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2014 60 Susana Hernández Agoiz Nuevos inmunosensores magnéticos de transducción espectrofotométrica y electroquímica para la determinación de deoxinivalenol en cereales Departamento Director/es Química Analítica Castillo Suárez, Juan Ramón Vidal Ibáñez, Juan Carlos Bonel Sanmartín, Laura Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Susana Hernández Agoiz NUEVOS INMUNOSENSORES MAGNÉTICOS DE TRANSDUCCIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA Y ELECTROQUÍMICA PARA LA DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL EN CEREALES Director/es Química Analítica Castillo Suárez, Juan Ramón Vidal Ibáñez, Juan Carlos Bonel Sanmartín, Laura Tesis Doctoral Autor 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA U UN NI IV VE ER RS SI ID DA AD D D DE E Z ZA AR RA AG GO OZ ZA A I IN NS ST TI IT TU UT TO O U UN NI IV VE ER RS SI IT TA AR RI IO O D DE E I IN NV VE ES ST TI IG GA AC CI IÓ ÓN N E EN N C CI IE EN NC CI IA AS S A AM MB BI IE EN NT TA AL LE ES S D DE E A AR RA AG GÓ ÓN N N NU UE EV VO OS S I IN NM MU UN NO OS SE EN NS SO OR RE ES S M MA AG GN NÉ ÉT TI IC CO OS S D DE E T TR RA AN NS SD DU UC CC CI IÓ ÓN N E ES SP PE EC CT TR RO OF FO OT TO OM MÉ ÉT TR RI IC CA A Y Y E EL LE EC CT TR RO OQ QU UÍ ÍM MI IC CA A P PA AR RA A L LA A D DE ET TE ER RM MI IN NA AC CI IÓ ÓN N D DE E D DE EO OX XI IN NI IV VA AL LE EN NO OL L E EN N C CE ER RE EA AL LE ES S SUSANA HERNÁNDEZ AGOIZ TESIS DOCTORAL 2014 N NU UE EV VO OS S I IN NM MU UN NO OS SE EN NS SO OR RE ES S M MA AG GN NÉ ÉT TI IC CO OS S D DE E T TR RA AN NS SD DU UC CC CI IÓ ÓN N E ES SP PE EC CT TR RO OF FO OT TO OM MÉ ÉT TR RI IC CA A Y Y E EL LE EC CT TR RO OQ QU UÍ ÍM MI IC CA A P PA AR RA A L LA A D DE ET TE ER RM MI IN NA AC CI IÓ ÓN N D DE E D DE EO OX XI IN NI IV VA AL LE EN NO OL L E EN N C CE ER RE EA AL LE ES S Memoria presentada en la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza por Dña. Susana Hernández Agoiz para optar al grado de Doctora por la Universidad de Zaragoza Agradecimientos En primer lugar quiero agradecer al profesor D. Juan Ramón Castillo la confianza puesta en mí para el desarrollo de este trabajo de investigación, quién me dio la posibilidad de comenzar una carrera investigadora y de conseguir retos que nunca habría imaginado. También al profesor D. Juan Carlos Vidal, quién me ayudo y me guió en mis dudas, intentando que el camino recorrido en estos años fuera mucho más sencillo y agradable. Para la Doctora Laura Bonel, quiero tener un agradecimiento especial, por el tiempo invertido en mi tesis, la ayuda ofrecida en los momentos difíciles en los que vimos todo negro, y la alegría mostrada en mis triunfos. A mis compañeros de laboratorio y ya amigos, de los cuales he extraído grandes valores profesionales y sobre todo personales. Gracias a mis chicas, por vuestro apoyo y por vuestros consejos; sabéis que no ha sido fácil pero todo se consigue con confianza y esfuerzo. Positivismo ante todo. Me llevo esos momentos del laboratorio, y también de fuera de él (comidas diarias, sobremesas, celebraciones…). A mis amigos y amigas de toda la vida, quienes han estado conmigo a lo largo de este camino, y que pese a no entender a penas el tema de mi tesis me han animado a seguir adelante, mostrando gran curiosidad por cada paso que daba. Aquí tenéis el resultado para cuando lo queráis leer. Una mención especial se merecen mis padres y mi hermano Ángel. Sin ellos la conclusión de esta tesis no habría sido posible dadas las dificultades del momento. Gracias por animarme a seguir adelante, aguantar mis cambios de humor, valorarme, y acompañarme en los momentos bajos y gracias por vuestro interés diario, vuestra alegría constante y el orgullo mostrado por cada cosa que hago. Gracias a Jorge, por su compañía, paciencia, por entender mis agobios y saber estar a mi lado en cada momento durante todos estos años. Gracias por cambiar fines de semana de salidas o viajes por días aburridos en casa esperando que yo acabara de estudiar, redactar la tesis o quién sabe qué. Gracias por tu confianza en mí y por tu apoyo. Y un agradecimiento general a todos los miembros del Departamento de Química Analítica. Hemos pasado muchos momentos juntos que siempre recordaré. Gracias de verdad Í ÍN ND DI IC CE E ABREVIATURAS Páginas CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN…………………………….…………………………………1 1.1. MICOTOXINAS 1 1.1.1 Técnicas analíticas para la determinación de micotoxinas 3 1.2 DEOXINIVALENOL 7 1.2.1 Toxicidad del deoxinivalenol 11 1.2.2 Legislación 13 1.2.3 Determinación de deoxinivalenol mediante inmunoensayo 15 1.2.4 Determinación de deoxinivalenol mediante técnicas cromatográficas 30 1.3 ANTICUERPOS COMO ELEMENTOS DE BIORRECONOCIMIENTO 33 1.3.1. Producción de anticuerpos selectivos a deoxinivalenol: inmunógenos 33 1.3.2. Anticuerpos selectivos al deoxinivalenol: inmunoensayos 37 1.4 PARTÍCULAS MAGNÉTICAS COMO SUPERFICIE SÓLIDA DE INMOVILIZACIÓN 39 EN EL INMUNOENSAYO 1.4.1. Uso de partículas magnéticas como superficie de un inmunosensor 39 1.4.2. Uso de partículas magnéticas en inmunosensores para micotoxinas 43 1.5 ELECTRODOS SERIGRAFIADOS DE CARBONO 44 1.5.1. Producción de electrodos serigrafiados (SPEs) 46 1.5.2. Uso de electrodos serigrafiados de carbono en biosensores 50 electroquímicos para micotoxinas CAPÍTULO 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………..57 CAPÍTULO 3. PARTE EXPERIMENTAL……………………………………………………63 3.1 MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN 63 3.2 REACTIVOS QUÍMICOS Y BIOQUÍMICOS 70 3.2.1 Reactivos de uso general 70 3.2.2 Reactivos de inmunoensayo 71 3.2.3 Materiales de referencia certificados y muestras de cereales 71 3.3 DISOLUCIONES TAMPÓN 73 3.4 PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES 74 3.4.1 Síntesis del conjugado enzimático DON-HRP 74 3.4.2 Resonancia de Plasmón Superficial 76 3.4.3 Inmovilización del anticuerpo sobre las partículas magnéticas 77 3.4.4 ELISA espectrofotométrico 83 3.4.5 Inmunosensor electroquímico con electrodos serigrafiados 86 SPCEs individuales 3.4.6 Inmunosensor electroquímico con electrodos múltiples 88 3.4.7. Inmunosensor competitivo para la determinación de Fumonisina B1 90 3.4.8 Extracción de micotoxinas en muestras de harina de cereales 91 3.4.9 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) 95 3.4.10 Procedimiento de inmunoensayo con el kit comercial de 96 Europroxima(5121DON) 3.5 MODELO MATEMÁTICO DE AJUSTE DE LOS CALIBRADOS COMPETITIVOS: 99 MODELO 4PL CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………….105 4.1 CARACTERIZACIÓN DEL CONJUGADO ENZIMÁTICO DEOXINIVALENOL105 PEROXIDASA (DON-HRP) 4.2 ESTUDIO DE LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS POLICLONAL Y MONOCLONAL 109 DE DEOXINIVALENOL 4.2.1 Anticuerpo policlonal 110 4.2.2 Anticuerpo monoclonal 136 4.3 OPTIMIZACIÓN Y DESARROLLO DE UN INMUNOSENSOR DIRECTO 143 COMPETITIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL 4.3.1 mELISA utilizando partículas magnéticas funcionalizadas 144 con proteína G 4.3.2 Inmunosensor electroquímico utilizando electrodos serigrafiados 161 (SPCEs) individuales 4.3.3 Inmunosensor electroquímico utilizando electrodos SPCEs 164 múltiples (CH8): Multistep Amperometric 4.3.4. Inmunosensor electroquímico utilizando electrodos SPCEs 183 múltiples (CH8): Amperometric Detection 4.4 INTERFERENCIAS Y REACTIVIDAD CRUZADA DEL ANTICUERPO 199 MONOCLONAL (mAbDON) CON OTRAS MICOTOXINAS 4.4.1 Interferencias producidas por disolventes orgánicos 199 4.4.2 Interferencias de otras micotoxinas en la muestra: reactividad 207 cruzada de los anticuerpos monoclonales del DON y la FB1 4.5 TIEMPO DE VIDA DEL INMUNOSENSOR 210 4.6 DETERMINACIÓN DE DON EN MUESTRAS DE ORIGEN CEREAL 212 4.6.1 Determinación de DON en muestras de cereales 214 4.6.2 Comparativa de resultados obtenidos por mELISA y AD-a 225 4.6.3 Estudio de la reproducibilidad entre determinaciones 230 realizadas sobre diferentes extractos del CRM TR-D100. 4.7 VALIDACIÓN DEL INMUNOSENSOR PARA LA DETERMINACIÓN DE DON 234 4.7.1 Comparación de resultados con un kit ELISA comercial 235 (Europroxima) 4.7.2 Validación de resultados por HPLC-UV-Vis 238 4.7.3 Comparación estadística de los resultados frente a HPLC-UV-Vis 246 y frente al kit comercial ELISA (Europroxima) 4.8 DETERMINACIÓN CONJUNTA DE DON Y FB1 EN UNA MUESTRA DE 250 HARINA DE CEREALES 4.8.1 Extracción conjunta de DON y FB1 de las muestras 250 4.8.2 Determinación simultánea de DON y FB1 en los CRMs 252 4.8.3 Validación de resultados por HPLC-UV-Vis 260 4.8.4 Determinación de DON y FB1 por mELISA en una muestra 265 conjunta de harina de maíz y de trigo (TR-F100 + TR-D100) CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………..279 CAPÍTULO 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………287 ANEXOS A AB BR RE EV VI IA AT TU UR RA AS S Ab Anticuerpo Abs Absorbancia AC Tampón acetato ACN Acetonitrilo AD Amperometric Detection AD-a Amperometric Detection modo alternado AD-c Amperometric Detection modo consecutivo AF Aflatoxina AFB1 Aflatoxina B1 AFM1 Aflatoxina M1 AFB1-BSA Conjugado AFB1 con albúmina sérica bovina ANOVA Análisis de la varianza AOAC Association of Official Analytical Chemists APPCC Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control AuNPs Nanopartículas de oro BSA Albúmina Sérica Bovina CB Tampón carbonatos CDI 1,1,-carbodiimidazol CIT Citrulina CH8 Electrodos serigrafiados de carbono múltiples CMEs Electrodos Químicamente Modificados CRA Cronoamperometría CRM Patrón de referencia certificada DNA Ácido desoxirribonucleico DON Deoxinivalenol DON-BSA Conjugado Deoxinivalenol con albúmina sérica bovina DON-HRP Conjugado Deoxinivalenol con peroxidasa DON-HSA Conjugado Deoxinivalenol con albúmina sérica humana DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DPV Voltametría de pulsos diferenciales DSR Desviación estándar relativa eaHRP Peroxidasa funcionalizada con estreptavidina EAM-UV-Vis Espectrometría de absorción molecular UV-visible EC50 Mitad de la máxima concentración efectiva (toxicidad) EDC 1-Etil-3-(3-dimetillaminopropil) carbodiimida EIS Espectroscopía de Impedancia Electroquímica EFSA European Food Safety Authority ELIME Enzyme-Linked-Immunomagnetic-Electrochemical Assay ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EA Electrodo auxiliar ER Electrodo de referencia ET Electrodo de trabajo FAO Food and Agricultural Organization FB1 Fumonisina B1 FB1-HRP Conjugado Fumonisina FB1 con peroxidasa FB2 Fumonisina B2 GAP Buenas prácticas agrícolas (Good Agricultural Practices) GC-ECD Cromatografía de Gases/Detección por captura de electrones GC-MS Cromatografía de gases/ Espectrometría de masas GMP Buenas prácticas de manipulación (Good Manufacturing Practices) HBS-EP Tampón compuesto de HEPES, NaCl, EDTA y Polisorbato HPLC-FD Cromatografía líquida de alta resolución/Detección fluorescente HPLC-MS Cromatografía líquida de alta resolución/Espectrometría de masas HPLC-UV-Vis Cromatografía líquida de alta resolución/UltravioletaVisible HQ Hidroquinona HRP Peroxidasa de rábano picante HSA Albúmina sérica humana i Intensidad IAC Columnas de Inmunoafinidad IARC Agencia Internacional de Investigación del Cáncer J Jumpers (J1, J2, J3, J4, …) LC-MS/MS Cromatografía líquida/Espectrometría de masas LOD Límite de detección (Limit Of Detection) MA Multistep Amperometric mAb Anticuerpo monoclonal mAbDON Anticuerpo monoclonal selectivo al DON mAbFB1 Anticuerpo monoclonal selectivo a la FB1 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization MBs Partículas magnéticas MBs-aIgG Partículas magnéticas funcionalizadas con un anticuerpo tipo IgG MBs-COOH Partículas magnéticas funcionalizadas con grupos carboxilo MBs-NH2 Partículas magnéticas funcionalizadas con grupos amino MBs-prA Partículas magnéticas funcionalizadas con proteína A MBs-prG Partículas magnéticas funcionalizadas con proteína G MBs-To Partículas magnéticas funcionalizadas con el grupo tosilo mELISA ELISA utilizando MBs como superficie de inmovilización MES Tampón de ácido 2-(N-morfolino etano sulfónico) MIPs Molecularly Imprinted Polymers Modelo 3PL Modelo de ajuste de los 3 parámetros logísticos Modelo 4PL Modelo de ajuste de los 4 parámetros logísticos NHS N-Hidroxisuccinimida NIV Nivalenol NOAEL Non Observed Adverse Effects Level NPs Nanopartículas OEPM Oficina Española de Patentes y Marcas OTA Ocratoxina A OTA-BSA Conjugado OTA con albúmina sérica bovina 1.1.Micotoxinas 3 Dada su importancia, las micotoxinas fueron reguladas en países de todo el mundo, aunque que las regulaciones en un principio variaban de un país a otro según el tipo de micotoxina, la matriz (tipo de alimento o pienso), así como el nivel máximo de concentración permitido. Como resultado de la creación de la Unión Europea (UE) y más especialmente desde mediados de la década de los 2000, alrededor de 100 países (aproximadamente el 85% de los habitantes del mundo) tenían regulaciones específicas o directrices detalladas para la presencia de micotoxinas en alimentos [8]. Con el fin de beneficiar y coordinar el mercado común en la UE, se han elaborado normativas relativas a determinados contaminantes comunes en todos los países miembros de la Comunidad Europea [9], fijando unos límites máximos permitidos que dependen no sólo de la toxicidad, sino también del tipo de alimento y de su nivel de procesado previo a la ingesta. El objetivo principal de los reglamentos comunes en la UE es la protección de la salud del consumidor, junto a la descripción de los procedimientos para la disminución de las cantidades de micotoxina en productos alimenticios [2]. Una de las directivas más importantes en este aspecto es la Comisión Reguladora 1881/2006 del 19 de Diciembre de 2006 [10] que establece los niveles máximos de ciertos contaminantes en productos alimenticios, entre los que se encuentran las micotoxinas. Además el Reglamento de la UE 401/2006 del 23 de septiembre de 2006 [11], que establece los métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en productos alimentarios. Los métodos de muestreo según el Reglamento 401/2006 se realizan en función de la micotoxina, del tipo de alimento (cereal, fruta, frutos secos, especias, leche, café…), de las toneladas de producto, del tipo de lotes, etc. Además se exponen las características analíticas de las determinaciones tales como porcentaje de desviación estándar relativa (%DSR), porcentaje de recuperación, etc. en función del tipo de micotoxina y de la cantidad de muestra ensayada [11]. La detección temprana de las micotoxinas o de los hongos que las producen, es un factor crucial para los países donde se produce principalmente la contaminación, con el fin de cumplir con los requisitos comerciales y para tener un control fiable y rentable, así como para implantar estrategias de prevención en el lugar de la contaminación [9]. 1.1.1 Técnicas analíticas para la determinación de micotoxinas La presencia de micotoxinas en alimentos y en piensos es un riesgo para la salud de los animales y los seres humanos. Se pueden encontrar en una amplia gama de alimentos y piensos contaminados por el deterioro invisible en el campo durante el crecimiento 4 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN de las plantas, por la cosecha, el almacenamiento o el procesado. Varios estudios anteriores reportan que alrededor del 25% de los productos alimenticios (principalmente de origen vegetal) están contaminados por micotoxinas en el mundo [9]. Entre estos, las aflatoxinas representan la principal amenaza en todo el mundo, debido a su enorme toxicidad y amplia presencia. Debido a la peligrosidad que entraña ingerir alimentos contaminados por las diferentes micotoxinas en concentraciones muy pequeñas (en algunos casos por debajo de los ppb´s) se hace necesario buscar técnicas analíticas que permitan la determinación cuantitativa de estos compuestos en las matrices de alimentos. Además, dadas estas concentraciones tan pequeñas, es necesario utilizar métodos analíticos muy sensibles y selectivos [12]. Los métodos analíticos convencionales se basan principalmente en técnicas de separación instrumentales como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con diferentes tipos de detección (principalmente UV-Vis, fluorescencia molecular o espectrometría de masas) y los inmunoensayos enzimáticos por su gran selectividad como los ensayos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) [13]. Las técnicas analíticas más utilizadas actualmente en los métodos oficiales son la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con columnas de fase reversa, utilizando detectores de fluorescencia molecular [14], de absorción UV-Vis [15] o detectores de espectrometría de masas [16], proporcionando límites de detección en un intervalo entre 0,01 y 5 ng ml-1. Estos métodos implican generalmente procedimientos previos de preconcentración y limpieza para la eliminación de la matriz y de las interferencias, por ejemplo usando columnas de inmunoafinidad (IAC) que contienen anticuerpos anti-micotoxinas, o columnas de extracción en fase sólida (SPE) utilizando disolventes orgánicos. En ocasiones, es necesario realizar una derivatización previa de la micotoxinas para su detección óptica, en el caso de que no sea activa ópticamente, como en el caso de la FB1 (detección fluorescente, HPLC-FD) [17; 18]. La determinación por ELISA espectrofotométrico se ha convertido en una de las herramientas más útiles para un rápido control de las micotoxinas, consiguiendo en ocasiones límites de detección tan bajos como 0,1 ng g1 [19]. La tecnología se basa en la capacidad de los anticuerpos específicos para distinguir la estructura tridimensional de una micotoxina durante la incubación competitiva en tiempos aproximados de una hora. A pesar de la alta dependencia de la matriz, las grandes ventajas del ELISA son la velocidad de obtención de resultados, la facilidad de operación, la sensibilidad y la gran cantidad de muestras que se pueden determinar a la vez [20]. Otra de las técnicas más rápidas y sencillas basadas en los inmunoensayos son los dispositivos de flujo lateral, que se presentan en general en un formato de una tira inmunocromatográfica, pero que sólo ofrecen información cualitativa generalmente relacionada con la concentración de corte legislada [21]. 1.1.Micotoxinas 5 Debido al control de la seguridad alimentaria y la gran demanda de métodos rápidos y precisos para detectar micotoxinas, el desarrollo de biosensores es crucial, y se ha incrementado significativamente en los últimos 20 años, y actualmente es una de las áreas más activas de la investigación analítica gracias a su sensibilidad, precisión, bajo coste, eficacia y simplicidad, no sólo de la construcción, sino también de la etapa de pretratamiento de la muestra y la etapa de medida [22]. Los biosensores implican que el elemento de reconocimiento biológico esté en contacto con un transductor [2]. Además son unas de las herramientas más prometedoras para la detección de micotoxinas en los alimentos ya que disminuyen el tiempo de análisis y la exactitud se mejora al eliminar interferencias de las matrices[2; 23]. Un biosensor es un dispositivo en el que materiales de origen biológico, como enzimas, tejidos animales o vegetales, antígenos, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc. son usados como elementos de biorreconocimiento para dotar al dispositivo de la selectividad y especificidad requeridas para la determinación de analitos de origen muy variado en el ámbito clínico, toxicológico, medioambiental, agroalimentario, etc [24]. El mayor avance en los biosensores para la determinación de micotoxinas en matrices alimentarias ha sido el uso de inmunosensores, que aprovechan las reacciones de afinidad entre un anticuerpo selectivo y el antígeno o analito (micotoxina en este caso) correspondiente y basándose en el mismo procedimiento de inmunoensayo de un ensayo ELISA permiten la determinación cuantitativa de la concentración de micotoxina, en órdenes de magnitud de ppb. Particularmente, los inmunosensores electroquímicos para la detección de micotoxinas son cada vez más utilizados como métodos cuantitativos de análisis de alimentos debido a su sensibilidad (pueden medirse corrientes eléctricas muy pequeñas), selectividad, bajo coste, simplicidad, y en algunos casos la posibilidad de miniaturización, la portabilidad y la integración en dispositivos automatizados [25; 26; 27]. Uno de los campos más interesantes para la mejora de los biosensores para la detección y determinación de micotoxinas, es el desarrollo y síntesis de nuevos ligandos de afinidad. Sin lugar a dudas, los nuevos anticuerpos recombinantes y la síntesis de nuevos aptámeros inexistentes hoy en día ampliarán estas oportunidades. Los aptámeros son secuencias cortas de oligonucleótidos de cadena sencilla, que tienen una gran capacidad de reconocimiento selectivo hacia moléculas para las que se han seleccionado por un procedimiento denominado SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Los cambios conformacionales de los aptámeros marcados para su unión específica con la micotoxina pueden usarse para modular la 6 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN distancia de las etiquetas electroactivas al electrodo, alterando de este modo las corrientes redox en el diseño de nuevos aptasensores [28]. En el campo de las micotoxinas, hasta el momento se ha seleccionado un único aptámero de OTA en el año 2008 [29], y posteriormente para FB1 [30] y para ZEA [31]. Debido al selectivo reconocimiento que producen los aptámeros se han desarrollado aptasensores, biosensores que utilizan aptámeros para el reconocimiento selectivo de la micotoxina. Nuestro grupo de investigación ha desarrollado uno de los primeros aptasensores electroquímicos competitivos para la determinación de ocratoxina A, utilizando un aptámero ssDNA biotinilado muy selectivo, con 36 oligonucleótidos que se inmovilizó sobre partículas paramagnéticas funcionalizadas con estreptavidina, y realizando la etapa competitiva por la unión al aptámero entre OTA y OTA-HRP. El aptasensor presenta límites de detección de 0,07 ± 0,01 ng ml-1 de OTA (muy inferior a los LODs habituales de inmunosensores de OTA) y posee un intervalo de trabajo entre 0,78 y 8,74 ng ml-1. El aptámero utilizado presentó una baja reactividad cruzada con OTB (micotoxina muy similar a OTA), obteniéndose una reactividad de la OTB 100 veces inferior que para el caso de la OTA. El aptasensor de OTA se aplicó en muestras de trigo contaminadas realizando medidas con gran reproducibilidad (DSR < 8 %) [2; 32]. Además en nuestro grupo de investigación se ha caracterizado un aptasensor electroquímico de FB1, utilizando un aptámero compuesto por una secuencia de 39 oligonucleótidos y partículas magnéticas funcionalizadas con el grupo tosilo como soporte de inmovilización y de incubación del aptasensor. Se realizaron estudios previos de afinidad y competitividad para el desarrollo futuro de un aptasensor [33]. Por el contrario, en la actualidad no existen aptámeros diseñados para el reconocimiento del DON. Los aptámeros y aptasensores de DON no se mencionan en las bases de datos mundiales como The Aptamer Database [34] ni en trabajos publicados, hasta donde llega nuestro conocimiento. Si bien se han desarrollado biosensores enzimáticos de inhibición, basados en la inhibición de la actividad de un enzima producida por las micotoxinas, este tipo de biosensores catalíticos carecen de la selectividad necesaria (otras moléculas podrían inhibir igualmente a enzimas)[35; 36]. Por ésta razón, lo habitual es utilizar biosensores con ligandos de afinidad, sobre todo con anticuerpos (inmunosensores) [23] y recientemente también con aptámeros [28; 32]. En la actualidad se han desarrollado ligandos artificiales para su uso como elementos de reconocimiento de micotoxinas, los llamados polímeros de impronta molecular (MIPs, Molecularly Imprinted Polymers) obtenidos por síntesis combinatoria. Los MIPs son polímeros sintéticos funcionales hechos en presencia de la micotoxina de interés. Después de su polimerización térmica o bajo luz UV, se elimina la molécula de analito utilizada como “plantilla”, formando así una cavidad complementaria a la molécula 1.2. Deoxinivalenol 7 diana en la que sólo el analito de interés se puede introducir de forma muy selectiva, actuando de un modo similar a los anticuerpos sintéticos [2; 37]. Sin embargo, a pesar de algunas aplicaciones en analitos fluorescentes [38; 39], los MIPs sólo han sido aplicados a la extracción selectiva para la OTA [40; 41] y para la extracción conjunta de ZEA + DON [42], o en columnas de fase sólida [43], donde el problema principal es la selectividad de micotoxinas en una matriz alimentaria compleja. En este tipo de materiales se puede incluir además de los MIPs otros nanomateriales y estructuras de membrana, aptámeros [32; 44; 45], proteínas de unión y péptidos sintéticos, así como algunos óxidos metálicos [46; 47; 48], aunque en términos generales los elementos de biorreconocimiento más utilizados son los anticuerpos [49]. Los biosensores utilizados para la determinación de micotoxinas, en cuanto al tipo de transducción, pueden clasificarse en cuatro grandes grupos:  Sensores luminiscentes/colorimétricos [27]  Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) [21]  Sensores piezoeléctricos (QCM) [50]  Sensores electroquímicos [28; 51; 52] Los biosensores electroquímicos para la determinación de micotoxinas ocupan un lugar destacado debido a su sensibilidad, selectividad, bajo coste, simplicidad, y en algunos casos la miniaturización, portabilidad e integración en dispositivos automatizados. Para transformar la interacción de la toxina en una señal analítica, se han utilizado una gran variedad de técnicas electroquímicas (amperométrica, potenciométrica, conductimétrica, impedancia electroquímica) [51; 53; 54]. De entre todas ellas, destacan la transducción amperométrica y de espectroscopía de impedancia electroquímica por su gran sensibilidad. 1.2 DEOXINIVALENOL Los tricotecenos son un grupo de micotoxinas de gran importancia agrícola, que se generan principalmente por especies de hongos pertenecientes al género Fusarium (Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium crookwellense y Fusarium poae) [55]. Los tricotecenos se dividen en cuatro grupos (tipos A-D), de acuerdo con sus grupos funcionales característicos (tipo A grupo funcional distinto de una cetona en el carbono 8; tipo B grupo carbonilo en el carbono 8; tipo C grupo epóxido en carbonos 7, 8 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN 8 o carbonos 9, 10; tipo D sistema de anillos macrocíclicos entre carbonos 4 y 15 con dos enlaces éster)[56]. En el tipo A se encuentran las toxinas T-2 y HT-2, y en el tipo B que es el más frecuente contiene el deoxinivalenol (DON), 3-acetil-DON, 15-acetil DON, nivalenol y fusarenon [55; 57]. En la tabla siguiente (Tabla 2) se han representado los tricotecenos más importantes del tipo A y B según los grupos funcionales de cada uno [58]: Figura 1: Estructuras químicas de los tricotecenos A y B TRICOTECENOS TIPO A NOMBRE P.M. R1 R2 R3 R4 R5 Neosolaniol 382 OH OAc OAc H OH Toxina HT2 424 OH OH OAc H OCOCH2CH(CH3)2 Toxina T2 466 OH OAc OAc H OCOCH2CH(CH3)3 15-Monoacetoxiscirpenol 324 OH OH OAc H H 4,15-Diacetoxiscirpenol 366 OH OAc OAc H H Tabla 2: Estructuras químicas de los tricotecenos tipo A TRICOTECENOS TIPO B NOMBRE P.M. R1 R2 R3 R4 Deoxinivalenol 296 OH H OH OH 3-AcetilDON 338 OAc H OH OH 15-AcetilDON 338 OH H OAc OH Nivalenol 312 OH OH OH OH 3-Acetilnivalenol 354 OH OAc OH OH Tabla 3: Estructuras químicas de los tricotecenos tipo B El deoxinivalenol (DON) pertenece a la familia de los tricotecenos de tipo B (posee un grupo carbonilo en el carbono 8). El DON se produce a través del metabolismo secundario del hongo Fusarium graminearum que suele desarrollarse en los suelos, preferentemente en temperaturas ambientales templadas, de entre 24 y 26 °C, y que contamina especialmente cereales como el trigo y el maíz, y otros como la cebada, la 1.2. Deoxinivalenol 9 avena, y el centeno. Además puede aparecer en sus granos procesados como la malta, la cerveza o el pan [59]. La fórmula empírica del DON o 4-Deoxinivalenol es C15H20O6 (12,13-epoxi-3,4,15trihidroxitricotec-9-en-8-ona), y su peso molecular es 296,32 Da. La estructura química se representa en la Figura 2: Figura 2: Estructura química del deoxinivalenol (DON) El DON es altamente estable a 120 °C, moderadamente estable a 180 °C y parcialmente estable a 210 °C. Además posee gran estabilidad bajo condiciones débilmente ácidas, pero aparece inestabilidad en medios altamente alcalinos [60]. Se trata de un compuesto muy estable tanto en el almacenaje y la molienda como durante su procesamiento o su cocinado, lo que afecta a su poder contaminante y por lo que se han encontrado intoxicaciones de personas y de animales ocurridas después del consumo de alimentos contaminados con tricotecenos aun después de su procesado [2]. El DON aparece especialmente en cereales cultivados en regiones templadas de Europa, América y Asia [2]. Las infecciones de cereales y la contaminación con deoxinivalenol puede deberse a varios factores como el clima, la rotación de cultivos, las variedades de cereal, los suelos, la manipulación de los cultivos y las aplicaciones de fungicidas. Incluso con buenas prácticas no se pueden controlar todos estos factores, como las condiciones meteorológicas de cada época del año o de cada región [6]. A pesar de realizar unas “buenas prácticas agrícolas” (GAP) que constituyen la primera línea de defensa para el control de la contaminación de los cereales, seguido de la aplicación de “buenas prácticas de fabricación” (GMP) durante la manipulación, almacenamiento, elaboración y distribución de cereales para alimentación humana y animal, es necesaria la detección y prevención temprana del DON en los productos agrícolas dado que sigue siendo posible su contaminación [61]. 