Repositorio Institucional de Documentos

2014 70 Sara Oliván García Alteración de la autofagia y su modulación por una dieta rica en lípidos en un modelo murino de Esclerosis Lateral Amiotrófica Departamento Director/es Anatomía, Embriología y Genética Animal Osta Pinzolas, Rosario Calvo Royo, Ana Cristina Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Sara Oliván García ALTERACIÓN DE LA AUTOFAGIA Y SU MODULACIÓN POR UNA DIETA RICA EN LÍPIDOS EN UN MODELO MURINO DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA Director/es Anatomía, Embriología y Genética Animal Osta Pinzolas, Rosario Calvo Royo, Ana Cristina Tesis Doctoral Autor 2014 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA ALTERACIÓN DE LA AUTOFAGIA Y SU MODULACIÓN POR UNA DIETA RICA EN LÍPIDOS EN UN MODELO MURINO DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA TESIS DOCTORAL SARA OLIVÁN GARCÍA 2014 LABORATORIO DE GENETICA BIOQUIMICA (LAGENBIO) Dpto. Anatomía, Embriología y Genética Animal Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza Alteración de la autofagia y su modulación por una dieta rica en lípidos en un modelo murino de Esclerosis Lateral Amiotrófica Memoria presentada por Sara Oliván García Para optar al grado de Doctora por la Universidad de Zaragoza Zaragoza, Junio 2014 Doña Rosario Osta Pinzolas, Profesora Titular, y Doña Ana Cristina Calvo Royo, Profesora Asociada, del Departamento De Anatomía, Embriología y Genética Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza. CERTIFICAN QUE: La Tesis Doctoral titulada “Alteración de la autofagia y su modulación por una dieta rica en lípidos en un modelo murino de Esclerosis Lateral Amiotrófica” que se recoge en la presente Memoria, de la que es autora Sara Oliván García, ha sido realizada bajo nuestra dirección y se corresponde con el Proyecto de Tesis aprobado por la Comisión de Doctorado en Abril de 2013, cumpliendo, por tanto, todos los requisitos exigidos para que su autora pueda optar al Grado de Doctora por la Universidad de Zaragoza con la mención de “Doctor Europeo”. Y para que así conste, firman la presente en Zaragoza a 12 de Mayo de 2014. Fdo. Rosario Osta Pinzolas Fdo. Ana Cristina Cavo Royo INDICE 1 RESUMEN/SUMMARY .................................................................................................................. 1 2 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 5 2.1 ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA .................................................................................. 7 2.1.1 ASPECTOS GENERALES DE LA ENFERMEDAD 7 2.1.2 CLASIFICACIÓN 8 2.1.3.1 Excitotoxicidad 11 2.1.3.2 Alteración del transporte axonal 12 2.1.3.3 Disfunción mitocondrial 14 2.1.3.4 Estrés oxidativo 15 2.1.3.5 Agregación proteica 17 2.1.3.6 Neuroinflamación 19 2.1.3.7 Procesamiento de RNA 20 2.1.3.8 Tráfico endosomal 22 2.1.3.9 Epigenética por metilación del DNA 23 2.1.4 IMPLICACIÓN DEL MUSCULO EN LA ELA 23 2.2 PROTEASOMA ..................................................................................................................... 25 2.2.1 ESTRUCTURA Y MECANISMO DE ACCIÓN DEL PROTEASOMA 26S 26 2.2.2 PROCESO UBIQUITINACIÓN 28 2.2.3 PROTEASOMA Y PATOGENESIS DE LA ELA 30 2.3 AUTOFAGIA ........................................................................................................................ 34 2.3.1 ASPECTOS GENERALES 34 2.3.2 CLASIFICACIÓN 35 2.3.2.1 Macroautofagia 36 2.3.2.2 Microautofagia 38 2.3.2.3 Autofagia mediada por chaperonas (CMA) 38 2.3.2 REGULACION DE LA AUTOFAGIA 38 2.3.3 AUTOFAGIA Y ELA 41 2.3.3.1 Motoneuronas SOD1G93A y autofagia 42 2.3.3.2 Músculo y autofagia 44 2.4 APOPTOSIS .......................................................................................................................... 45 2.4.1 ASPECTOS GENERALES DE LA APOPTOSIS 45 2.4.1.1 Apoptosis extrínseca 45 2.4.1.2 Apoptosis intrínseca 47 2.4.2 APOPTOSIS EN LA ELA 47 2.5 RELACION ENTRE PROTEASOMA, AUTOFAGIA Y APOPTOSIS ......................................... 50 2.5.1 AUTOFAGIA Y PROTEASOMA 50 2.5.1.1 Tipo de proteína a degradar 51 2.5.1.2 Señalización de las proteínas 51 2.5.1.3 Moléculas comunes adaptadoras 52 2.5.1.4 Moléculas comunes reguladoras 52 2.5.1.5 Mecanismos integrativos 53 2.5.1.5.1 Vía del estrés del ER 53 2.5.1.5.2 Factor de transcripción FoxO 54 2.5.1.5.3 Niveles de energía celular disponible 54 2.5.2 AUTOFAGIA Y APOPTOSIS 54 2.6 METABOLISMO DE LÍPIDOS EN ELA ................................................................................... 60 2.5.1 METABOLISMO DE LÍPIDOS Y AUTOFAGIA 60 2.5.2 METABOLISMO ENERGÉTICO 61 2.5.3 TRATAMIENTO DE LA ELA CON LÍPIDOS 65 3 OBJETIVOS ................................................................................................................................. 67 4 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................. 71 4.1 MODELO ANIMAL ............................................................................................................... 73 4.1.1 ASPECTOS GENERALES DEL MODELO MURINO SOD1G93A DE ELA 73 4.1.2 GENOTIPADO 74 4.1.3 EXTRACCION Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ANIMALES 75 4.2 PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL ................................................................................. 76 4.2.1 EXTRACCIÓN DEL RNA TOTAL 76 4.2.2 SINTESIS DE DNA COMPLEMENTARIO O cDNA 76 4.2.3 PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR) 76 4.3 WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 78 4.3.1 EXTRACCION Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEINA 78 4.3.2 ELECTROFORESIS E INMUNODETECCIÓN 78 4.4 DETECCIÓN DE APOPTOSIS: TUNEL ................................................................................... 80 4.5 ENSAYO IN VITRO DE LA CLOROQUINA ........................................................................... 80 4.6 ACTIVIDAD PROTEASOMA ................................................................................................. 81 4.6.1 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN PROTEÍNA 81 4.6.2 MEDIDA ACTIVIDAD PROTEASOMA 26S 82 4.7 PRUEBAS DE COMPORTAMIENTO EN EL MODELO ANIMAL ........................................... 82 4.7.1 PESO 82 4.7.2 TEST DEL ROTAROD 83 4.7.3 TEST DE LA REJILLA 83 4.7.4 TREADMILL 83 4.7.5 SUPERVIVIENCIA 84 4.8 HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS Y ESTADÍSTICA ........................................................ 84 4.8.1 HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS 84 4.8.2 HERRAMIENTAS ESTADÍSTICAS 84 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................................... 87 5.1 MANUSCRITO 1 ................................................................................................................... 93 5.2 MANUSCRITO 2 ................................................................................................................... 98 5.3 MANUSCRITO 3 ................................................................................................................. 118 5.4 MANUSCRITO 4 ................................................................................................................. 133 5.5 MANUSCRITO 5 ................................................................................................................. 157 6 CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 177 7 BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 181 8 ABREVIATURAS ........................................................................................................................ 199 1 RESUMEN/SUMMARY RESUMEN | 1 La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que se caracteriza por una afectación y pérdida selectiva de las motoneuronas y por una progresiva debilidad muscular. Los mecanismos fisiopatológicos causantes de esta enfermedad no se conocen todavía, pero en los últimos años, entre las muchas teorías propuestas, se postula que la acumulación de proteínas anormalmente plegadas podría estar relacionada con el desarrollo de la enfermedad. Los dos principales mecanismos que participan en la proteostasis celular son la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), y ambos procesos pueden ser esenciales para la reducción de la toxicidad mediada por la proteína SOD1 mutada. En esta Tesis Doctoral se han estudiado los procesos de degradación proteica mediada por la autofagia y por el proteasoma, así como los procesos de muerte celular programada a lo largo de la enfermedad en el músculo esquelético y la médula espinal en el modelo murino SOD1G93A. En un primer lugar, para eliminar el sesgo por el efecto del género en los procedimientos experimentales, se determinaron las diferencias existentes entre machos y hembras en la autofagia constitutiva en el músculo esquelético y la medula espinal de ratones wild type. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los marcadores de autofagia objeto de estudio (LC3 y p62) entre ambos sexos, y además estas diferencias son específicas del tejido estudiado. Después de confirmar la necesidad de incluir grupos experimentales balanceados para el sexo, se ha estudiado la activación de la autofagia y el proteasoma en el músculo esquelético de los ratones modelo a lo largo de la enfermedad. Los datos obtenidos indican una alteración en la actividad del proteasoma en los estadios estudiados y un aumento de la autofagia en el estadio terminal de la enfermedad. Además el análisis del proceso de muerte celular por apoptosis, indica que no se producen una activación significativa de la misma a lo largo de la progresión de la enfermedad. Por otra parte, se han analizado distintas pruebas de comportamiento para conocer cuál de ellas es la más adecuada para poder evaluar el efecto de un posible tratamiento en nuestros ratones modelo. Los resultados obtenidos muestran que tanto la prueba de rotarod como de la rejilla, son las pruebas más sensibles para detectar fallos tempranos en el comportamiento motor de los 2 | RESUMEN ratones, y además estas pruebas permiten una adecuada caracterización del comportamiento motor de dichos animales. Posteriormente, se realizó un ensayo pre-clínico consistente en la administración de una dieta enriquecida en lípidos, concretamente con aceite de oliva extra virgen y de palma, en los ratones modelo. La ingestión de la dieta enriquecida con aceite de oliva mejora el comportamiento motor y aumenta la supervivencia de los animales, además de mejorar el estado del músculo como lo evidencia el aumento del grosor de las fibras. Tal y como esperábamos, esta dieta produce una mejora de los indicadores moleculares de la autofagia y de los parámetros asociados al estrés del retículo endoplasmático y al daño muscular en el estadio terminal de la enfermedad. Finalmente, puesto que los procesos de muerte celular programada han sido ampliamente estudiados en la médula espinal, pero no los procesos de degradación proteica, se ha llevado a cabo el estudio de los mismos en dicho tejido. El análisis de estos mecanismos a lo largo de la enfermedad en el modelo animal indica que la autofagia no tiene un papel tan relevante como en el musculo esquelético, y el proteasoma se encuentra activado sólo en estadios terminales de la enfermedad. Las alteraciones observadas en los procesos de degradación proteica objeto de estudio a lo largo de la enfermedad se presentan como una posible diana terapéutica, tal como se ha demostrado con la administración de una dieta enriquecida con aceite de oliva extra virgen. . RESUMEN | 3 Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterized by a selective motor neuron loss and a progressive muscle weakness. The cause of the physiopathological mechanisms remains unknown although recently, it is believed that the misfolded protein accumulation could be in close relation to the progression of the disease. The two main mechanisms involved in the cellular proteostasis are autophagy and the ubiquitin-proteasome system (UPS). Indeed, these processes can play an essential role in the amelioration of the mutant SOD1 mediated toxicity. In this Doctoral Thesis the protein degradative systems by means of autophagy and the proteasome have been analyzed together with the programme cell death mechanisms, along disease progression, in the skeletal muscle and the spinal cord from a murine model SOD1G93A. Firstly, to eliminate sex bias in the experimental procedures, the differences between male and female mice in constitutive autophagy was determined. For this purpose, skeletal muscle and spinal cord tissues from wild type mice were studied. The results showed sex-dependent differences in each tissue when autophagy markers were analized (LC3 and p62). The next step and taking into consideration the need for using sex balanced groups of animals, the activation of autophagy and the proteasome in the skeletal muscle from the murine model along disease progression was assessed. The data showed an alteration in the proteasome activity and an autophagy activation at the terminal stage of the disease. Furthermore, no significant activation of the apoptotic cellular death was observed along disease progression. On the other hand, different behavioral tests have been analyzed to determine which of them is the most appropriate to evaluate the effect of a possible treatment in the animal model. The results suggested that either rotarod or hanging wire tests were the most sensitive tests to detect early symptoms in the motor behavior in the mice. In addition, these tests allowed an adequate characterization of the motor behavior in these animals. Afterwards, a preclinical trial focused on the administration of a lipid enricheddiet was carried out. In particular, the transgenic mice were fed with extra virgin olive oil and palm oil. The olive oil enriched-diet improved the motor behavior and increased the survival of the animals. In addition, this enriched diet improved 4 | RESUMEN the muscle state as evidenced by an increment in the thickness of the muscle fibres. As we expected, this enriched diet induced an improvement in the molecular markers of autophagy, endoplasmic reticulum stress and muscle damage at the terminal stage of the disease. Finally, due to the study in depth of the cellular programme death mechanisms in the spinal cord tissue, we analyzed the less known protein degradative processes in this tissue. The analysis of these mechanisms along disease progression in the animal model suggested that autophagy did not play a relevant role as it was observed in skeletal muscle. Furthermore, the proteasome was only activated at terminal stages of the disease. The impairments found in the protein degradative processes, which have been studied along disease progression, become a potential therapeutic target as it has been shown under an extra virgin olive oil enriched-diet treatment. INTRODUCCIÓN | 11 Los avances en la investigación de la ELA han permitido identificar nuevos genes causantes de la enfermedad relacionados con procesos como el tráfico endosomal, las vías de degradación de proteínas, el estrés oxidativo, la excitotoxicidad, el procesamiento del RNA, la agregación proteica, el transporte axonal y/o la disfunción mitocondrial (figura 1). Además, numerosos estudios han demostrado que existe una compleja interacción entre los distintos mecanismos. Otros aspectos relevantes en la patofisiología de la enfermedad son la participación de las células que se encuentran entorno a las motoneuronas (células de la glía o astrocitos), la intervención de determinadas vías de señalización molecular en la supervivencia y la muerte de las neuronas, la unión neuromuscular y el compartimento axonal distal (Ferraiuolo et al. 2011). 2.1.3.1 Excitotoxicidad La excitotoxicidad inducida por glutamato, que es el principal neurotransmisor excitatorio en el sistema nervioso central, fue uno de los primeros mecanismos patogénicos propuestos, al presenciarse tanto en los pacientes de ELAF y ELAE, como en los modelos animales de la enfermedad. Dicha excitotoxicidad produce daño neuronal como resultado de una excesiva activación de los receptores de glutamato, que puede estar causada por un aumento de los niveles de glutamato a nivel sináptico, o por un aumento de la sensibilidad de la neurona al glutamato (Van Damme et al. 2005). La pérdida de la homeostasis del calcio intracelular, junto con la activación de los sistemas enzimáticos relacionados con la proteolisis y la producción de ROS (especies reactivas del oxígeno), la alteración de la función mitocondrial y la producción de ATP son hechos claves en la excitotoxicidad (Arundine and Tymianski 2003). En pacientes de ELAF y ELAE, se ha demostrado que la recaptación del glutamato por parte de los astrocitos está disminuida debido a una pérdida selectiva del transportador de glutamato astroglial (EAAT2) en la corteza motora y en la medula espinal (Van Damme et al. 2005). Por otro lado, la pérdida de la conexión entre las motoneuronas altas y bajas produce una menor trascripción de EAAT2 al disminuir la expresión de los motivos NF- de unión de fosfoproteínas (Yang et al. 2009). Además, la SOD1 provoca un daño oxidativo en el extremo C-terminal intracelular de EAAT2 y como consecuencia se 12 | INTRODUCCIÓN disminuye el transporte del glutamato (Trotti et al. 1999). Asimismo, la producción de la forma truncada de EAAT2 activa a la caspasa-3, proteína efectora de la apoptosis (Boston-Howes et al. 2006). Sin embargo, la sobreexpresión de EAAT2 en los ratones transgénicos de mSOD1 retrasa el inicio de los síntomas motores de la enfermedad (Guo et al. 2003). Todas estas alteraciones de EAAT2 pueden interferir en la eliminación de glutamato, con lo que éste permanece en el medio y activa los receptores de forma continuada. Una vez activados los receptores, se produce una entrada masiva de calcio a la neurona que no se puede controlar porque no existen suficientes proteínas de unión a calcio. Como consecuencia de esta elevada concentración de calcio intracelular se activa la apoptosis, lo que provoca la muerte de la neurona y la degeneración. Aunque la excitotoxicidad inducida por glutamato es un evento patológico característico en la ELA, queda por determinar si estos cambios representan un defecto primario responsable de la degeneración de la motoneurona, o si son resultado de la enfermedad (Musaro 2010). 