaron con los vectores vacíos correspondientes, y fueron utilizadas como control negativo. El vector pEarleyGate101 contenía la proteína YFP (Yellow Fluorescent Protein) fusionada en C-terminal y el vector pEarleyGate102 contenía la CFP (Cian Fluorescent Protein) también en C-terminal. Ambos vectores pertenecen a la colección de vectores de destino compatible con Gateway descrita en Earley y col., (2006). Utilizamos ambos vectores con vistas a estudiar en un futuro la posible co-localización de las proteínas AtFAD6 (con CFP) y AtFAD7 (con YFP). Si los patrones de localización de ambas proteínas por separado fueran similares, sería posible utilizar la técnica de FRET para estudiar si existe interacción entre ellas. La elección de las fusiones en C-terminal y no en N-terminal se hizo pensando en que las proteínas de estudio son cloroplásticas y poseen un péptido señal cloroplástico que es procesado tras la inserción de la proteína en la membrana, por lo que de hacer las fusiones en Nterminal probablemente no hubiéramos obtenido ningún tipo de señal. 119 4.2.8. Generación de líneas estables homocigóticas de Arabidopsis Tras la construcción de los vectores de destino, su inserción en Agrobacterium tumefaciens y la transformación de plantas de Arabidopsis de fenotipo silvestre, éstas se propagaron hasta obtener plantas homocigóticas para la inserción. Éstas se caracterizaban por presentar un porcentaje de germinación en medio selectivo con glufosinato de amonio, próximo al 100 %. Los porcentajes de germinación de las generaciones T2 y T3 de estas plantas en medio selectivo se muestran en la tabla 4.2. Construcción % germinación T2 % germinación T3 pEarleyGate101 Vector vacío 59 94 pEarleyGate102 Vector vacío 66 80 AtFAD6:CFP 58 95 AtFAD7:YFP 70 83 GmFAD7-1:YFP 47 72 GmFAD7-2:YFP 69 96 Tabla 4.2 Porcentajes de germinación de las semillas de las generaciones T2 y T3 de las líneas estables generadas durante esta Tesis Doctoral. Con fondo rojo se indican las que dieron resultados positivos y con fondo gris las que no dieron resultados. Los porcentajes teóricos de germinación de las generaciones T2 y T3 deberían ser de un 75 % y un 100 % respectivamente, los valores de germinación de las 120 líneas generadas obtenidos experimentalmente, aunque diferentes, se aproximaban a éstos. Cabe resaltar también, que aunque algunas de las líneas homocigóticas no presentaban porcentajes de germinación próximos a los teóricamente aceptados, dieron resultados positivos. 4.2.9. Microscopía confocal de las líneas estables homocigóticas generadas Las muestras de plantas se prepararon en fresco con glicerol como solución de montaje y se observaron directamente en el microscopio confocal Leica-SP2 (Servicio Científico Técnico de Microscopía e Imagen del IACS-Aragón). En la figura 4.13 se observan las muestras de las líneas estables que contenían los vectores vacíos pEarleyGate101 y pEarleyGate102 utilizadas como control negativo. 121 Figura 4.13 Imágenes de microscopía confocal donde se observan la ausencia de señal de fluorescencia (YFP o CFP) en las plantas transformadas con los vectores vacíos. En estas muestras solamente se observa la señal emitida por la clorofila de los cloroplastos (en rojo). (A) y (B) Imágenes de plantas transformadas con el vector pEarleyGate101 (con YFP) vacío (  excitación YFP: 514 nm,  emisión YFP: 518-580 nm). (C) y (D) Imágenes de plantas transformadas con el vector pEarleyGate102 (con CFP) vacío (  excitación CFP: 458 nm,  emisión CFP: 465-571). En todos los casos se registró la fluorescencia de la clorofila para la colocalización en los cloroplastos (  excitación Clorofila: 633 nm,  emisión Clorofila: 651-717). Como se observa en la figura 4.13, las plantas transformadas con los vectores vacíos no presentaban señal de fluorescencia en el rango de detección de la YFP ó la CFP. En la figura 4.14 se observan los resultados que mostraron las plantas de las líneas estables que expresaban la proteína FAD6 de Arabidopsis fusionada a la proteína fluorescente cian (CFP). 