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Abstract
Los hidrogeles son una clase de materiales capaces de retener una gran cantidad de agua como consecuencia de su arquitectura tridimensional, formada por estructuras poliméricas entrecruzadas. Debido al alto contenido en agua de estos materiales, que los hace similares a los tejidos naturales, su permeabilidad, porosidad, flexibilidad en la fabricación y posibilidad de variar su composición para obtener las propiedades físicas necesarias en función de la aplicación, o de diseño químico que permita su biocompatibilidad, los hidrogeles por sí mismos o combinados con células, han ampliado en la actualidad su espectro de aplicaciones biomédicas. Así, los hidrogeles pueden servir de andamiajes o scaffolds que actúan como un soporte para el crecimiento celular, como materiales para la encapsulación de células, fármacos, proteínas o genes (terapia génica), como adhesivos entre tejidos y superficies de materiales, como sistemas que permiten una respuesta reversible ante un estímulo externo o como membranas porosas. En particular, campos tan activos como la Ingeniería de tejidos (IT) y su uso como sistemas para transporte y Liberación controlada de fármacos (LCF), han identificado a los hidrogeles como materiales con amplias posibilidades, e impulsado en gran medida su desarrollo. El trabajo recogido en esta Memoria está enfocado al desarrollo de hidrogeles físicos termosensibles susceptibles de ser posteriormente reticulados químicamente mediante fotopolimerización, para ser procesados de forma macroscópica, con dimensiones desde varias micras a varios centímetros, y utilizados como soportes en cultivo celular, y procesados de forma nanoestructurada (Nanogeles), que son dispersiones acuosas de partículas de hidrogel con tamaño nanométrico, para su utilización en transporte y Liberación controlada de fármacos. Las moléculas gelificantes utilizadas para la preparación de estos hidrogeles están basadas en estructuras de tipo dendrítico-lineal-dendrítico, que combinan en su estructura un polímero lineal termosensible, Pluronic F127®, con dendrones de poliéster derivados del ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico (bis-MPA). Estos dendrones proporcionan multifuncionalidad y puntos de degradación por la presencia de enlaces éster. Como grupos funcionales terminales, unidos a la periferia de los dendrones, se han seleccionado grupos fotoreactivos acrilato y tiol. El procesado macroscópico de los materiales ha permitido, mediante polimerización fotoinducida de acrilatos o tiol-enos, la preparación de hidrogeles fotopolimerizados. Los hidrogeles presentaron morfología porosa, diferentes tiempos de degradación y viabilidades celulares in vitro superiores al 85 % tras 72 horas, en ensayos celulares realizados en entorno 2D, lo que permite pensar en su posible aplicación en Ingeniería de tejidos. Por otro lado, el procesado en forma de hidrogeles nanoestructurados ha permitido, mediante polimerización fotoinducida de acrilatos, la preparación de nanogeles. Los nanogeles han presentado tamaños entre 50-100 nm a 37 ¿C y viabilidades celulares in vitro superiores al 50 % tras 72 horas de ensayo. Los nanogeles obtenidos son termosensibles y pueden cargarse con moléculas hidrófobas e hidrófilas, así como producir su transporte e internalización en células in vitro, lo que permite pensar en su posible aplicación como sistemas de transporte y Liberación controlada de fármacos. Jiménez Pardo, Isabel; Ros Latienda, Blanca; Sierra Travieso, Teresa
Full text
2014 28 Isabel Jiménez Pardo Hidrogeles termosensibles y fotopolimerizables derivados de Pluronic® para aplicaciones biomédicas Departamento Director/es Química Orgánica Ros Latienda, María Blanca Sierra Travieso, Teresa Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Departamento Director/es Isabel Jiménez Pardo HIDROGELES TERMOSENSIBLES Y FOTOPOLIMERIZABLES DERIVADOS DE PLURONIC® PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS Director/es Química Orgánica Ros Latienda, María Blanca Sierra Travieso, Teresa Tesis Doctoral Autor 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
TESISDOCTORAL HIDROGELESTERMOSENSIBLESYFOTOPOLIMERIZABLES DERIVADOSDEPLURONIC®PARAAPLICACIONES BIOMÉDICAS Autor ISABELJIMÉNEZPARDO Directores MARÍABLANCAROSLATIENDA TERESASIERRATRAVIESO Dpto.deQuímicaOrgánica FacultaddeCiencias‐ICMA UniversidaddeZaragoza‐CSIC Zaragoza,enerode2014
TESISDOCTORAL HIDROGELESTERMOSENSIBLESYFOTOPOLIMERIZABLES DERIVADOSDEPLURONIC®PARAAPLICACIONESBIOMÉDICAS MemoriapresentadaenlaUniversidaddeZaragozaparaoptaral gradodeDoctor ISABELJIMÉNEZPARDO Dpto.deQuímicaOrgánica FacultaddeCiencias‐ICMA UniversidaddeZaragoza‐CSIC Zaragoza,enerode2014
Prof.MARÍABLANCAROSLATIENDA,CatedráticadelDepartamentodeQuímica OrgánicadelaFacultaddeCienciasdelaUniversidaddeZaragozay Dra.TERESASIERRATRAVIESO,InvestigadorCientíficodelConsejoSuperiorde InvestigacionesCientíficasdelInstitutodeCienciadeMaterialesdeAragóndela UniversidaddeZaragoza‐CSIC. HACENCONSTAR: QuelaMemoriatitulada:“Hidrogelestermosensiblesyfotopolimerizables derivadosdePluronic®paraaplicacionesbiomédicas”hasidorealizadabajo nuestradirecciónporDÑA.ISABELJIMÉNEZPARDOenelDepartamentode QuímicaOrgánicadeestaUniversidadyreúnelascondicionesrequeridasparasu presentacióncomotesisdoctoral. Zaragoza,a30deenerode2014 Fdo.:Prof.MaríaBlancaRosLatienda Fdo.:Dra.TeresaSierraTravieso
ACRÓNIMOS 13C‐RMN ResonanciaMagnéticaNucleardecarbono 1H‐RMN ResonanciaMagnéticaNucleardeprotón ADN Ácidodesoxirribonucleico Alfa‐MEM MinimunEssentialMedium BAβ‐alanina bis‐MPA Ácido2,2‐bis(hidroximetil)propiónico BSA BovineSerumAlbumin CC Ensayosmecánicosconfinados CGC ConcentraciónCríticadeGelificación CMC ConcentraciónMicelarCrítica CMT TemperaturaMicelarCrítica DCC N,N´‐diciclohexilcarbodiimida DCU N,N´‐diciclohexilurea DLS DynamicLightScattering DMAP Dimetilaminopiridina DMEM Dulbecco´sModifiedEagle´sMedium DPBS Dulbecco´sPhosphateBufferedSaline DPTS p‐toluensulfonatodeN,N‐dimetilaminopiridinio DSC (DifferentialScanningCalorimetry)CalorimetríaDiferencial deBarrido DTT Ditiotreitol ECM (ExtracellularMatrix)MatrizExtracelular EDMA Dimetacrilatodeetilenglicol EE EficienciadeEncapsulación EM EspectrometríadeMasas EPR EnhancedPermeationRetentionEffect
FBS (FetalBovineSerum)Suerofetalbovino FDA FoodandDrugAdministration FGF FibroblastGrowthFactor FT‐IR EspectroscopiainfrarrojacontransformadadeFourier GL Glicerol GMA‐chitosan Quitosanometacrilado GPC (GelPermeationChromatography)Cromatografíade PermeaciónenGel HeLa CélulasHomoSapiensCervixAdenocarcinoma HEMA Metacrilatode2‐hidroxietilo HMBC HeteronuclearMultipleBondCorrelation HSQC HeteronuclearSingle‐QuantumCorrelation I2959 Irgacure2959 IT IngenieríadeTejidos LCF LiberaciónControladadeFármacos LCST LowerCriticalSolutionTemperature LSU LightScatteringUnits MALDI‐MS MatrixAssistedLaserDesorption/Ionization‐Mass Spectroscopy Mn Pesomolecularpromedioennúmero MSC (MesenchymalStemCells)CélulasMesenquimales MTT Bromurode3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐ilo)‐2,5‐difeniltetrazol Mw Pesomolecularpromedioenpeso NC Ensayosmecánicosnoconfinados PBS PhosphateBufferedSaline PCL Policaprolactona PDI ÍndicedePolidispersidad PEA Poliesteramidas
PEG Polietilenglicol PEGDA Diacrilatodepolietilenglicol PLA Ácidopoliláctico PLGA ÁcidoPoliláctico‐co‐glicólico PNIPAAm Poli‐N‐isopropilacrilamida PPG Polipropilenglicol Py Piridina RGD Arginina,glicina,ácidoaspártico RTG ReverseThermalGelation S.D. Desviaciónestándar SA ÁcidoSuccínico SEM (ScanningElectronMycroscopy)Microscopíaelectrónicade barrido TEA Trietilamina TEG Tetraetilenglicol TEM (TransmissionElectronicMycroscopy)Microscopía electrónicadetransmisión TsOH Ácidop‐toluensulfónicomonohidrato UCST UpperCriticalSolutionTemperature UV Ultravioleta W0 Pesoinicial Wt Pesoatiempot β‐TGF TransformingGrowthFactor ΔG EnergíadeGibbs ΔS Entropía
ÍNDICE CAPÍTULO1.ANTECEDENTES1 1.1.HIDROGELESCOMOMATERIALESPARAAPLICACIONESENBIOMEDICINA3 1.2.CARACTERISTICASDELOSHIDROGELESPARAAPLICACIONESBIOMÉDICAS8 1.2.1.Hidrogelesconreticulaciónfísica9 1.2.2.Hidrogelesconreticulaciónquímica 13 1.2.3.Hidrogelesnanoestructurados22 1.3.PLURONICYSUSAPLICACIONESBIOMÉDICAS 25 CAPÍTULO2.OBJETIVOSYPLANTEAMIENTO 39 2.1.OBJETIVOS41 2.2.PLANTEAMIENTODELTRABAJO45 CAPÍTULO3.HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:POLIACRILATOS 49 3.1.SÍNTESISYCARACTERIZACIÓN53 3.1.1.Derivadolineal53 3.1.2.Derivadosdendríticos55 3.2.DETERMINACIÓNDELASPROPIEDADESSOL‐GEL 78 3.2.1.Métododeinversióndelvial79 3.2.2.DSC81 3.2.3.Discusióndelosresultados84 3.3.PREPARACIÓNDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS 87 3.4.CARACTERIZACIÓNDELAMORFOLOGÍAINTERNAPORSEM 89 3.5.ESTUDIODEDEGRADACIÓNDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS 92 3.6.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR96 3.6.1.Resultadosdeviabilidadcelulardederivadosacrilados 100 3.6.2.Resultadosdeviabilidadcelulardederivadoscongrupos benciloehidroxiloterminales107
3.7.CARACTERIZACIÓNMECÁNICA114 3.7.1.Ensayosdecompresiónuniaxialmonotónica 116 3.7.2.Ensayosdecompresiónuniaxialdecarga‐relajación 119 3.7.3.Ensayosdefatiga121 3.7.4.Comparaciónconpropiedadesmecánicasdelcartílago 122 CAPÍTULO4:HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:TIOL‐ENOS 125 4.1.DERIVADOSDEPLURONICCONGRUPOSTIOLTERMINALES 129 4.1.1.Síntesisycaracterización129 4.1.1.1.Derivadolineal129 4.1.1.2.Derivadostioladosdendríticos 134 4.1.2.Determinacióndelaspropiedadessol‐gel 141 4.1.2.1.Métododeinversióndelvial 142 4.1.2.2.DSC144 4.1.2.3.Discusióndelosresultados 147 4.1.3.Ensayosdeviabilidadcelular148 4.2.FORMULACIONESDEDERIVADOSF127‐SH‐nYRETICULANTES ACRILADOS154 4.2.1.MaterialesbasadosenmezclasdeF127‐SH‐nconF127‐Ac‐n 154 4.2.1.1.Preparacióndeloshidrogelesprecursoresy estudiodesureticulación 155 4.2.1.2.Determinacióndelaspropiedadessol‐gel dehidrogelespolimerizables 164 4.2.1.3.CaracterizacióndelamorfologíainternaporSEM 167 4.2.1.4.Degradacióndehidrogelesfotopolimerizados 171 4.2.1.5.Ensayosdeviabilidadcelular 173 4.2.2.MaterialesbasadosenmezclasdeF127‐SH‐nconotros reticulantesacrilados180 4.2.2.1.Preparacióndeloshidrogelespolimerizables ehidrogelesfotopolimerizados 181
4.2.2.2.Caracterizacióndelamorfologíainternapor SEMdehidrogelespolimerizadosbasadosenF127‐NHAc‐2182 4.2.2.3.Degradacióndehidrogelesfotopolimerizados 183 4.2.2.4.Ensayosdeviabilidadcelular 184 4.3.ESTUDIOCOMPARATIVOENTREHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS DELCAPÍTULO3Y4186 CAPÍTULO5:HIDROGELESNANOESTRUCTURADOS(NANOGELES) 189 5.1.PREPARACIÓNDENANOGELES195 5.1.1.DeterminacióndelaCMC195 5.1.2.Fotopolimerizacióndelosnanogeles 198 5.1.3.Liofilizacióndelosnanogelesfotopolimerizados 203 5.2.ENCAPSULACIÓNENNANOGELES205 5.3.CARACTERIZACIÓNMORFOLÓGICA208 5.4.ENSAYOSCELULARES219 5.4.1.Viabilidadcelular220 5.4.2.Ensayosdeinternalización222 CAPÍTULO6:PARTEEXPERIMENTAL235 6.1.SÍNTESISYCARACTERIZACIÓNDELOSCOMPUESTOS 239 6.2.PROTOCOLOSDETRABAJO259 6.3.MATERIALESYTÉCNICAS271 CAPÍTULO7.CONCLUSIONES275 ANEXOS279 ANEXOI.CARACTERIZACIÓNESTRUCTURAL 283 ANEXOII.CARACTERIZACIÓNDEHIDROGELESPORDSC 288 ANEXOIII.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR 291
CAPÍTULO1 ANTECEDENTES
Capítulo1 9 Enalgunoscasos,losdostiposdeinteracciones,físicasyquímicas,pueden coexistirenunmismohidrogel.28 Porotraparte,loshidrogelespuedenutilizarsecondimensionesmacroscópicas, desdevariasmicrasavarioscentímetros,oensistemasnanoestructurados,los citadosnanogeles,quesondispersionesacuosasdenanopartículasdehidrogel. Enelcasodelasaplicacionesbiomédicas,eldesarrolloylascaracterísticasdelos hidrogeleshanestadoclaramentemarcadosporeltipodeaplicacionesalquese hadirigidoelmaterial. EltrabajorecogidoenestaMemoriaestáenfocadoaldesarrollodehidrogeles físicossusceptiblesdeserposteriormentereticuladosquímicamentemediante fotopolimerización,paraserprocesadosdeformamacroscópicayutilizados comosoportesencultivocelular,yprocesadosdeformananoestructurada, comonanogeles,parasuutilizaciónentransporteyLiberacióncontroladade fármacos. Pordichomotivo,acontinuaciónserecogenlosaspectosmásimportantesde estostiposdehidrogeles,asícomoantecedentesrecientesrelacionadosconel planteamientodelpresentetrabajo. 1.2.1.‐Hidrogelesconreticulaciónfísica Loshidrogelesfísicossecaracterizanporestarconstituidosporestructuras tridimensionalesgeneradasmedianteinteraccionesnocovalentes,comopor ejemplo,interaccioneselectrostáticas,29hidrófobas30ointeraccionesporenlaces dehidrógeno,31siendoestaestructuratridimensionalcapazdereteneragua. 28(a)Klouda,L.;Hacker,M.C.;Kretlow,J.D.;Mikos,A.G.,Biomaterials2009,30(27), 4558‐4566;(b)Hacker,M.C.;Klouda,L.;Ma,B.B.;Kretlow,J.D.;Mikos,A.G.,S., Biomacromolecules2008,9(6),1558‐1570. 29Wang,Q.;Mynar,J.L.;Yoshida,M.;Lee,E.;Lee,M.;Okuro,K.;Kinbara,K.;Aida,T., Nature2010,463(7279),339‐343.
Capítulo1Capitulok 10 Dentrodeloshidrogelesfísicostienengranimportanciaenbiomedicinaaquellos que,enagua,sufrenunatransicióndefasereversibledebidoaunestímulo externocomoporejemplouncambiodetemperatura,pH,campoeléctrico, concentracióniónica,etc. Eltrabajodeestatesisdoctoralsehacentradoenhidrogelesfísicos termosensibles,32cuyocomportamientosol‐geldependedelatemperatura.Este tipodehidrogelessepuedenclasificarendostipos: ‐ Hidrogelestermosensiblespositivos,queporencimadeunatemperatura seencuentranenelestadosolysugelificaciónseproduceenelproceso deenfriamiento,cuandosealcanzaladenominadaUCST(UpperCritical SolutionTemperarure). ‐ Hidrogelestermosensiblesnegativos,quepordebajodeunatemperatura seencuentranenelestadosolysugelificaciónseproduceenelproceso decalentamiento,cuandosealcanzaladenominadaLCST(LowerCritical SolutionTemperature).Estefenómenotambiénseconocecomo GelificaciónTérmicaInversa(RTG,ReverseThermalGelation). Durantelasúltimasdécadashanadquiridoespecialimportancialoshidrogeles inyectables,quepermitenlaformacióndelhidrogelinsitu.32b,33Lainyecciónes unatécnicamínimamenteinvasivaqueresultafavorableporsufácil administraciónylamínimaincomodidadquecausaenelpaciente.Porotra parte,lainyeccióndelhidrogelenellugardeimplantaciónpermiteunamejor 30Liu,C.B.;Gong,C.Y.;Pan,Y.F.;Zhang,Y.D.;Wang,J.W.;Huang,M.J.;Wang,Y.S.; Wang,K.;Gou,M.L.;Tu,M.J.;Wei,Y.Q.;Qian,Z.Y.,ColloidsandSurfacesa‐ PhysicochemicalandEngineeringAspects2007,302(1‐3),430‐438. 31Pal,A.;Basit,H.;Sen,S.;Aswal,V.K.;Bhattacharya,S.,JournalofMaterialsChemistry 2009,19(25),4325‐4334. 32(a)Klouda,L.;Mikos,A.G.,EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics 2008,68(1),34‐45;(b)Jeong,B.;Kim,S.W.;Bae,Y.H.,AdvancedDrugDeliveryReviews 2002,54(1),37‐51. 33(a)Ruel‐Gariépy,E.;Leroux,J.‐C.,EuropeanJournalofPharmaceuticsand Biopharmaceutics2004,58(2),409‐426
Capítulo1 11 adaptacióndelandamiajealtejidocircundante.Loshidrogelestermosensibles negativosconstituyenunodelosmaterialesmásadecuadosparaeldesarrollode biomaterialesinyectables.34Paralasaplicacionesbiomédicasdeestoshidrogeles termosensiblesinyectables,laLCSTdebeserpróximaalatemperatura fisiológica,permitiendolainyeccióndelprecursordelhidrogelenelestadosola bajatemperaturaysugelificaciónatemperaturacorporal,talycomosemuestra enlaFigura1.4. Figura1.4.Procesodegelificacióninducidoporelaumentodetemperaturaenun hidrogeltermosensibledetiponegativo(conLCST).34a Paraqueunhidrogelsufraunatransiciónsol‐gelporefectodelaumentode temperatura,elgelificanteconstituyentedelhidrogeldebeposeernaturaleza anfífila,conundelicadobalancehidrófoboehidrófiloensuestructuraque permitacambiosdeorganizaciónsupramolecularenfuncióndela temperatura.35Laestructuraquímicadealgunosgelificantes,enconcreto polímeros,semuestranenlaFigura1.5. 34(a)Moon,H.J.;Ko,D.Y.;Park,M.H.;Joo,M.K.;Jeong,B.,ChemicalSocietyReviews 2012,41(14),4860‐4883;(b)Sosnik,A.,ArsPharm2007,48(1),83‐102. 35Jeong,B.;Bae,Y.H.;Lee,D.S.;Kim,S.W.,Nature1997,388(6645),860‐862.
Capítulo1Capitulok 12 Figura1.5.Estructuraquímicadealgunospolímeroscapacesdegelificarendisolución porefectodelatemperatura,mediantetransiciónsol‐gel:a)CopolímerobloquedePEG‐ PPG‐PEG(Pluronic®oPoloxamer®);b)CopolímerobloquedePEG‐PLGA‐PEG;c)poli‐N‐ isopropilacrilamida. Lospolietilenglicoles(PEG)hansidoampliamenteutilizadoscomosegmento hidrófiloeneldiseñodegelificantesanfífilosdebidoenparteasu biocompatibilidadyasudeshidratacióndependientedelatemperatura.Deesta formasehandescritocopolímerosbloquedepolietilenglicolypolipropilenglicol (PEGyPPG(comoPluronic®oPoloxamer®),36copolímerosdepolietilenglicoly poliésteres(comoPEGconPLA(ácidopoliláctico),35PEGconPCL (policaprolactona),37oPEGconPLGA(ácidopoliláctico‐co‐glicólico).38 Asímismo,otrotipodecadenaspoliméricasampliamenteutilizadaen gelificantesparahidrogelestermosensibleshasidolapoli‐N‐isopropilacrilamida (PNIPAAm).28b,39 36Alexandridis,P.;Hatton,T.A.,ColloidsandSurfacesa‐Physicochemicaland EngineeringAspects1995,96(1‐2),1‐46. 37Bae,S.J.;Joo,M.K.;Jeong,Y.;Kim,S.W.;Lee,W.‐K.;Sohn,Y.S.;Jeong,B., Macromolecules2006,39(14),4873‐4879. 38Jeong,B.;Lee,K.M.;Gutowska,A.;An,Y.H.,Biomacromolecules2002,3(4),865‐868. 39Duarte,A.R.C.;Mano,J.F.;Reis,R.L.,ActaBiomaterialia2011,7(2),526‐529. a) b) c)
Capítulo1 13 1.2.2.‐Hidrogelesconreticulaciónquímica Comosehaindicado,loshidrogelesquímicossecaracterizanporpresentar reticulacionesdetipocovalente. Lasestrategiasutilizadasparaproducirlareticulaciónquímicadehidrogeleshan sidovariadas,usandoenmuchoscasosreaccionesdepolimerizaciónclásicas, talescomoreaccionesentremonómeroscongruposreactivoscomplementarios (p.e.laadicióndeMichael,reaccionesdecicloadición1,3‐dipolarcatalizadaspor Cu(I),formacióndebasesdeSchiff,etc.)40oreaccionesradicalarias,utilizando uniniciadortérmico(polimerizacióntérmica)omedianteunfotoiniciador (fotopolimerización).41Enelcasodehidrogelesdiseñadosparaaplicacionesque implicanlapolimerizaciónencondicionesfisiológicas,hayquetenerencuenta queelentrecruzadoquímicodeestosmaterialessedebeproducirsincausar dañosalascélulasomoléculasqueseencuentrancombinadasconelhidrogel. Lafotopolimerizaciónhasidounprocedimientodereticulaciónmuyaceptado enbiomedicinayaqueofreceventajascomoelcontrolespacialytemporaldela polimerización,elevadasvelocidadesdecuradoquevandesdeminutosa segundos,sonreaccionesquesepuedenllevaracaboatemperaturaambienteo fisiológicayproducenmuypococalor.Así,lafotopolimerizaciónofotocuradode materialesseutilizaconéxitoconagentesdeselladoorestauracionesdentales42 oenelselladodevasossanguíneosmedianteadhesivosfotopolimerizables.43 Lafotopolimerizaciónprecisageneralmentedelapresenciadeunfotoiniciador, queposeeunaaltaabsorciónlumínicaaunalongituddeondaespecífica(luz visibleoultravioleta),generandolosradicaleslibresiniciadoresdelproceso. 40Ko,D.Y.;Shinde,U.P.;Yeon,B.;Jeong,B.,ProgressinPolymerScience2013,38(3–4), 672‐701. 41Nguyen,K.T.;West,J.L.,Biomaterials2002,23(22),4307‐4314. 42Maffezzoli,A.;DellaPietra,A.,Biomaterials1994,15(15),1221‐1228. 43Dumanian,G.A.;Dascombe,W.;Hong,C.;Labadie,K.;Garret,K.;Sawhney,A.S.; Pathak,C.P.;Hubbel,J.A.;Johnson,P.C.,Plast.ReconstrSurg1995,95,901‐907.