2.1.3.2 Alteración del transporte axonal La alteración del transporte axonal constituye otro evento característico en la ELA (Sasaki et al. 2005) y puede, por ello, ser crucial en la patofisiología de la enfermedad. Las motoneuronas son células fuertemente polarizadas con largos axones, y el transporte axonal es necesario para el desplazamiento de componentes esenciales para la célula (RNA, proteínas y orgánulos celulares) a los compartimento axonales como son las estructuras sinápticas de la unión neuromuscular. Se pueden producir dos tipos de transporte axonal: el anterógrado cuando se produce desde el soma hacia la unión neuromuscular y esta mediado por quinesinas dependientes de microtúbulos; y/o el retrógrado cuando va hacia el cuerpo celular y depende de las dineinas (figura 2) (Pasinelli and Brown 2006; Ferraiuolo et al. 2011). Cuando se produce una alteración en la estructura del citoesqueleto y el transporte axonal se ve afectado, el axón se puede retraer y producir la denervación de la neurona en el músculo, lo que promueve la muerte celular (Robberecht and Philips 2013). INTRODUCCIÓN | 13 En ratones SOD1G93A, el transporte axonal de las motoneuronas es deficiente desde los estadios tempranos de la enfermedad, tanto a nivel del transporte anterógrado como del retrógrado. Además, parece ser que esta afectación es específica de la carga que se transporta, como se aprecia en el caso del transporte anterógrado de las mitocondrias. Cuando surge un fallo en la función mitocondrial, se produce una disminución del transporte axonal mitocondrial, lo que podría afectar al transporte de otras sustancias por la falta de energía (Bilsland et al. 2010). FIGURA 2 Disfunción del transporte axonal en la ELA (Pasinelli and Brown 2006). La alteración del transporte axonal de las mitocondrias y la disminución del número de mitocondrias en el axón distal, junto con la disfunción mitocondrial, puede ocasionar la axonopatía por “dying-back” en la ELA como consecuencia del agotamiento energético (De Vos et al. 2007). Esta axonopatía por “dyingback” se ha descrito tanto en pacientes como en modelos animales (Fischer et al. 2004). Por otro lado, se ha demostrado que existe una conexión entre la excitotoxicidad por glutamato y el fallo en el transporte axonal que podría contribuir al daño de la motoneurona en la ELA. En cultivos de neuronas, se ha revelado que el glutamato reduce el transporte axonal de neurofilamentos a 14 | INTRODUCCIÓN través de la activación de enzimas quinasas que los fosforilan (Ackerley et al. 2000; Turner et al. 2011). 2.1.3.3 Disfunción mitocondrial La mitocondria posee un papel clave en la producción de energía intracelular, la homeostasis del calcio y el control de la apoptosis, además de participar en la producción de especies reactivas del oxígeno. Numerosos estudios han demostrado una relación entre la ELA y determinadas anormalidades mitocondriales, si bien no se conoce el papel que estas anomalías pueden tener en el comienzo y desarrollo de la enfermedad. Esta relación ha sido ampliamente estudiada en los modelos animales que presentan la SOD1 mutada (figura 3)(Ferraiuolo et al. 2011). FIGURA 3 Disfunción mitocondrial en la ELA (Ferraiuolo et al. 2011). En ratones mSOD1, los agregados de la proteína SOD1 mutada que se localizan en vacuolas en el espacio mitocondrial intermembranoso junto con los depósitos adheridos a la membrana exterior provocan una disfunción mitocondrial selectiva en la médula espinal al impedir la importación de proteínas (Vande Velde et al. 2008). En tejidos procedentes de dichos ratones y de pacientes, se han encontrado también defectos en la función de la cadena respiratoria que se han asociado al daño oxidativo en proteínas y lípidos mitocondriales. Por lo INTRODUCCIÓN | 15 que los fallos detectados en la regulación del metabolismo energético podrían contribuir al daño de la motoneurona en la ELA (Ferraiuolo et al. 2011). Además, se han descrito alteraciones en la morfología mitocondrial tanto en el músculo esquelético como en la médula espinal de pacientes (Sasaki and Iwata 2007). Incluso en algunos modelos de mSOD1 la vacuolización mitocondrial está presente en los estadios presintomáticos de la enfermedad, lo que evidencia una contribución importante de la mitocondria al inicio de la enfermedad (Wong et al. 1995). También se ha demostrado que existe una conexión directa entre la mitocondria y la hipótesis de la excitotoxicidad a través de la homeostasis del calcio, al detectarse fallos en el intercambio de calcio entre el retículo endoplasmático y la mitocondria en los modelos de ELA (Grosskreutz et al. 2010). Asimismo, si la muerte de la motoneurona está mediada por la activación de las caspasas y de la apoptosis, el daño mitocondrial podría contribuir a este proceso (Sathasivam et al. 2005). 2.1.3.4 Estrés oxidativo El estrés oxidativo se produce como consecuencia de una alteración en el balance entre la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS, reactive oxygen species) y su eliminación, junto con la capacidad del sistema biológico de eliminar o reparar el daño inducido por ROS. La acumulación del estrés oxidativo en neuronas durante el envejecimiento puede ser un factor importante que inclina la balanza de la capacidad para hacer frente a una agresión tóxica hacia el daño celular, lo que produce la muerte neuronal y por tanto, el comienzo de la neurodegeneración. El descubrimiento de que un 20% de los casos de ELAF están causados por mutaciones en el gen SOD1 (Rosen 1993), que codifica una de las proteínas antioxidantes más relevantes, y el hecho de que se han descrito más de 150 mutaciones distintas susceptibles de ser patogénicas (Andersen and Al-Chalabi 2011), ha aumentado el interés en el papel del estrés oxidativo en la ELA. Las mutaciones de SOD1 que afectan a su actividad, pueden además aumentar el daño oxidativo y por ello, activar la apoptosis o causar alteraciones en la mitocondria como son la despolarización de la membrana, la disminución en la 16 | INTRODUCCIÓN actividad de los complejos respiratorios y la liberación de citocromo C (Musaro 2010) En tejidos procedentes de autopsias de pacientes de ELAF y ELAE, se han detectado niveles elevados de proteínas, lípidos y DNA que presentan daño oxidativo (Shaw et al. 1995; Fitzmaurice et al. 1996; Shibata et al. 2001). Además, se han encontrado evidencias de daño oxidativo en RNA del sistema nervioso central tanto en pacientes como ratones mSOD1. En el modelo animal, el daño en el RNA se localiza en las motoneuronas y los oligodendrocitos en estadios tempranos presintomáticos de la enfermedad, y está asociado con una disminución de la expresión de la proteína. Además, determinados mRNA parecen ser más susceptibles a la oxidación, como son los que están involucrados en la cadena mitocondrial transportadora de electrones, la biosíntesis, plegamiento y degradación de proteínas, la mielinización, el citoesqueleto y las vías de glicolisis (Chang et al. 2008; Duan et al. 2010). El desarrollo del modelo celular de TDP-43 asociado a la ELA, ha demostrado que la presencia de TDP-43 mutado también provoca estrés oxidativo en líneas celulares de motoneurona (Duan et al. 2010). Por otra parte, en los modelos animales de mSOD1, se ha demostrado la existencia de otras fuentes de estrés oxidativo que podrían causar la enfermedad. En las células de la microglia, se ha probado que la producción de superóxido mediada por NADPH oxidasa está incrementada a través de Rac1, lo que provoca el consiguiente aumento de la producción de ROS (Harraz et al. 2008). En el sistema nervioso central de pacientes de ELA, así como en los ratones mSOD1, se ha encontrado que la expresión de la NADPH oxidasa esta aumentada, y cuando las isoformas 1 o 2 de dicha enzima se silencian aumenta la supervivencia de los ratones SOD1G93A (Wu et al. 2006). Además, el estrés oxidativo interactúa y aumenta otros procesos patofisiológicos que contribuyen al daño de la motoneurona y del músculo, incluyendo la excitotoxicidad, el fallo mitocondrial, la agregación proteica, el estrés del retículo endoplasmático y las alteraciones en la señalización de astrocitos y microglia (Barber and Shaw 2010; Musaro 2010). INTRODUCCIÓN | 17 2.1.3.5 Agregación proteica En los últimos años, las teorías en cuanto al origen de la enfermedad de la ELA están relacionadas con la proteostasis celular, y son numerosos los trabajos que relacionan la acumulación de proteínas anormalmente plegadas con el desarrollo de enfermedad. En el caso concreto del modelo animal mSOD1, las proteínas mutadas y mal plegadas se unen a ubiquitinas para ser eliminadas a través del proteasoma (Basso et al. 2006); sin embargo, parece ser que esto no sucede y las proteínas terminan escapando de este proceso regulatorio (figura 4). La acumulación de las formas mutadas de SOD1, primero en dímeros y más tarde en pre-agregados y agregados, podría tener un efecto directo tóxico sobre la respiración mitocondrial o el transporte axonal, o indirecto sobre la proteostasis celular, afectando tanto a la vía del sistema ubiquitin-proteasoma (UPS) como a la de los lisosomas/autofagia, lo que provocaría alteraciones en el correcto desarrollo de estos mecanismos (Bendotti et al. 2012; Chen et al. 2012). FIGURA 4 Posible patogenia en el mecanismo de toxicidad inducido por agregados de SOD1 mal plegada (Robberecht and Philips 2013). Por otro lado, las proteínas mal plegadas provocan la activación de la vía de respuesta del estrés del retículo endoplasmático (ER, endoplasmic reticulum). EL 18 | INTRODUCCIÓN primer paso en la respuesta a una proteína no plegada (UPR, unfolded protein response) conlleva el reconocimiento de dichas proteínas aberrantes por chaperonas residentes del ER que corrigen el plegamiento. Aunque la activación del sistema UPR se cree que es protectora para la célula, al menos en las fases iniciales del estrés celular, en ratones mSOD1 a los que les falta el factor de transcripción XBP1 (x-box binding proteína 1) clave para el UPR, se observó un aumento en la supervivencia, la activación de la degradación de proteínas asociadas al ER, el aumento de la autofagia y la disminución de agregados mSOD1 (Hetz et al. 2009). Otra proteína clave para el estudio de la patobiología de la ELA asociada a la agregación proteica ha sido TDP43 (Neumann et al. 2006). EL TDP43 es una ribonucleoproteína localizada normalmente en el núcleo que une RNA a DNA y participa en procesos de transcripción, splicing y transporte de RNA. En situaciones de estrés como el ayuno o el estrés oxidativo, aparece localizada en el citoplasma. Si la situación se resuelve, los gránulos de estrés son eliminados por chaperonas y disgregasas que liberan el TDP43 para que pueda retornar al núcleo; mientras que si se mantiene, los gránulos pueden llegar a acumularse de modo irreversible. Como resultado final de esta circunstancia, se producen fallos en el splicing del mRNA que conllevan la degradación de RNAs o la acumulación de proteínas con secuencias aberrantes en el núcleo. Además, los fragmentos tóxicos de RNA pueden abandonar el núcleo y provocar efectos tóxicos en el citoplasma (Dewey et al. 2012). Sin embargo, recientemente se ha desarrollado un modelo murino cuya expresión de TDP43 mutado induce la ELA sin formación de agregados o procesamiento anormal de la proteína mutada, e incluso, sin la salida de TDP43 del núcleo (Arnold et al. 2013), lo que implicaría una vía alternativa independiente de la agregación proteica. Otra de las mutaciones causantes de ELA asociadas a la agregación proteica se ha descrito en el gen que codifica VCP (valosin containig protein) (Johnson et al. 2010). Las mutaciones en el gen VCP se describieron por primera vez en pacientes con miopatía por cuerpos de inclusión con la enfermedad de Paget de comienzo temprano y demencia frontotemporal. La proteína VCP es una chaperona ubiquitina-sensible multifuncional que participa en los procesos de desdoblamiento de proteínas y disgregación de complejos, y en la degradación de proteínas a través del sistema proteasomal o de la autofagia. En el caso INTRODUCCIÓN | 19 particular de la autofagia, esta proteína interviene en la fusión del lisosoma con el autofagosoma. A través de la región N-terminal de VCP, se produce la unión a sustratos poliubiquitinizados, y es precisamente en esta región donde se han identificado el mayor número de mutaciones en el caso de la ELA (Johnson et al. 2010). En relación directa con la agregación proteica, como ha quedado demostrado en el caso de la proteína VCP, se encuentran los sistemas de “limpieza” celular como son el proteasoma y la autofagia. Dichos procesos han sido ampliamente estudiados en enfermedades neurodegenerativas que cursan con la presencia de agregados proteicos como son el Alzheimer o la ELA, ya que una alteración en el funcionamiento de los mismos podría ser la causa de la enfermedad. Ambos procesos son objeto de estudio en apartados posteriores de esta tesis doctoral. 2.1.3.6 Neuroinflamación En el modelo animal mSOD1, diversos trabajos han demostrado que las células de la microglia y los astrocitos que rodean a la motoneurona contribuyen al comienzo y la progresión de la enfermedad de la ELA. El proceso por el cual las células de la glia van aumentando progresivamente su actividad conforme progresa la enfermedad tanto en pacientes como en los modelos animales se denomina neuroinflamación. Esta reacción puede tener consecuencias protectoras o perjudiciales (Philips and Robberecht 2011). Los trabajos realizados tanto in vitro como in vivo, han puesto de manifiesto que los astrocitos procedentes de ratones mSOD1 y de pacientes con ELAE pueden inducir la muerte de las motoneuronas. Además, cuando se produce una disminución de SOD1 en los astrocitos de estos pacientes, se anula dicha toxicidad (Haidet-Phillips et al. 2011). Este descubrimiento demuestra el papel relevante que tiene la SOD1 en la ELAE. Por otro lado, la activación de los astrocitos parece ser un hecho clave en la inflamación. En el caso concreto de cultivos de astrocitos procedentes de ratones SOD1G93A, son estas células las que realizan la secreción de mediadores inflamatorios como son la prostaglandina E2, los leucotrienos B4 y el óxido nítrico tanto en condiciones basales como activadas (Hensley et al. 2006). 20 | INTRODUCCIÓN Otros indicadores de la existencia de inflamación en la patología del sistema nervioso central de los enfermos de ELA, es la presencia de células de la microglia activadas y de linfocitos infiltrados. En el líquido cefalorraquídeo de pacientes de ELA se ha detectado la presencia de mediadores proinflamatorios como son la proteína quimioatrayente de monocitos 1 y la interleuquina 8; mientras que en sangre se han encontrado indicadores de la activación de la respuesta inmune (Mantovani et al. 2009). En relación a la respuesta inmune, el estudio realizado en los ratones mSOD1 consistente en la inyección intraperitoneal del anticuerpo monoclonal especifico de CD40L (ligando expresado en células T que activan la respuesta inmune), MR1; se produce un retraso en el comienzo de la enfermedad, aumenta la supervivencia, y se reduce la astrogliosis del sistema nervioso central y la activación de la microglia (Lincecum et al. 2010). Otra célula no neuronal que interviene en la patología de la ELA es el oligodendrocito, que participa en el mantenimiento del axón al proveer a la neurona de lactato a través del transportador de lactato monocarboxilado MCT1. Experimentos realizados, tanto in vitro como in vivo, han revelado que cuando el transportador MCT1 falta, se produce la degeneración de la motoneurona. Así, en pacientes y ratones con ELA, se ha demostrado que la disminución de la expresión de MCT1 probablemente contribuya a la pérdida de la motoneurona (Lee et al. 2012). 2.1.3.7 Procesamiento de RNA La identificación de TDP-43, proteína de unión RNA-DNA, como el mayor componente de las inclusiones ubiquitinadas en la ELA; así como de FUS, ha puesto de manifiesto el interés en la alteración del procesamiento de RNA como un posible mecanismo patofisiológico de la enfermedad. Actualmente se desconoce si el daño en la motoneurona está causado por la pérdida de función de las proteínas en el procesamiento de RNA, o por una ganancia de función toxica o por ambas. EL TDP43 es una proteína predominantemente nuclear implicada en múltiples aspectos del procesamiento del RNA, incluyendo la regulación postranscripcional, el splicing alternativo y el procesamiento de microRNAs. Tal y como se ha descrito en el apartado de la agregación proteica, las inclusiones INTRODUCCIÓN | 27 La zona central de la partícula 19S está formada por seis subunidades ATPasa o Rpt (Rpt1-Rpt6) que se encargan de proveer de sustratos a las zonas proteolíticas del proteasoma. Para unir el anillo formado por las subunidades Rpt intervienen 2 subunidades de mayor tamaño denominadas Rpn1, localizada en la zona exterior del anillo, y Rpn2 que aparece en la zona superior. La partícula 19S completa su estructura con un conjunto de 9 subunidades Rpn localizadas en la zona más exterior y cuya forma recuerda a la de una “tapa” (Finley 2009; Inobe and Matouschek 2014). FIGURA 2 Sistema de degradación de proteínas por el proteasoma 26S (Inobe and Matouschek 2014). Para que se produzca la eliminación de las proteínas aberrantes, el proteasoma primero reconoce el sustrato ubiquitinado a través de los receptores Rpt10 y Rpt13 que se encuentran en la subunidad 19. Tras la unión del proteasoma y la proteína, ésta se va desdoblando a medida que se produce la translocación a la cavidad central de la partícula 20S (figura 2). Antes de que se lleve a cabo la degradación de la proteína, las ubiquitinas unidas a la misma se liberan por medio de la partícula Rpn11 a través de un proceso dependiente de ATP (Wong and Cuervo 2010). 