10 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN Los métodos analíticos disponibles para la determinación de DON y sus derivados se basan principalmente en los principios de inmunoensayo, cromatografía, y espectrometría de masas, con los que se obtienen resultados tanto cualitativos como cuantitativos [62]. Los métodos tradicionalmente más utilizados incluyen la cromatografía de gases (GC), la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y la cromatografía en capa fina (TLC), los cuales implican preparación de la muestra, largos tiempos de análisis y conocimientos técnicos [63; 64; 65]. Existen también numerosos métodos de análisis para las micotoxinas del grupo Fusarium rápidos, sencillos y de bajo coste, que permiten obtener de modo semicuantitativo la presencia o ausencia de los niveles máximos permitidos (legislados) de la micotoxina en diversos tipos de alimentos (métodos de screening)[66]. Además de los métodos semicuantitativos, para la determinación de la concentración de deoxinivalenol se utilizan diversos métodos analíticos cuantitativos basados en separaciones cromatográficas (GC-ECD, HPLC-UV, LC-MS/MS) [61; 67] y en métodos inmunoquímicos por sus buenas prestaciones analíticas (alta sensibilidad y especificidad) [68] o en nuevas tecnologías como los inmunoensayos de fluorescencia de polarización, el uso de polímeros de impronta molecular (MIPs) [42], la espectroscopía UV [15] o infrarroja [69] o los sensores ópticos como la Resonancia de Plasmón Supericial (SPR) [70]. El método de referencia según la AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para la determinación de DON es la cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta (HPLC-UV-Vis) ya que el DON carece de propiedades fluorescentes (propiedades fluorescentes limitadas) [71], y por ser un método robusto y exacto. Por contra, el HPLC-UV-Vis necesita largos tiempos de análisis, y es un método poco económico y ecológico debido al elevado consumo de reactivos y disolventes orgánicos que se precisan [72], necesita instrumentación sofisticada y poco económica, así como una alta cualificación del personal técnico en las operaciones analíticas y en el manejo de la instrumentación [73]. Por las razones anteriores, los métodos alternativos más comunes y con mayores ventajas para la determinación de DON y de otras micotoxinas son los basados en inmunoensayos, [74; 75] sobre todo los ensayos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) convencionales que utilizan un anticuerpo (monoclonal o policlonal) selectivo al deoxinivalenol como elemento de biorreconocimiento y llevan a cabo una detección espectrofotométrica. Además aprovechando las reacciones de afinidad entre un anticuerpo y un antígeno y basándose en el procedimiento que ocurre en un ensayo ELISA, actualmente se están desarrollando diferentes inmunosensores electroquímicos y ópticos. 1.2. Deoxinivalenol 11 Los inmunosensores para la determinación de DON no han sido muy desarrollados hasta el momento, a diferencia de los muy diversos y numerosos ensayos ELISA. Se han desarrollado diferentes sensores que utilizan técnicas electroquímicas, como la voltametría cíclica (VC) [76] o la cronoamperometría (CRA) [77] para llevar a cabo las determinaciones de DON y otros inmunosensores basados en una detección óptica que aprovecha las propiedades de absorción de la etiqueta que se conjuga con el DON para obtener la señal analítica, los cuáles se describen más adelante. Los resultados obtenidos con los sensores electroquímicos existentes, en muestras de alimentos (maíz, trigo o alimentos preparados de origen cereal) demuestran que son unas potentes y novedosas herramientas analíticas para la determinación de DON, manteniendo una alta correlación con los resultados obtenidos con la metodología oficial (HPLC-UV-Vis). Debido a los buenos resultados observados en los inmunosensores encontrados y a los escasos dispositivos desarrollados se decidió comenzar la optimización de un inmunosensor directo para la determinación de DON para su aplicación sobre muestras de cereales. El inmunosensor desarrollado en el trabajo de esta memoria tiene como principal objetivo disponer de un dispositivo pionero en la determinación cuantitativa y sensible de DON en muestras contaminadas de cereales y con las mejores propiedades analíticas, además de proporcionar sencillez y portabilidad. Su desarrollo se ha plasmado finalmente en una patente (Anexo I) que actualmente se encuentra en tramitación en la OEPM (Oficina Española de Patentes y Marcas). 1.2.1 Toxicidad del deoxinivalenol Como sucede con el resto de las micotoxinas, es muy importante tener en cuenta los efectos adversos que el DON puede tener sobre la salud humana y animal. Los peligros asociados con tricotecenos fueron reconocidos por primera vez en intoxicaciones producidas sobre el ganado, causadas por la ingestión de alimentos contaminados. Por lo tanto se comenzaron con estudios en animales vivos y con estudios in vitro, a través de los cuales han identificado posteriormente otros nuevos efectos tóxicos de este grupo de micotoxinas [6]. La ingestión de DON ha ocasionado brotes de micotoxicosis agudas en la población de la India, China y zonas rurales de Japón. Un grave brote surgido en China entre los años 1984-1985 debido al consumo de maíz y trigo mohosos provocó que en un plazo de entre cinco y treinta minutos aparecieran entre otros síntomas no conocidos como náuseas y vómitos, de ahí que al DON se le conozca vulgarmente con el nombre de vomitoxina. Además aparecieron dolores abdominales, diarrea, mareos y cefaleas [78; 79]. 12 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN La toxicidad que presenta el DON (y en general del resto de tricotecenos) en alta dosis se caracteriza por efectos tales como toxicidad hematológica, toxicidad cardiovascular y toxicidad gástrica produciendo diferentes efectos como diarreas, vómitos, leucocitosis, apoptosis, hemorragias, e incluso la muerte, mientras que la toxicidad aparecida en dosis bajas se caracteriza por la disminución del apetitito llegando incluso a producir anorexia, reducción de la ganancia de peso, disminución de la eficiencia nutricional, cambios neuroendocrinos y efectos perjudiciales sobre el sistema inmunológico [6; 80]. Básicamente, los tricotecenos se unen a los ribosomas eucariotas e inhiben la síntesis de DNA y RNA y de proteínas ribosómicas mediante el bloqueo de la traducción y la inhibición de la elongación de las cadenas peptídicas, además de la aparición de un efecto hemolítico en los eritrocitos. El efecto de los tricotecenos sobre el sistema inmune, paradójicamente puede ser a la vez estimulante y supresor. La hematotoxicidad es un síntoma importante común que se observa en los seres humanos después del consumo de alimentos contaminados con tricotecenos, que se ha observado para las toxinas T-2 y HT-2, pero que no aparece tras el consumo de alimentos contaminados por DON [81]. Del mismo modo puede descartarse la actividad carcinogénica y genotóxica del DON según los datos de la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (IARC) [82]. El DON no ha mostrado efectos teratogénicos con las pruebas realizadas sobre ratones, ratas y conejos, pero si se ha observado que dependiendo de la concentración administrada produce descensos en la fertilidad. Por todos los efectos detallados y con los datos de los que se dispone, se ha estimado la toxicidad en humanos en un valor NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level) de 100 µg Kg-1 de peso corporal por día [80; 81]. Los productos alimenticios infectados por hongos en el campo o durante la cosecha o el almacenamiento pueden contener de forma concomitante otros grupos de micotoxinas (no sólo tricotecenos ) [83]. Esta co-existencia de micotoxinas puede ser el resultado de la producción de varias micotoxinas por una especie de hongo en particular o incluso resultar de varias especies de hongos productores de micotoxinas diferentes que crecen al mismo tiempo o con posterioridad uno del otro. En un estudio sobre la inducción potencial de una enfermedad renal se probó si un consumo combinado de diferentes micotoxinas podría representar un posible riesgo mayor que la ingesta de una única micotoxina. Se ha demostrado que distintos factores que actúan juntos a través de mecanismos similares o diferentes podrían contribuir teóricamente al desarrollo de la enfermedad. Los factores mencionados fueron las micotoxinas (DON, fumonisinas, ocratoxina A), además de otros agentes infecciosos, endotoxinas y estrés oxidativo [6]. 1.2. Deoxinivalenol 19 anticuerpos selectivos a un solo analito, con bajas reactividades cruzadas con productos de naturaleza semejantes [111; 112]. Por todas las características descritas, los métodos ELISA espectrofotométricos aparecen como la principal alternativa a los métodos de determinación de DON oficiales como el HPLC-UV-Vis por sus ventajas en los análisis rutinarios, lo que hace que numerosas casas comerciales hayan desarrollado diferentes kits ELISA que permiten la determinación cuantitativa de la concentración de DON en muestras contaminadas con diferentes prestaciones analíticas [113]. La mayoría de ELISAs utilizan medidas de absorción molecular de productos generados tras la reacción enzimática realizada por la etiqueta (en muchos casos HRP o alcalino-fosfatasa), aunque también es posible medidas de fluorescencia molecular [114; 115]. Los primeros ELISAs espectrofotométricos de DON se describen en el año 1988, utilizando calibrados competitivos directos e indirectos sobre un anticuerpo monoclonal entre la micotoxina libre y la marcada con albúmina sérica humana (DONHSA). Se obtuvo un mayor rango de concentraciones de trabajo con el inmunosensor directo (0,2 a 5,0 µg ml-1) que con el inmunosensor indirecto (0,2 a 2,0 µg ml-1) [116]. Otros de los primeros ensayos ELISA para la determinación de DON fueron descritos en los años 1990 [117] y en 1991 [74] basados en ambos casos en inmunoensayos competitivos de DON y DON marcado con albúmina sérica bovina (BSA) y con peroxidasa (HRP) respectivamente, utilizando como elemento de biorreconocimiento un anticuerpo policlonal [74; 117]. Una de las principales dificultades en el inmunoensayo del DON es la forma de realizar la unión de la micotoxina al enzima u otra proteína para sintetizar conjugados competitivos, y también en esta unión para crear moléculas de gran tamaño inmunogénicas capaces de crear anticuerpos en el organismo animal correspondiente. Igualmente, esta conjugación puede modificar las propiedades químicas de la micotoxina, modificar la afinidad de los anticuerpos utilizados, o incluso hacer desaparecer su capacidad de biorreconocimiento, si por ejemplo un grupo funcional de la molécula es el grupo reactivo de enlace covalente y a la vez constituye un epítopo reconocido por el anticuerpo, por lo que ha de haber una coincidencia de grupos funcionales utilizados en la síntesis del inmunógeno y en el conjugado competitivo utilizado en el inmunoensayo [105]. La reacción más utilizada para la formación de conjugados micotoxina-proteína es la reacción de la carbodiimida, pero se trata de una reacción no selectiva y que puede producir la unión a través de uno o más de los hidroxilos de los carbonos 3, 7 y 15 aunque el hidroxilo del carbono 7 es poco reactivo por la presencia del carbonilo en el carbono 8 (Ver figura 1). Por lo tanto con la reacción de carbodiimida se obtiene una 20 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN mezcla de conjugados de DON unidos en el extremo C-3, C-15, o ambos, lo que modifica arbitrariamente su reconocimiento por el anticuerpo [95]. En la actualidad, aunque muchos de los grupos de investigación continúan sintetizando sus propios conjugados [59; 101] se tiende al uso de conjugados ya sintetizados y purificados, y perfectamente caracterizados (relación molar y pureza) generalmente por GC/MS o por MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization con detector de iones de tiempo de vuelo) donde la ausencia de DON libre en el conjugado y su presencia en el producto de hidrólisis confirma la unión covalente del DON en la proteína [111]. En la bibliografía científica se describen procedimientos competitivos muy semejantes entre sí, en los que se utilizan diferentes marcadores para el DON como son la albúmina sérica humana (HSA) [74], albúmina sérica bovina (BSA) [117; 118], ovoalbúmina (OV), peroxidasa de rábano picante (HRP) [68] y otras proteínas de gran tamaño que permiten en la preparación del conjugado y su purificación por cromatografía de exclusión molecular después de su síntesis, en lugar utilizar diálisis, que es mucho menos selectiva y especialmente lenta (tiempos próximos a 3 días) [111]. Varias casas comerciales han desarrollado kits ELISA para el DON con diferentes prestaciones analíticas y que suponen un avance importante en el control de micotoxinas en alimentos [16]. Algunos de estos kits ELISA comerciales se recogen en la siguiente tabla (Tabla 6): CASA COMERCIAL Pocillos Tipo LOD (µg l-1) Rango lineal (µg l-1) Recuperación ROMER 96 Directo 200 250-5000 - AGRAQUANT 48 Directo 200 250-5000 - RISDASCREEN 96 Directo 3,7 3,7-100 85-110% RISDASCREEN FAST 96 Directo 200 200-6000 - ZEU INMUNOTECH 96 Directo 1,5 0,313-10 80-110% NEUROGEN VERATOX HS 48 Directo LOQ = 25 0-250 - NEUROGEN VERATOX DON 5/5 48 Directo 100 0-2000 - HELICA 96 Directo 0,15 0-200 - ANTIBODIES ONLINE 96 Directo <200 0-400 >80% Tabla 6: Métodos de inmunoensayo ELISA comerciales para la determinación de DON Los kits ELISA comerciales para la determinación de DON ofrecen numerosas ventajas mencionadas anteriormente, pero también presentan limitaciones. El principal inconveniente de estos kits está en el hecho de que son de uso individual lo que puede 1.2. Deoxinivalenol 21 aumentar el coste económico así como posibles falsos positivos y falsos negativos que pueden aparecer, además de la necesidad de etiquetado del analito [9]. Otros inconvenientes de los ensayos ELISA están relacionados con la alta dependencia de la matriz que puede originar importantes interferencias (efecto matriz) y la reactividad cruzada de los anticuerpos que debe estudiarse y considerarse en el análisis cuantitativo [119]. Otra posibilidad muy novedosa, de reciente aparición son los métodos ELISA electroquímicos realizados sobre placas dotadas de 96 pocillos estándar con sus correspondientes electrodos serigrafiados, constituyendo cada uno de ellos una celda electroquímica completa (figura 5), incluidos en microplacas de 96 pocillos [23]. A este novedosa técnica se le conoce con el acrónimo de ELIME (Enzyme-LinkedImmunomagnetic-Electrochemical assay) y de momento hay muy escasas aplicaciones en micotoxinas y para el DON, aunque se trata de una posibilidad futura muy interesante [120]. Figura 5: Placa con array de 96 SPCEs colocados en el fondo de una placa de 96 pocillos [121] El uso del ELIME viene dado por las ventajas que aportan las medidas electroquímicas sobre las espectrofotométricas, entre las que se incluyen la posibilidad de aumento de la velocidad, la miniaturización, la multiplexación, el bajo coste de la instrumentación, la posibilidad de realizar análisis in situ y la insensibilidad a las muestras turbias se encuentran entre las otras ventajas de esta técnica [77; 122]. Las sensibilidades son similares o incluso superiores con respecto a los ELISAs ópticos convencionales [122; 123]. La adaptación de un ensayo ELISA a un enfoque electroquímico no es un proceso sencillo. De hecho, a pesar de que el formato de ensayo y los pasos generales de análisis son semejantes, varios factores deben tenerse en cuenta para lograr resultados comparables o incluso mejores que los del método ELISA. Por ejemplo, la selección y optimización de la superficie del electrodo que se utiliza como soporte para la inmovilización del elemento de biorreconocimiento (anticuerpo o antígeno), la elección del sustrato enzimático que debe conducir a un producto electroactivo, la 22 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN selección de los métodos electroquímicos más apropiadas (frente a la medida de la absorbancia) y del instrumento adecuado son algunos de los factores más importantes a considerar en la adaptación de un ELISA óptico en una plataforma electroquímica [100]. Como contraprestación, la transducción electroquímica aporta ventajas que ya se han comentado. Los protocolos de trabajo basados en el ELIME utilizan partículas magnéticas funcionalizadas como superficie de inmovilización para la cadena inmunoquímica, y electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) como transductores electroquímicos [122]. Existe un inmunoensayo ELIME para la determinación de DON (y del resto de tricotecenos) rápido y sensible en muestras de trigo. En este último caso, el procedimiento es demasiado complicado aunque sensible (LOD = 1,1 µg g-1 DON), pues se requiere de la hidrólisis del DON con microondas para su transformación en una molécula electroactiva y posterior detección voltamétrica sobre los electrodos serigrafiados [124]. 1.2.3.2 Determinación de DON mediante inmunosensores: Los inmunosensores para la determinación de DON en alimentos no son muy comunes. Pese a los numerosos kits ELISA convencionales que hay disponibles para el DON, se han descrito en la bibliografía científica muy escasos trabajos que hayan desarrollado inmunosensores para esta micotoxina, al contrario de lo que ocurre con otras micotoxinas como por ejemplo las aflatoxinas y la ocratoxina A [125]. Entre los inmunosensores más importantes utilizados para la determinación de DON además de los sistemas ELISA cabe destacar la técnica de Resonancia de Plasmón Superficial (inmunosensor óptico) y los inmunosensores electroquímicos basados en una reacción competitiva [70; 76; 77; 99] Los ensayos basados en la detección por Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) al igual que los biosensores basados en la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), producen la señal analítica a través de los cambios de masa depositada sobre la superficie del sensor (variación en el índice de refracción producidos por cambios de masa), ofreciendo así la posibilidad de proporcionar estrategias libres de etiquetado para la obtención de la señal analítica [23]. Además se han registrado dos inmunosensores para la determinación DON basados en técnicas ópticas como la interferometría bicapa (BLI) y la espectroscopia de onda óptica LightMode (OWLS) [126; 127]. El inmunosensor basado en la detección por BLI utiliza un conjugado de un anticuerpo con oro y se produce una amplificación de señal 1.2. Deoxinivalenol 23 debida a las AuNPs que permite el desarrollo de ensayos cualitativos y cuantitativos rápidos. El límite de detección del método fue 0,09 mg kg-1 y unos porcentajes de recuperación en trigo en el intervalo de 0,2 a 5 mg kg-1. Los resultados obtenidos, sugieren que la técnica BLI se puede utilizar para medir DON en el trigo rápidamente [126]. El inmunosensor basado en la espectroscopia “Optical Waveguide Light Mode” (OWLS) consiste en una técnica libre de etiqueta para la detección de DON utilizando anticuerpos policlonales específicos. Después de la inmovilización del anticuerpo (ensayo directo) o del conjugado de DON (ensayo indirecto), se utilizó un sistema de análisis de inyección de flujo [127]. - Inmunosensores de DON basados en resonancia de pasmón superficial (SPR) En el trabajo experimental de esta Tesis Doctoral se ha utilizado la técnica de espectrosocopía de resonancia de plasmón superficial (SPR) para la caracterización de los anticuerpos de DON, por lo que se describe brevemente su fundamento y aplicaciones en inmunosensores de DON. La espectroscopía de resonancia de plasmón superficial (SPR) se basa en la interacción de radiación electromagnética polarizada con la interfase entre un metal (normalmente oro) y un dieléctrico (un prisma). Bajo ciertas condiciones, y para un cierto ángulo de incidencia (ángulo de resonancia), se produce una onda evanescente cuya energía puede ser absorbida por las oscilaciones colectivas de los electrones de conducción del metal (denominado plasmón superficial) [70]. Este ángulo de resonancia es particularmente sensible al índice de refracción en las proximidades de la interfase, de tal manera que cambios debidos a interacciones macromoleculares sobre esta interfase (por ejemplo la unión de antígenos sobre una monocapa de anticuerpos inmovilizados sobre el metal [99]) pueden seguirse cinéticamente y permiten cuantificar las cantidades de micotoxinas de una muestra [105]. La alta popularidad de esta técnica en el desarrollo de nuevos inmunosensores de DON (y de otras micotoxinas) es debido a su alta sensibilidad (permite determinar concentraciones del orden de picomolar, con límites de detección del orden de 200 Da), ser capaz de medir las interacciones de los anticuerpos en tiempo real y sin necesidad de etiquetado, y al cálculo de constantes de afinidad en estudios de caracterización de estos inmunosensore [128]. Los dispositivos SPR presentan una ventaja frente a otros inmunosensores como es la facilidad de regeneración del chip para la reutilización en múltiples mediciones. Otra de sus principales ventajas es que no necesita etiquetado para la obtención de la señal, al medir directamente índices de refracción relacionados con cambios de masa. 24 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN Sus principales desventajas son el elevado coste de la instrumentación y la dificultad de manejo. El SPR se considera una valiosa herramienta con la que obtener resultados en poco tiempo (aproximadamente 9 minutos cada muestra) y con la que es relativamente fácil realizar determinaciones sobre muestras de maíz o trigo para la determinación de DON con DSR < 10% y recuperaciones entre 92 y 115% para todas las matrices [129]. No obstante, la sensibilidad del SPR es relativamente baja en comparación con los inmunoensayos enzimáticos e inmunosensores, ya que generalmente no existe ninguna mejora ni amplificación de la señal [105]. En nuestro trabajo el uso del sensor SPR ha resultado una técnica muy útil para la caracterización de la afinidad de los biorreactivos que hemos utilizado en el inmunosensor y para el estudio de posibles uniones inespecíficas de anticuerpos, conjugados, DON y HRP. Figura 6: Esquema de la etapa de interacción antígeno-anticuerpo y su transducción SPR [108] Los inmunoensayos basados en SPR han sido desarrollados para algunas micotoxinas como fumonisinas [130], aflatoxina B1 [131] y deoxinivalenol [129] aunque solamente para el DON se ha aplicado en muestras de cereales [70; 87]. Nuestro grupo de investigación GEAS tiene una gran experiencia en el desarrollo de nuevos detectores basados en la resonancia de plasmón superficial [132; 133], y su uso como alternativa a detectores de índice de refracción en HPLC [133; 134]. Otros grupos de investigación han centrado su trabajo en el desarrollo de instrumentos de SPR de fabricación casera con el fin de reducir el alto coste de los equipos comerciales, superando así una de las principales razones de su uso limitado [23]. Este es el caso del dispositivo desarrollado por Nabok [135] para la detección de la toxina T-2, aunque presenta muy baja sensibilidad. El instrumento desarrollado por Mullett [130] para la FB1 tuvo una alta sensibilidad (LOD = 50 ng ml-1) en un ensayo 1.2. Deoxinivalenol 25 directo mediante la acumulación de la toxina en la superficie del chip. Cabe destacar también el dispositivo SPR pequeño y portátil desarrollado por Van der Gaag [36] con el beneficio adicional del procedimiento descrito para la detección simultánea de varias micotoxinas (DON, AFB1, FB1 y ZEA) en cuatro celdas de flujo conectadas en serie, donde se llevaron a cabo los ensayos competitivos. Los ensayos SPR se seleccionan dependiendo de las características del analito, del tipo de muestra y de la sensibilidad del instrumento. La detección mediante ensayos directos es sólo útil para moléculas con alto peso molecular superior a 10 kDa. Sin embargo, el DON es un compuesto químico pequeño (296,32 Da), con masa insuficiente para provocar un cambio grande en el índice de refracción, por lo que debido a la dificultad para detectar directamente se han desarrollado nuevas estrategias, como la inmovilización de la micotoxina sobre la superficie del chip (superficie sensora) dando ensayos indirectos o la realización de ensayos directos trabajando con el DON conjugado a una molécula de alto peso molecular, por ejemplo una proteína [23; 70; 136]. La inmovilización directa del conjugado DON–proteína sobre la superficie del chip en ensayos indirectos, proporciona una superficie sensora muy estable en comparación con la inmovilización directa de anticuerpos, los cuales además son susceptibles de desnaturalización y degradación con el tiempo [87]. Para la determinación de DON se han descrito ensayos indirectos utilizando el SPR, mediante la inmovilización de DON-BSA [99], DON-Biotina [87], DON-Caseína [70] o diferentes conjugados DON-proteína [129] sobre la superficie del chip, realizando en todos los casos una activación inicial de la superficie del chip con EDC + NHS, previa a la inyección del conjugado de DON en un pH próximo a 5 (tampón de acetatos). A continuación se procedió a la inyección del anticuerpo (policlonal o monoclonal) obteniéndose las uniones antígeno-anticuerpo correspondientes en cada caso. En los resultados obtenidos, la sensibilidad ha sido suficiente (µg l-1) para la determinación en muestras contaminadas [87]. Es también habitual una etapa de bloqueo con etanolamina con el objetivo de cubrir los huecos reactivos libres sobre el chip después de la inmovilización del anticuerpo [87; 99]. En general, deben ser considerados y controlados los mismos aspectos críticos que en otros inmunoensayos, aunque para los ensayos basados en SPR los efectos de la matriz de la muestra y la reactividad cruzada de los anticuerpos son más importantes que en otras técnicas. Se han registrado también ensayos basados en el SPR para la determinación simultánea de ZEA y DON mediante un inmunoensayo competitivo, entre las micotoxinas libres y las marcadas enzimáticamente de un modo similar a los ensayos ELISA competitivos, mostrando límites de detección muy bajos (ZEA 16 ng ml-1 y DON 26 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN 10 ng ml-1) y una buena correlación de los resultados comparando con HPLC-MS [137]. Además se tiene constancia de la existencia un inmunosensor que utiliza MIPs para el reconocimiento del DON y cuya detección se lleva a cabo con un instrumento SPR. El polímero de impronta molecular, junto con el DON fueron inmovilizados sobre la superficie del chip de oro y se obtuvo un LOD de 1 ng ml-1 [138]. - Inmunosensores electroquímicos de DON Los biosensores (inmunosensores, aptasensores) electroquímicos aportan numerosas ventajas sobre los métodos de detección óptica, sobre todo en relación a su sensibilidad, sencillez e instrumentación pequeña y de fácil portabilidad. La posibilidad de miniaturizar los electrodos (soporte de la transducción), la capacidad de multiplexación y su adecuación para volúmenes muy pequeños (del orden de 5-50 μl o incluso nanolitros), o la posibilidad de producción de electrodos serigrafiados económicos y en gran escala son otras ventajas que hacen el enfoque electroquímico atractivo para abordar el desarrollo de nuevos inmunosensores. En la mayoría de los casos los anticuerpos y antígenos son incapaces de reaccionar con un par redox por sí mismos, por lo que es necesario incluir en el ensayo un marcado enzimático a alguno de los componentes. En nuestro caso se utilizó un conjugado de DON marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) dando una reacción competitiva por su unión a un anticuerpo específico. Dado que las interferencias electroactivas son relativamente escasas, la detección electroquímica para interacciones de tipo antígeno-anticuerpo, pueden ser de gran utilidad en los análisis de alimentos dada la complejidad de sus matrices [66]. Figura 7: Esquema de la etapa de detección en un inmunosensor electroquímico competitivo 1.2. Deoxinivalenol 27 También es importante tener en cuenta que existen diferentes formatos posibles que pueden ser utilizados para desarrollar un inmunosensor electroquímico de modo semejante a los formatos en los ELISA. Los esquemas de inmunoensayo utilizados son los formatos competitivos, tanto directos (inmovilización de anticuerpo) como indirectos (inmovilización del antígeno o el antígeno marcado), como ensayos tipo sándwich (utilizando 2 anticuerpos que se unen al antígeno, solo utilizados con moléculas grandes o que poseen varios epítopos). Generalmente, los formatos más