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2014 87 Eduardo José Lezcano Callén Modificación de las rutas metabólicas de las lipoproteínas de alta densidad en fases precoces del daño endotelial en obesidad y diabetes: estudio en modelo experimental animal Departamento Director/es Medicina, Psiquiatría y Dermatología Íñigo Gil, Pablo Javier Osada García, Jesús de la Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Eduardo José Lezcano Callén MODIFICACIÓN DE LAS RUTAS METABÓLICAS DE LAS LIPOPROTEÍNAS DE ALTA DENSIDAD EN FASES PRECOCES DEL DAÑO ENDOTELIAL EN OBESIDAD Y DIABETES: ESTUDIO EN MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL Director/es Medicina, Psiquiatría y Dermatología Íñigo Gil, Pablo Javier Osada García, Jesús de la Tesis Doctoral Autor 2013 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA 1 Universidad de Zaragoza Departamento de Medicina, Psiquiatría y Dermatología MODIFICACIÓN DE LAS RUTAS METABÓLICAS DE LAS LIPOPROTEÍNAS DE ALTA DENSIDAD EN FASES PRECOCES DEL DAÑO ENDOTELIAL EN OBESIDAD Y DIABETES. ESTUDIO EN MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL Memoria para optar al grado de Doctor en Medicina presentada por: Eduardo José Lezcano Callén El interesado Visto bueno de los directores de Tesis: Dr. Pablo Iñigo Gil Dr. Jesús Osada García Especialista Nefrología Profesor Titular. Facultad de Medicina Servicio de Nefrología. Hospital Clinico Universitario "Lozano Blesa" Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Facultad de Veterinaria, Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón CIBEROBN Zaragoza, mayo 2012 2 AGRADECIMIENTOS A mis padres por educarme en la perseverancia, la tenacidad y el esfuerzo diario. A mi hermano por consentirme las horas que le ha robado esta tesis y resignarse a entenderme A mis primas por soportar mis ausencias reiteradas A mis amigos por darme ánimos en los momentos más necesarios A Pablo y a Jesús por haberme dado la oportunidad de participar en esta parte del proyecto experimental. A Ana por su dedicación y el enorme trabajo que ha realizado. 3 TÍTULO AGRADECIMIENTOS I. ÍNDICE (p.3) II. INTRODUCCIÓN (p.5) A. Definición. Diabetes Mellitus (DM) y Obesidad (p.6) B. Epidemiología. I. Prevalencia de DM y Obesidad (p.8) II. Morbimortalidad asociada a DM y Obesidad (p. 12) C. Patogenia I I. Metabolismo de las Lipoproteínas (p.15) II. Arteriosclerosis y metabolismo de las lipoproteínas (p.26) III. DM, Obesidad y metabolismo de las lipoproteínas. Concepto de Dislipemia Aterógena (p.32) D. Patogenia II I. Lipoproteínas de alta densidad (HDL). Estructura y función. Protección vascular por HDL (p.38) II. Dislipemia aterógena y HDL. Modificación proaterogénica de las HDL (p.45) III. Microalbuminuria (MAU) como signo precoz de daño endotelial (p.50) E. Enfoque general del tratamiento de la dislipemia en la DM y Obesidad. HDL como diana terapéutica. I. Manejo farmacológico y no farmacológico de la dislipemia en DM y Obesidad (p.51) II. Las HDL como objetivo terapéutico. Aproximación desde la medicina traslacional al tratamiento de la dislipemia aterógena (p.55) 1. PPAR 2. PPAR y Telmisartán. Más allá de la HTA: nefroprotección y modulación del metabolismo lipídico. III. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS (p.61) IV. MATERIAL Y MÉTODOS (p.67) A. El proyecto. Ámbito de trabajo (p.69) B. Animales (p.69) C. La dieta (p.73) D. Dosificación de fármacos antiproteinúricos (Telmisartán) (p.74) E. Parámetros séricos y de función renal (p.74) 4 F. Lípidos y lipoproteínas (p.76) I. Determinación de colesterol total en plasma (p.76) II. Determinación de colesterol HDL en plasma (p.76) 1. Determinación colorimétrica de colesterol HDL 2. Determinación fluorimétrica de colesterol HDL III. Determinación de triglicéridos en plasma (p.77) IV. Separación de lipoproteínas por cromatografía líquida de gel filtración 1. Análisis del perfil lipoproteico G. Determinación de APO A-I Y APO A-IV (p.79) I. Determinación de la concentración plasmática de apolipoproteínas mediante técnica immunoenzimática (ELISA) (p.79) II. Aislamiento de RNA (p 80) III. Cuantificación de RNAm por RT-qPCR (p.81) H. Ensayos de oxidación de lipoproteínas (DCF) (p.82) I. Análisis estadístico (p.83) V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN (p.85) VI. CONCLUSIONES (p.129) VII. BIBLIOGRAFÍA (p.133) 5 INTRODUCCIÓN 6 13 La obesidad, la diabetes y la patología cardiovascular no sólo se circunscriben a nuestro medio, sino que se trata de un tema de gran preocupación en todo el mundo. Entre 1990 y el 2020, la mortalidad por enfermedades cardiovasculares en los países en desarrollo se espera que aumente un 120% en mujeres y un 137% en hombres, un incremento sustancialmente mayor que para los países desarrollados (29 y 48% respectivamente), siendo por ejemplo cercana a los 2 millones de personas en la India en el año 2010 17,18 . B. EPIDEMIOLOGÍA. II. MORBIMORTALIDAD ASOCIADA A DM Y OBESIDAD Diabetes. En un gran número de países alrededor del mundo, y principalmente en los económicamente más desarrollados, la diabetes es una de las principales causas de ceguera, insuficiencia renal, y amputación de miembros. También es conocida por ser una de las causas principales de mortalidad, fundamentalmente debido a un marcado aumento del riesgo de enfermedad coronaria e ictus. Así, los costes económicos de la diabetes son muy elevados; incluyendo los derivados de la atención sanitaria, y los gastos sociales derivados de la pérdida de productividad y los asociados a la pérdida de oportunidades para el desarrollo económico 7 . Los mecanismos por los que la diabetes provoca complicaciones tan variadas es complejo y no del todo aclarado pero incluyen efectos directos tóxicos de la hiperglucemia, e indirectos por efecto de niveles anormales de lípidos y alteraciones funcionales y estructurales de los pequeños vasos sanguíneos. Las principales complicaciones crónicas de la diabetes son: la enfermedad cardiovascular, la nefropatía, la neuropatía, la amputación de miembros, y la retinopatía. De forma breve 19 : − Enfermedad cardiovascular. Es la mayor causa de muerte en pacientes diabéticos, contribuyendo en la mayoría de poblaciones a más del 50% de la comorbilidad asociada a la diabetes. Engloba la enfermedad coronaria en sus varias manifestaciones clínicas, el accidente vascular cerebral, la enfermedad vascular periférica, y la insuficiencia cardiaca. La Diabetes puede incrementar el riesgo de enfermedad coronaria y accidente cerebral hasta en cinco veces 20,21 . − Nefropatía. La diabetes es una importante causa del aumento de fallo renal, y realmente se ha convertido en la causa aislada más común de enfermedad renal crónica terminal 22 . 14 − Neuropatía. El área más frecuentemente afectada por el exceso de glucosa en sangre, son los nervios periféricos de miembros inferiores, provocando una neuropatía periférica que cursa con disestesias/hipoestesia y que puede llevar a infecciones graves y amputaciones por heridas que pasan inadvertidas en un primer momento. Además, alteraciones digestivas, urinarias e impotencia son otras posibles manifestaciones 23 . − Amputación. A través de su acción sobre nervios periféricos y arterias, la diabetes puede llevar a la ulceración en zonas acras, principalmente los pies, con el riesgo consiguiente de infecciones graves y necesidad de amputación. El riego de un paciente diabético de sufrir una amputación es 25 veces mayor que el de alguien no diabético 24 . − Retinopatía. La diabetes es una importante causa de ceguera a través de varios mecanismos. La complicación más frecuente es la retinopatía proliferativa, que provoca disminución de la agudeza visual y puede llevar a la ceguera por hemorragias retinianas repetidas, aunque la causa más común de ceguera total, es el edema macular 25 . Morbilidad y mortalidad. Como se ha mencionado, la diabetes es una de las principales causas de enfermedad prematura y muerte en muchos países. Por ejemplo, de las 284000 muertes en 2007 atribuidas a la DM y a sus complicaciones en US, cerca del 65% eran debidas a eventos cardio o cerebrovasculares 26 . Figura 3. Rangos de prevalencia (%) de enfermos diabéticos con complicaciones, en diferentes estudios realizados en varias regiones del mundo. Adaptado de IDF Atlas, 3th editon, 2006. 15 A nivel global, se estimaba que cerca de 4 millones de muertes de personas en el grupo de 20 a 79 años, podrían ser atribuidas a la diabetes en el año 2010 (un 5.5% mayor que las previsiones para el año 2007), siendo un 6.8% de las causas de mortalidad global para ese grupo de edad, con una mayor proporción de mujeres respecto a hombres. Aunque se ha documentado una mejoría de la supervivencia de diabéticos en ciertos países desarrollados, el aumento de la prevalencia es fundamentalmente a expensas de un incremento en la incidencia de la enfermedad 27 . Impacto económico. La diabetes supone una gran carga económica para los sistemas nacionales de salud. Los gastos sanitarios se estimaron en alrededor del 11.6% del total del gasto sanitario global para el año 2010. Alrededor del 80% de los países estudiados por la IDF se prevé que gasten entre el 5% y el 13% del total de su gasto general en diabetes (por ejemplo, los gastos derivados de la atención sanitaria a la diabetes y sus complicaciones en USA, se estimaron en 376 millones de dólares en el año 2010). Además de en gasto sanitario directo, una de las grandes cargas económicas la asociada con la discapacidad y la merma en esperanza de vida como resultado de la propia enfermedad y sus complicaciones, así como pérdida de productividad y de crecimiento económico. En un estudio reciente (Straka y colaboradores) en el que se compararon casi 30000 enfermos hospitalizados por evento cardiovascular (cirugía coronaria, infarto de miocardio, angina, insuficiencia cardiaca, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica ), los pacientes diabéticos generaban mayores costes en su atención durante el seguimiento a tres años, que los que no lo eran (en el primer año 8805 $, en el segundo 13860$, y en el tercero 16149$, frente a los 6982$, 10056$, 12163$, respectivamente) 28 . Obesidad. Es un trastorno para la salud alrededor del cual se originan y progresan diversas comorbilidades que influyen negativamente en el propio individuo así como en la sociedad ala que pertenece. El número de muertos por año atribuibles a la obesidad está cerca de 30.000 en el Reino Unido, siendo unas diez veces mayor en EEUU, donde la obesidad ha desplazado al tabaquismo como la principal causa prevenible de enfermedad 29,30 . Entre otras, la obesidad tiene un importante impacto en la esperanza de vida, la DM2 y todas las enfermedades cardiovasculares. En el Swedish National Diabetes Register, con más