28 | INTRODUCCIÓN En los últimos años, se ha descubierto que el proteosoma es capaz de llevar a cabo procesos de degradación alternativos al proceso con proteínas poliubiquitinadas dependiente de ATP, anteriormente descrito, como son el proceso independiente de proteínas ubiquitinas, el independiente de ATP por el proteasoma 20S sin la región 19S y/o la modificación de proteínas sin degradación. Además, se han identificado una serie de proteínas que realizan el papel de las ubiquitinas, y de señales capaces de iniciar la degradación como es el caso de las regiones “degron” que se localizan en la propia secuencia de la proteína. En el caso concreto de los mecanismos independientes de ATP, son las mismas zonas hidrofóbicas de las proteínas mal plegadas que quedan expuestas, las que realizan una función similar a la que desempeñan las ubiquitinas. El proteasoma, así mismo, puede intervenir en procesos de modificación de proteínas que no implican la degradación de las mismas, como ocurre por ejemplo con determinados factores de transcripción (Lilienbaum 2013). En general, el sistema proteasomal se caracteriza por ser un proceso altamente selectivo y rápido, ya que generalmente reconoce solamente sustratos ubiquitinados. 2.2.2 PROCESO UBIQUITINACIÓN La ubiquitinación consiste en la unión covalente de ubiquitinas por medio de un enlace isopeptídico al extremo carboxi de las proteínas a través de los grupos εamino de los residuos de lisina (Komander et al. 2009). Las ubiquitinas son pequeñas proteínas globulares ubicuas (de ahí su nombre) de aproximadamente 8.5 kDa, con secuencias altamente conservadas y que se localizan en todos los organismos eucariotas. En el proceso de ubiquitinación participan 3 enzimas: la E1 activante (ubiquitinactivating enzyme) que hidroliza ATP y forma un enlace tioéster entre ella y la ubiquitina, la E2 conjugadora (ubiquitin-conjugating enzyme) que recibe la ubiquitina de E1 y forma un enlace tioéster similar con la ubiquitina, y la enzima E3 ligante (ubiquitin-ligase enzyme) que une la enzima E2 al sustrato y trasfiere la ubiquitina al mismo (figura 3)(Rubinsztein 2006) (Hershko and Ciechanover 1998). INTRODUCCIÓN | 29 Hasta el momento se han identificado 2 genes que codifican la enzima E1, al menos 37 para E2 y más de 1000 para la ligasa E3 (Pickart and Eddins 2004). Esta gran variedad de isoformas y las distintas preferencias de unas hacia otras en función del contexto celular, genera un amplio número de combinaciones complejas y posibles de estas tres enzimas ligasas. FIGURA 3 Mecanismo de ubiquitinación (Lilienbaum 2013) A través de este mecanismo de señalización puede unirse una única ubiquitina (monoubiquitinización) o varias (poliubiquitinización), en uno o varios sitios específicos, e incluso participar más de un tipo de ellas. En función de cómo se produce la ubiquitinación, el destino de la proteína variará ya que son las ubiquitinas las proteínas responsables de determinar cuándo y en qué orden se producirá la degradación de los sustratos (Wong and Cuervo 2010). Para añadir más complejidad a este proceso, existen enzimas desubiquinizadoras (DUBs, deubiquitinating enzymes) que pueden revertir el proceso de degradación por ubiquitinas al eliminar dichos residuos de sustratos tanto monoubiquitinados como poliubiquitinados antes de que se produzca su acceso al proteasoma (Amerik and Hochstrasser 2004). Este proceso permite por un lado generar ubiquitinas libres para mantener su concentración celular que es 30 | INTRODUCCIÓN limitada, y por otro, dar la oportunidad a proteínas que presentan un correcto plegamiento de escapar de la degradación (Kalderon 1996). Por último, cabe destacar el hecho de que algunas proteínas no requieren la unión a ubiquitinas para ser degradadas por el proteasoma, pero la relevancia de este proceso in vivo todavía no está claro (Murakami et al. 1992). En relación con el proteasoma existen una serie de enfermedades neurodegenerativas, entre ellas la ELA o el Huntington, que tienen en común la acumulación de agregados proteicos ubiquitinados en el interior de las células. Esta acumulación puede ser debida o bien a que se produce un aumento en la expresión de proteínas, o a que la actividad de degradación del proteasoma disminuye (Wong and Cuervo 2010). 2.2.3 PROTEASOMA Y PATOGENESIS DE LA ELA Los trabajos que han estudiado y demostrado que existe una relación directa entre el proteasoma y la ELA son numerosos, como se demuestra en la tabla 1, y abarcan una gran variedad de proteínas asociadas a la enfermedad. En la ELA, la presencia de inclusiones proteicas ricas en ubiquitinas en las neuronas es un hecho neuropatológico presente no solo en pacientes de ELAF y ELAE, sino también en los modelos celulares y animales de la enfermedad (Bendotti and Carri 2004). Además, tanto en los pacientes de ELA como en los modelos animales, se ha descrito no solo la presencia de estos agregados, sino también de cambios en las subunidades del proteasoma o en las proteínas relacionas con el UPS (Cheroni et al. 2005). Así mismo, algunas mutaciones de genes asociados a las ELAF afectan a proteínas que interactúan directamente con el UPS (como puede ser VCP) o que son degradadas por el proteasoma, como es el caso de SOD1, TDP43 y la optineurina. Estudios realizados en el modelo murino SOD1G93A han demostrado que la formación de agregados ubiquitinados se correlaciona con la progresión de la enfermedad, y que dichas inclusiones ricas en SOD1 se encuentran parcialmente ubiquitinadas (Basso et al. 2006). Este hecho pone de manifiesto que la ubiquitinación de SOD1 es un proceso secundario a la formación de los agregados y que no es necesaria para el proceso de agregación. Además, las INTRODUCCIÓN | 31 proteínas SOD1 mono u oligoubiquitinadas no son reconocidas eficientemente por el proteasoma, lo que produce la acumulación de formas aberrantes y la disfunción del UPS. De hecho, en ratones SOD1G93A la acumulación intracelular de proteínas en la médula espinal correlaciona con una disminución de las subunidades constitutivas del proteasoma que se detecta selectivamente en las astas ventrales durante la progresión de la enfermedad (Cheroni et al. 2005). Estos hallazgos han sido también ratificados en otros modelos celulares y animales de determinadas formas de ELAF asociadas a SOD1 (Kabashi et al. 2008). TABLA 1 Proteínas asociadas a la ELA y el UPS (Bendotti et al. 2012) PROTEINA FUNCION IMPLICACION SOD1 MUTADA Enzima antioxidante con ganancia de función comparada a WT Degradada por proteasoma DORFIN Ligasa E3 ubiquitin (tipo dedo RINGER) En inclusiones en modelos murinos y pacientes UBIQUITIN Proteína marcadora de degradación dependiente de ubiquitina En inclusiones y aumentada en médula espinal de pacientes NEDL1 Ligasa E3 ubiquitin (tipo HECT) Media ubiquitinación de SOD1 y se localiza en inclusiones CHIP Enzima E4 dependiente de chaperona Localizada en inclusiones de modelos murinos SUMO-1 Proteína como ubiquitin Modifica SOD1 en la Lys75 aumentando su estabilidad UCHL1 Enzima de-ubiquitinizante Depleción de transcritos en el córtex motor de pacientes UBIQUILIN 2 Proteína como ubiquitin ubiquilin 2 Une 19S y las cadenas poliubiquitinadas Sub β constitutiva proteasoma 20S Degradación proteína Disminuida en médula espinal de ratones Sub β inducible proteasoma 20S Degradación proteína y producción de péptidos antigénicos Aumentada en médula espinal de ratones Sub α5 proteasoma 20S Cámara confinamiento proteolítico Disminuida en médula espinal de ratones Proteasoma 19S Complejo regulatorio del proteasoma 26S Disminuida en médula espinal de ratones VCP ATPasa requerida para marcar cadenas multi-ubiquitinadas Mutada en ELAF autosómica dominante TDP43 Regulación de factores de transcripción y splicing RNAm Degradada por proteasoma y acumulada en pacientes Gp78 Ligasa E3 ubiquitin implicada en la degradación asociada a ER Interacciona y promueve la degradación de hSOD1 MITOL Enzima E3 mitocondrial Promueve la degradación de mSOD1 mitocondrial 32 | INTRODUCCIÓN Esta disfunción del sistema UPS en el modelo SOD1G93A parece tener cierta especificidad tisular al producirse exclusivamente en la motoneurona (Cheroni et al. 2009). La generación de un ratón doble transgénico para SOD1G93A y el indicador de sustratos UPS, UbG76V, ha demostrado que en estadios sintomáticos de la enfermedad se produce una acumulación de UbG76V en motoneuronas espinales y craneales. Este fenómeno es debido a una degradación deficiente por parte del UPS, y va acompañada por una acumulación en dichas motoneuronas de marcadores de patogenia de la ELA como son los neurofilamentos ubiquitinados y fosforilados; estos hechos sugieren que el fallo del UPS tiene un efecto perjudicial en estas células (Cheroni et al. 2009). Por otra parte, el empleo de la proteína YFPu, que es un indicador de la actividad del proteasoma, ha permitido estudiar el efecto que la proteína mSOD1 produce por si misma sobre el proteasoma. La proteína YFPu induce el desplegamiento de las proteínas y cuando la actividad del proteasoma es normal es degradada rápidamente. Se ha estudiado en células de motoneurona NSC34 el efecto que SOD1G93A mutada y WT ejerce sobre la actividad del proteasoma (Crippa et al. 2010). Los datos han demostrado que la sobreexpresión de mSOD1 produce una acumulación significativa de YFPu; y por otro lado, que mientras la forma WT de SOD1 está presente en el citoplasma y en el núcleo de las células NSC34 y en ratones transgénicos, la forma mutada sólo se encuentra en el citoplasma, lo que indica que ambas proteínas tienen distinto efecto en el proteasoma nuclear o citoplasmático (Sau et al. 2007). Además el análisis de la actividad del proteasoma en estos dos compartimentos subcelulares ha determinado que el fallo del proteasoma se produce solamente en el citoplasma. Por otro lado se ha estudiado y comparado el comportamiento molecular de mSOD1 en distintos tipos celulares, en concreto en la línea NSC34 de motoneuronas y la C2C12 de músculo. Los resultados indican que hay un patrón de distribución de las formas mutadas y WT similar en la línea muscular. Esto podría ser debido a que los procesos de limpieza funcionan mejor en el músculo que en las motoneuronas, lo que evidencia el hecho de que se produzca la acumulación de YFPu en NCS34 y no en C2C12; es decir, la mSOD1 perjudica la INTRODUCCIÓN | 33 actividad del proteasoma únicamente en las motoneuronas NSC34 (Onesto et al. 2011). Además, las células NSC34 se caracterizan por tener un potencial autofágico en condiciones basales mayor que las C2C12 al presentar niveles altos de mRNA de LC3 que es el marcador por excelencia de la autofagia. Sin embargo, la activación de LC3 es mayor en las células musculares que en las motoneuronas, lo que sugiere que la activación de la autofagia es mayor en las C2C12 (Onesto et al. 2011). En conjunto, los altos niveles de mRNA de LC3 y la baja activación de esta proteína en las células NSC34 sugieren que la eficiencia de la activación de la autofagia es baja en las motoneuronas. Este hecho podría explicar por qué las células musculares presentan una mayor resistencia que las motoneuronas en relación a la acumulación de proteínas mSOD1 mal plegadas en la ELA. Gracias a los hallazgos en relación al proteasoma y la ELA descritos en este apartado, y en concreto a los relacionados con el modelo SOD1G93A, se plantea la necesidad de realizar más estudios que analicen la actividad del sistema UPS a lo largo de la enfermedad. 34 | INTRODUCCIÓN 2.3 AUTOFAGIA 2.3.1 ASPECTOS GENERALES La autofagia es el proceso de degradación de componentes intracelulares a través de lisosomas. Los lisosomas son el componente esencial de este sistema proteolítico, y se caracterizan por ser vesículas de membrana simple que contienen en su lumen una gran variedad de hidrolasas celulares que incluyen proteinasas, lipasas, glicosidasas y nucleotidasas responsables de degradar los productos de deshecho (Wong and Cuervo 2010). El principal papel de la autofagia es el de proteger a la célula de situaciones de estrés como por ejemplo el ayuno. Durante los periodos de ayuno, se degradan materiales citoplasmáticos para producir amino ácidos y ácidos grasos que serán usados para sintetizar nuevas proteínas, o serán oxidados en la mitocondria para producir energía en forma de ATP. Sin embargo, cuando se pierde el control del proceso autofágico y éste está excesivamente inducido, se puede producir la muerte celular. Este proceso se conoce como muerte programada de tipo II (Chen and Klionsky 2011). A través de la autofagia no sólo se produce la simple eliminación de materiales, sino que además sirve como un sistema dinámico de reciclaje que produce nuevos sustratos y energía para la renovación celular y la homeostasis celular (Mizushima and Komatsu 2011). De este modo, la autofagia participa en los procesos de crecimiento celular, supervivencia, desarrollo y muerte; y por esta razón, está implicada en patologías como el cáncer, enfermedades neurodegenerativas, miopatías y enfermedades de hígado, corazón o gastrointestinales (Kroemer et al. 2010). El proceso de la autofagia fue observado por primera vez por Keith R. Porter y su estudiante post-doctoral Thomas Ashford en 1962; sin embargo, el término de “autofagia” es debido a Christian de Duve. Fue precisamente este último quien INTRODUCCIÓN | 35 consiguió el premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1974 por el descubrimiento de los lisosomas y los peroxisomas. 2.3.2 CLASIFICACIÓN Se diferencian 3 tipos principales de autofagia en función de cómo se presenta el material a eliminar a los lisosomas: la autofagia mediada por chaperonas (CMA, chaperone-mediated autophagy), la microautofagia y la macroautofagia o autofagia propiamente dicha (figura 1). Aunque estos procesos tienen en común la participación del lisosoma, difieren entre ellas en el modo en que se señalan o seleccionan los sustratos, cómo se regula el proceso en sí y/o las condiciones que rodean a la activación de uno y no otro. Además, cuando se va a proceder a degradar un orgánulo celular específico, se puede hablar también de mitofagia, lipofagia, pexofagia, reticulofagia o ribofagia cuando se trata de mitocondrias, gotas de lípidos, peroxisomas, retículo endoplasmático o ribosomas (Klionsky et al. 2003). FIGURA 1 Tipos de autofagia. Macroautofagia (a), microautofagia (b) y autofagia mediada por chaperonas (c) (Cuervo 2011). 36 | INTRODUCCIÓN 2.3.2.1 Macroautofagia La macroautofagia se caracteriza por usar un tipo intermediario de orgánulo denominado autofagosoma. Se piensa que este es el principal tipo de autofagia que se produce en las células, y por este motivo, se le denomina simplemente con el término autofagia y es la forma más estudiada. El proceso comienza cuando una membrana de aislamiento de nueva formación, denominada fagóforo, secuestra una pequeña porción de citoplasma que incluye materiales solubles y orgánulos, para formar el autofagosoma, y finaliza con la fusión del autofagosoma al lisosoma para degradar los materiales que contiene en su interior. Ocasionalmente, se puede producir un paso intermedio, previo a la fusión con el lisosoma, que implica la unión con el endosoma (Mizushima and Komatsu 2011). El descubrimiento en levaduras, en la década de los 90, de una familia de aproximadamente 35 proteínas conocidas como proteínas relacionadas con la autogagia o ATG que participan en la formación de los autofagomas, ha permitido comprender el mecanismo molecular por el cual se produce la autofagia (Mizushima and Komatsu 2011). En mamíferos se han encontrado proteínas ortólogas a las Atg de levaduras, así como factores adicionales específicos. Estas proteínas se organizan en complejos funcionales que participan en la regulación de cada uno de los pasos de la autofagia como se detalla más adelante (Wong and Cuervo 2010). FIGURA 2 Proceso de autofagia. Iniciación (a), nucleación (b,c), elongación (d) y fusión lisosoma al autofagosoma (e). (Marino et al. 2014) INTRODUCCIÓN | 43 que mejore la patología de la ELA. De los fármacos empleados destaca el litio, la rapamicina, la progesterona y últimamente la trehalosa. En cultivos primarios de motoneuronas de ratones SOD1G93A, la inducción de la autofagia por el tratamiento con litio y rapamicina, elimina las proteínas SOD1 al igual que las ubiquitinas y α-sinucleinas, las cuales son características de determinadas formas de ELAF Y ELAE. Ambos fármacos producen un aumento de la expresión de marcadores autofágicos y la recuperación de la patología celular. El tratamiento con litio es capaz de inducir la autofagia para eliminar estas proteínas y así poder rescatar a las motoneuronas de la excitotoxicidad en ratones WT y transgénicos (Fornai et al. 2008a; Fornai et al. 2008b; Caldero et al. 2010). Además, este compuesto es capaz de producir un retraso en el comienzo de la enfermedad y aumentar la supervivencia de los ratones transgénicos, activar la autofagia, aumentar las mitocondrias en las motoneuronas y suprimir la astrogliosis reactiva (Basso et al. 2006). Por el contrario, el tratamiento con rapamicina, que es un fármaco que aumenta la autofagia por inhibición de mTOR, acelera la degeneración de la motoneurona, además de disminuir la supervivencia en los ratones enfermos, aumentar los niveles de Bax y aumentar la activación de caspasa 3. Este resultado parece indicar que la degeneración selectiva de las motoneuronas está asociada con una discapacidad del proceso autofágico (Zhang et al. 2011). El tratamiento con progesterona además de aumentar el flujo de la autofagia, reduce los niveles de la proteína mSOD1 y la muerte de la motoneurona, retrasa la disfunción motora y aumenta la vida de los animales tratados. Este tratamiento activa la autofagia y además, presenta tiene un efecto neuroprotector en los ratones SOD1G93A de ELA (Kim et al. 2013). En el caso de la trehalosa, su administración retrasa el comienzo de la enfermedad, prolonga la supervivencia y reduce la muerte de las motoneuronas en la medula de los ratones SOD1G93A. También disminuye la agregación de SOD1 y p62, reduce la acumulación de ubiquitinas y mejora el flujo autofágico. Además puede reducir la denervación del músculo esquelético, proteger la mitocondria e inhibir las vías proapoptóticas (Zhang et al. 2014). 