utilizados son los ensayos competitivos directos. Del mismo modo que los ELISA competitivos, los inmunosensores electroquímicos competitivos están basados en la competición del anticuerpo por el analito presente en la muestra y el analito marcado generalmente con un enzima, que es capaz de transformar un sustrato en un producto con propiedades electroquímicas [74]. La etiqueta (enzima) cataliza la transformación de un sustrato, por lo que la detección electroquímica de los productos de la reacción enzimática genera una señal amplificada. De esta forma, en un ensayo competitivo cuanto mayor es la concentración de analito en la muestra, menor unión se va a producir entre el anticuerpo y el analito marcado enzimáticamente, y en consecuencia se obtendrá una menor señal analítica. En este tipo de inmunosensores, a diferencia que en un esquema tipo sándwich, la señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. La principal ventaja que presentan es su elevada sensibilidad para concentraciones de analito muy bajas y cercanas al límite de detección [139]. Para transformar la interacción de la toxina en una señal analítica, se han utilizado una gran variedad de técnicas electroquímicas (amperométrica, potenciométrica, conductimétrica, impedimétrica) [51; 53; 54]. A pesar de la alta sensibilidad de las técnicas electroquímicas tradicionales mencionadas, el desarrollo de dispositivos electroquímicos para la detección de micotoxinas ha sido a menudo limitada por la necesidad de utilizar etiquetas electroactivas sobre el analito [140]. En consecuencia, algunos investigadores han enfocado sus trabajos en técnicas electroquímicas libres de etiquetas alternativas, tales como conductimetría o con Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS) [23]. La amperometría y voltametría en general son, sin duda, los modos de transducción electroquímica más adecuadas debido a su alta sensibilidad y la respuesta de trabajo en un amplio intervalo de concentraciones de micotoxina. La amperometría es ampliamente utilizada y se basa en la medición de una corriente frente a un potencial fijo o variable [2]. Se han desarrollado una gran variedad de inmunosensores electroquímicos para micotoxinas con LOD que se encuentran en intervalos de 0,5 - 20 28 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN ng ml-1 y que son válidos para rangos de concentraciones que abarcan desde 1 a 100 ng ml-1 [4]. Sin embargo para el DON la existencia de biosensores electroquímicos es limitada pese a sus múltiples ventajas, lo que abre una posibilidad de desarrollo de novedosos dispositivos sensores eficaces y selectivos. Por otro lado, la Espectroscopía de Impedancia Electroquímica (EIS) es una técnica poderosa, muy sensible y no destructiva que permite estudiar las propiedades eléctricas que ocurren en la interfase del dispositivo de detección y así realizar el seguimiento de las reacciones que se producen en el mismo [51; 141]. Es una técnica en la que se modelizan los cambios producidos en la resistencia de transferencia de electrones sobre la superficie del electrodo de trabajo resultante de la complejación de las micotoxinas en el rango de concentraciones de 1 - 20 ng ml-1, obteniéndose límites de detección de aproximadamente 0,5 ng ml1. Una de las principales ventajas de los inmunosensores EIS es que no necesitan el etiquetado del analito para producir la señal electroquímica [54]. Esto implica la dificultad añadida de modificación de la superficie del electrodo. Las reacciones antígeno-anticuerpo provocan cambios en la impedancia electroquímica sobre el electrodo de trabajo, medidas habitualmente con un indicador electroquímico (frecuentemente el sistema redox ferro/ferri-cianuro), que se ajustan a un modelo teórico y se relaciona con las concentraciones implicadas. Para el caso concreto del DON, en la actualidad no hay descritos muchos inmunosensores electroquímicos, a diferencia de para otras micotoxinas como la OTA o las aflatoxinas, por lo que los avances obtenidos en esta Tesis Doctoral abren un importante camino para la determinación de DON mediante inmunosensores con detección electroquímica, buscando una mejora en los escasos dispositivos existentes en la actualidad. Otros inmunosensores electroquímicos descritos en la bibliografía son los inmunosensores potenciométricos [142] y conductimétricos [140] para el DON, aunque son mucho menos utilizados debido a la baja relación señal/ruido que producen y pequeña sensibilidad [143]. Los dispositivos potenciométricos (electrodos selectivos) detectan cambios en el potencial trabajando a corriente cero, mientras que los dispositivos conductimétricos detectan cambios en la conductividad entre los dos electrodos. También se ha desarrollado un importante subgrupo de los biosensores potenciométricos, como son los transistores de efecto de campo químicamente sensibilizados (CHEMFET) que han sido utilizado en algunas ocasiones para la detección de DON, aunque para concentraciones altas [143]. Se han desarrollado otros biosensores para la determinación de DON en cereales con técnicas electroquímicas, como la voltametría cíclica (VC) [76] o la cronoamperometría (CRA) [77]. El primero de ellos consiste en un inmunosensor directo que se realiza por 1.3. Anticuerpos como elemento de biorreconocimiento 35 producir en gran escala a partir de células de Escherichia coli a bajo coste, surgiendo como una alternativa eficaz a los anticuerpo monoclonales [101]. Desde la primera descripción de anticuerpos para micotoxinas por el grupo de F.S Chu en la década de 1970, cientos de artículos publicados describen anticuerpos antimicotoxina y su uso para analizar alimentos, piensos y otros materiales y para su uso en inmunoensayos [173]. Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales han sido producidos para la mayoría de las micotoxinas, aunque sus propiedades varían ampliamente. Los primeros anticuerpos selectivos al DON se describen en el año 1988. Mediante un procedimiento para la derivatización selectiva del OH del carbono 3 de DON con ácido succínico, dando 3-0-hemisuccinyldeoxynivalenol, que se conjugó a albúmina de suero bovino (BSA) a través de su carboxilo libre grupo. Este conjugado DON-BSA se utilizó luego como un inmunógeno en la etapa de inmunización in vivo del ratón. El anticuerpo monoclonal resultante reaccionó bien con DON y 3-acetil-DON y algo menos con otros tricotecenos, incluyendo 15-acetil DON [116]. La investigadora más relevante en cuanto a producción y caracterización de anticuerpos anti-DON es Chris M. Maragos, (Mycotoxin Research Unit, National Centre for Agricultural Utilization Research (USDA/ARS) San Pretoria, IL-USA) [59; 95; 174], quien gran parte de su trabajo se ha basado en el desarrollo y producción de nuevos anticuerpos monoclonales para el DON, que mejoraran la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos policlonales ya existentes, a través de la síntesis de nuevos inmunógenos. En este sentido, la molécula de DON ofrece varias posibilidades de conjugación con varios grupos funcionales disponibles. Por ejemplo, mediante la reacción de la carbodiimida entre los grupos hidroxilo del DON y los grupos amino en las proteínas portadoras (enlace carbamato) [74; 175]. Para la producción de mAbDON, diez hembras de ratón fueron inicialmente inmunizadas mediante la inyección de 95 µg de DON-OVA por animal, seguidas de hasta 4 dosis repartidas en un espacio de aproximadamente 3 meses. Uno de los mAbs resultantes (derivado del clon #22) se utilizó en un ELISA sensible para DON y 3-AcDON en el trigo por su alta especificidad y sensibilidad [59; 95]. 36 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN Figura 8: Etapas para la producción de anticuerpos monoclonales por inmunización de ratones. Figura extraída de la referencia [176] Los anticuerpos anti-DON generados, en algunas ocasiones fueron tratados con agentes reductores o enzimas proteolíticas para generar fragmentos que retienen la región de unión al antígeno (Fab) y pueden producir un aumento de la afinidad y especificidad por su menor tamaño [171; 174]. Además es posible con las tecnologías recombinantes aislar las porciones variables de la inmunoglobulina que están involucrados principalmente con la unión de la toxina. Los fragmentos Fab se muestran como una alternativa a los anticuerpos completos, y su tamaño más pequeño contribuye a la minimización de la unión no específica debido a las interacciones a través del fragmento Fc y a la disminución del impedimento estérico en esquemas heterogéneos [77]. Para el procesos de inmunización y producción de anticuerpos selectivos, es necesario que el DON se una a proteínas portadoras adecuadas ya que el DON es una molécula no inmunogénica pequeña (haptenos) y por si solas no son capaces de inducir la respuesta inmune adecuada en el organismo de un animal vivo [117]. Esto implica la posibilidad de aparición de algún tipo de afinidad para la proteína portadora, por ejemplo, de BSA [177]. Debe tenerse en cuenta el conjugado de DON utilizado y el carbono por el que se produce la unión con la proteína portadora (los carbonos más activos de la molécula de DON son C3 y C15), porque la probabilidad de que el anticuerpo tenga reactividad cruzada por un derivado de DON será mayor para los análogos que tienen un grupo oacetilo en el carbono a través del cual se preparó el conjugado [59]. De la inmunización realizada con los derivados acetilados, podría esperarse anticuerpos que reconocen principalmente al 3-Acetil-DON, 15-Acetil-DON, y 3,15-Diacetil-DON, pero que además 1.3. Anticuerpos como elemento de biorreconocimiento 37 podrían tener una reacción cruzada con DON [111; 116; 178]. Por ejemplo, cuando la unión de la proteína portadora al DON se realiza a través del hidroxilo del carbono 3, la actividad observada para el 3-Acetil-DON fue mayor que para el DON [116]. En segundo lugar, si los derivados acetilados de DON (3-Acetil-DON y 15-Acetil-DON) se utilizan como inmunógenos con la proteína portadora en el carbono no acetilado, la actividad del anticuerpo será con toda seguridad mayor para el compuesto de DON acetilado utilizado para preparar el conjugado, y menor hacia el derivado de DON acetilado en el mismo sitio que el sitio de la conjugación de la proteína portadora. Es decir, cuando 3-Acetil-DON se utilizó para preparar un inmunógeno mediante la unión de la proteína a través del carbono 15 de la resultante anticuerpos eran más específicos para la 3-Acetil-DON que para 15-Acetil-DON [110]. De todo lo anterior se extrae que los grupos acetilo, así como su posición son importantes para provocar la respuesta inmune del animal y en último término, para el reconocimiento del DON en su aplicación posterior de inmunoensayo. Cuando un grupo acetilo está presente, los anticuerpos que resultan son altamente específicos para su detección. Alternativamente, si no hay grupos acetilo la mejor respuesta del anticuerpo se produce en la región a través de la cual se hizo la conexión. Con lo cual se sugiere una estrategia para preparar el inmunógeno mediante un enlace en sitios distintos de la hidroxilos (C3 y C15), tales como en el carbonilo del carbono 8 o en el epóxido del los carbonos 12,13 para obtención satisfactoria de anticuerpos que no desarrollen reactividad cruzada con los derivados acetilados del DON, los cuales tienen una presencia natural en cereales (y capacidad contaminante) similar a la del DON [59]. Un enfoque indirecto, pero genérico y muy sensible para detectar el DON y sus derivados acetilados es el uso de anticuerpos que poseen una reactividad cruzada con 3-acetilDON o con triacetilDON y realizar una detección de "DON total" después de la acetilación total de estas toxinas en los extracto de la muestra, dada la dificultad de producir anticuerpos selectivos a DON y donde no se aprecie reactividad cruzada con dichos productos acetilados, pero en este caso no podría conocerse la cantidad exacta de DON ni el riesgo toxicológico individual que puede producir [179; 180]. 1.3.2. Anticuerpos selectivos al deoxinivalenol: inmunoensayos. Se han descrito anticuerpos específicos para todos los derivados del DON, excepto para el nivalenol (NIV), aunque se han realizado varios intentos hacia este último, o se ha determinado con anticuerpos selectivos al DON con alta reactividad cruzada con el 38 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN NIV. Esto demuestra que las pequeñas diferencias existentes en las estructuras moleculares, por ejemplo entre el DON y el NIV que se diferencian únicamente en un grupo OH (Tabla 2) pueden alterar fuertemente las propiedades inmunoquímicas de biorreconocimiento hacia esta micotoxina y su toxicidad (toxicidad del NIV es muy inferior a la del DON) [105]. La síntesis de anticuerpos específicos para el DON, comentada en el apartado anterior, ha permitido el desarrollo de una gran variedad de inmunoensayos basados en el reconocimiento de cualquier epítopo libre en la molécula de DON. Por lo general, los anticuerpos con alta selectividad y alta afinidad frente al DON, se pueden producir de forma relativamente barata, y por esta razón se han incorporado a un gran número de formatos y dispositivos de ensayo, facilitando así la determinación de DON en ensayos de rutina [181]. En general, los formatos diseñados que contienen anticuerpos se dividen en dos grupos: en los que se utiliza el anticuerpo para aislar y purificar las toxinas, como por ejemplo en las columnas de inmunoafinidad (IAC), y en los que la interacción entre el anticuerpo y la toxina es la base para la detección (inmunoensayos) [171]. El principal inconveniente de los anticuerpos de DON es la reactividad cruzada que puede existir con otras micotoxinas o derivados por la similitud en sus estructuras químicas. En el caso de DON y tal como se ha indicado anteriormente, puede aparecer reactividad cruzada con el NIV, los compuestos acetilados del DON (3-AcetilDON y 15AcetilDON), provocando que los resultados analíticos obtenidos se puedan interpretar erróneamente. La reactividad cruzada excesiva no permite comprobar el cumplimiento de las normas legales, pero permite una evaluación general de riesgos para los consumidores [96]. Un ejemplo es la producción del anticuerpo a través de un conjugado DON-BSA unido por la posición 15 del DON (reacción de unión de la BSA con el derivado 15-AcetilDON), que posteriormente mostró alta especificidad tanto para el DON como para el 15-AcetilDON [111] o por el contrario, realizar la inmunización a través de un derivado del compuesto 3-AcetilDON y que por lo tanto el anticuerpo generado lo reconozca selectivamente [181]. Existe una amplia variedad de anticuerpos de DON monoclonales [59; 111; 116; 178] y policlonales utilizados en inmunoensayo, [67; 74; 175; 182], que se diferencian especialmente en su modo de producción durante la inmunización del animal y por lo tanto en la reactividad cruzada desarrollada por moléculas de estructura similar al DON. Estos anticuerpos, son la también la base de numerosos kits comerciales. 1.4. Partículas magnéticas como superficie sólida de inmovilización en el inmunoensayo 39 1.4 PARTÍCULAS MAGNÉTICAS COMO SUPERFICIE SÓLIDA DE INMOVILIZACIÓN EN EL INMUNOENSAYO En los últimos años han surgido grandes avances científicos sobre los biosensores convencionales de micotoxinas y en la mejora de sus propiedades analíticas. Una de las áreas más activas es el uso de nanomateriales y su nanoestructuración [28; 183], por ejemplo utilizando nanopartículas de oro [25] o nanotubos de carbono [28; 49; 169]. La nanoestructuración aportan ventajas en los biosensores electroquímicos como una mayor área superficial y un incremento en las corrientes obtenidas [49]. Otro de los avances recientes es el uso de partículas magnéticas (MBs) como soporte sólido para la inmovilización del anticuerpo o del antígeno y las reacciones propias del inmunoensayo. Estas partículas magnéticas son atraídas por un campo magnético externo, pero no presentan agregación o atracciones propias en ausencia del mismo (paramagnetismo), por lo que pueden ser manipuladas fácilmente con rendimientos de eficiencia y de separaciones próximos al 100% [169]. Dado que nuestros inmunosensores se basan en estas partículas magnéticas, en este apartado se describe su uso en inmunosensores (micotoxinas, DON) y se comentan sus ventajas. Las MBs se encuentran recubiertas con diferentes grupos de funcionales, tales como estreptavidina, grupos tosilo, grupos amino, grupos carboxilo, anti-anticuerpos genéricos (aIgG) o una variedad de proteínas para la inmovilización rápida y específica del elemento de reconocimiento. Existen partículas magnéticas comerciales provenientes de empresas como Invitrogen, Pierce, Millipore o Promega entre otras [184; 185; 186; 187] y su coste económico depende tanto de su tamaño como del tipo de funcionalización [100]. Es importante seleccionar las MBs óptimas y comprobar la afinidad de cada tipo de MBs por el anticuerpo según su procedencia animal, y seguir las pautas y los procedimientos de inmovilización que se recomiendan según la capacidad de unión teórica y las características de cada una de ellas [41]. 1.4.1. Uso de partículas magnéticas como superficie sólida de un inmunosensor Debido al tamaño y la geometría esférica de las MBs, un gran número de biomoléculas (anticuerpos o fragmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo) se puede inmovilizar sobre la superficie de cada MB lo que lleva a una mejora de la sensibilidad del inmunoensayo y permite reducir los tiempos de reacción y utilizar volúmenes más pequeños de disolución en las etapas de incubación al encontrarse estos ligandos en dispersión [100]. 40 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN Las MBs son partículas esféricas con diámetros habitualmente comprendidos entre 1 y 3 µm, fabricadas con una dispersión de material magnético (núcleo compuesto de Fe2O3 y Fe3O4) y recubiertas con una capa delgada de poliestireno que sirve para definir el área de superficie para la adsorción o acoplamiento de una gran variedad de moléculas funcionalizadas, para su posterior conjugación con micotoxinas, proteínas, anticuerpos, aptámeros, etc. Los diversos tipos de funcionalización, pueden clasificarse en dos grupos según la unión posterior sea: por unión covalente o por afinidad [188]. Si bien los usos de las MBs son múltiples (por ejemplo separaciones selectivas de proteínas), una de las aplicaciones más interesantes se encuentra en los procedimientos de inmunoensayo [26] por la posibilidad de funcionalización de las partículas magnéticas, así como por su capacidad de separación utilizando un campo magnético externo, que provoca una mejora sustancial del rendimiento de los inmunosensores clásicos y facilita enormemente el modo de trabajo [51]. En nuestro laboratorio hemos demostrado que el uso de las MBs mejora el rendimiento de la reacción inmunológica de micotoxinas como la ocratoxina A, debido a un aumento en el área superficial y de la cinética de la reacción provocada por su estado de dispersión en comparación con una superficie sólida de inmovilización del anticuerpo (el analito difunde más fácilmente hacia el anticuerpo) [32; 41; 189]. Su fácil separación bajo la acción de un campo magnético externo mejora enormemente su manipulación en las etapas de separación y de lavado y evita problemas como la influencia de matrices en las reacciones del inmunoensayo [190]. La fácil unión de las MBs a anticuerpos (normalmente por afinidad o por reacciones de unión covalente), en algunos casos de pocos minutos, y su almacenamiento posterior sin pérdida de su capacidad de reconocimiento (hemos llegado a unos 25 días con almacenamiento a 4 °C sin pérdida de capacidad del mAbDON), facilita mucho los procedimientos de inmunoensayo sobre estas MBs [41]. Las MBs han jugado un papel importante en las 3 fases de los inmunosensores de este trabajo: 1) Inmovilización del anticuerpo sobre las MBs. En el caso de reacciones de afinidad, este proceso puede realizarse con incubaciones de tan sólo 10 minutos (por ejemplo con MBs funcionalizadas con proteína G o proteína A). 2) Ensayos competitivos directos sobre las MBs unidas al anticuerpo en sus diversas etapas de incubación, separaciones y lavados [191; 192]. 1.4. Partículas magnéticas como superficie sólida de inmovilización en el inmunoensayo 41 3) Transducción sobre los electrodos de trabajo (SPCEs) de forma localizada, con la ayuda de un campo magnético externo, para realizar finalmente la detección electroquímica de los productos de la reacción enzimática [41]. Una ventaja adicional del uso de MBs es que la inmovilización del elemento de reconocimiento se puede realizar en grandes cantidades en un solo paso y posteriormente, las MBs recubiertas se puede almacenar durante varias semanas sin pérdida de la actividad del anticuerpo almacenado a 4 °C (debe de estudiarse en cada caso), hecho muy importante cuando se espera el análisis de gran número de muestras al reducir el tiempo dedicado. Otra ventaja importante es su confinamiento controlado en la superficie de transducción, por ejemplo sobre el electrodo de trabajo en el caso de transducción electroquímica [2; 41]. Las partículas son paramagnéticas, por lo que en ausencia del campo magnético externo no se produce su agregación. En la bibliografía se describen algunos inconvenientes que en nuestro caso no se han presentado. Por ejemplo, la posibilidad de pasivación del electrodo de trabajo y la aparición de nuevos interferente electroquímicos. En nuestro laboratorio hemos comprobado, que con el tipo de electrodos utilizados, hasta 50 µg de MBs confinadas sobre el electrodo de trabajo no disminuye la transferencia de carga de la detección voltamétrica de la p-benzoquinona [41]. El elemento de biorreconocimiento (anticuerpo), no está en contacto directo con la superficie del electrodo, lo que puede hacer pensar que disminuiría la sensibilidad, pero por el contrario, el uso de superficies magnetizadas en los electrodos ya sea a través de la inclusión en el material de electrodo [193; 194], de partículas magnéticas [41; 195] o a través de la colocación de pequeños imanes debajo de la superficie del electrodo de trabajo [77; 122; 196; 197] permite concentrar y confinar las MBs sobre la superficie del electrodo para la etapa de detección electroquímica [100], consiguiendo que la totalidad de las MBs (que contienen la cadena inmunológica inmovilizada sobre su superficie) se encuentren sobre el electrodo de trabajo, consiguiendo una mayor sensibilidad y una mejora en la reproducibilidad de las medidas electroquímicas. 42 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN Figura 9: Partícula magnética utilizada como superficie sólida de inmovilización del elemento de biorreconocimiento [184] En la tabla 7 se recogen ejemplos de uso de MBs en inmunosensores electroquímicos para diferentes analitos como micotoxinas [77; 122], hormonas (prolactina, testosterona, cortisol) [198; 199; 200], residuos de antibióticos [194] y otros compuestos como hidrocarburos policíclicos aromáticos [201], sulfonamidas [202], etc., para ilustrar la amplia variedad de inmunoensayos posibles debido a las ventajas de su uso. MATERIAL TIPO DE FUNCIONALIZACIÓN REFERENCIAS PARTÍCULAS MAGNÉTICAS (MBs) Grupos amino [203] Grupos carboxilo [204; 205] Enlace avidina/estreptavidina [193; 198; 206] Proteina A/Proteina G [199; 200; 202; 207] Grupos tosilo activados [73; 77; 122; 194; 206] Anticuerpos [120; 201] Tabla 8: Ejemplos de biosensores electroquímicos que utilizan MBs funcionalizadas como superficie de inmovilización Siguiendo esquemas similares de inmovilización de biorreactivos sobre las diferentes MBs, se han desarrollado inmunoensayos basados en ELISA espectrofotométricos, realizando en la mayoría de los casos una reacción enzimática final para la detección óptica del ensayo especialmente, aunque no para el caso del DON que se describen por primera vez en este trabajo [208; 209]. En los últimos años se han descrito inmunoensayos que utilizan MBs como superficie de inmovilización con detección óptica basadas en la fluorescencia molecular [210; 211], en la absorción molecular [212; 213] o en la quimiluminiscencia [209], obteniendo una buena correlación entre un ELISA y un biosensor electroquímico. 1.4. Partículas magnéticas como superficie sólida de inmovilización en el inmunoensayo 43 1.4.2. Uso de partículas magnéticas en inmunosensores para micotoxinas El uso de MBs funcionalizadas para la determinación de DON no está muy extendido. Por este motivo, en este apartado se ilustran aplicaciones en general para otras micotoxinas, como ejemplo de futuras aplicaciones que podrían desarrollarse para el DON. Los primeros usos de MBs con micotoxinas se dieron con la OTA hace unos 10 años [214; 215]. Las MBs se han utilizado sobre todo en inmunosensores para esta micotoxina [41; 214; 216] aunque también se han desarrollado aptasensores [32; 217], con ensayos directos e indirectos [45]. Dentro de nuestro grupo de investigación se ha desarrollado un inmunosensor directo electroquímico para la determinación de OTA en vinos tintos realizando la inmovilización del anticuerpo monoclonal de OTA sobre MBs funcionalizadas con estreptavidina, obteniendo unos bajos límites de detección 0,11±0,01 ng ml−1. Con el inmunosensor desarrollado se determinaron los niveles de OTA en dos vinos tintos de la denominación "Campo de Borja” que oscilaron entre 0,027 y 0,033 ng ml-1 de OTA [41]. También de forma satisfactoria hemos desarrollado un aptasensor basado en la inmovilización de un aptámero selectivo a la OTA sobre partículas magnéticas funcionalizadas con nanopartículas de oro, para determinar la concentración de esta micotoxina en trigo a través de una reacción competitiva entre la OTA libre y el conjugado enzimático OTA-HRP, con un límite de detección de 0,07±0,01 ng ml-1 [32]. Para el caso de la ZEA hay numerosos estudios, especialmente para la determinación de dicha micotoxina en alimentos infantiles, para los que se requiere una gran sensibilidad en el método desarrollado dado las bajas concentraciones de ZEA permitidas (inferiores a 20 ppb) en la legislación vigente [190; 218; 219; 220]. Con el inmunosensor electroquímico con MBs y electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) se determinó la ZEA de un CRM con matriz semejante a la comida para bebés, obteniendo un límite de detección muy bajo (0,007 μg l−1) y una excelente precisión, con una tasa de recuperación de 101-111 %, así como un error sistemático sobre la concentración certificada en el CRM inferior al 4 % y una excelente reproducibilidad (DSR = 6 %). Por lo tanto se observó que el uso de MBs aumenta las ventajas analíticas de los inmunosensores [219]. La ZEA también se ha determinado en piensos de alimentación animal siguiendo un esquema semejante basado en un inmunoensayo competitivo directo (entre ZEA y ZEA-HRP) que utiliza un anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre MBs funcionalizadas con el grupo 3-aminopropil y sobre un electrodo de oro. El primero de ellos mostró mayor sensibilidad y límites de detección inferiores que el método 44 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN estándar, lo que muestra la mejora obtenida por el hecho de inmovilizar los anticuerpos sobre las MBs [221]. Basados en ensayos competitivos semejantes se han desarrollado inmunosensores electroquímicos de aflatoxinas (concretamente aflatoxina M1, AFM1) en matrices de leche en los que se inmoviliza el anticuerpo selectivo a AF sobre MBs funcionalizadas con proteína G [195; 222]. Los ensayos desarrollados son directos, en los que se encontró que el límite de detección es 37,7 ng l1 de AFM en solución tampón y 27,5 ng l-1 de AFM en muestras de leche. Este método también se puede extender fácilmente a la rápida detección de otras micotoxinas y las especies biológicas, tal y como se ha visto en los últimos años [222]. Para las toxinas HT-2 y T-2, se ha desarrollado un inmunosensor electroquímico competitivo realizando la inmovilización directa sobre MBs de un anticuerpo con una reactividad cruzada de 100% hacia HT-2 y T-2 que permite detectar simultáneamente ambas toxinas con una sensibilidad similar, con el objetivo de determinar la cantidad total de las toxinas HT-2 y T-2 en la muestra. Después de las reacciones inmunoquímicas, el producto enzimático se detectó con voltamperometría de pulsos diferencial (DPV) [122]. El uso de MBs no se ha llevado a cabo sobre tricotecenos ni sobre DON. Por lo que puede decirse que este trabajo es un gran avance analítico en el desarrollo de dicha metodología para inmunosensores de DON. Únicamente se ha publicado un procedimiento de inmovilización de un anticuerpo monoclonal específico y selectivo para DON, sobre MBs funcionalizadas con grupos amino (reacción de la carbodiimida), teniendo como utilidad la extracción de DON de piensos animales, pero no son usadas como superficie sólida de inmovilización, sino como modo de extracción. Los autores comentan que este sistema de extracción podría ser una herramienta útil para detectar la contaminación por micotoxinas en piensos y en diferentes alimentos [223]. 