Capítulo1Capitulok 14 Factoresdeterminantesalahoradeseleccionarunfotoiniciadorparala reticulacióndehidrogelesincluyensubiocompatibilidad,solubilidadenaguay estabilidad.41,44 Aunquesehanutilizadofotoiniciadoresbiocompatiblesactivosenelrangodela luzvisible,comoEosinY,45elfotoiniciadormásutilizadoparala fotopolimerizacióndehidrogelesenaplicacionesbiomédicasesunfotoiniciador activobajoluzultravioleta,Irgacure2959(I2959),productocomercial,solubleen agua,cuyaestructuraquímicayprocesodegeneraciónderadicaleslibresse muestraenlaFigura1.6.46Sehademostradoquelatoleranciadeeste fotoiniciadoradiferentesconcentracionesyparaungrannúmerodelíneas celulares,porejemplocélulasmesenquimales(MSC),condrocitos(célulasque formanpartedelcartílagonatural)yosteoblastos(célulasdehueso),es elevada.44 Figura1.6.EstructuraquímicadelfotoiniciadorIrgacure2959yformaciónderadicales libresporefectodelaluz. Enloquerespectaalosgelificantesfotopolimerizablesutilizadosenla produccióndehidrogelesquímicos,suvariedadesampliaeincluyentanto polímerossemisintéticos,esdecirpolímerosnaturalesmodificados 44Williams,C.G.;Malik,A.N.;Kim,T.J.;Manson,P.N.;Elisseeff,J.,Biomaterials2005, 26(11),1211‐1218. 45Bahney,C.S.;Lujan,T.J.;Hsu,C.W.;Bottlang,M.;West,J.L.;Johnstone,B.,European Cells&Materials2011,22,43‐55. 46(a)You,Z.;Wang,Y.,AdvancedFunctionalMaterials2012,22(13),2812‐2820;(b) Coutinho,D.F.;Sant,S.V.;Shin,H.;Oliveira,J.T.;Gomes,M.E.;Neves,N.M.; Khademhosseini,A.;Reis,R.L.,Biomaterials2010,31(29),7494‐7502;(c)Vermonden, T.;Fedorovich,N.E.;vanGeemen,D.;Alblas,J.;VanNostrum,C.F.;Dhert,W.J.A.; Hennink,W.E.,Biomacromolecules2008,9(3),919‐926. hν
Capítulo1 15 químicamenteparaintroducirgruposfotopolimerizables(p.e.gruposacrilatoo metacrilato),comopolímerossintéticos. Dentrodelospolímerossemisintéticossehandescritoungrannúmerode polisacáridosnaturalesfuncionalizadoscongruposacrilatoometacrilato,como sulfatodecondroitina,47ácidohialurónico,48quitosano,49heparina50oalginato.51 TodosellossehanutilizadoenlaencapsulacióndecondrocitosoMSCcon buenosresultadosencuantoasupervivenciayadhesióncelular,debidoala presenciadelpolisacárido,yconpropiedadesmecánicasydedegradación controlablesenfuncióndelgradodefuncionalizaciónconacrilatoso metacrilatosreactivos. Denuevo,unadelasestructurasquímicasutilizadaseneldiseñodegelificantes sintéticosconmáséxitoenaplicacionesbiomédicas,yespecialinterésenel campodelaIT52ydelaencapsulaciónyLCF,53eselPolietilenglicol(PEG),debido asunaturalezahidrófilaybiocompatibilidad.Lossistemasfotopolimerizables basadosenPEGsecomponenprincipalmentedediacrilatosdePEG(PEGDA, Figura1.7). Figura1.7.EstructuraquímicadediacrilatosdePEG(PEGDA). 47Li,Q.;Williams,C.G.;Sun,D.D.N.;Wang,J.;Leong,K.;Elisseeff,J.,Journalof BiomedicalMaterialsResearchPartA2004,68,28‐33. 48Nettles,D.L.;Vail,T.P.;Morgan,M.T.;Grinstaff,M.W.;Setton,L.A.,Annalsof BiomedicalEngineering2004,32,391‐397. 49Amsden,B.G.;Sukarto,A.;Knight,D.K.;Shapka,S.N.,Biomacromolecules2007,8, 3758‐3766. 50Seto,S.P.;Casas,M.E.;Temenoff,J.S.,CellandTissueResearch2012,347,589‐601. 51Jeon,O.;Bouhadir,K.H.;Mansour,J.M.;Alsberg,E.,Biomaterials2009,30,2724‐ 2734. 52Peppas,N.A.;Hilt,J.Z.;Khademhosseini,A.;Langer,R.,Adv.Mater.2006,18,1345‐ 1360. 53Sawhney,A.S.;Pathak,C.P.;Hubbell,J.A.,Macromolecules1993,26,581‐587.
Capítulo1Capitulok 16 LanaturalezanoadhesivadelPEGlohahechouncandidatoidealparasuuso concélulasnoadherentes,comoporejemploloscondrocitos.54Sushidrogelesse hanutilizadoparalaencapsulacióndeestascélulaspermitiendo,ademásdeuna elevadasupervivenciacelular,lasecreciónporpartedeloscondrocitosde proteoglicanosycolágeno,componentesestructuralesdelaECMdelcartílago.55 Sinembargo,concélulasadherentes(MSC,osteoblastos,fibroblastos,etc.)seha trabajadoconmoléculasdePEGDAfuncionalizadasconlasecuenciapeptídica RGD(R:arginina,G:glicina,D:ácidoaspártico).ElRGDnosolopromuevela adhesióncelularsinoquetambiénpuedeserutilizadoparaconseguirla respuestaselectivadedeterminadotipodecélulas.56Así,unhidrogeltipoRGD‐ PEGDAsehautilizadoparalaencapsulacióndeMSC,consiguiendosu diferenciaciónaosteoblastos,conproduccióndeECMcompuestaporproteínas presentesenelhuesocomolafosfatasaalcalina.57 TambiénsehandescritohidrogelesdemezclasdemoléculastipoPEGDAcon productosnaturales.58En2013,Elisseeffetal.describieronunodelosmateriales conmásdesarrolloenITpararegeneracióndecartílago.11Estematerialesun sistemamulticomponente(Figura1.8).11b 54Lee,J.H.;Lee,H.B.;Andrade,J.D.,ProgPolymSci1995,20,1043‐1079. 55(a)Elisseeff,J.;McIntosh,W.;Anseth,K.;Riley,S.;Ragan,P.;Langer,R.,Journalof BiomedicalMaterialsResearch2000,51(2),164‐171;(b)Elisseeff,J.;Anseth,K.;Sims, D.;McIntosh,W.;Randolph,M.A.;Yaremchuk,M.;Langer,M.,Plast.Reconstr.Surg. 1999,104(4),1014‐1022. 56Hersel,U.;Dahmen,C.;Kessler,H.,Biomaterials2003,24(24),4385‐4415. 57Yang,F.;Williams,C.G.;Wang,D.‐a.;Lee,H.;Manson,P.N.;Elisseeff,J.,Biomaterials 2005,26(30),5991‐5998. 58Ouasti,S.;Donno,R.;Cellesi,F.;Sherratt,M.J.;Terenghi,G.;Tirelli,N.,Biomaterials 2011,32(27),6456‐6470.
Capítulo1 17 Figura1.8.AdhesivobasadoensulfatodecondroitinayPEGNH2.11b Unodeloscomponentesesunadhesivodesulfatodecondroitinacongrupos ácidoterminales(activadosenformadeN‐hidroxisuccinimida),queseinyectóen ellugardeldefectodelcartílago.Esteadhesivoreaccionaconeltejido circundanteatravésdelosgruposaminoterminalesdelasproteínasytambién lohaceconotrocomponente,PEGqueposeegruposterminalesamino(PEGNH2) Posteriormente,enelmismolugarseinyectóunamezcladeácido hialurónico+PEGDAquealfotopolimerizarinsituconluzultravioletaformael hidrogel.Estematerialcompuestorellenócompletamenteeldefectoe interaccionóconeltejidocircundanteporlapresenciadeladhesivobasadoen sulfatodecondroitina.Elisseeffetal.hanpublicadoensayosclínicospiloto realizadosconestematerialen18pacientes,demostrandolaseguridadyposible aplicaciónclínicadelmaterial.11a Juntoaestosdiseñosmoleculares,laestructuradePEGtambiénseha incorporadoenestructurasmáscomplejaseinnovadoras.Algunasdeellas,por suimportancia,secomentanacontinuación. Grinstaffetal.propusieronlautilizacióndecopolímerosbloquehíbridos dendrítico‐linealesbasadosenpolímerosdePEGparalaobtencióndehidrogeles
Capítulo1Capitulok 18 fotopolimerizables.59Loshíbridosdendrítico‐linealessonestructuraspoliméricas máscomplejasquecombinanensuestructuracadenaslinealesdepolímeroy segmentosdendríticos.60 Centrándonosenestructurasdendríticas,deentrelosdiferentestiposde estructurasdendríticassedistinguenlosdendrímeros,quesecaracterizanpor sermacromoléculasaltamenteramificadasqueposeentrespartes fundamentales(Figura1.9):elnúcleo,lasunidadesderamificaciónquedanlugar alasdistintasgeneraciones(generación1(G1),generación2(G2),etc.);yla periferia,quepermitelafuncionalizaciónconungranvariedaddegrupos funcionalescuyonúmeroestádeterminadoporlageneracióndeldendrímero. Figura1.9.Estructurageneraldelosdendrímerosydendrones.61 Comoestructurasdendríticasmássencillas,estánlosdendrones,consideradas comolasunidadesestructuralesdeundendrímero(Figura1.9).Setratade moléculasramificadasqueposeenungrupofuncionalreactivocomopuntofocal 59(a)Grinstaff,M.W.,JournalofPolymerSciencePartA:PolymerChemistry2008,46(2), 383‐400;(b)Degoricija,L.;Bansal,P.N.;Sontjens,S.H.M.;Joshi,N.S.;Takahashi,M.; Snyder,B.;Grinstaff,M.W.,Biomacromolecules2008,9(10),2863‐2872;(c)Sontjens,S. H.M.;Nettles,D.L.;Carnahan,M.A.;Setton,L.A.;Grinstaff,M.W.,Biomacromolecules 2006,7(1),310‐316;(d)Carnahan,M.A.;Grinstaff,M.W.,JACS2001,123,2905‐2906. 60Gitsov,I.,JournalofPolymerScienceParta‐PolymerChemistry2008,46(16),5295‐ 5314. 61Movellan,J.,Dendriticderivativesasbuildingblocksforbiomedicalapplications.Tesis doctoral,2013. Dendrón NÚCLEO G1 G2 G3 G4
Capítulo1 25 ΔT Figura1.12.Esquemarepresentativodelprocesodeentradaysalidadefármacosenun nanogelproducidaporefectodelatemperatura. 1.3.PLURONICYSUSAPLICACIONESBIOMEDICAS Enlosapartadosanterioressehapodidocomprobarqueenlabúsquedade materialesparaaplicacionesbiomédicas,elPluronichasidounodelos compuestosobjetodeestudioenelcampodeloshidrogelestermosensibles, debidoasusparticularescaracterísticas. ConeltérminoPluronic®seidentificaauncopolímerobloquegenérico constituidopordosunidadesdePEG,separadasporunaunidadcentraldePPG (Figura1.5(a)).Comercialmenteestándisponiblesdistintasvariedadesde Pluronic®(Pluronic®deBASFoPoloxamerdeICI)yenunampliorangodepesos molecularesylongitudesdelosbloquesconstituyentes. 78 Losdistintostiposde Pluronic,asícomosunomenclatura,sepresentanenlaFigura1.13. 36 78PluronicandTetronicSurfactants,TechnicalBrochure,.BASFCorp.,Parsippany,NJ. 1989. Moléculasencapsuladas enelinteriordelnanogel EstadocolapsadoT>LCST Entradaysalidademoléculas Estado“hinchado”T<LCST
Capítulo1Capitulok 26 Figura1.13.VariedadesynomenclaturadeloscopolímerosbloquedePluronic®.36 Loscopolímerosqueestánsituadosenlamismacolumnadelarepresentación delaFigura1.13presentanelmismoporcentajedelbloquedePEG,mientras queloscopolímerosqueseencuentranenlamismafilapresentanunbloquede PPGdelmismopesomolecular.LanomenclaturaparalosderivadosdePluronic comienzaconlasletrasL(paraPluronicenestadolíquido),P(paraPluronicen pasta)oF(paraPluronicenestadosólido,enformadecopos).Losdosprimeros númerossonindicativosdelpesomoleculardelacadenahidrófobadePPG,y vandesdeelnúmero3paraelcopolímeroconelmenorpesomoleculardePPG hastaelnúmero12paraeldemayorpesomoleculardePPG(ejeverticalenla Figura1.13).ElúltimonúmeroserefierealporcentajedePEG,yvadesdeel1 paraelmenorporcentajedePEGhasta8paraelmayorporcentajedePEG(eje horizontalenlaFigura1.13).
Capítulo1 27 UnadelasvariedadesdePluroniceselPluronicF127®(Figura1.14).Elnúmero 12hacereferenciaaquesetratadeuncopolímerobloqueconunpeso moleculardelbloquedePPGde4000g/mol,mientrasqueelnúmero7hace referenciaalapresenciadeun70%dePEGenlamolécula. Figura1.14.EstructuraquímicadePluronicF127®. LamayoríadeloscopolímerostipoPluronic®presentanlassiguientes característicasgenerales: ‐ Endisolucionesacuosassoncapacesdeautoorganizarseformando micelas,lascualesconsistenenunnúcleohidrófobodePPGyunacorona hidrófiladePEG(Figura1.15).Laautoorganizaciónenmicelasseproduce apartirdeunadeterminadaconcentración,denominadaConcentración MicelarCrítica(CMC),quesedefinecomolaconcentraciónmínimade materialnecesariaparadarlugaramicelastermodinámicamente estables.OtroparámetrofundamentaleslaTemperaturaMicelarCrítica (CMT)queeslatemperaturaapartirdelacualseformanlasmicelas, siemprequeelpolímeroseencuentreporencimadesuCMC. Figura1.15.EsquemadelaestructuramicelardelPluronicenagua,a concentracionesporencimadesuConcentraciónMicelarCrítica(CMC). EncolorazulserepresentaelnúcleohidrófobodePPGyencolorverdela coronahidrófiladePEG. C>CMC
Capítulo1Capitulok 28 ‐ LasdisolucionesacuosasabajasconcentracionesdePluronic®,debidoa sucapacidaddeautoorganizaciónenformademicelasporencimadela CMCydebidoalapresenciadesunúcleohidrófoboysucoronahidrófila, sehanutilizadocomosistemasdeencapsulacióndefármacostanto hidrófobos,paramejorarsusolubilidadenmedioacuoso,como hidrófilos,paramejorareltiempoderesidenciaeneltorrente sanguíneo.79 ‐ AlgunasdelasvariedadesdePluronic®disueltosenaguaaaltas concentracionespresentangelificacióntermorreversibleapartirdeuna ConcentraciónCríticadeGelificación(CGC).Losfactoresquedeterminan laCGC,asícomoalatemperaturadetransiciónsol‐gel(LCST),sonelpeso moleculardelpolímero,suarquitecturamolecular(longituddelos bloquesysecuenciadebloques)ylapresenciadeespeciesiónicasenla disolución.80 ElmecanismodelagelificacióndePluronic®siguesiendountemaquedespierta muchacontroversia.Sehanpropuestodistintosmecanismosquetratande explicarlatransiciónsol‐geldeestecopolímerobloque,quesecomentana continuación. RassingyAttwood81explicaronlagelificacióndelPluronicporcambios intrínsecosenlaspropiedadesmicelares,comoelnúmerodeagregación (númerodemoléculasqueformanlasmicelas)ylasimetríamicelar. 79(a)Li,Y.‐Y.;Li,L.;Dong,H.Q.;Cai,X.J.;Ren,T.B.,Materialsscience&engineering.C, 2013,33(5),2698‐707;(b)Yoncheva,K.;Calleja,P.;Agüeros,M.;Petrov,P.;Miladinova, I.;Tsvetanov,C.;Irache,J.M.,InternationalJournalofPharmaceutics2012,436(1–2), 258‐264. 80Lixin,F.;Degen,M.;Grupido,N.;Bendle,S.;Pennartz,P.,MaterialsScienceand Engineering:A2010,528(1),127‐136. 81Rassing,D.;Attwood,D.,UltrasoundInt.J.Pharm.1983,13,47‐55.
Capítulo1 29 Vadnereetal.82atribuyeronlatransiciónsol‐gelauncambiodeentropíadebido alapresenciademoléculasdeaguaordenadaspróximasalascadenas hidrófobasdePPG.Lapresenciademoléculasdeaguaordenadasalrededorde lascadenashidrófobasminimizaelcontactoagua‐cadenahidrófoba.Para polímerosquepresentanLCST,elaumentodetemperaturapermitela deshidratacióndelascadenashidrófobas,provocandounaumentodeldesorden enlasmoléculasdeaguayportantounaumentodelaentropía(ΔS),loquehace queseaunprocesofavorable(EnergíadeGibbs,ΔG<0).Enestasituación,las interaccionesagua‐polímerosehacendesfavorablesmientrasquesefavorecen lasinteraccionesagua‐aguaypolímero‐polímero.Estefenómeno,queseconoce como“efectohidrofóbico”,83esprobablementeelmecanismomásaceptado paralaexplicacióndelagelificacióndedisolucionesdePluronic®.32a,84 Añosmástarde,Wankaetal.85propusieronlagelificacióncomouna organizacióntridimensionalestructurada.Lasmoléculasdepolímerose autoorganizanenmicelaspordebajodelaLCSTyporencimadelaCMC.Al aumentarlatemperaturahastalaLCST,seproduceelempaquetamientode micelasenunaestructuraordenadaformandomesofasesliótropascristal líquido.86 Sibienalprocesodegelificaciónselehaprestadoatención,latransicióngel‐sol enuncalentamientoposteriorhasidopocoestudiada.Noobstante,seha propuestoquelatransicióngel‐solpuedeestarrelacionadaconelhinchamiento queexperimentanlascadenasdePEGenlasmicelas,alaumentarlasolubilidad conelincrementodetemperatura.32b 82Vadnere,M.;Amidon,G.;Lindenbaum,S.;Haslam,J.L,IntJPharm1984,22,207‐218. 83Southall,N.T.;Dill,A.D.;Haymet,D.J.,J.Phys.Chem.B,2002,106(3),521‐533. 84Alexandridis,P.;Holzwarth,J.F.;Hatton,T.A.,Macromolecules1994,27(9),2414‐ 2425. 85Wanka,G.;Hoffman,H.;Ulbricht,W.,JColloidInterfaceSci1990,268(2),101‐117. 86Wanka,G.;Hoffman,H.;Ulbricht,W.,Macromolecules1994,27(15),4145‐4159.
Capítulo1Capitulok 30 EstascaracterísticasdelasestructurasdePluronic®,unidasasu biocompatibilidad,hanhechoqueensusdistintasvariedades,esténpresentes enproductosdeusocotidianotalescomochampús,enjuaguesbucales, desmaquillantes‐limpiadoresfaciales,cremasanti‐acné,cremas antiinflamatorias,87etc. Comoseharesaltado,enlasúltimasdécadas,elPluronic®hasidounodelos copolímerosbloquemásutilizadosenITyensistemasdetransporteyLiberación controladadefármacos.88Sinembargo,ypesealasventajasquepresenta,estos copolímerosestánlejosdeserconsideradoscomounmaterialidealpara hidrogelesinyectables,debidoaquemuestrantiemposderesidenciacortosen ellugardelimplante(<1día),bajaadhesióncelularalmaterialybaja biodegradabilidaddelosbloquesquelocomponen.Noobstanteseconsidera queelPluronic®conpesomolecularinferiora13000g/molesbioabsorbiblepor filtraciónatravésdelriñon.27 Esporelloqueparamejorarlabiodegradabilidad,compatibilidadyadhesión celular,sehandiseñadoderivadosdePluronic®combinadosconmoléculasde origennatural89oconmoléculasbioactivas,90utilizándolosenlapreparaciónde hidrogelestermosensibles. 87Park,Y.J.;Yong,C.S.;Kim,H.M.;Rhee,J.D.;Oh,Y.K.;Kim,C.K.;Choi,H.G.,IntJ Pharm2003,263(1‐2),105‐111. 88(a)Basak,R.;Bandyopadhyay,R.,Langmuir2013,29(13),4350‐4356;(b)Lee,J.H.; Kim,J.H.;Oh,S.H.;Kim,S.J.;Hah,Y.S.;Park,B.W.;Kim,D.R.;Rho,G.J.;Maeng,G.H.; Jeon,R.H.;Lee,H.C.;Kim,J.R.;Kim,G.C.;Kim,U.K.;Byun,J.H.,Biomaterials2011,32 (22),5033‐5045;(c)Han,D.K.;Ahn,K.D.;Cha,S.H,2007,PatentnumberWO 2007/064152A1;(d)Kumar,M.;Kumar,N.;Domb,A.;Arora,M.,AdvancesinPolymer Science,2002,160,45‐117(e)Kavanov,a.V.;Alakhov,V.Y.,Criticalreviewsin therapeuticDrugCarrierSystems2002,19(1),1‐73. 89Park,K.M.;Lee,S.Y.;Joung,Y.K.;Na,J.S.;Lee,M.C.;Park,K.D.,ActaBiomaterialia 2009,5(6),1956‐1965. 90(a)Park,k.M.P.K.D.,MacromolecularResearch2008,16(6),517‐523;(b)Huang,K.; Lee,B.P.;Ingram,D.R.;Messersmith,P.B.,Biomacromolecules2002,3(2),397‐406.
Capítulo1 31 Porejemplo,Fangetal.91describieronunderivadodePluronicF127®modificado químicamenteensusextremosmediantelauniónaunpolisacáridonatural comoelalginato(Figura1.16). Figura1.16.EstructuraquímicadelderivadoPluronicF127‐AlginatodescritoporFanget al.91 EstederivadoretienelaspropiedadesdegelificacióndePluronicF127®ymejora labiocompatibilidaddebidoalapresenciadelalginato.HidrogelesdePluronic F127‐alginatosehanutilizadocomosoporteparalaadministracióndeforma tópicayliberacióncontroladadeseleginina,fármacoindicadoparael tratamientodedesordenesdepresivos.Asímismo,sehanutilizadoenla dispensación,medianteinyección,decis‐platinoeneltratamientodelcáncer. Estoshidrogelesmostraronunaliberacióncontroladadecis‐platinoasícomoun aumentodeladeposicióndeésteenzonastumorales.92 Rotondaetal.93combinaronPluronicF127®conotropolisacáridonatural,ácido hialurónico.Lapresenciadeesteácidoprovocaladisminucióndelatemperatura degelificaciónymejoralaspropiedadesdeadhesióncelularenelhidrogel.Por otraparte,laincorporacióncovalenteadicionaldeunaproteínabioactiva implicadaenlosprocesosdeproliferacióncelularyenprocesosde 91Chen,C.C.;Fang,C.L.;Al‐Suwayeh,S.A.;Leu,Y.L.;Fang,J.Y.,InternationalJournalof Pharmaceutics2011,415(1‐2),119‐128. 92Fang,J.Y.;Hsu,S.H.;Leu,Y.L.;Hu,J.W.,J.Biomater.Sci.Polym.Ed.2009,20,1031‐ 1047. 93Mayol,L.;Quaglia,F.;Borzacchiello,A.;Ambrosio,L.;Rotonda,M.I.L.,European JournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics2008,70(1),199‐206.