44 | INTRODUCCIÓN La publicación de un reciente estudio ha permitido conocer que la alteración en el proceso de la autofagia está vinculada a la degeneración de las motoneuronas del tronco cerebral al igual que ocurre en las de la medula espinal. Y además se acompaña de la acumulación de SOD1 en astrocitos, gliosis y estrés oxidativo como en la medula espinal (An et al. 2014). Todos estos datos parecen indicar que la autofagia ejerce un papel neuroprotector en las motoneuronas de la medula espinal, pero no se ha realizado ningún estudio completo del proceso a lo largo de la enfermedad, desde los estadios presintomáticos hasta el estadio terminal. 2.3.3.2 Músculo y autofagia Como se ha indicado previamente, el proceso de eliminación de proteínas SOD1 mal plegadas es más eficiente en las células musculares C2C12 que en la línea celular de motoneuronas NSC34. Esta limpieza en el músculo se correlaciona con una mayor eficiencia del proteasoma junto con la activación del proteasoma (Onesto et al. 2011). Los resultados de este trabajo también parecen indicar que las células musculares son más resistentes a la acumulación de la proteína mSOD1 mal plegada. El mismo grupo de investigadores ha presentado recientemente un trabajo realizado con tejido muscular procedente de ratones SOD1G93A y ha corroborado los resultados que anteriormente habían obtenido con los estudios in vitro. En el músculo la autofagia inducida por las formas mutadas de SOD1 es mayor que en tejido procedente de la médula espinal, pero todavía se desconoce si la toxicidad de mSOD1 está relacionada con una actividad de la autofagia aberrante. Además, si mSOD1 ejerce un efecto tóxico en el músculo, éste podría no estar mediado por la acumulación de proteínas mal plegadas (Crippa et al. 2013). Los trabajos que se han realizado para conocer la situación del proceso autofágico en el tejido muscular con presencia de agregados proteicos de SOD1 son muy escasos, lo que pone de manifiesto la necesidad de realizar estudios que describan con mayor profundidad dicho proceso a lo largo de la enfermedad. INTRODUCCIÓN | 45 2.4 APOPTOSIS 2.4.1 ASPECTOS GENERALES DE LA APOPTOSIS La apoptosis es un tipo de muerte celular programa caracterizada por una serie de cambios morfológicos que incluyen la condensación (pyknosis) y fragmentación (karyorrhexis) del núcleo, así como la formación de cuerpos apoptóticos. Además está acompañado por una serie de cambios bioquímicos característicos como son la permeabilización de la membrana mitocondrial exterior (MOMP, mitochondrial outer membrane permeabilization), la activación de caspasas efectoras (caspasa 3, 6 y 7) y la activación de hidrolasas catabólicas que degradan la mayoría de las macromoléculas celulares, incluyendo el DNA (Marino et al. 2014). En general, existen dos tipos de apoptosis: la intrínseca que se induce intracelularmente y la extrínseca, cuya activación es extracelular (figura 1). Dentro de las formas extrínsecas se han descrito dos grupos, la extrínseca mediada por receptores de dependencia y la mediada por receptores de muerte. Mientras que en el caso de la apoptosis intrínseca, ésta puede ser dependiente o independiente de caspasas (Galluzzi et al. 2012b). 2.4.1.1 Apoptosis extrínseca El término de apoptosis extrínseca hace referencia a la muerte celular inducida por señales extracelulares de estrés cuya sensación y propagación se lleva a cabo por receptores transmembrana específicos. Se trata de una apoptosis dependiente de caspasas y por ello, puede ser inhibida por sustancias pancaspasas. La apoptosis extrínseca se produce a través de tres vías principales (Galluzzi et al. 2012b): 46 | INTRODUCCIÓN - A través de receptores de muerte que activan la caspasa 8, que a su vez conduce a la cascada de la caspasa 3, que es una caspasa efectora de la muerte celular por apoptosis. - A través de receptores de muerte que activan la caspasa 8 que promueve la liberación de BID, la permeabilización de la membrana exterior de la mitocondria y la activación de caspasa 9. Esta última caspasa forma parte del apoptosoma que activa a las caspasas efectoras (caspasa 3,6 y 7). - O bien, inducida por la falta de ligando a través de receptores de dependencia que conducen a la activación de caspasa 9 y de las caspasas efectoras. La apoptosis extrínseca puede ser iniciada por la unión de ligandos letales como FAS/CD95, el receptor de TNFR1 (tumour necrosis factor receptor 1) o el receptor TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). Como resultado de esta unión, se produce la movilización de proteínas como FADD (FAS associated dearth domain), TRADD (TNFR1-associated death domain) y la caspasa 8. FIGURA 1 Tipos de apoptosis (Marino et al. 2014) La activación de la caspasa 8 puede propagar la muerte celular a través de 3 vías: por la activación proteolítica directa de las caspasas efectoras, por la INTRODUCCIÓN | 47 proteólisis de BID (BH3-interacting domain death agonist) que provoca la migración de la proteína truncada BID a la mitocondria y la consecuente permeabilización de la membrana exterior o por la activación de la kinasa RIP (Galluzzi et al. 2012b; Marino et al. 2014). 2.4.1.2 Apoptosis intrínseca La apoptosis intrínseca está caracterizada por un hecho fundamental que es permeabilización de la membrana mitocondrial exterior (MOMP); y por ello, va siempre asociado a una disipación del potencial de la membrana mitocondrial generalizada e irreversible, la liberación de proteínas del espacio mitocondrial intermembranoso al citosol y la inhibición de la cadena respiratoria. Se produce como respuesta a una situación de estrés intracelular como puede ser el daño al DNA o una sobrecarga de calcio citosólico, que desencadena una serie de señales que favorecen la supervivencia o la muerte celular. En el caso de la apoptosis intrínseca independiente de caspasas, como consecuencia de MOMP, se liberan las proteínas AIF o EndoG que se traslocan al núcleo y promueven la fragmentación del DNA. Mientras que en el caso de la dependiente de caspasas, la liberación de citocromo c contribuye a la formación del apoptosoma que se une a la caspasa 9 y activa la cascada de la caspasas efectoras (Zhang et al. 2011; Galluzzi et al. 2012b; Marino et al. 2014). 2.4.2 APOPTOSIS EN LA ELA La implicación de la mitocondria en la enfermedad de la ELA está avalada por los hallazgos obtenidos en los numerosos trabajos llevados a cabo tanto en pacientes como en modelos animales. Las primeras investigaciones realizadas en tejidos procedentes de necropsias de pacientes ya mostraban alteraciones morfológicas de las mitocondrias en las neuronas de la médula espinal y en el músculo esquelético (Hirano et al. 1984). En relación con los modelos animales, en la medula espinal de los ratones SOD1 se han detectado defectos en la capacidad de tamponamiento del calcio (Kawamata and Manfredi 2010) y en la actividad de la cadena transportadora de electrones en los estadios presintomáticos de la enfermedad (Jung et al. 48 | INTRODUCCIÓN 2002). Además en los ratones SOD1G93A se han encontrado mitocondrias con crestas dilatadas y desorganizadas en los axones y las dendritas de motoneuronas en el comienzo de la enfermedad (Kong and Xu 1998). En estos mismos ratones, este comienzo del trastorno está precedido por un aumento de la degeneración de las mitocondrias con casi ausencia de muerte de las motoneuronas, que continua progresando durante la fase sintomática junto con la aparición de vacuolas en el interior de las mitocondrias (Higgins et al. 2003). El hecho de que estas anormalidades morfológicas aparezcan en ratones antes de los síntomas y que además se produzca la degeneración de las motoneuronas, sugiere que el deterioro mitocondrial desempeña un papel clave en la iniciación de degeneración de neuronas motoras en la ELA. La presencia de agregados insolubles de mSOD1 en la membrana exterior de la mitocondria, plantea la posibilidad de que la proteína mSOD1 afecte directamente a la función mitocondrial provocando en última instancia la muerte celular. De hecho, las mitocondrias aisladas expuestas in vitro a mSOD1 purificada mostraron una mayor susceptibilidad al estrés oxidativo y al daño estructural, lo que finalmente causó la liberación del citocromo c (Pedrini et al. 2010; Pickles et al. 2013). Además, la proteína mSOD1 puede unirse de forma aberrante a Bcl-2 en la membrana externa mitocondrial y desencadenar la toxicidad mediada por esta proteína (Pedrini et al. 2010; Tan et al. 2013). Aunque las mitocondrias alteradas por la ELA pueden desencadenar el proceso apoptótico y la muerte celular a través de la liberación de citocromo c (Naniche et al. 2011), se desconoce todavía si la apoptosis iniciada por las mitocondrias tiene un papel determinante en la neurodegeneración. En ratones SOD1G93A a los que se les ha bloqueado la proteína pro-apoptótica Bax, el comienzo y la progresión de la enfermedad se retrasa y se previene la muerte de las motoneuronas, aunque la degeneración de las mitocondrias se sigue produciendo. Estos datos sugieren que la apoptosis mediada por mitocondrias en las motoneuronas podría ser un efecto secundario en la neurodegeneración (Fischer et al. 2004; Fischer and Glass 2007). Por otro lado es interesante destacar que cuando en el mismo modelo murino de ELA se bloquean Bax y Bak que son proteínas pro-apoptóticas de la familia de Bcl2, se produce un aumento de la supervivencia de los ratones (Reyes et al. 2010). Al tratarse de dos proteínas que participan en la formación de poros en la membrana externa de la mitocondria INTRODUCCIÓN | 49 a través de los cuales se libera el citocromo c (Korsmeyer et al. 2000), estos resultados ponen de manifiesto la importancia de la permeabilización de la membrana mitocondrial en la patogénesis de la ELA. En las terminaciones nerviosas las mitocondrias son muy abundantes y se encargan de proporcionar energía y regular los niveles de calcio. Por esta razón es necesario que se coordine la actividad sináptica, el transporte y la distribución mitocondrial y la generación de ATP. Sin embargo, en ratones mSOD1 el transporte axonal es lento debido a la rotura de la red de neurofilamentos (Zhang et al. 1997; Ligon et al. 2005) y la acumulación de proteínas insolubles (Tateno et al. 2009). Este transporte deficiente que impide el reemplazo de las mitocondrias dañadas en las terminales neuromusculares puede causar la enfermedad a través del denominado “dying back”, previamente señalado. Si bien son numerosos los trabajos que han estudiado la apoptosis en las motoneuronas, el estudio de este tipo de muerte celular asociado a la atrofia muscular en el contexto de la ELA es más bien escaso. En ratones SOD1G93A, la expresión de mSOD1 puede causar primero la atrofia del músculo para continuar produciendo la alteración de la unión neuromuscular, la degeneración axonal retrógrada y finalmente terminar con la muerte de la motoneurona. Este patrón retrógrado y progresivo sugiere la posibilidad de que determinadas anormalidades musculares precedan a la muerte de la motoneurona y no al revés. Los resultados obtenidos por este grupo indican que la atrofia muscular asociada a la expresión de SOD1 es independiente de la activación de las caspasas, mientras que en los músculos paralizados se produce la muerte por apoptosis mediada por caspasas (Dobrowolny et al. 2011). 50 | INTRODUCCIÓN 2.5 RELACION ENTRE PROTEASOMA, AUTOFAGIA Y APOPTOSIS 2.5.1 AUTOFAGIA Y PROTEASOMA La necesidad de mantener la homeostasis energética y el equilibrio proteico (proteostasis) requiere que ambos sistemas de degradación estén controlados y coordinados durante toda la vida celular. La contribución relativa de cada sistema es diferente en función del tipo celular. En general, se puede decir que las proteínas de vida corta son degradadas preferiblemente por el proteasoma, mientras que las de vida larga son sustratos preferidos por la autofagia (Clague and Urbe 2010). Aunque durante mucho tiempo se ha considerado que el sistema UPS y la autofagia eran independientes entre sí, se ha demostrado que existe una conexión entre ambos. En condiciones normales, ambos procesos están sintonizados para regular procesos celulares relevantes que requieren modificaciones en las proteínas. Esta regulación del catabolismo de las proteínas es vital para proteger a la célula de los efectos tóxicos de las formas mutadas y/o mal plegadas (Li et al. 2008b). Por tanto, los trabajos que demuestran la conexión existente entre el proteasoma y la autofagia son numerosos. Así, Zeng et al. (2009) sugieren que la autofagia compensa la labor del UPS cuando este no es capaz de desarrollar su función correctamente, y viceversa. Además, la inhibición de UPS activa la degradación de proteínas por autofagia (Zheng et al. 2009; Crippa et al. 2010), mientras que cuando se inhibe la autofagia se produce la acumulación de proteínas ubiquitinadas en el citoplasma (Hara et al. 2006). Por otro lado, se han identificado proteínas comunes para los 2 sistemas, como es el caso de la chaperona Cdc48 (también denominada p97 o VCP) presente en algunas formas de ELAF (Johnson et al. 2010). También son numerosos los trabajos que han demostrado en neuronas de pacientes de ELAF y ELAE, que cuando se producen alteraciones en distintos INTRODUCCIÓN | 51 pasos de estos complejos sistemas de degradación, tiene lugar una acumulación de proteínas aberrantes. La comunicación existente entre UPS y autofagia puede llevarse a distintos niveles, a nivel del tipo de proteína a degradar, de las proteínas que marcan los productos aberrantes como ubiquitinas o co-chaperonas o de las moléculas comunes adaptadoras como p62 o reguladoras como factores de transcripción o LC3. 2.5.1.1 Tipo de proteína a degradar El primer nivel de comunicación entre el UPS y la autofagia se encuentra en el tipo de proteína que va a ser degradada. Las proteínas contienen en su estructura elementos que determinarán su destino, como son: - La estabilidad y la vida media de las mismas en función de la presencia de secuencias “degron” o zonas hidrofóbicas. Las “degron” son secuencias específicas de amino ácidos que marcan el lugar de inicio de la degradación. - La estructura secundaria que determina su inestabilidad o la exposición de las zonas hidrofóbicas. - La solubilidad, ya que las proteínas solubles prefieren ser degradadas por el proteasoma, mientras que los agregados proteicos solo pueden ser degradados por la autofagia (Ding and Yin 2008). La mayoría de las proteínas solubles prefieren ser degradadas por el proteasoma, y por el proceso de autofagia cuando la capacidad del proteasoma se ha excedido. Sin embargo, los agregados solo pueden ser eliminados por la autofagia (Pankiv et al. 2007). 2.5.1.2 Señalización de las proteínas En función de cómo se produzca el marcaje de las proteínas a degradar, bien sea por ubiquitinas o proteínas como ubiquitinas, el destino de las mismas variará. Este rumbo dependerá de la estructura y la polimerización realizada por las ubiquitinas. Sin embargo, previo al proceso de ubiquitinación, las proteínas aberrantes son detectadas por el sistema de chaperonas/co-chaperonas (Tyedmers et al. 2010). Este sistema de degradación se encarga de las proteínas recién 52 | INTRODUCCIÓN sintetizadas, de las desnaturalizadas por situaciones de estrés o de las que presentan regiones con niveles muy bajos de estructuración. Dentro de las cochaperonas que median en los procesos UPS y de autofagia, destacan CHIP y BAG. Como consecuencia de este primer paso de identificación por chaperonas o co-chaperonas, las proteínas a degradar se unirán a ubiquitinas. 2.5.1.3 Moléculas comunes adaptadoras El siguiente nivel de comunicación se produce después de la ubiquitinación a través de las moléculas adaptadoras como son p62, NRB1, UBD (proteins bearing ubiquitin binding domains) o UBA (ubiquitin-associated domains). Estos adaptadores se encargan de llevar las proteínas al proteasoma o de conectar con sustratos autofágicos. La proteína p62/SQSTM1 es una molécula adaptadora de unión a proteínas ubiquitinadas a través de dominios UBA por un lado y de unión directa a LC3 y otros homólogos de Atg8 a través de los motivos LIR (regiones de interacción con LC3) por otro (Pankiv et al. 2007). Además puede interaccionar con subunidades intrínsecas del proteasoma a través de dominios UBL (ubiquitin like) para transportar sustratos al proteasoma (Komatsu and Ichimura 2010). Mientras que los inhibidores del proteasoma inducen autofagia como respuesta compensatoria (Ding et al. 2007), la inactivación genética de genes esenciales para el proceso autofágico produce la acumulación y agregación de proteínas ubiquitinadas (Hara et al. 2006; Komatsu et al. 2006). Sin embargo cuando se producen largos periodos de inhibición de la autofagia, la eliminación de proteínas de vida corta específicas del proteasoma se ralentiza por los niveles elevados de p62 (Korolchuk et al. 2010), es decir, cuando se inhibe la autofagia no se induce el UPS como mecanismo compensatorio. 2.5.1.4 Moléculas comunes reguladoras Las moléculas reguladoras pueden activar o inhibir un sistema y por ello, pueden ser degradadas por el otro; dentro de ellas se encuentran varias quinasas y los factores de transcripción como p53. INTRODUCCIÓN | 59 este complejo, se produce un aumento de las mitocondrias, se desintegra el entramado mitocondrial y se produce una resistencia a la apoptosis intrínseca (Radoshevich et al. 2010). FIGURA 1 Proteínas autofágicas en la apoptosis intrínseca (Mukhopadhyay et al. 2014). Del mismo modo ocurre con la proteína Atg7 que induce la muerte celular tras el daño lisosomal al desencadenar la permeabilización de la membrana del lisosoma (Kessel et al. 2012); o con Atg5, que además de intervenir en la formación de los autofagosomas, puede sufrir una modificación postranslacional por la acción de una calpaína y ejercer un efecto pro-apoptótico (Codogno and Meijer 2006). Como se ha descrito en el capítulo, los procesos de degradación proteica (autofagia y proteasoma) y de muerte celular programada están muy relacionados, y su estudio debería llevarse a cabo como un conjunto, no como procesos aislados. 