1.5 ELECTRODOS SERIGRAFIADOS DE CARBONO Nuestro trabajo se ha basado en el uso de electrodos serigrafiados como transductores de la señal electroquímica, por lo que también consideramos conveniente describir su uso en inmunosensores electroquímicos (micotoxinas y DON). No obstante, ya se ha comentado la escasez de trabajos previos sobre inmunosensores para la micotoxina DON, por lo que también se ilustran ejemplos de otras micotoxinas en forma de trabajos que podrían ser similares para el DON. También se comenta la importancia del material y tipos de electrodos en transducción electroquímica. 1.5. Electrodos serigrafiados de carbono 51 (inmovilización de la AFB1-BSA sobre la superficie de cada SPCE) con el que se obtuvo un límite de detección de 30 pg ml-1 y un rango lineal de entre 0,05 y 2 ng ml-1 [197]. Para la OTA se han descrito varios aptasensores electroquímicos basado en transductores desechables (SPCEs) [32; 248; 249], además de inmunosensores electroquímicos competitivos descritos para la determinación de la micotoxina ocratoxina A (OTA) con SPCEs. En nuestro grupo de investigación han sido desarrollados varios inmunosensores electroquímicos competitivos para la OTA [32], que se basan en la adsorción física de la OTA-BSA sobre la superficie del SPCE, realizando una reacción competitiva con la OTA libre y un anticuerpo policlonal. Por otro lado, con el mismo esquema indirecto de trabajo, estudiamos la diferencia de la inclusión de nanopartículas de oro (AuNPs) sobre las que se inmovilizó la OTA-BSA [25]. En ambos casos, después de la etapa de competición, llevamos a cabo la detección mediante el uso de un anticuerpo tipo IgG secundario marcado con fosfatasa alcalina y usando alfa-fosfato-naftil como sustrato, y se midieron las señales por voltametría de pulsos diferencial. El rango de trabajo lineal de los biosensores descritos varió entre 0,9 y 9,0 ng ml-1 para el inmunosensor con la OTA-BSA inmovilizada sobre la superficie del SPCE, y entre 0,3 y 8,5 ng ml-1 para el inmunosensor nanoestructurado con nanopartículas de oro, con un límite de detección (LOD) igual a 0,86 ng ml-1 (DSR = 10,6%) y 0,20 ng ml-1 (DSR = 8,0%) de OTA, respectivamente [25; 32]. Otro inmunosensor electroquímico competitivo para la determinación de OTA en muestras de trigo y cebada utilizando SPCEs se realizó mediante un ensayo directo y uno indirecto utilizando en ambos casos un anticuerpo monoclonal selectivo a la OTA. Se realizó la competición entre OTA y OTA-BSA obteniendo un límite de detección de 60 μg l−1 para el ensayo directo, y de 100 μg l−1 para el indirecto. Se observó una buena correlación (R = 0,9992) en un análisis comparativo de muestras de trigo contaminadas de forma natural utilizando este ensayo y un método de detección por HPLC [250; 251]. Para la micotoxina DON, se utilizó la fracción Fab de un anticuerpo anti-DON sobre una placa típica de un ELISA con detección electroquímica sobre SPCEs (placa de 96x SPCEs) en un sistema ELIME. Con un esquema indirecto se llevó a cabo la inmovilización de un conjugado de DON con albúmina sérica humana (DON-HSA) sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas con grupos tosilo, con el que se determinaron concentraciones de DON en muestras de trigo y de alimentos de origen cereal. Este inmunosensor se aplicó en muestras de cereales y de alimentos de base de cereales (trigo, cereales para el desayuno y alimentos para bebés). La precisión fue de entre 9 y 24% en cereales y entre 10 y 33 % en alimentos para bebés. Las recuperaciones estuvieron comprendidas entre el 82 y el 110 % [77]. Tal y como se observa, la 52 Capítulo 1: INTRODUCCIÓN imprecisión obtenida con el inmunosensor indirecto desarrollado es muy superior a la registrada con otros inmunosensores desarrollados para otras micotoxinas. Una DSR superior al 24% debe ser controlada para evitar resultados irreproducibles en la determinación de muestras contaminadas. En un segundo inmunosensor de DON, se describe la determinación electroquímica sobre una placa de 96 pocillos para la detección de DON y NIV en muestras de trigo, proporcionando un límite de detección (LOD = 1,1 µg g-1) y un intervalo de trabajo de entre 2 y 20 µg g-1 para la determinación de deoxinivalenol en cereales de consumo y con un dispositivo ELIME [124]. Debido al escaso trabajo en inmunosensores electroquímicos de DON, el trabajo de esta Tesis Doctoral pretende contribuir a un mayor desarrollo de los mismos. Para ello nos basamos en nuestra experiencia previa con las herramientas metodológicas descritas en esta introducción (MBs, SPCEs, ELISA espectrofotométrico, transducción electroquímica). Por lo tanto, en el trabajo correspondiente a esta Memoria de Tesis Doctoral, el objetivo inicial ha sido aportar nuevos inmunosensores para la determinación analítica de esta micotoxina, con el punto de partida de la casi inexistencia de inmunosensores electroquímicos, que sean capaces de la determinación rápida de DON en muestras de alimentos y para concentraciones que se encuentren por debajo de la legislación Europea. Para ello aportamos nuestra amplia experiencia en el desarrollo de inmunosensores y de aptasensores de casi 10 años de trabajo sobre el tema. El trabajo implica la puesta a punto de procedimientos de extracción y de tratamiento de las muestras que han de ser acordes con el procedimiento de inmunoensayo y respetuosa con el funcionamiento de enzimas y de anticuerpos. Los resultados experimentales de esta Tesis Doctoral han dado lugar a conclusiones y resultados que se encuentran actualmente registrados en la OEPM (Oficina Española de Patentes y Marcas) para su última tramitación y plasmación en forma de patente de procedimiento y de prototipo de inmunosensores para esta micotoxina (Anexo I) cuyo título es “Inmunosensor electroquímico para la determinación de la micotoxina deoxinivalenol (DON)” (número de registro en la OEPM ES1510.105b) C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O 2 2: : O OB BJ JE ET TI IV VO OS S Capítulo 2: OBJETIVOS 57 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O 2 2. . O OB BJ JE ET TI IV VO OS S El objetivo general de este trabajo es el desarrollo y optimización de inmunosensores electroquímicos para la determinación cuantitativa de la micotoxina deoxinivalenol (DON), basados en esquemas de inmunoensayo directo competitivo con anticuerpos específicos como elementos de biorreconocimiento. Estos inmunosensores deberán de tener la suficiente selectividad (frente a otras micotoxinas), especificidad y sensibilidad (el biosensor deberá ser capaz de determinar concentraciones por debajo de la legislación europea sobre esta micotoxina), para su aplicación en muestras de cereales. El trabajo experimental se completará con el desarrollo de nuevos esquemas de inmunoensayo magnético (mELISA), se utilizarán herramientas analíticas para estudiar la reacción de afinidad de los anticuerpos utilizados (ELISA, SPR, HPLC), y se validarán estos inmunosensores mediante el uso de materiales de referencia certificados (CRMs) y métodos oficiales de análisis (HPLC-UV-Vis). Otro aspecto importante es la aplicabilidad de estos inmunosensores, que habrán de responder a los retos analíticos planteados y su disponibilidad comercial. Teniendo en cuenta este objetivo general, se plantean los siguientes objetivos específicos: 1. Estudio de la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y dos anticuerpos, un anticuerpo policlonal y otro monoclonal (pAbDON y mAbDON respectivamente). Comparación de la reacción de afinidad de los anticuerpos con conjugados DON-HRP utilizando el enzima peroxidasa (HRP) como etiquetado del inmunoensayo. Estudio de la selectividad de estos dos anticuerpos. 2. Optimización de las etapas del inmunoensayo sobre las que se basarán estos inmunosensores electroquímicos, utilizando diferentes funcionalizaciones de partículas magnéticas (MBs) como superficie sólida, que permiten mejorar las separaciones y lavados, la eliminación de interferencias de matriz y la localización precisa sobre el transductor electroquímico (electrodo de trabajo). 3. Optimización de la etapa de transducción electroquímica utilizando electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) como elemento transductor y técnicas amperométricas para medir la extensión de un inmunoensayo competitivo utilizando el enzima peroxidasa (HRP) como generador de la señal analítica. 58 Capítulo 2: OBJETIVOS 4. Desarrollo complementario de nuevos procedimientos ELISA basados en la utilización de partículas magnéticas (mELISA), con medida espectrofotométrica de absorción molecular, que permita optimizar, evaluar y comparar analíticamente un mismo esquema de inmunoensayo utilizando dos tipos de transducción diferentes (óptico y electroquímico). 5. Aplicación de los inmunosensores desarrollados en muestras de cereales. Validación estadística de estos inmunosensores utilizando materiales de referencia certificados de esta micotoxina y comparación con métodos oficiales de análisis (HPLC) y procedimientos ELISA comerciales. 6. Extracción múltiple de micotoxinas provenientes de hongos Fusarium (FB1 y DON) en harinas de cereales de maíz y de trigo, para su determinación con inmunosensores electroquímicos. Influencia del tipo de matriz y del rendimiento de diferentes procedimientos para su extracción múltiple, teniendo en cuenta sus diferentes propiedades químicas. 7. Aplicabilidad comercial de los inmunosensores que se han desarrollado para el DON, que aporten facilidad y rapidez en el control de esta micotoxina como herramienta de análisis por debajo de los límites de concentración exigidos por la legislación alimentaria de micotoxinas. 3.1. Materiales e instrumentación 67 Potenciostato Palmsens (PSTrace) con conector múltiple MUX8 para placas de 8 electrodos (Palmsens, Holanda) Figura 24: Potenciostato Palmsens (PSTrace) con conector múltiple MUX8 para placas de 8 electrodos [254] Con el instrumento de Palmsens utilizado se puede realizar una gran variedad de técnicas electroquímicas (voltametría de barrido lineal, voltametría de onda cuadrada, voltametría cíclica, potenciometría, multistep amperometric (MA), amperometric detection (AD), amperometría de pulso múltiple, etc). Su pequeño tamaño permite una fácil portabilidad. Las características técnicas más importantes del instrumento son: rango de corrientes de 100 pA a 10 mA (9 rangos), la corriente máxima es de ± 30 mA, la resolución en la corriente es de 0,01 % y la precisión depende de las corrientes utilizadas (≤ 1 % en 1 nA, 5% en 100 pA, ≤ 0.5 % entre 10 nA y 10 mA y ≤ 0.2 % desde 100 nA a 1 mA). La velocidad de adquisición de datos máxima es de 200.000 puntos/s. El conector MUX8 es un dispositivo de multiplexado que permite trabajar con hasta ocho electrodos sensores. Con el cable de conexión correspondiente es posible trabajar con detección amperométrica en el llamado modo consecutivo una medida después de la otra (en los 8 sensores, cada uno de ellos con los 3 electrodos ET, ER y EA), o bien en el llamado modo alternado, en donde se toman medidas de los 8 sensores de forma multiplexada cada 0,24 s (es decir 0,03 s cada sensor, el resto del tiempo se encuentran los sensores en circuito abierto) aunque en la práctica se considera que la medida de los 8 electrodos es simultánea. - Electrodos serigrafiados de carbono (ItalSens-Universidad de Florencia): Figura 25: SPCEs individuales con ET de carbono (ItalSens-Universidad de Florencia) [254] 68 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL Electrodos serigrafiados individuales de carbono SPCEs (Universidad de Florencia): electrodo de trabajo y electrodo auxiliar están compuestos por pasta carbono (grafito) y electrodo de referencia de plata (pseudo-referencia), serigrafiados sobre una superficie de poliéster flexible. Una tinta aislante (dieléctrica) se utiliza para definir la superficie del electrodo de trabajo (Ø = 3 mm) junto al ER (electrodo de referencia) y EA (electrodo auxiliar). Placas de 8 electrodos serigrafiados de carbono, CH8 (ItalSens-Universidad de Florencia) Figura 26: SPCEs múltiples con ET de carbono (SPCEs de ItalSens-Universidad de Florencia) Se trata de un array de ocho electrodos serigrafiados sobre una película flexible de poliéster. Cada uno de los electrodos tiene un electrodo de trabajo de pasta de carbono grafito (Ø = 2 mm), un electrodo de pseudo-referencia de plata y un electrodo auxiliar de grafito. De cada electrodo derivan 3 pins de contacto (24 pines en total) que permiten conectarlos al potenciostato a través de la interfase de conexión y multiplexado diseñado para estos electrodos. Para facilitar la adición de los reactivos se suministran con una placa de metacrilato con ocho agujeros (14 mm x 84 mm x 5 mm) que coinciden con los ocho electrodos serigrafiados, lo que permite producir una serie electroquímica con 8 celdas completas y confinar un volumen de disolución máximo de aproximadamente 250 µl. - Espectrofotómetro de absorción molecular, diode Array (Hewlett Packard, USA) - Espectrofotómetro de fluorescencia (Perkin Elmer, USA) - Instrumentación Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), Waters 2796 (Waters, Hertfordshire, Reino Unido) 3.1. Materiales e instrumentación 69 Figura 27: Instrumento HPLC Waters 2796 Se utilizó un detector UV-Visible (Waters 996). - Centrífuga Heraeus Multifuge X1R (Thermo Fischer, Waltham, Massachusetts, USA) - Estufa de laboratorio (T max 300 °C) con precisión de ±1 °C (Memmert, Schwabach, Alemania) 70 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL 3.2 REACTIVOS QUÍMICOS Y BIOQUÍMICOS 3.2.1 Reactivos de uso general: - N-succinimil S-acetiltioacetato, SATA (Sigma-Aldrich): introducción de un grupo sulfhidrilo en el enzima HRP, para posteriormente reaccionar con los grupos NH2 de la HRP a través de su grupo N-hidroxisuccinimida (NHS) en la síntesis del DON-HRP - p-maleimidofenil isocianato, PMPI (Sigma-Aldrich): conjugación de los grupos hidroxilo del DON con moléculas que contengan grupos sulfhidrilo en la síntesis del DON-HRP - Dimetilformamida, DMF (Sigma-Aldrich) - Dimetilsulfóxido, DMSO (Sigma-Aldrich) - 1-Etil-3-(3-dimetillaminopropil)carbodiimida (EDC): para la activación de ácidos carboxílicos formando un intermedio tipo éster (Sigma-Aldrich) - N-hidroxisuccinimida (NHS): reacción con grupos éster para introducir un grupo NH2 (Sigma-Aldrich) - Etanolamina (Sigma-Aldrich) - Caseinato de sodio (Sigma-Aldrich) - Albúmina sérica bovina (BSA) EC N° 232-936-2 (Sigma-Aldrich) - 3,3′,5,5′-Tetrametilbencidina, TMB (Sigma-Aldrich) - H2SO4 95-97% (Merck, Madrid, España) - Tween-20 P1379 (Sigma-Aldrich) - Polietilenglicol 8000, PEG8000 (Sigma-Aldrich) - Hidroquinona (HQ), (Sigma-Aldrich) - H2O2 30% (Sigma-Aldrich) - Tampón Superblock Blocking (Thermo Fischer, Rockford, USA) - Tampón Protein Free Blocking (Thermo Fischer, Rockford, USA) - Acetonitrilo, grado HPLC (Fischer, Waltham, Massachusetts, USA) - Metanol, grado HPLC (Scharlau, Sentmenat, Barcelona, España) - Sales iónicas para la preparación de tampones - Agua MilliQ 3.2 Reactivos químicos y bioquímicos 71 3.2.2 Reactivos de inmunoensayo: - Anticuerpo policlonal selectivo a DON (tipo IgG1 procedente de conejo), 1000 mg l-1 D01F-1 lote 1, (Antiprot, Aachen, Alemania), pAbDON - Anticuerpo monoclonal selectivo a DON IB12 (tipo IgG1 procedente de ratón), 5500 mg l-1 (R-Biopharm, Darmstadt, Alemania), mAbDON - Anticuerpo monoclonal selectivo a FB1 IC9 (tipo IgG1 procedente de ratón), 2748 mg l-1 (R-Biopharm, Darmstadt, Alemania), mAbFB1 - Deoxinivalenol, >98 % (Sigma-Aldrich, referencia D0156) - Fumonisina B1, >98 % (Sigma-Aldrich, referencia F1147) - Conjugado DON-HRP, 5121DONCO/NN6994 (Europroxima, Holanda) - Conjugado FB1-HRP, 5121FUMCO/NN5666 (Europroxima, Holanda) - Enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). EC N° 1.11.1.7 (Sigma-Aldrich) - Conjugado DON-HRP (sintetizado en nuestro laboratorio) - Micropartículas magnéticas Dynabeads Protein A, MBs-prA (30 mg ml-1, Ø=2,8 μm) (Invitrogen, Oslo, Noruega) - Micropartículas magnéticas Dynabeads Tosylactivated, MBs-To (30 mg ml-1, Ø=2,8 μm) (Invitrogen) - Micropartículas magnéticas Dynabeads M-280 Sheep anti-rabbit IgG, MBs-aIgG (10 mg ml-1, Ø=2,8 μm) (Invitrogen, Oslo, Noruega) - Micropartículas magnéticas Dynabeads MyOne Carboxylic Acid, MBs-COOH (10 mg ml-1, Ø=1 μm) (Invitrogen, Oslo, Noruega) - Micropartículas magnéticas Dynabeads Protein G, MBs-prG (30 mg ml-1, Ø=2,8 μm) (Invitrogen, Oslo, Noruega) - Columnas de inmunoensayo DONTest HPLC (Vicam, Móstoles, Madrid) 3.2.3 Materiales de referencia certificados y muestras de cereales - Patrón de referencia certificada TR-D100 (Lote D-W-158) DON certificado: 1400 ± 200 µg kg-1, (Trilogy, Washington, USA) (Anexo II) - Patrón de referencia certificada TR-F100, (Lote F-C-433) FB1 certificado: 1500 ± 400 µg kg-1, (Trilogy, Washington, USA) (Anexo III) 72 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL - Harina comercial de maíz Haricaman (Harinas de Castilla la Mancha, Toledo, España) - Harina comercial de trigo Super para Haricaman (Harinas de Castilla la Mancha, Toledo, España) 3.3.Disoluciones tampón 73 3.3 DISOLUCIONES TAMPÓN En cada uno de los estudios realizados para la caracterización de la afinidad entre los anticuerpos con la micotoxina, así como en las etapas del inmunoensayo, que requieren un valor de pH muy preciso, se utilizaron las disoluciones tampón que se indican en la Tabla 9 para mantener el pH óptimo en cada caso, indicando su uso concreto. NOMBRE DENOMINACIÓN COMPOSICIÓN USO Tampón A Tampón fosfato salino + EDTA K3PO4 (50 mM), NaCl (150 mM) y EDTA (1mM) (se preparó a pH 7,8 y a pH 6,8) Reacción de conjugación del DONHRP sintetizado HBS-EP Running Buffer HEPES (10 mM), NaCl (150 mM), EDTA (3 mM), Polysorbate20 (0.005%), pH 7,4 Running buffer en el SPR AC Tampón acetato CH3COO- (0,1 M) pH 4 Tampón de inmovilización del anticuerpo sobre el chip del SPR CB Tampón carbonatos HCO3-/CO3-2 (0,05 M) pH= 9,6 Inmovilización anticuerpo sobre placa poliestireno ELISA PBS Tampón fosfato salino HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 Fases de incubación, diluciones, disoluciones, almacenamiento PBST Tampón fosfato salino + tween20 HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 + tween20 Fases de lavado PBS-BSA Tampón fosfato salino + BSA HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 + BSA (0,1% m/v) Tampón de almacén y bloqueo de MBs-To PBS-MBsaIgG Tampón fosfato salino para MBsaIgG HPO4-2 (6,9 mM), H2PO4- (1,16 mM) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 Fase inicial de lavado de MBs-aIgG MES Ácido 2-(Nmorfolino) etanosulfónico MES (15 mM, pH 6) Fase inicial de lavado de MBs-COOH y reacción con EDC PBS (MBsCOOH) Tampón fosfato salino para MBsCOOH HPO4-2 (8 mM), H2PO4- (1,88 mM) y NaCl (0,15M) pH=7,4 Fases de lavados en las reacciones con MBs-COOH Tabla 9: Disoluciones tampón utilizadas para el inmunosensor de DON 74 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL 3.4 PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Para el desarrollo de los inmunosensores electroquímicos, conjugaciones, procedimientos analíticos y tratamiento de las muestras se llevaron a cabo una serie de procedimientos experimentales optimizados que se recopilan a continuación. 3.4.1 Síntesis del conjugado enzimático DON-HRP Por la inexistencia de un conjugado independiente comercial de DON unido al enzima peroxidasa (DON-HRP) necesario para la etapa de competición y para generar la señal analítica tras la reacción enzimática, se optó por realizar la síntesis de un conjugado enzimático DON-HRP mediante un procedimiento similar al descrito por S.H. Wang [101]. Esta conjugación se realizó a través de la síntesis previa de los dos conjugados SATA-HRP y DON-PMPI con los reactivos bifuncionales indicados, y tal como se esquematiza en la figura 28. El reactivo PMPI (p-maleimidofenil isocianato) tiene la función de conjugar los grupos hidroxilo del DON con moléculas que contengan grupos sulfhidrilo. Por su parte, el reactivo SATA (N-succinimidil S-acetiltioacetato) se usa para introducir un grupo sulfhidrilo en el enzima HRP, para después reaccionar con los grupos NH2 de las proteínas y otras moléculas a través de su grupo N-hidroxisuccinimida (NHS). De este modo, en el enzima HRP se forma un grupo sulfhidrilo protegido que puede ser almacenado sin degradarse. El éster activo NHS en el extremo del SATA permite reaccionar con los grupos amino de las proteínas y formar enlaces amida muy estables, formando finalmente el conjugado DON-HRP [255]. Para la síntesis, primero se llevó a cabo la reacción de formación del conjugado SATAHRP. Se utilizó 1 mg de SATA que fue disuelto en 50 μl de DMF y se mezcló con una disolución de HRP (1 mg ml-1) en tampón A (pH 7,8) añadiendo la disolución de SATA sobre la de HRP. Se mantuvo durante 1 h con agitación y se dializó cambiando el pH del tampón A de pH=7,8 a pH=6,8. El segundo paso fue la preparación del conjugado DON-PMPI. Se tomó 1 mg de DON y se disolvió en 150 μl de DMSO. A continuación se disolvieron 4,82 mg de PMPI en 160 μl de DMSO. Se realizó la mezcla de ambas disoluciones y se mantuvo con agitación durante 1 h a T ambiente. El conjugado DON-HRP se sintetizó utilizando 130 μl del conjugado DON-PMPI y 1 ml de SATA-HRP en tampón A a pH= 6,8 mediante agitación durante 2 h a T ambiente. 3.4. Procedimientos experimentales 75 Figura 28: Reacciones de la síntesis de DON-HRP El DON-HRP sintetizado según el protocolo anterior se utilizó en las experiencias en las que se trabaja con el anticuerpo policlonal (pAbDON). Posteriormente se adquirió un nuevo DON-HRP comercial (reactivo incluido en un kit ELISA de Europroxima) que tenía una alta afinidad hacia un anticuerpo monoclonal (mAbDON de R-Biopharm), también proveniente de un kit comercial ELISA, y muy selectivo hacia el DON. Fue muy importante comparar la afinidad de ambos anticuerpos de DON frente al DON y frente al DON-HRP con técnicas analíticas sin etiquetado, para lo que se utilizó la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance). Como se menciona en apartados posteriores, tanto esta afinidad como el reconocimiento de cada anticuerpo de DON con diferentes conjugados de DON-HRP varía en gran medida, hasta el punto de no reconocer al conjugado según el tipo de anticuerpo. El motivo es el inmunógeno utilizado en la síntesis de cada anticuerpo, en donde la unión de la micotoxina a la proteína generadora del efecto antigénico en el animal puede realizarse utilizando diferentes grupos funcionales del DON o con diferentes procedimientos de bioconjugación. Es muy importante que la conjugación en el biorreactivo DON-HRP y en el inmunógeno que se utilizó para generar el anticuerpo sea la misma, para que la selectividad del anticuerpo hacia el DON-HRP se mantenga. 76 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL 3.4.2 Resonancia de Plasmón Superficial Para el estudio de la reacción de afinidad entre el anticuerpo policlonal selectivo a DON (pAbDON) y el DON se utilizó la técnica de Espectroscopía de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). Se utilizó un esquema directo con inmovilización del anticuerpo sobre la superficie del chip de oro recubierto de dextrano, y se inyectaron concentraciones crecientes de DON. Esta técnica no necesita de etiquetado enzimático para la transducción óptica de la señal analítica [70]. Para la inmovilización del elemento de biorreconocimiento sobre la superficie del chip fueron necesarias tres etapas: activación de la superficie de dextrano del chip, inyección del anticuerpo y bloqueo de los sitios libres que quedan sobre la superficie del chip, realizadas de forma automatizada con el propio instrumento. En primer lugar se realizó la activación de la superficie del chip con el método de la carbodiimida, mediante inyección manual de 50 μl de una mezcla de 1-Etil-3-(3dimetillaminopropil) carbodiimida, EDC (200 mM) y de N-hidroxisuccinimida, NHS (50 mM). A continuación se procedió a la inyección del anticuerpo pAbDON (1 μl de 1000 mg l-1 en 130 μl tampón AC) sobre la superficie activada del chip a una velocidad de 10 μl min-1 durante 600 s [70]. Finalizada la inmovilización del pAbDON se bloquearon los sitios libres del chip con 60 μl de etanolamina (1 M pH 8,5) para evitar posibles uniones inespecíficas de los biorreactivos utilizados. Figura 29: Esquema del estudio de la afinidad entre pAbDON y DON por SPR Con el objetivo de evaluar la unión selectiva del DON al pAbDON y descartar posibles uniones inespecíficas de la HRP sobre el pAbDON o sobre el chip se inyectaron concentraciones crecientes (de 0 a 2 mg l-1) de disoluciones de DON, de HRP y de DONHRP en Running Buffer (Tampón HBS-EP, HEPES (10 mM), NaCl (150 mM), EDTA (3 mM), Polysorbate20 (0.005%), pH 7,4). 3.4. Procedimientos experimentales 83 proteína G es su capacidad para orientar el anticuerpo durante la inmovilización por afinidad, a través de su región Fc, dejando libre la región Fab del anticuerpo para poder reconocer más fácilmente al antígeno. Las MBs-prG son similares a las MBs-prA con ligeras diferencias entre la afinidad con los diferentes tipos de anticuerpos. La diferencia más significativa es que mientras las MBs-prA poseen una muy baja afinidad con los anticuerpos IgG1 procedentes de ratones, las MBs-prG tienen una alta afinidad, por lo que son más adecuadas para el anticuerpo utilizado (mAbDON) [256]. Los tampones específicos utilizados con las MBs-prG fueron: - Tampón de reacción, PBS: HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 - Tampón lavado PBST: PBS con tween20 (0,1% m/v) La capacidad de unión que poseen las MBs-prG son 8 µg de anticuerpo por mg de MBsprG. El protocolo de trabajo (final después de las optimizaciones) con estas partículas magnéticas fue el siguiente: 1. Agitación de las partículas magnéticas durante 3 minutos. 2. Adición de 690 µg MBs-prG (23 µl, 30 mg ml-1) en un vial eppendorf 3. Lavados: se realizan 2 lavados con 500 µl de PBST (0,1 M, pH 7,4; tween20 0,1%) y 1 lavado con 500 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) 4. Adición de 5,5 µg mAbDON (1 µl, 5500 mg l-1) en PBS (0,1 M, pH 7,4) 5. Etapa de inmovilización: agitación durante de 10 minutos a T ambiente en un volumen total de 1380 µl 6. Lavados: se realizan 2 lavados con 500 µl de PBST (0,1 M, pH 7,4; tween20 0,1%) y 1 lavado con 500 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) 7. Almacenamiento de las MBs-prG-mAbDON a 4 °C hasta su uso en PBS (0,1 M pH 7,4) 3.4.4 ELISA espectrofotométrico El trabajo realizado con la técnica Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) con detección espectrofotométrica se utilizó principalmente para el estudio de la afinidad 84 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL entre los anticuerpos y la micotoxina, además de la optimización de las etapas del inmunoensayo y para diseñar inmunosensores ELISA magnéticos. 3.4.4.1 ELISA espectrofotométrico convencional Se utilizaron esquemas de inmunoensayo directo (inmovilización del anticuerpo sobre los pocillos de poliestireno) y posterior incubación competitiva de DON y DON-HRP. La inmovilización se realizó en tampón de carbonatos (CB) y a continuación se llevó a cabo la reacción competitiva entre el DON y el conjugado enzimático DON-HRP. Para realizar el ensayo ELISA convencional, de forma general, se llevaron a cabo las siguientes etapas [67; 74]: 1. Lavado de los pocillos con tampón CB (2 veces) 2. Adición de diferentes concentraciones de AbDON (policlonal o monoclonal) en tampón CB (50 µl por pocillo) 3. Incubación durante 24 h sin agitación a 4 °C 4. Lavados con 300 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) (3 veces) 5. Etapa de bloqueo: caseínato de sodio (2% m/v) en 200 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 30 minutos con agitación y a T ambiente 6. Lavados con 300 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) (3 veces) 7. Adición DON-HRP (y DON en los casos de reacción competición) 8. Agitación durante 60 minutos (agitación orbital) a T ambiente 9. Lavado con 300 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) (3 veces) 10. Adición de 50 µl de TMB: reacción con agitación orbital, 20 minutos a T ambiente. 11. Adición de 50 µl de H2SO4 (0,5 M) para parar la reacción enzimática 12. Medida de la absorbancia a 450 nm con el lector ELISA. Con esta técnica se estudió la afinidad entre el DON tanto en su modo libre como en el conjugado con el enzima peroxidasa (DON-HRP) y el anticuerpo inmovilizado sobre los pocillos de la placa de polietileno, y para comprobar la competición entre los intervalos de concentraciones de DON necesarios para una sensibilidad adecuada. 3.4. Procedimientos experimentales 85 Otro objetivo fue el estudio de posibles adsorciones inespecíficas del DON-HRP sobre los pocillos de poliestireno, que produciría falsos negativos en las señales obtenidas (mayores absorbancias debidas al conjugado adsorbido que significarían menores concentraciones competitivas de la micotoxina). 