122 Figura 4.14 Imágenes de microscopía confocal donde se muestran superpuestas la señal emitida por la proteína fluorescente CFP fusionada a AtFAD6 (en azul), y la señal emitida por la clorofila de los cloroplastos (en rojo) (  excitación CFP: 458 nm,  emisión CFP: 465-571;  excitación Clorofila: 633 nm,  emisión Clorofila: 651-717). (A), (B) y (C) Detalles de cloroplastos del mesófilo. (D) Detalle de cloroplastos de las células guarda. Como se observa en la figura 4.14, la señal emitida por la CFP fusionada a la proteína FAD6 se detectó en forma de puntos específicos (foci) que parecían localizarse en el contorno de los cloroplastos, tanto en cloroplastos del mesófilo como de la epidermis. Para confirmar si la señal obtenida se localizaba en el contorno del cloroplasto se tomaron imágenes de un mismo cloroplasto en diferentes planos de enfoque en el eje z (altura). Los resultados se muestran en la figura 4.15. 123 Figura 4.15 Imágenes de Imágenes de microscopía confocal donde se muestran superpuestas la señal emitida por la proteína fluorescente CFP fusionada a FAD6 (en azul), y la señal emitida por la clorofila de los cloroplastos (en rojo) en un mismo cloroplasto (  excitación CFP: 458 nm,  emisión CFP: 465-571;  excitación Clorofila: 633 nm,  emisión Clorofila: 651-717). (A) Plano de enfoque superior del cloroplasto. (B) Plano de enfoque medio del cloroplasto. (C) Plano de enfoque inferior del cloroplasto. Como se observa en la figura 4.15, la señal correspondiente a la CFP fusionada a FAD6 se localiza en el contorno del cloroplasto en todos los planos de enfoque, detectándose siempre en puntos concretos o foci. Este patrón de localización es similar al obtenido con otras proteínas localizadas en la envuelta del cloroplasto (Haswell y Meyerowitz, 2006 ; Maple y Moller, 2007 ; Burch Smith y col., 2011 ; Ruppel y col., 2011). Por tanto, los resultados sugieren la localización de FAD6 en la envuelta del cloroplasto. Estos datos son coherentes con toda la literatura anterior referida a la localización de FAD6. Además, las imágenes de microscopía confocal muestran que FAD6 no se localiza de manera homogénea en la envuelta, sino que se organiza en puntos concretos, lo cual sugiere la existencia de zonas de la envuelta cloroplástica especializadas en la actividad -6 desaturasa. En la figura 4.16 se observan los resultados que mostraron las plantas de las líneas estables que expresaban la proteína FAD7 de Arabidopsis fusionada a la proteína fluorescente amarilla (YFP). 124 Figura 4.16 Imágenes de microscopía confocal donde se muestran superpuestas la señal emitida por la proteína fluorescente YFP fusionada a AtFAD7 (en amarillo), y la señal emitida por la clorofila de los cloroplastos (en rojo) (  excitación YFP: 514 nm,  emisión YFP: 518-580;  excitación Clorofila: 633 nm,  emisión Clorofila: 651-717). (A) Detalle de cloroplastos de las células guarda. (B), (C) y (D) Detalles de cloroplastos del mesófilo. Como se observa en la figura 4.16, la señal emitida por la YFP fusionada a proteína FAD7 de Arabidopsis se detectó en forma de puntos específicos en el contorno de los cloroplastos, similares a los observados para FAD6. Este resultado indicó que la proteína AtFAD7 también se localiza en puntos concretos de la envuelta del cloroplasto, tanto en cloroplastos de mesófilo como de la epidermis. Dado el patrón de localización de AtFAD6 y AtFAD7 en foci y, con objeto de confirmar los resultados obtenidos con las líneas transgénicas estables, se llevaron 125 a cabo experimentos de expresión