Capítulo1Capitulok 32 diferenciación,laβ‐TGF(TransformingGrowthFactor),favorecióla diferenciacióncelulardeMSCacondrocitosylaproducciónenconejosdeuna matrizcartilaginosaendefectosdecartílagoarticular.94 ConelfindemejorarlaestabilidadmecánicadehidrogelesbasadosenPluronic® sehanpropuestodiferenteshidrogelesquecombinansutermosensibilidadcon lapresenciaenloscomponentesdegruposfuncionalesreactivosquepermitanla formacióndeotraredtridimensional,entrecruzadaquímicamente.Conestefin, lasreaccionesmásutilizadasenlapreparacióndehidrogelesderivadosde Pluronic®mixtos(reticulaciónfísica+reticulaciónquímica),hasidola fotopolimerizacióndegruposacrilatosometacrilatosolaadicióndegrupostiol (‐SH)adoblesenlaces(C=C)deficientesenelectrones(reaccióntiol‐eno), medianteunmecanismoiónico(adicióndeMichael)oporunmecanismo radicalariofotoiniciado.41,95 Laaproximaciónsintéticamássencillaseguidaparalaobtencióndeestetipode derivadosdePluronic®hasidolafuncionalizacióndelosdosgruposhidroxilo terminalesdelamoléculadePluronic®congruposacrilatoometacrilato,ysu entrecruzamientoporfotopolimerizaciónconsigomismo96oconotrosgrupos reactivosdepolímerosbiodegradables,naturales97osintéticos.98 Enestalínea,Parketal.97describieronunhidrogeltermosensibley fotopolimerizablebasadoenunamezcladediacrilatodePluronicF127yácido hialurónicofuncionalizadocongruposmetacrilato.Estosautoresprepararonun amplionúmerodehidrogeles,condiferentesdensidadesdeentrecruzamientoy propiedadesmecánicas,variandoeltiempodeirradiaciónconluzultravioleta. 94Jung,H.H.;Park,K.;Han,D.K.,JournalofControlledRelease2010,147(1),84‐91. 95Tasdelen,M.A.;Yagci,Y.,AngewandteChemieInternationalEdition2013,52(23), 5930‐5938. 96Lee,S.Y.;Tae,G.,JournalofControlledRelease2007,119(3),313‐319. 97Chun,K.W.;Lee,J.B.;Kim,S.H.;Park,T.G.,Biomaterials2005,26,3319‐3326. 98(a)Park,J.H.;Moon,J.R.;Hong,K.H.;Kim,J.H.,JournalofPolymerResearch2011,18 (2),273‐278;(b)Pang,X.;Chu,C.C.,Polymer2010,51(18),4200‐4210.
Capítulo1 33 EstoshidrogelesseutilizaronparaencapsularADNmediantelaformacióndel hidrogelporefectodelatemperaturaylaposteriorfotopolimerización.Sus estudiosdemostraronquelaliberacióndeADNseproducíadurante10días,de formalentaycontrolada,condiferenciasdependiendodelgradode entrecruzamientodelhidrogel. Chuetal.98bmezclarondiacrilatodePluronicF68conunpolímerosintético biodegradablebasadoenpoliesteramidas(PEA)congruposacrilato,conelfinde disponerdehidrogelestermosensiblesyfotopolimerizables(Figura1.17). Figura1.17.Representaciónesquemáticadelhidrogelfotopolimerizadobasadoen Poliesteramidas(PEA)ydiacrilatodePluronicF68,descritoporChuetal.98b Hanetal.88c,99handescritootraaproximacióndiferentealaobtenciónde derivadosfotopolimerizablesdePluronic®.UtilizandoelcopolímeroPluronic F68®ysiguiendoelprocedimientoquesemuestraenlaFigura1.18,prepararon underivadodePluronicF68®condosgruposmetacrilatofotopolimerizablesy dosestructuraspeptídicasRGD,incorporadasparafavorecerlaadhesióncelular. Estosmaterialeshansidoobjetodedospatentesorientadasasuutilizaciónen LCFeIT.88c,99a 99(a)Han,D.K.;Park,K.;Kim,J.J.,2010,PatentnumberWO2007/064152A1;(b)Cha, M.‐H.;Choi,J.;Choi,B.G.;Park,K.;Kim,I.H.;Jeong,B.;Han,D.K.,JournalofColloidand InterfaceScience2011,360(1),78‐85. PEA DiacrilatodePluronic
Capítulo1Capitulok 34 Figura1.18.RutasintéticadeloscopolímerosreactivosdePluronicF68®descritospor Hanetal.99a Comounaalternativaalafotopolimerizacióndeacrilatosometacrilatos,varios autoreshanutilizadolareaccióndetiol‐enosparalareticulaciónquímicade hidrogelesderivadosdePluronic®.Conestefinsehanutilizadounsignificativo númerodemoléculasfuncionalizadascongrupostiol,parasuinteracción covalentecondiacrilatodePluronic,desdemoléculasdeorigennatural,como porejemplodextranotiolado,100hastaelpropioPluronic®congrupostiol terminales.101 Deformageneral,enestoshidrogeleslareaccióndetiol‐enossehallevadoa caboencondicionessuaves(condicionesfisiológicas),dandolugaramateriales conbuenabiocompatilibilidadybajogradodehinchamientoenentornoacuoso. 100(a)Lin,C.;Zhao,P.;Li,F.;Guo,F.;Li,Z.;Wen,X.,MaterialsScienceandEngineering:C 2010,30(8),1236‐1244;(b)Niu,G.;Zhang,H.;Song,L.;Cui,X.;Cao,H.;Zheng,Y.;Zhu, S.;Yang,Z.;Yang,H.,Biomacromolecules2008,9(10),2621‐2628. 101(a)Cellesi,F.;Tirelli,N.,JournalofMaterialsScience:MaterialsinMedicine2005,16 (6),559‐565;(b)Cellesi,F.;Tirelli,N.;Hubbell,J.A.,Biomaterials2004,25(21),5115‐ 5124;(c)Cellesi,F.;Tirelli,N.;Hubbell,J.A.,MacromolecularChemistryandPhysics 2002,203(10‐11),1466‐1472.
Capítulo2 41 2.1.‐OBJETIVOS Elobjetivoprincipaldeestatesisdoctoralhasidoeldiseño,síntesis,preparación ycaracterizacióndehidrogelestermosensiblesyfotopolimerizables,para aplicaciónenIngenieríadeTejidosysistemasdeencapsulaciónyLiberación controladadefármacos. Comosehaexpuestoenelapartadodeantecedentes,eldiseñomolecularde hidrogelesparaaplicacionesbiomédicashaestadofuertementecondicionado porlaaplicaciónúltimaquesedeseabaparaestosmateriales.Ennuestrocaso, juntoalhechodeestarconsiderandomaterialesquedebengelificarenmedio acuosoycombinarlosrequisitospropiosdecualquierbiomaterial,nuestro interéssehacentradoenhidrogelestermosensiblesquepermitanser fotopolimerizados,conelfindeestabilizarestructuralmentetantounsoporte paraIngenieríadetejidos,comonanogelesparaencapsulaciónyLiberación controladadefármacos. Basándonosenlosantecedentesdeltemaylapropiaexperienciadelgrupode trabajo,eldiseñoquímicoelegidosehacentradoencopolímerosbloque dendrítico‐lineal‐dendrítico,cuyaestructuraseesquematizaenlaFigura2.1. Figura2.1.Diseñoestructuraldemacromoléculasdendrítico‐lineal‐dendríticoobjetode estudio. Laestructuraquímicadeloscompuestospropuestospresentatrespartes claramentediferenciadas:unnúcleolinealpolimérico,queasuvezesun Dendrón Copolímerobloque Gruposfuncionalesterminales
Capítulo2Capitulok 42 polímerotribloqueABA(colorverdeyazulenlaFigura2.1),dosestructurasde tipodendríticoenlasposicionesterminales(colormorado)ydistintosgrupos fotopolimerizablesterminalesquedifierenennaturalezaquímicayennúmero (colorrojo). Laestructuraquímicapropuestadeestosbloquesrespondeadistintosaspectos. Conelobjetivodeconseguircompuestosconpropiedadesdeautoensamblajey termosensibilidad,sehaelegidouncopolímerobloquedetipoPluronic®como bloquelinealcentral,enconcretolavariedadPluronicF127®,79a,88a,104unodelos másutilizadosparaaplicacionesbiomédicasyaprobadoporlaFDA(Foodand DrugAdministration)endiferentesaplicacionesenelcampofarmacéuticopara suusoinvivoenhumanos:105disoluciónoftálmica,106administraciónoral107o usotópico(Figura2.2). 104(c)Manaspon,C.;Viravaidya‐Pasuwat,K.;Pimpha,N.,JournalofNanomaterials2012; (d)Abdi,S.I.H.;Choi,J.Y.;Lee,J.S.;Lim,H.J.;Lee,C.;Kim,J.;Chung,H.Y.;Lim,J.O., TissueEngineeringandRegenerativeMedicine2012,9(1),1‐9;(e)Antunes,F.E.; Gentile,L.;OlivieroRossi,C.;Tavano,L.;Ranieri,G.A.,ColloidsandSurfacesb: Biointerfaces2011,87(1),42‐48;(f)Shachaf,Y.;Gonen‐Wadmany,M.;Seliktar,D., Biomaterials2010,31(10),2836‐47. 105Approveddrugproducts.Poloxamer407oPluronicF127.USFDA,2003, www.accesdata.fda.gov/scripts/cder/igg/. 106Li,H.;Sung,K.C.,JournalofControlledRelease2000,69(3),379‐388. 107Padilla,M.;Clark,G.T.;Merril,R.L.,J.Am.Dent.Assoc.2000,131(2),184‐195.
Capítulo2 43 Figura2.2.ConcentracionesmáximaspermitidasdePluronicF127®(Poloxamer407) paradistintasaplicaciones,aprobadasporlaFDA. EstecopolímeroposeeunbloquedePPGcon67unidadesrepetitivasydos bloquesdePEGde99unidadesrepetitivascadauno(Figura2.3).PluronicF127® tieneunpesomolecularde12600g/mol. Figura2.3.EstructuraquímicadePluronicF127®. ElPluronicF127®secaracterizaporpresentarunatransicióndefasesol‐gela temperaturafisiológicaenunaconcentracióndel16%(w/v)enagua.Esunode losderivadoscomercialesdePluronic®querequiereunamenorCGCpara producirlatransiciónsol‐gelatemperaturafisiológica.
Capítulo2Capitulok 44 Comoestructuradendríticabásicasehaoptadoporpoliésteresbasadosenel ácido2,2‐bis(hidroximetil)propiónico(bis‐MPA)(Figura2.4). Figura2.4.Estructuraquímicadeácido2,2‐bis(hidroximetil)propiónico(bis‐MPA). Losdendrímerosydendronesdetipopoliésterbasadosenbis‐MPApresentan unaseriedecaracterísticasqueloshacencandidatosidealesparaaplicaciones biomédicas:sonbiocompatiblestantoinvitro108comoinvivo,sonsolublesen entornobiológicoysoncapacesdedegradarseporunprocesohidrolíticodelos enlaceséster.108,109Porotraparte,launidadmonoméricadebis‐MPApresenta ensuestructuragruposhidroxiloquepermitensufuncionalizaciónconungran númerodegruposfuncionales,mediantediferentestiposdereacciones orgánicas.110Asímismo,elgrupoácidoenelpuntofocalposibilitasuinteracción congruposfuncionalescomohidroxilooaminodeotrasmoléculas. Comogruposfuncionalesterminalessehaoptadoporgruposfotoreactivos acrilatoytiol. ApesardelcrecientenúmerodeaplicacionestantodelPluronic®104a‐b,111como delospoliésteresdendríticos110deformaindividual,hastalafechanosehan descritohíbridosdendrítico‐lineal‐dendríticoqueloscombinen. 108Feliu,N.;Walter,M.V.;Montañez,M.I.;Kunzmann,A.;Hult,A.;Nyström,A.; Malkoch,M.;Fadeel,B.,Biomaterials2012,33(7),1970‐1981. 109Zhang,H.;Patel,A.;Gaharwar,A.K.;Mihaila,S.M.;Iviglia,G.;Mukundan,S.;Bae,H.; Yang,H.;Khademhosseini,A.,Biomacromolecules2013,14(5),1299‐1310. 110Carlmark,A.;Malmstrom,E.;Malkoch,M.,ChemicalSocietyReviews2013,42(13), 5858‐5879. 111Wu,C.‐J.;Gaharwar,A.K.;Chan,B.K.;Schmidt,G.,Macromolecules2011,44(20), 8215‐8224.
Capítulo2 45 2.2.‐PLANTEAMIENTODELTRABAJO Paralaconsecucióndelobjetivoprincipaldeestetrabajodeinvestigaciónseha planteadolapreparacióndedosseriesdiferentesdecompuestosdendrítico‐ lineal‐dendríticoquerespondenalaestructuraantescomentada: 1.‐Copolímerosbloquedendrítico‐lineal‐dendríticoderivadosdePluronic F127®ydedendronesdebis‐MPA,ysuanálogolineal,congruposacrilato terminales(SerieA,Figura2.5),quepermitanlapreparacióndehidrogeles basadosenpoliacrilatosmediantepolimerizaciónfotoinducida. 2.‐Copolímerosbloquedendrítico‐lineal‐dendríticoderivadosdePluronic F127®ydedendronesdebis‐MPA,ysuanálogolineal,congrupostiolterminales (SerieB,Figura2.6),quepermitanlapreparacióndehidrogelesbasadosentiol‐ enos,mediantereacciónfotoinducida.Paralaincorporacióndelosgrupostiolse hanseleccionadorestosdetipocisteaminaunidosalosgruposhidroxilo terminalesmedianteenlacescarbamato. Paralaidentificacióndelosdiferentescompuestoslinealesydendrítico‐lineal‐ dendríticoobjetodeestudiodeestamemoriasehautilizadounanomenclatura F127‐GFT‐ncomolaindicadaenlasFiguras2.5y2.6,quepermiteidentificarla presenciadelaestructuradePluronicF127®,lanaturalezaquímicadelosgrupos funcionalesterminales(GFT)ysunúmero(n). Porejemplo,F127‐Ac‐4identificaalcompuestodendríticolinealdePluronic F127®funcionalizadocondendronesdebis‐MPAdeprimerageneración,que presentacuatrogruposacrilatoterminales.
Capítulo2Capitulok 46 Figura2.5.EstructuraquímicaynomenclaturaparalasmoléculasdelaSerieAcon gruposacrilatoterminales.
Capítulo2 47 F127‐SH‐2 OOOO 99 67 99 O O O OO O O O O O H N H NN H N H F127‐SH‐4 SH SH HS HS OOOO 99 67 99 O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O NH NH NH NH O O O O NH HS SH SH SH SH NH HS NH HS NH HS F127‐SH‐8 OOO 99 67 99 N H SHO H N HS O O Figura2.6.EstructuraquímicaynomenclaturaparalasmoléculasdelaSerieBcon grupostiolterminales. Elplandetrabajodesarrolladohaimplicadolossiguientesapartados: ‐ Síntesisycaracterizaciónestructuraldelasmacromoléculasmediante diferentestécnicasexperimentales(1H‐RMN,13C‐RMN,FT‐IR,EMyGPC). ‐ Determinacióndelaspropiedadessol‐geldelosmaterialesenfunciónde laconcentraciónenPBS(PhosphateBufferSaline)ydelatemperatura. ‐ Preparacióndeformulacionesbinariasbasadasenderivadosacriladosy tioladosydeterminacióndesuspropiedadessol‐gel.
Capítulo2Capitulok 48 ConelfindedesarrollarMaterialesparaaplicacionesenIngenieríadeTejidos, eltrabajodesarrolladosehaconcretadoen: ‐ Preparacióndehidrogelesmacroscópicosporaccióndelatemperaturay porfotopolimerización. ‐ CaracterizacióndesumorfologíainternaporSEM. ‐ Análisisdesusprocesosdedegradación. ‐ Estudiosdeviabilidadcelular. ‐ Evaluacióndesuspropiedadesmecánicas. ConelfindedesarrollarMaterialesnanoestructuradosparaencapsulación (Nanogeles),eltrabajodesarrolladohasido: ‐ DeterminacióndelaConcentraciónMicelarCrítica(CMC)delas moléculas. ‐ Preparacióndenanogelesmediantefotopolimerización. ‐ Estudiosdeencapsulacióndemoléculashidrófobasehidrófilas. ‐ EstudiodelamorfologíaytamañodelosnanogelesporTEM/SEMyDLS. ‐ Estudiosdeviabilidadcelular. ‐ Estudiosdeinternalizacióndenanogelesencélulas.
CAPÍTULO3 HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC: POLIACRILATOS
Capítulo3 57 Elacoplamientodelosdendronesdeprimera[2]ysegundageneración[5]con PluronicF127®serealizóporreaccióndeesterificacióndeSteglichentrelos gruposácidodelosdendronesylosgruposhidroxilodePluronicF127®(Esquema 3.3).Sinembargo,estareacciónnoproporcionólafuncionalizacióncompletadel copolímerobloque,siendoimposiblelaseparacióndelpolímerosinfuncionalizar oparcialmentefuncionalizado,delcompletamentefuncionalizado,comosepudo comprobarporlaincorrectacorrelacióndelvalordelasintegrales correspondientesaPluronicF127®ylasdelosfragmentosdendríticos,ensus correspondientesespectrosde1H‐RMN. Esquema3.3.Rutasintéticaconvergenteparalaobtencióndelosderivadosdendríticos deprimeraysegundageneración,conlosgruposhidroxiloperiféricosprotegidosen formadeacetal.Condicionesdereacción:i)[2],DCC,DPTS,diclorometano.ii)[5],DCC, DPTS,diclorometano. Estosresultadosllevaronaplanteardeformaalternativaelempleodelmétodo desíntesisdivergenteutilizadoporFréchet62paralaobtencióndecopolímeros bloquedendrítico‐lineal‐dendríticoderivadosdebis‐MPAyPEG.Enestecaso,el crecimientodegeneraciónserealizadirectamentesobreelnúcleodePEG, alternandoetapasdecrecimientodegeneraciónydesprotección.Parael crecimientodegeneraciónseutilizaunanhídridoderivadodebis‐MPA[7]
Capítulo3Capítulokk 58 (Esquema3.4),conelcualseconsiguenfuncionalizacionescompletas,elevados rendimientosypurificacionessencillas. Esquema3.4.Rutasintéticaparalaobtencióndelanhídridoderivadodebis‐MPA[7]. Condicionesdereacción:i)TsOH,acetonaii)DCC,diclorometano. Finalmente,lasíntesisdeloscompuestossedesarrollóconformealarutaquese muestraenelEsquema3.5.Lareaccióndelanhídrido[7]conlamoléculade PluronicF127®proporcionóelderivadodendrítico‐lineal‐dendríticodeprimera generaciónprotegido,F127‐Bn‐2[8],conrendimientossuperioresal95%.Otra ventajadeestareaccióneslafacilidaddepurificación,queconsisteenun pretratamientodelcrudodereacciónconmetanolparaladestruccióndel anhídrido[7]enexceso,queseconvierteenelcorrespondienteácidobenciliden‐ 2,2‐bis(oximetil)propiónico[6]yqueadiferenciadelanhídrido[7]essolubleen dietiléter,loquepermitelaposteriorprecipitacióndeF127‐Bn‐2[8]endietil
Capítulo3 59 éterfrío.Deestaformaseobtieneelproductobuscadotrasfiltraciónylavado condietiléterfrío. Esquema3.5.Rutasintéticadivergenteparalaobtencióndelosderivadosdendríticosde primeraysegundageneración,ensusformasprotegidascongruposbenciloyformas desprotegidascongruposhidroxiloterminales. Condicionesdereacción:i)[7],DMAP,diclorometano,ii)Pd/C,acetatodeetilo.
Capítulo3Capítulokk 60 N,PyQ A B C D,E,I´ F GIL CDCl3 J LacompletafuncionalizacióndePluronicF127®paradarF127‐Bn‐2[8]sesiguió por1H‐RMNyporFT‐IR. EnlaFigura3.3seobservaelespectrode1H‐RMN,asícomoeletiquetadode carbonosysuscorrespondientesprotones,delderivadoF127‐Bn‐2[8]. Figura3.3.Espectrode1H‐RMNdeF127‐Bn‐2enCDCl3,400MHz. Analizandoelespectrodemayoramenordesplazamientoquímico,a7.42‐7.32 ppmaparecenlasseñalescorrespondientesalosprotonesaromáticos(N,PyQ), a5.44ppmapareceelprotónbencílico(L),a4.66ppmseobservaundoblete quecorrespondeaunodelosprotonesdiastereotópicosdelbis‐MPA(I), apareciendoelotrodoblete(I´)enmascaradoporlasseñalesdelcopolímeroque estánentre3.37‐3.82ppm.Estosprotonesdiastereotópicossedescribencomo unsistemaAXconsiderandolarelaciónΔѵ II´/JII´>4[ΔѵII´(diferenciade frecuenciasentrelasseñales)yJII´(constantedeacoplamientoentrelos núcleos)].A4.36ppmsepuedeverlaaparicióndeuntripletecaracterísticoque integrapor4protonesyquecorrespondealosprotonesGdelbloquedePEGdel
Capítulo3 61 PluronicF127®adyacentesalnuevoenlaceésterformadoentreelpolímeroyla partedendrítica.Porúltimo,a1.05ppmapareceunsingletequeintegrapor6 protonescorrespondientesalosgruposmetilodelaestructuradebis‐MPA(J). Losvaloresdelasintegralesdelosnuevosgruposintroducidosenlamoléculade PluronicF127®concuerdanconloesperadoconsiderandolosvaloresdelas integralesdelosprotonestipoAytipoBdeestamolécula. Enelespectroinfrarrojodeestecompuestoseobservalaaparicióndela vibracióndetensióncaracterísticadelenlacecarbonilodelgrupo–COORa1737 cm‐1(Figura3.4). Figura3.4.EspectroFT‐IRdeF127‐Bn‐2,muestrapreparadaapartirdelcompuestoneto fundidosobrepastilladeNaCl. Paraelcrecimientodegeneraciónserealizóladesproteccióndelosgrupos hidroxiloporhidrogenolisisdeF127‐Bn‐2[8]conPd/C,obteniendoelderivado deprimerageneracióndesprotegidoF127‐OH‐4[9](reacciónquesecomentará enelsubapartadob).Sobreestederivadoseintrodujeron4nuevasunidades derivadasdebis‐MPAapartirdelanhídridoderivadodebis‐MPA[7],talycomo sehamostradoenelEsquema3.5,paralaobtencióndeF127‐Bn‐4[10]. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 6001.1001.6002.1002.6003.100 Transmitancia% cm‐1 Vibraciónde tensióndel enlaceC=O a1737 cm‐1
Capítulo3Capítulokk 62 Encomparaciónconlafuncionalizacióndelderivadodeprimerageneración,la completafuncionalizacióndeF127‐OH‐4[9]requiriótrabajarconexcesosde anhídrido[7]yDMAP,asícomomayorestiemposdereacción(72horasfrentea 48horas).EnloquerespectaalcompuestoF127‐Bn‐4[10],permitiósu obtenciónunapurificaciónsencillasimilaralautilizadaconF127‐Bn‐2[8]. LacorrectaformacióndeF127‐Bn‐4[10]sesiguiópor1H‐RMNyporFT‐IR.En estecasoelespectroobtenidopresentabaelaspectoqueseobservaenlaFigura 3.5.Sepuedenverlasseñalescorrespondientesalosanillosaromáticosa7.38‐ 7.28ppm(protonestipoR,SyT)ylosprotonesbencílicosa5.40ppm(protones tipoP).Losprotonesdelaestructuraderivadadebis‐MPAexterna(protonestipo LyL´)aparecencomodosdobletesyaquesonprotonesdiastereotópicos correspondientesaunsistemaAX.Unodelosdobletesseencuentraa4.56ppm eintegrapor8protones(protonestipoL),mientrasqueelotrodobleteaparece enmascaradoporlasseñalesdelnúcleopolimérico(protonestipoL´).Además, losprotonescorrespondientesalasestructurasdebis‐MPAinternas(protones tipoI),aparecencomounsingletea4.37ppm.LosprotonestipoGaparecenen estecasoa4.11ppm.Loshidrógenoscorrespondientesalosgruposmetilodelos gruposdebis‐MPAinternos(J)aparecena1.24ppm,mientrasquelosdelos gruposdebis‐MPAexternos(N)aparecena0.93ppm.