3.4.4.2 ELISA espectrofotométrico utilizando partículas magnéticas como superficie de inmovilización Se diseñaron nuevos esquemas de inmunoensayo sobre MBs a los que llamaremos ELISA inmunomagnético (mELISA), con el objetivo de comprobar y cuantificar la afinidad y selectividad de los anticuerpos de DON (inmovilizado sobre las propias MBs), así como la optimización de todas las etapas y protocolos que posteriormente se utilizaron en el inmunosensor con transducción electroquímica [223]. Para integrar las optimizaciones, el mELISA se realizó de forma muy similar a un ELISA convencional, con la única diferencia de que previamente se inmovilizaron los anticuerpos sobre las MBs (en lugar de realizar la inmovilización sobre los pocillos de poliestireno) siguiendo los procedimientos específicos recogidos en el apartado 3.4.3 para cada una de ellas, y las etapas de lavados, y separaciones se realizaron bajo la acción de un campo magnético externo. El modo de trabajo es más cómodo y rápido comparado con la inmovilización del anticuerpo sobre los pocillos, ya que las partículas magnéticas se pueden almacenar con el anticuerpo inmovilizado sobre su superficie (se ha estimado hasta 25 días a 4 C para las MBs-prG) y el gasto de anticuerpo es menor debido a que la superficie relativa de reacción es mayor utilizando las MBs. Además las etapas de lavado y separación de las partículas magnéticas son más efectivas al disponer de la ayuda de un campo magnético que retiene las partículas magnéticas modificadas con los diferentes biorreactivos [222]. Al encontrarse las MBs modificadas en dispersión, el transporte y acceso de las moléculas de antígeno es más efectivo y rápido que en el caso de los anticuerpos inmovilizados sobre la pared sólida de los pocillos. El protocolo de trabajo genérico que se utilizó fue el siguiente: 1. Inmovilización del anticuerpo (protocolos anteriores según el tipo de MBs) 2. Adición del conjugado enzimático: 25 µl DON-HRP (concentración constante en todos los pocillos) 3. Adición 25 µl DON (con concentraciones crecientes para los calibrados) 4. Adición de MBs-AbDON (la concentración dependerá de la inmovilización) 86 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL 5. Etapa de competición: Incubación con agitación orbital y a T ambiente 6. Lavado: se realizan 2 lavados con 300 µl de PBST (0,1 M, pH 7,4; tween20 0,1%) y 1 lavado con 300 µl de PBS (0,1 M, pH 7,4) 7. Reacción enzimática: Adición de 50 µl de TMB. Reacción durante 20 minutos con agitación orbital y a T ambiente 8. Parada de la reacción enzimática: Adición de 50 µl de H2SO4 (0,5 M) 9. Detección espectrofotométrica midiendo la absorción molecular a una longitud de onda de 450 nm El protocolo expuesto es general ya que para cada tipo de MBs se debe optimizar la cantidad de anticuerpo dependiendo de sus características y de la capacidad de unión de las partículas magnéticas, la concentración de DON-HRP y el intervalo de concentraciones de DON en el que se realiza la competición y el correspondiente calibrado, así como los tiempos y temperaturas de incubación, competición, etc. Todos estos parámetros influyen decisivamente en el funcionamiento óptimo del inmunosensor electroquímico que se diseñe, por lo que se requiere una optimización muy cuidadosa. Se han utilizado varios tipos de partículas magnéticas (MBs) modificadas con diferentes grupos funcionales, con el objetivo de comprobar las prestaciones que ofrece cada una de ellas y seleccionar las MBs óptimas para el desarrollo del inmunosensor. Los protocolos específicos de inmovilización del anticuerpo sobre cada tipo de MBs son los detallados en el Apartado 3.4.3. 3.4.5 Inmunosensor electroquímico con electrodos serigrafiados SPCEs individuales A continuación se indica el protocolo genérico de los inmunosensores electroquímicos que hemos desarrollado utilizando electrodos individuales serigrafiados de base carbono (SPCEs, Universidad de Florencia). Estos electrodos individuales sirvieron para las optimizaciones iniciales, antes de una segunda fase de mayor productividad analítica con los sensores serigrafiados de 8 canales. No obstante, las condiciones de transducción se adaptaron a cada tipo de SPEs. De forma general, las etapas de los inmunosensores electroquímicos con SPCEs individuales se realizaron según: 1. Inmovilización del anticuerpo sobre las MBs (protocolo seguido y condiciones dependiendo del tipo de MBs utilizadas) en viales eppendorf de 1,5 ml 3.4. Procedimientos experimentales 87 2. Adición de un volumen constante de MBs-AbDON (policlonal o monoclonal) en cada vial eppendorf de 1,5 ml 3. Adición de una concentración constante del conjugado enzimático DON-HRP 4. Adición de la micotoxina DON (concentraciones crecientes) 5. Etapa de competición: Incubación con agitación orbital a T ambiente 6. Lavados: 2 lavados con 500 μl de PBST (0,1 M, pH 7,4; tween20 0,1%) y 1 lavado con 500 μl de PBS (0,1 M, pH 7,4) con ayuda de un campo magnético y agitación orbital 7. Resuspensión de MBs-AbDON en PBS (0,1 M, pH 7,4) en el volumen de partida en el propio vial eppendorf. 8. Deposición de 10 µl de la suspensión de MBs-AbDON sobre la superficie del electrodo de trabajo del SPCE individual. 9. Reacción enzimática: Adición de 25 µl de HQ y 25 µl de H2O2 para cubrir la superficie de los tres electrodos. Reacción durante 10 minutos a T ambiente 10. Detección electroquímica: cronoamperometría con un salto de potencial (∆ECRA) desde 0 a -0,25 V y se toma el valor de la corriente a un tiempo constante de 90 s (Potenciostato Autolab PGSTAT12) Las etapas de incubación y competición se desarrollan en viales eppendorf (1,5 ml) individuales, y una vez terminadas las reacciones se depositó la suspensión de las partículas magnéticas sobre la superficie del electrodo de trabajo bajo la acción de un campo magnético, y en donde se produce la reacción enzimática de oxidación de la hidroquinona a H2O2 catalizada por la HRP del conjugado, tal y como se esquematiza en la figura 32: Figura 32: Esquema de la reacción enzimática y detección electroquímica que se produce sobre la superficie del electrodo de trabajo con los SPCEs individuales 88 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL Después de 10 minutos de la reacción de oxidación enzimática, se aplica un impulso de potencial de 0 a -0,25 V y se mantiene el potencial constante durante 90 s, tomando el valor de la corriente catódica generada por la reducción de la p-benzoquina (pBQ) (formada por la reacción enzimática con la HRP en presencia de peróxido de hidrógeno) a hidroquinona (HQ). 3.4.6 Inmunosensor electroquímico con electrodos múltiples En el caso de utilizar una batería (array) de 8 electrodos serigrafiados (CH8) durante la etapa de detección electroquímica (Figura 26) y para facilitar el trabajo, hacerlo de un modo más limpio y utilizando menor cantidad de reactivos y tampones se propuso el trabajo sobre placas de poliestireno en lugar del trabajo en viales eppendorf utilizados anteriormente con SPCEs individuales, y con un separador magnético para placas ELISA con 96 imanes individuales dispuestos para cada pocillo (Figura 15). La forma de trabajo fue similar a la indicada en el apartado anterior con el mELISA, realizando de igual modo las etapas del inmunoensayo de forma simultánea en los pocillos de una placa convencional ELISA pero finalmente la suspensión de las MBs modificadas fue depositada sobre la superficie de cada uno de los 8 electrodos de trabajo para la transducción electroquímica y bajo la acción de un campo magnético de 8 imanes coincidentes sobre la superficie de los 8 electrodos de trabajo. La correcta posición de las partículas magnéticas sobre la superficie del electrodo de trabajo es fundamental para lograr una alta reproducibilidad y sensibilidad en la medida. El uso de un dispositivo que cuenta con 8 imanes colocados bajo cada uno de los electrodos de trabajo, facilita el proceso de deposición de las partículas magnéticas. Este tipo de array permite una adaptación rápida de 8 medidas de inmunoensayo sobre una columna de una placa convencional ELISA. Esta forma de trabajo ha permitido de una forma rápida, sencilla y efectiva trasladar las condiciones y parámetros optimizados con inmunoensayo al trabajo con electrodos serigrafiados múltiples, y nos ha permitido comparar los resultados obtenidos por ambas técnicas, ya que la única diferencia en el modo de trabajo es la etapa de transducción (óptica o electroquímica), aunque en la práctica dependiendo del tipo de transducción algunas variables se optimizaron de forma diferente. El protocolo que se expone a continuación es el resultado final del proceso de optimización de cada uno de los parámetros que influyen en el funcionamiento del inmunosensor. 3.4. Procedimientos experimentales 89 1. Inmovilización del anticuerpo sobre las MBs (condiciones dependientes del tipo de MBs utilizadas) 2. Adición DON-HRP (10x), proveniente del kit comercial Europroxima (ELISA 5121DON)  25 µl dilución 1/5 (v/v) en PBS (0,1 M pH 7,4). 3. Adición de 25 µl DON (0,01-100 µg l-1). 4. Adición de 25 µg MBs-prG-mAbDON (50 µl 0,5 mg ml-1) 5. Etapa de competición: Incubación durante 60 minutos, con agitación orbital a T ambiente. 6. Lavado: se realizan 2 lavados con PBST (0,1 M, pH 7,4; tween20 0,1%) y 1 lavado con PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 2 minutos cada uno, con agitación orbital y T ambiente. 7. Resuspensión de las MBs-mAbDON en 22 µl de PBS (0,1 M, pH 6,5). 8. Deposición de 20 µl de MBs sobre cada electrodo de trabajo del electrodo múltiple CH8 manteniendo un campo magnético independiente debajo de cada electrodo de trabajo. 9. Reacción enzimática: Adición de 40 µl de HQ (4,5 mM, concentración final de 1,8 mM) y 40 µl de H2O2 (24 mM, concentración final de 9,6 mM) en PBS (0,1 M, pH 6,5) para cubrir la superficie de los tres electrodos. Reacción durante 10 minutos a T ambiente. 10. Detección electroquímica: Aplicar salto de potencial ∆EAD de 0 a -0,35 V. Medida por Amperometric Detection (alternate mode) a los 90 seg (Potenciostato Palmsens). La etapa de transducción electroquímica en el inmunosensor sobre cada uno de los electrodos de trabajo se esquematiza en la siguiente figura (Figura 33): 90 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL Figura 33: Esquema del inmunosensor electroquímico para la determinación de DON con electrodos múltiples CH8 Se observa que el ensayo y la reacción enzimática es la misma que en el caso de los SPCES individuales pero se ha modificado ligeramente la forma de trabajo, asemejándose más al protocolo con el inmunoensayo mELISA y reduciendo considerablemente el tiempo en la medida electroquímica. Con la técnica amperométrica en modo alternado (alternate mode), explicada más adelante, se pueden medir simultáneamente los ocho electrodos de trabajo, tomando medidas cada 0,24 s, en forma de señal potenciostática multiplexada con el monopotenciostato Palmsens (Figura 24). 3.4.7. Inmunosensor competitivo para la determinación de Fumonisina B1: Las condiciones optimizadas del inmunosensor para la determinación de la FB1, surgen del trabajo dentro de nuestro grupo de investigación, de forma paralela al desarrollo del inmunosensor para DON. Del mismo modo, el anticuerpo monoclonal selectivo a la FB1 se inmovilizó sobre partículas magnéticas funcionalizadas con proteína G. Las condiciones óptimas y fijadas para el inmunosensor de FB1 son las siguientes: 1. Inmovilización del anticuerpo mAbFB1 sobre las MBs-prG según las especificaciones de las partículas magnéticas 2. Adición a los pocillos del conjugado enzimático FB1-HRP, proveniente del kit ELISA comercial de Europroxima (5121FUMCO)  25 µl dilución 1/200 (v/v) en PBS (0,1 M pH 7,4) 3.4. Procedimientos experimentales 91 3. Adición de 25 µl FB1 (0,01-100 µg l-1) 4. Adición de 25 µg MBs-prG-mAbFB1 (50 µl 0,1 mg ml-1) 5. Etapa de competición: Incubación durante 30 minutos, con agitación orbital a T ambiente 6. Lavado: se realizan 2 lavados con PBST (0,1 M, pH 7,4; tween-20, 0,1% (m/m)) y 1 lavado con PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 2 minutos cada uno, con agitación orbital y T ambiente La detección se realizó por absorción UV-visible (procedimiento mELISA) y por detección amperométrica (modo alternado, AD-a). En el mELISA se utilizó el TMB (20 minutos) como sustrato del enzima realizando la parada de la reacción enzimática con H2SO4 0,5 M y midiendo posteriormente la absorbancia producida a una longitud de onda λ = 450 nm. En la detección amperométrica se obtuvo la corriente después de la reacción enzimática de la HRP inmovilizada con HQ (1,8 mM) y H2O2 (9,6 mM) durante 10 minutos, y se midió con amperometría (AD-a) de modo semejante al inmunosensor para DON. 3.4.8 Extracción de micotoxinas en muestras de harina de cereales Para la determinación de las micotoxinas por alguna de las técnicas instrumentales disponibles, es preciso su extracción y puesta en disolución a partir de los alimentos (sólidos) en los que se determine. La etapa de extracción de la totalidad de micotoxina contenida en los cereales es un proceso clave para la determinación cuantitativa de la concentración de las mismas, con el fin de elucidar si su consumo resultaría tóxico o no para la salud humana y animal. La elección del disolvente de extracción se debe basar en la obtención de la máxima recuperación del analito (máximo porcentaje de extracción), y evitando en todo lo posible las interferencias provocadas por efectos del disolvente orgánico de extracción sobre la reactividad del anticuerpo en el momento de la etapa de competición, o incluso en su posible interferencia sobre la reacción enzimática de la HRP. Los disolventes más utilizados para la extracción de micotoxinas son mezclas de agua en diferentes proporciones, con disolventes orgánicos como metanol, hexano o 92 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL acetonitrilo [8, 12]. Sin embargo, para el caso del DON, y debido a su alta polaridad, con frecuencia se ha utilizado simplemente agua o disoluciones acuosas tamponadas (PBS) para su extracción efectiva a partir de las muestras sólidas que contienen a esta micotoxina [77; 257]. Los procedimientos utilizados se resumen a continuación. 3.4.8.1 Extracción de DON en harinas de cereales para la determinación con el inmunosensor (mELISA e inmunosensor electroquímico). La extracción realizada sobre las muestras de harina de trigo se resume en los siguientes pasos [58; 257]: 1. Pesada 1 g de muestra (precisión 0,1 mg) de harina finamente molida. 2. Extracción con 5 ml PBS (0,1 M) durante 30 minutos con agitación por volteo. 3. Centrifugación a 2000 x g durante 5 minutos a T ambiente 4. Filtrado del sobrenadante con un microfiltro de 0,22 µm. 5. Almacenamiento a 4 °C hasta su uso. Se comprobó que el extracto, almacenado como se indica, mantiene la concentración de DON durante al menos 20 días (ver apartado 4.6.1) sin que haya disminución estadísticamente significativa (95% nivel de confianza) de este valor durante este tiempo. Pasando este tiempo se observó un aumento de la turbidez y en ocasiones la aparición sólidos en suspensión (mohos), así como una disminución de la concentración del DON, por lo que no es posible su utilización para determinar la micotoxina. 3.4.8.2 Extracción de FB1 en harinas de cereales para la determinación con el inmunosensor (mELISA y electroquímico). El procedimiento para la extracción de FB1 de las harinas de maíz fue el siguiente [258]: 1. Pesada de 1 g de muestra (precisión 0,1 mg) de harina finamente molida 2. Extracción con 10 ml MeOH/H2O (70:30, v/v) durante 30 minutos con agitación por volteo 3. Centrifugación 2000 x g durante 30 minutos a T ambiente 3.5 Modelo matemético de ajuste no lineal de los calibrados competitivos: Modelo 4PL 99 3.5 MODELO MATEMÁTICO DE AJUSTE NO LINEAL DE LOS CALIBRADOS COMPETITIVOS: MODELO 4PL Las curvas de calibrado para ensayos de unión de ligandos por afinidad se caracterizan generalmente por una relación no lineal entre la señal analítica y la concentración de analito. Normalmente, la respuesta produce una relación sigmoidal (punto de inflexión central) con respecto a la concentración [263; 264]. Muchos tipos de funciones han sido probadas para el ajuste de las curvas para inmunoensayos, pero pocos de ellos poseen todas las propiedades necesarias para que el ajuste sea óptimo [263]. Uno de estos modelos es el modelo logit-log el cual funciona bien pero solamente en los casos en los que los datos son simétricos, y además empeora el carácter del ruido en los datos estándar [265]. Además, en la linearización de la ecuación sigmoidea se pierde información estadísticamente significativa. El modelo de referencia que se utiliza normalmente (y que mejor se ajusta) en uniones de afinidad competitiva es el llamado “modelo de los 4 parámetros logísticos” (modelo 4PL), que optimiza la exactitud y la precisión en todo el rango máximo de concentraciones del antígeno (el DON). La ecuación de este modelo, muy utilizado en las técnicas de inmunoensayo, es: Ecuación 1: Ecuación para aplicar el modelo 4PL En donde: m1 = señal mínima (señal del máximo de inhibición del anticuerpo, en ensayo directo la máxima concentración de DON) m2= señal máxima (señal del 0% de inhibición de la unión de DON-HRP, en ensayo directo la mínima concentración de DON que no compite con este conjugado) m3 = punto de inflexión (factor EC50, correspondiente a la concentración de DON, normalmente logarítmica, que produce un 50% de inhibición en el anticuerpo) m4 = pendiente del tramo aproximadamente lineal (central) del calibrado. Para aplicar el modelo 4PL, se toma el logaritmo de las concentraciones de DON (μg l-1) y se representa frente a la señal obtenida (Abs o µA). En la figura 36 se representa un calibrado típico. Se utilizó el software GraphPad Prism v.6.0 de ajuste no lineal [266], pues otros procedimientos de linearización de la ecuación 4PL anterior producen 100 Capítulo 3: PARTE EXPERIMENTAL pérdida significativa de información estadística. Este software ajusta los datos experimentales a la ecuación 4PL de forma no lineal, evitando esta pérdida de información, y para un nivel de confianza dado (hemos tomado como estándar el 95% de probabilidad estadística) [263]. -2 -1 0 1 2 3 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 Log [DON] (g/l) I (A) Figura 36: Calibrado sigmoideo de DON ajustado por el modelo 4PL Con el software de GraphPad Prism v6.0, una vez introducidos los datos del calibrado (junto con las señales obtenidas en la determinación de muestras) se realiza la conversión de los valores de concentración en su logaritmo a modo de hoja de cálculo, y a continuación se lleva a cabo el ajuste no lineal basado en este modelo 4PL. En la figura 37 se incluye una imagen del software de GraphPad Prism v6.0 mientras se realiza un ajuste no lineal de la curva sigmoidea por el modelo 4PL: 3.5 Modelo matemético de ajuste no lineal de los calibrados competitivos: Modelo 4PL 101 Figura 37: Interfase de trabajo con el programa GraphPad Prism v6.0 para el ajuste no lineal de los datos de calibración de una curva sigmoidea típica de inhibición El propio software ofrece la opción de realizar el ajuste sigmoideo en función únicamente de tres de los parámetros logísticos (modelo 3PL) en los casos en los que la pendiente de la zona lineal de la curva es próxima a 1, y tomando este valor teórico de pendiente (relación molar 1:1 antígeno/anticuerpo) como valor constante. Para realizar el ajuste óptimo el programa compara estadísticamente ambos modelos de ajuste (3PL y 4PL) en cada uno de los calibrados realizados [266], y el propio programa elige estadísticamente el modelo que se ajusta con mayor probabilidad (95% nivel de confianza) a las medidas de los calibrados. Insistimos que este ajuste es no lineal y se realiza tomando todos los puntos experimentalmente medidos, con lo que no se produce pérdida de información como ocurre en otros modelos (ya obsoletos) que linearizan la ecuación logarítmica 4PL [266]. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O 4 4: : R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S Y Y D DI IS SC CU US SI IÓ ÓN N 4.1 Caracterización del conjugado enzimático deoxinivalenol-peroxidasa (DON-HRP) 105 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O 4 4. . R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S Y Y D DI IS SC CU US SI IÓ ÓN N Los esquemas de inmunoensayo sobre los que se basarán los inmunosensores de este trabajo serán ensayos directos mediante la inmovilización de los anticuerpos sobre la superficie sólida de micropartículas magnéticas. En una dispersión de estas partículas magnéticas (MBs) modificadas con el anticuerpo, se lleva a cabo una incubación competitiva de una concentración constante del conjugado DON-HRP (micotoxina deoxinivalenol unida al enzima peroxidasa) con disoluciones de DON libre. Después de etapas de lavado y separación del exceso de DON-HRP no unido al anticuerpo, se lleva a cabo la etapa de transducción (hemos estudiado paralelamente transducción espectrofotométrica y electroquímica) añadiendo un sustrato del enzima HRP (HQ ó TMB) y peróxido de hidrógeno. El producto de la reacción enzimática amplificada se detecta mediante absorción molecular o amperométricamente. Hemos escogido un esquema de ensayo directo evitando el problema de reconocimiento por el anticuerpo de la micotoxina una vez inmovilizada. Para una mayor accesibilidad del anticuerpo, la micotoxina ha de conjugarse previamente a una proteína de gran tamaño, como por ejemplo albúmina sérica bovina, por lo que no quedan muchos grupos funcionales epítopos del anticuerpo en el ensayo indirecto. La gran ventaja del inmunoensayo directo del DON es que menores concentraciones de DON hacen que aumente competitivamente la cantidad de DON-HRP que se une a los sitios de anticuerpo disponibles, por lo que aumenta la señal obtenida. De esta forma, se mejora la sensibilidad y el límite de detección. Como se irá comentando más adelante, el uso de partículas magnéticas hace que las etapas de lavado y separaciones (en presencia de un campo magnético externo) tengan una eficiencia del 100%. La dispersión de MBs mejora la accesibilidad en las reacciones antígeno-anticuerpo, por lo que los tiempos de incubación y la eficacia de la reacción de inmunoensayo mejoran comparando con una inmovilización del anticuerpo de DON directamente sobre una superficie sólida, como por ejemplo un pocillo de una microplaca ELISA. 4.1 CARACTERIZACIÓN DEL CONJUGADO ENZIMÁTICO DEOXINIVALENOLPEROXIDASA (DON-HRP) El conjugado DON-HRP es uno de los reactivos más importantes de los esquemas de inmunoensayo en el que se han basado los inmunosensores electroquímicos y procedimientos mELISA que hemos desarrollado en todo este trabajo, puesto que 106 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN compite junto al DON por los sitios de unión de los anticuerpos, y es el responsable de producir las señales analíticas (absorbancia y corriente). Por lo tanto, es importante su caracterización inicial y el estudio de su afinidad hacia los anticuerpos. Después de la síntesis del conjugado enzimático DON-HRP (apartado 3.4.1) se calculó la relación molar teórica de DON/HRP = 13,48 según las cantidades añadidas de cada uno de ellos. Con el objetivo de comprobar que la síntesis había sido satisfactoria y para conocer aproximadamente la relación molar real entre el DON y la HRP y el rendimiento de la reacción, se aplicaron diferentes técnicas analíticas para elucidar esta relación molar en el conjugado enzimático sintetizado. El valor tiene interés teórico en la optimización de concentraciones del inmunoensayo, aunque esta optimización en realidad se llevó a cabo según las condiciones encontradas experimentalmente. Ambas moléculas presentan absorción molecular y fluorescencia molecular, por lo que a partir de espectros individuales se ensayó discernir las concentraciones de ambas en el nuevo conjugado enzimático DON-HRP. Mediante espectrometría de absorción molecular UV-visible (EAM-UV-Visible) se realizó un barrido en todo el espectro (λ = 180 - 800 nm) en cubeta de cuarzo (l=1 cm) con disoluciones individuales de DON y de HRP, para comprobar su absorción molecular. Para ello se midieron disoluciones de DON (10 mg l-1) y de HRP (1000 mg l-1) en agua, obteniéndose los espectros de la Figura 38. 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 0200 400 600 800 1000 Abs λ(nm) DON (10 mg/l) HRP (1000 mg/l) Figura 38: Espectro de absorción molecular (λ = 0 - 800 nm) de DON (10 mg l-1) y de HRP (1000 mg l-1) en agua 4.1 Caracterización del conjugado enzimático deoxinivalenol-peroxidasa (DON-HRP) 107 Los resultados obtenidos demostraron que el máximo de absorción del DON y de la HRP aparece en λ = 218 nm provocando una interferencia aditiva que impide que se pueda realizar la determinación de ambos compuestos en el conjugado DON-HRP. Se observó también un pico a λ = 402 nm para la HRP (originado por su grupo hemo) [255], pero debido a su baja sensibilidad no se obtuvo una buena recta de calibrado con patrones de HRP a esa longitud de onda (coeficiente de regresión R = 0,6870) por lo que la concentración de HRP obtenida no fue coherente con lo esperado. Se propuso medir por espectrofotometría de absorción molecular UV-visible aplicando la Ley de Aditividad de Absorbancias donde se cumple (Ecuación 2): Abs total = Abs DON + Abs HRP Ecuación 2: Ley de Aditividad de Absorbancias Se realizó la medida de la absorbancia producida por los patrones de DON (10 mg l-1) y de HRP (1000 mg l-1) en agua a dos longitudes de onda diferentes, 218 y 402 nm y se aplicó la Ley de Lambert-Beer, según el sistema de ecuaciones (Ecuación 3): Ecuación 3: sistema de ecuación de la ley de Aditividad de Absorbancias para λ 218 y 402 nm Con los resultados obtenidos no se pudo calcular la relación molar DON/HRP, y se obtuvieron valores negativos o incoherentes. Por lo tanto, la relación molar no se puede medir de esta forma, teniendo en cuenta también que el método de Aditividad de Absorbancias solo es válido para mezclas de moléculas simples pero no para conjugados, al aparecer absorbancias diferentes debidas a la conjugación. Esto significa que la suma de las absorbancia de ambos compuestos puros no es igual a la absorbancia producida por el conjugado enzimático resultante de la reacción entre ambos individualmente, provocando que las igualdades propuestas no sean correctas y que por lo tanto el sistema de ecuaciones sea matemáticamente erróneo. Mediante fluorescencia molecular (cubetas de cuarzo, l=1 cm), se realizó un espectro de emisión de fluorescencia para el DON utilizando como longitud de onda de excitación su máximo de absorción (λexc = 218 nm). El espectro obtenido se muestra en la Figura 39: 108 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN -5 0 5 10 15 20 25 30 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 Fluorescencia λ(nm) Figura 39: Espectro de emisión de fluorescencia (λexc = 218 nm) de DON (10 mg l-1) en tampón PBS En el espectro de emisión obtenido se obtuvieron dos picos. Se comprobó mediante pequeños cambios en la λexc que el pico debido a la fluorescencia del DON es el que se encuentra en λem = 382 nm (el pico en 450 nm corresponde a algún tipo de dispersión porque al modificar λexc no permanece fijo). Se ensayaron diferentes λem para comprobar la existencia de otros máximos de fluorescencia. El máximo de emisión del DON apareció en λem = 382 nm., por lo tanto, las longitudes de onda óptimas de trabajo fueron: λexc = 218 nm λem = 382 nm En estas condiciones, los espectros de fluorescencia de los patrones de DON (10 mg l-1) y de HRP (1000 mg l-1) son los representados en la Figura 40. λem = 382 nm 4.2 Estudio de la afinidad de anticuerpos policlonal y monoclonal para el deoxinivalenol 115 los pocillos de poliestireno de la placa ELISA, con diferentes concentraciones de DONHRP sintetizado. Es una experiencia más completa que la llevada a cabo mediante SPR puesto que se van a poder estudiar comparativamente varias concentraciones de ambos biorreactivos, al contrario que en el SPR que solo se puede inmovilizar una concentración determinada de pAbDON para cada experiencia, pues una vez inmovilizado, se consume ese canal del chip y supone un elevado coste económico. La etapa más importante del ensayo ELISA es la inmovilización del anticuerpo sobre los pocillos de poliestireno porque una correcta inmovilización dará como resultado una orientación apropiada de los anticuerpos con su región Fab libre para el reconocimiento del analito y por lo tanto una mayor sensibilidad obteniéndose por lo tanto mayores señales. Sin embargo, la adsorción física sobre los pocillos de poliestireno no asegura la correcta orientación de los anticuerpos, y su adecuada y uniforme orientación de su región Fab en posición óptima y accesible para el reconocimiento de DON y DON-HRP, pudiendo producirse ésta de forma aleatoria en posiciones más o menos adecuadas. Se siguió un procedimiento en el que la inmovilización del pAbDON se realizó con agitación y a T ambiente [74], obteniéndose absorbancias correspondientes con las concentraciones añadidas muy bajas (Absmáximas < 0,200), por lo que se decidió modificar las condiciones de esta etapa realizando la inmovilización del pAbDON durante más tiempo (24 h) , a 4 °C y sin agitación. Las absorbancias debidas a diferentes concentraciones de anticuerpo y de conjugado DON-HRP después del tiempo de incubación (60 min), midiendo la cantidad de HRP tras su reacción con TMB/H2SO4, se recogen en la tabla 12. pAbDON (mg l-1) DON-HRP (mg l-1) 2 1 0,5 0,25 0,125 0 5 0,866 0,733 0,708 0,463 0,437 0,374 2,5 0,417 0,204 0,173 0,143 0,094 0,114 1,25 0,318 0,115 0,053 0,030 0,050 0,022 0,625 0,348 0,040 0,028 0,005 0,006 0,005 0 0,266 0,042 0,007 0,003 -0,009 -0,012 Tabla 12: Absorbancias obtenidos en el ELISA convencional con inmovilización de pAbDON (02 mg l-1) durante 24 h, 4 °C y DON-HRP (0-5 mg l-1) incubación 60 min Con estas modificaciones sobre el procedimiento inicial se observó un aumento considerable de las absorbancias, con lo cual se consiguió una mayor sensibilidad. Con 116 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN estos resultados experimentales se pudo comprobar que existe afinidad entre el pAbDON y el DON-HRP, sin tener en cuenta la etapa de competición posterior ya que se observa que para todas las concentraciones hay una disminución de la señal a medida que se disminuye la concentración de pAbDON (filas) de la misma forma que en los casos que se disminuye la concentración de DON-HRP (columnas). Se observó, no obstante, una elevada unión no específica cuando no hay pAbDON sobre la superficie del pocillo obteniéndose una señal 0,374 unidades de absorbancia para una concentración de DON-HRP de 5 mg l-1 y una señal de 0,266 cuando no hay DON-HRP y sí hay pAbDON inmovilizado sobre la superficie del pocillo. La existencia de uniones inespecíficas no se había observado con el sensor SPR, por lo que son producidas por uniones de los biorreactivos sobre los pocillos de poliestireno que no se han podido eliminar durante las etapas de lavado. Esta situación es normal, dada la capacidad de adsorción de las proteínas sobre el poliestireno, por lo que se barajó la posibilidad de realizar en futuras experiencias, etapas previas de bloqueo de los pocillos. -ELISA inmunomagnético (mELISA) utilizando MBs: Las partículas magnéticas se utilizaron como superficie sólida de inmovilización del elemento de biorreconocimiento (anticuerpo) y de las etapas del inmunoensayo, con las ventajas que esto conlleva. El uso de MBs produce una mejora en el rendimiento de la reacción inmunológica debido a un aumento de la relación superficie/volumen para la disposición del anticuerpo (evita impedimentos estéricos), así como favorecen separaciones, lavados y preconcentraciones bajo la acción de un campo magnético con un rendimiento próximo al 100%, y garantizan menores tiempos de incubación al tratarse de una dispersión (frente por ejemplo a la superficie sólida de un pocillo ELISA), y una localización muy precisa sobre la superficie del transductor [269]. Las MBs poseen una cinética más rápida ya que se encuentran en suspensión y favorecen la difusión del antígeno y su acercamiento al anticuerpo. Además, presentan una baja adsorción inespecífica y se minimiza el efecto matriz de las muestras analizadas [73] debido a la alta eficiencia en la separación durante las etapas de lavado por acción de un campo magnético que es capaz de atraer las partículas magnéticas con los biorreactivos inmovilizados sobre las mismas y permite la eliminación del sobrenadante con los reactivos en exceso que no se hayan unido [189]. Debido a las ventajas descritas que supone el uso de partículas magnéticas como superficie sólida de inmovilización del anticuerpo como elemento de biorreconocimiento y en el inmunoensayo, se propuso el modo de trabajo con MBs. La 4.2 Estudio de la afinidad de anticuerpos policlonal y monoclonal para el deoxinivalenol 117 detección de la señal se realizó mediante un lector ELISA espectrofotométrico de absorción molecular, de forma semejante a la realizada en las reacciones sobre el pocillo de poliestieno. En un primer lugar, se utilizaron para este estudio MBs modificadas con la proteína A, capaz de orientar favorablemente anticuerpos tipo IgG1, especialmente los procedentes de conejo (coincidiendo con el tipo de anticuerpo pAbDON), uniéndose a su región Fc y dejando por lo tanto libre la región Fab libre para el reconocimiento del antígeno. La experiencia se realizó en presencia del pAbDON (1 µg) inmovilizado sobre las MBsprA y en ausencia de éste. Se incubó en ambos casos DON-HRP (0 µg l-1) y DON-HRP (1 µg l-1) para evaluar la afinidad entre la micotoxina y el pAbDON cuando éste se encuentra inmovilizado sobre las MBs-prA y la especificidad y selectividad de esta unión. La incubación del DON-HRP (1 µg l-1) se realizó de modo que fuera en un principio equimolar a la concentración de pAbDON inmovilizada según el procedimiento recomendado por la casa comercial asumiendo que la unión de pAbDON y de DON-HRP (procedente de la síntesis) tenga una estequiometría 1:1. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 44: 0.181 0.115 0.247 0.159 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 MBS-prA-pAbDON MBS-prA Abs DON-HRP (0 µg/l) DON-HRP (1 µg/l) Figura 44: Afinidad y especificidad entre pAbDON (0 y 1 µg) inmovilizado sobre MBs-prA durante 10 min y DON-HRP (0 y 1 µg l-1). Tiempo de incubación: 60 min 118 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se observa el biorreconocimiento del DON-HRP sintetizado por parte del pAbDON, obteniéndose una mayor señal en la experiencia que incluye pAbDON y DON-HRP (Abs 0,247), pero se observa una fuerte unión inespecífica del DON-HRP sobre la proteína A en los casos en los que no hay pAbDON y por lo tanto la señal debería ser mínima (no existe unión de DON-HRP ni de enzima catalizando la reacción del TMB y la señal de absorbancia obtenida es alta), provocadas por un gran exceso de la cantidad de HRP en relación al DON en el conjugado enzimático sintetizado. Además aparece una alta señal de blanco en los casos en los que no se añadió el DON-HRP, producida por la unión inespecífica del sustrato TMB sobre la proteína A. No es posible trabajar con una señal mínima de absorbancia de 0,115 producida por uniones inespecíficas con este tipo de MBs, por lo que se ensayaron a continuación con otro tipo de MBs funcionalizadas con grupos Tosilo (MBs-To). El anticuerpo pAbDON fue inmovilizado mediante un enlace covalente a través de sus grupos amino sobre las MBs-To según se ha indicado en el apartado 3.4.3.2 (concentración de pAbDON utilizada 0,2 mg l-1) produciendo el desplazamiento de los grupos tosilo. A continuación se llevó a cabo la incubación con diferentes concentraciones de DON-HRP (0-5 mg l-1) con la finalidad de comprobar la afinidad entre ambos. Una vez incubado y tras los lavados posteriores se añadieron 50 µl de MBs-TopAbDON-DON-HRP en los pocillos para llevar a cabo la reacción con el sustrato enzimático TMB. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 13: Tabla 13: Absorbancias obtenidas en el ELISA inmunomagnético utilizando MBs-To con inmovilización de pAbDON (0,2 mg l-1) durante 24 h y DON-HRP (0-5 mg l-1). Tiempo de incubación: 60 min Se obtuvo un aumento proporcional de señales de absorbancia a medida que se aumentó la concentración de DON-HRP en el ensayo, lo que significa que al utilizar MBs-To se produce la reacción de afinidad entre el pAbDON inmovilizado y el DONHRP sintetizado. Quizás por una mejor inmovilización del anticuerpo sobre las partículas magnéticas modificadas con el grupo tosilo en comparación con las modificadas con proteína A. MBs-To-pAbDON (0,2 mg l-1) DON-HRP (mg l-1) 0 0,3 0,6 1,25 2,5 5 0,060 0,232 0,282 0,334 0,545 0,849 4.2 Estudio de la afinidad de anticuerpos policlonal y monoclonal para el deoxinivalenol 119 Se realizó una comparativa entre los resultados obtenidos con la inmovilización sobre el pocillo de poliestireno y sobre las MBs-To para una concentración similar de pAbDON se resume en la Tabla 14: SIN MBs CON MBs DON-HRP (mg l-1) pAbDON (0,25 mg l-1) pAbDON (0,2 mg l-1) 0 0,003 0,060 0,6 0,005 0,282 1,25 0,030 0,334 2,5 0,143 0,545 5 0,363 0,849 Tabla 14: Comparativa de absorbancias obtenidas utilizando el ELISA inmunomagnético con inmovilización del pAbDON (0,25 o 0,2 mg l-1) durante 24 h sobre el pocillo de poliestireno o sobre las MBs-To y DON-HRP (0-5 mg l-1) incubación 60 min Estos datos (Tabla 14) han demostrado que los valores de absorbancia obtenidos con MBs-To y con inmovilización del pAbDON sobre el pocillo muestran la misma tendencia, pero en el caso de utilizar MBs-To las señales de absorbancia son mucho mayores. Por el contrario, se observa que las señales de blanco o para concentraciones bajas de DON-HRP son mucho mayores utilizando MBs-To que sin ellas, esto es debido a una alta unión no específica sobre la superficie de las partículas magnéticas modificadas con el grupo tosilo, lo que provoca problemas de unión inespecífica de la HRP del conjugado DON-HRP sobre las MBs-To, pero que no se producen en el caso de trabajar sobre el pocillo de poliestireno. 4.2.1.3. Optimización de la transducción electroquímica del inmunosensor - Optimización de la detección electroquímica y de la reacción enzimática sobre electrodos serigrafiados individuales (SPCEs): La etapa final de los inmunosensores electroquímicos mide la cantidad de conjugado enzimático micotoxina-HRP unido competitivamente a los anticuerpos inmovilizados que no ha sido desplazada por la micotoxina libre, por consiguiente, la señal obtenida es menor cuanta mayor es la concentración de DON que compite. 120 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Puesto que son muy diversos los sustratos enzimáticos catalizados por este enzima (HRP), para nuestro trabajo se caracterizó únicamente la hidroquinona. La hidroquinona (HQ) es un sustrato muy sensible de la reacción enzimática de la HRP, y en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) se oxida a p-benzoquinona (pBQ), compuesto activo electroquímicamente por lo que podemos cuantificarla aplicando el potencial de reducción adecuado. Para seleccionar el potencial óptimo de reducción de la pBQ, se caracterizó electroquímicamente la HQ (1,8 mM) aplicando un barrido cíclico de potenciales (voltametría cíclica, VC) sobre los mismos SPCEs. Las condiciones que se fijaron en el potenciostato fueron:  Potencial inicial: -0,6 V  Potencial final: 1 V  Velocidad de barrido de potencial: 50 mV s-1  Electrodo serigrafiado SPCEs (Universidad de Florencia, Italia). Con la voltametría cíclica (VC) realizada en primer lugar hacia potenciales positivos se provocó la oxidación de la HQ para posteriormente llevar a cabo la reducción, de igual forma que se realizó en la etapa final del inmunosensor sobre el electrodo serigrafiado de carbono (SPCE). El voltagrama cíclico obtenido se muestra en la figura 45: Figura 45: Voltametría cíclica HQ (1,8 mM) de -0,6 a 1 V a 50 mV s-1 utilizando los SPCEs individuales El compuesto químico HQ presenta un potencial de oxidación en torno a +0,4 V, y una vez oxidada, la pBQ generada se reduce a un potencial cercano a -0,2 V. 4.2 Estudio de la afinidad de anticuerpos policlonal y monoclonal para el deoxinivalenol 121 El alto valor de potenciales que separa a ambos picos (460 mV), mucho mayor del valor teórico de reversibilidad (52/n mV), indica un proceso de transferencia de carga lento o irreversible electroquímicamente. Esto que en principio puede parecer un inconveniente, en realidad en nuestro caso supone una ventaja en la detección voltamétrica aplicada al inmunosensor, pues durante un barrido catódico se evita de una forma más eficaz la posible oxidación electroquímica en los menores potenciales iniciales de la HQ, con lo que la pBQ generada provendría en parte de la oxidación enzimática y además de la oxidación electroquímica no relacionada esta última con la extensión de la reacción del inmunoensayo competitivo. Al contrario, es importante observar que al potencial inicial de la medida (0 V) todavía no se ha producido la oxidación electroquímica de la HQ debido a la irreversibilidad (separación de los picos anódico y catódico) del voltagrama cíclico. Con estos valores de potencial de oxidación y reducción se seleccionó el salto de potencial óptimo para la técnica cronoamperometría (∆ECRA), para ello se tomó la posición del pico catódico (-0,16 V) y se eligió un salto de potencial en el sentido de la reducción desde 0 hasta -0,25 V durante 90 segundos. - Optimización de la concentración H2O2: Se realizaron medidas por cronoamperometría (CRA) con el potenciostato PGSTAT12, provocando un salto de potencial desde 0 hasta -0,25 V para optimizar las concentraciones del sustrato y cosustrato de la reacción enzimática (HQ y H2O2), en primer lugar en ausencia del enzima HRP unida a estreptavidina (eaHRP tomada como patrón) para comprobar la corriente capacitativa (y faradaica) de una disolución blanco, que equivaldría a la corriente de una medida del inmunosensor en condiciones de competitividad total (ausencia de DON-HRP completamente desplazado por el DON). Las corrientes obtenidas se muestran en la tabla 15: EXPERIENCIA Sin HQ Con HQ (1,8 mM) Ausencia HRP I (µA) I (µA) H2O2 (0 mM) -0,059 -0,134 H2O2 (0,4 mM) -0,068 -0,110 H2O2 (0,6 mM) -0,073 -0,114 H2O2 (1 mM) -0,098 -0,142 H2O2 (1,8 mM) -0,102 -0,143 H2O2 (2,4 mM) -0,113 -0,140 Tabla 15: Corrientes CRA entre 0 y -0,25 V con H2O2 (0 - 2,4 mM), en ausencia de HQ y con HQ (1,8 mM) y en ausencia de eaHRP 122 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se observó que cualquier concentración de H2O2 produce corrientes muy pequeñas en ausencia del enzima HRP (del orden de nA). Cuando se añadió además HQ (1,8 mM) y todavía en ausencia del enzima HRP la corriente aumentó, pero en principio no se puede considerar interferente (aprox. -0,1 µA). Este aumento en la corriente en presencia de la HQ y el H2O2 fue debido a la oxidación de la HQ que se produce una vez disuelta, dando pBQ generada químicamente por el oxígeno del aire, y su posterior reducción electroquímica, lo que demuestra la inestabilidad de la disolución de HQ que es preciso preparar inmediatamente antes de cada medida electroquímica. Otro factor a tener en cuenta es el efecto de la presencia de la HQ en contacto con la HRP. Se inmovilizó el enzima peroxidasa (la eaHRP comercial se tomó como patrón de la concentración de HRP) durante 24 h sobre la superficie del electrodo de trabajo (4 µl) a 4 °C y protegida de la luz, y se midió la corriente generada mediante la técnica de CRA (cronoamperometría) después de 10 minutos de reacción enzimática con los sustratos de la reacción (HQ + H2O2), contados desde la adición del H2O2 sobre el SPCE. Los resultados que se obtuvieron son: EXPERIENCIA Sin HQ Con HQ (1,8 mM) HRP (0,13 µg) I (µA) I (µA) H2O2 (0 mM) -0,057 -0,023 H2O2 (0,4 mM) -0,033 -0,421 H2O2 (0,6 mM) -0,033 -0,831 H2O2 (1 mM) -0,033 -1,52 H2O2 (1,8 mM) -0,023 -2,34 H2O2 (2,4 mM) -0,026 -2,44 Tabla 16: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (0 – 2,4 mM), en ausencia y con HQ (1,8 mM) y en presencia de eaHRP (0,13 µg) tras 10 min de reacción Con estos resultados se demuestra que, lógicamente, para que la reacción enzimática se produzca tienen que intervenir los tres reactivos (enzima + sustrato + mediador de transferencia de carga). En ese caso, se observó un aumento proporcional de la señal con el aumento de la concentración de H2O2 hasta la saturación de la señal a partir de H2O2 (1,8 mM), tal y como se recoge en la tabla 16 y se representa en la figura 46: 4.2 Estudio de la afinidad de anticuerpos policlonal y monoclonal para el deoxinivalenol 123 -0.0234 -0.421 -0.83 -1.52 -2.34 -2.44 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0 0.4 0.6 1 1.8 2.4 I(µA) [H2O2] mM Figura 46: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (0 – 2,4 mM), con HQ (1,8 mM) y en presencia de eaHRP (0,13 µg) después de 10 min de reacción A la vista de los resultados se seleccionó la concentración óptima del H2O2 (1 mM), por los buenos calibrados que se obtuvieron con esta cantidad de conjugado. A partir de 1,8 mM de H2O2 la corriente alcanza un valor constante, lo que significa una saturación cinética de la señal máxima con mayores concentraciones. Las condiciones seleccionadas como óptimas para la reacción enzimática y detección electroquímica del inmunosensor electroquímico fueron:  HQ (1,8 mM)  H2O2 (1 mM)  10 minutos de reacción enzimática  Cronoamperometría (0 a -0,25 V) durante 90 segundos Una vez fijadas estas condiciones, se realizó un calibrado inmovilizando la concentración teórica deseada de DON-HRP (HRP entre 0,0001 y 2 mg l-1) durante 24 h sobre la superficie del electrodo de trabajo (4 µl) a 4 °C mediante adsorción física. Se llevó a cabo la medida por CRA (0 a -0,25 V) tras la correspondiente reacción enzimática junto con HQ (1,8 mM) y H2O2 (1 mM) una vez transcurridos los 10 min. Los resultados obtenidos se presentan en la figura 47: 124 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN -0.108 -1.40 -1.76 -2.33 -2.55 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.0001 0.05 1 1.5 2 I (µA) [HRP] mg/l DON-HRP Figura 47: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (1 mM), y HQ (1,8 mM) con concentraciones DON-HRP ([HRP] 0,0001-2 mg l-1). Reacción enzimática 10 min. La corriente medida va aumentando frente al aumento de la cantidad de HRP inmovilizada. En esta experiencia se confirmó que la reacción electroquímica entre el DON-HRP sintetizado con HQ (1,8 mM) y H2O2 (1 mM) por CRA (0 a - 0,25 V) sucede de forma satisfactoria, y existe un aumento de la señal con respecto al aumento de la concentración del conjugado enzimático. 4.2.1.4 Estudio de la afinidad del pAbDON sobre diferentes partículas magnéticas Después del estudio de afinidad utilizando MBs-To como superficie sólida de inmovilización en un ensayo basado en un ELISA espectrofotométrico en el que se ha observado un cierto biorreconocimiento del DON-HRP sintetizado por el pAbDON y tras la elección de la técnica electroquímica y la optimización de las condiciones óptimas de la reacción enzimática, se estudió la afinidad de pAbDON y el DON-HRP utilizado transducción electroquímica con el objetivo de seleccionar las MBs que ofrezcan los mejores resultados. 4.6 Determinación de DON en muestras de origen cereal 227 Se concluye que la reacción de inmunoensayo que se ha optimizado produce valores de concentración de DON consistentes por los dos tipos de transducción espectrofotométrica y electroquímica. 4.6.2.2 Comparativa estadística para la harina de trigo (Super para Haricaman): Del mismo modo, se realizaron las comparaciones de concentraciones obtenidas en los extractos de la harina de trigo (Haricaman) por el sensor óptico mELISA y por el inmunosensor con detección AD-a. Los resultados a comparar (obtenidos en el apartado 4.6.1.1) se han recogido en la tabla 60: TRIGO mELISA TRIGO AD-a 68,9 58 70,4 70,2 74,6 65,2 Tabla 60: Concentraciones de DON (µg kg-1) de la harina de trigo obtenidas con medidas mELISA y AD-a. La prueba F realizada para comprobar si las varianzas de las series de datos son iguales concluyó que las varianzas son diferentes con una probabilidad del 95% (Fcrit < Fcalc). Prueba F para varianzas de dos muestras TRIGO mELISA TRIGO AD-a Media 69,78 64,1 Varianza 15,12 74,42 Observaciones 4 2 Grados de libertad 3 1 F 0,20 P(F<=f) una cola 0,11 Valor crítico para F (una cola) 0,10 Tabla 61: Prueba F para el cálculo de varianzas Como consecuencia de la prueba F realizada se realizó el test t suponiendo varianzas desiguales (tabla 62): 228 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales TRIGO mELISA TRIGO AD-a Media 69,78 64,1 Varianza 15,12 74,42 Observaciones 4 2 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 1 Estadístico t 0,89 P(T<=t) una cola 0,27 Valor crítico de t (una cola) 6,31 P(T<=t) dos colas 0,54 Valor crítico de t (dos colas) 12,71 Tabla 62: Prueba t para 2 muestras con varianzas desiguales para comparar la concentración obtenida en la harina de trigo por mELISA y por AD-a A la vista de los resultados puede confirmarse que el inmunosensor mELISA y el electroquímico dieron concentraciones de DON estadísticamente comparables (probabilidad 95%) sobre la harina de trigo. 4.6.2.3 Comparativa estadística para la harina de maíz (Haricaman): Para los resultados obtenidos en los extractos de la harina de maíz (Haricaman) con ambos tipos de transducción, se comparó de igual modo que en los casos anteriores. Las concentraciones se recogen en la tabla 63 (apartados 4.6.1.1 y 4.6.1.2): MAIZ mELISA MAIZ AD 64,8 69,2 79,0 59,6 72,4 Tabla 63: Concentraciones de DON (µg kg-1) obtenidas en la harina de maíz a partir de las medidas por mELISA y por AD-a. En la tabla 64 se ha incluido el cálculo del factor estadístico F: 4.6 Determinación de DON en muestras de origen cereal 229 Prueba F para varianzas de dos muestras MAIZ mELISA MAIZ AD Media 72,07 64,4 Varianza 50,49 46,08 Observaciones 3 2 Grados de libertad 2 1 F 1,09 P(F<=f) una cola 0,56 Valor crítico para F (una cola) 199,5 Tabla 64: Prueba F para el cálculo de varianzas De la tabla 64 se extrae que las varianzas obtenidas entre las 2 series de datos se consideran estadísticamente iguales (Fcalc < Fcrit) con una probabilidad del 95%. Por lo tanto se procedió a realizar el test estadístico para el cálculo de t en muestras con varianzas iguales (tabla 65): Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales MAIZ ELISA MAIZ AD-a Media 72,01 64,4 Varianza 50,49 46,08 Observaciones 3 2 Varianza agrupada 49,02 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 3 Estadístico t 1,20 P(T<=t) una cola 0,16 Valor crítico de t (una cola) 2,35 P(T<=t) dos colas 0,32 Valor crítico de t (dos colas) 3,18 Tabla 65: Prueba t para 2 muestras con varianzas iguales en la comparación de la concentración en la harina de maíz por mELISA y por AD-a Al igual que en los casos anteriores, no existen diferencias significativas entre las concentraciones de DON determinadas por mELISA y por AD-a. Como conclusión final, en las tres muestras de harina estudiadas (CRM, harina comercial de trigo y de maíz) tanto la transducción espectrofotométrica como 230 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN electroquímica proporciona iguales resultados de concentración de DON, con una probabilidad del 95%. Por lo tanto los inmunosensores desarrollados pueden considerarse métodos exactos y analíticamente robustos para la determinación de DON en harinas de maíz y de trigo. 4.6.3 Reproducibilidad entre determinaciones realizadas sobre diferentes extractos del CRM TR-D100. En este apartado se estudia la reproducibilidad de la determinación de DON sobre 4 extractos diferentes del CRM (TR-D100, Lote D-W-158) obtenidos en cuatro extracciones independientes realizadas de forma simultánea. Las concentraciones de las señales se interpolaron en un único calibrado realizado simultáneamente. En todos los casos, las disoluciones de DON-HRP (10x, dilución 1/5 (v/v), PBS (0,1 M pH 7,4) y las MBs-prG-mAbDON fueron las mismas con el fin de evitar los cambios de estas variables que influyan en la DSR. El calibrado se muestra en la Figura 96: -3 -2 -1 0 1 2 3 -4 -3 -2 -1 0 Log [DON] (g/l) I (A) Figura 96: Calibrado de DON utilizado en el estudio de reproducibilidad Los parámetros del ajuste no lineal (modelo 3PL óptimo en este caso) se recogen en la Tabla 66. 4.6 Determinación de DON en muestras de origen cereal 231 Parámetros Mínimo (µA) -0,074 Máximo (µA) -3,267 EC50 (µg l-1) 7,57 Pendiente 1 %Competición 91,9 R 0,9940 Tabla 66: Parámetros logísticos (modelo 3PL) del calibrado de la figura 96 (AD-a). El ajuste es satisfactorio (R=0,9940), y los parámetros encontrados son los habituales. Se obtuvo un EC50 de 7,57 µg l-1 valor que se encuentra dentro del intervalo de EC50 obtenido en calibrados anteriores en las mismas condiciones (comprendidos entre 7 y 11 µg l-1). Las extracciones de DON del CRM se realizaron en PBS (0,1 M pH 7,4) siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.4.8.1. Para la correcta interpolación se realizó una dilución 1/10 en PBS (0,1 M pH 7,4) para que la concentración final quede en la zona central de la curva sigmoidea (la dilución del extracto 1/10 fue estimada según el valor de EC50 esperado, ya que el calibrado y la reacción competitiva del extracto se realizaron al mismo tiempo, sin conocer previamente el factor EC50. Las 4 determinaciones, así como el calibrado, se realizaron utilizando el mismo array de electrodos CH8, siendo reutilizados una vez lavados con agua milliQ y secados con una corriente de aire a presión. Se realizaron 8 réplicas de cada uno de los extractos de DON diferentes (4x8 medidas). Las señales obtenidas en los cuatro extractos se interpolaron en la curva de calibración de la figura 96, obteniéndose las concentraciones (µg kg-1 DON) indicadas en la Tabla 67. Los errores que aparecen en la tabla 67 se han calculado con respecto al valor certificado del CRM (TR-D100, Lote D-W-158), 1400± 200 µg kg-1. 232 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN [DON]obtenida (µg kg-1) Réplicas Extracto 1 Extracto 2 Extracto 3 Extracto 4 Media %DSR %Error 1 1127,7 1589,7 1475,0 1726,6 1479,7 17,3 5,7 2 1481,6 2318,4 1461,4 1660,9 1730,6 23,2 23,6 3 1394,3 1318,5 2007,7 1959,6 1670,0 20,8 19,3 4 1773,1 1567,9 1518,9 1458,9 1579,7 8,6 12,8 5 1578,1 1683,3 1733,7 1437,7 1608,2 8,1 14,9 6 1705,5 1815,8 1371,8 2138,3 1757,9 18,0 25,6 7 1860,1 1620,4 1975,8 1876,2 1833,1 8,2 30,9 8 1645,7 1409,2 1393,6 1439,6 1472,0 8,0 5,1 Media 1570,8 1665,4 1617,2 1712,2 %DSR 14,9 18,3 15,8 15,4 %Error 12,2 19,0 15,5 22,3 Tabla 67: Concentraciones de DON (µg kg-1) obtenidas de los 4 extractos del CRM 8 réplicas de cada extracto. El porcentaje de DSR obtenido para las 8 determinaciones realizadas sobre un mismo electrodo son muy próximas al 15% (intervalo entre 14,9 y 18,3%). Los errores en la determinación de DON en los 4 extractos son comparables entre si y todos ellos son inferiores al 22%, por exceso. En el caso de los 8 electrodos de un mismo array CH8 se observó que la %DSR encontrada en las 8 medidas varía en un intervalo más amplio que en el caso de los 4 extractos. Se obtuvo una variación de %DSR comprendida entre 8% (para los electrodos número 4, 5, 7 y 8) y 23% (para el electrodo 2). Igualmente los errores calculados se encuentran en un intervalo amplio, desde 5,1 a 30,9%. Con los datos obtenidos se realizó un análisis de la varianza de un factor (ANOVA) para evaluar si existen diferencias significativas (con una 95% de probabilidad) entre los resultados obtenidos entre diferentes extractos y entre diferentes electrodos. ANOVA para los 4 extractos: Se estudió la existencia de diferencias significativas entre los 4 extractos independientes de DON, tomando las medias de las 8 medidas realizadas sobre el array CH8 para cada extracto: 4.6 Determinación de DON en muestras de origen cereal 233 RESUMEN Extractos Cuenta Suma Promedio Varianza EXTRACTO 1 8 12566,13 1570,77 54849,50 EXTRACTO 2 8 13323,31 1665,41 93239,27 EXTRACTO 3 8 12937,95 1617,24 65574,08 EXTRACTO 4 8 13697,82 1712,23 69471,97 ANÁLISIS DE VARIANZA Origen variaciones Suma cuadrados Grados libertad Promedio cuadrados Fcalc Prob. Fcrit Entre grupos 89326,77 3 29775,59 0,42 0,74 2,95 Dentro de grupos 1981943,79 28 70783,71 Total 2071270,57 31 Tabla 68: ANOVA de un factor aplicada sobre las concentraciones de los 4 extractos independientes del CRM Del cálculo ANOVA anterior se concluye que no existen diferencias estadísticas entre los 4 extractos estudiados (Fexp<Fcrit), luego las concentraciones determinadas pueden considerarse iguales. Por lo tanto la extracción de muestra es reproducible, considerando que el resto de variables y el propio procedimiento de medida no introduce variaciones sobre los resultados al haberse realizado en el mismo día y con los mismos biorreactivos. ANOVA de un mismo extracto medido sobre 8 electrodos: En este caso se comparan las concentraciones de un mismo extracto replicado en los 8 electrodos de la placa serigrafiada CH8. Se comparan las medias de las 4 medidas obtenidas sobre cada uno de los 8 electrodos de cada placa sensora CH8. RESUMEN Electrodos Cuenta Suma Promedio Varianza 1 4 5918,95 1479,74 65669,88 2 4 6922,32 1730,58 161634,89 3 4 6680,10 1670,03 132501,28 4 4 6318,83 1579,71 18617,79 5 4 6432,87 1608,23 17119,43 6 4 7031,53 1757,8 99952,99 7 4 7332,50 1833,13 22722,16 8 4 5888,11 1472,03 13768,054 234 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ANÁLISIS DE VARIANZA Origen variaciones Suma de cuadrados Grados libertad Promedio cuadrado s Fcalc Prob Fcrit Entre grupos 475311,18 7 67901,60 1,02 0,44 2,42 Dentro de grupos 1595959,4 24 66498,31 Total 2071270,6 31 Tabla 69: ANOVA de un factor aplicada sobre los resultados de los 8 electrodos del array CH8 Tal y como se muestra en la tabla 69, no hay evidencia de la existencia de diferencias significativas entre las medidas obtenidas entre los 8 electrodos (Fcalc<Fcrit). Por lo tanto, pese a los amplios intervalos de %DSR y %error obtenidos en la tabla 67, estadísticamente las concentraciones determinadas a lo largo de los 8 electrodos del array pueden considerarse iguales. Así pues, se concluye que la determinación de las concentraciones de DON de los cuatro extractos diferentes realizados sobre la misma muestra, así como de las medidas realizadas sobre los 8 electrodos de un mismo array CH8 pueden considerarse iguales entre sí con una probabilidad del 95%, asegurando medidas estadísticamente reproducibles en todos los casos al haberse obtenido valores pequeños de %DSR. 4.7 VALIDACIÓN DE LOS INMUNOSENSORES PARA LA DETERMINACIÓN DE DON Después de las comparaciones estadísticas de concentraciones de DON en las muestras de harinas (mELISA e inmunosensor electroquímico), procedimos a validar los inmunosensores con otras técnicas y procedimientos analíticos, utilizando un kit ELISA comercial y un método de referencia según la AOAC (Association of Official Analytical Chemists) cromatográfico de determinación de DON en cereales mediante HPLC-UV-Vis [71]. El kit ELISA utilizado procede de la casa comercial Europroxima (Referencia 5121DON) y utiliza el mismo conjugado enzimático de nuestro trabajo experimental. Para la comparación de los resultados por ELISA se realizó el ensayo con todos los biorreactivos suministrados en el kit de Europroxima y se siguió el procedimiento y las 4.7 Validación de los inmunosensores para la determinación de DON 235 condiciones indicadas en el manual de instrucciones de este kit comercial (Apartado 3.4.10). Además en los apartados posteriores se describe la validación de los inmunosensores mediante el método oficial mencionado (HPLC-UV-Vis), utilizando el CRM (TR-D100, Lote D-W-158) y midiendo la concentración de DON en una harina comercial de trigo y otra de maíz (Haricaman para supermercados “El Árbol”, ambas con concentraciones de DON desconocidas) para su comparación con los resultados obtenidos con el mELISA y con el inmunosensor electroquímico. El procedimiento recomendado por Vicam que se detalla en el apartado 3.4.8.4, incluye la extracción de la muestra, la limpieza de la matriz y preconcentración con una columna de inmunoafinidad, la dilución del eluído con los disolventes de la fase móvil y la separación y determinación cromatográfica con el HPLC. Puesto que el DON produce una baja intensidad de fluorescencia intrínseca, se utilizó un detector UV-Visible (Waters 996), para su detección y se siguió el procedimiento indicado en el apartado 3.4.9.