transitoria de estas proteínas en hojas de Nicotiana tabacum (tabaco) a través de una colaboración con el Dr. Fabian E. Vaistij del grupo del Prof. Ian Graham de la Universidad de York, Inglaterra. Los resultados obtenidos mediante esta técnica se muestran en la figura 4.17. Figura 4.17 Imágenes de microscopía confocal de la expresión transitoria en hojas de tabaco de la fusión FAD7:YFP en dos zonas diferentes de células del mesófilo. En estas imágenes se muestran superpuestas la señal emitida por la proteína fluorescente YFP fusionada a AtFAD7 (en verde), y la señal emitida por la clorofila de los cloroplastos (en rojo) (  excitación YFP: 514 nm,  emisión YFP: 518-580;  excitación Clorofila: 633 nm,  emisión Clorofila: 651-717). Como se observa en la figura 4.17, el patrón de localización de la proteína FAD7 de Arabidopsis utilizando la técnica de la expresión transitoria en hojas de tabaco es el mismo que el obtenido en las líneas estables de Arabidopsis. La señal de la proteína AtFAD7 en esta expresión transitoria se localiza de manera homogénea en todos los cloroplastos de las células de tabaco, en puntos concretos (foci) de la envuelta del cloroplasto. La obtención del mismo patrón de localización utilizando ambas técnicas de transformación en dos especies diferentes (líneas transgénicas 132 La validación de estos modelos se podría realizar utilizando las técnicas de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) o BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) para evaluar la posible interacción entre FAD6 y FAD7. Los estudios de topología transmembrana mostrados en la introducción general (apartado 1.4.1.2) mostraron que para los dos programas utilizados, los extremos C-terminales de las proteínas de estudio (AtFAD6 y AtFAD7) estaban localizados hacia el mismo lado de la membrana, apoyando el uso de la técnicas de FRET o BiCF para el estudio de la posible interacción entre AtFAD6 y AtFAD7. Por otra parte, la elevada proporción de señal detectada en cloroplastos de hojas de plantas jóvenes respecto a la que detectada en cloroplastos de hojas de plantas maduras lleva a pensar que existe un control sobre la traducción o la vida media de estas proteínas que depende del estado de desarrollo de los cloroplastos. Los resultados mostrados en la discusión del primer capítulo de resultados (apartado 4.1.8) sobre la expresión de las -3 desaturasas plastidiales en Arabidopsis sugerían una posible regulación post-transcripcional, que en el caso de FAD7 ya ha sido descrita a nivel de mRNA en cultivos celulares de soja (Collados y col., 2006). Los datos disponibles sobre AtFAD6 durante el desarrollo de la hoja en la base de datos eFP Browser sugieren que la expresión de este gen es mayor en hojas jóvenes que en hojas maduras, lo cual presenta mayor correlación con los datos de proteína presentados en esta Tesis Doctoral. Los resultados obtenidos hasta el momento con las líneas transgénicas AtFAD6:CFP y AtFAD7:YFP sugieren que existe un mecanismo de regulación que controla los niveles de proteína disponible que se podría correlacionar con la producción de lípidos cloroplásticos con elevado grado de insaturación durante la maduración foliar (Horiguchi y col., 1996b). Estos datos sugieren que la actividad de las -6 y -3 desaturasas plastidiales es de mayor relevancia al comienzo del desarrollo de las hojas, y que conforme éstas se desarrollan la presencia de estos enzimas es menos importante. 