de 13000 personas y seguimiento a 6 años, el riesgo relativo de enfermedad coronaria, ictus y mortalidad para un IMC basal incrementado en cinco unidades, era del 14%, 11% y 27% respectivamente tras ajustar por edad, sexo, tabaquismo y tratamiento hipolipemiante. Era del 9%, 7%, y 20% 16 respectivamente, ajustado por hemoglobina glicosilada (HbA1c), presión sanguínea, medicación hipolipemiante y microalbuminuria 31 . En una revisión sistemática, Guh y colaboradores observaron que existía asociación significativa entre la obesidad y la incidencia de diabetes tipo 2, hipertensión arterial, todas las enfermedades cardiovasculares, asma y algunos tipos de cáncer (mama, endometrio, colorrectal, riñón) 32 La obesidad ha demostrado que disminuye la esperanza de vida hasta en 7 años a la edad de 40. El incremento en el riesgo de muerte con cada unidad de aumento del IMC disminuye progresivamente con la edad pero persiste significativo hasta el grupo de edad mayor de 75 33 . Por ejemplo el gobierno de UK estimaba en 2005 que un IMC de 25 Kg/m 2 disminuía la esperanza de vida en 2 años, y que dada la epidemia de obesidad, el efecto aumentaría hasta los 5 años en el 2050. La evidencia de la que se dispone sugiere que se puede prolongar la esperanza de vida mediante la reducción de peso en individuos obesos 34 . El riesgo de HTA es hasta cinco veces mayor entre las personas obesas que en aquellas con peso normal. Los estudios poblacionales sugieren que más del 85% de la HTA aparece en individuos con IMC > 25 Kg/m 2 , tanto por los efectos metabólicos de la grasa como por el tipo de dieta que les lleva a ese incremento del peso 35 . Resultados del Asia-Pacific Cohort Collaboration Study, con más de 300.000 adultos seguidos al menos 7 años, mostraban que por cada unidad de incremento en el IMC, existía un 9% de diferencia en los eventos por cardiopatía isquémica y del 8% en accidentes isquémicos cerebrales 36 . También, otros estudios como el metaanálisis de McGee y colaboradores indica que la obesidad es un factor de riesgo significativo para el desarrollo de enfermedad cardiovascular y de mortalidad. El análisis de este estudio mostró que la obesidad (IMC>30) estaba asociada a un riesgo relativo de mortalidad global de 1,22; de muerte por enfermedad coronaria de 1,57; y otras enfermedades cardiovasculares de 1,48. Esto es en parte debido a su asociación con factores de riesgo tradicionales de enfermedad cardiovascular como la hipertensión, la dislipemia (en particular los bajos niveles de HDL y la hipertrigliceridemia), y la resistencia a la insulina/tolerancia anormal a la glucosa 37 . C. PATOGENIA I I. METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEÍNAS. Metabolismo de las Lipoproteínas. El transporte de los lípidos en sangre -excepto el de los ácidos grasos no esterificados, que se unen a la albúminase hace mediante complejos 17 moleculares denominados lipoproteínas. Los lípidos se unen a ciertas proteínas (apolipoproteínas) que facilitan la estabilidad en un medio acuoso como es el plasma. Éstas adoptan una forma subesférica de manera que pueden albergar en su interior los lípidos más apolares - triglicéridos y ésteres de colesteroly en su superficie los que no lo son tanto como fosfolípidos y colesterol libre. No son moléculas de composición y estructura fijas. Son poblaciones de microemulsiones, formadas por partículas con una gran composición porcentual de lípidos y proteínas, de diferente tamaño, densidad y carga. Esta variabilidad en la composición y estructura se debe a su metabolismo, un proceso continuo por el que estas partículas experimentan diferentes grados de exposición a la acción de diversas enzimas, así como al intercambio de componentes lipídicos y proteicos con otras lipoproteínas y con células durante distintos periodos 38 . Mediante técnicas como la ultracentrifugación podemos separar las diferentes clases de lipoproteínas del plasma según su peso específico: − los quilomicrones, cuya principal apolipoproteína es la Apo B48. − las lipoproteínas de muy baja y baja densidad, cuya proteína principal es la Apo B100: very low density lipoproteins (VLDL), intermediate density lipoproteins (IDL), low density lipoproteins (LDL) y lipoproteína a (Lpa). − las de alta densidad, high density lipoproteins (HDL), y sus subfracciones las HDL 2 y HDL 3 , que son el grupo de lipoproteínas que no contienen Apo B sino Apo A, con un metabolismo muy complejo y en cierto modo, opuesto al de los grupos anteriores. La principal función de las lipoproteínas es pues la del transporte de lípidos, y esto tiene lugar a través de varias rutas metabólicas, íntimamente relacionadas, pero en sentidos, si no opuestos, diferentes, en función del origen y los diferentes destinos: − La vía exógena: desde el intestino hacia los tejidos, que consumen ácidos grasos como fuente de energía, que los almacenan en forma de triglicéridos, o hacia el hígado. − La vía endógena, desde el hígado (el colesterol que llega de la dieta o bien de síntesis propia) hacia los tejidos que lo consumen o almacenan. − El transporte reverso, desde los tejidos ricos en colesterol hacia los que los que lo demandan para su metabolismo, o hacia el hígado para su eliminación. En cada una de las rutas interviene principalmente una familia de lipoproteínas 39 : La vía exógena. Se basa en la maduración de quilomicrones, que se van transformando desde quilomicrón naciente, a maduro y a residual, mediante le intercambio de Apo C y E con las HDL 18 y a la acción de la lipoprotein lipasa (LPL), sobre parte de sus triglicéridos. El quilomicrón residual, es retirado de la circulación por la interacción de apo E con receptores hepáticos específicos. La vía endógena. También denominada cascada lipolítica, se basa en la transformación de las VLDL en IDL, y estas en LDL, también, por la acción sucesiva de la LPL y el intercambio de apoproteínas con las HDL. Las LDL por medio de receptores celulares para apo B 100 son internalizadas y degradadas, liberando colesterol en el espacio intracelular. Cuando esta interacción es defectuosa, la LDL se acumula en el espacio extracelular, padeciendo modificaciones como la oxidación, siendo eliminadas por la vía del receptor denominado basurero (scavenger). Transporte reverso. Es la última parte del metabolismo lipoproteico (si bien no es un proceso biológico lineal), que dirige el flujo de colesterol desde células donde abunda éste hacia células con menor contenido, o bien hacia el hígado para su reciclaje o eliminación por la bilis. A modo de resumen, sin entrar en profundidad, se describen brevemente las diferentes etapas del metabolismo lipoproteico: I. Absorción de lípidos de la dieta. Los lípidos complejos, esto es, los que contienen ácidos grasos esterificados en su estructura, deben ser hidrolizados para poder ser absorbidos posteriormente. De forma general, son dos los procesos fundamentales, la emulsión y la digestión, principalmente mediados por la secreción biliar y pancreática. El resultado es la formación de pequeñas vesículas y micelas, estables en el medio acuoso, por la disposición de sales biliares en el borde externo, albergando en su interior fosfolípidos y ácidos grasos libres 40 . Las micelas atraviesan la capa de agua que recubre las microvellosidades de la mucosa intestinal y entran en contacto con la membrana apical de los enterocitos, permitiendo la absorción de los lípidos. Esta absorción es un proceso, que para los ácidos grasos libres y los monoglicéridos no implica gasto energético (principalmente lo hacen por difusión), y que en el caso de los esteroles de la dieta es más complejo. Existe un transporte micelar mediante el cual los esteroles de la dieta (colesterol, fitoesteroles y otros) alcanzan los lisosomas por vía endocítica; después: - Los fitoesteroles salen a la luz intestinal por la acción de transportadores de la familia de las ABC (ATP-binding-cassette), ABCG5-ABCG8. - Mientras, el colesterol es dirigido al retículo endoplasmático para su metabolización. Es esterificado con un ácido graso, principalmente ácido oleico por la acción de la 19 acilcoenzima A-colesterol aciltransferasa (ACAT), para luego depositarse en el citoplasma o bien incorporarse a las lipoproteínas para su exportación a la sangre 41 . II. Metabolismo de los quilomicrones. Una vez en el citoplasma del enterocito, los lípidos de la dieta, junto con apolipoproteínas específicas, son ensamblados para formar quilomicrones, que serán secretados a los vasos linfáticos para su transporte a otros tejidos. Se sintetizan principalmente durante el periodo absortivo, regulado por la composición de la ingesta y la disponibilidad de lípidos. Los quilomicrones son el medio de transporte de los ácidos grasos, el colesterol dietético y ciertas vitaminas liposolubles, desde el intestino hacia el hígado y el resto de tejidos. Los triglicéridos suponen el 85% de su masa, y aparte de otro lípidos y apolipoproteínas (que en el caso de la apo E, la adquieren una vez se encuentran en la linfa o en el plasma, por transferencia de otras lipoproteínas), la apo B 48 , es el componente proteico esencial. El proceso comienza con la síntesis de la apolipoproteína (apo) B 48 . A medida que se transcribe el ARNm, en la misma luz del retículo endoplásmico, se van asociando los lípidos complejos, transferidos por la proteína microsomal transferidora de triglicéridos (MTP), que transfiere principalmente triglicéridos, pero también fosfolípidos y ésteres de colesterol. El complejo entre la apo B 48 y los lípidos va adoptando la conformación de una partícula lipoproteica, aunque pequeña y relativamente pobre en triglicéridos, que debe fusionarse con otro complejo rico en triglicéridos pero carente de apo B 48 para formar un quilomicrón. Desde allí, a través del aparato de Golgi, son exocitadas a través de vesículas, por la membrana basolateral hacia la linfa mesentérica. Llegan a la sangre a través de conducto torácico, y allí adquieren apo C y E de las HDL. La presencia de apo C-II en este momento permite a los quilomicrones ser substrato para la lipoproteinlipasa (LPL), que hidroliza sus triglicéridos, facilitando la provisión de ácidos grasos a los tejidos subyacentes. Los ataques lipolíticos sucesivos de la LPL, y la cesión de colesterol y fosfolípidos a las HDL, genera partículas cada vez más pequeñas y pobres en triglicéridos, hasta el quilomicrón residual o remanente. La presencia de apo E permite que sean reconocidos por receptores hepáticos como el receptor de lipoproteínas de baja densidad (r-LDL) y el receptor relacionado con el r-LDL (LRP), que median su captación y su eliminación final del plasma 43 . 20 Figura 4. Metabolismo de los quilomicrones, VLDL, IDL y LDL. Adaptado de Rader, J Clin Invest. 