Capítulo3 63 PG I L R,S,T A J N B C F D,E,L´ CDCl3 H2O 12.0 183.0 6.4 66.9 5.0 4.3 7.8 8.7 4.0 13.0 8.2 Figura3.5.Espectrode1H‐RMNdeF127‐Bn‐4enCDCl3,300MHz. EnlaFigura3.6semuestraelespectroFT‐IRdelosderivadosF127‐OH‐4[9]y F127‐Bn‐4[10].Lacompletafuncionalizaciónseconfirmaporladesapariciónde labandadevibracióna3482cm‐1correspondientealosgruposhidroxilo. Figura3.6.EspectrosFT‐IRdeF127‐OH‐4yF127‐Bn‐4,muestrapreparadaapartirdel compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl. 6001.1001.6002.1002.6003.1003.600 Transmitancia(u.a.) cm‐1 F127‐OH‐4F127‐Bn‐4 Desaparición vibración‐OH a3482cm‐1
Capítulo3Capítulokk 64 b)Desproteccióndelosgruposhidroxiloporhidrogenolisis. LaeliminacióndelosgruposbencilodelosderivadosdePluronicdeprimera generación,F127‐Bn‐2[8]ydesegundageneración,F‐127‐Bn‐4[10]serealizó porhidrogenolisis,utilizandoPd/Ccomocatalizador.Parallevaracabodicha reacciónseprobarondosdisolventesdistintos.Enuncasoseutilizóunamezcla diclorometano/metanolenproporcion1:2,talcomosedescribeeneltrabajode Fréchet.62 Aunquelasdesproteccionestuvieronlugardeformacompleta,comoseobservó por1H‐RMNprincipalmenteporladesaparicióndelasseñalescorrespondientes alosgruposaromáticos,secomprobóunamalaconcordanciaentrelosvalores delasintegralescorrespondientesalosprotonestipoG,adyacentesalenlace ésterentrelapartedendríticayelpolímero,ylosprotonestipoAyBdelnúcleo polimérico,loqueseatribuyóaunaroturaparcialdelsistemadendrítico.Ante estosresultadossedescartóelusodelamezcladiclorometano/metanolparala realizacióndelasdesprotecciones. Elsegundodelosdisolventesutilizadosparallevaracaboladesprotecciónfue acetatodeetilo.Enestecasoseobservóunacorrectaintegracióndelasseñales, comosedetallaacontinuación. EnladesproteccióndeF127‐Bn‐2[8]paraobtenerF127‐OH‐4[9](Figura3.7),se confirmóladesaparicióndelasseñalesdelosprotonesbencílicosyaromáticos mediante1H‐RMN,asícomoeldesplazamientoacamposmayoresdelos protonestipoIeI´correspondientesalosgrupos‐CH2‐delsistemadebis‐MPA, queenestecasoaparecenenmascaradosjuntoalosprotonesdelpolímero, entre3.37y3.82ppm.LaseñaldelosprotonesG,próximosalenlaceéster aparecea4.34ppmylosmetilosdelsistemadebis‐MPA(J)a1.11ppm.
Capítulo3 65 C B D,E J Figura3.7.Espectrode1H‐RMNdeF127‐OH‐4enCDCl3,300MHz. EnelespectroinfrarrojodeF127‐OH‐4(Figura3.8),comparándoloconsu análogoprotegidoF‐127‐Bn‐2[8],seobservalaaparicióndelavibracióndel enlacecorrespondientealosgruposhidroxiloa3482cm‐1,asícomolabandade vibracióndetensióncorrespondientealgrupocarbonilo. Figura3.8.EspectrosFTIRdeF127‐Bn‐2yF127‐OH‐4,muestrapreparadaapartirdel compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl. 6001.1001.6002.1002.6003.1003.600 Transmitancia(u.a.) cm‐1 F127‐Bn‐2F127‐OH‐4 A G CDCl3 Aparición vibraciónOHa 3482cm‐1 VibraciónC=O
Capítulo3Capítulokk 66 LadesproteccióndeF127‐Bn‐4[10]queproporcionóF127‐OH‐8[11]seconfirmó porladesaparicióndelosprotonesdelsistemabencílicoenelespectrode1H‐ RMN(Figura3.9).AdemáslosprotonestipoIqueenelprecursorprotegido aparecíancomounsinglete,aparecencomouncuadrupletecorrespondientea unsistemaABa4.32ppm(II´q,8H,ΔѵII´=35Hz,JII´=11.2Hz),considerandola relaciónΔѵ II´/JII´<4[ΔѵII´(diferenciadefrecuenciasentrelasseñales)yJII´ (constantedeacoplamientoentrelosnúcleos)].Partedeestecuadruplete aparecesolapadojuntoconeltripletea4.26ppmdelosprotonesGdel polímero,adyacentesalenlaceéster,siendoelvalortotaldelaintegralde12 protones,8correspondientesalosprotonesIeI´yotros4correspondientesa losprotonesG.LosprotonesLcorrespondientesalosgrupos‐CH2‐ delas estructurasdebis‐MPAexternas,aparecenjuntoconlasseñalesdelpolímero entre3.37y3.82ppm. Ademásseobservalaaparicióndeunsingletedebidoalosgruposmetilodela estructuradebis‐MPAinterno(J)yotrosingletedelosgruposmetilodelas estructurasdebis‐MPAexternas(N).Losvaloresdelasintegracionesdelos extremosdendríticossoncoherentesconlasintegracionesdelosprotonesAyB dePluronicF127®.
Capítulo3 73 devibracióncorrespondientealosgruposhidroxilodeF127‐OH‐8a3457cm‐1 (Figura3.16). Figura3.16.EspectroFT‐IRdeF127‐OH‐8yF127‐Ac‐4,muestrapreparadaapartirdel compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl. Comonormageneral,losproductoscongruposacrilatoensuestructuraquímica fueronalmacenadosa4⁰C,avacíoyenoscuridadparaevitarsupolimerización. d)CaracterizaciónporCromatografíadePermeaciónenGel(GPC)y Espectrometríademasas(MALDI‐MS). LastécnicasdeGPCyMALDI‐MSproporcionaroninformaciónadicionalparala caracterizacióndelosdiferentescompuestos. MedianteGPC,sedeterminaronlospesosmolecularespromedioennúmero (Mn),promedioenpeso(Mw)yelíndicedepolidispersidad(PDI),utilizando patronesdepoliestirenoparaelcalibrado. ParalarealizacióndeloscromatogramasdePluronicF127®ysusderivadosse hanutilizadodostiposdecolumnascromatográficas,Styrage®HR1THFWatersy PLgel5µmMIXED‐CdeAgilentTechnologies,únicascolumnasdisponibles. 6001.1001.6002.1002.6003.1003.600 Transmitancia(u.a.) cm‐1 F127‐OH‐8F127‐Ac‐8
Capítulo3Capítulokk 74 Loscromatogramasobtenidos(FiguraI.3delAnexoI)presentarondos distribucionesdepesosmolecularesmásomenosseparadasenfuncióndeltipo decolumnautilizadaydeltipodematerialensayado. EnlaFigura3.17,amododeejemplo,semuestraelcromatogramadePluronic F127®comercialutilizado,quepresentadosdistribucionesdepesosmoleculares conlacolumnaStyrage®HR1THFWaters. Figura3.17.CromatogramadeGPCdePluronicF127®utilizandocolumnasStyrage®HR1 THFWaters. Sinembargo,elusodecolumnasPLgel5µmMIXED‐CdeAgilentTechnologiesno permiteunaseparaciónadecuadadelasdosdistribucionesdepesos moleculares,aunquesímuestralapresenciadediferentespesosmoleculares,tal ycomoseobservaenlaFigura3.18paraelderivadoF127‐Ac‐8. Figura3.18.CromatogramadeGPCdeF127‐Ac‐8utilizandocolumnasPLgel5µmMIXED‐ CdeAgilentTechnologies. 0 500 1000 1500 10 12 14 16 18 20 LSU Tiempo(minutos) 0 5 10 15 20 25 10 12 14 16 18 20 LSU Tiempo(minutos)
Capítulo3 75 EnlaTabla3.1serecogenlosresultadosdeMnyPDIobtenidosporGPC, proporcionándosedosvaloresdeMncuandoloscromatogramasmostraban distribucionesdepesomolecularmásseparadas,yunsolovalorparalas distribucionesdepesomolecularpeorseparadas.Tambiénseincluyenlos valoresdelpesomolecularteórico,calculadoscomolasumadelospesos molecularesdelosbloquesindividualesqueformancadaunodelosderivados analizados(Pmcalculado). Tabla3.1.Pesomolecularpromedioennúmero,índicedepolidispersidadypeso molecularcalculadoparalosderivadosdePluronicF127®. MnaPDIbPmcalculadoc PLURONICF127d16748 6438 1.03 1.1 12600 F127‐Ac‐2e77131.0912708 F127‐Bn‐2e75871.0913008 F127‐OH‐4d181661.112842 F127‐Ac‐4e77981.0913048 F‐127‐Bn‐4e69031.1313649 F127‐OH‐8d21910 9218 1.01 1.02 13297 F127‐Ac‐8e87311.0913729 aMn:Pesomolecularpromedioennúmeroeng/molobtenidoporGPC bPDI:Índicedepolidispersidad(Mw/Mn)obtenidoporGPC cPmcalculado:Pesomolecularcalculadoeng/molcomolasumadelos pesosmolecularesdelosbloquesindividuales dColumnaStyrage®HR1THFWaters eColumnaPLgel5µmMIXED‐CdeAgilentTechnologies SicomparamoslosvaloresdeMnobtenidosporGPC,independientementedela columnautilizada,conelPmcalculado,seobtieneunaclaradesviaciónentre ellos,tantoparaPluronicF127®comoparatodossusderivados,talycomoseha observadoparaotroscopolímerosbloquedendrítico‐linealesdescritosenla
Capítulo3Capítulokk 76 bibliografía.112c,113ElpesomoleculardeterminadoporGPCesunpesomolecular aparente,debidoalasdiferenciasdevolumenhidrodinámicoexistentesentre PluronicF127®ysusderivados,ylosdeestándaresdepoliestirenoutilizados paralacalibración. AunquemedianteGPCnoseobtuvoinformaciónconcluyenteencuantoala variacióndepesomolecular,todosloscromatogramasdelosderivadosde PluronicF127®analizadosporGPCconfirmaronlapresenciade2distribuciones depesomolecular(mejoropeorseparadas)quecorrespondenalpolímero completamentefuncionalizado,descartándoselapresenciademoléculaso fragmentosdemoléculasnounidasalnúcleocentralpoliméricoopolímero parcialmentefuncionalizado. MedianteMALDI‐MSseobservó,aligualqueconGPC,lapresenciadedos distribucionesdepesosmolecularesparaPluronicF127®ysusderivados(Figura 3.19).Lasdosdistribucionesdepesosmolecularesobservadasparatodoslos compuestosaumentansumasaoladisminuyenenfuncióndeltipodereacción llevadaacaboenelderivado.Conelcrecimientodegeneraciónseproduceel desplazamientodelosmáximosamayorrelaciónm/z(masa/carga). 113Martín‐Rapún,R.;Marcos,M.;Omenat,A.;Serrano,J.L.;Luckhurst,G.R.;Mainal,A., ChemistryofMaterials2004,16(24),4969‐4979.
Capítulo3 77 Figura3.19.MALDI‐MSdelPluronicF127®utilizadoysusderivadosdendríticos. EnlaFigura3.20sepuedeobservareldesplazamientodeladistribucióndepesos amayoresrelacionesmasa/cargatraslafuncionalizacióndePluronicF127®(en rojo)condendronesderivadosdebis‐MPAdesegundageneraciónterminados engruposacrilato,compuestoF127‐Ac‐8(enmorado).Laintroduccióndelos extremosdendríticossuponeunaumentodepesomolecularconrespectoa 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 4993.6 13041 5050.2 13297.2 5213.9 13708.1 5615.9 13844.4 5286.1 13693.8 PluronicF127 F127‐Bn‐2 F127‐OH‐4 F127‐Bn‐4 F127‐OH‐8
Capítulo3Capítulokk 78 PluronicF127®de1129g/mol,calculadocomolasumadelosfragmentos acopladosalnúcleocentralpolimérico.MedianteMALDI‐MSseobtieneun aumentodepesomolecularde1135.6g/mol,queconcuerdaconelvalorteórico calculado. Figura3.20.ComparacióndelosespectrosdeMALDI‐MSdePluronicF127®yF127‐Ac‐8. 3.2.‐DETERMINACIÓNDELASPROPIEDADESSOL‐GEL Enelcampodeinvestigacióndegelessupramolecularessehandescrito básicamentedosmetodologíasparalaLCST(LowCriticalSolutionTemperatura): elmétododeinversióndelvialylacalorimetríadiferencialdebarrido(DSC). Conestefin,yutilizandoambosmétodos,sehanpreparadoycaracterizado disoluciones(enPBS10mMypH7.4)decadaunodelosderivadosdePluronic F127®sintetizados,aconcentracionesdel16.5%,18%,20%,23%y25%(w/v). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z PluronicF127 F127‐Ac‐8
Capítulo3 79 3.2.1.‐Estudiodegelificaciónmedianteelmétododeinversióndelvial Elmétododeinversióndelvialconsisteendeterminarlatemperaturade gelificación(LCST)alacualnoexisteflujodelgelalrealizarlainversióndelvial quelocontiene(Figura3.21). Figura3.21.Procesoreversibledegelificaciónobservadoporelmétododeinversióndel vialyproducidoporelaumentodelatemperatura. Unavezalcanzadoelestadogel,continuandoelcalentamientoseconsigue determinarlatemperaturadelatransicióngel‐sol. EnlaTabla3.2semuestranlastemperaturasdetransicióndefasesol‐gelygel‐ solobtenidasparalosmaterialesestudiados.Conladeterminacióndelasdos temperaturasquedareflejadoelintervalodeexistenciadelestadogel. Experimentalmente,ambastemperaturasseestablecieronsiguiendoel protocolodescritoenelapartado6.2.a,delaParteExperimental. ΔT ‐ΔT SOL GEL
Capítulo3Capítulokk 80 Tabla3.2.Temperaturasdetransicióndefasesdelosdiferenteshidrogelesobtenidas porelmétododeinversióndelvial. Concentración (%w/v) LCSTamétodo inversiónvial(⁰C) Temperatura transicióngel‐sol (⁰C) PluronicF127®16.5%3778 18%3676 20%2668 23%2165 25%1859 F127‐Ac‐216.5%4050 18%3457 20%2868 23%25,589 25%2496 F127‐Bn‐216.5%NOGELNOGEL 18%NOGELNOGEL 20%NOGELNOGEL 23%3843 25%3052 F127‐OH‐416.5%NOGELNOGEL 18%NOGELNOGEL 20%3152 23%2565 25%2268 F127‐Ac‐416.5%NOGELNOGEL 18%3739 20%3444 23%3148 25%2854 F127‐Bn‐816.5%NOGELNOGEL 18%NOGELNOGEL 20%NOGELNOGEL 23%NOGELNOGEL 25%NOGELNOGEL F127‐OH‐816.5%NOGELNOGEL 18%NOGELNOGEL 20%NOGELNOGEL 23%3152 25%2556 F127‐Ac‐816.5%NOGELNOGEL 18%NOGELNOGEL 20%NOGELNOGEL 23%3742 25%3546 aLCST(LowCriticalSolutionTemperature),temperaturadetransiciónsol‐gel.
Capítulo3 81 Losdatosexperimentalestabuladoshanpermitidoestablecerlosdiagramasde fasequesemuestranenlaFigura3.22yquefacilitanelestudiocomparativo entrelosdistintosmateriales. Figura3.22.Diagramadefasesdeloshidrogeles,preparadosenPBS10mMpH7.4,con PluronicF127®yconsusdiferentesderivados,aconcentracionesdel16.5%,18%,20%, 23%y25%(w/v). 3.2.2.‐ EstudiodegelificaciónmedianteCalorimetríaDiferencialdeBarrido (DSC) ElprocedimientodepreparacióndelasmuestrasparaelestudioporDSCse describeenelapartado6.2.b,delaParteExperimental. ParaelestudioporDSCseaplicóelprocedimientoexplicadoenelAnexoII,que proporcionatermogramasconlaprimeraderivadadelflujodecalorconrespecto altiempofrentealatemperatura.Elprimerpicoendotérmicoobservadoeneste tipodetermogramas,identificalaCMT,queeslatemperaturaalacualse producelamicelizaciónparaunadisolucióndepolímerodeunadeterminada concentración,mientrasqueelsegundopicocorrespondealaLCST. 15 25 35 45 55 65 75 85 95 15 17 19 21 23 25 27 Temperatura(⁰C) Concentracion(%w/v) PluronicF127 F127‐Ac‐2 F127‐Bn‐2 F127‐OH‐4 F127‐Ac‐4 F127‐OH‐8 F127‐Ac‐8
Capítulo3Capítulokk 82 Amododeejemplo,enlaFigura3.23,semuestranlostermogramasdeDSCpara F127‐Ac‐4paratresdelasconcentracionesestudiadas.Encadaunodelos termogramassehamarcadolatemperaturademicelización(enmorado),laLCST (enazul)ylaLCSTobtenidaporelmétododeinversióndelvial(enverde). ParaelderivadoF127‐Ac‐4al16.5%(Figura3.23(a))noseobservaelpicodela gelificaciónyaqueelpolímeronoescapazdeformarhidrogelestermosensibles, loqueescoherenteconloobtenidoconelmétododeinversióndelvial. Paralasconcentracionesintermedias,18%y20%(Figura3.23(b)),lospicosde gelificaciónseobservancomounpicodebajaintensidad. Lospicosdegelificaciónsedetectandeformamásclaraydefinidaparalos hidrogelesdemayorconcentración,23%y25%(Figura3.23(c)). Estavariacióndeintensidaddelospicosdebidosalagelificaciónenfuncióndela concentraciónesextensiblealrestodecopolímerosbloquelinealydendrítico‐ lineal‐dendrítico.
Capítulo3 89 3.4.‐CARACTERIZACIÓNDELAMORFOLOGIAINTERNAPORSEM ParallevaracaboelestudioporSEMdeloshidrogelesfotopolimerizados,las muestrassefracturarontalycomosedescribeenelapartado6.2.d.,delaParte Experimental. EnlasFiguras3.25,3.26y3.27serecogenlasimágenesdeSEMdelosdiferentes materialesenlasquesepuedenverlasestructurasinternasporosasdelos hidrogelesfotopolimerizadosderivadosdeF127‐Ac‐2,F127‐Ac‐4yF127‐Ac‐8, respectivamente. Figura3.25.ImágenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127‐Ac‐2a concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd). d)P/H23‐F127‐Ac‐2 c)P/H23‐F127‐Ac‐2 b)P/H18‐F127‐Ac‐2 a)P/H18‐F127‐Ac‐2 50µm 50µm 50µm 30µm
Capítulo3Capítulokk 90 Figura3.26.ImágenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127‐Ac‐4a concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd). Figura3.27.ImágenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127‐Ac‐8a concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd). a)P/H18‐F127‐Ac‐4b)P/H18‐F127‐Ac‐4 d)P/H23‐F127‐Ac‐4c)P/H23‐F127‐Ac‐4 c)P/H23‐F127‐Ac‐8d)P/H23‐F127‐Ac‐8 a)P/H18‐F127‐Ac‐8 50µm 5µm 100µm 30µm 50µm b)P/H18‐F127‐Ac‐8 5µm 50µm 5µm
Capítulo3 91 Todosloshidrogelesestudiadospresentanunamorfologíaporosairregular.Con elfinderealizarelestudiocomparativo,enlaTabla3.4,serecogenlosintervalos correspondientesalosvaloresmínimoymáximodetamañodeporoobservados porSEM(estudionoestadístico). Tabla3.4.TamañodeporodeloshidrogelesdederivadosacriladosdePluronic observadosporSEM. HIDROGELTamañosdeporoa(µm) P/H18‐F127‐Ac‐22‐25 P/H23‐F127‐Ac‐22‐15 P/H18‐F127‐Ac‐42‐25 P/H23‐F127‐Ac‐42‐40 P/H18‐F127‐Ac‐81‐6 P/H23‐F127‐Ac‐81‐4 aIntervaloscorrespondientesalosvaloresmínimoymáximodetamaño deporoobservadosporSEM(estudionoestadístico). EnelcasodeloshidrogelesfotopolimerizadosP/H18‐F127‐Ac‐2(Figura3.25, imágenesayb)seobservaunaestructuraconelevadadensidaddeporos,con untamañomediodeporosdealrededorde15μm,sibienlostamañosvarían entre2y25μm.ParaelanálogodemayorconcentraciónP/H23‐F127‐Ac‐2 (Figura3.25,imágenescyd)lamorfologíaporosaessimilar,sibienseobserva unpredominiodeporosdemenortamañodealrededorde10μm(Figura3.25, imagend),loquedalugaraunaestructuraligeramentemáscompacta.Los porosobservadoscorrespondenaporoshuecos,quesugierelainterconexión entrelosmismos. LoshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐4(Figura3.26,imágenesayb)yP/H23‐F127‐Ac‐4 (Figura3.26,imágenescyd)poseentambiénunaestructurainternaporosa,de tamañosdeporode2‐25µmyde2‐40µm,respectivamente.Enestecasoel aumentodeconcentraciónnosuponeunareduccióndeltamañodeporoe inclusoP/H23‐F127‐Ac‐4parecetenerunamayorpredominiodeporosdemayor tamaño(ComparacióndeimágenesaycenlaFigura3.26;sedebeteneren
Capítulo3Capítulokk 92 cuentaquelaescaladelasdosimágenesesdiferente).Enlasimágenesbyd (Figura3.26)semuestranconmásdetallelosporosinterconectadosentresí. Elaumentodegruposacrilatoporcopolímerobloquereactivo,2paraF127‐Ac‐2 y4paraF127‐Ac‐4,nosuponeunadisminucióndeltamañodeporoniportanto laformacióndeunaestructurainternamáscompactaenloshidrogeles fotopolimerizados.SinembargolaestructuradeP/H18‐F127‐Ac‐8yP/H23‐F127‐ Ac‐8esmuchomáscompacta,menosporosayconunmayorpredominiode porosdepequeñotamaño.Estascaracterísticassepuedenobservarclaramente sicomparamoslasimágenesaycdelasFiguras3.25y3.26conlasimágenesay cdelaFigura3.27.EnlasimágenesbyddelaFigura3.27seobservaendetalle laestructuradeporoscompactosdondenoseapreciaclaramenteconexión entrelosporos.Elmayornúmerodegruposacrilatopormoléculaproporciona unamayorcapacidaddeentrecruzamientoenlareaccióndefotopolimerización, loquesetraduceenunasignificativareduccióndeltamañodeporoenuna estructuramuchomáscompactaquelaobtenidaparaP/H18‐F127‐Ac‐2,P/H23‐ F127‐Ac‐2,P/H18‐F127‐Ac‐4yP/H23‐F127‐Ac‐4. 3.5.‐ESTUDIODEDEGRADACIÓNDELOSHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS Anteunaposibleaplicacióndeloshidrogelesfotopolimerizadoscomoscaffolds paraITesimportanteconocerelprocesodedegradacióndeéstos,yaquees necesariaunadegradaciónprogresivadelmaterialenuntiemposuficienteque permitaladiferenciacióncelularasícomolaproduccióndeECMporpartedelas células. Elprocesodedegradacióndetodosloshidrogelesfotopolimerizados,P/H18‐ F127‐Ac‐2,P/H23‐F127‐Ac‐2,P/H18‐F127‐Ac‐4,P/H23‐F127‐Ac‐4,P/H18‐F127‐ Ac‐8yP/H23‐F127‐Ac‐8,seanalizósiguiendoelprotocolodetrabajoquese describeenelapartado6.2.e.,delaParteExperimental.Estametodologíaseha establecidosiguiendounprocedimientodescritoporWen,100aenelquela degradaciónseevidenciaatravésdelhinchamientodelasmuestras.