60 | INTRODUCCIÓN 2.6 METABOLISMO DE LÍPIDOS EN ELA En pacientes con la enfermedad de ELA, una de las complicaciones que se manifiestan ante el avance de la misma son las alteraciones energéticas que surgen como consecuencia de un desequilibrio entre la ingesta de alimentos y la energía disponible en el organismo (Braun et al. 2012; Muscaritoli et al. 2012). Estos pacientes pueden llevar asociadas a su patología alteraciones del metabolismo como son las dislipidemias, una disminución de la masa corporal y un incremento del gasto energético en reposo (Funalot et al. 2009; Dupuis et al. 2011). Del mismo modo ocurre en los modelos animales de la enfermedad, los animales transgénicos que portan la mSOD1 se caracterizan por tener un peso corporal menor que los WT, ser hipermetabólicos, e hipolipidémicos y presentar un incremento del consumo de ácidos grasos en el músculo (Dupuis et al. 2004; Fergani et al. 2007; Kim et al. 2011). Tal y como se ha expuesto en el capítulo anterior, la autofagia está presente en la enfermedad y, además, existe una relación entre este proceso y el metabolismo de los lípidos. 2.5.1 METABOLISMO DE LÍPIDOS Y AUTOFAGIA A nivel intracelular, los lípidos son cruciales para el mantenimiento de la homeostasis de la energía celular. En momentos de escasez de nutrientes, las reservas celulares de lípidos (triglicéridos en forma de gotas de grasa) se hidrolizan en ácidos grasos para producir energía, a la vez que se induce la autofagia como otra fuente de energía extra a partir de la degradación de proteínas y orgánulos celulares. Por lo tanto, si la falta de nutrientes provoca la movilización de los lípidos, se podrían pensar que la autofagia y el metabolismo lipídico comparten similitudes regulatorias y funcionales. Además, se ha INTRODUCCIÓN | 61 demostrado que los lisosomas tienen la capacidad de degradar lípidos gracias a la presencia de lipasas lisosomales o lipasas acidas en su interior, lo que se conoce con el término de lipofagia (Singh et al. 2009; Singh and Cuervo 2012). Numerosos trabajos han demostrado que la activación de la lipofagia se produce como respuesta a los cambios en el contenido lipídico de la célula en tejidos como el neuronal (Nowicki et al. 2010), el muscular o el hepático (Cahova et al. 2010) entre otros; aunque el mecanismo que modula la activación del proceso autofágico todavía no está definido (Singh and Cuervo 2012). La exposición a ácidos grasos insaturados como el ácido oleico ejerce un efecto estimulatorio sobre la autofagia en función de la concentración aplicada (Koga et al. 2010; Mei et al. 2011), mientras que el ácido palmítico, que es un ácido graso saturado, permanece en el citosol a altas concentraciones e inhibe la autofagia en células hepáticas (Mei et al. 2011). En los animales expuestos a una dieta alta en grasa durante períodos prolongados de tiempo, es posible detectar un aumento en la actividad autofágica durante las primeras semanas de tratamiento, que es seguido progresivamente por una disminución gradual en la autofagia. Aunque muchos mecanismos pueden contribuir al efecto inhibitorio ejercido por los ácidos grasos libres en la autofagia, el análisis del proceso de autofagia ha puesto de manifiesto la presencia de un defecto en la fusión entre los autofagosomas y los lisosomas en las células expuestas a altas concentraciones de ácidos grasos libres o en animales sometidos a una dieta alta en grasa de forma prolongada en el tiempo. El análisis de estas vacuolas autofágicas ha revelado que los alteraciones en la composición lipídica de la membrana de estas vesículas puede influir en el proceso de unión del autofagosoma con el lisosoma (Koga et al. 2010). 2.5.2 METABOLISMO ENERGÉTICO Las alteraciones del metabolismo de lípidos están presentes tanto en las motoneuronas como en el músculo de los ratones mSOD1 y de los pacientes de ELA. 62 | INTRODUCCIÓN En los últimos diez años el número de estudios relacionados con las alteraciones metabólicas en pacientes de ELA han ido aumentando. Los estudios epidemiológicos han demostrado que existe una asociación entre la nutrición y el riesgo de padecer ELA. Un primer estudio llevado a cabo en Japón en el año 2007 demostró que una alta ingesta de carbohidratos junto con un bajo consumo de grasas aumenta el riesgo de padecer ELA (Okamoto et al. 2007). Por el contrario, el seguimiento durante 10 años de un grupo formado por población general ha puesto en evidencia que el consumo de alimentos con un alto contenido en grasa reduce el riesgo de desarrollar la enfermedad (Gallo et al. 2013). Estos datos son coherentes con los encontrados en el modelo de ratones SOD1 que muestran una disminución de su supervivencia cuando se disminuye el aporte calórico de su dieta (Hamadeh et al. 2005; Patel et al. 2010). Cuando los ratones mSOD1 ingieren una mayor cantidad de calorías, este incremento calórico resulta beneficioso para ellos. Así, una dieta rica en lípidos administrada a ratones SOD1 normalizó los valores de masa corporal y restauró la adiposidad, retrasó el comienzo de los síntomas motores y de la degeneración de la motoneurona, y además aumentó la supervivencia en un 20% (Dupuis et al. 2004). Estos resultados han sido corroborados por los trabajos que posteriormente realizaron los grupos de Camandola y Pasinetti (Mattson et al. 2007; Zhao et al. 2012). En pacientes de ELA se ha estudiado la relación entre los lípidos y la progresión de la enfermedad a través de la cuantificación de los lípidos circulantes. Los resultados indican que en estos enfermos se produce una dislipidemia, que además correlaciona positivamente con un aumento de la supervivencia. Este aumento puede alcanzar hasta los 13 meses en el caso de los pacientes con un mayor ratio HDL/LDL (Dupuis et al. 2008). Otros grupos de trabajo han demostrado también que tanto la hiperlipidemia como el aumento de la masa corporal tienen un mayor pronóstico de supervivencia (Dorst et al. 2011; Paganoni et al. 2011; Shimizu et al. 2012; Reich-Slotky et al. 2013). Uno de los últimos trabajos llevados a cabo han puesto de manifiesto que la presencia de grasa subcutánea correlaciona de modo positivo con la supervivencia (Kouroku et al. 2007); mientras que un ratio HDL/LDL bajo o una disminución rápida del índice de masa corporal está asociado con un declive más rápido en estos INTRODUCCIÓN | 63 pacientes (Jawaid et al. 2010). Además, un estado nutricional pobre tiene un peor pronóstico de la progresión de la enfermedad (Marin et al. 2011). Por otra parte, en situaciones de hipoglucemia, las neuronas pueden usar los cuerpos cetónicos en caso de una alto requerimiento energético (LaManna et al. 2009), y en esta situación, los astrocitos pueden utilizar los lípidos para proporcionar los cuerpos cetónicos a las motoneuronas en caso de necesidad (Yi et al. 2011). En los ratones SOD1, la administración de triglicéridos de cadena media, que son precursores de los cuerpos cetónicos, preservan las funciones motoras y la supervivencia de las motoneuronas por medio del aumento del metabolismo de los lípidos (Zhao et al. 2012). Además, en pacientes de ELA se ha observado un aumento de los cuerpos cetónicos en el fluido cerebroespinal que proceden de la ruptura de ácidos grasos (Blasco et al. 2010) lo que podría indicar una alteración en la beta oxidación de los lípidos. En relación con el tejido muscular, los ratones SOD1 presentan un alto requerimiento energético (Dupuis et al. 2004) que se relaciona con una mayor necesidad de ácidos grasos y con cambios en el patrón de expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico (Fergani et al. 2007; Gonzalez de Aguilar et al. 2008; Thau et al. 2012). En el caso de los pacientes de ELA, se ha descrito un predominio del metabolismo oxidativo y deficiencias en la función de la cadena mitocondrial oxidativa en el músculo (Crugnola et al. 2010). Las alteraciones descritas en las funciones energéticas de la mitocondria podrían contribuir a la atrofia del músculo en la enfermedad de ELA (Zhou et al. 2010). A modo de resumen, a continuación se recogen en las siguientes tablas, los estudios relacionados con el metabolismo energético que se han realizado en pacientes (tabla 1) y en modelos animales de ELA (tabla 2). 64 | INTRODUCCIÓN TABLA 1 Estudios relacionados con el metabolismo energético en pacientes de ELA (Schmitt et al. 2014). TAMAÑO MUESTRA CONCLUSIONES REFERENCIA Metabolismo basal n=44 Pacientes ELA son hipermetabólicos. (Funalot et al. 2009) Epidemiología y riesgo a ELA n=153 Ingesta alta de carbohidratos y baja de lípidos aumenta el riesgo de ELA (Okamoto et al. 2007) n=222 Alto contenido en grasa corporal reduce el riesgo de padecer ELA. (Gallo et al. 2013) Lípidos y prognosis n=369 LDL/HDL alto correlaciona con aumento supervivencia (Dupuis et al. 2008) n=658 Hiperlipidemia no correlaciona con aumento supervivencia (Chio et al. 2009) n=658 LDL/HDL bajo correlaciona con disfunción respiratoria (Chio et al. 2009) n=285 BMI bajo correlaciona con declive rápido (Jawaid et al. 2010) n=92 Estatus nutricional pobre asociado a alta mortalidad (Marin et al. 2011) n=488 Colesterol y triglicéridos altos correlacionan con mayor supervivencia. (Dorst et al. 2011) n=427 BMI alto correlaciona con mayor supervivencia (Paganoni et al. 2011) n=77 Alta reducción BMI predice declive rápido (Shimizu et al. 2012) n=150 Alto BMI correlaciona con un declive de la puntuación ALSFRS más lento (Reich-Slotky et al. 2013) n=62 Alta grasa subcutánea correlaciona positivamente con supervivencia (Lindauer et al. 2013) TABLA 2 Estudios relacionados con el metabolismo energético en modelo murinos de ELA (Schmitt et al. 2014). MODELO TAMAÑO MUESTRA CONCLUSIONES REFERENCIA SOD1G93A n=8 Composición alterada de lípidos en la medula espinal (Cutler et al. 2002) n=13 Dieta alta en grasa retrasa el comienzo de la enfermedad y aumenta la supervivencia. (Dupuis et al. 2004) n=27 Dieta cetogénica protege frente a la muerte de la motoneurona (Zhao et al. 2006) n=15 Hipolipidemia (Fergani et al. 2007) n=49+31 Restricción calórica disminuye la supervivencia con aumento de peroxidación lipídica, inflamación y apoptosis. (Patel et al. 2010) n=30 Hipolipidemia en el estadio presintomático de la enfermedad. (Kim et al. 2011) n=machos Triglicéridos de cadena acorta protegen motoneuronas, pero no aumenta supervivencia (Zhao et al. 2012) SOD1G86R n=7-8 Defecto dramático en la homeostasis energética e hipermetabolismo de origen muscular (Dupuis et al. 2004) n=10 Hipolipidemia (Fergani et al. 2007) Tal y como se acaba de describir, los estudios preclínicos y la investigación básica han demostrado que un nivel alto de lípidos correlaciona con una mejor INTRODUCCIÓN | 65 prognosis de la enfermedad. Estos datos sugieren que una dieta suplementada con lípidos puede ser una terapia prometedora para el tratamiento del ELA. 2.5.3 TRATAMIENTO DE LA ELA CON LÍPIDOS Cuando los ratones mSOD1 ingieren una mayor cantidad de calorías, este incremento calórico resulta beneficioso para ellos (tabla 2). Así, una dieta rica en lípidos administrada a ratones SOD1 normalizó los valores de masa corporal y restauró la adiposidad, retrasó el comienzo de los síntomas motores y de la degeneración de la motoneurona, y además aumentó la supervivencia en un 20% (Dupuis et al. 2004). Estos resultados han sido corroborados por los trabajos que posteriormente realizaron los grupos de Camandola y Pasinetti (Mattson et al. 2007; Zhao et al. 2012). En la actualidad se están realizando varios ensayos clínicos en relación con la nutrición con la finalidad de conocer más exactamente que sucede en los pacientes. A nivel farmacológico, se está analizando el medicamento Olanzapine (10 mg/día) para tratar la pérdida de apetito (NCT00876772; clinicaltrial.gov), pero hasta el momento no se han publicado los resultados. Sin embargo, el ensayo con el medicamento Pioglitazone (45 mg/día) que es un anti-diabético, ha sido suspendido en fase II al no encontrarse beneficio alguno en su administración (NCT00690118; clinicaltrial.gov). En relación a las dietas suplementadas, se está administrando una dieta rica en grasa y alto contenido calórico para corregir la malnutrición (NCT00983983; clinicaltrial.gov) (Schmitt et al. 2014), además en pacientes de ELA con alimentación asistida por sonda de gastrostomía se está administrando una dieta cetogénica rica en grasas y baja en carbohidratos (NCT01016522; clinicaltrial.gov). Con estos ensayos se pretende prevenir el estado de malnutrición característico de estos pacientes (Schmitt et al. 2014). También se está estudiando el metabolismo basal de los pacientes con ELA. Un primer ensayo, en vías de reclutamiento, pretende cuantificar el sustrato nutricional que utilizan estos pacientes (NCT00714220; clinicaltrial.gov), mientras que un segundo ensayo, se ha centrado en la influencia de la hiperlipidemia en la ELA (NCY01592084; clinicaltrial.gov) (Schmitt et al. 2014). 66 | INTRODUCCIÓN Por otra parte, tal y como quedo de manifiesto en el “IV Encuentro Nacional de personas con ELA e Investigadores” realizado el pasado mes de abril, se está llevando a cabo en España un ensayo con pacientes de ELA a los que se les está administrando como suplemento alimenticio el compuesto ALGATRIUM Plus que es un aceite omega 3 con un alto contenido en DHA (ácido docosahexaenoico), pero por el momento se desconocen los resultados. El resultado de todos estos ensayos ayudará a determinar si la modulación de los lípidos, bien a nivel farmacológico o bien a modo de suplementación, puede ser un potencial tratamiento para la ELA. 3 OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS | 75 4.1.3 EXTRACCION Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ANIMALES Los tejidos objeto de estudio del presente trabajo fueron el músculo cuádriceps y la médula espinal de ratones WT y transgénicos de ambos sexos a las edades de 40, 60, 90 y 120 días. Estas edades se corresponden con los siguientes estadios de la enfermedad: asintomático a la edad de 40 días, sintomático temprano a los 60 días de vida, sintomático a los 90 días y estado terminal a los 120 días de edad. Los ratones fueron sacrificados mediante asfixia en una cámara de CO2. Posteriormente, ambos músculos cuádriceps y la médula espinal de cada animal fueron disecados y, en caso de no ser usados en ese momento, rápidamente congelados en nitrógeno líquido para su almacenamiento en un congelador a -80ºC. Los tejidos obtenidos (músculo y médula espinal) destinados al estudio bioquímico se pulverizaron con nitrógeno líquido por medio del sistema CellcrusherTM (Cellcrusher). A partir de este punto, el tejido se dividió igualmente para el estudio génico y proteico. Esto permite realizar tantoel estudio proteico como el génico en los mismos animales y evitar los posibles errores debidos a la variabilidad entre animales. Mientras que las muestras para los ensayos histológicos se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 24 horas, y se criopreservaron en sacarosa al 30% durante 48 horas a 4 ºC. Posteriormente, los tejidos fueron embebidos en una resina para congelación OCTTM Tissue-Tek (Sakura) y se congelaron en 2-metilbutano enfriado con nitrógeno. Los bloques se almacenaron a -80 º C hasta el momento de su utilización. Para realizar el corte de las muestras, primero lo bloques se dejaron atemperar a -20ºC en el criostato (CM1510S, Leica Microsystems) y se cortaron secciones transversales de 10 µm de grosor. Los cortes se recogieron en portaobjetos Superfrost®Plus (Thermo Fisher Scientific) que se almacenaron a -20ºC hasta el momento de su uso. 76 | MATERIAL Y MÉTODOS 4.2 PCR CUANTITATIVA A TIEMPO REAL 4.2.1 EXTRACCIÓN DEL RNA TOTAL Para realizar la extracción del RNA de las muestras, se utilizaron dos métodos distintos en función de las características especiales del tejido de partida. En el caso concreto de la médula espinal, por tratarse de un tejido rico en lípidos, fue necesaria la utilización de un protocolo específico. En el caso del tejido muscular, el RNA se extrajo por medio del Trizol Reagent (Invitrogen) usando un homogenizador de muestras (IKA T10 UltraTurrax), seguido del tratamiento con cloroformo e isopropanol que separa y precipita el RNA respectivamente. Finalmente, se lavó con etanol al 75% y se resuspendió el RNA en agua DEPC. Por otra parte, para la extracción del RNA de la médula espinal, se usó el kit comercial RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) basado en un sistema de extracción y purificación por columnas, siguiéndose las indicaciones del fabricante. 4.2.2 SINTESIS DE DNA COMPLEMENTARIO O cDNA Para evitar la presencia de DNA genómico en las muestras de RNA que podrían provocar amplificaciones inespecíficas en los estudios de expresión génica, 10 µg de RNA fueron tratados con la DNasa Turbo DNA-free (Ambion). Seguidamente, y tras medir la concentración de RNA en un espectrofotómetro (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific), se sintetizó el cDNA a partir de 1 µg de RNA por medio del Super-ScriptTM First-Strand Synthesis System kit (Invitrogen). 4.2.3 PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR) La PCR a tiempo real o RT-PCR es una técnica que permite amplificar y cuantificar simultáneamente una muestra de cDNA. Para cuantificar el número de copias del gen en estudio, se normalizaron los valores con genes normalizadores o housekeepings. MATERIAL Y MÉTODOS | 77 Se utilizaron sondas TaqMan® (Applied Biosystems) caracterizadas por ser oligonucleótidos modificados que emiten fluorescencia cuando hibridan específicamente con un DNA complementario. Las sondas empleadas en este trabajo aparecen citadas en la tabla 4.2. Todas las reacciones se optimizaron para realizarse en un volumen final de 5 µl con 2.5 µl TaqMan® Universal PCR Master Mix, 0.25 µl de la sonda específica para cada gen, 2 µl de cDNA diluido 1/10 y agua DEPC para completar el volumen. Las reacciones se realizaron por duplicado en un ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Como genes normalizadores se usaron los 2 genes endógenos GAPDH y βactina, cuya media geométrica se utilizó para corregir la expresión de los genes objeto de estudio. Estos genes se seleccionaron basándonos en estudios previos realizados por nuestro laboratorio, en función del tipo de tejido, para nuestro modelo animal (Calvo et al. 2008). La expresión relativa de los genes se determinó usando el método 2CT (Livak and Schmittgen 2001). Este método, permite comparar el mismo gen en 2 muestras distintas tras la previa corrección con el gen normalizador en relación a su valor Ct o ciclo umbral (cycle threshold). TABLA 2 Lista de sondas TaqMan® usadas para la RT-PCR. SONDA REFERENCIA LC3 Mm00458724_m1 p62/SQSTM1 Mm00448091_m1 E2F1 Mm00432939_m1 ATG5 Mm00504340_m1 Beclin1 Mm00517174_m1 GAPDH 4352932E β-actina 4352933E 78 | MATERIAL Y MÉTODOS 4.3 WESTERN BLOT 4.3.1 EXTRACCION Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEINA El tejido pulverizado proveniente de músculo y médula espinal se homogenizó en una solución de lisis RIPA con antiproteasas (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche) en frío. El homogenado se centrifugó a 10000g durante 10 minutos a 4ºC, y se recuperó el sobrenadante. Para cuantificar la proteína presente en las muestras, se utilizó el método del ácido bicinconínico o BCA. El sobrenadante de las muestras se sometió a una reacción colorimétrica y la absorbancia se midió a 562 nm en un espectrofotómetro (Infinite F200, Tecan Ibérica Instrumentación). 