2003 III. Metabolismo de las lipoproteínas de muy baja y baja densidad. Las VLDL. La función de las VLDL es la del transporte de los triglicéridos de síntesis endógena a los tejidos periféricos. Son partículas sintetizadas en los hepatocitos en un proceso análogo a los quilomicrones, aunque su proteína constitutiva fundamental es la apo B 100 . La síntesis se regula en función de la cantidad de ácidos grasos de la que disponga el hígado, suma de la propia síntesis, los procedentes del tejido adiposo y los cedidos por los quilomicrones. Un vez secretadas al plasma, adquieren apo C-II y E de las HDL, convirtiéndose en sustrato para la LPL, hidrolizando sus triglicéridos y dejando los ácidos grasos en disposición de ser captados por las células de los tejidos subyacentes. A la vez que la lipólisis, las VLDL intercambian triglicéridos por ésteres de colesterol con las HDL, y con las VLDL más grandes y ricas en triglicéridos, mediante la proteína transferidora de ésteres de colesterol (CETP). De esta manera, una proporción de las VLDL se convierten en lipoproteínas de densidad intermedia (IDL). El resto, abandona la circulación como VLDL residuales hacia el hígado previa interacción con los receptores específicos r-LDL y LRP, gracias a la presencia de apo E 42 . 21 Las IDL. Son las lipoproteínas intermedias en la cascada de la lipólisis. Conservan la apo B 100 , que identifica su procedencia, y por la acción de la lipasa hepática endotelial acaban dando origen a las LDL. Las LDL. Son el resultado del catabolismo de las VLDL e IDL. En condiciones normales, menos de la mitad de las VLDL se convertirán en LDL. Éstas constituyen una reserva circulante de colesterol: cuando las células requieren abastecerse de colesterol, expresan el r-LDL en su membrana y captan estas proteínas para degradarlas. El hígado es el principal destino de las LDL, que utiliza el colesterol para excretarlo a la bilis, utilizarlo para la síntesis de ácidos biliares, o bien devolverlo a la circulación en forma de VLDL. La concentración de LDL en plasma viene determinada por la tasa de producción de VLDL, por un lado, y la tasa de eliminación de VLDL residuales, IDL y las mismas LDL, por otro. Cuando el hígado recibe un exceso de colesterol y ácidos grasos de la dieta, se inhibe la expresión de r-LDL hepático. Al tiempo, se estimula la secreción de VLDL, y consecuentemente la producción de LDL en plasma. Se produce un desequilibrio entre la tasa de entrada del colesterol en el plasma y la tasa de eliminación de las LDL, aumentando su concentración en el plasma. Este desequilibrio metabólico, propiciado por las ingesta rica en colesterol y ácidos grasos, es la causa principal de hipercolesterolemia moderada en seres humanos 43 . IV. Metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad. Profundizaremos un poco más en un capítulo más adelante. Existe una enorme heterogeneidad en la composición y la estructura de esta fracción lipoproteica, traduciéndose en un metabolismo muy complejo. La apo A-I es su componente proteico fundamental, de origen hepático e intestinal. Las HDL participan en lo que se denomina transporte reverso del colesterol (desde los tejidos periféricos hasta al hígado), aunque también desempeñan un papel importante en otros procesos fisiológicos (protección frente a lipoperoxidación lipídica, modulación de la función endotelial, etc.…). 22 Fig 5. Metabolismo de las HDL. Biosíntesis de las HDL. Adaptado de Rader, J Clin Invest 2006 En el espacio intersticial, las HDL recogen el colesterol libre de las células, bien mediante difusión del colesterol a favor de gradiente desde la membrana celular al medio (poco eficiente y no específico de las HDL), bien por interacción de la partícula o parte de ella con la superficie celular, activándose la translocación del colesterol intracelular a la membrana y posteriormente incorporándose a la HDL 44 . En este proceso hay que destacar el papel de dos proteínas: el receptor CLA-1/SR-BI, y una proteína de la familia de los transportadores de membrana ABC (ATP Binding-Cassette, con dominio de unión al ATP), la ABCA1, la función de la cual consiste en translocar el colesterol libre y los fosfolípidos desde la cara citoplasmática a la cara externa de la membrana, para ser donados a moléculas aceptoras, en un proceso que requiere el consumo de ATP 45 . La expresión de ABCA1 se estimula en respuesta al aumento en el contenido celular de colesterol con lo que se favorece la eliminación de éste, y su actividad es limitante en el transporte reverso de colesterol y en la propia generación de HDL. En el caso de los macrófagos, las HDL también pueden recoger el colesterol mediante un proceso denominado retroendocitosis, por el que la partícula lipoproteica es endocitada y posteriormente secretada portando colesterol. Además, estas células pueden excretar colesterol asociado a apo E de síntesis propia, originando un subtipo de HDL, las γLpE 46 . 29 cardiovascular, existiendo no sólo cuando las manifestaciones clínicas son evidentes, sino en estadíos tempranos preclínicos 61 . Se define como la falta de relajación vascular endotelio-dependiente a través del sistema NO/GMPc (óxido nítrico/monofosfato de guanosina cíclico), y es un marcador excelente de riesgo cardiovascular, ya que su estado es un índice integrado de factores proaterogénicos y ateroprotectores 62,63 . La edad, la hipertensión arterial, el tabaquismo, la hiperlglucemia y la hiperlipemia entre otros, pueden afectar a la funcionalidad del endotelio. La disfunción del endotelio desempeña un papel muy importante en todas las etapas de la arteriosclerosis. Además de marcar que existe una deficiente respuesta vasomotora, denota lo que se llama un ambiente de “activación endotelial”, caracterizado por estados proinflamatorios, proliferativos y procoagulantes. Durante periodos prolongados en la historia natural de la arteriosclerosis, la disfunción endotelial es reversible si se corrige, por ejemplo, la hiperlipemia, ya sea por medio de la dieta o bien farmacológicamente 64 . Arteriosclerosis y modificación de las LDL. Como se ha dicho es fundamental para el desarrollo de la placa de ateroma, que en las fases iniciales se acumulen LDL en la matriz subendotelial. Esta acumulación es mayor cuando existen concentraciones elevadas de LDL circulantes. Las LDL nativas son modificadas por oxidación, lipólisis, proteólisis, glicosilación, asociación con proteoglicanos o incorporación en immunocomplejos 65,66 . En contacto con las LDL modificadas, los monocitos las fagocitan y se activan, transformandose en macrófagos, que acumulan en su interior colesterol en elevadas concentraciones, y les proporciona el aspecto de células espumosas 67 . La endocitosis de LDL altamente oxidadas está mediada por un grupo de receptores que reconocen una gran variedad de ligandos (receptores basureros), cuya expresión está regulada por el PPARγ, y por citocinas como TNFα y el IFNγ. En este proceso el macrófago libera proteasas que contribuyen a la rotura de la lámina elástica externa, y elabora citocinas que contribuyen a la migración, desdiferenciación y proliferación de las células del músculo liso 68 . Así, pues las anomalías lipídicas se han reconocido como factores patogénicos clave en el desarrollo de aterosclerosis. Tanto estudios en animales de experimentación como análisis epidemiológicos y ensayos de intervención farmacológica han mostrado un incremento de lesiones arteriosclerosas ante concentraciones séricas de colesterol elevadas. Los puntos clave de la hipótesis lipídica son: − Las concentraciones elevadas de LDL y disminuidas de HDL son importantes factores de riesgo de aterosclerosis y sus consecuencias 69 . 30 − En las fases iniciales de la aterogénesis, el aumento de la permeabilidad endotelial favorece el transporte de las LDL hacia la íntima arterial, donde interaccionan con elementos de la matriz 70 . − La modificación oxidativa de las LDL es un prerrequisito para ser acumuladas en el interior de los macrófagos. Estas partículas causan daño endotelial y promueven cambios inflamatorios e inmunológicos 71 . − La modificación de las LDL puede ser evitada por la acción de lipoproteínas de alta densidad y proteínas asociadas a éstas como la paraoxonasa 1 (PON 1) 72 . Fig 9. Arteriosclerosis; etapas: desde la estría grasa (a) hasta la lesión vulnerable (c) y/o obstructiva (d). Adaptado de El primer cambio histopatológico en el proceso aterogénico se inicia con la acumulación local de lipoproteínas de baja densidad en el espacio subintimal donde por la asociación con componentes de la íntima. Estas interacciones van a incrementar el tiempo de estancia de estas partículas en la íntima y su sensibilidad a experimentar modificaciones, predominantemente oxidativas e hidrolíticas. Una vez las lipoproteínas apo B forman complejos con elementos de la íntima extracelular, se convierten en una partícula modificada, puesto que se encuentra limitada su capacidad de regresar al plasma. Cada uno de los componentes de las lipoproteínas puede ser degradado por enzimas que se encuentran en la íntima arterial 73 . Una vez que las LDL han formado complejos reversibles e irreversibles con los proteoglicanos arteriales de la íntima, y han sido expuestas a las reacciones de hidrólisis y oxidación, son internalizadas por los macrófagos derivados de los monocitos que han invadido la íntima y por las células del músculo liso que han migrado desde la media, lo que da lugar a 31 las características células espumosas, que reciben su nombre por el aspecto vacuolado que presentan 74 . Las vacuolas están llenas de lípidos, principalmente ésteres de colesterol, colesterol, triglicéridos y fosfolípidos 75 . Esta vacuolización de los macrófagos es un mecanismo de defensa (en su interior el colesterol se encuentra esterificado) para evitar la lisis celular por la entrada excesiva de LDL y colesterol libre. Sin embargo, esto es una solución temporal, puesto que si el macrófago sigue captando LDL modificada, saturará la capacidad de neutralizar colesterol libre. Los centros necróticos en los ateromas es producto de la lisis de las células espumosas que han saturado su capacidad de control sobre el colesterol libre. La necrosis celular que acontece posteriormente, con liberación de lípidos a partir de las células espumosas y enzimas lisosomales, modifica o daña más las células de la íntima y los componentes intersticiales e induce una segunda cascada de respuestas inflamatorias dentro de la íntima arterial. Por tanto una gran parte de la respuesta tisular responde a un proceso inflamatorio crónico iniciado por la sedimentación de las LDL. Las lipoproteínas apo B pueden incorporarse a macrófagos por dos vías: la fagocitosis de agregados formados en la íntima, y la endocitosis