Capítulo3 93 Sedefinecomohinchamientoalcocienteentreelpesodelmaterialaun determinadotiempo(Wt)yelpesoinicialdelhidrogel(W0).Elgradode hinchamientoatiempoceroes1,mientrasquecuandoelhidrogelestá completamentedegradadoelvalordelhinchamientoes0. Gradodehinchamiento W W Loshidrogelesqueposeenunbajogradodehinchamientoinicialyque experimentanunaumentodelgradodehinchamientoconelpasodeltiempo, permitenunsoporteinicialdelaspropiedadesmecánicasquesevan transfiriendoalaECMendesarrolloconelpasodeltiempo.Mayoresgradosde hinchamientoenloshidrogelesconelpasodeltiemposonbeneficiososparala produccióndeECM.14b EnlaFigura3.28serepresentaelperfildedegradaciónparaloshidrogeles P/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2.Estoshidrogelesmuestranunbajogrado dehinchamientoinicial,ligeramentesuperiorparalaconcentracióndel23%en peso.Tras35díasdeensayoseobservacomoloshidrogelesvanaumentandoel gradodehinchamientodebidoaquelosenlaceséstersevandegradando, produciendolapérdidadelaintegridadestructuralquehacequeelhidrogelsea capazdeabsorbermásagua.Alos42días,elhinchamientoesmásnotablepara ambos,einclusoseobservapérdidadelaformacilíndricaoriginaldelmonolito (Figura3.28(a)paraP/H18‐F127‐Ac‐2,(c)paraP/H23‐F127‐Ac‐2),siendoesta pérdidamásevidenteenelcasodelaconcentracióndel18%. Alcabode49díaslaformasehaperdidocompletamente(Figura3.28(b)para P/H18‐F127‐Ac‐2,(d)paraP/H23‐F127‐Ac‐2)ytras57díasdeensayoambos hidrogelessehandegradadocompletamente. EnlaFigura3.29semuestranlosperfilesdedegradaciónparaP/H18‐F127‐Ac‐4y P/H23‐F127‐Ac‐4.Comoenlosanterioresmateriales,inicialmenteel
Capítulo3Capítulokk 94 hinchamientoesmuybajoparaambasconcentraciones.Apartirdelos57días deensayoloshidrogelescomienzanahincharsehastaalcanzarsupesomáximoa los77díasparaP/H18‐F127‐Ac‐4yalos84díasparaP/H23‐F127‐Ac‐4.Elmayor gradodehinchamientosealcanzaantesparaloshidrogelesdemenor concentración,loquepuededeberseaunadegradacióndelosenlacesésterde lasunidadesdendríticas108ligeramentemásrápida,debidoalamenordensidad delaredentrecruzada.Apartirdeahíloshidrogelescomienzanaperdermasa hastasucompletadegradación,alos93díasparaP/H18‐F127‐Ac‐4y98días paraP/H23‐F127‐Ac‐4. ElmayortiempodeestabilidaddeloshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐4yP/H23‐F127‐ Ac‐4frentealoshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2estádeacuerdo conunmayorentrecruzamientodelaredpolimérica,posibleporelaumentode gruposacrilatoenelderivadotetracriladofrentealdiacrilado. Figura3.28.HinchamientodeloshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2en funcióndeltiempo. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 102030405060 Hinchamiento Tiempo(días) P/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2 P/H18‐F127‐Ac‐2 P/H23‐F127‐Ac‐2 A B CD 42días49días b cd a
Capítulo3 95 Figura3.29.HinchamientodeloshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐4yP/H23‐F127‐Ac‐4en funcióndeltiempo. Enestalínea,loshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐8yP/H23‐F127‐Ac‐8(Figura3.30) presentanunbajogradodehinchamientoinicialsinningúnindiciode degradacióntrasmásde200díasdeensayo.Apartirdelos240díasel hinchamientodeloshidrogelesylaprogresivapérdidadelamorfologíacilíndrica comienzanasernotables,produciéndoseladegradacióntotaldelhidrogel P/H18‐F127‐Ac‐8en276díasydeP/H23‐F127‐Ac‐8en286días. Figura3.30.HinchamientodeloshidrogelesP/H18‐F127‐Ac‐8yP/H23‐F127‐Ac‐8en funcióndeltiempo. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 102030405060708090100 Hinchamiento Tiempo(días) P/H18‐F127‐Ac‐4yP/H23‐F127‐Ac‐4 P/H18‐F127‐Ac‐4 P/H23‐F127‐Ac‐4 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 50 100 150 200 250 300 Hinchamiento Tiempo(días) P/H18‐F127‐Ac‐8yP/H23‐F127‐Ac‐8 P/H18‐F127‐Ac‐8 P/H23‐F127‐Ac‐8 49días70días b d a c 248días261días a b cd
Capítulo3Capítulokk 96 Estosresultadostambiénsoncoherentesconlamorfologíainternaobservada porSEM(apartado3.4,deestecapítulo),queresultabasermuycompactaenlos derivadosoctacriladosporelaltogradodeentrecruzamiento. Comoresumendeloobservado,laTabla3.5recogelostiemposdedegradación obtenidosparacadaunodeloshidrogelesfotopolimerizados.Eltiempode degradaciónsepuedemodularconelnúmerodegruposacrilatopresentesenel copolímerobloquelinealodendrítico‐lineal‐dendríticoyconlaconcentración. Tabla3.5.TiempodedegradacióndehidrogelesfotopolimerizadosdeF127‐Ac‐2,F127‐ Ac‐4yF127‐Ac‐8. HIDROGELTiempodedegradación (días) P/H18‐F127‐Ac‐257 P/H23‐F127‐Ac‐257 P/H18‐F127‐Ac‐493 P/H23‐F127‐Ac‐498 P/H18‐F127‐Ac‐8276 P/H23‐F127‐Ac‐8286 3.6.‐ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR Losensayosdeviabilidadbiológicahansidorealizadosconcélulashumanas,en untrabajodecolaboraciónconlaDra.MaríaJoséMartínezLorenzodelBancode SangreyTejidosdeAragón.Paralarealizacióndeestosensayosseeligieron célulasmesenquimaleshumanas(MSC)extraídasdecartílago. LasMSCfueronestudiadasporprimeravezporFriedensteinenlosaños70.115 Dosdelasprincipalescaracterísticasdeestascélulas,comodefinelaSociedad InternacionaldeTerapiaCelular,sonsucapacidaddeadhesiónalplástico, adquiriendounaformacaracterísticaalargada,enformadeaguja,ysucapacidad dediferenciaciónadistintostiposdecélulasquedanlugaradistintasvariedades 115FriedensteinAJ,G.J.,KulaginaNN,ExpHematol1976,4,267‐274.
Capítulo3 97 detejidos,comosepuedeobservarenlaFigura3.31. 116 Estacapacidadde diferenciaciónadistintostejidosfuedeterminantealahoradeelegireltipode célulasparalarealizacióndenuestrosensayos,antelaposibilidaddeaplicación deloshidrogelescomoandamiajesparaIngenieríadetejidos. Figura3.31.EsquemadelasdiferentesviasdediferenciacióndelasMSCahueso, cartílago,músculo,médula,tendonesoligamentosytejidosconectivos.116 EnlaTabla3.6seresumenlostiposdeexperimentosrealizados,incluyendoa continuaciónalgunoscomentariosrelativos.Laexposiciónydiscusióndelos resultadosseharealizadoenfuncióndelgrupofuncionalterminalpresenteenla estructuraquímicadelosmateriales:gruposacrilato(resumendeexperimentos encolorrosaenlaTabla3.6)ygruposbenciloohidroxilo(resumende experimentosencolorazulenlamismatabla).Lasviabilidadescelulares obtenidassehancomparadoentodosloscasosconlasupervivenciacelularen 116(a)Sensebé,L.;Krampera,M.;Schrezenmeier,H.;Bourin,P.;Giordano,R.,Vox Sanguinis2010,98(2),93‐107;(b)Caplan,A.I.,TheJournalofPathology2009,217(2), 318‐324.
Capítulo3Capítulokk 98 presenciadelpolímeroPluronicF127®,determinadadelamismaformaquepara loscopolímerosbloquelinealodendrítico‐lineal‐dendrítico. Tabla3.6.Tablaresumendelosensayosdeviabilidadcelularrealizados. COMPUESTO TIEMPO (h) DISOL. (%w/v) EXPTO. H (%w/v) P/H (%w/v) EXPTO. Tª (⁰C) F127‐Ac‐224/48/725y102D18y2318y232Dy3D37 F127‐Ac‐424/48/725y102D18y2318y232Dy3D37 F127‐Ac‐824/48/725y102D18y2318y232Dy3D37 PluronicF12724/48/725y102D18y23‐ 2Dy3D37 F127‐Bn‐224/48/725y102D23‐ 2Dy3D37 F127‐OH‐424/48/725y102D23‐ 2Dy3D37 F127‐Bn‐424/48/725y102D‐ ‐ 2Dy3D37 F127‐OH‐824/48/725y102D23‐ 2Dy3D37 Laviabilidadcelularsehaevaluadoalas24,48y72horasdeincubación,yse hanllevadoacabo2tiposdeensayos,quesehandenominadoensayos2Dy3D, cuyarepresentaciónesquemáticasepuedeverenlaFigura3.32. Figura3.32.Esquemailustrativode:a)experimentos2D,capadecélulascubiertasporel hidrogel,yb)experimentos3D,célulasdistribuidasenunentornotridimensionalenel interiordelhidrogel. a)b)
Capítulo3 105 Figura3.35.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddehidrogeles fotopolimerizadosdeF127‐Ac‐4al18%y23%tras24horasdeensayo,alaizquierdaen colorverdeseobservanlascélulasvivasyaladerechaencolorrojolascélulasmuertas. Figura3.36.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles fotopolimerizadosdeF127‐Ac‐4al18%y23%tras24horasdeensayo,alaizquierdaen colorverdeseobservanlascélulasvivasyaladerechaencolorrojolascélulasmuertas. Conelfindedisponerdeunaobservacióntridimensionaldelascélulas encapsuladasenelinteriordelhidrogel,lamorfologíacelularenlosensayos 3D/P/H23‐F127‐Ac‐4secaracterizótambiénmediantemicroscopiaconfocal,tras 24horasdeensayo.ParalatincióndelascélulasvivasseutilizóCalceinAMy paralosnúcleosdelascélulas,DAPI,queesunmarcadorfluorescenteenelazul 2D/P/H18‐F127‐Ac‐4 2D/P/H23‐F127‐Ac‐4 2D/P/H18‐F127‐Ac‐4 2D/P/H23‐F127‐Ac‐4 3D/P/H18‐F127‐Ac‐4 3D/P/H23‐F127‐Ac‐4 3D/P/H18‐F127‐Ac‐4 3D/P/H23‐F127‐Ac‐4
Capítulo3Capítulokk 106 queseunealassecuenciasdeADNenelnúcleo.Elmarcajedelascélulasenel interiordeloshidrogelesserealizódelaformadescritaenelapartado6.2.f.,de laParteExperimental. EnlaFigura3.37(a)semuestraunaimagenen3Ddeunacélulaencapsuladaen elinteriordelhidrogel.EnlaFigura3.37(b)y(c)semuestraunodelosplanosdel hidrogelconcélulasensuinteriorconmarcajedeCalceinAMyDAPI respectivamente.Además,enlaFigura3.37(d)seobservalasuperposiciónde losmarcajesfluorescentesconlascélulasobservadasencontrastedefases. Figura3.37.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaconfocalparaensayos3Dde hidrogelesfotopolimerizadosdeF127‐Ac‐4al23%tras24horasdeensayo,a)imagen en3Ddeunacélulaencapsuladaenelinteriordelhidrogel,b)célulasvivasteñidascon CalceinAMencapsuladasenelhidrogelsituadasenunmismoplano,c)núcleoscelulares decélulasteñidosconDAPIsituadasenunmismoplano,d)superposicióndeimágenes defluorescenciaenelverde,fluorescenciaenelazulsobreimagenencontrastede fases.Laescalacorrespondea30µm. a) b)c)d)
Capítulo3 107 Conesteensayosehademostradoquelascélulasseencapsulanenelinteriorde loshidrogelestraslaformacióndeestosporefectodelatemperaturayla posteriorfotopolimerización. Losresultadosdeviabilidadcelularobtenidos,enparticularconhidrogeles fotopolimerizadosdeF127‐Ac‐4enentorno3D,hanpermitidoseleccionarlos paraprepararcorteshistológicos,estudioqueseestárealizandoenlaactualidad. Estetipodepreparacionespermitirácuantificarelgradodediferenciación celularenelinteriordeloshidrogeles,mediantelatinciónespecíficadelos distintostiposdeproteínasconstituyentesdelaECMexcretadosporlascélulas enelcasodeproducirsedichadiferenciación. 3.6.2.‐ResultadosdeviabilidadcelulardederivadosF127‐Bn‐n(n=2,4):F127‐ Bn‐2yF127‐Bn‐4yF127‐OH‐n(n=4,8):F127‐OH‐4yF127‐OH‐8. EnlasFiguras3.38y3.39serecogenlosresultadosdeviabilidadcelularen entorno2Dy3D,respectivamente,deestosmaterialesnoreactivostambién estudiadosenestetrabajo,tantoendisolución(D)comoenformadehidrogeles (H).
Capítulo3Capítulokk 108 PluronicF127F127‐Bn‐2F127‐OH‐4F127‐Bn‐4F127‐OH‐8 Figura3.38.ViabilidadcelulardederivadosF127‐Bn‐2,F127‐OH‐4,F127‐Bn‐4yF127‐ OH‐8,enentorno2D:a)al5%(w/v)endisolución,b)al10%(w/v)endisoluciónyc)al 23%(w/v)enestadogel. 99.8 98.4 93.3 96.7 90.5 65.2 100.2 95.3 83.3 99.4 97.9 93.4 99.3 93.0 86.4 0 20 40 60 80 100 24horas 48horas 72horas Viabilidadcelular(%) 2D/D5‐F127‐Bn‐n(n=2,4) 2D/D5‐F127‐OH‐n(n=4,8) 96.2 76.3 35.9 91.4 77.6 34.6 98.8 93.5 71.9 94.6 93.2 85.5 98.4 89.4 66.9 0 20 40 60 80 100 24horas 48horas 72horas Viabilidadcelular(%) 2D/D10‐F127‐Bn‐n(n=2,4) 2D/D10‐F127‐OH‐n(n=4,8) 72.1 59.6 52.9 67.9 50.6 31.4 98.8 97.7 90.7 95.8 95.1 87.6 0 20 40 60 80 100 24horas 48horas 72horas Viabilidadcelular(%) 2D/H23‐F127‐Bn‐n(n=2) 2D/H23‐F127‐OH‐n(n=4,8) a) b) c)
Capítulo3 109 Figura3.39.ViabilidadcelulardederivadosF127‐Bn‐2,F127‐OH‐4,F127‐Bn‐4yF127‐ OH‐8,enentorno3Dal23%(w/v)enestadogel. Delanálisisdelosresultadosobtenidosenensayoscelulares2Ddedisoluciones al5%(w/v)(Figura3.38,(a)),2D/D5‐F127‐Bn‐n(n=2,4)y2D/D5‐F127‐OH‐n(n=4, 8),sededuceunaviabilidadcelulardeestoscompuestossimilaraPluronicF127® ypróximasal90%tras72horasdeensayoenlamayoríadeloscasos. Alaumentarlaconcentraciónal10%(w/v)(Figura3.38,(b)),con2D/D10‐F127‐ Bn‐n(n=2,4)y2D/D10‐F127‐OH‐n(n=4,8)seobservaunadisminucióndela viabilidadcelularentodoslosmateriales.Sinembargo,estadisminuciónes inclusomenossignificativaquelaobservadaparaPluronicF127®, manteniéndoseenvaloressuperioresal65%tras72horasdeensayo. Cuandolosensayosserealizanenentorno2Dconlosmaterialesal23%(w/v)en estadogel(Figura3.38,(c)),2D/H23‐F127‐Bn‐n(n=2)y2D/H23‐F127‐OH‐n(n=4, 8),sibienseproduceunadisminucióndelaviabilidadcelularparaF127‐Bn‐2con respectoalosmaterialesendisolución,loshidrogelesdelosderivadosF127‐OH‐ 4yF127‐OH‐8presentanunaviabilidadcelularentornoal90%tras72horasde ensayo. Estabuenaviabilidaddelosmaterialespolihidroxiladossemantieneinclusoen losensayos3Dconlosmaterialesenestadogelal23%(w/v)(Figura3.39), 3D/H23‐F127‐OH‐n(n=4,8),superandosignificativamentealPluronicF127®. 29.2 41.5 40.9 7.8 7.7 2.5 96.9 92.4 85.4 97.6 96.5 81.1 0 20 40 60 80 100 24horas 48horas 72horas Viabilidacelular(%) 3D/H23‐F127‐Bn‐n(n=2) 3D/H23‐F127‐OH‐n(n=4,8) PluronicF127 F127‐Bn‐2 F127‐OH‐4 F127‐OH‐8
Capítulo3Capítulokk 110 EnlasFiguras3.40a3.46semuestranlasmorfologíascelularesobservadasen losensayos2Dy3Ddelosdiferenteshidrogeles,asícomoendisolución. ComosepuedecomprobarenlosensayosdederivadosF127‐Bn‐2enentorno 2Dlascélulasposeenunamorfologíaalargadayredondeadaen3D(Figuras3.40 y3.41,respectivamente). Figura3.40.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones ehidrogelesdeF127‐Bn‐2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imágenesen contrastedefases;Segundacolumna:Célulasvivas;Terceracolumna:Célulasmuertas. Figura3.41.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles deF127‐Bn‐2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imágenesencontrastede fases;Segundacolumna:Célulasvivas;Terceracolumna:Célulasmuertas. 2D/D5‐F127‐Bn‐2 2D/D10‐F127‐Bn‐2 2D/H23‐F127‐Bn‐2 2D/D5‐F127‐Bn‐2 2D/D10‐F127‐Bn‐2 2D/H23‐F127‐Bn‐2 2D/D5‐F127‐Bn‐2 2D/D10‐F127‐Bn‐2 2D / H23‐F127‐Bn‐2 3D/H23‐F127‐Bn‐23D/H23‐F127‐Bn‐23D / H23‐F127‐Bn‐2
Capítulo3 111 Lamorfologíacelularalargadatambiénseobservóenensayoscelularesen entorno2DparalosderivadosF127‐OH‐4yF127‐OH‐8(Figura3.42y3.43, respectivamente)atodaslasconcentracionesestudiadas. Figura3.42.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones ehidrogelesdeF127‐OH‐4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imágenesen contrastedefases;Segundacolumna:Célulasvivas;Terceracolumna:Célulasmuertas. 2D/D5‐F127‐OH‐4 2D/D10‐F127‐OH‐4 2D/H23‐F127‐OH‐4 2D/D5‐F127‐OH‐4 2D/D10‐F127‐OH‐4 2D/H23‐F127‐OH‐4 2D/D5‐F127‐OH‐4 2D/D10‐F127‐OH‐4 2D / H23‐F127‐OH‐4
Capítulo3Capítulokk 112 Figura3.43.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones ehidrogelesdeF127‐OH‐8tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imágenesen contrastedefases;Segundacolumna:Célulasvivas;Terceracolumna:Célulasmuertas. Enlosensayos3D/H23‐F127‐OH‐4(Figura3.44)tras24horasdeensayose observóunpredominiodecélulasconmorfologíaredondeada,loqueindicabaja adhesióndelascélulasalmaterial. Figura3.44.Imágenesdecontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesde F127‐OH‐4tras24y72horasdeensayo.Enlaimagendelaizquierdaseseñalaconuna flechaunacélulaconmorfologíaredondeada.Enlaimagendeladerechaseseñalacon unaflechaunacélulaconmorfologíaalargada. 3D/H23‐F127‐OH‐43D / H23‐F127‐OH‐4 2D/D5‐F127‐OH‐8 2D/D10‐F127‐OH‐8 2D/H23‐F127‐OH‐8 2D/D5‐F127‐OH‐8 2D/D10‐F127‐OH‐8 2D/H23‐F127‐OH‐8 2D/D5‐F127‐OH‐8 2D/D10‐F127‐OH‐8 2D / H23‐F127‐OH‐8 24horas72horas
Capítulo3 113 Tras72horasdeensayosecompruebaquelamayoríadelascélulashan adquiridosucaracterísticamorfologíaalargadadebidoalaadhesiónalaplacade cultivo(imagenderecha,Figura3.44).Sededuceportantoquelascélulashan migradodesdeelhidrogelhastaelfondodelpocillo.Laelevadamigracióncelular queseproducealfondodelpocillopermitededucirquesetratadeunhidrogel demasiadoblandoparaalojarcélulasensuinterior. EnlaFigura3.45semuestranlasimágenesencontrastedefasesyde fluorescenciaenelverdeyelrojo,para3D/H23‐F127‐OH‐4tras72horasde ensayo. Figura3.45.Imágenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles deF127‐OH‐4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imágenesencontrastede fases;Segundacolumna:Célulasvivas;Terceracolumna:Célulasmuertas. Elensayoanálogoconelmaterial3D/H23‐F127‐OH‐8presentóun comportamientosimilarencuantoamigracióncelularalfondodelpocillo.Como sepuedeobservarenlaFigura3.46,lamigracióncelularyaesvisiblealas24 horasdadalaelevadacantidaddecélulasadheridasalfondodelpocillo,siendo másnotablelapresenciadecélulasconestamorfologíatras72horasdeensayo. 3D/H23‐F127‐OH‐43D/H23‐F127‐OH‐43D / H23‐F127‐OH‐4
Capítulo3Capítulokk 114 Figura3.46.Imágenesdecontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesde F127‐OH‐8tras24y72horasdeensayo. 3.7.‐CARACTERIZACIÓNMECÁNICADELOSHIDROGELES ComosehaindicadoalcomienzodeestaMemoria,unadelasposibles aplicacionesplanificadasparaloshidrogelesfotopolimerizadosestudiadosessu utilizaciónenlapreparacióndescaffoldsadecuadosparaIngenieríadetejidos, enconcretoparaandamiajesderegeneracióndecartílagoarticular.Porellose decidiórealizarlacaracterizaciónmecánicadelosmaterialesmedianteensayos queseutilizanhabitualmenteenlacaracterizacióndecartílago. Enlacaracterizaciónmecánicadematerialesesposibleutilizardistintostiposde ensayos,loscualessepuedenclasificarenfuncióndemúltiplesparámetros.Una posibleclasificaciónvienedeterminadaporlarealizacióndelosensayosaaltao bajavelocidaddeaplicacióndelacarga,clasificándosecomoensayosdinámicos oestáticosrespectivamente. Dentrodeestostiposdeensayoslosmásutilizadosenlacaracterizacióndelas propiedadesmecánicasdelcartílagoarticularsonensayosdetipoestático,entre losqueseincluyenlosmétodosdecompresiónuniaxialmonotónicaylos métodosdecompresiónuniaxialdecarga‐relajación.Ambosmétodossepueden realizarencompresiónnoconfinada(NC),compresiónconfinada(CC)ode indentacióndependiendodelutillajeutilizadoparalaaplicacióndelacarga (Figura3.47)(verAnexoIV). 3D/H23‐F127‐OH‐83D / H23‐F127‐OH‐8 24horas72horas
Capítulo3 121 Elcálculodelapermeabilidad,κ,realizadosedetallaenelAnexoIV. EnlaFigura3.53semuestranlosresultadosdeκobtenidosparalosdos hidrogelesensayados,P/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2.Ambosmateriales sonpermeables,conunvalordeκligeramentesuperiorparaelhidrogelde menorconcentración,P/H18‐F127‐Ac‐2,loqueestádeacuerdoconlamayor permeabilidadquemuestranloshidrogelesmenosrígidos.Estosdatosestánen concordanciaconloobservadoenlamedidadeESyHA;P/H18‐F127‐Ac‐2esun hidrogelmenosrígidoquesuanálogodeconcentraciónsuperior, P/H23‐F127‐Ac‐2. Figura3.53.ValoresmediosdePermeabilidad(κ)paraloshidrogelesfotopolimerizados deF127‐Ac‐2. 3.7.3.‐Ensayosdefatiga Unensayodefatigapermitedeterminarlavidaútildeunmaterialsometidoa cargasfluctuantes.Habitualmenteseregistraelnúmerodeciclosrequeridos paraproducirelfallodelmaterial.Enelcasoquenosocupa,sehaconsiderado queseproducefalloorupturadelmaterialunavezqueelhidrogelpierdesus característicaselásticas,norecuperandoelespesorinicialtrasdescargarla probeta. LosdatosprocedentesdelosensayosdefatigaserepresentanendiagramasS‐N. EnelejeYserepresentalatensiónsoportada(S)yenelejeXelnúmerodeciclos 9.99E‐15 9.67E‐15 0 F127‐Ac‐2 Permeabilidad(m2) P/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2 18% 23%
Capítulo3Capítulokk 122 (N). 119 EnlaFigura3.54semuestranlosresultadosobtenidospara P/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2.Enlagráficapuedeobservarseuna tendencialinealparaambasconcentraciones,lascualesposeenlamisma pendiente.Estecomportamientopermiteestimarqueloshidrogeles P/H18‐F127‐Ac‐2yP/H23‐F127‐Ac‐2secomportandelmismomodo,conlaúnica diferenciadeunamayortensiónsoportadaenelcasodelhidrogeldemayor concentración,enconcordanciaconlamayorrigidezdelmaterial. Figura3.54.GráficoS‐NparaloshidrogelesfotopolimerizadosdeF127‐Ac‐2. Apesarderealizartodoslospasosdepreparacióndelasmuestrasen condicionesestérilesyadicionarantibióticoaladisolucióndePBS,nosepudo extenderlosensayoshastarupturadelmaterialdebidoalaaparicióndehongos. Noobstante,estosresultadossonprometedoresyaquetras130000ciclosel materialsiguesinllegararuptura. 3.7.4.‐Comparaciónconpropiedadesmecánicasdelcartílago Unavezdeterminadoslosparámetrosmecánicosdeloshidrogeles,las propiedadesmecánicasdenuestrosmaterialessehancomparadoconlosvalores queseestimancomonecesariosparasuaplicabilidad.Enconcreto,considerando unaposibleaplicacióndeloshidrogelescomosoportepararegeneraciónde y=‐5E‐05x+15,014 R²=0,9718 y=‐5E‐05x+23,825 R²=0,9531 0 5 10 15 20 25 30 0 50000 100000 150000 TensiónSoportada(KPa) Nºdeciclos Pluronic18% Pluronic23% 18% 23%
Capítulo3 123 cartílagoarticular,losvaloresmedidosparanuestrosmaterialessehan comparadoconvalorespromedioparacartílagohumanoyconlosdeunmodelo animal(oveja). EnlaTabla3.7semuestranlaspropiedadesmecánicasdelcartílagoarticular. Enlapartesuperiordelatablaseincluyenlosvalorespromedioexperimentales tantoparaunmodeloanimal(oveja)comoparacartílagohumano,quesonlos queseutilizaránparaestablecercomparación. Juntoaestosvalores,enlaparteinferiordelatabla,serecogenlosvalores máximosymínimoscorrespondientesapropiedadesmecánicasdecartílago humano,determinadosexperimentalmente,quedanideadesugran variabilidad.Lavariabilidaddelosdatosobservadaenlosparámetrosmecánicos decartílagoarticularhumanosedebenaqueestosparámetrosseencuentran muyafectadospordiversosfactorescomolaedad,elsexoolaarticulaciónenla queseencuentraelcartílagoestudiado. EnlaTabla3.8serecogenlosvalorespromedioexperimentalesdeνyκ evaluadasparanuestroshidrogeles.Comosepuedeobservar,nuestros materialesmuestranparaestosparámetros(ν yκ)órdenesdemagnitud similaresalosvaloresdelmodelohumanoydelanimal.Sinembargo,estos hidrogelespresentanbajosvaloresdeESyHA,encomparaciónconlosestudios encartílago.