4.3.2 ELECTROFORESIS E INMUNODETECCIÓN En un primer lugar se procedió a la electroforesis de las proteínas en un gel SDSPAGE (tabla 4.3). Para ello, se desnaturalizaron las proteínas junto el buffer Laemmli durante 5 minutos a 98ºC; tras lo cual, un total de 40 µg de proteína se resolvieron en un gel de acrilamida al 5-15% (tabla 4.4). TABLA 3 Composición de las soluciones usadas en el Western blot. SOLUCIONES COMPOSICIÓN Buffer RIPA 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 1% deoxicolato, 0.1% SDS y 1% tritón X-100 Buffer Laemmli 2x 100 mM Tris-HCl ph 6.8, 4% SDS, 20% glicerol, 5% -mercaptoetanol, 2.5% azul bromofenol al 0.5% etanol al 10% Buffer gel inferior 4x 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 Buffer gel superior 4x 1.5 M Tris-HCl pH 6.8 Buffer electroforesis 50 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 0.2% SDS Buffer transferencia 50 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 20% metanol TBS 10x 200 mM Tris-HCl pH 8, 1.5 M NaCl TTBS 20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 MATERIAL Y MÉTODOS | 79 A continuación, se transfirieron las proteínas del gel a una membrana de PVDF (Amersham HybondTM-P, GE). Para comprobar que la transferencia fue correcta, se tiñó la membrana con solución Ponceau (Sigma). Para la inmunodetección de las proteínas, se bloquearon los sitios inespecíficos de la membrana con leche desnatada al 5% en TTBS en agitación a 4ºC toda la noche. Al día siguiente, la membrana se incubó durante una hora a temperatura ambiente y en agitación con el anticuerpo primario en un 0.1% de BSA en TTBS (tabla 4.5). Se lavó seguidamente 3 veces durante 10 minutos con TTBS y se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con HRP durante una hora a temperatura ambiente en agitación. Finalmente, se lavó la membrana de nuevo 3 veces durante 10 minutos con TTBS. La inmunodetección se llevó a cabo aplicando un sustrato quimioluminiscente ECL (ECLplus, GE). Se expusieron las membranas en las películas radiográficas, y se realizó el análisis densitométrico de las bandas con el programa AlphaEase FC (Bonsai). La normalización de los datos se realizó diviendo las intensidades ópticas de cada proteína a estudio entre las de la proteína normalizadora GAPDH. TABLA 4 Composición de los geles de acrilamida. GEL SEPARACIÓN GEL CONCENTRACIÓN 15% 5% Buffer 4x (ml) 2.5 1.25 Acrilamida (ml) 3.75 0.625 H2Od (ml) 3.65 2.9 SDS (µl) 100 50 TEMED (µl) 15 10 APS (µl) 50 25 TABLA 5 Anticuerpos primarios y secundarios. ANTICUERPO PM (KDA) DILUCIÓN CASA COMERCIAL 1º LC3 18-16 1:1000 PD014, MBL p62/SQSTM1 62 1:1000 BML-PW9860, Enzo Life Sciences Bax 23 1:1000 sc-526, Santa Cruz Biotechnology Bcl2 26 1:1000 sc-492, Santa Cruz Biotechnology Caspase-3 32-17 1:500 9662, Cell Signalling Technology GAPDH 37 1:1000 sc-25778, Santa Cruz Biotechnology 2º Goat anti-rabbit - 1:3000 sc-2004, Santa Cruz Biotechnology Mouse anti-rabbit - 1:3000 sc-2005, Santa Cruz Biotechnology 80 | MATERIAL Y MÉTODOS 4.4 DETECCIÓN DE APOPTOSIS: TUNEL Además de la detección de proteínas relacionadas con la apoptosis, se realizó la determinación de la apoptosis a través del ensayo denominado TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). El TUNEL consiste en la incorporación por parte de la enzima TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase) de nucleótidos modificados o marcados (dUTP) a la zonas terminales –OH de los ácidos nucleicos formados tras la fragmentación del DNA por la apoptosis. Para este estudio, se usó el kit comercial In situ Cell Death Detection kit (Roche) que permite detectar y cuantificar la muerte celular sobre nuestras preparaciones de músculo y médula espinal de los animales. Para detectar los núcleos apoptóticos por medio de un microscopio de fluorescencia, se incorpora la fluoresceína como sistema de marcaje de los fragmentos de DNA. Como control positivo de la técnica se usaron muestras de tejido tratadas con DNasa I recombinante. Al final del ensayo, las secciones se montaron con medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector) que es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones enriquecidas en adenina y timina en secuencias de ADN y por tanto, es un marcador celular. El porcentaje de células apoptóticas se determina por el número de células positivas en relación al número total de células usando un microscopio de fluorescencia (Olympus IX81). 4.5 ENSAYO IN VITRO DE LA CLOROQUINA Para evaluar el estado del proceso de autofagia en el músculo y la médula espinal de los animales se trataron las muestras con cloroquina. La cloroquina es MATERIAL Y MÉTODOS | 81 un fármaco del grupo de las 4-aminoquinolinas usado en el tratamiento y/o prevención de la malaria que, en el caso de la autofagia, impide la acidificación de los lisosomas, y por tanto, su eliminación. Como consecuencia de este bloqueo en el proceso autofágico, se produce una acumulación de la proteína LC3-II (presente en los autofagosomas) al interrumpirse la degradación de la misma. Los músculos cuádriceps y la médula espinal de los ratones de 90 y 120 días de edad fueron disecados y troceados en pequeñas porciones. Tras lavar los tejidos con PBS, los explantos se incubaron en DMEN con 10% (v/v) de suero fetal bovino y cloroquina 100 µM (Sigma) durante 6 horas a 37ºC y un 5% de CO2. Finalmente, se lavaron los tejidos y se extrajo la proteína para poder evaluar con la técnica de WB los niveles de la expresión proteica de LC3-II en cada una de las muestras. 4.6 ACTIVIDAD PROTEASOMA 4.6.1 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN PROTEÍNA El proteasoma como sistema proteolítico puede realizar 3 tipos de actividades catalíticas distintas, como son la actividad de la quimotripsina, la de la tripsina y la de la caspasa. Para evaluar la actividad enzimática del sistema proteasomal se ha usado un kit comercial capaz de detectar dicha actividad. Al tratarse de un ensayo que evalúa la actividad enzimática del proteasoma, la medida de dicha actividad requiere el uso de muestras proteicas frescas que no hayan sido sometidas a ciclos de congelación/descongelación (Strucksberg et al. 2010). Para ello, tras su disecación, dichas muestras de cuádriceps y médula espinal de los ratones se homogenizaron en buffer frío (20 mM TrisHCl pH 7.5 y 2 mM EDTA) el mismo día que se realizó la determinación de la actividad. Las muestras se centrifugaron a 15000g durante 10 minutos a 4ºC y se recuperó el sobrenadante. 82 | MATERIAL Y MÉTODOS La determinación de la concentración proteica se realizó por el método BCA y una cantidad total de 10 µg de proteína se usó para el ensayo. 4.6.2 MEDIDA ACTIVIDAD PROTEASOMA 26S Para medir la actividad del proteasoma 26S se usó el kit comercial CHEMICON® Proteasome Activity Assay Kit (Millipore). Los extractos proteicos se incubaron durante 2 horas a 37°C con el sustrato marcado LLVY-7-amino-4-methylcoumarin y la actividad enzimática se determinó por detección del fluoróforo libre 7amino-4-methylcumarin (AMC). La fluorescencia emitida por AMC se midió usando un lector de placas (Infinito F200 PRO, TECAN) con un rango de excitación de 360 nm y de emisión de 460 nm. 4.7 PRUEBAS DE COMPORTAMIENTO EN EL MODELO ANIMAL La evaluación del comportamiento motor de los animales se llevó a cabo por medio de una serie de pruebas como son el test del rotarod, el de la rejilla y el treadmill. Además, se realizó un control sobre la evolución del peso y la supervivencia de los ratones a medida que se desarrolla la enfermedad. El registro de estas pruebas se hizo semanalmente, siempre por las mañanas. Para evitar comportamientos anómalos en los animales que pudieran alterar los resultados de las pruebas, se comenzó siempre con los machos y tras evaluar cada animal, los aparatos se limpiaron en profundidad. 4.7.1 PESO Previo a la realización de las pruebas de comportamiento, los ratones se pesaron en una balanza electrónica (VIPER SW 3, Mettler Toledo). MATERIAL Y MÉTODOS | 83 4.7.2 TEST DEL ROTAROD El rotarod es un test que nos permite evaluar la coordinación, el equilibrio y la fuerza motora. El aparato consiste en un cilindro que gira de modo continuo a una velocidad constante de 14 rpm y presenta 5 compartimentos independientes para evitar el contacto entre los ratones (RotaRod/RS, LE8200, LSI-LETICA Scientific Instruments). Para el correcto desarrollo de la prueba, fue necesario entrenar los ratones una semana antes de comenzar con el ensayo, y se descartaron aquellos animales que a pesar de no tener ninguna dificultad motora, no fueron capaces de superarla (falta de atención, nerviosismo…). Cada ratón tuvo tres oportunidades y se registró el tiempo máximo que los ratones permanecieron sin caer, tomando como tiempo límite 180 segundos. 4.7.3 TEST DE LA REJILLA A través de este test se evalúa la fuerza muscular y el punto en el cual se produce el comienzo de los síntomas de la enfermedad. Cada animal es colocado sobre una rejilla, que se gira 180º y deja al animal suspendido de ella. Al igual que se hace en la prueba del rotarod, los ratones dispusieron de 3 intentos y un tiempo máximo de 180 segundos. Se registró el tiempo máximo que aguantaron los ratones en suspensión sin caer. 4.7.4 TREADMILL Para la realización de esta prueba, los animales fueron sometidos a ejercicio involuntario en una cinta de correr para pequeños roedores (1055SDRM Columbus Instruments). La actividad motora se registró 3 días a la semana a partir de los 45 días de edad. Para animar a los ratones a correr y evitar que se queden parados en la parte final de la cinta, el sistema está equipado con una rejilla electrificada en la parte inferior que produce una leve descarga 0,3 mA que no daña o hiere a los animales. Se analizaron tres velocidades (11, 22 y 44 cm/s) durante 10 minutos con una inclinación de la cinta de 5 º. Los resultados de la prueba se miden en relación con el tiempo que cada ratón permanece en la zona electrificada. De esta forma, a medida que avanza la enfermedad 84 | MATERIAL Y MÉTODOS de un animal, aumenta el tiempo que pasa en la rejilla electrificada y disminuye el tiempo que pasa corriendo sobre la cinta transportadora. 4.7.5 SUPERVIVIENCIA Debido a la severidad del modelo murino empleado para este trabajo, fue necesario establecer un punto final en la vida de estos animales para proceder a su sacrificio. El punto final tiene lugar cuando el animal permanece más de 30 segundos colocado en posición decúbito y no es capaz de girarse por sí mismo (Azzouz et al. 2004), procediéndose al sacrificio del mismo en una cámara de CO2. 4.8 HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS Y ESTADÍSTICA 4.8.1 HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS A la hora de elaborar el presente trabajo se necesitaron programas informáticos tanto para el análisis como para el procesamiento de los resultados obtenidos en los distintos ensayos realizados. A continuación se enumeran los distintos programas: • Análisis de secuencias y productos amplificados por la RT-PCR: StepOneTM software v2.0. (Applied Biosystems). • Análisis densitométrico de las bandas del Western Blot: AlphaEase®FC (Alpha Innotech). 4.8.2 HERRAMIENTAS ESTADÍSTICAS Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos se empleó el programa SPSS 19.0. (IBM). Como paso previo, se hizo un estudio de la normalidad por el test de Shapiro– Wilk. Tras comprobar la normalidad de los datos, se llevó a cabo el análisis de los RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 91 A continuación se enumeran los manuscritos a los que se ha hecho mención anteriormente: Manuscrito 1. Oliván S, Calvo AC, Manzano R, Zaragoza P, Osta R. Sex differences in constitutive autophagy. Biomed Research International. 2014;2014:652817. Manuscrito 2. Oliván S, Calvo AC, Gasco S, Muñoz MJ, Zaragoza P, Osta R. Time-point dependent activation of autophagy and the UPS in the skeletal muscle from SOD1G93A mice. Manuscrito 3. Oliván S, Calvo AC, Rando A, Muñoz MJ, Zaragoza P, Osta R. Comparative study of behavioural tests in the SOD1G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Manuscrito 4. Oliván S, Martínez-Beamonte R, Calvo AC, Surra JC, Manzano R, Arnal C, Osta R, Osada J. Extra virgin olive oil intake delays the development of Amyotrophic Lateral Sclerosis associated with reduced reticulum stress and autophagy in muscle of SOD1G93A mice. Journal of Nutritional Biochemistry (in press). Manuscrito 5. Oliván S, Calvo AC, Herrera M, Zaragoza P, Osta R. The interplay between defective autophagy and UPS actuvation in SOD1G93A mice spinal cord. En preparación. 92 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 93 5.1 MANUSCRITO 1 Sex differences in constitutive autophagy Oliván S, Calvo AC, Manzano R, Zaragoza P, Osta R Biomed Res Int. 2014;2014:652817. doi: 10.1155/2014/652817. 94 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 95 96 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 97 98 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.2 MANUSCRITO 2 Time-point dependent activation of autophagy and the UPS in muscle of SOD1G93A mice. Oliván S, Calvo AC, Gasco S, Muñoz MJ, Zaragoza P, Osta R Enviado a Cell Death and Disease RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 99 ABSTRACT Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by a selective loss of motor neurons together with a progressive muscle weakness. Albeit the pathophysiological mechanisms of the disease remain unknown, growing evidence suggests that skeletal muscle can be a target of ALS toxicity. In particular, the two main intracellular degradation mechanisms, autophagy and the ubiquitin-proteasome degradative system (UPS) have been poorly studied in this tissue. In this study we investigated the time-point dependent activation of autophagy and the UPS in the skeletal muscle from transgenic SOD1G93A mice, a mouse model for the disease, along disease progression. Our results showed a significant upregulation of proteasome activity at early symptomatic stage, while the autophagy activation was found at terminal stages, since chloroquine treatment revealed the upregulated levels of LC3-II and p62 found at late stages were indicative of an autophagy activation. The mRNA upregulated levels of LC3, p62, Beclin1, Atg5 and E2f1 were only observed at symptomatic and terminal stages, which reinforced the time-point activation of autophagy. Furthermore, no apoptosis activation was observed along disease progression. The combined data provided clear evidence for the first time that proteasome impairment triggered autophagy at late stages of the disease in the skeletal muscle from transgenic SOD1G93A mice. These findings could represent a new approach for potential therapeutic treatments. Keywords: ALS, autophagy, LC3, skeletal muscle, transgenic SOD1G93A mice, UPS Abbreviations: ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis; CQ, chloroquine; ER, endoplasmic reticulum; fALS, familial ALS; LC3, microtubule-associated protein 1 light chain; P, postnatal day; PBS, phosphate-buffered saline; SEM, standard error of the mean; UPR, unfolded protein response; UPS, ubiquitin-proteasome degradative system. 