mediada por receptor. La internalización de las LDL nativas por esta vía, se realiza a través del receptor específico apo B/E y no lleva a la acumulación de colesterol porque puede disminuir la expresión de receptores, reducir la síntesis endógena de colesterol, y activar la esterificación del colesterol libre intracelular. Por el contrario, la LDL modificada, es únicamente reconocida por un receptor no específico cuya funcionalidad no se modifica por la entrada de colesterol a la célula. Esta familia de receptores son conocidos con el nombre de basureros (scavengers), y se caracterizan por su baja afinidad. El reconocimiento de la LDL por su receptor depende de la afinidad existente entre la carga negativa del dominio de unión del receptor celular para las LDL (r-LDL), con la carga positiva de los aminoácidos lisina y arginina presentes en la apoproteína (apo) B 100 , que es la principal proteína de la LDL. La modificación química de la LDL enmascara la carga positiva de los residuos lisina de la apo B, provocando la pérdida de afinidad entre receptor y LDL 76 . Al mismo tiempo, este incremento de la carga negativa de la LDL aumenta la afinidad de la LDL por el receptor scavenger (basurero). Se observó que la expresión del receptor scavenger no estaba regulada por el contenido intracelular del colesterol y, por lo tanto, permitía la acumulación incontrolada de ésteres de colesterol en el citoplasma del macrófago convirtiéndolo en célula espumosa 77 . Son diversas las modificaciones de la LDL que se pueden realizar in vitro, aunque difícilmente pueden darse en una situación fisiológica. Las modificaciones que tienen relevancia in vivo son: la oxidación (la más importante y estudiada de todas), la glicación no 32 enzimática, la desialización, la electronegatividad, la agregación, la formación de complejos con proteoglicanos, o algunos tipos de modificación inducidos por diversas enzimas lipolíticas. Las LDL oxidadas intervienen prácticamente en todas las etapas del proceso de formación de la lesión arterosclerótica. Como resumen, los efectos de la LDL oxidada pueden resumirse en los siguientes puntos 78 : • Formación de células espumosas. La modificación de los residuos de lisina de la apo B por productos de oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados, elimina la afinidad por el r-LDL. Este hecho, implica, a su vez, el reconocimiento de la LDL oxidada por el receptor scavenger, y la consiguiente acumulación intracelular de ésteres de colesterol y formación de células espumosas. • Citotoxicidad. La LDL oxidada es citotóxica para prácticamente todas las células de la pared arterial, pero especialmente para las células endoteliales 79 . • Inflamación. Productos de la oxidación son capaces de activar una serie de factores de trascripción (NF-kB, AP-1, PPAR alfa y gamma) para estimular la expresión de factores de crecimiento (factor estimulador de colonias, CSF; factor de crecimiento epidérmico, EGF), quimioquinas (proteína quimiotáctica para monocitos, MCP-1; moléculas de adhesión vascular, VCAM-1, e intercelular, ICAM-1) y citocinas (IL 1,6 y 8), etc… 80 . • Inhibición de vasodilatación. La LDL oxidada inhibe la acción vasodilatadora del óxido nítrico en células endoteliales 81 . • Actividad protrombótica. La LDL oxidada induce la expresión de factor tisular, endotelina-1 e inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) 82,83 . • Respuesta inmunológica. La LDL oxidada es capaz de actuar como antígeno, induciendo una respuesta inmunológica, y la generación de autoanticuerpos 84 . Como se explica en más detalle en capítulos posteriores, la LDL no es la única lipoproteína que padece modificaciones en sus propiedades químicas y físicas que acaban resultando en partículas aterogénicas. Otra familia de lipoproteínas, las HDL, si bien en sentido contrario, modifican su estructura y en consecuencia sus funciones ateroprotectoras, en determinados ambientes metabólicos. 33 C. PATOGENIA I III. DM, OBESIDAD Y METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEÍNAS. CONCEPTO DE DISLIPEMIA ATERÓGENA. La dislipemia aterógena y su relación con la enfermedad arterial coronaria. La dislipemia aterógena, caracterizada principalmente por triglicéridos (TG) elevados y HDL-c bajo, es un fenotipo asociado con un incremento del riesgo cardiovascular. La concentración de triglicéridos elevados en ayunas, son de hecho, un factor de riesgo independiente para enfermedad arterial coronaria. Estaban independientemente asociados con la incidencia de enfermedad arterial coronaria en el “Paris Prospective Study”, el “Prospective Cardiovascular Munster Study” y el “Copenhagen Male Study”, y el análisis multivariante ajustado por HDL-c, obesidad, diabetes y otros factores de confusión, demostraron una asociación estadísticamente significativa 85,86 . También el descenso del HDL-c es claramente un factor de riesgo independiente para enfermedad arterial coronaria, como se demostró ya en el “Framingham Heart Study” y confirmado en otros posteriormente 87 . La prevalencia de dislipemia aterógena, definida como anormalidades en el eje TGHDL-c, es muy alta en pacientes con enfermedad arterial coronaria. Por ejemplo en el “Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Intervention Trial”, el 33% tenían Triglicéridos elevados (>200 mg/dL) y el 64% tenían bajos niveles de HDL-c (<40 mg/dL) 88 . En el “Third National Health and Nutrition Examination Survey –NHANES III-”, la prevalencia de triglicéridos elevados (>150 mg/dL) fue del 30%, y la de bajos niveles de HDL-c (<40 mg/dL en hombres y <50 mg/dL en mujeres) fue del 37%; en esta muestra la prevalencia de obesidad era del 39%, y existía un solapamiento significativo entre los tres fenotipos 89 . La dislipemia aterógena está fuertemente asociada con la obesidad y la diabetes tipo II, es frecuente, y es un importante factor de riesgo para eventos cardiovasculares. Así, comprender las relaciones fisiopatológicas entre obesidad y dislipemia aterógena es de gran importancia para reducir el riesgo cardiovascular en personas obesas. El adipocito y las diversas vías metabólicas de las lipoproteínas son los puntos clave de esta relación, que cuando se alteran, favorecen la aparición de arteriosclerosis y sus consecuencias clínicas. La captación de los ácidos grasos derivados de lipoproteínas y su almacenamiento por tejido adiposo. El tejido adiposo es responsable de la captación coordinada, el almacenaje, y la liberación de energía en forma de triglicéridos (almacenaje), y ácidos grasos (captación y liberación). Adquiere los ácidos grasos de la dieta por la vía del metabolismo de lipoproteínas ricas en triglicéridos, principalmente quilomicrones. El músculo esquelético y cardiaco tiene la 34 habilidad de hidrolizar los triglicéridos de los quilomicrones y extraer ácidos grasos según sus necesidades metabólicas, pero la mayoría de la energía en forma de triglicéridos de los quilomicrones se dirige hacia el tejido adiposo durante la fase postpandrial para el almacenaje. En los capilares del tejido adiposo, los quilomicrones se encuentran con la enzima lipoprotein lipasa (LPL), sintetizada por los adipocitos. La apoC-II de estas lipoproteínas actúa como cofactor de la LPL, iniciando la hidrólisis de los triglicéridos y la liberación de ácidos grasos no esterificados, que son captados por los adipocitos adyacentes. La expresión de la LPL derivada de adipocitos y su actividad se incrementa en la fase postpandrial, mientras que en la fase de ayuno, disminuye. En contraste, la LPL muscular aumenta casi el doble que la del tejido adiposo en la fase de ayuno, dirigiendo los ácidos grasos derivados de los triglicéridos hacia el músculo para la utilización de energía. Una vez que los ácidos grasos son captados por el adipocito, se esterifican para poder ser atrapados en el interior celular y prevenir la difusión fuera 90 . Fig 10. Captación de ácidos grasos y lipólisis. Acciones de LPL y HSL en el tejido adiposo. Adaptado de Lipólisis de Triglicéridos y liberación de NEFAs por el tejido adiposo. La lipólisis se define como el catabolismo de los triglicéridos en respuesta a los requerimientos celulares de ácidos grasos, tanto cuando son necesarios como sustrato de energía o para la síntesis de muchos lípidos, como cuando es preciso retirarlos porque están presentes en exceso. Pueden ser tan sumamente importantes para la formación de membranas, la señalización celular o la obtención de energía como tóxicos cuando exceden la demanda; de ahí que exista un órgano especializado como el tejido adiposo que los convierte en moléculas inertes por esterificación con glicerol y formación de Triglicéridos. 35 Como ya se ha visto previamente, la hidrólisis de esos triglicéridos tiene lugar a tres niveles diferentes: la lipólisis gastrointestinal para la grasa dietética; la lipólisis vascular responsable de la hidrólisis de los triglicéridos asociados a lipoproteínas; y la lipólisis intracelular que cataliza la liberación de ácidos grasos desde las gotas lipídicas donde se almacenan Triglicéridos para la exportación desde el tejido adiposo, o su metabolismo en otros tejidos. Esta lipólisis intracelular se produce principalmente por la acción de lipasas neutras pero también por las lipasas ácidas lisosomales. La hidrólisis neutra de los triglicéridos requiere tres pasos consecutivos que son llevados a cabo por al menos tres enzimas diferentes: la ATGL – adipose triglyceride lipase-, que cataliza el paso inicial convirtiendo los triglicéridos en diacilglicéridos (DGs); la HSL – hormona sensitive lipaseque convierte DGs en monoacilglicéridos (MGs); y la MG lipasa que los hidroliza en ácidos grasos y glicerol. En el tejido adiposo ATGL y HL son las responsables de más del 90% de la hidrólisis de los triglicéridos. La insulina y el la ingesta de comida son reguladores negativos de la acción de estas enzimas, promoviéndose el almacenaje de TG. Contrariamente, durante la fase de ayuno, los niveles de insulina están bajos, y se promueve la hidrólisis de los triglicéridos. También las catecolaminas, a través de la estimulación de los receptores β, los glucocorticoides y los agonistas de los receptores PPAR, regulan positivamente su activación 91,92 . Los triglicéridos también pueden ser hidrolizados por la enzima LAL –lysosomal acid lipaseen lo que se conoce como autofagia o lipólisis ácida ya que se produce en el interior de los lisosomas una vez se endocitan las gotas lipídicas. Tiene diferentes funciones según el tejido; en el hígado la autofagia contribuiría a la lipólisis en condiciones de dietas ricas en grasa o en periodos largos de ayuno; pero en el tejido adiposo se relaciona con la diferenciación de adipocitos y la lipogénesis pero no con la lipólisis. Además