Capítulo3Capítulokk 124 Tabla3.7.Propiedadesmecánicasdecartílagoarticularenmodeloanimal(oveja)ydel cartílagoarticularhumanodeterminadasexperimentalmente.119,120,121 Valorespromedioexperimentales(oveja) ES(MPa)HA(MPa)ν κ(m2) 0.210.310.325.8E‐15 Valorespromedioexperimentales(humano) ES(MPa)HA(MPa)ν κ(m2) 0.6250.7<0.45.5E‐16 Propiedadesmecánicasexperimentalesdelcartílagoarticular humano ES(MPa)HA(MPa)ν κ(m2) Min.Max.Min.Max.RangoMin.Max. 0.450.80.50.8<0.4E‐16E‐15 Tabla3.8.Propiedadesmecánicasmedidasendiferenteshidrogelesfotopolimerizados. Valorespromedioexperimentales ES(MPa)HA(MPa)ν κ(m2) P/H18‐F127‐Ac‐20.0480.10.379.9E‐15 P/H23‐F127‐Ac‐20.0990.150.429.67E‐15 P/H18‐F127‐Ac‐40.039‐‐‐ P/H23‐F127‐Ac‐40.111‐ ‐ ‐ P/H18‐F127‐Ac‐80.042‐‐‐ P/H23‐F127‐Ac‐80.050‐ ‐ ‐
CAPÍTULO4 HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC: TIOL‐ENOS
Capítulo4 127 Losresultadosdescritosenelcapítuloanteriorhanpermitidodemostrarla viabilidaddecopolímerosdendrítico‐lineal‐dendríticoderivadosdePluronicpara obtenerhidrogelestermosensiblesfotopolimerizables. Noobstante,conelfindedisponerdematerialesfotorreticulablesconmenor densidaddegruposacrilato,asícomodeincorporaralgunasmodificaciones químicasquepuedancambiarlasinteraccionesintermolecularesymodularlas propiedadessol‐gel,einclusolasinteraccionesconlascélulas,seplanteó trabajarconformulacionesbasadasenotrostiposdederivadosfotorreactivosde Pluronic. Enestenuevocapítulodelamemoriasedescribeeltrabajodesarrolladoconel findeprepararhidrogelestermosensiblesfotopolimerizablesquepermitanuna víaalternativadefotorreticulación,enconcretomediantelareaccióndetioles conalquenos,tiol‐enos(–SH/CH2=CHCOO‐).66,95Paraellosehaoptadopor mezclasbinariasdecompuestoscongruposacrilatoydederivadoscongrupos tiol(‐SH)ensusposicionesterminales. Losgrupostiol(‐SH)sehanincorporadoadiferentesmateriales:PluronicF127®, F127‐OH‐4yF127‐OH‐8mediantefuncionalizacióndesusgruposhidroxilo terminalesconcisteamina(NH2‐CH2‐CH2‐SH),atravésdeenlacescarbamato.El grupocarbamatopuedefavorecerinteraccionesporenlacesdehidrógeno intermoleculares,loquepuedetambiéncontribuiramodificarpropiedadesde gelificación,degradaciónyviabilidadcelularconrespectoalasdescritasparalos análogosconenlacesésterdescritosenelCapítulo3. Enlaprimerapartedeestecapítulo,apartado4.1,sedescribelasíntesisy caracterizacióndeloscompuestostioladosasícomosuspropiedadesgelificantes ydeviabilidadcelular.Enlasegundapartedelcapítulo,apartado4.2,sedescribe lapreparaciónycaracterizacióndeformulacionesbinariasbasadasen componentestioladosyelestudiodesuspropiedadescomohidrogeles.
Capítulo4 129 4.1.‐DERIVADOSDEPLURONICCONGRUPOSTIOLTERMINALES 4.1.1.‐Síntesisycaracterización 4.1.1.1.‐Derivadolineal:F127‐SH‐2 LasíntesisdelderivadolinealF127‐SH‐2hasidodescritaporvariosautores.122, 123Paraformarelenlacecarbamato,quepermiteintroducirlacisteamina,es necesarioactivarpreviamentelosgruposhidroxiloterminalesdePluronicF127® concloroformiatodep‐nitrofenilo,utilizandoelprocedimientodesíntesis descritoenelEsquema4.1. Esquema4.1.SíntesisdeF127‐PN‐2[14].Condicionesdereacción:i)cloroformiatodep‐ nitrofenilo,base,diclorometano. EnestaMemoriasehaabordadolasíntesisdeF127‐PN‐2utilizandodistintas condicionesdereacción,quesemuestranenlaTabla4.1.Enprimerlugarse utilizóTEAcomobase(métodoA),siguiendoelmétododescritoporParketal. en2006.76eSinembargo,noseconsiguiófuncionalizarcompletamentelosdos 122(a)Tao,Y.;Han,J.;Ye,C.;Thomas,T.;Dou,H.,JournalofMaterialsChemistry2012, 22(36),18864‐18871;(b)Bae,K.H.;Choi,S.H.;Park,S.Y.;Lee,Y.;Park,T.G.,Langmuir 2006,22(14),6380‐6384. 123(a)Ryu,J.H.;Lee,Y.‐h.;Kong,W.H.;Kim,T.G.;Park,T.G.,JournalofControlledRelease2011, 152(1)236‐237;(b)Ryu,J.H.;Lee,Y.;Kong,W.H.;Kim,T.G.;Park,T.G.;Lee,H., Biomacromolecules2011,12(7),2653‐2659;(c)Lee,Y.;Chung,H.J.;Yeo,S.;Ahn,C.‐H.;Lee,H.; Messersmith,P.B.;Park,T.G.,SoftMatter2010,6(5),977‐983.
Capítulo4Capitulok 130 gruposhidroxiloterminalesdePluronicF127®,talycomosecomprobópor1H‐ RMN(Tabla4.1).Porelloseensayaronotrostiposdebasecomopiridina(Py) (métodoB)124odimetilaminopiridina(DMAP)(métodosCyD),enlugardeTEA. Asímismo,sevariaronotrosparámetrosdereaccióncomoelnúmerode equivalentesdelasdistintasbasesydecloroformiatodep‐nitrofenilo,con respectoalacantidaddepolímero,asícomoeltiempodereacción.EnlaTabla 4.1serecogen,ademáslascondicionesdereacciónensayadas,losporcentajes defuncionalizacióndelosgruposhidroxiloterminalesdePluronicF127®aque handadolugar. Tabla4.1.CondicionesdereacciónutilizadasenlaobtencióndeF127‐PN‐2. Método Relaciónmolar PluronicF127®/cloroformiatodep‐ nitrofenilo/Base Tiempode reacción (h) % funcionalizadoa A1/8/8.8(TEA)2462 B1/8/28(Py)24100 C1/14/14(DMAP)2437 D1/14/14(DMAP)4100 aPorcentajedegruposhidroxiloterminalesfuncionalizadosdeterminadopor1H‐RMN. Delasdosopcionesquedieronlugarafuncionalizacióncompletadelos hidroxilosterminalesdePluronicF127®,métodosByD,seeligieronlas condicionesdereacciónByaque,apesardenecesitarunmayortiempode reacción,eltratamientoposteriorresultomássencilloenestecaso(verapartado 6.1,delaParteExperiemental. Loscompuestossintetizadossecaracterizaronprincipalmentepor1H‐RMNyFT‐ IR. 124Gillies,E.R.;Fréchet,J.M.J.,JACS2002,124(47),14137‐14146.
Capítulo5 233 Amododeresumen,enlaTabla5.7serecogenlosensayosdeinternalización celularrealizadosysusresultados. Tabla5.7.ResumendeensayosdeinternalizaciónrealizadosencélulasHeLa. NanogelCarga37⁰C4⁰CInternalización ‐ ROD(17y23µg)+ +(pordifusión) ‐ ROD(48µg)+ +(pordifusión) ‐ ROD(48µg)++(pordifusión) PDF/N‐F127‐Ac‐2‐RODROD(23µg)+ + PDF/N‐F127‐Ac‐4‐RODROD(17µg)+ Roturadecélulas PDF/N‐F127‐Ac‐8‐RODROD(23µg)+ + PDF/N‐F127‐Ac‐8‐RODROD(48µg)+ + PDF/N‐F127‐Ac‐8‐RODROD(48µg)++(pordifusión) ‐ ROD‐EST(50µg)+ +(pordifusión) ‐ ROD‐EST(50µg) ++(pordifusión) ‐ ROD‐EST(25µg)+ +(pordifusión) ‐ ROD‐EST(25µg) ++(pordifusión) PDF/N‐F127‐Ac‐2‐ROD‐ESTROD‐EST(50µg)++(máslentaquelibre) PDF/N‐F127‐Ac‐2‐ROD‐ESTROD‐EST(50µg) +‐(endocitosisinhibida) PDF/N‐F127‐Ac‐8‐ROD‐ESTROD‐EST(50µg)++(máslentaquelibre) PDF/N‐F127‐Ac‐8‐ROD‐ESTROD‐EST(50µg) +‐(endocitosisinhibida) PDF/N‐F127‐Ac‐4‐ROD‐ESTROD‐EST(25µg)+ + PDF/N‐F127‐Ac‐4‐ROD‐ESTROD‐EST(25µg) ++(pordifusión) Ensayodeinternalizaciónpositivo:ensayoquepresentafluorescenciaenelinteriorde lacéluladebidaalapresenciadefluoróforo(rodaminaBorodamina‐EST),ensuforma libreoencapsuladaenelnanogel. Ensayoscualitativospreliminareshandemostradoqueestosnanogelesse internalizandeformaefectivaenelinteriordelacélula.Sinembargo,son necesariosmásensayosdeinternalización,incluyendoensayosdetipo cuantitativoyensayosenfuncióndeltiemposeincubacióndelascélulasconlos nanogeles.Estosestudiospermitiránconfirmarlaviabilidaddeestosmateriales
Capítulo5Capitulo 234 comotransportadoresdefármacosyexplicareldistintocomportamiento observadoparacadaunodelosnanogelesestudiados,investigaciónquese planteacomounobjetivofuturo. Losresultadosdeinternalizaciónydeencapsulacióndemoléculaspermitiránel usodelosnanogelescomosistemasdeencapsulacióndefármacoshidrófobos, comolaCamptotecina,fármacoconbajasolubilidadenaguayelevada citotoxicidadensuformalibre,activocontralahepatitis.Asímismo,se comprobarálaefectividadytoxicidaddelosnanogelescargadoscon Camptotecinaalproducirselainternalizacióncelular,encomparaciónconel fármacolibre.DichosexperimentosserealizaránencolaboraciónconOlgaAbián delInstitutoUniversitariodeInvestigacióndeBiocomputaciónyFísicade SistemasComplejos(BIFI),pertenecientealIACS.
CAPÍTULO6 PARTEEXPERIMENTAL
Capítulo6 237 Enestecapítuloseincluyentodosaquellosaspectosrelacionadosconeltrabajo experimentaldesarrolladoparaestatesisdoctoral. Paraellosehanconsideradolossiguientesapartados: ‐Síntesisycaracterizacióndeloscompuestos: Apartadoenelquesedescribenlosprocedimientosexperimentalesquehan permitidoobtenerlosdiferentescompuestos,asícomolosdatosrelativosasu caracterizaciónquímica. Lanomenclaturaynumeraciónqueidentificacadacompuestoeslautilizadaen losesquemassintéticosytextoincluidosenlosCapítulos3y4. ‐Protocolosdetrabajo: Apartadoenelqueserecogenlosdiferentesprocedimientosexperimentales puestosapunto,estandarizadosydesarrolladosparalapreparacióno caracterizacióndelosdiferentesmateriales. ‐Materialesytécnicasexperimentales. Apartadoenelqueseincluyenlosmateriales,técnicasyequiposutilizadosenla preparaciónycaracterizacióndelosdistintosmateriales.
Capítulo6 239 6.1.‐SÍNTESISYCARACTERIZACIÓNDELOSCOMPUESTOS CompuestoF127‐Ac‐2[1] DescritoporTirellietal.,MacromolecularChemistryandPhysics2002,203(10‐ 11),1466‐1472.(Referencia101c). EnunmatrazsepesaPluronicF127®(10g,0.79mmol)secadopreviamentea vacíoysedisuelveen20mLdediclorometanoseco.Unavezdisueltoelpolímero seañadetrietilamina(0.97mL,6.99mmol)gotaagotabajoatmósferadeargón. Elmatrazdereaccióndeintroduceenunbañodehieloyseañademuy lentamente,gotaogotaclorurodeacriloilo(0.54mL,6.35mmol).Lamezclade reacciónsemantieneatemperaturaambiente,bajoatmósferadeargónyen oscuridaddurantetodalanoche.Transcurridoestetiemposefiltraelcrudode reacciónsobrealúminaneutraparalaeliminacióndelsubproductohidrocloruro detrietilamonio.AlfiltradoseleañadeNa2CO3anhidroysemantienecon agitaciónenoscuridaddurante2horas.Elsólidosefiltraporgravedadyel filtradoseconcentraenelrotavapor.Acontinuaciónlamezclaseviertesobreun litrodedietiléterfrio.Elsólidoqueprecipitasedejadecantarduranteunanoche enelfrigorífico,yelprecipitadosefiltrayselavacondietiléterfrio, obteniéndoseunsólidoblanco.Rto:67‐78%. 1H‐RMN(400MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),3.37‐3.82(m,~1100H,B, C,D,E,F),4.31(m,4H,G),5.83(dd,Jcis=10.4Hz,Jgem=1.6Hz,2H,J),6.15(dd, Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,2H,I),6.42(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.6Hz,2H,J). 13C‐RMN(125MHz,CDCl3):δ(ppm):17.3‐17.4(A),63.6(G),68.4‐69.1(F),70.5 (D,E),72.9‐73.3(C),75.1‐75.3‐75.5(B),128.2(I),130.9(J),166.1(H). FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2882(C‐Hst),1724(C=O),1114 (C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z5201.1y13449.6.
Capítulo6Capitulo 240 ANÁLISISELEMENTALparaC603H1200O268,calculado:C,56.94;H,9.44., experimental:C,56.44;H,9.47. Compuesto[2] DescritoporHultetal.,Macromolecules1998,31(13),4061‐4068.(Referencia 63). Enunmatrazsedisuelveácido2,2‐bis(hidroximetil)propiónico(10g,74.5mmol), 2,2‐dimetoxipropano(13.8mL,112mmol)yácidop‐toluensulfónico monohidrato(0.7g,3.7mmol)en50mLdeacetonaseca.Lamezcladereacción seagitadurante2horasenatmósferadeargónatemperaturaambiente. Transcurridoestetiemposeadicionaalamezcladereacción1mLdeunamezcla amoniaco/etanol1.1(v/v).Acontinuaciónseeliminaeldisolventeenrotavapory elresiduoblancoseredisuelveen250mLdediclorometano.Lafaseorgánicase extraecon20mLdeagua(x2),sesecaconMgSO4,sefiltrayevaporaa sequedad.Elproductoseobtienecomounsólidoblanco.10.3g.Rto.:79%. 1H‐RMN(400MHz,CDCl3):δ(ppm):1.21(s,3H,D),1.42(s,3H,A),1.45(s,3H, A´),3.68(d,J=12Hz,2H,C),4.18(d,J=12Hz,2H,C´). 13C‐RMN(100MHz,CDCl3):δ(ppm):18.4(D),21.8(A),25.3(A´),41.7(E),65.9(C, C´),98.3(B),180.0(F). FT‐IR(cm‐1,KBr):3142(COO‐Hst),2995‐2891(C‐Hst),1723(C=O). MS(ESI+)paraC8H14O4,calculado:174.09,experimental:(M+Na+)196.9.
Capítulo6 241 Compuesto[3] DescritoporHultetal.,Macromolecules1998,31(13),4061‐4068.(Referencia 63). Enunmatrazsedisuelveácido2,2‐bis(hidroximetil)propionico(18g,134mmol) yKOH(8.6g,154mmol)en100mLdedimetilformamidaseca.Lareacciónse mantienea100⁰Cduranteunahora.Transcurridoestetiemposeadiciona bromurodebencilo(19mL,162mmol).Lamezcladereacciónsemantiene durante15horasa100⁰C.Elcrudodereacciónseevaporaenelrotavaporyse redisuelveen300mLdediclorometano.Acontinuaciónseextraecon50mLde agua(x2),sesecalafaseorgánicaconMgSO4,sefiltrayeldisolventeseevapora enelrotavapor.Elaceiteamarilloobtenidosecristalizaenunamezcla diclorometano/hexano1:1(v/v).Elproductoseobtienecomounsólidoblanco. Rto.:43‐54%. 1H‐RMN(400MHz,CDCl3):δ(ppm):1.08(s,3H,A),3.74(d,J=12Hz,2H,C),3.94 (d,J=12Hz,2H,C´),5.21(S,2H,E),7.36(M,5H,G,H,I). 13C‐RMN(100MHz,CDCl3):δ(ppm):17.2(A),49.3(B),66.7(C,C´),68.4(E),127.9 (G),128.4(I),128.7(H),175.8(D). IR(cm‐1,nujol):3351.6(OH),2923.2‐2853.2(C‐Hst),1701.3(C=Ost). MS(MALDI+)paraC12H16O4,calculado:224.2,experimental:(M+Na+)246.8.