133 4.3. EL ÁCIDO GRASO HEXADECATRIENOICO (16:3) COMO PRECURSOR DE LA SÍNTESIS DE JASMONATOS Las oxilipinas son una amplia familia de compuestos derivados de los ácidos grasos poliinsaturados que generalmente actúan como moléculas señalizadoras (fitohormonas) controlando procesos muy diversos tales como, la respuesta a estrés biótico o abiótico o el desarrollo y el crecimiento de los tejidos vegetales (Feussner y Wasternack, 2002 ; Schaller y Stintzi, 2009). Las oxilipinas más conocidas y mejor caracterizadas son las pertenecientes a la familia de los jasmonatos. Su síntesis tiene su origen en los 9ó 13hidroperóxidos generados a partir de los ácidos grasos poliinsaturados cloroplásticos, pues las enzimas responsables de las etapas iniciales de su síntesis se han localizado en este orgánulo (Ishiguro y col., 2001). Los jasmonatos son moléculas clave en la defensa de las plantas frente al ataque de herbívoros y patógenos (tanto específicos de hoja como de raíz) (Acosta y Farmer, 2010) y también juegan un papel importante en el desarrollo vegetal. Así, son esenciales para el correcto desarrollo de los estambres y su ausencia provoca esterilidad masculina; además participan en la regulación del tamaño del peciolo, de las semillas, de los pétalos y afectan a la estructura del tejido conductor (Acosta y Farmer, 2010). 4.3.1. Lipasas implicadas en la liberación de los ácidos grasos poliinsaturados de los lípidos de membrana El primer paso para la síntesis de oxilipinas, consiste en la separación de los ácidos grasos poliinsaturados de los lípidos a los que se encuentran esterificados. Por analogía a la ruta de biosíntesis de eicosanoides en mamíferos (moléculas similares a los jasmonatos en plantas), se postuló que es una enzima fosfolipasa de tipo A la que produce la liberación de los ácidos grasos poliinsaturados de los 134 lípidos para la síntesis de los peróxidos (Narváez-Vásquez y col., 1999 ; Schaller, 2001), aunque se han descrito un gran número de enzimas (hasta 46) que podrían ser responsables de este proceso (Delker y col., 2006). Entre todas ellas se encuentran enzimas fosfolipasas A1 y A2 (específicas de las posiciones sn-1 y sn-2 del glicerol, respectivamente), acyl-hidrolasas similares a la proteína “patatin”, lipasas similares a DAD (Defective in Anther Dehiscence) y acil-hidrolasas similares a SAG (Senescence Associated Gene) (Delker y col., 2006). A nivel experimental se ha detectado el aumento de la actividad fosfolipasa A en células de tabaco y en plantas de soja sometidas al tratamiento con diferentes moléculas estimulantes de la respuesta a la defensa en plantas (Roy y col., 1995 ; Chandra y col., 1996). Sin embargo, la mayor parte de los ácidos grasos poliinsaturados en plantas se encuentran asociados a los galactolípidos, y éstos se localizan en el cloroplasto, lugar de inicio de la síntesis de los derivados hidroperoxidados y de los jasmonatos (Schaller, 2001). En Arabidopsis, se ha descrito la existencia de enzimas galactolipasas como la denominada DONGLE (DGL) que posee más especificidad por los galactolípidos que la que posee la fosfolipasa DAD1 descrita hasta el momento (Ishiguro y col., 2001 ; Hyun y col., 2008). Ambas enzimas pertenecen a una amplia familia de genes que codifican lipasas denominada AtPLA1-I (fosfolipasas A1, tipo I), y de modo más reciente se ha visto que existen otras enzimas, diferentes a DGL y DAD1, que realizan funciones redundantes a las descritas para éstas (Ellinger y col., 2010). Debe hacerse notar que el 16:3 se localiza preferencialmente en los lípidos en posición sn-2, de un modo diferente al 18:3, que se encuentra en ambas posiciones, de lo cual se deduce que las lipasas que actúan sobre cada uno de ellos podrían ser diferentes. Si fuera así, la regulación de estas enzimas podría ser clave en la síntesis de ácido 12-oxo fitodienoico (OPDA) y ácido dinor-oxo fitodinenoico (dnOPDA) y su colaboración individual a la síntesis de ácido jasmónico (JA). 