de ser substrato energético y precursores de otros lípidos los ácidos grasos están directamente involucrados en vías de señalización celular y transcripción genética. Pueden unirse y activar receptores nucleares de la familia de los factores de transcripción que controlan la expresión de genes implicados en la homeostasis energética. Tanto la concentración de ácidos grasos en plasma como en el interior celular está correlacionada positivamente con el aumento de la resistencia a la insulina. También el incremento del contenido celular en triglicéridos está fuertemente asociado a la resistencia a la insulina en el músculo esquelético y el hígado, pero sólo son marcadores y no reguladores de la acción y las vías de señalización de la insulina como lo es la propia lipólisis 93,94 . La familia de receptores nucleares PPAR requieren ácidos grasos para su activación, sin embargo estos precisan un ciclo de esterificación y rehidrólisis por parte de enzimas como ATGL y HSL para poder actuar como 36 ligandos de PPAR. La lipólisis no sólo es necesaria para PPARα, altamente expresado en tejidos oxidativos, sino también para activar PPARγ, más implicado en la síntesis lipídica. Como ejemplos, la activación de PPARγ por rosiglitazona se asociaba con un incremento de la lipólisis en tejido adiposo blanco en ratas por inducción de ATGL y HSL. Por otra parte, la deficiencia en HSL llevaba a la regulación a la baja de genes diana de PPARγ en el tejido adiposo en modelos experimentales 95,96 . Resistencia a la insulina y alteración del atrapamiento de ácidos grasos por el tejido adiposo. La obesidad y la resistencia a la insulina que se observa en la DM2, se asocian tanto al atrapamiento defectuoso de los ácidos grasos en los adipocitos, como a la lipólisis excesiva, como al incremento de los NEFAs circulantes con niveles superiores a los requerimientos metabólicos de otros tejidos. Se han postulado diversos mecanismos para esta relación de los ácidos grasos con la resistencia a la insulina. El incremento celular de NEFA puede facilitar la síntesis de lípidos lipotóxicos que interfieren en la señalización funcional de la insulina, como las ceramidas 97 . También directamente o a través de la producción de especies reactivas del oxígeno pueden activar kinasas que inactivan la respuesta a la insulina 98 . La obesidad de forma aislada se asociada con trastornos funcionales de otra enzima lipolítica, la lipoprotein lipasa (LPL). La actividad global de la LPL en obesos está disminuida, y se incrementa en respuesta a la pérdida de peso y la terapia intensiva con insulina en los pacientes que además asocian diabetes tipo 2 99,100 . La resistencia a la insulina, altera la regulación positiva de la LPL y el atrapamiento efectivo de los ácidos grasos 101 . Este flujo aumentado de NEFA desde el tejido adiposo conlleva un incremento de la recaptación de estos ácidos grasos por el hígado, aumento de la lipogénesis hepática y la producción de VLDL, dando lugar al perfil lipídico plasmático conocido como dislipemia aterógena 102 . Sobreproducción de VLDL hepáticas en estados de resistencia a la insulina. El aumento de lipoproteínas apo B, particularmente de lipoproteínas ricas en triglicéridos es una característica de la obesidad y la resistencia a la insulina. Como se ha dicho, uno de los principales motivos es el aumento del flujo de NEFA desde el tejido adiposo hacia el hígado. El hígado es un órgano eficiente en retirar los NEFA de la circulación. Algunos acaban en la vía de la β-oxidación de los ácidos grasos, pero muchos NEFAs son reesterificados en Triglicéridos 103 . Estos triglicéridos sintetizados de nuevo por el hígado pueden ser cargados en apoproteínas apo B-100 e incorporados a VLDL para su secreción en un proceso que requiere de MTP (que 37 se encuentra regulada positivamente en estados de RI). Los triglicéridos que son transportados al interior del hígado tienen dos destinos posibles: almacenarse en el citoplasma, o ser secretados a la circulación como VLDL apo-B. Los precisos mecanismos moleculares que llevan de la resistencia a la insulina a la sobreproducción de VLDL están sin definir. Los ácidos grasos y la regulación de la lipólisis intra y extracelular, parece que tienen un papel importante. Fisiopatología de HDL-c bajo en la obesidad. Los niveles bajos de HDL-c son muy comunes en la obesidad 104 . Sin embargo, los mecanismos de la reducción de HDL-c en obesidad y otras situaciones de resistencia a la insulina no están bien establecidos y son diversas las causas que se postulan: - Una de las causas son los niveles elevados de lipoproteínas ricas en triglicéridos. Existe una interacción importante entre las lipoproteínas ricas en Triglicéridos y las HDL durante su metabolismo. Con la hidrólisis por parte de la LPL de los triglicéridos de los quilomicrones y VLDL, el exceso de fosfolípidos de superficie y apoproteínas (incluyendo apoA-I, apoC, y apoE) son transferidos a las HDL. Así, la alteración de la actividad LPL, que resulta frecuente en los estados de obesidad y resistencia a la insulina, es un factor que reduce los niveles de colesterol unido a HDL por un menor intercambio con VLDL. - Como se ha visto, los ésteres de colesterol son transferidos desde las HDL a las lipoproteínas ricas en triglicéridos a cambio de Triglicéridos mediante la proteína transferidora de ésteres de colesterol (CETP). El incremento de los niveles de partículas aceptoras ricas en triglicéridos (QM, VLDL) aumenta la tasa de intercambio mediado por la CETP, resultando en un mayor contenido de colesterol fuera de las HDL y una reducción de los niveles de HDL-c 105 . Además, el proceso de transferencia mediado por la CETP enriquece las HDL con Triglicéridos, resultando en partículas que son mejor sustrato para la lipasa hepática. La hidrólisis de los triglicéridos de las HDL por esta enzima lleva a la formación de partículas de HDL más pequeñas que son más rápidamente catabolizadas 106 . También, por tanto, el incremento en la concentración de lipoproteínas ricas en triglicéridos, resulta en un mayor intercambio mediado por la CETP de colesterol fuera de las HDL y triglicéridos dentro de ellas, llevando a niveles más bajos de HDL-c. Los pacientes obesos frecuentemente tienen niveles bajos de HDL-c incluso cuando los triglicéridos en ayuno son normales, sugiriendo que existen otros mecanismos que contribuyen a esa disminución en su concentración más allá del aumento de las lipoproteínas ricas en Triglicéridos. El tejido adiposo secreta y es una fuente importante de CETP en plasma humano 107 . Además, la actividad y la masa de CETP aumentan y se correlacionan con los niveles de leptina en plasma, por lo que se 38 sugiere que la producción de CETP por el tejido adiposo en estados de obesidad podría directamente llevar a la reducción de HDL-c, incluso sin aumento de las lipoproteínas ricas en triglicéridos 108 . - Otras proteínas derivadas de los adipocitos podrían influir directamente en el metabolismo de las HDL, como por ejemplo la adiponectina, cuyos niveles se encuentran reducidos en los estados de obesidad y la resistencia a la insulina, y que se correlacionan con los niveles de HDL-c en plasma 109 . Además, la pérdida de peso estaba asociada con el incremento de adiponectina así como de HDL-c, y los cambios en estos parámetros estaban correlacionados incluso después de ajustar por cambios en la adiposidad y la sensibilidad a la insulina 110 . También existe una fuerte correlación negativa entre la tasa de catabolismo de apo A-I y los niveles plasmáticos de adiponectina, consistente con una acción directa sobre el metabolismo de las HDL 111 . - Como se ha dicho, la lipasa hepática (HL) está incrementada en los estados de obesidad y resistencia a la insulina. Después del enriquecimiento de Triglicéridos mediado por CETP, las HDL son mejores sustratos para HL y son más rápidamente aclarados de la circulación, como resultado de la lipólisis mediada por esta enzima. La base del incremento en la actividad HL en la obesidad y la resistencia a la insulina tampoco está determinada todavía. - La lipasa endotelial (EL), podría tener un papel importante contribuyendo a reducir los niveles de HDL-c en la obesidad y la resistencia a la insulina. EL tiene importantes efectos en el metabolismo de HDL en ratones; la sobreexpresión reduce los niveles de HDL-c mediante el aumento de su tasa de catabolismo, mientras que la inhibición o la deleción genética los aumenta por descenso de su catabolismo 112,113 . También existen datos que señalan que la EL es relevante en el metabolismo de HDL en humanos, y que sus niveles están correlacionados significativamente de forma negativa en la obesidad y el síndrome metabólico. Es importante señalar, que la expresión de EL por células endoteliales y macrófagos está regulada positivamente por estímulos inflamatorios, y que la obesidad es un estado proinflamatorio caracterizado por la infiltración de macrófagos del tejido adiposo y los niveles elevados de marcadores plasmáticos de inflamación 114 . - Finalmente, el tejido adiposo podría ser un importante origen de flujo de colesterol hacia HDL, que podría alterarse en los estados de resistencia a la insulina. El tejido adiposo contiene aproximadamente el 25% del colesterol corporal total en sujetos flacos y más aún en obesos, y la gran mayoría del colesterol está no esterificado 115 . Diversos estudios han demostrado que los adipocitos expresan los principales transportadores como ABCA1, ABCG1 y SR-BI. Es posible, aunque no demostrado, que estos transportadores 45 paraoxonasa (PON), la acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas (PAF-AH), y la glutation peroxidasa (GPX) 138 . − A nivel endotelial promueve la proliferación celular y disminuye la apoptosis celular 112 . − Previene la disfunción endotelial, uno de los eventos iniciales de la aterogénesis. El óxido nítrico (NO) y la prostaciclina (PGI 2 ) median en la relajación de las células de músculo liso y tienen un potente efecto antitrombótico; un descenso en su biodisponibilidad es un hecho prominente en la disfunción endotelial. En cultivos de células endoteliales, HDL activa la sintasa endotelial de NO (eNOS), a través de la unión de apo A-I con SR-BI, y por tanto aumenta la producción de NO. En plasma humano, HDL-C es un potente predictor independiente de la vasodilatación mediada por NO 139 . HDL también mejora la producción de prostaglandina (PGI 2 ) en células endoteliales en cultivo, induciendo la expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). − HDL regula negativamente la expresión de moléculas de adhesión (CAMs), inhibe la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas, y aumenta la expresión de citocinas antiinflamatorias en cultivos celulares. En