[71; 291]. 4.7.1 Comparación de resultados con un kit ELISA comercial (Europroxima) Para la comparación de los resultados obtenidos se utilizó el kit ELISA comercial (5121DON) de Europroxima para la determinación de DON. En las recomendaciones del kit se recoge que puede ser utilizado para la determinación cuantitativa de DON hasta concentraciones de 50 µg l-1 para la mayoría de las matrices. El kit comercial incluye una placa ELISA de 96 pocillos (12x8), un bote de tampón “Dilution Buffer” para las diluciones realizadas sobre los biorreactivos y otro de tampón “Rinsing Buffer” para los lavados realizados después de las incubaciones, un vial con anticuerpo (no se indica si es policlonal o monoclonal ni su concentración) selectivo y específico a DON en formato sólido, un vial de conjugado DON-HRP también en formato sólido (tanto el anticuerpo como el DON-HRP fueron diluidos en 4 ml de “Dilution Buffer” tal y como se indica en las instrucciones del kit, con concentraciones propietarias no conocidas) y 8 estándares preparados de DON en un intervalo de concentraciones entre 0 y 2,5 ng ml-1 (0 y 2,5 µg l-1). Además el kit incluye un vial de TMB preparado para el revelado de la señal y un vial de H2SO4 (0,5 M) para parar la reacción enzimática después de la etapa de incubación durante 30 min a 4 °C en ausencia de luz. El protocolo definido por Europroxima (apartado 3.4.10) consiste en un ensayo competitivo directo sobre un anticuerpo específico para DON utilizando un conjugado enzimático de DON-HRP (5121DONCO/NN6994). De ninguno de ambos reactivos se proporciona ninguna información que los caracterice (tipos de biorreactivos, inmunógenos utilizados, concentraciones, etc). 236 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para la extracción de la muestra, se siguió el procedimiento recomendado en las especificaciones del kit (Europroxima). Sobre 1 g de muestra del CRM (TR-D100, Lote D-W-158) se extrajo la micotoxina en 19 ml de agua milliQ con agitación por volteo (agitador Heidolph Reax 2) utilizando la velocidad de agitación 2 (velocidad máxima 10) durante 5 minutos en un vial tipo Falcon para conseguir la homogeneización y la puesta en contacto del disolvente de extracción con la harina sólida. Posteriormente se centrifugó durante 5 minutos a una velocidad de 2000 x g, y finalmente el sobrenadante se separó por filtración. Este último paso se modificó utilizando un microfiltro de 0,22 µm en lugar del filtro de papel indicado, con el fin de facilitar la manipulación, aumentar la velocidad de filtración y disminuir los riesgos de toxicidad dada la alta concentración de DON en el extracto. En las indicaciones del kit se recomienda una dilución 1/5 (v/v) del extracto obtenido con “Dilution Buffer”. Después de la incubación competitiva durante 60 minutos siguiendo en protocolo establecido, la posterior etapa de revelado con TMB durante 30 minutos (parada de la reacción con 100 µl H2SO4 (0,5 M)) y la medida de la absorbancia producida a 450 nm, se obtuvo la curva de calibración recogida en la figura 97. Los parámetros de ajuste de regresión no lineal de este calibrado se recogen en la tabla 70: -4 -3 -2 -1 0 1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Log [DON] (g/l) Abs Figura 97: Curva de calibración de DON obtenida con el kit comercial Europroxima (5121DON) 4.7 Validación de los inmunosensores para la determinación de DON 243 En la segunda experiencia se evaluó la influencia del secado de la muestra. Para ello se procedió a evaporar el disolvente de extracción del DON (de una disolución de 1,4 mg l-1 preparada en 1 ml de MeOH simulando la disolución de DON que se extrae de la columna) con una corriente de N2. Una vez evaporado el disolvente en su totalidad, se reconstituyó en fase móvil y se procedió a su determinación en el HPLC-UV-Vis con el procedimiento cromatográfico habitual. En esta experiencia se pretende evaluar la etapa de secado a través del cálculo del porcentaje de recuperación de DON de una disolución preparada de concentración conocida. Las unidades de las concentraciones de DON indicadas en las tablas son mg l1. ALTURA DE PICO TIEMPO ALTURA [DON]exp [DON]prep %error %Recuperación 6,80 3202,6 1,399 1,4 -0,1 99,9 6,79 3186,9 1,392 1,4 -0,6 99,4 MEDIA 1,396 -0,3 99,7 s 0,005 %DSR 0,355 Int conf 0,044 Tabla 75: % Recuperación obtenidos en la evaluación del proceso de secado de [DON]=1,4 mg l-1 en MeOH. Interpolación en función de la altura de pico La evaporación del disolvente se produce de forma satisfactoria, obteniéndose recuperaciones próximas al 100%, lo que indica que no hay pérdidas del analito durante el proceso de secado y evaporación del MeOH. Es un proceso que hay que realizar con sumo cuidado y controlando la presión del N2, para evitar que la disolución se proyecte, lo que produciría importantes pérdidas de analito y errores en la determinación de DON. Se evaluó también los porcentajes de recuperación obtenidos a partir de la recta de calibrado en función del área de pico (Tabla 76): 244 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ÁREA DE PICO TIEMPO ÁREA [DON]exp [DON]prep %error %Recuperación 6,80 1688,6 1,402 1,4 0,1 100,1 6,79 1687,4 1,401 1,4 0,1 100,1 MEDIA 1,402 0,1 100,1 s 0,001 %DSR 0,050 Int conf 0,006 Tabla 76: Porcentajes de recuperación obtenidos en la evaluación del proceso de secado de [DON]final =1,4 mg l-1 en MeOH. Interpolación en función del área de pico Los resultados obtenidos interpolando a partir del área de pico son muy similares a los obtenidos tomando la altura de pico, consiguiendo recuperaciones del 100% que indican el correcto proceso de secado. Puede concluirse que realizar la evaporación del disolvente con una corriente de N2 hasta sequedad total no produce pérdidas del analito, consiguiendo una recuperación completa del DON (próxima al 100%). Comprobado que el proceso de preconcentración en la columna, recuperación del DON retenido y evaporación del disolvente son correctos y que no suponen pérdidas significativas de analito, se procedió a la determinación de las concentraciones de DON en tres muestras: en el CRMs de DON (TR-D100, Lote D-W-158) harina de trigo certificada con 1400 ± 200 µg kg-1, en una harina comercial de trigo y en otra harina comercial de maíz (Haricaman), estas 2 últimas de concentración no conocida de DON en un principio. El procedimiento de extracción de DON y preparación de las muestras para su inyección en el HPLC es el indicado en el apartado 3.4.8.4. Se ha realizado el proceso de extracción completo (pesada, filtrado, purificación en columna DON test y preconcentración) sobre el CRM (TR-D100, Lote D-W-158) y sobre las harinas comerciales de trigo y maíz. El CRM se inyectó en el HPLC en una concentración final de 1,4 mg l-1 a partir de la concentración inicial de DON en el sólido (1,4 mg kg-1): 1,4 mg kg-1  1 g en 4 ml (PEG/Agua)  Pasar 2 ml por IAC  evaporar y reconstituir en 500 µl de fase móvil  1,4 mg l-1 En la tabla 77 se han recogido las absorbancias obtenidas tanto en la medida de la altura del pico del cromatograma como en las áreas correspondientes para los tiempos de retención de 6,80 min aproximadamente. Las unidades de las concentraciones de DON recogidas en las tablas de resultados son mg l-1. 4.7 Validación de los inmunosensores para la determinación de DON 245 MUESTRAS mg l-1 tr Altura pico [DON]exp Int conf Área pico [DON] exp Int conf CRM 6,78 2836 1,236 1680,2 1,395 6,78 2700 1,176 1636,6 1,359 MEDIA 1,206 MEDIA 1,377 s 0,04 0,384 s 0,03 0,228 %DSR 3,55 %DSR 1,84 Trigo 6,80 22 -0,015 1,3 0,016 6,78 19 -0,017 1,25 0,016 MEDIA -0,016 MEDIA 0,016 s 0,001 0,0085 s 0,00003 0,0003 %DSR 5,95 %DSR 0,18 Maíz 6,90 48 -0,004 9,63 0,023 6,79 57 0,0004 8,85 0,022 MEDIA -0,002 MEDIA 0,023 s 0,003 0,025 s 0,0005 0,004 %DSR 174,4 %DSR 2,00 Tabla 77: Concentraciones de DON (mg l-1) obtenidas para el CRM (TR-D100, Lote D-W-158) y las harinas comerciales de trigo y maíz por HPLC-UV-Vis En la tabla 77 se han recogido las concentraciones de DON obtenidas en los extractos del CRM (TR-D100, Lote D-W-158) así como de las dos harinas comerciales estudiadas, obteniéndose resultados más reproducibles para la determinación en función del área del pico. Se ha observado que en ocasiones es más fiable y reproducible tomar el área de pico como señal analítica ya que resulta proporcional a la concentración de analito, mientras que si el máximo del pico (altura) se desvía del centro del pico unos segundos (unidad de medida en el eje de abscisas) puede dar lugar a diferencias en la altura, lo que supone aumentos en la irreproducibilidad de los resultados. Las conclusiones más relevantes son que en el caso de las harinas comerciales de trigo y de maíz la determinación de la concentración de DON con HPLC no es posible, al no disponer la técnica de la sensibilidad suficiente y a las bajas concentraciones de DON en ambas harinas, por debajo del límite de detección del método HPLC-UV-Vis (LOD = 100 ng g-1 (o 100 µg kg-1) [71]. Por lo tanto puede decirse a partir de la determinación por HPLC que las concentraciones de DON en estas muestras son inferiores a 0,1 mg l-1 (inferiores a 100 µg kg-1, similar a lo obtenido por el mELISA y el inmunosensor electroquímico en los que se encontraron concentraciones de DON en la harina de trigo y de maíz comerciales (Haricaman) próximas a 70 µg kg-1). 246 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se calcularon además los errores cometidos en la determinación de la concentración de DON (concentraciones en mg kg-1) con respecto al CRM certificado interpolando en ambas rectas de calibrado (tabla 78). ALTURAS PICO AREAS PICO mg kg-1 [DON]exp [DON]cert %Error %Rec [DON]exp [DON]cert %Error %Rec Medida 1 1,236 1,401 -11,8 88,2 1,395 1,401 -0,4 99,6 Medida 2 1,176 1,401 -16,1 83,9 1,359 1,401 -3,0 97,0 Tabla 78: Errores en la determinación de DON por HPLC-UV-Vis en 2 réplicas del mismo extracto del CRM (TR-D100, Lote D-W-158) De nuevo se pone de manifiesto que los resultados obtenidos en función de las áreas de pico son mejores que los obtenidos con las alturas de pico. La determinación de la concentración de DON en el CRM (TR-D100, Lote D-W-158) por HPLC-UV-Vis para 2 réplicas realizadas sobre el mismo extracto de muestra, ha dado los resultados que se representan a continuación: [DON]CRM =1,377 ± 0,228 mg kg-1 (%DSR (n=2) = 1,84%) %Error -1,7% %Recuperación 98,3% Los intervalos de confianza se calcularon según el criterio: 4.7.3 Comparación estadística de los resultados frente a HPLC-UV-Vis y frente al kit comercial ELISA (Europroxima). Para la validación de los dos tipos de inmunosensores mELISA y electroquímico se compararon las concentraciones que se obtuvieron con el método de referencia HPLCUV-Vis y frente al kit comercial ELISA (Europroxima). En el apartado 4.6.2 se evalúan posibles diferencias significativas entre las concentraciones de DON del CRM (TR-D100, Lote D-W-158) halladas por mELISA y por detección electroquímica, obteniéndose que pueden considerarse estadísticamente iguales con una probabilidad del 95%. En la tabla 79 se han recogido las concentraciones obtenidas sobre el CRM con los diferentes procedimientos llevados a cabo y con las distintas técnicas analíticas utilizadas: 4.7 Validación de los inmunosensores para la determinación de DON 247 [DON] (µg Kg-1) HARINA TRIGO HPLC-UV-Vis ELISA (kit comercial) mELISA Inmunosensor electroquímico AD-a [DON] certificado TR-D100 1377,1 ± 288,2 1286,3 ± 373,7 1364,7 ± 108,5 1407,3 ± 89,8 1400 ± 200 %Error -1,7 -8,1 -2,5 0,5 %DSR 20,9 3,2 8,6 7,6 Tabla 79: Concentraciones de DON en el CRM y errores cometidos con las distintas técnicas y procedimientos A la vista de los resultados puede decirse que los inmunosensores desarrollados han ofrecido unos resultados de gran exactitud y precisión. Los errores obtenidos tanto para el mELISA como para el inmunosensor electroquímico han sido inferiores al 3%. Con respecto a la precisión se puede decir que es aproximadamente 8% con ambos modos de detección (mELISA y AD-a) en el inmunosensor desarrollado (8,6% y 7,6% respectivamente) y que son inferiores a los %DSR obtenidos con el HPLC-UV-Vis. Para comparar las concentraciones obtenidas con los sensores desarrollados frente al HPLC-UV-Vis como método oficial y frente al kit ELISA de Europroxima (5121DON), se realizó un análisis de varianza ANOVA de un factor para evaluar la existencia de diferencias significativas entre las concentraciones halladas en los inmunosensores desarrollados (Tabla 50 mELISA y Tabla 55 para electroquímico) en comparación con el método oficial de determinación de DON (HPLC-UV-Vis), como se resume en la Tabla 80: Análisis de varianza de un factor RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza HPLC 2 2754,7 1377,4 644,4 ELISA 7 9553 1364,7 13732,5 AD-a 8 11258,1 1407,3 11570,9 248 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados Fcalc Prob Fcrit Entre grupos 6937,11 2 3468,6 0,29 0,75 3,74 Dentro de los grupos 164035,9 14 11716,9 Total 170973,1 16 Tabla 80: ANOVA de un factor aplicada para comparar las concentraciones obtenidas por HPLC, mELISA y AD-a Se ha obtenido Fcrit > Fcalc por lo que puede decirse que estadísticamente no existen diferencias significativas entre las concentraciones halladas con los inmunosensores mELISA y electroquímico (AD-a) en comparación con las concentraciones determinadas con el HPLC. Con estos resultados se concluye que tanto el inmunosensor con detección óptica (mELISA) como con detección electroquímica (AD-a) son robustos en sus resultados analíticos, ya que no se han encontrado diferencias en las concentraciones determinadas el método de referencia AOAC basado en HPLC-UV-Vis. Además se realizó un ANOVA de un factor para la comparación de las concentraciones de los inmunosensores con las obtenidas en el kit ELISA comercial. A priori se vio que los métodos mELISA y AD-a basados en partículas magnéticas producen errores menores que el ELISA convencional en donde el anticuerpo se inmoviliza sobre la pared sólida de los pocillos. Análisis de varianza de un factor RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza kit 2 2572,6 1286,3 1728,7 ELISA 7 9553 1364,71 13732,5 AD-a 8 11258,1 1407,3 11570,9 4.7 Validación de los inmunosensores para la determinación de DON 249 ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados Fcalc Prob Fcrit Entre grupos 24798,5 2 12399,2 1,05 0,38 3,74 Dentro de los grupos 165120,3 14 11794,3 Total 189918,7 16 Tabla 81: ANOVA de un factor aplicada para comparar las concentraciones obtenidas por el kit de Europroxima, mELISA y AD-a En el ANOVA realizado se ha obtenido que Fcrit > Fcalc lo que indica que no existen diferencias significativas entre las concentraciones de DON determinadas por mELISA y por AD-a con las obtenidas con el kit de Europroxima. Las concentrcaiones determinadas con los inmunosensores desarrollados no difieren significativamente de las halladas con el kit comercial de Europroxima. En todos los casos, las concentraciones de DON se encuentran dentro del intervalo del valor certificado por el CRM (TR-D100, Lote D-W-158). Con los resultados expuestos en los apartados anteriores, así como en validación realizada en el apartado 4.7.3 frente a otras técnicas, obteniendo resultados estadísticamente comparables, puede decirse que el inmunosensor de DON desarrollado con transducción espectrofotométrica y electroquímica es capaz de detectar DON en matrices de origen cereal, en concentraciones inferiores a las que permite el HPLC-UV por su límite de detección. Los resultados obtenidos demuestran que se ha desarrollado una técnica reproducible, sensible y selectiva para la determinación de DON en cereales, y que permite determinar concentraciones muy pequeñas y muy por debajo de las limitadas por la legislación Europea y Española. De acuerdo a estos objetivos generales, una de las finalidades del trabajo de investigación reflejado en esta Memoria de Tesis Doctoral es la plasmación del trabajo de investigación en nuevos inmunosensores disponibles para el control de la micotoxina en alimentos, y su posterior comercialización en forma de un nuevo producto que contribuya a su control analítico, partiendo de la base de los dispositivos diseñados, optimizados y validados a lo largo de las experiencias que se han expuesto. El inmunosensor electroquímico desarrollado junto con los protocolos de trabajo necesarios se encuentra plasmado en forma de patente en la Oficina española de 250 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN Patentes y Marcas (OEPM), bajo título “INMUNOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA MICOTOXINA DEOXINIVALENOL (DON)” con el número de registro ES1510.105b (Anexo I). Los términos de autoría y titularidad corresponden 50% a la Universidad de Zaragoza y 50% a la empresa Capher IDI SL (Zaragoza). 4.8 DETERMINACIÓN CONJUNTA DE DON Y FB1 EN MUESTRAS DE HARINA DE CEREALES En la última parte de esta memoria, se muestran los resultados iniciales de la determinación conjunta de DON con la micotoxina FB1, ambas procedentes del mismo hongo (Fusarium), y que usualmente co-existen en una misma muestra. El objetivo es comprobar la posibilidad de determinación conjunta en un mismo extracto de ambas micotoxinas con los dos inmunosensores que hemos desarrollado individualmente para cada una de ellas: inmunosensor para la determinación del DON en este trabajo de Tesis y para la FB1 con las condiciones óptimas (Apartado 3.4.7) de un inmunosensor que están estudiadas en un trabajo previo realizado dentro de nuestro grupo de investigación. La contaminación en alimentos derivados de maíz y/o trigo con ambas micotoxinas (FB1 y DON), es bastante frecuente, ya que ambas provienen de hongos de la misma familia Fusarium, por lo que se planteó este objetivo sobre la extracción conjunta de las dos micotoxinas y su posterior determinación con los dos inmunosensores individuales optimizados. El objetivo en un futuro próximo, es el desarrollo de un dispositivo capaz de determinar cuantitativamente varias micotoxinas de forma simultánea minimizando el tiempo con respecto al uso de inmunosensores individuales. Este apartado pretende tan sólo ser un primer paso para el diseño de este dispositivo y ver las dificultades que se presentan antes de su desarrollo completo. El primer paso es la extracción conjunta de las dos micotoxinas con un buen rendimiento de extracción. 4.8.1 Extracción conjunta de DON y FB1 de las muestras La extracción individual de ambas micotoxinas se estudió previamente, optimizando procedimientos diferentes dadas las diferentes propiedades químicas del DON y de la FB1. El DON (Figura 101) es una molécula muy polar con varios sustituyentes –OH, capaz de disolverse en disolvente (orgánico o inorgánico) de origen polar o incluso en agua. Su extracción individual se realizó en este trabajo utilizando tampón fosfato 4.8 Determinación conjunta de DON y FB1 en muestras de harina de cereales 251 (PBS), sin la presencia de ningún disolvente orgánico y en el mismo tampón utilizado en las etapas del inmunosensor (Apartado 3.4.8.1). Por el contrario, la FB1 (Figura 101) es una molécula lineal compuesta por un grupo amino, grupos metilo y grupos COOH, por lo que es necesario el uso de un disolvente orgánico para su extracción, normalmente mezclas de metanol con agua en proporciones mayores del 70% (v/v) de MeOH, y en algunos casos poniendo una pequeña proporción de ácido acético para asegurar la forma protonada (extraíble) de las dos moléculas [58; 223; 257]. Figura 101: Estructuras químicas del DON y de la FB1 En la bibliografía se describe una amplia variedad de tipos de extracción tanto para el DON (PBS, MeOH, acetonitrilo, mezclas acuosas) como para la FB1 (lo más frecuente mezclas acuosas de metanol o de acetonitrilo en diferentes proporciones) [58; 258]. Estos procedimientos son también dependientes del tipo de determinación instrumental posterior, por ejemplo el acetonitrilo es muy frecuente en extracciones previas a la determinación con cromatografía líquida. Para nuestro estudio en este apartado, realizamos ensayos previos de recuperación de ambas micotoxinas DON y FB1 de la misma muestra, utilizando diferentes porcentajes en volumen de MeOH/H2O (se ensayaron 60:40, 70:30 y 80:20 (v/v)). Se obtuvieron buenos porcentajes de recuperación conjunta de FB1 y de DON provenientes de la misma muestra de cereal con una extracción única utilizando como disolvente MeOH/H2O 70:30 (v/v) (Apartado 4.8.1). El procedimiento coincide con el utilizado habitualmente para la FB1, mientras que los porcentajes de recuperación del DON fueron analíticamente comparables (ANOVA, 95% nivel de confianza) a los obtenidos con el inmunosensor utilizando para la extracción PBS 0,1 M, pH=7,4. No es posible utilizar PBS como disolvente en la extracción conjunta (procedimiento habitual para la extracción de DON) debido a la naturaleza química de la FB1, que hace necesario utilizar un disolvente orgánico. Para rendimientos de extracción próximos al 100% de ambas micotoxinas no fue necesario un mayor porcentaje de metanol del 70% (v/v), que haría necesaria una mayor dilución posterior con tampón PBS para disminuir en lo posible su presencia en 252 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN las disoluciones competitivas del inmunoensayo. El procedimiento de extracción conjunta de DON+FB1 de una matriz de origen cereal (harina) se describe en el apartado 3.4.8.3. En las condiciones indicadas, el porcentaje final de MeOH es menor del 5% (v/v), no afectando negativamente sobre todo a la unión del DON con su anticuerpo. La determinación conjunta de DON+FB1 se realizó sobre una mezcla de los patrones de referencia certificada (CRMs: TR-F100 (Lote F-C-433) y TR-D100 (Lote D-W-158)) procediendo a su extracción según el procedimiento optimizado que se ha descrito en el apartado 3.4.8.3, utilizando como disolvente de extracción MeOH/H2O 70:30 (v/v). 4.8.2 Determinación simultánea de DON y FB1 en los CRMs En los patrones de referencia certificada utilizados, una harina de trigo (TR-D100 [DON]cert = 1400±200 µg kg-1), y una harina de maíz (TR-F100 [FB1]cert=1500±400 µg kg1) solo certifica la concentración de una sola micotoxina (Ver Anexo II y Anexo III), pero se desconoce la existencia y concentración de otras que pueden co-existir en el mismo CRM, procedentes del mismo (o de diferentes) hongo(s). Con el objeto de utilizar estos CRMs en esta parte del trabajo, en primer lugar, para cada CRM se comprobó la existencia y se midieron las concentraciones de DON y FB1 no certificadas. Los procedimientos utilizados fueron los procedimientos que se optimizaron para cada una de las micotoxinas individualmente (Apartado 3.4.8.1 para la extracción de DON y Apartado 3.4.8.2 para la extracción de FB1). Para esta caracterización de los dos CRMs se utilizó mELISA y el inmunosensor electroquímico. Los resultados se describen en los apartados posteriores. 4.8.2.1 Determinación de DON en TR-F100 y de FB1 en TR-D100 por mELISA: Las extracciones individuales realizadas para estos ensayos previos fueron una extracción de DON del CRM TR-F100 (Lote F-C-433) que se realizó en PBS (0,1 M, pH 7,4) siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para la extracción del DON de muestras de origen cereal (Apartado 3.4.8.1), y de la FB1 del TR-D100 (Lote DW-158) en MeOH/H2O (70:30 v/v) siguiendo un procedimiento recogido en el Apartado 3.4.8.2. Las determinaciones se realizaron por mELISA utilizando los calibrados individuales respectivos para FB1 y de DON, que se representan en la Figura 102. 4.8 Determinación conjunta de DON y FB1 en muestras de harina de cereales 259 Las concentraciones de FB1 encontradas experimentalmente sobre el mismo el patrón certificado TR-D100 (Lote D-W-158), con los dos tipos de detección fueron: [FB1]mELISA = 39,4 ± 2,6 µg kg-1 con %DSR (n=4) = 4,0% [FB1]AD-a = 44,8 ± 13,9 µg kg-1 con %DSR (n=4) = 19,6% Para comprobar si los resultados obtenidos por ambos modos de detección (amperométrica y mELISA) para la FB1 son iguales estadísticamente, se realizó un test estadístico t para los dos modos de detección del inmunosensor desarrollado: Prueba F para varianzas de dos muestras FB1 AD-a mELISA Media 44,65 39,38 Varianza 78,00 2,67 Observaciones 4 4 Grados de libertad 3 3 F 29,2 P(F<=f) una cola 0,01 Valor crítico para F (una cola) 9,28 Tabla 91: Prueba F para el cálculo de varianzas Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales FB1 AD-a mELISA Media 44,65 39,38 Varianza 78,00 2,67 Observaciones 4 4 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 3 Estadístico t 1,17 P(T<=t) una cola 0,16 Valor crítico de t (una cola) 2,35 P(T<=t) dos colas 0,33 Valor crítico de t (dos colas) 3,18 Tabla 92: Test t realizado para la comparativa de las concentraciones de FB1 obtenidas por el inmunosensor AD-a y mELISA El test t, calculado para muestras con varianzas desiguales, indica que no hay diferencias significativas con una probabilidad del 95% entre las concentraciones de 260 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN FB1 obtenidas por los 2 modos de detección optimizados, por lo que puede decirse que ambos han ofrecido las mismas concentraciones. En conclusión, la concentración de FB1 obtenida en la harina de trigo TR-D100 (Lote DW-158, harina con DON certificado) por el inmunosensor electroquímico es estadísticamente comparable a la concentración obtenida por mELISA, con un valor de concentración próximo a 40 µg kg-1 FB1, determinada sobre el mismo extracto. 