135 4.3.2. Reacciones de peroxidación de lípidos. Enzimas implicadas. Una vez liberados los ácidos grasos poliinsaturados de los lípidos a los que están esterificados, se llevan a cabo diversas reacciones de hidroperoxidación de los mismos en respuesta a diferentes estímulos. Las diferentes reacciones de hidroperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados se resumen a continuación en la figura 4.1. Figura 4.1 Metabolismo de los ácidos grasos poliinsaturados que da lugar a los derivados hidroperoxidados en Arabidopsis, principalmente a través de la acción de las enzimas 9-LOX y 13-LOX en plantas. POX (Hidroperóxido isomerasa o Peroxigenasa), AOS (Óxido de Aleno Sintasa), DOX (Dioxigenasa), DES (Divinil Éter Sintasa), EAS (Epoxi Alcohol Sintasa), HPL (Hidroperóxido Liasa); LOX (Lipoxigenasa). Extraída y adaptada de (Feussner y Wasternack, 2002). 136 Como se observa en la figura 4.1, los ácidos grasos poliinsaturados pueden dar lugar a hidroperóxidos que son posteriormente modificados hasta dinorisoprostanos (también fitoprostanos) mediante reacciones no enzimáticas (Parchmann y Mueller, 1998). En plantas, se ha observado el aumento de los niveles de estas moléculas, de estructura similar a las prostaglandinas, en condiciones de estrés oxidativo y en herida (Imbusch y Mueller, 2000). Esto las convierte en buenos sensores del daño oxidativo al igual que en animales, sin embargo, su posible actividad biológica es desconocida (Imbusch y Mueller, 2000). Los ácidos grasos poliinsaturados también pueden transformarse en hidroperóxidos mediante la acción de enzimas - dioxigenasas (Hamberg y col., 1999). Los productos de esta reacción se han relacionado con las reacciones de la planta en defensa al ataque por patógenos (Hamberg y col., 1999). Sin embargo, los hidroperóxidos producidos de manera mayoritaria en plantas provienen de la actividad de las enzimas lipoxigenasas 9-LOX y 13-LOX (Feussner y Wasternack, 2002). Estos hidroperóxidos son posteriormente metabolizados por diferentes reacciones secundarias (figura 4.1). Los compuestos producidos mediante la acción de la enzima peroxigenasa (POX) tienen la misma composición molecular que los producidos mediante la acción de la enzima epoxi alcohol sintasa (EAS). Sin embargo, su estructura tridimensional es diferente debido a la estereoquímica. Ambos tipos de compuestos se han relacionado con las reacciones de defensa frente al ataque de patógenos, aunque los derivados de la acción de la enzima epoxi alcohol sintasa (EAS) sólo se han encontrado en solanáceas (Sanz y col., 1998 ; Hamberg y col., 1999). Menos se conoce de la biosíntesis de los hidroxiácidos grasos producidos por la enzima hidroperóxido-reductasa. Se sabe que éstos son capaces de activar genes de respuesta a patógenos y que, en semillas, parecen ser intermediarios en la degradación de los lípidos de reserva (Weichert y col., 1999 ; Feussner y Wasternack, 2002). También se ha descrito la 137 transformación de los hidroperóxidos en alcoxiradicales a través de enzimas lipoxigenasas, aunque el papel fisiológico de estas moléculas es, a día de hoy, desconocido (Kuhn y col., 1991 ; Feussner y Wasternack, 2002). Los otros tres tipos de reacciones secundarias de transformación de los hidroperóxidos se llevan a cabo por una familia atípica de enzimas monooxigenasas (CYP74s), que consta de tres subfamilias diferentes: AOS (Aleno Óxido Sintasa), HPL (Hidroperóxido Liasa) y DES (Divinil Éter Sintasa). Estas enzimas se caracterizan por no requerir oxígeno molecular ni reductasas del tipo citocromo P450 dependientes de NADP(H) y los nuevos enlaces carbono-oxígeno se generan utilizando hidroperóxidos tanto como sustratos, como donadores de oxígeno (Nelson, 1999 ; Noordermeer y col., 2001 ; Feussner y Wasternack, 2002). De la subfamilia DES se han clonado los cDNAs de patata (Solanum tuberosum), tomate (Lycopersicum esculentum) y Physcomitrella patens (Itoh y Howe, 2001 ; Stumpe y col., 