plasma humano, los niveles de HDL-C se correlacionan inversamente con niveles de CAMs solubles e IL-6 140 . Fig 13. Propiedades y efectos antiaterogénicos de las HDL. Adaptado de Hausenloy, Heart 2008 Evidencia experimental de la protección vascular por HDL. Los modelos animales han contribuido considerablemente al conocimiento de la aterogénesis y la influencia de los lípidos y de los tratamientos que modifican su perfil. En las primeras líneas de investigación, monos 46 con dietas con alto contenido en grasa, acababan desarrollando hipercolesterolemia y arteriosclerosis acelerada, mientras que el seguimiento con dieta normal, hacía que la enfermedad regresara en parte 141 . Actualmente los modelos animales, son ratones o ratas, que permiten una precisa manipulación genética. La primera evidencia experimental de los efectos protectores del HDL fue obtenida por Badimon y colaboradores que realizaron inyecciones de HDL purificado en conejos alimentados con dieta rica en colesterol, y observaron que disminuía la arteriosclerosis tras 90 días con respecto a los controles 142 . Más recientemente, la posibilidad de mantener elevaciones mantenidas de HDL-C en ratones mediante la expresión transgénica de su principal apoproteína, Apo A-I, ha permitido series de experimentos determinando el efecto de esos niveles de HDL en el tamaño y composición de la placa, además de en el remodelado avanzado de estas. La naturaleza dinámica y reversible mostrada en estos animales, eleva la posibilidad de que usando nuevos tratamientos se llegue a la regresión y el remodelado cínicamente importante de las placas de ateroma en humanos. Sin embargo los descubrimientos en modelos animales no siempre llevan a tratamientos clínicamente eficaces (ACAT inhibitors, CETP inhibitors…) 143 . D. PATOGENIA II II. DISLIPEMIA ATERÓGENA Y HDL. MODIFICACIÓN PROATEROGÉNICA DE LAS HDL. La DLP aterógena que caracteriza los estados de obesidad y DM2, que se postula como uno de los mecanismos fundamentales en el desarrollo de arteriosclerosis acelerada, posiblemente no sea únicamente una cuestión cuantitativa sino cualitativa. En algunos subgrupos poblacionales, los niveles bajos de HDL-C no confieren mayor riesgo CV como ocurre en los portadores de apo AI Milano; y al revés, como muestran los resultados de un estudio reciente de intervención farmacológica, con un inhibidor de la enzima CETP, en el que los pacientes tratados, presentaban incremento significativo de su HDL-C pero no experimentaban impacto favorable en cuanto a la arterosclerosis sino lo contrario (el ensayo se suspendió por importante morbilidad asociada) 144 . Es decir, la concentración de HDL en un momento determinado no da información directa sobre el estado del transporte centrípeto de colesterol desde las células al hígado, ni sobre las acciones antiinflamatorias, antioxidantes, antitrombóticas que tienen las HDL 145 . Los niveles bajos de HDL son un importante factor de 47 riesgo cardiovascular, pero pueden no ser sino “la punta del iceberg” de un trastorno funcional subyacente de estas lipoproteínas y su capacidad para frenar y/o revertir la arteriosclerosis. Las funciones protectoras frente a la arteriosclerosis están influenciadas por interacciones con proteínas de la propia vía metabólica u otras, lípidos, agentes oxidantes, etc… en los diversos ambientes celulares en los que se puede encontrar una molécula de HDL durante su metabolismo. Así, las partículas de HDL son susceptibles de modificaciones estructurales que pueden afectar al contenido en lípidos, apolipoproteínas, enzimas y proteínas transferidoras, provocando cambios sustanciales que llevan incluso a HDL disfuncionantes que podrían promover el proceso aterogénico. Estas modificaciones pueden tener lugar por diversos mecanismos, fundamentalmente en microambientes inflamatorios como la placa arterioslerótica: − no-enzimáticos, por iones metálicos en las placas de arteriosclerosis. − enzimáticos, por enzimas celulares que degradan las apoproteínas, crean agregados, o inducen la oxidación de sus componentes − por proteínas de fase aguda, que modifican la estructura de las HDL − modificaciones metabólicas (glicosilación) que ocurre con exceso de glucosa. Estos cambios se asocian con modificaciones en las funciones biológicas de las HDL, ya que se ha demostrado que disminuyen la capacidad de estas partículas para promover el transporte reverso del colesterol, provocan que tengan acción citotóxica sobre macrófagos y células linfoblastoides en cultivo, y se alteren sus propiedades antiinflamatorias. La gran mayoría de estos efectos se deben a las alteraciones que sufren las enzimas asociadas a las HDL 146 . Modificaciones enzimáticas. - Mieloperoxidasa (oxidación, nitrosilación y tirosilación). La mieloperoxidasa (MPO) es una proteína secretada por fagocitos y se encuentra expresada en las lesiones ateroscleróticas. Es capaz degenerar especies reactivas oxidantes, modificando las HDL de diversas maneras. El mayor producto de la actividad MPO es el ácido hipocloroso (HOCl), que puede modificar diferentes biomoléculas por clorinación y/o oxidación 147,148 . En las HDL provoca la disminución de la actividad PLTP y de la formación de Apo A-I de elevado peso molecular (similar a las observadas tras oxidación mediada por Cu). Esto conlleva un descenso en el flujo centrífugo de colesterol por dos mecanismos: Las HDL modificadas por HOCl pierden la capacidad de 48 promover este flujo dependiente de los transportadores ABCA-1, y aunque aumenta su afinidad por SR-BI, la unión es defectuosa, incapaz de soportar eficientemente la transferencia bidireccional de colesterol por este receptor 149,150 . Además se observa que la incubación de células endoteliales con HOCl-HDL atenúa la expresión y la actividad de la sintasa endotelial de óxido nítrico 151 . Otros reactivos producidos por la MPO son el radical dióxido de nitrógeno, que promueve la nitrosilación de la apo A-I; y el radical tirosilo. En la nitrosilación, a diferencia de la clorinación (modificación por ácido hipocloroso), el flujo de colesterol mediado por ABCA1 se afecta sólo minimamente, sugiriendo que las dos modificaciones afectan a la conformación de ApoA-I de forma diferente 152,153 . La exposición de lipoproteínas a los radicales tirosilo induce el agregado de apoproteínas con la formación de dímeros y trímeros de apo A-I, y la formación de complejos Apo A-I/Apo A-III, y la peroxidación lipídica. Se observa que las HDL tirosiladas pueden promover el flujo de colesterol desde fibroblastos humanos y disminuir la formación de placas de ateroma en ApoE-deficient mice, aunque datos opuestos, sobre otras estirpes celulares, muestran que esta modificación hace que las HDL sean aceptores de colesterol menos eficientes 154,155 . - Enzimas de las células cebadas (chymase and tryptase). Las células cebadas son componentes del sistema immune y están presentes en la íntima arterial. Tras ser activadas estas células se degranulan y liberan varios componentes con actividad biológica, entre ellos, enzimas proteolíticas como la quimasa y la triptasa. Estas, son capaces de degradar apoproteínas, principalmente las Apo A-I y IV que se encuentran en las partículas preβ. Por ello, las HDL modificadas por la acción de estas enzimas, muestran alteraciones en el flujo de colesterol mediado por ABCA-1, sin afectar la vía de SR-BI 156,157 . - MMPs. (Matrix metalloproteinases) Las metaloproteinasas de la matriz son una familia de proteasas que actúan en la degradación de componentes de la matriz extracelular. La actividad MMPs se ha implicado en el remodelado vascular tanto en situaciones fisiológicas como patológicas, contribuyendo al adelgazamiento de la pared arterial y desestabilizando las placas de ateroma. Además podrían contribuir a la génesis de estas placas alterando el papel ateroprotector de las HDL, ya que como se ha demostrado, la incubación de HDL 3 con diferentes MMPs causa la pérdida completa de partículas preβ, reduciendo el componente de alta afinidad en el eflujo de colesterol desde los macrófagos 158 . 49 - Enzimas asociadas a los Polimorfonucleares. Los leucocitos polimorfonucleares están presentes en las etapas iniciales del desarrollo de las lesiones ateroscleróticas, y se les implica en la modificación de las lipoproteínas de baja y alta densidad mediante la producción de grandes cantidades de especies reactivas del oxígeno y enzimas proteolíticas. Las HDL modificadas por la acción de elastasas, son reconocidas por SR-BI y más eficientemente internalizadas por macrófagos 159,160 . - EL (endotelial lipase). La lipasa endotelial tiene una acción fundamentalmente fosfolipasa con las HDL como sustrato preferido. La expresión de EL se encuentra aumentada durante el proceso inflamatorio, y podría estar involucrada en la aterogénesis. La incubación de HDL con EL resulta en un descenso del contenido en fosfatidilcolina, y dado que la composición de fosfolípidos es una de los factores principales en el flujo de colesterol dependiente de SR-BI, las HDL modificadas por EL muestran una disminución en la capacidad de asociarse con estos receptores, y se altera el flujo de colesterol 161 . - SAA. (serum amyloid A protein). La proteína amiloide A del suero, es una proteína de fase aguda sintetizada por el hígado durante la inflamación. En el plasma se asocia a HDL, alterando sus propiedades fisicoquímicas. SAA desplaza a Apo A-I, induce un aumento de tamaño en la lipoproteína y altera la capacidad de proteger a las LDL de la oxidación, probablemente por afectar a sus enzimas. Además, in vitro, estas partículas modificadas, son menos eficaces en retirar el exceso de colesterol de los macrófagos. - sPLA2. (secretory phospholipase A2) La fosfolipasa “secretory” A2 tipo II es una enzima que se expresa durante la inflamación, y posiblemente involucrada en la aterogénesis. De hecho, sus niveles circulantes están elevados en la aterosclerosis y a nivel de la palca de ateroma también 162 . El tratamiento de HDL con sPLA2 provoca hidrólisis de fosfolípidos, y la presentación de algunos dominios de apoproteínas en superficie, que podría ser el responsable de la elevada capacidad de unión a las células, y el rápido catabolismo de estas partículas modificadas 163 . 