100 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN INTRODUCTION Autophagy and the ubiquitin-proteasome degradative system (UPS) are considered two main critical mechanisms that contribute to basal elimination of misfolded proteins and hence, they maintain the balancing protein homeostasis inside cells. Albeit autophagy was initially described as a central mechanism for cell survival under starvation conditions, a growing number of studies indicate that autophagy can play a relevant role in eliminating protein aggregates, especially in neurodegenerative diseases, mainly because its activation can efficiently degrade misfolded mutant proteins.1 For this reason, autophagy markers are becoming the new targets for potential therapeutic strategies in neurodegenerative diseases, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). ALS is one of the most known neurodegenerative diseases characterized by a selective loss of motor neurons together with a progressive muscle weakness. The first studies that connected an impairment in autophagy to the progression of ALS showed a significant upregulation of the activated microtubule-associated protein 1 light chain (LC3) protein levels at the end symptomatic stage in the spinal cord from SOD1G93A mice, one of the best characterized animal models of the disease.2,3 At this step, macroautophagy, an intracellular process that leads to the elimination of cytoplasmic components inside lysosomes, was proposed as the main process that degraded mutant SOD1 in vitro and in vivo in the spinal cord from SOD1G93A mice.4 Remarkably, a wide range of studies have characterized till now the possible cause of autophagy impairment in different experimental models for ALS.5-13 In addition, mutant SOD1 aggregates not only induce impairment in proteasome activity but also alterations in SOD1 intracellular distribution.14 In particular, there is clear evidence that endoplasmic reticulum (ER) stress correlates directly to motor neuron loss and ALS progression and interestingly, the adaptative responses to ER stress through protein folding pathways, such as unfolded protein response (UPR) are also closely related to macroautophagy in mutant SOD1 transgenic mice.7,8 The UPR is the main protective mechanism during ER stress and it promotes either protein folding or degradation of misfolded proteins. Precisely, the UPS is an important mechanism for the degradation of misfolded proteins exporting from ER and its failure can lead to significant ER stress.7,15-17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 107 the fact that mutant SOD1 was not directly influencing mitochondrial dysfunction as previously reported.28,33 Furthermore, in connection with this result it is interesting to note that rapamycin, an autophagy enhancer, accelerated the motor neuron degeneration in transgenic SOD1G93A mice and it exacerbated the pathological progression mainly through apoptosis, suggesting that specific stimuli could possibly trigger the tissue degeneration through apoptosis.38 The data presented here uncover for the first time that there is a cross-talk between autophagy and the UPS in the skeletal muscle from transgenic SOD1G93A mice. It has been described their compensatory way of action, in other words, the autophagy activation is prompted when the UPS impairment is present, and therefore autophagy blockage directly influences the UPS function.39 Based on the fact that a failure of the UPS function is relevant in the neurodegenerative progression in motor neuron diseases, our results are in line with this point, since the activation of proteasome activity was only relevant at early symptomatic stage and this activation was followed by the autophagy activation at symptomatic and terminal stages. Taking into consideration that in skeletal muscle, in contrast to other tissues, the activation of autophagy can persist for long periods of time, the transient activation of autophagy at late stages in transgenic SOD1G93A mice could suggest a deregulation of this process along disease progression due to the degeneration related to ALS. These findings provide new insights into the role of autophagy in the progression of ALS, although further studies are required to completely unravel unknown features of this protein degradation mechanism and its close relation to the UPS. Consequently, a possible progress in the design of promising therapeutic interventions could be addressed. MATERIALS AND METHODS Animals. Transgenic mice expressing the G93A mutant human SOD1 were originally obtained from The Jackson Laboratory (B6SJLTg(SOD1*G93A)1Gur/J). Hemizygotic transgenic mice were obtained by mating transgenic males with F1 females (B6SJL). The offspring were identified by PCR amplification of DNA extracted from tail tissue with specific primers for human SOD1. Wild type littermates were used as controls for all experiments. Hemizygous SOD1G93A 108 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN mice at the following days of life were used: 40 (presymptomatic, P40), 60 (early symptomatic, P60), 90 (symptomatic, P90) and 120 (terminal stage, P120). The animals were housed in the Unidad Mixta de Investigación of the University of Zaragoza under a 12h light/dark cycle. Food and water were available ad libitum. The care and use of animals were performed accordingly with the Spanish Policy for Animal Protection RD53/2013, which meets the European Union Directive 2010/63/UE on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. The mice were sacrificed by CO2 anesthesia and skeletal muscles from both hindlimbs were dissected, snap-frozen and preserved at -80ºC. Muscle tissue from each group of mice was pulverized in liquid nitrogen with a cell crusher. The powdered tissue was divided equally for RNA and protein extraction. All experimental groups were balanced to avoid sex bias.40 mRNA expression. For RNA extraction, powdered muscle tissue was homogenized with Trizol Reagent (Invitrogen) (n=10 animals per time point and genotype) using a PRO200 homogenizer (PRO Scientific Inc.). RNA extracted was treated to eliminate genomic DNA using the Turbo DNA-freeTM kit (Ambion). Reverse transcription was carried out according to the SuperScriptTM First-Strand Synthesis System kit (Invitrogen). Gene expression variations in all of the samples were assayed by real-time PCR in an ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Primer and probe mixtures for each gene LC3 (Mm00458724_m1) and p62 (Mm00448091_m1) were supplied by Applied Biosystems. Two endogenous genes (GAPDH and β-actin, Applied Biosystems) were used for normalization of the data.41,42 All reactions were performed in triplicate and the reaction efficiencies of the primer/probe sets were close to 100%. Western blot analysis. The powdered skeletal muscle tissue (n=12 animals per time point and genotype) was resuspended in RIPA lysis buffer with protease inhibitors (Complete, Roche) and the homogenate were centrifuged at 10.000 g for 10 min at 4°C. The supernatants were collected and the protein concentration was quantified by BCA method (Sigma-Aldrich). Forty micrograms of protein was resolved on a 15% SDS-page gel and the proteins were transferred RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 109 to PVDF membranes (Amersham Biosciences). The membranes were blocked in Tris-buffered saline supplemented with 0.1% Tween 20 and 5% (w/v) powered skim milk overnight at 4ºC and then incubated with primary antibodies for one hour against LC3 (1:1000, MBL), p62/SQSTM1 (1:1000, Enzo Life Sciences), Caspase-3 (1:500, Cell Signalling), Bax (1:1000, Santa Cruz), Bcl2 (1:1000, Santa Cruz) and GAPDH (1:1000, Santa Cruz). After incubation with HRP-conjugated secondary antibodies, bands were visualized by ECL (GE Healthcare Life Science). Inmunoblots were scanned and densitometry was measured with AlphaEase FC software (Bonsai). Proteasome activity. Skeletal muscle tissue was homogenized in cold buffer (20 mM TrisHCl pH 7.5, 2 mM EDTA) and centrifuged at 15000 g for 10 min at 4ºC (n=6 animals per time point and genotype). Protein concentration in supernatants was determined using the BCA protein assay. All samples were assayed in triplicate using 10 µg of freshly protein extracts. Proteasome activity was measured using the CHEMICON® Proteasome Activity Assay Kit (APT280, Millipore) as described by the manufacturer. The extracts were incubated (2h at 37°C) with a labeled substrate, LLVY-7-amino-4-methylcoumarin, and the cleavage activity was monitored by detection of the free fluorophore 7-amino-4-methylcoumarin using a fluorescence plate reader (Infinite F200 PRO, TECAN) at 360/460 nm. In vitro assay. Skeletal muscle tissue (P120, n=6 animals per time point and genotype) were dissected and the tissue was then chopped into small pieces. The explants were rinsed in phosphate-buffered saline (PBS) prior to being cultured in DMEM containing 10 % (v/v) fetal bovine serum and 100 M chloroquine (Sigma) for 6 hours at 37ºC and 5% CO2. After culture, the explants were washed twice with PBS, snap-frozen and preserved at -80ºC. Apoptotic detection. Skeletal muscle tissue was removed, fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 24 hours and cryopreserved in 30% sucrose for 48 hours. Sample tissues were embedded in Tissue-Tek frozen tissue embedding medium and frozen in liquid nitrogen-cooled 2-methylbutane. The tissue blocks were stored at -80ºC. Transverse sections (10 µm) were cut with using a cryostat (CM1510S Leica Microsystems). Detection of apoptotic nuclei was assessed by 110 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN TUNEL assay (Terminal deoxynucleotidyl transferase fluorescein-dUTP nick endlabelling) using the In situ Cell Death Detection kit (Roche). The positive controls were carried out on serial sections after prior incubation with DNAse I, while negative control used label solution instead of TUNEL reaction mixture. At the end of the assay, the slides were mounted with Vectashield with DAPI (Vector laboratories). The percentage of apoptotic cells was determined by counting TUNEL-positive cells on an Olympus IX81 microscope. Statistical analysis. Statistical analyses were carried out using T-Student test. All of the values were expressed as means and error bars represent standard error of the mean (SEM). The statistical significance threshold was set at p<0.05. The software used for the statistical analysis was SPSS 19.0 (IBM). CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest. ACKNOWLEDGEMENTS The authors would like to thank Miriam de la Torre, Silvia Garcés and Pilar Lierta for their expert technical assistance. They also thank Dr. Patricia Boya and Dr. Victor Sorribas for their helpful assistance. This work was supported by Grants PI10/0178 from Fondo de Investigación Sanitaria of Spain and INNPACTO IPT2011-1091-900000 Ministerio de Ciencia e Innovación. AUTHOR CONTRIBUTIONS RO supervised all experiments. SO and ACC wrote the manuscript. SO and SG performed the experiments. PZ and MJM provided helpful discussions and helped in the revision of the manuscript. RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 111 REFERENCES 1. Nassif M, Hetz C. Targeting autophagy in ALS. Autophagy 2011; 7: 450-453. 2. Morimoto N, Nagai M, Ohta Y, Miyazaki K, Kurata T, Morimoto M, et al. Increased autophagy in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene. Brain Res. 2007; 1167: 112-117. 3. Tian F, Morimoto N, Liu W, Ohta Y, Deguchi K, Miyazaki K, et al. In vivo optical imaging of motor neuron autophagy in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Autophagy 2011; 7: 985-992. 4. Li L, Zhang X, Le W. Altered macroautophagy in the spinal cord of SOD1 mutant mice. Autophagy 2008; 4: 290-293. 5. Kabuta T, Suzuki Y, Wada K. Degradation of Amyotrophic Lateral Sclerosislinked Mutant Cu,Zn-Superoxide Dismutase Proteins by Macroautophagy and the Proteasome. J. Biol. Chem. 2006; 281: 30524–30533. 6. Winslow AR, Rubinsztein DC. Autophagy in neurodegeneration and development. Biochim. Biophys. Acta 2008; 1782: 723-729. 7. Hetz C, Thielen P, Matus S, Nassif M, Court F, Kiffin R, et al. XBP-1 deficiency in the nervous system protects against amyotrophic lateral sclerosis by increasing autophagy. Genes Dev. 2009; 23: 2294–2306. 8. Madeo F, Eisenberg T, Kroemer G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 2009; 23: 2253-2259. 9. Onesto E, Rusmini P, Crippa V, Ferri N, Zito A, Galbiati M, et al. Muscle cells and motoneurons differentially remove mutant SOD1 causing familial amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem. 2011; 118: 266-280. 10. Mori A, Yamashita S, Uchino K, Suga T, Ikeda T, Takamatsu K, et al. Derlin-1 overexpression ameliorates mutant SOD1-induced endoplasmic reticulum stress by reducing mutant SOD1 accumulation. Neurochem. Internat. 2011; 58: 344-353. 11. Ferrucci M, Fulceri F, Toti L, Soldani P, Siciliano G, Paparelli A, et al. Protein clearing pathways in ALS. Arch. Ital. Biol. 2011; 149: 121-149. 12. Otomo A, Pan L, Hadano S. Dysregulation of the AutophagyEndolysosomal System in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Related Motor Neuron Diseases. Neurol. Res. Int. 2012; 2012: 498428, doi:10.1155/2012/498428. 13. Dasuri K, Zhang L, Keller JN. Oxidative stress, neurodegeneration, and the balance of protein degradation and protein synthesis. Free Rad. Biol. Med. 2013; 62: 170-185. 14. Sau D, De Biasi S, Vitellaro-Zuccarello L, Riso P, Guarnieri S, Porrini M, et al. Mutation of SOD1 Mutation of SOD1 in ALS: a gain of a loss of function. Human Mol. Genet. 2007; 16: 1604-1618. 15. Ding WX, Ni HM, Gao W, Yoshimori T, Stolz DB, Ron D, et al. Linking of autophagy to ubiquitin-proteasome system is important for the regulation of endoplasmic reticulum stress and cell viability. Am. J. Pathol. 2007; 171: 513–524. 16. Pandey UB, Nie Z, Batlevi Y, McCray BA, Ritson GP, Nedelsky NB, et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature 2007; 447: 859–863. 17. Kaganovich D, Kopito R, Frydman J. Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments. Nature 2008; 454: 1088–1095. 18. Kabashi E, Agar JN, Hong Y, Taylor DM, Minotti S, Figlewicz DA, et al. Proteasomes remain intact, but show early focal alteration in their 112 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN composition in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem. 2008; 105: 2353-2366. 19. Dobrowolny G, Aucello M, Rizzuto M, Beccafico S, Mammucari C, Bonconpagni S, et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93AMediated Toxicity. Cell Metabol. 2008; 8: 425-436. 20. Pansarasa O,Rossi D, Berardinelli A, Cereda C. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Skeletal Muscle: An Update. Mol. Neurobiol. 2014; 49: 984990. 21. Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. Methods in mammalian autophagy research. Cell 2010; 140: 313–326. 22. Wills J, Credle J, Oaks AW, Duka V, Lee JH, Jones J, et al. Paraquat, but not maneb, induces synucleinopathy and tauopathy in striata of mice through inhibition of proteasomal and autophagic pathways. PLoS One 2012; 7: e30745, doi: 10.1371/journal.pone.0030745. 23. Musaró A. State of the art and the dark side of amyotrophic lateral sclerosis. World J. Biol. Chem. 2010; 1: 62–68. 24. Douglass CP, Kandler RH, Shaw PJ. An evaluation of neurophysiological criteria used in the diagnosis of motor neuron disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2010; 81: 646–649. 25. Burgunder JM, Schöls L, Baets J, Andersen P, Gasser T, Szolnoki Z, et al. EFNS guidelines for the molecular diagnosis of neurogenetic disorders: motoneuron, peripheral nerve and muscle disorders. Eur. J. Neurol. 2011; 18: 207–217, doi: 10.1111/j.1468-1331.2010.03069.x. 26. Dobrowolny G, Aucello M, Rizzuto E, Beccafico S, Mammucari C, Bonconpagni S, et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93Amediated toxicity. Cell Metabolism 2008a; 8: 425-436. 27. Crippa V, Carra S, Rusmini P, Sau D, Bolzoni E, Bendotti C, et al. A role of small heat shock protein B8 (HspB8) in the autophagic removal of misfolded proteins responsible for neurodegenerative diseases. Autophagy 2010; 6: 958-960. 28. Crippa V, Boncoraglio A, Galbiati M, Aggarwal T, Rusmini P, Giorgetti E, et al. Differential autophagy power in the spinal cord and muscle of transgenic ALS mice. Frontiers in Cell Neurosci. 2013; 7: 1-12, doi: 10.3389/fncel.2013.00234. 29. Grumati P, Bonaldo P. Autophagy in Skeletal Muscle Homeostasis and in Muscular Dystrophies. Cells 2012; 1: 325-345, doi:10.3390/cells1030325. 30. Garcia-Garcia A, Rodriguez-Rocha H, Tseng MT, Montes de Oca-Luna R, Zhou HS, McMasters KM, et al. E2F-1 lacking the transcriptional activity domain induces autophagy. Cancer Biol. Ther. 2012; 13: 1091-1101. 31. Polager S, Ofir S, Ginsberg D. E2F1 regulates autophagy and the transcription of autophagy genes. Oncogene 2008; 27: 4860–4864. 32. Araki W, Minegishi S, Motoki K, Kume H, Hohjoh H, Araki YM, et al. DiseaseAssociated Mutations of TDP-43 Promote Turnover of the Protein Through the Proteasomal Pathway. Mol. Neurobiol. 2014; Jan 30, doi.org/10.1007/s12035-014-8644-6. 33. Wei R, Bhattacharya A, Chintalaramulu N, Jernigan AL, Liu Y, Van Remmen H, et al. Protein misfolding, mitochondrial dysfunction and muscle loss are not directly dependent on soluble and aggregation state of mSOD1 protein in skeletal muscle of ALS. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012; 417: 1275-1279. RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 113 34. Dobrowolny G, Aucello M, Molinaro M, Musaró A. Local expression of mIgf1 modulates ubiquitin, caspase and CDK5expression in skeletal muscle of an ALS mouse model. Neurol. Res. 2008b; 30: 131–136, doi: 10.1179/174313208X281235. 35. Battistelli M, Salucci S, Burattini S, Falcieri E. Further considerations on in vitro skeletal muscle cell death. Muscles, Ligaments and Tendons Journal 2013; 3: 267-274. 36. Dobrowolny G, Aucello M, Musarò A. Muscle atrophy induced by SOD1G93A expression does not involve the activation of caspase in the absence of denervation. Skeletal Muscle 2013; 1: 3, doi: 10.1186/20445040-1-3. 37. Jang YC, Lustgarten MS, Liu Y, Muller FL, Bhattacharya A, Liang H, et al. Increased superoxide in vivo accelerates age associated muscle atrophy through mitochondrial dysfunction and neuromuscular junction degeneration. FASEB J. 2010; 24: 1376-1390. 38. Zhang X, Li L, Chen S, Yang D, Wang Y, Zhang X, et al. Rapamycin treatment augments motor neuron degeneration in SOD1G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Autophagy 2011; 7: 412-425. 39. Carra S, Crippa V, Rusmini P, Boncoraglio A, Minoia M, Giorgetti E, et al. Alteration of protein folding and degradation in motor neuron diseases: Implications and protective functions of small heat shock proteins. Progress in Neurobiol. 2012; 97: 83-100. 40. Oliván S, Calvo AC, Manzano R, Zaragoza P, Osta R. Sex Differences in Constitutive Autophagy. BioMed Res. Int. 2014; 2014: 652817. doi: 10.1155/2014/652817. 41. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002; 3: RESEARCH0034. 42. Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat. Protoc. 2008; 3:1101-1108. 114 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN FIGURE LEGENDS Figure 1 LC3, p62, Beclin1, Atg5 and E2f1 mRNA expression levels in skeletal muscle from SOD1G93A mice. The transcript levels of these autophagy markers were analyzed at P40, P60, P90, and P120. Relative expression values of these autophagy markers in SOD1G93A mice (black bars) were represented in relation to the levels of their age-matched wild type mice (WT, grey bars) at each studied stage. Each data point represented the mean ± SEM, balanced group n=10 animals per time-point and genotype. Asterisks denoted a student t-test p value <0.05 (∗), <0.01 (∗∗) and <0.001 (∗∗∗). RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 115 Figure 2 LC3-II, LC3-I and p62 protein expression in skeletal muscle. (a) Western blots for LC3-II, LC3-I and p62 protein levels in skeletal muscle from transgenic SOD1G93A mice (grey bars) and age-matched wild type mice (WT, black bars). GAPDH protein levels were used for the normalization of the protein levels of the selected autophagy markers. The representative blots for each stage of the disease are shown at the bottom. Data showed mean ± SEM, balanced group n=12 animals per time-point and genotype. p value <0.05 (∗) and <0.001 (∗∗∗). (b) Relative expression levels of LC3-II in muscles from SOD1G93A mice at the terminal stage, before (light grey bars) and after chloroquine treatment (dark grey bars, CQ 100µM). The representative blots for each stage of the disease are shown at the bottom; GAPDH protein levels were used for the normalization of the data. Data showed mean ± SEM, balanced group n=6 animals per time-point and genotype. p value <0.05 (∗). 