Capítulo6Capitulo 242 Compuesto[4] DescritoporHultetal.,Macromolecules1998,31(13),4061‐4068.(Referencia 63). Enunmatrazsedisuelven[2](10g,57.4mmol),[3](6.1g,27.4mmol)yDPTS (3.2g,10.9mmol)en90mLdediclorometanoseco.Lamezcladereacciónse enfríaa0⁰Cysepurgaconargón.Acontinuaciónseañade N,N´‐dicicliohexilcarbodimida(DCC)(14.3g,69.1mmol)previamentedisueltaen diclorometano.Lamezcladereacciónsemantieneatemperaturaambienteyen atmósferadeargónduranteunanoche.ElprecipitadodeN,N´‐diciclohexilurea (DCU)formadosefiltrayelfiltradoseevaporaenelrotavaporparaobtenerun aceiteamarillo.Elcrudosepurificaporcromatografíaencolumnaeluyendo inicialmenteconhexanoeincrementandogradualmentelapolaridaddel disolventedeeluciónhastahexano/acetatodeetilo60:40.Elproductose obtieneenformadeaceiteamarillentoviscoso.10.2g.Rto.:70%. 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):1.09(s,3H,D),1.30(s,3H,H),1.34(s,3H,A), 1.41(s,3H,A´),3.58(d,J=12Hz,4H,C),4.11(d,J=12Hz,4H,C´),4.34(s,4H,G), 5.16(s,2H,K),7.34(m,5H,M,N,O). 13C‐RMN(100MHz,CDCl3):δ(ppm):17.6(H),18.4(D),22.2(A),24.9(A´),42.0 (E),46.8(I),65.3(C,C´),65.9(G),66.9(K),98.0(B),128.1(M),128.3(O),128.5 (N),135.4(L),172.3(J),173.4(F). FT‐IR(cm‐1,puro):2991.4‐2876.7(C‐Hst),1737(C=Ost). MS(MALDI+)paraC29H43O10,calculado:536.6,experimental:(M+Na+)559.2.
Capítulo6 249 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.30(s,6H,J),3.37‐3.82 (m,~1100H,B,C,D,E,F),4.34(II´q,8H,ѵII´=7.6Hz,JII´=11.2Hz,I,I´),4.27(m,4H, G),5.85(dd,Jcis=10.4Hz,Jgem=1.3Hz,4H,N),6.10(dd,Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz, 4H,M),6.39(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.3Hz,4H,N´). 13C‐RMN(75MHz,CDCl3):δ(ppm):17.3‐17.4(A),17.7(J),46.3(K),65.4(I),68.7 (G),70.5(D,E,F),72.9‐73.3(C),75.1‐75.3‐75.5(B),127.8(M),131.2(N,N´), 165.4(L),172.5(H). FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2869(C‐Hst),1733(C=O),1110 (C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z5920.3y13255.4. ANÁLISISELEMENTALparaC619H1220O276,calculado:C,56.93;H,9.35., experimental:C,56.52;H,9.73. CompuestoF127‐Ac‐8[13] Enunmatrazsedisuelve[11](1.5g,0.11mmol)en20mLdediclorometano seco.Seañadetrietilamina(0.55mL,3.98mmol)y4‐metoxifenol(200mg)como inhibidordepolimerización.Serealizanenelmediodereaccióntresciclosvacío‐ argónyacontinuaciónseenfríalamezclaconhielo.Tras10minutosseañade clorurodeacriloilo(0.29mL,3.61mmol),gotaagota,yconagitaciónylamezcla dereacciónsedejabajoatmósferadeargónyenoscuridaddurante72horas.El crudodereacciónsefiltraatravésdeunacolumnadealúminaneutrayel filtradosesecaconNa2CO3anhidrodurante2horas.Elfiltradoseconcentraen
Capítulo6Capitulo 250 rotavaporysepurificaporprecipitaciónen250mLdedietiléterfrío.Elproducto seobtienetrasfiltracióncomounsólidoblanco.Rto.:47‐82%. 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.23(s,6H,J),1.27(s, 12H,N),3.37‐3.87(m,~1100H,B,C,D,E,F),4.23‐4.30(m,28H,G,I,L),5.85(dd, Jcis=10.4Hz,Jgem=1.3Hz,4H,Q),6.10(dd,Jtrans=17.3Hz,Jcis=10.4Hz,4H,R),6.39 (dd,Jtrans=17.3Hz,Jgem=1.3Hz,4H,Q´). 13C‐RMN(125MHz,CDCl3):δ(ppm):17.3‐17.4(A),17.7(J,N),45.8(K),46.5(M), 64.9(G),65.3‐65.6(I,L),68.5‐68.7(F),70.5(D,E),72.9‐73.3(C),75.1‐75.3‐75.5 (B),127.7(Q),131.5(R),165.4(P),171.9‐172.0(H). FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2867(C‐Hst),1733(C=O),1109 (C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z5761.4y14176.6. ANÁLISISELEMENTALparaC651H1260O292,calculado:C,56.90;H,9.18., experimental:C,56.48;H,9.66. CompuestoF127‐PN‐2[14] DescritoporParketal.Langmuir2006,22(4),1758‐1762. ProcedimientoexperimentalconcondicionesdereacciónB EnunmatrazsepesaPluronicF127®(5g,0.40mmol),previamentesecoyse disuelveen15mLdediclorometanoseco.Acontinuaciónseañadepiridinaseca (0.9mL)ycloroformiatodep‐nitrofenilo(0.65g,3.2mmol)bajoatmósferade argón.Lamezcladereacciónsemantieneatemperaturaambiente,conagitación durantetodalanoche.Elcrudodereacciónsediluyecon50mLde diclorometanoyseextraeconNaHSO41M(2x30mL)ydisolucióndeNaCl saturada(1x30mL).LafaseorgánicasesecaconMgSO4yseconcentraen rotavapor.Lafaseorgánicaconcentradaseprecipitaen200mLdedietiléterfrio.
Capítulo6 251 Elproductoseobtienetrasfiltraciónylavadocondietiléterfríocomounsólido blanco.Rto.:75‐85%. ProcedimientoexperimentalconcondicionesdereacciónD EnunmatrazsepesaPluronicF127®(5g,0.40mmol),previamenteseco,yse disuelveen15mLdediclorometanoseco. Porotrolado,sedisuelvecloroformiatodep‐nitrofenilo(1.13g,5.60mmol)en5 mLdediclorometano,yseañadebajoatmósferadeargónsobreladisolución anterior. AladisoluciónresultanteseleadicionaDMAP(0.68g,5.60mmol),previamente disueltaen5mLdediclorometano.Lamezcladereacciónsemantienebajo agitaciónyenatmósferadeargóndurante4horas.Transcurridoestetiempo,el crudodereacciónseviertesobre350mLdedietiléterfrío.Elsólidoblancoque precipitasefiltraylavacondietiléterfrioyacontinuación,seredisuelveen100 mLdediclorometano.LafaseorgánicaseextraeconHCl1N(2x75mL)ycon disoluciónsaturadadeNaCl(1x75mL)paraeliminarelclorurode dimetilaminopiridinioformadoenlareacción,sesecaconMgSO4anhidroyse evaporahastasequedad.Elproductoseobtienecomounsólidoblanco.Rto:65‐ 74%. 1H‐RMN(300MHz,CDCl3)δ(ppm):1.13(m,201H,A),3.37‐3.85(m,~1000H,B, C,D,E,F),4.41‐4.44(m,4H,G),7.38(m,4H,J),8.26(m,4H,K). 13C‐RMN(75MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐17.5(A),68.4(G),68.7(F),70.7(D,E), 72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐75.6(B),121.8(J),125.4(K),145.5(L),152.5(H),155.6 (I). FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2867(C‐Hst),1769(C=Ost carbonato),1520(NO2stas),1200(C‐Ostascarbonato),1110(C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z4999.3y12842.8. ANÁLISISELEMENTALparaC611H1202N2O274,calculado:C,56.63;N,0.22;H,9.28., experimental:C,56.12;N,0.11;H,8.64.
Capítulo6Capitulo 252 CompuestoF127‐SH‐2[15] DescritoporParketal.,Langmuir2006,22(14),6380‐6384. MétododesíntesisE Enunmatrazsedisuelve[14](0.5g,0.041mmol)en25mLdeaguadestilada.A continuaciónseañadedihidroclorurode2,2´‐diaminoetildisulfuro(cistamina)y 0.5mLdeTEA.Lamezcladereacciónsemantieneatemperaturaambientey atmósferadeargóndurantetodalanoche.Acontinuaciónelcrudodereacción sedializaconmembrana(Spectra/Por®DyalisismembraneMWCO3500, Spectrum)hastaladesaparicióndelatonalidadamarillentadelsubproductode reacciónp‐nitrofenol(7días).Unavezeliminadoelsubproductoseañadeal dializado148mgdeD,L‐ ditiotreitol(DTT)comoagentereductorysedeja reaccionardurante6horasenatmósferadeargón.Elcrudosedializadurante3 díasutilizandobufferdecitratoapH=4paralaeliminacióndelagentereductor. Elproductoseobtienetrasliofilizacióndeldializado. MétododesíntesisF Enunmatrazdedisuelve[14](2g,0.16mmol)en30mLdediclorometanoseco. Acontinuaciónseañadecisteamina(24mg,0.32mmol)bajoatmósferade argón.Lamezcladereacciónsemantieneatemperaturaambienteconagitación durantetodalanoche.Elcrudodereacciónseprecipitaen200mLdedietiléter frío,sefiltrayselavacondietiléterfríoparaeliminarelsubproductop‐ nitrofenol.Elproductoseobtienecomounsólidoamarillo.Rto.:91‐96%. 1H‐RMN(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),2.79(t,4H,J),3.37‐3.77 (m,~1000H,B,C,D,E,F,I),4.20(m,4H,G). 13C‐RMN(125MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐ 17.5(A),38.2(J),39.9(I),64.2(G), 68.6‐68.7‐69.7(F),70.7(D,E),72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐75.6(B).
Capítulo6 253 FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2867(C‐Hst),1732(C=O carbamato),1525(NO2stas),1108(C_O_C). MS(MALDI+):máximoam/z4849.7. ANÁLISISELEMENTALparaC603H1206N2O268S2,calculado:C,56.50;N,0.22;H, 9.42,S,0.50.,experimental:C,55.83;N,0.11;H,8.64,S,0.76. CompuestoF127‐PN‐4[16] Enunmatrazsepesa[9](2.3g,0.18mmol)ysedisuelveen17mLde diclorometanoseco.Acontinuaciónseañadepiridinaseca(0.8mL)y cloroformiatodep‐nitrofenilo(0.6g,2.9mmol)bajoatmósferadeargón.La reacciónsemantieneatemperaturaambiente,conagitacióndurantetodala noche.Elcrudodereacciónsediluyecon50mLdediclorometanoyseextrae conNaHSO41M(2x30mL)ydisolucióndeNaClsaturada(1x30mL).Lafase orgánicasesecaconMgSO4yseconcentraenrotavapor.Elconcentradose viertesobre200mLdedietiléterfrio.Elproductoqueprecipitaseobtienetras filtraciónylavadocondietiléterfríocomounsólidoblanco.Rto.:71‐92%. 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.38(s,6H,J),3.37‐3.85 (m,~1000H,B,C,D,E,F),4.34(m,4H,G),4.52(ABq,8H,ΔѵAB=31.8Hz,JAB=9Hz, I,I´),7.37(m,8H,M),8.26(m,8H,O). 13C‐RMN(75MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐ 17.5(A),17.7(J),46.5(K),64.5(G), 68.6‐68.7‐69.2(F),70.7(D,E,I,I´),72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐75.6(B),121.7(M), 125.3(O),145.5(P),152.1(L),155.2(N),171.5(H).
Capítulo6Capitulo 254 FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2867(C‐Hst),1772(C=Ost carbonato),1732(C=Oester),1527(NO2stas),1212(C‐Ostascarbonato),1113 (C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z5340.8y13561.3. ANÁLISISELEMENTALparaC635H1224N4O288,calculado:C,54.65;N,0.40;H,8.78., experimental:C,56.10;N,0.35;H,9.02. CompuestoF127‐SH‐4[17] Enunmatrazsedisuelve[16](1.7g,0.13mmol)en30mLdediclorometano seco.Acontinuaciónseañadecisteamina(50mg,0.65mmol)bajoatmósferade argón.Lamezcladereacciónsedejaatemperaturaambiente,conagitación durantetodalanoche.Elcrudodereacciónseprecipitaen200mLdedietiléter frío,sefiltrayselavacondietiléterfríoparaeliminarelp‐nitrofenol.Elproducto seobtienecomounsólidoamarillo.Rto.:92%‐Cuantitativo. 1H‐RMN(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.23(s,6H,J),2.79‐2.95 (m,8H,N),3.37‐3.76(m,~1000H,B,C,D,E,F,M),4.27(m,12H,I,G). 13C‐RMN(125MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐17.5(A),18.3(J),38.5(N),41.8(M), 64.2(I),67.4(G),68.6‐68.7‐69.0(F),70.7(D,E),72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐75.6 (B),156.2(L). FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2880(C‐Hst),1733(C=Ost carbamato,C=Oester),1112(C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z5184.5y13217.4. ANÁLISISELEMENTALparaC619H1232N4O276S4,calculado:C,56.08;N,0.42;H, 9.30,S,0.97.,experimental:C,55.59;N,0.14;H,8.97,S,1.29.
Capítulo6 255 CompuestoF127‐PN‐8[18] Enunmatrazsepesa[11](1.6g,0.12mmol)ysedisuelveen50mLde diclorometanoseco.Acontinuaciónseañadepiridinaseca(1.3mL)y cloroformiatodep‐nitrofenilo(0.8g,3.9mmol)bajoatmósferadeargón.La reacciónsedejaatemperaturaambiente,conagitacióndurantetodalanoche.El crudodereacciónsediluyecon50mLdediclorometanoyseextraeconNaHSO4 1M(2x30mL)ydisolucióndeNaClsaturada(1x30mL).Lafaseorgánicase secaconMgSO4yseconcentraenrotavapor.Elconcentradoseprecipitaen200 mLdedietiléterfrio.Elsólidoblancoobtenidosefiltrayselavacondietiléter frío.Rto.:80‐92%. 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.34(s,6H,J),1.37(s,12H, N),3.37‐3.85(m,~1000H,B,C,D,E,F),4.27(m,4H,G),4.45(m,24H,I,L),7.37 (m,16H,R),8.26(m,16H,S). 13C‐RMN(75MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐17.5(A),17.7(J,M),46.6(K,M),65.8 (G),69.1(F),70.7(D,E,I),72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐75.6(B),121.7(R),125.3(S), 145.6(T),152.0(P),155.2(Q),171.05(H,H´). FT‐IR(cm‐1,neto,películadelgadasobreNaCl):2867(C‐Hst),1771(C=Ost carbonato),1736(C=Ostester),1526(NO2stas),1212(C‐Ostascarbonato), 1008(C_O_C). MS(MALDI+):máximosam/z5871.7y14635.1. ANÁLISISELEMENTALparaC683H1268N8O316,calculado:C,56.07;N,0.77;H,8.67., experimental:C,55.62;N,0.67;H,7.66.
Capítulo6Capitulo 256 CompuestoPEG‐Ac‐2[19] EnunmatrazsedisuelvePEG(Pm=2000g/mol)(1g,0.51mmol)en15mLde diclorometanoseco.AcontinuaciónseañadeTEA(0.65mL,4.7mmol)y4‐ metoxifenol(50mg)comoinhibidor.Serealizanalmediodereaccióntresciclos vacío‐argónyacontinuaciónseenfríalamezcladereacciónconhielo. Trancurridos10minutosseañadeclorurodeacriloilo(0.34mL,4.2mmol),gotaa gota,conagitaciónylamezcladereacciónsedejabajoatmósferadeargónyen oscuridaddurante24horas.Elcrudodereacciónsefiltraatravésdeuna columnadealúminaneutraparaeliminarclorurodetretilamonioformadocomo subproductoyelfiltradosesecaconNa2CO3anhidrodurante2horas. Transcurridoestetiemposefiltrayelfiltradoseconcentraenrotavapor.A continuaciónelconcentradosevierteen200mLdedietiléterfrío.Elproductose obtienecomounsólidoblancotraslafiltración.0.9g.Rto.:82% 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):3.64(s,180H,A),3.74(t,4H,B),4.31(t,4H, C),5.83(dd,Jcis=10.2Hz,Jgem=1.5Hz,2H,F),6.15(dd,Jtrans=17.1Hz,Jcis=10.2Hz, 2H,E),6.42(dd,Jtrans=17.1Hz,Jgem=1.5Hz,4H,F´). CompuestoF127‐NH(CH2)6OH‐2[20] Enunmatrazdedisuelve[14](2.5g,0.2mmol)en15mLdediclorometanoseco. Acontinuaciónseañade6‐amino‐1‐hexanol(50mg,0.43mmol)bajoatmósfera deargón.Lamezcladereacciónsemantieneatemperaturaambientecon agitacióndurantetodalanoche.Elcrudodereacciónseprecipitaen200mLde dietiléterfrío,sefiltrayselavacondietiléterfríoparaeliminarp‐nitrofenol
Capítulo6 257 formadocomosubproducto.Elproductoseobtienecomounsólidoblanco.1.8 g.Rto.:70%. 1H‐RMN(300MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.34(m,8H,K,L),1.53(m, 8H,J,M),3.16(q,4H,I),3.37‐3.77(m,~1000H,B,C,D,E,N),3.87(m,4H,F),4.20 (m,4H,G). 13C‐RMN(75MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐17.5(A),25.3(L),26.3(J),29.9(K),32.5 (M),40.9(I),62.6(G),63.8(N),68.6(F),70.7(D,E),72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐ 75.6(B),156.4(H). FT‐IR(cm‐1,neto,ATR):2867(C‐Hst),1726(C=Ocarbamato),1108(C_O_C). CompuestoF127‐NHAc‐2[21] Enunmatrazsedisuelve[20](1.5g,0.12mmol)en15mLdediclorometano seco.AcontinuaciónseañadeTEA(0.14mL,1.04mmol)y4‐metoxifenol(50mg) comoinhibidor.Serealizanalamezclatresciclosvacío‐argónyacontinuaciónse enfríaconhielo.Trancurridos10minutosseañadeclorurodeacriloilo(0.08mL, 0.94mmol),gotaagotaconagitaciónylareacciónsedejabajoatmósferade argónyenoscuridaddurante24horas.Elcrudodereacciónsefiltraatravésde unacolumnadealúminaneutraparaeliminarelsubproductoclorurode tretilamonioyelfiltradosesecaconNa2CO3anhidrodurante2horas. Transcurridoestetiemposefiltrayelfiltradoseconcentraenrotavapor.A continuaciónseprecipitaen200mLdedietiléterfrío.Elproductoseobtiene comounsólidoblancotraslafiltración.1.2g.Rto.:78% 1H‐RMN(400MHz,CDCl3):δ(ppm):1.13(m,201H,A),1.37(m,8H,K,L),1.52(m, 4H,J),1.67(m,4H,M),3.16(q,4H,I),3.37‐3.77(m,~1000H,B,C,D,E),3.81(m, 4H,F),4.20(m,4H,G),5.81(dd,Jcis=10.4Hz,Jgem=1.6Hz,2H,F),6.10(dd, Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,2H,E),6.39(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.6Hz,4H,F´).
Capítulo6Capitulo 258 13C‐RMN(75MHz,CDCl3):δ(ppm):17.4‐17.5(A),25.6(L),26.3K),28.5(K),29.8 (M),40.9(I),64.4(N),66.9(G),68.6(F),70.7(D,E),72.9‐73.5(C),75.2‐75.4‐ 75.6(B),128.6(Q),130.5(R),156.4(H),166.2(P). FT‐IR(cm‐1,ATR):2867(C‐Hst),1728(C=O),(1108(C_O_C).
Capítulo6 265 Figura6.2.Detalledelascámarasdeensayoutilizadasparalosensayosdefatiga. Figura6.3.Detalledelascámarasdeensayoutilizadasparalosensayosdefatigaconel bañotermostatizadoexterno. h.ProtocolodedeterminacióndelaCMC ‐Lasdisolucionesdeloscopolímerosbloquelinealydendrítico‐lineal‐dendrítico demayorconcentración(1,0.5,0.3y0.1%(w/v))seprepararonpordisolución directadelosmaterialesenaguadestilada.Lasdisolucionesdemenor concentración(0.05,0.01,0.001,0.0001%(w/v))seprepararonpordilucióna partirdeunadisolucióndemayorconcentración.Todaslasdisolucionesse mantuvierondurante4horasa4⁰C. ‐Paralapreparacióndeladisolucióndepirenosedisolvieron0.485mgdepireno en200mLdeagua(1.2x10‐5M).Paragarantizarunacompletadisolucióndeéste ydadasubajasolubilidadenagua,elpirenosedisolviópreviamenteenacetona,
Capítulo6Capitulo 266 yestadisoluciónseadicionósobre200mLdeaguadestilada.Acontinuaciónla acetonaseevaporódurante4horasavacío. ‐Sobrelasdisolucionesacuosasdelosdiferentescopolímerosseadicionaron10 µLdeladisolucióndepireno(1.2x10‐5M)paraconseguirunaconcentraciónfinal depirenode6x10‐8M.Lasdisolucionesseincubarondurante1horaa temperaturaambienteyenoscuridad. ‐Elespectrodeexcitacióndelasdiferentesmuestrasconpirenosemidióenel intervalode300a350nmconλemisión=390nm.Deestosespectrossetrabajócon elvalordelaintensidad,a332nm(I332)ya335nm(I335),paracadaunadelas concentracionesdematerialpreparadas. i.Protocolodepreparacióndenanogelesfotopolimerizados ‐Sepreparóunadisoluciónal10%(w/v)delcopolímeroenaguadestilada,que conteníaun0.1%(w/v)defotoiniciadorIrgacure2959previamentedisuelto.Esta disoluciónsemantuvoduranteunanochea4°Cparasucompletadisolución. ‐Estadisoluciónal10%(w/v)sefiltróutilizandounfiltrode0.2µmdeacetatode celulosaparaeliminarposiblespartículasensuspensión. ‐ Apartirdeestadisolucióndel10%(w/v)seprepararondisolucionesde concentración0.77%(w/v),utilizandoparasudiluciónunadisoluciónacuosacon un0.1%(w/v)defotoiniciadorI2959previamentefiltradaconfiltrode0.2µm. ‐Lasdisolucionesprecursorasal0.77%(w/v)seequilibrarondurante1horaa temperaturaambiente,paraconseguirelestadodeequilibrio. ‐ 5mLdelasdisolucionesprecursorasconelcopolímeroreactivose fotopolimerizaronenunrecipientedevidriocilíndricode6cmdediámetro, irradiandoconluzultravioleta(365nm)durante10minutosaunadistanciade8 cmdelalámparaalamuestra. ‐Lafotopolimerizaciónsellevóacaboa25°C.Paramantenerlatemperaturade fotopolimerizaciónconstanteseutilizóunaplacacalefactora,sobrelacualse colocóelmoldecilíndricodevidrio.