50 Modificaciones no enzimáticas - Metales de transición. Cu ++ . Las placas de aterosclerosis contienen iones metálicos libres. La producción de radicales del oxígeno inducida por estos metales se sugiere tiene un papel en la enfermedad cardiovascular, probablemente debido a la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad. La modificación de las lipoproteínas de alta densidad por el cobre, induce la peroxidación de los lípidos, y la oxidación de las apoproteínas determinando la aparición de agregados con mayor peso molecular 164 . A nivel de efectos biológicos: - En macrófagos. Las modificaciones en las HDL reducen la capacidad de estas partículas de estimular el flujo de colesterol desde los macrófagos cargados de lípidos. Además, se ha observado que son citotóxicas para este tipo de células 154 . - En células endoteliales. Las HDL oxidadas por cobre se unen a las células endoteliales promoviendo la activación de kinasas intracelulares, NF-kB, Cox-2 y el aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y en la expresión de PAI-1 165 . Modificaciones metabólicas - Glicosilación. Los individuos con diabetes del tipo 2 presentan niveles más bajos de HDL, que se cree es el responsable del riesgo cardiovascular aumentado que presentan. Los sujetos afectos de diabetes tipo 1 desarrollan aterosclerosis severa independientemente de los niveles normales o altos de HDL. Una posible explicación es que la hiperglucemia induce alteraciones funcionales en las HDL que contribuirían a acelerar la aterosclerosis. La glucosa induce una reacción no enzimática con proteínas formando primero productos reversibles (bases de Schiff, compuestos de Amatory), y posterioremente irreversibles (los AGEs o advanced glycation end products). En los sujetos diabéticos, las HDL se encuentran altamente glicosiladas. La glicosilación in vitro de las HDL aumenta la peroxidación lipídica, acelera su catabolismo y reduce la capacidad de promover el RCT 166,167 . Aumenta además la susceptibilidad de estas partículas por se oxidadas. La glicoxidación in vitro, reduce la habilidad de las HDL de retirar los lípidos peroxidados de las membranas aún preservando la actividad PON1, induce la apoptosis de células endoteliales, la liberación de peróxido de hidrógeno y la regulación negativa en la expresión de catalasa, CuZn-superóxido dismutasa, y sintasa endotelial de NO 168 . - Homocisteilación. Existe evidencia de que los niveles elevados de homocisteína están asociados con un aumento del riesgo de aterosclerosis y enfermedad cardiovascular. Se ha 51 hipotetizado con que el daño vascular inducido por la homocisteína puede ser debido a un derivado reactivo, homocisteína-thiolactona (Hcy-thiolactona), que reacciona espontáneamente con los grupos amino de los residuos de lisina de la apoproteínas. Las homocystamida-LDL (Hcy-LDL), se agregan, inducen su captación por macrófagos y provocan daño oxidativo en las células endoteliales. Los cambios inducidos por la homocisteinación de las HDL, se reflejan en una disminución de la actividad PON 169 . D. PATOGENIA II III. MICROALBUMINÚRIA (MAU) COMO SIGNO PRECOZ DE DAÑO ENDOTELIAL GENERALIZADO El hallazgo de albúmina en orina es un fenómeno normal en todos los individuos que con métodos sensibles de medición, su valor normal es de menos de 30 mg/día. Valores persistentes entre 30 y 300 mg/día se consideran como microalbuminuria y mayores a 300 mg/día se consideran macroproteinuria o proteinuria clínica. La microalbuminuria es el hallazgo clínico más temprano de la enfermedad renal y es considerado un marcador independiente de enfermedad cardiovascular. Para aparecer en la orina la albúmina es filtrada en los glomérulos renales atravesando tres niveles: las fenestraciones endoteliales, la membrana basal y las hendiduras diafragmáticas que dejan los pedicelos de los podocitos. Una vez filtrada la albúmina en el lumen del túbulo proximal puede seguir tres vías distintas. La primera, ser absorbida por la célula del túbulo por un proceso de endocitosis, transportada en su interior y finalmente ser secretada en la membrana opuesta por exocitosis. La segunda vía es entrar a la célula y ser destruida en los lisosomas de la misma total o parcialmente. Y por último la albúmina filtrada puede pasar inalterada por los túbulos renales y ser excretada en la orina. Comenzó a utilizarse en diabéticos tipo 1, para los que demostró que era el marcador más temprano de daño renal y un predictor de riesgo de progresión hacia la insuficiencia renal terminal. Si bien, en pacientes con diabetes tipo 2 también es un marcador precoz de daño renal, el significado del hallazgo de microalbuminuria tiene un valor agregado, ya que es un mejor predictor de riesgo cardiovascular elevado, posiblemente por su mayor edad, años de 52 HTA o dislipemia y por lo tanto mayor riesgo cardiovascular. Aproximadamente un 30% de las personas con Diabetes tipo 1 y un 40% de aquellos con Diabetes tipo 2 tienen microalbuminuria, y en estos pacientes (DM 2) el riesgo de muerte por enfermedad cardiovascular podría aumentar en un 100-150 % en función del grado de MAU 170 . Las actuales recomendaciones del JNC 7 (Seventh report of the Joint National Comittee on the prevention, detection, evaluation, and treatment of high blood pressure), reconocen a la MAU como un factor de riesgo cardiovascular 171 . La MAU se asocia con los componentes del síndrome metabólico (fundamentalmente contribuyen a esto, las alteraciones del metabolismo hidrocarbonato, y la hipertensión arterial): obesidad abdominal, intolerancia a la glucosa/hiperinsulinemia/resistencia a la insulina, dislipidemia característica (descenso de HDL y aumento de Triglicéridos), e hipertensión 172 , y sugiere aumento de permeabilidad vascular por daño endotelial precoz e inicio del proceso de arteriosclerosis. Incluso en pacientes no afectados por hipertensión arterial ni diabetes, la presencia de MAU se relaciona con disfunción endotelial y riesgo cardiovascular, observándose un descenso de la hiperemia mediada por flujo tras oclusión braquial 173 . En resumen, la MAU es un indicador de daño endotelial generalizado, punto clave en el posterior desarrollo de aterosclerosis. E. ENFOQUE GENERAL DEL TRATAMIENTO DE LA DISLIPEMIA EN LA DM Y OBESIDAD. HDL COMO DIANA TERAPÉUTICA. I. MANEJO FARMACOLÓGICO Y NO FARMACOLÓGICO DE LA DISLIPEMIA EN DM Y OBESIDAD Manejo No Farmacológico. Los pacientes con DM2 y/o obesidad frecuentemente padecen lo que denominamos dislipemia (mixta) aterógena, caracterizada por niveles bajos de HDL, elevados de Triglicéridos y partículas LDL pequeñas y densas. Las diversas guías terapéuticas de práctica clínica que existen al respecto reconocen que la intervención sobre el estilo de vida es el primer peldaño en el manejo de la dislipemia de estos pacientes aunque frecuentemente cuando no se consiguen los objetivos se debe 53 asociar un tratamiento farmacológico. Los otros dos puntos importantes en el manejo no farmacológico de los pacientes con DM2 y obesidad son la actividad física y la dieta 174,175 . - Ejercicio físico. El incremento de la actividad física (no sólo en frecuencia sino en intensidad) tiene efectos beneficiosos en la sensibilidad a la insulina y el perfil lipídico. - Dieta. La evidencia de diversos ensayos al respecto, sustenta que el uso de dietas hipocalóricas, pobres en grasas saturadas y ricas en ácidos grasos Omega3, junto con la restricción de la carga de carbohidratos (punto este, al parecer, con mayor impacto a largo plazo), son las que deberían ser prescritas a estos pacientes dada su contrastada eficacia en reducir el peso, y controlar el perfil metabólico de lípidos e insulina. El NCEP ATP III revisado (National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III) junto a la American Heart Association Nutrition Committee recomiendan una ingesta de grasa del 25-35% total de las calorías diarias como parte de los cambios terapéuticos en la dieta de los pacientes diabéticos y obesos, si bien no es el único punto importante a tener en cuenta 161,176 . Las dietas pobres en carbohidratos son útiles en mejorar los índices glucémicos así como los parámetros lipídicos (disminuyen Triglicéridos y elevan HDL), de forma aislada, incluso mejor que únicamente una dieta pobre en calorías 177 . Las dietas restrictivas con la cantidad de calorías y grasas ingeridas, tal y como muestra el estudio de Howard y colaboradores 178 , aunque efectivas en reducir el peso a largo plazo, serían menos efectivas en modificar y mejorar la dislipemia mixta (únicamente con mínimos cambios en HDL y Triglicéridos) si bien consiguen reducir el colesterol total y el LDL. El enriquecimiento con ácidos grasos Omega3 tiene un particular beneficio sobretodo en los enfermos con enfermedad arterial coronaria, aunque en los estudios en que se demuestra, estaba siempre asociado a un tipo de dieta Mediterránea, rica en fruta, vegetales, cereales, y pobre en carnes y huevos 179,180 . Manejo Farmacológico. Al igual que con medidas no farmacológicas, las diversas guías terapéuticas de práctica clínica que existen sobre el tratamiento de la dislipemia en pacientes diabéticos y obesos (en muchas de ellas se hace mención al denominado Síndrome Metabólico) reconocen que tras la intervención sobre el estilo de vida, la siguiente actuación debe ir dirigida a reducir el exceso de LDL-c con una estatina como la primera intervención para reducir el riesgo cardiovascular de estos pacientes. A modo de resumen, una breve descripción de las opciones terapéutica hipolipemiantes que existen hoy en día, sería: 54 Disminución intensiva de LDL. 1. Monoterapia con estatinas. Como se ha mencionado, la adición de una estatina en el primer escalón de tratamiento es una opción más que contrastada. Sólo a modo de ejemplo en el metaanálisis de Baigent y colaboradores, con 90.000 pacientes de 14 estudios, mediante el tratamiento con estatinas se consigue una reducción de eventos coronarios del 23% por cada mmol/L de reducción de LDL-c 181 . Si bien existen diferencias entre guías de práctica clínica, el abordaje general pasa por reducir LDL-c > 30-40% hacia un objetivo de < 100 mg/dL. En algunos casos de alto riego se recomienda incluso hasta 70 mg/dl. La evidencia que sustenta esta estrategia se basa fundamentalmente en el ensayo TNT (Treating to New Targets) en el que 10.000 pacientes con enfermedad arterial coronaria conocida fueron randomizados al tratamiento con dosis altas (80 mg/día) o dosis convencionales (10 mg/día) de un tipo de estatina (Atorvastatina). Los resultados mostraban una reducción del riesgo relativo para eventos cardiovasculares del 25% en diabéticos y del 30% en los sujetos sin DM pero con síndrome metabólico 182 . Así, la última revisión del consenso NCEP ATP III, recomendaba un nivel objetivo de LDL-c de 70 mg/dL en pacientes de alto riesgo, como los diabéticos. 