116 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figure 3 Proteasome activity measurements. Proteasome activity was measured in skeletal muscle homogenates from SOD1G93A mice (grey bars) and from agematched wild type mice (WT, black bars) at each stage of the disease, P40, P60, P90 and P120. Data showed mean ± SEM, balanced group n=6 animals per timepoint and genotype. p value <0.05 (∗)and <0.001 (∗∗∗). Figure 4 Protein expression profile in apoptotic markers along disease progression. Western blots for Bax, Bcl-2 and procaspase-3 protein levels in skeletal muscle from SOD1G93A mice (grey bars) and age-matched wild type mice (WT, black bars). GAPDH protein levels were used for the normalization of the protein levels of the selected autophagy markers. The representative blots for each stage of the disease are shown at the bottom. Data showed mean ± SEM, balanced group n=12 animals per time-point and genotype. p value <0.05 (∗) and <0.001 (∗∗∗). RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 123 mate of different sex separately, the weight loss began to be significant around P96 (p<0.05) in males while in females, this loss was found at P117 (p<0.05). When survival time was analyzed, no statistical significant difference was observed between males and females (Fig. 1B). Transgenic males showed a mean life span of 135.6±1.6 days, while the mean in females was observed at 137.7±1.6 days. Rotarod test.Significant differences between control and transgenic mice was observed at P89 (p<0.05) and P96 (p<0.001) until the endpoint. In particular, some transgenic males showed early symptoms around P75, although from P82 these symptoms became more evident (Fig. 2). In contrast females showed early symptoms at P82 and started to decline around P96, although the performance was worse from P103, which was coincident with the maximum weight observed (p<0.05, p<0.001). During disease progression significant differences were not detected between transgenic males and females, and in both sexes, a similar progression was observed, showing transgenic male mice more motor deficits than transgenic female mice. Hanging-wire test. Motor symptoms appeared earlier in transgenic males (P68) than transgenic females (P82), although in both sexes a similar test evolution was observed (Fig. 3A). The decline began to be significant at P82 (p<0.05) and continued until the end (p<0.001) when control and transgenic mice, males and females, were compared. Significant differences between transgenic male and female mice were detected at P103, which was coincident with the maximum weight observed, P110 and P117 days of life, in which the most important and fast loss of weight was registered (p<0.01). Treadmill. When the speed was set at 11 cm/s on the treadmill, the first motor deficits were detected at P109 in transgenic males and P120 in transgenic females (Fig. 4A). However, significant motor function began to get worse at P116 (p<0.05) in males and P123 in females (p<0.05), becoming gradually aggravated (p>0.001). At 22 cm/s alterations in motor function were detected earlier at P104 in males and at P108 in females (Fig. 4B). Significant differences were detected at P111 in males and at P118 in females and form these points 124 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN significance increased (p<0.001). Finally, at 44 cm/s some animals had problems to reach the performance from the beginning, showing males more motor difficulties than females (Fig. 4C). Significant differences at P106 in males and P111 in females, comparing to wild-type, were visible (p<0.05) and motor dysfunction became more evident at P113 (p<0.001). At P74, transgenic mice (males and females) showed the first alteration in their motor behaviour. DISCUSSION The most objective and simple parameter to first characterize transgenic SOD1G93A mice is the body weight, which is also virtually observer independent. ALS, in fact, is accompanied by a significant weight loss in both human and mice. Studies of SOD1G93A mice confirmed that changes in body weight occurred as a sign of motor neuron death over the course of the disease. This is a rather unspecific characteristic and it can be due to many conditions such as dehydratation or malnutrition, developmental abnormalities [12], background strain [10] or orolingual motor deficits [13]. However, the age at which these changes occur differs substantially among published studies. Our results are coincident with the ones described by Azari, Hayworth or Smittkamp who reported stable body weight in transgenic mice from P55 to P125 to finally decrease during end-stage disease. Furthermore, reported differences in body weight between transgenic mice and control mice emerging from P98 to P126 have been also described [15-17]. Therefore these results suggested that weight loss was not an accurate measurement of disease onset or progression in this animal model of ALS. Differences between transgenic male and female mice have been described in several studies, not only about weight or survival, but also about onset and progression disease [18,8]. In case of survival rate, genetic background studies in this model described longer survival in transgenic females than in transgenic males [7,15,18], albeit females survived two more days than males in our study, no significant gender differences were detected [19,20]. Moreover we found that transgenic male mice exhibited more severe symptoms including earlier RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 125 onset and motor deficits than transgenic female mice in each behaviour test assessed. In rotarod, hanging wire test and treadmill, the male mice showed deficits before females, therefore the differences in disease progression between males and females are obvious. But only in the case of hanging wire test significant differences appeared between transgenic male and female mice, so our results are consistent with previous reports that transgenic females displayed motor symptom later than transgenic male mice with no evidence of higher survival rates. These discrepancies may be related to the copy number of the transgene, the mouse background, the experimental protocol (food supplies in final stage) or estrogens effects [18]. On view of these results, we recommend that gender should be taken into account in experimental design since the behavioural differences seem to contribute to variability. The most frequently used analysis of motor impairment in mice is the rotarod test which let us register how long the animals were able to run on a rotating cylinder [17]. The rotarod test is a complex task that requires good motor coordination and balance in addition to strength; a decline in motor strength is specific for ALS disease. Hence a decline in rotarod performance is a rather indirect measurement of the motor deficit. However, the lack of sensitivity of this test to detect motor deficits prior to the onset of clinical symptoms has been widely discussed and other tests have been also used to expand the time frame to detect early changes [4,9]. Although the first motor dysfunction evidence appeared in the pre-symptomatic phase (P75 in males and P82 in females), transgenic male mice showed this motor dysfunction 2 weeks later while transgenic female mice displayed it 3 weeks later since the deficits began to be significant. The performance progression observed for this test was similar to that described by Alves or Smiitkamp. The wide variety of results could be explained by differences in training days, protocols performance or genetic background of mice model. Overall, previous experiences in our group have demonstrated that animals must be training before, and the training should realize at least one week before starting the experiments in order to ensure proper test development if early symptoms want to be detected [21]. The hanging wire test requires only balance and grip strength [12] and there is no need for any significant training of the mice. The simplicity (a conventional cage lid), reliability and improved diagnostic accuracy of this test are a great 126 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN advantage. Our results are in agreement with Hayworth and Gonzalez-Lima, and Smittkampp which reported the first muscle limb weakness changes at P68 in transgenic females and P82 in transgenic males. Moreover we found that disease progression was better endured by transgenic female mice than transgenic male mice, which is in accordance to Choi, and this gender differences were significant during symptomatic stage (P103, P110 and P117). Therefore, we could be able to detect early motor performance deficits, suggesting this test as a good choice among the rest. Treadmill-based systems have been suggested as a better way to monitor gait dysfunction and disease progression in models of genetic neurological disorders [10] and as a training system to evaluate the benefit of physical activity in ALS [7,8]. As compared to the methods that do not use computerized acquisition and analysis (footprints), the computerized gait analysis systems are marketed as a more efficient, sensitive and reliable way to measure motor deficits [22]. This system can incorporate a video camera for capture of paw placement, so parameters like stride, swing or stance time are able to be analyzed [9]. Among the speeds we applied in this test, we found that the slow and medium speeds (11 and 22 cm/s) were unable to detect motor deficits before P100, and as a consequence it was possible that mice could offset the loss of hind limb muscle strength, unlike the results observed in the rotarod test. When we worked at 44 cm/s the deficits were detected before (around P74), which is in agreement with Guillot and Wooley. At this point, the treadmill was able to detect early symptoms as well as the rotarod or the hanging-wire test. We therefore suggest, an intermediate speed between 22 and 44 cm/s, that could be enough to detect early motor symptoms and therefore it could not cause excessive attrition, especially in the case of transgenic male mice. Moreover, this system is also able to change the conditions of the test (belt inclination for example), so new protocols of resistance and strength are possible; and the training is not required. In addition, these results are in accordance with the speed range used in the same animal model [23] and highlight the importance of using a particular speed value in treadmill, especially when further molecular and cellular studies are needed. However, comparing treadmill to rotarod test we found a best sensitivity in rotarod test as we could detect the first significant RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 127 motor deficit symptoms in transgenic mice at P90 in rotarod test while this detection was found since P106 in treadmill. CONCLUSIONS The results show gender differences in the motor impairment, so balanced groups must be taken into account in the experimental design in order to avoid any sex bias. The clinical phenotype in SOD1 transgenic mice is perfectly characterized by the conventional behavioural tests such as rotarod and hanging-wire, as shown by the data. Moreover, our results suggested that the use of treadmill can represent an alternative to rotarod or hanging-wire test when an appropriate speed is used. CONFLICT OF INTEREST The authors declare that they have no conflict of interest. AUTHOR CONTRIBUTIONS S.O., R.O., M.J.M. and P.Z. conceived and designed the experiments. S.O. and A.R. performed the experiments. S.O. and A.C.C. analysed the data. S.O. and A.C.C. wrote the paper. ACKNOWLEDGEMENTES The authors would like to acknowledge the use of Servicios Científico-Técnicos del CIBA (Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud-SAI Universidad de Zaragoza), especially to Miriam de la Torre, Silvia Garcés, Pilar Lierta, Susana Murillo and Eduardo Romanos for their expert technical assistance. FUNDING This work was supported by grants PI10/0178 from Fondo de Investigación Sanitaria of Spain, ALS Association nº 554406 and Ministerio de Ciencia e Innovación INNPACTO IPT-2011-1091-900000. 128 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN REFERENCES [1] Shibata N: Transgenic mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis with superoxide dismutase-1 mutation. Neuropathology 2001, 21:82–92. [2] Gurney ME, Pu H, Chiu AY, Dal Canto MC, Polchow CY, Alexander DD, Caliendo J, Hentati A, Kwon YW, Deng HX, et al: Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science 1994, 264:1772–5. [3] Yim MB, Kang JH, Yim HS, Kwak HS, Chock PB, Stadtman ER:A gain-of-function of an amyotrophic lateral sclerosis-associated Cu,Zn-superoxide dismutase mutant: An enhancement of free radical formation due to a decrease in Km for hydrogen peroxide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93:5709-14. [4] Azzouz M, Leclerc N, Gurney M, Warter JM, Poindron P, Borg J: Progressive motor neuron impairment in an animal model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve 1997, 20:45-51. [5] Brooks SP, Dunnett SB. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat Rev Neurosci 2009, 10:519-29. Review. [6] Ludolph AC, Bendotti C, Blaugrund E, Chio A, Greensmith L, Loeffler JP, Mead R, Niessen HG, Petri S, Pradat PF, et al: Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler 2010, 11:38-45. [7] Kirkinezos IG, Hernandez D, Bradley WG, Moraes CT: Regular exercise is beneficial to a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 2003, 53:804-7. [8] Veldink JH, Bär PR, Joosten EA, Otten M, Wokke JH, van den Berg LH: Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS. Neuromuscul Disord 2003, 13:737-43. [9] Mancuso R, Oliván S, Osta R, Navarro X: Evolution of gait abnormalities in SOD1 G93A transgenic mice. Brain Res 2011,1406:65-73. [10] Wooley CM, Sher RB, Kale A, Frankel WN, Cox GA, Seburn KL: Gait analysis detects early changes in transgenic SOD1 (G93A) mice. Muscle Nerve 2005, 32:43-50. [11] Azzouz M, Ralph GS, Storkebaum E, Walmsley LE, Mitrophanous KA, Kingsman SM, Carmeliet P, Mazarakis ND: VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature 2004,429:413-7. [12] Crawley JN: What’s wrong with my mouse?. Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. John Wiley & Sons, Inc., New York. 2000 [13] Smittkamp SE, Brown JW, Stanford JA: Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg (SOD1-G93A) 1Gur/J mice. Neuroscience 2008, 151:613-21 [14] Azari MF, Lopes EC, Stubna C, Turner BJ, Zang D, Nicola NA, Kurek JB, Cheema SS: Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res 2003, 982:92-7. [15] Alves CJ, de Santana LP, dos Santos AJ, de Oliveira GP, Duobles T, Scorisa JM, Martins RS, Maximino JR, Chadi G: Early motor and electrophysiological changes in transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis and gender differences on clinical outcome. Brain Res. 2011, 1394:90-104. RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 129 [16] Tankersley CG, Haenggeli C, Rothstein JD: Respiratory impairment in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Appl Physiol 2007, 102:926-32. [17] Weydt P, Hong SY, Kliot M, Möller T: Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport 2003, 14:1051-4. [18] Choi CI, Lee YD, Gwag BJ, Cho SI, Kim SS, Suh-Kim H: Effects of estrogen on lifespan and motor functions in female hSOD1 G93A transgenic mice. J Neurol Sci 2008, 268:40-7. [19] Hayworth CR, Gonzalez-Lima F: Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1 (G93A) ALS mouse model. Neuroscience 2009, 164:975-85. [20] Knippenberg S, Thau N, Dengler R, Petri S: Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res 2010, 213:82-7. [21] Miana-Mena FJ, Muñoz MJ, Yagüe G, Mendez M, Moreno M, Ciriza J, Zaragoza P, Osta R: Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 2005, 6:55-62. [22] Guillot TS, Asress SA, Richardson JR, Glass JD, Miller GW: Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. J Mot Behav 2008, 40:568-77. [23] Gerber YN, Sabourin JC, Hugnot JP, Perrin FE: Unlike physical exercise, modified environment increases the lifespan of SOD1G93A mice however both conditions induce cellular changes. PLoS One 2012, 7(9). 130 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN FIGURE LEGENDS FIG 1 Body weight and survival time. (A) Changes over time in weight of male (black) and female (grey) wild type and transgenic mice (WT males n=10, WT females n=10, transgenic females n=43 and transgenic males n=43). Data are shown as mean ± SEM. (B) Kaplan-Meier survival comparison of the male and female transgenic mice. No significant differences were detected between transgenic male and female mice. RESULTADOS Y DISCUSIÓN | 131 FIG 2 Rotarod test. Changes over time in rotarod test performance of male (black) and female (grey) wild type and transgenic mice (WT males n=10, WT females n=10, transgenic females n=15 and transgenic males n=15). Data are shown as mean ± SEM. Student’s t-test: *p<0.05 and ***p<0.001 (male mice), †p<0.05 and †††p<0.001 (female mice). FIG 3 Hanging-wire test. Changes over time in hanging-wire test of male (black) and female (grey) wild type and transgenic mice (WT males n=10, WT females n=10, transgenic females n=15 and transgenic males n=15). Data are shown as mean ± SEM. Student’s t-test: *p<0.05 and ***p<0.001 (male mice), †p<0.05 and †††p<0.001 (female mice). 132 | RESULTADOS Y DISCUSIÓN FIG 4 Treadmill performance of transgenic and wild type mice. The shock time (s) was registered at 3 speeds (11, 22 and 44 cm/s) from P45 to P137 (WT males n=10, WT females n=10, transgenic females n=10 and transgenic males n=10). Data are shown as mean ± SEM. (A) Results at 11 cm/s. (B) Results at 22 cm/s. (C) Results at 44 cm/s. Student’s t-test: *p<0.05 and ***p<0.001 (male mice), †p<0.05 and †††p<0.001 (female mice).