2001 ; Feussner y Wasternack, 2002), la actividad de estas enzimas se detectó en envueltas del cloroplasto (Blee y Joyard, 1996) y se relacionó con la defensa contra patógenos, tales como Phytophthora infestans, en plantas de patata debido a que se detectaron altos niveles de sus productos de reacción, ácido colnelénico (CnA) y ácido colneleico (CA), después de la infección (Weber y col., 1999). De la subfamilia HPL se ha clonado un único cDNA en la mayoría de las plantas, como en Lycopersicum esculentum (tomate), Solanum tuberosum (patata), Capsicum anuum (pimiento) o Arabidopsis (Bate y col., 1998 ; Matsui y col., 1999 ; Feussner y Wasternack, 2002), aunque en otras, como Medicago truncatula, se han detectado varios genes HPL. La enzima de Arabidopsis (AtHPL) es específica para los 13-hidroperóxidos, denominándola 13-HPL, aunque en otras especies se han identificado enzimas que no muestran especificidad para los compuestos hidroperoxidados en posición 9 ó 13, denominándolas 9/13-HPL (Feussner y Wasternack, 2002). La actividad HPL se localizó en primer lugar en los cloroplastos 138 (Vick y Zimmerman, 1987) y posteriormente se confirmó su localización en la envuelta externa del cloroplasto mediante la expresión in vitro del gen de tomate y posterior fraccionamiento cloroplástico (Froehlich y col., 2001b). La actividad de estas enzimas produce la síntesis de aldehídos y alcoholes de cadena corta, de características volátiles como el (3Z)-hexenal y (3Z)-hexenol, que son responsables principalmente del aroma de frutos y flores. Los productos de la actividad HPL también juegan un papel en la defensa de las plantas al ataque por patógenos. Este hecho fue demostrado en plantas de patata en las que la expresión del gen se inhibió mediante el uso de RNAs anti-sentido (Vancanneyt y col., 2001). Con respecto a la subfamilia AOS, en la mayoría de especies como en Linum usitatissimum (lino) o Arabidopsis, también se ha identificado únicamente un gen AOS (Laudert y col., 1996 ; Feussner y Wasternack, 2002) y se ha descrito que la mayoría de estas enzimas son específicas para los 13-hidroperóxidos denominándolas 13-AOS. Sin embargo también se han descrito enzimas de los tipos 9-AOS y 9/13-AOS en otras especies como Hordeum vulgare (cebada) o Physcomytrella patens (Maucher y col., 2000 ; Feussner y Wasternack, 2002). Su actividad también fue vinculada en primer lugar a los cloroplastos (Vick y Zimmerman, 1987). Esta localización fue posteriormente comprobada por inmunocitoquímica en cebada (Maucher y col., 2000). De un modo más concreto, la enzima se localizó en la envuelta interna del cloroplasto mediante expresión in vitro del gen de tomate y posterior fraccionamiento cloroplástico (Froehlich y col., 2001b). La expresión constitutiva del gen AtAOS tanto en plantas de Arabidopsis como de patata, únicamente provocó el aumento de los niveles de JA en las plantas sometidas a herida (Laudert y col., 2000). Sin embargo, la expresión del gen de lino (Linum usitatissimum) en plantas de patata provocó el aumento de los niveles basales de JA, aunque este aumento no tuvo como respuesta la habitual expresión de los genes inducidos por jasmónico, sugiriendo que estos niveles están 139 controlados a través de algún mecanismo de secuestro de la molécula (Harms y col., 1995). Todos estos datos sugieren que la regulación de la expresión y función del gen AOS puede ser diferente entre especies, incluso aunque las enzimas sean específicas del mismo tipo de productos como es el caso entre Arabidopsis y lino, ambas del tipo 13-AOS (Feussner y Wasternack, 2002). 4.3.3. Biosíntesis de Jasmonatos en plantas. Enzimas implicadas. La síntesis de estas moléculas comienza en el cloroplasto a través de la acción de las enzimas Lipoxigenasa (LOX) y Aleno Óxido Sintasa (AOS) que actúan ambas sobre ácidos grasos poliinsaturados como el 18:3 o el 16:3. El esquema de las reacciones que se llevan a cabo se muestra en la figura 4.2. 