4.8.3 Validación de resultados por HPLC-UV-Vis Como confirmación de los resultados anteriores, se utilizó la técnica oficial de determinación de DON en el CRM TR-F100 por HPLC con detección UV-Vis (HPLC-UVVis). Para la validación de los resultados se procedió a realizar la extracción de DON en el CRM TR-F100 siguiendo el procedimiento del apartado 3.4.8.4, con H2O/PEG8000 utilizando las columnas IAC (Vicam) DON-Test [71; 261]. El calibrado de DON con estándares comprendidos entre 0 y 3 mg l-1 en la fase móvil ACN/H2O (10:90) obtuvo los resultados de la Tabla 93. Las curvas de calibrado (altura y área de pico) se han representado en las figuras 104 y 105. CALIBRADO [DON] mg l-1 TIEMPO ALTURA AREA 0 6,98 0 0 0,01 6,98 4 0,08 0,05 7 10 0,67 0,1 7 134 37,8 0,2 6,93 351 125,6 0,3 6,95 631 248,2 0,5 6,95 1299 554,52 1 6,91 2863 1408,42 2 6,94 6256 3115,73 3 6,9 9205 4827,03 Tabla 93: Resultados del calibrado realizado con DON (0-3 mg l-1) en función de la altura y del área de pico del cromatograma 4.8 Determinación conjunta de DON y FB1 en muestras de harina de cereales 261 Figura 104: Curva de calibrado de DON (0-3 mg l-1) realizada en función de la altura de pico del cromatograma Figura 105: Curva de calibrado de DON (0-3 mg l-1) realizada en función del área de pico del cromatograma Ambos tipos de calibrados fueron satisfactorios (R > 0,9990). La determinación de la concentración de DON contenido en el patrón de FB1 (TR-F100, Lote F-C-433), se llevó 262 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN a cabo por HPLC-UV-Vis (λ = 218 nm). Los resultados obtenidos para un tR ≈ 7 min se muestran en la tabla 94: MUESTRAS TIEMPO ALTURA [DON] mg l-1 Int conf AREA [DON] mg l-1 Int conf TR-F100 7,31 1467 0,522 980,27 0,684 7,30 1338 0,481 892,3 0,630 MEDIA 0,501 MEDIA 0,657 s 0,03 0,261 s 0,04 0,343 %DSR 5,80 %DSR 5,80 Tabla 94: Resultados obtenidos en función de las alturas y de las áreas de pico integradas a tr= 7 min Las concentraciones de DON (µg kg-1) calculadas teniendo en cuenta las diluciones aplicadas durante el proceso se resumen en la tabla 95 (altura de pico) y en tabla 96 (áreas de pico): Tabla 95: Concentraciones de DON (µg kg-1) en función de la altura de pico Las concentraciones obtenidas después de la extracción de DON en el CRM TR-F100: [DON]TR-F100 =399,7 ± 208,4 µg kg-1 con %DSR (n=2) = 5,8% La concentración de DON hallada en la harina de maíz certificada CRM TR-F100 es próxima a las encontradas por los inmunosensores con detección por mELISA y AD-a. Igualmente se realizó la determinación de DON a partir de los datos obtenidos en función del área de pico. Los resultados encontrados se recogen en la tabla 96: ALTURAS PICO [DON]mg l-1 [DON]mg kg-1 [DON]µg kg-1 Int. Conf TR-F100 0,522 0,416 416,1 0,481 0,383 383,3 MEDIA 0,400 399,7 s 0,023 23,2 208,4 %DSR 5,8 5,8 4.8 Determinación conjunta de DON y FB1 en muestras de harina de cereales 263 Tabla 96: Concentraciones de DON (µg kg-1) en función del área de pico Los resultados de la tabla 96 resultaron ser algo mayores que los obtenidos en la tabla 95: [DON]TR-F100 = 524,1 ± 273,2 µg kg-1 A la vista de los resultados obtenidos, se va a considerar como mejores los resultados hallados a partir de la altura de pico ya que la concentración de DON obtenida en la extracción individual ha producido resultados satisfactorios (más cercanos a los obtenidos por mELISA y AD-a). Por lo tanto, para validar los resultados determinados con el inmunosensor mELISA y amperométrico, se realizó una comparativa estadística con los valores determinados por HPCL-UV-Vis (Tabla 97): DON en TR-F100 AD-a mELISA HPLC-UV-Vis 311,6 388,3 416,1 377,5 294,0 383,3 356,5 305,9 377,5 315,1 MEDIA 355,8 325,8 399,7 s 31,1 42,5 23,2 %DSR 8,73 13,05 5,8 Tabla 97: Concentraciones de DON obtenidas por AD-a, mELISA y HPLC-UV-Vis (alturas pico a tr= 7 min) Se realizó un ANOVA de un factor para comparar la concentración de DON determinada en un extracto de harina certificada (TR-F100, Lote F-C-433) por el AREAS PICO [DON]mg/l [DON]mg kg-1 [DON]µg kg-1 Int. Conf TR-F100 0,684 0,546 545,6 0,630 0,503 502,6 MEDIA 0,524 524,1 s 0,030 30,4 273,2 %DSR 5,8 5,8 264 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN inmunosensor con detección por AD-a, por mELISA y por HPLC-UV-Vis siguiendo los procedimientos establecidos. El estudio estadístico se resume en la tabla 98: RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza AD-a 4 1423,10 355,78 965,30 mELISA 4 1303,31 325,83 1809,33 HPLC-UV-Vis 2 799,42 399,71 537,92 ANÁLISIS DE VARIANZA Origen variaciones Suma cuadrados Grados libertad Promedio cuadrados Fcalc Prob Fcrit Entre grupos 7344,74 2 3672,37 2,90 0,12 4,73 Dentro grupos 8861,82 7 1265,97 Total 16206,56 9 oncentraciones de DON obtenidas por AD-a, mELISA y HPLC-UV-Vis (alturas pico a tr= 7 min) en el CRM (TR-F100) El análisis de la varianza (ANOVA) realizado sobre las concentraciones de DON determinadas en el patrón certificado TR-F100, en el cual se desconocía la concentración de DON ha demostrado que no existen diferencias significativas (probabilidad 95%) sobre los valores determinados, concluyendo que la concentración de DON contenido en esta harina de maíz corresponde a un concentración inferior a 400 µg kg-1 (concentraciones exactas recogidas en la tabla 97). La validación de la concentración de FB1 determinada en el patrón certificado TRD100 fue realizada dentro de nuestro grupo de investigación, para evaluar los resultados obtenidos con el mELISA y el inmunosensor electroquímico. Se siguió el procedimiento oficial para la determinación de FB1 en harinas por cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorescente (HPLC-FD). La extracción de la muestra se realiza en acetonitrilo (100%) y se utilizan columnas de inmunoafinidad específicas para la extracción de FB1 (FumuniTest, de Vicam). Debido a que la FB1 no posee grupos funcionales que le permitan ser detectada con un detector por absorción o por fluorescencia, es preciso derivatizarla previamente con el reactivo OPA (o-ftaldehido), una amina primaria con propiedades fluorescentes [292]. 4.8 Determinación conjunta de DON y FB1 en muestras de harina de cereales 265 En la comparativa estadística realizada (ANOVA con el 95% de probabilidad) entre los resultados obtenidos con el HPLC-FD y los determinados en los apartados 4.8.2.1 (mELISA) y 4.8.2.2 (electroquímico) de esta Tesis, no se encontraron diferencias significativas para una concentración de FB1 próxima a 40 µg kg-1 determinada con los inmunosensores electroquímicos y mELISA. Las concentraciones determinadas con las diferentes técnicas analíticas utilizadas se resumen en la Tabla 99: FB1 en TR-D100 AD-a mELISA HPLC-FD 33,9 40,1 41,3 51,0 37,1 39,8 41,4 40,9 - 52,7 39,4 - MEDIA 44,7 39,4 40,6 s 8,8 1,6 1,06 %DSR 19,9 4,1 2,6 Tabla 99: Concentraciones de FB1 obtenidas por AD-a, mELISA y HPLC-FD 4.8.4 Determinación de DON y FB1 por mELISA en una muestra conjunta de harina de maíz y de trigo (TR-F100 + TR-D100) La determinación cuantitativa simultánea de varias micotoxinas en un único ensayo reduce el tiempo y los costes de cada análisis, y por lo tanto se convierte en un método mucho más práctico y atractivo [293]. En la bibliografía se han descrito numerosos procedimientos de determinación de micotoxinas provenientes de Fusarium, donde la gran mayoría utilizan cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y sobre todo con detección por espectrometría de masas (HPLC-MS), y en donde las extracciones se realizan habitualmente utilizando mezclas acuosas del disolvente acetonitrilo coincidente en su composición con la fase móvil HPLC [294]. La importancia de la determinación en un sólo ensayo de las micotoxinas seleccionadas (FB1 y DON) recae en el hecho de que ambas proceden del mismo tipo de hongo Fusarium y pueden contaminar simultáneamente una misma muestra de cereales. Se produce además una toxicidad sinérgica provocada por su presencia conjunta en la misma muestra [36; 295]. 266 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN El desarrollo de un posible inmunosensor múltiple para la determinación simultánea requiere una planificación previa de las experiencias reduciendo en lo posible etapas con respecto al uso de sensores individuales para cada micotoxina [293]. Inicialmente, ensayamos la posibilidad de un inmunoensayo conjunto, para obtener una concentración que sería la suma de DON+FB1, con la única finalidad de comprobar que la suma de concentraciones se encontrara por debajo del límite individual legislado (screening). Sin embargo, dado que el etiquetado enzimático de los conjugados FB1HRP y DON-HRP es el mismo, no es posible separar en un inmunoensayo conjunto las señales provenientes de una u otra micotoxina, por lo tanto, lo que hemos estudiado son las bases iniciales de la extracción conjunta y determinación individual de DON y FB1 sobre este extracto. Con mayor detalle, los problemas que nos encontramos inicialmente son los siguientes: 1. El procedimiento único de extracción debe de tener un rendimiento lo suficientemente alto y próximo al 100% para ambas micotoxinas. El problema inicial surge de las diferentes propiedades químicas de ambas micotoxinas. En el caso del DON, mucho más polar, se ha visto que es suficiente su extracción en tampón acuoso PBS. Sin embargo, en el caso de la FB1 es preciso un disolvente orgánico; usualmente es suficiente con una proporción de metanol en agua superior al 70% (v/v). Se ha visto que un porcentaje en exceso de MeOH podría influir muy negativamente en la afinidad del anticuerpo de DON (Apartado 4.4.1). 2. La presencia del DON y FB1 en cereales, se produce de forma natural mayoritariamente en determinados tipos de harinas, pero muy escasamente en otras. Por ejemplo, la FB1 se encuentra mayoritariamente en harina de maíz (así se encuentra legislada), pero es muy escasa en otros tipos de harinas. En el caso del DON, en situación natural su presencia es mayoritaria en harinas de trigo. Adicionalmente, la propia matriz puede interferir de diferente manera tanto en la estabilidad de la micotoxina como en la extracción y en las determinaciones analíticas posteriores [258; 296]. Por ambos motivos, la determinación conjunta no es tan sólo una suma de determinaciones individuales. De hecho, un término que cada vez se le da más importancia en trabajos de presencia de micotoxinas, es el de “micotoxinas enmascaradas”, que se consideran aquellas que no son detectadas por los procedimientos analíticos propuestos o que se encuentran complejadas (con hidratos de carbono por ejemplo) y no responden a la metodología analítica utilizada. En nuestra opinión, y después de la experiencia de nuestro trabajo en el DON y en otras 4.8 Determinación conjunta de DON y FB1 en muestras de harina de cereales 267 micotoxinas (ocratoxina A y fumonisina B1), lo que se indica como micotoxinas enmascaradas no es debido a una falta de sensibilidad analítica del método propuesto, sino más bien a un deficiente y con muy bajo rendimiento procedimiento de extracción [297]. Una de las opciones previas que se ensayaron fueron dos calibrados diferentes de DON y FB1 en los intervalos de DON (0 -100 µg l-1) y FB1 (0 -100 µg l-1), pero realizando en ambos casos incubaciones en presencia de los 2 anticuerpos (mAbDON y mAbFB1) inmovilizados sobre las MBs-prG y los dos conjugados enzimáticos (DON-HRP y FB1HRP), siguiendo a continuación las etapas propias de los inmunoensayos individuales. Es decir, se realizaron dos calibrados diferentes de DON y FB1 en presencia de los dos anticuerpos y conjugados. Para la cuantificación suma de ambas micotoxinas se realizó la interpolación de un único extracto de la muestra contaminada. Los calibrados realizados según este esquema de trabajo, en función de DON y de FB1 se representan en la Figura 106: -3 -2 -1 0 1 2 3 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 DON (g/l) FB1 (g/l) Log [micotoxina] (g/l) Abs Figura 106: Calibrados múltiples para DON y FB1 realizados de modo simultáneo Como es lógico, y tal como se previó, en cada calibrado con su micotoxina, el otro conjugado no compite más allá de su reactividad cruzada y siempre se obtiene una señal mínima que se suma a la competitiva de la otra micotoxina, tal como se observa en la figura anterior (Figura 106). Es decir, el conjugado que no compite actúa como una interferencia aditiva, a la vez que las disminuciones en la inhibición de las absorbancias debidas a la competición de cada micotoxina con su propio conjugado (y reconocido con cada anticuerpo) disminuyen el 45% aproximadamente (Figura 106). Si bien podrían separarse ambas señales multivariantes, no sería muy adecuado bajo un 268 Capítulo 4: RESULTADOS Y DISCUSIÓN punto de vista práctico, sobre todo por el hecho que en cada calibrado, incluso si se realizaran el mismo día, pueden variar las señales obtenidas. Adicionalmente, en la interpolación de la muestra se produce la competición de las 2 micotoxinas presentes en la muestra con sus respectivos conjugados enzimáticos, lo que hace que la señal sea muy pequeña, menor a la obtenida en el punto más concentrado de los calibrados, por lo que no es posible el cálculo de las concentraciones (Tabla 100). Tabla 100: Absorbancias obtenidas en la interpolación de una muestra contaminada con DON y FB1 a partir de un calibrado conjunto en presencia de los dos anticuerpos y de los dos conjugados de ambas micotoxinas. Se consideró otra alternativa similar (aunque a priori poco factible), que consistió en la determinación suma de ambas micotoxinas con un único calibrado suma de las concentraciones de ambas. En el calibrado se incluyeron los dos anticuerpos y conjugados enzimáticos, pero la curva de calibrado se obtuvo con concentraciones de una disolución que contenía ambas micotoxinas (DON+FB1). En la misma situación se obtuvieron las señales del extracto. Los resultados previos de este planteamiento se unieron a los datos obtenidos con calibrados individuales, con la idea de separarlos en un análisis multifactorial. Los datos no se muestran, pero los resultados no fueron satisfactorios, pues calibrados efectuados en condiciones algo diferentes variaron significativamente los valores de Absmax, Absmin y EC50, con lo cual el análisis multifactorial no fue posible. En la bibliografía se describen inmunoensayos multifactoriales, aunque suelen provenir de DON/FB1 Abs 8 réplicas 0,180 0,192 0,171 0,166 0,190 0,169 0,203 0,189 MEDIA 0,183 s 0,013 %DSR 7,2 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O 5 5: : C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S Capítulo 5: CONCLUSIONES 279 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O 5 5. . C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado paralelamente un inmunosensor de DON con transducción espectrofotométrica (mELISA) y electroquímica (inmunosensor amperométrico), utilizando partículas magnéticas como soporte de biorreconocimiento. Los inmunosensores se validaron con muestras certificadas y técnicas oficiales de cromatografía líquida, y se han dado los primeros pasos en la extracción conjunta de DON y FB1 (Fusarium) y su determinación simultánea con estos biosensores. A continuación se resumen las conclusiones más relevantes del trabajo de esta Tesis Doctoral: I. La afinidad entre un anticuerpo policlonal pAbDON (D01F-1) y el DON-HRP sintetizado con los reactivos SATA y PMPI (SATA-HRP + DON-PMPI) no fue suficiente para el desarrollo de un inmunosensor con la sensibilidad requerida para la determinación de DON. Se obtuvieron fuertes uniones inespecíficas de este conjugado DON-HRP sobre las MBs con diferentes funcionalizaciones que impidieron un comportamiento óptimo del inmunosensor. II. Se seleccionó un nuevo anticuerpo (mAbDON IB12, R-Biopharm) y un conjugado enzimático DON-HRP (Europroxima, 5121DON) purificados, que mostraron una alta afinidad entre sí que fue evaluada por ELISA espectrofotométrico convencional y sobre inmunosensores con MBs (detección espectrofotométrica y electroquímica). Se concluyó que las uniones producidas entre el mAbDON y el DON-HRP son producidas únicamente por el biorreconocimiento antígenoanticuerpo, y permite una adecuada competitividad del DON libre (disminuciones de señal superiores al 90% en presencia de 100 μg l-1 de DON). III. Las partículas magnéticas óptimas, seleccionadas como superficie sólida de inmovilización del mAbDON y para las etapas del inmunoensayo y transducción, fueron las partículas magnéticas funcionalizadas con proteína G (MBs-prG). Con ellas se obtuvieron inmovilizaciones eficientes y orientadas hacia los epítopos del DON (alta afinidad), y bajas adsorciones inespecíficas de los biorreactivos utilizados (especialmente del conjugado DON-HRP). El tiempo de vida del mAbDON una vez inmovilizado sobre las MBs-prG es de al menos 25 días almacenado a 4 °C. IV. Se optimizaron inicialmente las etapas del inmunoensayo utilizando mELISA, siendo las mejores condiciones experimentales: 280 Capítulo 5: CONCLUSIONES  MBs-prG-mAbDON (15 µg) con mAbDON (5 mg l-1)  DON-HRP (10x) con dilución de 1/5 (v/v) en PBS (0,1 M, pH 7,4)  DON (0-100 μg l-1)  Tiempo de competición: 60 min Con estas condiciones y trabajando a Tª ambiente se obtuvieron porcentajes de competición del 76%. El uso de MBs evita la necesidad de agentes bloqueantes para eliminar adsorciones inespecíficas, una vez realizados los lavados en las etapas del inmunoensayo dos veces con el tensoactivo tween-20 (0,1% m/v en PBS 0,1 M pH 7,4) seguido de un último lavado con PBS (0,1 M pH 7,4), eliminando así cualquier exceso de biorreactivos que no han reaccionado. V. A partir de las condiciones óptimas del inmunoensayo mELISA, se fijaron las condiciones de transducción electroquímica utilizando detección amperométrica. Los electrodos SPCEs individuales produjeron mayores corrientes que los de un array de 8 electrodos serigrafiados CH8 (imax de -0,185 frente a -0,077 µA respectivamente), debido al mayor diámetro de su ET y diferente velocidad de transferencia de carga (composición de la tinta). Sin embargo, los electrodos CH8 disminuyeron el tiempo y simplificaron las medidas en el inmunosensor electroquímico, mejorando el modo de trabajo y la reproducibilidad. VI. Se han propuesto dos posibles formas de medida electroquímica utilizando detección amperométrica (AD): AD-a (AD en modo alterno) y AD-c (AD en modo consecutivo). En la primera (AD-a) se toman las corrientes de los 8 sensores cada 0,24 s durante los 90 s de medida, y en la segunda se mide 90 s cada sensor uno detrás del otro (tiempo de medida total unos 12 min). Los calibrados obtenidos tuvieron una sensibilidad similar en ambos casos (EC50 8,5 µg l-1 DON), utilizando un potencial de reducción E=-0,35 V, aunque las corrientes medidas aumentan en AD-a debido a una corriente capacitativa que no influyó en los resultados de concentración. Al realizarse las medidas de los 8 canales con AD-a en un tiempo inferior al modo AD-c (90 s frente a aproximadamente 12 min), se simplifica el trabajo experimental (necesidad de controlar el tiempo de la reacción enzimática) y sobre todo se evita la fácil oxidación de la HQ recién preparada y en contacto con el aire, lo que mejora la reproducibilidad, por lo que AD-a fue el modo escogido. Se optimizaron las diferentes configuraciones de medida de las que dispone el conector electrónico utilizado, seleccionando la configuración 1, que consiste en arrays de 8 electrodos independientes todos ellos (jumpers J4+J5 conectados). Capítulo 5: CONCLUSIONES 281 Las condiciones óptimas del inmunosensor electroquímico fueron:  MBs-prG-mAbDON (25 µg) con mAbDON (5 mg l-1)  DON-HRP (10x) con dilución de 1/5 (v/v) en PBS (0,1 M, pH 7,4)  Tiempo de competición: 60 min  HQ (1,8 mM) y H2O2 (9,6 mM)  Potencial -0,35 V con Amperometric Detection en modo alternado (AD-a) configuración 1 VII. El anticuerpo mAbDON es muy selectivo para el DON y no presenta gran afinidad frente a otras micotoxinas. La reactividad cruzada del mAbDON con FB1 es del 7%. El anticuerpo mAbFB1 utilizado en la determinación conjunta de DON+FB1 tiene una reactividad cruzada con el DON del 6%. VIII. La extracción del DON a partir de las muestras sólidas de cereales, debido a su carácter fuertemente polar, se llevó a cabo con un rendimiento próximo al 100% utilizando tampón de fosfatos (PBS 0,1 M, pH=7,4). Este extracto mantiene constante la concentración de DON durante al menos 20 días almacenado a 4 °C. La extracción del DON con otros disolventes orgánicos (en proporción con agua) es también posible, pero la presencia de un porcentaje superior al 5% (v/v) de acetonitrilo o de metanol interfieren en la acción del anticuerpo y del enzima sobre los inmunosensores de DON, por lo que estos extractos deben de diluirse en la proporción adecuada con tampón PBS, previamente a la etapa competitiva. IX. Los estudios de la reproducibilidad de ambos inmunosensores indicaron desviaciones estándares relativas (%DSR) en la determinación de DON (0,01-100 μg l-1) del orden de %DSR < 8% en mELISA y %DSR=8-11% con el inmunosensor electroquímico, con medidas realizadas en un mismo día (n=8). Si bien calibrados realizados en diferentes días muestran pequeñas variaciones de sensibilidad, las diferencias fueron estadísticamente significativas (análisis de varianza para un nivel de confianza del 95%), por lo que es necesario un calibrado diario realizado a la vez que las medidas de las muestras para su interpolación correcta, situación que es habitual en general en inmunoanálisis dada la gran cantidad de variables que influyen en la extensión de las reacciones antígeno-anticuerpo. X. Se ha efectuado una comparativa de réplicas de extractos (4 extracciones diferentes y 8 réplicas de medidas de concentración de DON en cada extracto) sobre un CRM de DON (TR-D100, lote D-W-158, 1400 ± 200 µg kg-1 DON), utilizando el inmunosensor electroquímico (AD-a). Las 8 medidas de concentración de DON replicadas sobre un mismo array CH8 mostraron 282 Capítulo 5: CONCLUSIONES aproximadamente un %DSR=15%. Los errores relativos de las concentraciones obtenidas con respecto al valor certificado fueron del 17,25 ± 5,13 % en las 4 extracciones, considerándose iguales significativamente (probabilidad 95%). Las concentraciones de los cuatro extractos, y 8 medidas de una misma concentración en cada electrodo individual dentro de un mismo CH8, no tuvieron diferencias significativas (ANOVA, nivel de confianza del 95%). XI. Ambos inmunosensores de DON (mELISA y electroquímico) se han validado con muestras de contenido certificado (TR-D100, lote D-W-158, 1400 ± 200 µg kg-1 DON). Los errores relativos de las concentraciones de DON fueron similares con ambos inmunosensores mELISA (0,6 - 14,5%) e inmunosensor electroquímico ADa (0,7 - 11,4%). Las concentraciones de DON obtenidas en diferentes días fueron significativamente iguales entre sí e iguales a la concentración certificada en el CRM (ANOVA, 95% nivel de confianza), en los dos inmunosensores tanto espectrofotométrico como electroquímico. Ambos inmunosensores permiten la medida de concentraciones de DON muy por debajo de los límites máximos establecidos por la legislación Europea en alimentos. XII. Sobre este mismo CRM (TR-D100, Lote D-W-158) se utilizó un kit ELISA comercial (Europroxima, 5121DON) para la determinación de DON, obteniéndose un error relativo de -8,1% (%DSR(n=2) = 3,2%) sobre el valor certificado. Los resultados de concentración del CRM que se obtuvieron con este ELISA comercial se han comparado también con los obtenidos por los dos inmunosensores que hemos desarrollado para el DON (mELISA e inmunosensor electroquímico), no encontrándose diferencias significativas en ambos casos (ANOVA, probabilidad 95%) XIII. Se utilizaron dos harinas comerciales (Haricaman) con matriz de trigo y de maíz respectivamente, para la extracción y determinación del DON con los inmunosensores que se han desarrollado. Las concentraciones obtenidas con mELISA en ambas harinas fueron próximas a 70 µg kg-1 de DON. Con el inmunosensor AD-a se determinó una concentración de DON de 64,1 µg kg-1 (harina de trigo) y de 64,4 µg kg-1 de DON (harina de maíz). Las concentraciones de DON obtenidas por ambos inmunosensores (mELISA y electroquímico) fueron estadísticamente comparables, no encontrándose diferencias significativas (nivel de confianza del 95%). XIV. En la validación de resultados, se utilizó una técnica de referencia AOAC basada en HPLC-UV para la determinación de DON en cereales (extracción con agua/PEG, columna de inmunoafinidad para la limpieza del extracto, y cuantificación con HPLC-UV). El valor obtenido para el CRM TR-D100 con este Capítulo 5: CONCLUSIONES 283 procedimiento (1,377±0,228 mg kg-1 DON, (%DSR(n=2) = 1,84%) es el que se tomó como referencia de comparación con los inmunosensores desarrollados, obteniéndose resultados estadísticamente iguales en todos los casos. En las harinas comerciales, no pudo determinarse de forma cuantitativa la concentración de DON por el método AOAC, por ser las concentraciones de estas harinas inferiores al límite de detección de este método cromatográfico HPLC-UV (LOD=100 ng g-1 (µg kg-1) de DON). XV. Se ha determinado la concentración no certificada de DON contenida de forma natural en el CRM de FB1 (TR-F100, lote F-C-433, 1500±400 µg kg-1 de FB1 certificado, harina de maíz), así como la concentración natural de FB1 (valor no certificado) sobre el CRM de DON (TR-D100, lote D-W-158, 1400±200 µg kg-1 de DON certificado, harina de trigo), utilizando una extracción única de ambas micotoxinas con una mezcla optimizada de disolventes MeOH/H2O 70:30 (v/v). Con esta extracción se han determinado las dos micotoxinas individualmente en los dos CRMs indicados, obteniéndose valores de concentración significativamente iguales tanto con mELISA, como por el inmunosensor electroquímico AD-a (ANOVA, 95% nivel de confianza). Las concentraciones encontradas y las precisión obtenidas (%DSR) fueron: [DON]TR-F100 = 299,5±97,3 µg l-1 (%DSR(n=4)=20,4%) y de [FB1]TR-D100=35,0±6,8 µg l-1 (%DSR(n=4)=12,2%) por mELISA y de [DON]TR-F100 = 355,8±49,4 µg kg-1 (%DSR(n=4)= 8,7%) y [FB1]TR-D100 = 44,8±13,9 µg kg-1 (%DSR(n=4)= 19,6%) por el inmunosensor electroquímico (ADa). XVI. La concentración de DON contenido de forma natural en el material certificado de referencia TR-F100 (lote F-C-433) que se obtuvo por el método AOAC (HPLCUV) fue estadísticamente comparable con las concentraciones obtenidas mediante los dos inmunosensores desarrollados en esta Tesis para el DON, para un nivel de confianza del 95%. XVII. Llevando a cabo la extracción conjunta de DON y FB1 a partir de una mezcla de harinas de trigo y de maíz, utilizando MeOH/H2O 70:30 (v/v) como disolvente de extracción, las concentraciones de DON y FB1 determinadas en dos extractos diferentes de la mezcla no mostraron diferencias significativas (95% nivel de confianza) utilizando los dos procedimientos desarrollados mELISA e inmunosensor electroquímico. Estos resultados significan que la presencia de ambas matrices (trigo y maíz) en una misma muestra no interfiere en los inmunoensayos magnéticos que hemos desarrollado ni en el rendimiento de la extracción conjunta optimizada para ambas micotoxinas. Las concentraciones 284 Capítulo 5: CONCLUSIONES obtenidas y las precisiones de estas determinaciones fueron [DON]Extracto conjunto=1165,97 ± 278,06 µg kg-1 (error relativo = -1,54%, %DSR(n=4)=15%) y [FB1]Extracto conjunto=331,85 ± 37,70 µg kg-1 (error relativo = +0,015%, %DSR(n=4)= 15%) XVIII. Los resultados y conclusiones de esta Tesis Doctoral se han plasmado en una patente denominada: “INMUNOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL (DON)” (solicitud P201331357), que se encuentra registrada (referencia ES1510.105b) en la Oficina Española de Patentes y Marcas (OEPM) con fecha 18 de Septiembre de 2013 (Anexo I). La tramitación de esta patente no ha permitido la difusión previa de los resultados del trabajo, sin embargo, resultados parciales y algunas cuestiones del trabajo desarrollado en esta Tesis ya han sido presentadas en comunicaciones a Congresos nacionales e internacionales, tal y como se ha recopilado en una lista que se ha incluido como anexo adjunto a esta memoria (Anexo IV). [29] J.A. Cruz-Aguado, and G. Penner, Determination of Ochratoxin A with a DNA Aptamer. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56 (2008) 10456-10461. [30] M. McKeague, C.R. Bradley, A. De Girolamo, A. Visconti, J.D. Miller, and M.C. 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A AN NE EX XO OS S ANEXO IV: Listado de comunicaciones a congresos An electrochemical competitive biosensor for Deoxynivalenol based on paramagnetic microparticle beads functionalized with protein A Congreso IMAGENANO Tipo comunicación Póster Ciudad Bilbao (España) Fecha Del 11 al 14 de Abril de 2011 Ámbito del congreso Internacional An electrochemical competitive biosensor for Deoxynivalenol based on paramagnetic microparticle beads functionalized with Tosyl Congreso V Workshop on Analytical Nanoscience and Nanotechnology Tipo comunicación Póster Ciudad Toledo (España) Fecha Del 21 al 23 de Septiembre de 2011 Ámbito del congreso Nacional Design of a competitive electrochemical biosensor based on affinity reaction between deoxinivalenol and its polyclonal antibody Congreso NanoSpain Tipo comunicación Póster y ponencia Ciudad Santander (España) Fecha Del 27 de Febrero al 1 de Marzo de 2012 Ámbito del congreso Nacional Design of a competitive electrochemical biosensor based on affinity reaction between deoxinivalenol and its polyclonal antibody Congreso 14 International Conference on Electroanalysis Tipo comunicación Ponencia Ciudad Portoroz (Eslovenia) Fecha Del 3 al 7 de Junio de 2012 Ámbito del congreso Internacional A novel immunosensor specific and selective to Deoxynivalenol using magnetic nanoparticles modified with protein G Congreso Trobada Transfronterera de sensors i biosensors Tipo comunicación Póster Ciudad Tarragona (España) Fecha Del 20 al 21 de Septiembre de 2012 Ámbito del congreso Autonómico (Cataluña) Determinación de deoxinivalenol mediante un magnetoinmunosensor competitivo electroquímico Congreso 5ª Jornada de Jóvenes Investigadores de Química y Física en Aragón Tipo comunicación Póster Ciudad Zaragoza (España) Fecha 4 de Diciembre de 2012 Ámbito del congreso Universidad de Zaragoza ANEXO IV: Listado de comunicaciones a congresos Mycotoxins in cereals and wine samples: determination by highperformance liquid chromatography with fluorescence detection Congreso XVIII Reunión de la Sociedad española de química Analítica Tipo comunicación Póster Ciudad Úbeda, Jaén (España) Fecha Del 17 al 19 de Junio de 2013 Ámbito del congreso Nacional Improvement Of The Time Of Measuring In An Electrochemical Immunosensor For Deoxynivalenol Mycotoxin Congreso XVIII Reunión de la Sociedad española de química Analítica Tipo comunicación Póster Ciudad Úbeda, Jaén (España) Fecha Del 17 al 19 de Junio de 2013 Ámbito del congreso Nacional Improvement Of The Time Of Measuring In An Electrochemical Immunosensor For Deoxynivalenol Mycotoxin Congreso VI Workshop en Nanociencia y Nanotecnología Analíticas Tipo comunicación Póster Ciudad Álcala de Henares, Madrid (España) Fecha Del 8 al 9 de Julio de 2013 Ámbito del congreso Nacional Electrochemical Magnetoimmunosensors For Simultaneous Determination Of Deoxynivalenol, Fumonisin B1 And Ochratoxin A Congreso VI Workshop en Nanociencia y Nanotecnología Analíticas Tipo comunicación Ponencia Ciudad Álcala de Henares, Madrid (España) Fecha Del 8 al 9 de Julio de 2013 Ámbito del congreso Nacional Inmunosensor magnético competitivo basado en un ensayo ELISA espectrofotométrico para la determinación de deoxinivalenol en cereales Congreso II Simposio Jóvenes Investigadores en Espectroscopia Tipo comunicación Ponencia Ciudad Granada (España) Fecha Del 17 al 20 de Julio de 2013 Ámbito del congreso Nacional