Capítulo6 267 ‐ Lasdisolucionesfotopolimerizadassedializarona4⁰Cdurante24horas (nanogelesdeF127‐Ac‐2)ydurante72horas(nanogelesdeF127‐Ac‐4yF127‐Ac‐ 8),utilizandounamembranadeacetatodecelulosaSpectra/Por®Biotech MWCO300,000(Spectrum)conuntamañodeporode30nm.Elmayortiempo dediálisisaplicadoparalosnanogelesdelosderivadosF127‐Ac‐4yF127‐Ac‐8se debealmayorpesomolecularquepresentanloquedisminuyelavelocidadde diálisis,talycomoseobservaenlasespecificacionesdelamembranadediálisis utilizada. ‐Acontinuación,lasmuestrasdializadas(más1mLdeaguadestiladautilizado paralavarlamembranadediálisis)sefiltrarondenuevoconfiltrosdeacetatode celulosade0.2µm,paralaeliminacióndeagregadosdetamañosuperioralos 200nm. j.ProtocolodecaracterizaciónporTEMySEMdenanogelesfotopolimerizados ‐ParalapreparacióndemuestrasdeTEM,seadicionaunagotadeladisolución acuosadelosnanogelessobreunarejilladecobrerecubiertadecarbono.El excesodemuestrasesecaconpapeldefiltroylarejillasedejasecara temperaturaambiente. ‐ParalapreparacióndemuestrasdeSEM,seadicionaunagotadedisolución acuosadenanogelessobreuncubreredondodevidriode12mmdediámetro. Lamuestrasedejasecaratemperaturaambienteyunavezsecaserecubrecon oro. k.‐Protocolodeencapsulaciónennanogeles EncapsulaciónderodaminaB ‐ SepreparóunadisoluciónderodaminaBdeconcentración0.15mg/mlen etanol.
Capítulo6Capitulo 268 ‐Estadisoluciónseadicionósobreladisolucióndecadaunodelosnanogeles, PDF/N‐F127‐Ac‐n(n=2,4y8).Lacantidadderodaminaadicionadaconrespecto alacantidaddenanogelesfue0.15mgderodamina/mgdenanogel. ‐ Acontinuaciónlamezcladeambasdisolucionesseincubóatemperatura ambientedurante24horas. ‐Eletanolseevaporóconagitaciónorbitalyladisoluciónacuosadenanogeles cargadosconrodaminayrodaminanoencapsuladaresultantesedializó(Slide‐A‐ Lyzes®DyalisisCassetteG22,000MWCO,ThermoScientific)conaguadestilada durante24horasparaeliminarlarodaminanoencapsulada. ‐ Lacuantificacióndelarodaminanoencapsuladaenlasaguasdediálisisse realizóporfluorescencia(λmaxenagua=576nm).Paralarealizacióndelacurvade calibradodelarodaminaseutilizarondisolucionesacuosasenelrangode concentraciones2.5‐38µg/ml.Lacantidadderodaminaencapsuladasecalculó deformaindirectacomoladiferenciaentrelacantidadderodaminaadicionada inicialmenteylacantidadderodaminapresenteenlasaguasdediálisis. Encapsulacióndepireno ‐Sepreparóunadisolucióndepirenodeconcentración0.15mg/mlenacetona. ‐Estadisoluciónseadicionósobreladisolucióndecadaunodelosnanogeles, PDF/N‐F127‐Ac‐n(n=2,4y8).Lacantidaddepirenoadicionadaconrespectoala cantidaddenanogelesfue0.15mgdepireno/mgdenanogel. ‐ Acontinuaciónlamezcladeambasdisolucionesseincubóatemperatura ambientedurante24horas. ‐Laacetonaseevaporóconagitaciónorbital,produciendolaprecipitacióndel pirenonoencapsuladoenladisoluciónacuosadenanogeles. ‐ Ladisoluciónacuosadenanogelescargadosconpirenoypirenono encapsuladoenformadeprecipitadosefiltróatravésdefiltrosdeteflónde0.45 µm.Elfiltroselavóconacetonaparalarecuperacióndelpirenonoencapsulado ysucuantificación.
Capítulo6 269 ‐Elpirenonoencapsuladoprecipitadosecuantificóporfluorescencia,utilizando elespectrodeexcitación(λmaxenacetona=332.5nm).Paralarealizacióndelacurva decalibradodelpirenoseutilizarondisolucionesdepirenoenacetonaenel rangodeconcentraciones13.4‐268µg/ml.Lacantidaddepirenoencapsuladose calculódeformaindirectacomoladiferenciaentrelacantidaddepireno adicionadainicialmenteylacantidaddepirenonoencapsuladoenformade precipitado. 6.3.l.‐Protocolodeensayoscelularesconnanogeles ‐Preparacióndelascélulas:LascélulasHeLasecultivaronenDMEMhighglucose (4.5g/l),4mMdeL‐glutamina,10%deFBS,1%dePenicilina/Estreptomicinay 1%deAnfotericinaBylascélulasMSCderatónsecultivaronenDMEMF12(3g/l deglucosa)2mMdeL‐glutamina,10%deFBS,1%dePenicilina/Estreptomicinay 1%deAnfotericinaB.Lascélulassemantuvierona37⁰C,con21%O2y5%CO2 paraHeLay3%O2y5%CO2paraMSC.Cuandolascélulasalcanzaronun80‐90% deconfluenciaselavaronconDPBS(Dulbbecco´sPhosphateBufferedSaline),se añadiósolucióndetripsinaal1%yseincubarondurante5minutosa37⁰C,para permitirlaroturadelasproteínasqueproducenlaadhesióndelascélulasal recipientedecultivo.Laaccióndelatripsinasedetuvoañadiendomediode cultivofresco. ‐ Preparacióndelasdisolucionesdenanogeles:Enelcasodelosnanogeles PDF/F127‐Ac‐2,trassuliofilización,seredisolvieronalaconcentracióndeseada directamenteenDMEMhighglucoseparaensayosconHeLayenDMEMF12 paraensayosconMSC.ParalosnanogelesPDF/N‐F127‐Ac‐4yPDF/N‐F127‐Ac‐8, disueltosenaguadestilada,laconcentraciónseajustóporadicióndemediode cultivoDMEMhighglucoseparaensayosconHeLayconDMEMF12para ensayosconMSC.Previoalajustedelaconcentración,lasdisolucionesde nanogelesdePDF/N‐F127‐Ac‐4yPDF/N‐F127‐Ac‐8enaguadestiladaunavez fotopolimerizadasydializadassefiltraronconfiltrosde0.22µmparaesterilizar. Todaslasmanipulacionesderedisolución,filtradooajustedelaconcentración
Capítulo6Capitulo 270 poradicióndemediodecultivoserealizaronencampanadeflujolaminarpara garantizarlascondicionesdeesterilidad. ‐Ensayosdeviabilidad:LascélulasHeLaoMSCsesembraronaunadensidadde 10000célulasporpocillo,utilizandoplacasde96pocillos.Tras24horasde incubaciónseretiróelmediodecultivoyseañadieron100µLdedisoluciónde nanogelesdelaconcentracióndeseada.Todoslosensayosserealizaronpor triplicado. Elmediodecultivoconnanogelesseretirótras24,48o72horasdeincubacióny seañadiómediodecultivofresco.Acontinuaciónseañadióunadisoluciónde AlamarBlue,enunacantidaddel10%delvolumendemediopresenteencada pocillo.Tras2horasdeincubacióna37⁰C,lafluorescenciaseleyóa530/590 (excitación/emisión)enunlectordeplacas.Laviabilidadcelularseexpresócomo laviabilidaddecélulasrelativaalcontrol(%comparadoconlascélulascontrol incubadassóloconmediodecultivo). ‐Ensayosdeinternalización: ‐LascélulasHeLasesembraronaunadensidad40000célulasporpocillo, sobreportasde12mmdispuestosenelfondodelospocillosdeplacasde cultivode24pocillos. ‐ ParalaincubaciónconlosnanogelescargadosconrodaminaBo rodamina‐ESTseadicionódisolucióndenanogelconrodaminaBo rodamina‐ESTdisueltoenaguadestilada,cuyaconcentraciónseajustó previamenteporadicióndemediodecultivoDMEMhighglucose,siendo elvolumenfinaldelensayode500µL.Lascélulasseincubarondurante4 horasa37⁰Coa4⁰C. ‐ Transcurridoesetiempo,seretiróelmediodecultivoconnanogel cargadoconrodaminaylascélulasselavaron3vecesconPBS. ‐ Lafijacióndelascélulasserealizóporadiciónde300µLde formaldehidoal4%eincubacióndurante20minutosatemperatura ambiente. ‐Acontinuaciónlascélulasselavarondurante5minutosconPBS(x2).
Capítulo6 271 ‐Pararealizarelmarcajedelaactinadelascélulasseutilizóelfluoróforo verdeAlexafluor488.Elportaconlascélulassedispusosobreunagota de40µLdeAlexafluoryseincubódurante1horaatemperatura ambiente.Lascélulasselavarondurante5minutosconPBS‐BS(PBS+1% BSA(BovineSerumAlbumin)+0.1%Saponina),PBS‐B(PBS+1%BSA)yagua destilada. ‐Loscubressesecaronconpapeldefiltro.Pararealizarelmarcajedel núcleodelascélulasseañadiósobreelcubre5µLdeDAPI‐Mowiol.El cubresetapóconunporta,sesellóconlacadeuñastransparenteytras susecadosealmacenóa4⁰Cenoscuridadhastaobservaciónpor microscopiaconfocal. 6.3.MATERIALESYTÉCNICAS ‐ Losreactivosydisolventesutilizadosenlasíntesisdeloscompuestosfueron suministradosporSigma‐AldrichoAcròs. LamembranadeacetatodecelulosaSpectra/Por®BiotechdeMWCO300,000y lamembranaSpectra/Por®deMWCO3500fueronsuministradasporSpectrum. LamembranaSlide‐A‐LyzesDyalisisCassetteG2deMWCO2,000fue suministradaporThermoScientific. ElDMEM,DMEMF12,DMEMhighglucose,DPBSyL‐glutaminafueron sumistradosporGibco,InvitrogenparaLifeTechnologies,ThermoFisher Scientific,España. ElkitLive/dead®(CalceinAM/Ethidiumhomodimer),PhalloidinAlexafluor488y DAPI(dilactate)fueronsuministradosporInvitrogen. ElmowiolfuesumistradoporMerck. LaPenicilina,Estreptomicina,AnfotericinaBytripsina(Trypsin‐Versene10X) fueronsuministradasporLonza. LaBSAfuesumistradaporSigma‐Aldrich. LascélulasHeLafueronsuministradasporCancerResearch‐UKcellbank.
Capítulo6Capitulo 272 LascélulasMSCderatón(bonemarrowofC57BL/6mouseat≤8weeksafter gestation)fueronsumistradasporGibco. ‐ Losespectrosde1H‐RMNy13C‐RMNsehanregistradoenlossiguientes equipos:BrukerAV‐400(operandoa400MHzpara1Hy100MHzpara13C)oAV‐ 500(operandoa500MHzpara1Hy125MHzpara13C),BrukerAMX300 (operandoa300MHzpara1Hy75MHzpara13C),equiposdelServiciode ResonanciaMagnéticadelCEQMA(CentrodeQuímicayMaterialesdeAragón). ElCDCl3sehautilizadocomodisolvente;losdesplazamientosquímicosse muestranenppmrelativosaTMS,utilizandoelpicodedisolventecomoestándar interno. ‐ LosespectrosdeFT‐IRsehanrealizadoenunespectrofotómetroThermo NICOLETAvatar360FT‐IR utilizandounapastilladeNaClcomosoporteoun equipoBrukerVertex70enmodoATRmodeloMKIIGoldenGateSingle ReflectionATRSystemdeSpecac.EquiposdelDepartamentodeQuímica OrgánicadelaUniversidaddeZaragoza. ‐Elanálisiselementaldeloscompuestosseharealizadoenunmicroanalizador PerkinElmerCHN2400,equipopertenecientealServiciodeAnálisisElemental delCEQMA. ‐LostermogramasdeDSCsehanrealizadoenelequipoQ20V24.10Build122de TAInstruments,utilizandocápsulasdealuminioparalapreparacióndelas muestras.EquipodelServiciodeCalorimetríadelCEQMA. ‐ LaespectrometríademasasseharealizadoenunESIBrükerEsquire300+, MALDI+/TOFBrükerMicroflexsystem,utilizandoNAFTA/ditranolcomomatriz. EquipodelServiciodeEspetrometríadeMasasdelCEQMA. ‐LasmuestrasdeSEMsehanobservadoenunequipoInspectF50perteneciente alLaboratoriodeMicroscopiasAvanzadas(LMA)delInstitutodeNanocienciade Aragón(INA).
Capítulo6 273 ‐LasmedidasdeTEMhansidorealizadasenunmicroscopioTECNAIG20(FEI COMPANY),200kV,pertenecientealLMAdelINA.Lasmuestrasfueron preparadasenrejillasholleycarbonfilm300MeshCu(50)deAgarScientific. ‐LasmedidasdeDLSserealizaronenunequipoMalvernInstrumentNanoZS queutilizaunlaserdeHe‐Neconunalongituddeondade633nmyunángulode detecciónde173⁰,a25⁰Cy37⁰C. ‐LasmedidasdeGPCsehanrealizadosobremuestrasdeconcentración1mg/ml utilizandounequipoWaterse2695Allianceequipadoconundetectorde dispersióndeluz,columnasStyragel®HR1deWatersoPLgel5µmMIXED‐Cde AgilentTechnologies.LasmedidassehanrealizadoconTHF(gradoHPLC)como disolvente,conunflujode1ml/min.Paraelcalibradosehanutilizadopatrones depoliestireno. ‐ Lasmedidasdefluorescenciasehanrealizadoenunespectrómetrode fluorescenciaPerkinElmerLS55,pertenecientealINA. ‐LaliofilizaciónserealizóenunliofilizadorCryodos50deTelstarperteneciente alINA. ‐ Laspropiedadesmecánicassemidieronenunamáquinadeensayosuniaxial Instrom5848yunamáquinaInstromMicroTester5548.Losensayosdefatigase realizaronenunamáquinaBOSEElectroForce5210BioDynamicconcapacidad para4cámarasdeensayoyunafuerzamáximaaplicablede200N.Equipos pertenecientesalgrupoGEMMdelI3A. ‐LascélulasHeLaseincubaronenunincubadordeCO2ExcellaECO‐170(New BrunswichScientific,UK).LasMSCseincubaronenunincubadordeCO2Forma seriesIIwaterjacketed,HEPAclass100(ThermoFisherScientific,Spain). ‐ Lasimágenesencontrastedefasesydefluorescenciadelascélulassehan realizadoenunmicroscopioinvertidomodeloOlympusIX81enelCIBA(Centro deInvestigacionesBiomédicasdeAragón).
Capítulo6Capitulo 274 ‐LafluorescenciaenelmétodoAlamarBluesedeterminóconunlectordeplacas SynergyHTdeBiotekpertenecientealaUnidaddeInvestigaciónTranslacional (UIT)delHospitalMiguelServet,IACS. ‐ LasimágenesdemicroscopiaconfocalserealizaronenunequipoFluoview FV10iconinmersiónenaceite,pertenecientealCIBA(CentrodeInvestigaciones BiomédicasdeAragón).Lasimágenessevisualizaronytrataronconelsoftware FV10‐ASW4.0Viewer.
ANEXOS 281 Enestosapartadosserecogendescripcionesdetalladasydatosdetécnicas, procedimientosyestudiosrealizadosyobtenidoscomopartedeltrabajo desarrolladoenestatesisdoctoral.
ANEXOS 283 I ANEXOI.CARACTERIZACIÓNESTRCUTURAL FiguraI.1.EspectrodeHSQCparalamoléculaF127‐Ac‐8ENCDCl3,500MHz. FiguraI.2.EspectrodeHMBCparalamoléculaF127‐Ac‐8enCDCl3,500MHz.
ANEXOSCapitulo 284 FiguraI.3.CromatogramasdeGPCdelosderivadosdePluronicF127®descritos: a)PluronicF127®,b)F127‐Ac‐2,c)F127‐Bn‐2,d)F127‐OH‐4,e)F127‐Ac‐4,f) F127‐Bn‐4,g)F127‐OH‐8yh)F127‐Ac‐8.Cromatogramasa),d)yg)realizados concolumnaStyrage®HR1THFWaters,restodecromatogramasrealizadoscon columnaPLgel5µmMIXED‐CdeAgilentTechnologies. 0 400 800 1200 0 102030 LSU Tiempo(minutos) 0 10 20 30 40 50 0 102030 LSU Tiempo(minutos) 0 20 40 60 80 100 120 0 102030 LSU Tiempo(minutos) 0 50 100 150 0 102030 LSU Tiempo(minutos) 0 20 40 60 80 100 120 0102030 LSU Tiempo(minutos) 0 20 40 60 80 0 102030 LSU Tiempo(minutos) 0 100 200 300 400 500 600 700 0 102030 LSU Tiempo(minutos) 0 5 10 15 20 25 0 102030 LSU Tiempo(minutos) a)b) c)d) e)f) g)h)
ANEXOS 285 J I G J I,I´GF M O 2.72.93.13.33.53.73.94.14.34.54.7 f2 (pp m ) 30 35 40 45 50 55 60 65 f 1 ( p p m ) FiguraI.4.EspectrodeHSQCparalamoléculaF127‐SH‐2enCDCl3,500MHz. FiguraI.5.Espectrode1H‐RMNparalamoléculaF127‐PN‐4enCDCl3,300MHz. A
ANEXOSCapitulo 286 FiguraI.6.CromatogramasobtenidosporGPCconcolumnasPLgel5µmMIXED‐Cde AgilentTechnologiesparaa)F127‐PN‐2,b)F127‐PN‐4yc)F127‐PN‐8. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 LSU Tiempo(minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 LSU Tiempo(minutos) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 LSU Tiempo(minutos) a) b) c)
ANEXOS 287 FiguraI.7.EspectrosMALDI‐MS:a)F127‐PN‐2,b)F127‐SH‐2,c)F127‐PN‐4,d)F127‐SH‐4y e)F127‐PN‐8. 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z 0 50 100 2000 7000 12000 17000 Intensidad(%) m/z a) b) c) d) e)
ANEXOSCapitulo 288 ANEXOII.CARACTERIZACIÓNDEHIDROGELESPORDSC LautilizacióndelatécnicadeDSCparaladeterminacióndelaLCST(LowCritical SolutionTemperature)dePluronicF127®hasidodescritaporvariosautores.135 Enlostermogramassemuestraelflujodecalorfrentealatemperatura, observándosedoscambiosdelalíneabase,adjudicadosalprocesode micelizaciónydegelificación(FiguraII.1). ElprimerpicoendotérmicoFiguraII.1(a)correspondealprocesode micelización,quesuponelaagregacióndelascadenasdepolímeroenmicelas. EstepicopermiteobtenerlaCMT,queeslatemperaturaalacualseproducela micelizaciónparaunadisolucióndepolímerodeunadeterminadaconcentración. FiguraII.1.TermogramadeDSCdeunadisoluciónacuosaal30%w/vdePluronic F127®.135d ElsegundopicodelaFiguraII.1(b),tambiénendotérmico,ycorrespondienteal procesodegelificación,aparececomounpequeñopicoaladerechadelpicode micelizaciónypermiteladeterminacióndelaLCST.Enlagelificaciónporefecto 135(a)Nie,S.F.;Hsiao,W.L.W.;Pan,W.S.;Yang,Z.J.,Int.J.Nanomed.2011,6,151‐166; (b)Barba,A.A.;d'Amore,M.;Grassi,M.;Chirico,S.;Lamberti,G.;Titomanlio,G.,Journal ofAppliedPolymerScience2009,114(2),688‐695;(c)Li,L.;Lim,L.H.;Wang,Q.;Jiang,S. P.,Polymer2008,49(7),1952‐1960;(d)Cabana,A.;Aıt‐Kadi,A.;Juhász,J.,Journalof ColloidandInterfaceScience1997,190(2),307‐312. (a) (b)
ANEXOS 289 delatemperaturaseproduceunareorganizacióndelasmicelasyaformadas. Estatransiciónsuponeunpequeñocambiodeentalpíaporloqueutilizandola representacióndelflujodecalorfrentealatemperaturaestepicosóloesvisible paradisolucionesdePluronicF127®deelevadaconcentración.135d EnlaFiguraII.2(a)semuestraeltermogramacorrespondienteaunadisolución deF127‐Ac‐4al25%(w/v)dóndesoloseapreciaelprocesoreversiblede micelizaciónenelcalentamientoyenelenfriamiento.Porello,paraunamejor determinacióndelatemperaturadegelificación,sehatrabajadoconla representacióndeladerivadadelflujodecalorrespectoaltiempofrenteala temperatura(FiguraII.2(b)).135aElprimerpicomásgrande,debidoaunmayor valordeentalpía,correspondealprocesodemicelización(CMT),mientrasqueel segundopicomáspequeño,debidoaunmenorvalordeentalpía,correspondea latransiciónsol‐gel(LCST).
ANEXOSCapitulo 290 FiguraII.2.TermogramadeDSCdeF127‐Ac‐4al25%w/venPBS10mMpH7.4,a)Flujo decalor(W/g)frentealatemperaturaenelprocesodecalentamientoyenfriamiento, b)Derivadadelflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperatura enelprocesodecalentamiento. ‐0,4 ‐0,3 ‐0,2 ‐0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 ‐10 10 30 50 Flujodecalor(W/g) Temperatura(⁰C) ‐2 ‐1 0 1 2 3 4 0102030 DerivadaFlujodeCalor (mW/min) Temperatura(⁰C) SOLGEL SOL Micelizacióncalentamiento Gelificacióncalentamiento GEL b ) a )
ANEXOS 297 Permeabilidad(κ) Elcálculodelapermeabilidad,κ,serealizaaplicandolaEcuación(2),dondeτ´es eltiempoderelajación,heselespesordelamuestrayHAeselMódulo Agregado.Elcálculodeτ´yHAserealizanconensayosdecompresiónuniaxialde carga‐relajacióndetipoCC. LaFiguraIV.1(a)muestralacurvatípicadetensión‐deformaciónobtenidapara losensayosdecarga‐relajación.Enellaseobservaelajustelinealpormínimos cuadrados(enrojo)delospuntosdemáximarelajaciónquepermiteobteneral valordeHA. FiguraIV.1.a)Curvatípicadetensiónvs.deformaciónobtenidaparaP/H23‐F127‐Ac‐2enun ensayodecompresiónuniaxialdecarga‐relajaciónconfinada.Encolorrojo,elajustelineal pormínimoscuadradosenlospuntosdemáximarelajación,b)Curvatípicadefuerzavs. tiempoparaunarampadecarga‐relajación,c)Selección(enrojo)yajusteexponencial(en azul)paraelcálculodelapermeabilidadapartirdeunacurvaderelajación. a)b) c) (2)
ANEXOSCapitulo 298 Paraelcálculodeτ´,enunensayodeCCdecarga‐relajaciónsepuedemedirla fuerzadereacciónenfuncióndeltiemporequeridoparaalcanzarelequilibrioen cadacicloderelajación.LaEcuación(3)esunafunciónexponencialdeltiempo dondeFeslafuerzaaplicada,F∞eslafuerzaamáximarelajación(t=infinito)yse suponequeesigualacero,F0eslafuerzaamáximatensión(t=0)yτ´(tiempode relajación)eselparámetroacalcular.EnlaFiguraIV.1(b)semuestralagráfica correspondientealafuerzaaplicadafrentealtiempo. Elajusteexponencialpormínimoscuadradosenlospuntosdemáximarelajación encadacurvaderelajaciónpermiteobtenerτ´. LaFiguraIV.1(c)muestralazonaseleccionadaparallevaracaboelajuste(en colorrojo)asícomoelajusteexponencialpormínimoscuadrados(encolorazul) apartirdelcualsecalculaτ´.119 (3)