140 Figura 4.2 Esquema de las reacciones de síntesis de jasmonatos que se llevan a cabo en cloroplastos y peroxisomas. Extraída y adaptada de (Schaller y Stintzi, 2009). Como se observa en la figura 4.2, sobre los ácidos grasos poliinsaturados actúan las enzimas LOX, AOS y AOC que transforman éstos en ácido 12oxofitodienoico (OPDA) ó ácido dinor-oxofitodienoico (dnOPDA) en el cloroplasto, dependiendo de que utilicen 18:3 o 16:3 como sustrato. Estos compuestos son posteriormente transportados a los peroxisomas, donde es sintetizado finalmente el 141 ácido jasmónico (JA). Se han descrito 6 genes LOX (Linoleate Oxygen Oxidorreductase) en Arabidopsis, de ellos, LOX1 y LOX5 se ha comprobado que son 9-lipoxigenasas, el resto (LOX2, LOX3, LOX4 y LOX6) son 13-lipoxigenasas (Bannenberg y col., 2009). Debido a que las enzimas responsables de la síntesis de jasmonatos son las 13-lipoxigenasas, los estudios sobre las enzimas 9lipoxigenasas son minoritarios, aunque de modo reciente se han descrito los productos de su reacción como posibles moduladores del desarrollo de raíces secundarias (Vellosillo y col., 2007) y su papel en la síntesis de oxilipinas o su interacción con otras hormonas vegetales como el etileno es de interés creciente (Bannenberg y col., 2009 ; López y col., 2011). De los genes LOX2, LOX3, LOX4 y LOX6, responsables de la síntesis de los derivados 13-hidroperoxidados, se conoce que el gen LOX2 se activa por aplicación de metiljasmonato (MeJA) y se inhibe durante la senescencia (Bell y Mullet, 1993). La proteína LOX2 se ha localizado en cloroplastos (envuelta y tilacoides) y se conoce que es esencial para la síntesis de ácido jasmónico durante la herida (Bell y col., 1995). En el caso del gen LOX3, se ha visto que se expresa en raíz y que existe inducción de su expresión durante la senescencia (al igual que LOX4) (He y col., 2002) y tras la aplicación exógena de JA (Chung y col., 2008). Aunque se tiende a pensar que las células con cloroplastos son las principales responsables de la síntesis de jasmonatos, estas moléculas también se detectan en la raíz (Staswick, 2009). De hecho también podrían formar parte de los mecanismos de defensa frente a patógenos de la raíz. Como se ha visto anteriormente, únicamente se ha descrito un gen AOS (Aleno Óxido Sintasa) en Arabidopsis (Laudert y col., 1996). La identificación del gen AOS en Arabidopsis y el aislamiento del correspondiente mutante permitió llegar a la conclusión de que su actividad es esencial para la síntesis de todos los compuestos biológicamente activos del tipo jasmonatos (Park y col., 2002). El mutante aos no sintetiza JA ni siquiera tras someter las plantas a herida, además posee esterilidad 244 Shanklin, J., Guy, J., Mishra, G. y Lindqvist, Y. 2009. Desaturases: emerging models for understanding functional diversification of diironcontaining enzymes. J. Biol. Chem. 284. 18559-18563. Shanklin, J. y Somerville, C. 1991. Stearoyl-acyl-carrier protein desaturase from higher plants is structurally unrelated to the animal and fungal homologs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88. 2510-2514. Shanklin, J. y Whittle, E. 2003. Evidence linking the Pseudomonas oleovorans alkane omega-hydroxylase, an integral membrane diiron enzyme, and the fatty acid desaturase family. FEBS lett. 545. 188-192. Shanklin, J., Whittle, E. y Fox, B. G. 1994. 8 histidine residues are catalytically essential in a membrane associated iron enzyme, strearoyl-CoA desaturase, and are conserved in alkane hydroxylase and xylene monooxygenase. Biochemistry. 33. 12787-12794. 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