2. Disminución intensiva de LDL. Estatinas + Ezetimibe. Uno de los aspectos negativos del tratamiento intensivo con estatinas podría ser la tolerancia y efectos secundarios, de ahí el papel potencial del Ezetimibe asociado a dosis bajas de estatinas. La estrategia combinada se basa en ensayos clínicos en los que se demuestra que se reduce de forma significativa la concentración plasmática de LDL-c. Sin embargo en cuanto a la reducción de eventos cardiovasculares no ha demostrado superioridad a la monoterapia 183 . Por eso se recomienda, asociado a estatinas, como segunda o tercera línea de tratamiento. Modificación de la dislipemia aterógena 1. HDL y Triglicéridos. Las guías clínicas del NCEP ATP III, la ADA (American Diabetes association) y la ESC/EAS (European Society of Cardiology/European Atherosclerosis Society), recomiendan incrementar los niveles bajos de HDL a > 40 mg/dL en varones y >50 mg/dL en mujeres, así como reducir los Triglicéridos a <150 mg/dL en sujetos de riesgo 160,161 . Las estatinas tienen modestos efectos en los componentes de la dislipemia aterógena característica de diabéticos y obesos. Así, en la práctica clínica lo recomendado es la adición de 61 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 62 63 JUSTIFICACIÓN La enfermedad cardiovascular secundaria a aterotrombosis es la principal causa de mortalidad en países occidentales y está convirtiéndose en la primera en países en desarrollo. Por ello la investigación en el campo de la arteriosclerosis es fundamental para poder paliar esta situación: desde la arteriosclerosis subclínica y el diagnóstico precoz/prevención primaria; hasta las enfermedades secundarias a la progresión de la placa de ateroma y su tratamiento efectivo cuando se manifiesta clínicamente. Entre las causas que se identifican como responsables de esta situación figuran, como dos de las más importantes, el incremento en la prevalencia de la Diabetes Mellitus (principalmente tipo 2) y la Obesidad, frecuentemente asociadas, y que han adquirido dimensiones de verdaderas epidemias en muchos países. La diabetes y la obesidad han incrementado su incidencia y prevalencia de forma alarmante en las últimas décadas. El número de casos de diabetes en el mundo se estima actualmente en 284 millones de personas. Igualmente la prevalencia de la obesidad y el sobrepeso entre adultos mayores de 35 años, se estima en 1.7 billones de personas alrededor del mundo que padecen sobrepeso y 310 millones de personas obesas. Ambas condiciones, como se ha dicho frecuentemente asociadas, suponen un exceso de morbilidad, mortalidad y costes económicos derivados de las enfermedades consecuencia de ambas, entre las que destaca la enfermedad cardiovascular, debida a arteriosclerosis. La arteriosclerosis es una enfermedad sistémica (aunque con manifestaciones locales), de naturaleza inflamatoria, que se caracteriza como hecho fundamental por el depósito de lípidos en la pared de las arterias de mediano y gran calibre. Así uno de los grandes hitos de la investigación traslacional aplicada a la medicina, y un punto de inflexión importante en la historia natural de la enfermedad arteriosclerótica, haya sido la posibilidad de modificar el metabolismo del colesterol con las conocidas estatinas (inhibidoras de la enzima 3-hidroxi-3metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductasa); fármacos capaces de disminuir los niveles de colesterol total y unido a lipoproteínas de alta densidad (LDL), así como tener propiedades antiinflamatorias y antitrombóticas. Aún así, pese al tratamiento efectivo con estatinas y la reducción del colesterol total y LDL, un gran porcentaje de pacientes sigue padeciendo eventos cardiovasculares. Se ha considerado responsable de este exceso de riesgo a los niveles disminuidos de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Es cierta la observación de que las concentraciones elevadas de colesterol 64 ligado a LDL, y sobretodo el descenso de colesterol ligado a HDL, son importantes predictores de riesgo de eventos cardiovasculares (en realidad cada aumento de LDL eleva el riesgo aproximadamente lo mismo, y sin embargo, cada descenso de HDL se acompaña de un riesgo entre 2 y 3% mayor). Sin embargo la cuantificación aislada de los niveles de HDL no predice adecuadamente su composición, ni su función protectora frente a la arteriosclerosis (antioxidante, moduladora de la inflamación, la adhesión plaquetaria, la coagulación, etc…). Además, en situaciones con una importante carga de stress oxidativo como son la diabetes y la obesidad, la estructura y por tanto la función de estas lipoproteínas se altera, perdiendo propiedades antiaterogénicas e incluso promoviendo el efecto contrario. La DM2 y la obesidad, se caracterizan por un perfil lipídico llamado Dislipemia Aterógena, haciendo referencia a la asociación que existe entre las alteraciones de las lipoproteínas que transportan lípidos en sangre y el desarrollo, progresión y desestabilización (responsable de los eventos clínicos) de las placas de ateroma. Se define por niveles elevados de partículas LDL pequeñas y densas (sdLDL, small-dense LDL) frecuentemente con niveles de LDL totales normales, elevación de triglicéridos (Triglicéridos); y un descenso de la concentración plasmática de HDL. Un atractivo campo de interés para la investigación de posibles dianas terapéuticas en el campo de la arteriosclerosis, es pues, el metabolismo de las HDL (ya que en sí, la función de estas partículas está ligada a su composición en un momento dado, y ésta depende de en qué momento de su ciclo metabólico se encuentre), para que interviniendo de una manera controlada sobre enzimas, proteínas reguladoras, receptores, etc… se pueda modificar la historia natural de la placa de ateroma y el exceso de riesgo cardiovascular que conllevan la diabetes y la obesidad. Se ha demostrado que la proteinuria puede ser un marcador precoz del daño que ambas entidades (DM y obesidad) producen en el árbol vascular. Este daño inicial se debe a un trastorno en la barrera de filtrado (membrana glomerular). Se produce a nivel de los podocitos y en estudios recientes se ha relacionado con la alteración o disminución en la expresión de una proteína estructural denominada Nefrina. Esta precocidad en conocer el impacto de la diabetes y la obesidad en la pared vascular se podría correlacionar en el tiempo con las alteraciones en el metabolismo de las HDL y comprender mejor la magnitud de las modificaciones proaterogénicas que sufren estas lipoproteínas 65 Estudiando en un modelo animal de enfermedad cardiovascular precoz, secundaria a Diabetes y Obesidad (y por tanto asumiendo el papel fundamental que tienen las lipoproteínas en la aterogénesis), el metabolismo tisular de las HDL, y modificando su curso natural con intervenciones no farmacológicas (dieta) y farmacológicas (antagonismo de los receptores PPAR γ) se pueden conocer cómo (a nivel histológico, bioquímico y transcriptómico) se altera el metabolismo de las HDL desde las primeras etapas, en que ya la Diabetes y la Obesidad han provocado daño vascular. Utilizaremos para ello un modelo experimental animal con ratas obesas y/o diabéticas (Zücker) para estudiar los cambios de estos parámetros debidos a la evolución de la enfermedad y valorar el efecto del tratamiento con un antagonista de la angiotensina-II (Telmisartán) que tiene también efectos moduladores del metabolismo lipídico y de la glucosa (efecto PPAR-γ) comparado con un tratamiento basado en medidas higiénicodietéticas semejantes a las que se aplican de entrada a un paciente en la práctica clínica habitual (ejercicio y dieta hipocalórica). El receptor nuclear PPAR-γ actúa como factor de transcripción de diversos genes implicados en el metabolismo lipídico y la sensibilidad a la insulina. Además de favorecer la captación de Triglicéridos y la diferenciación de adipocitos en el tejido adiposo blanco, modulan la captación de lipoproteínas aterogénicas y al flujo de colesterol en los macrófagos arteriales (puntos clave en la progresión de la lesión aterosclerótica). El Telmisartán es un antagonista no peptídico, competitivo y altamente selectivo del receptor AT1 de la Angiotensina II (ARA-II) con eficacia para el manejo de la hipertensión, que además tiene actividad como agonista parcial de PPARγ,y puede modular selectivamente la expresión de genes diana de este factor de transcripción. Esto, podría tener implicaciones terapéuticas en la prevención y el manejo de la arteriosclerosis. 66 OBJETIVOS Objetivo Principal. El objetivo principal será valorar el algunos aspectos del metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una situación patológica marcadamente aterogénica como es la diabetes asociada a obesidad, antes de la fase clínica de la enfermedad, aunque ya con evidencia de disfunción endotelial por aparición de microalbuminuria. Conocer así, marcadores de precocidad de daño vascular en el campo de los lípidos y su respuesta a la intervención dietética y farmacológica. Objetivos Secundarios. - Demostrar que las alteraciones de las HDL que se observan en la llamada dislipemia aterógena de los estados de Diabetes y Obesidad, son modificaciones estructurales que se han producido por cambios en su metabolismo tisular desde fases tempranas. - Conocer algunas de esas modificaciones estructurales mediante el estudio del hígado, del plasma y de la orina. o A nivel bioquímico (parámetros séricos de lípidos, glucosa, propiedades antiinflamatorias/antioxidantes de HDL). o A nivel transcriptómico, de elementos de la propia vía del metabolismo del HDL. En concreto las apoproteínas constituyentes, Apo A-I y Apo A-IV - Ver cómo influyen las modificaciones farmacológicas (interviniendo sobre los receptores PPARγ) y no farmacológicas (dieta) en ese metabolismo y en la estructura de las HDL. - Valorar la aparición y el seguimiento de la microalbuminuria (MAU) como signo o marcador de lesión vascular y su relación con los parámetros lipídicos de los sujetos a estudio. 67 MATERIAL Y MÉTODOS 68 69 1. EL PROYECTO. ÁMBITO DE TRABAJO El proyecto sobre el metabolismo de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y su relación con el daño endotelial y renal es una prolongación de otro proyecto de investigación que ya estaba en marcha y contaba con fondos de la Beca Multidisciplinar del Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de Aragón, PM010/2006, “Expresión de nefrina como marcador de daño renal en un modelo experimental de obesidad y diabetes mellitus tipo 2. Efecto renoprotector de medidas higiénico-dietéticas y fármacos antiproteinúricos” cuyo investigador principal es el Dr. Pablo Iñigo. El lugar de la realización del proyecto ha sido la Unidad Mixta de Investigación en el ámbito del Hospital Clínico Universitario de Zaragoza, el Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud y la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza. Las determinaciones relacionadas con la oxidación de lipoproteínas, el perfil lipídico y la cuantificación de apoproteínas se llevaron a cabo en el Departamento de Bioquímica y Biología de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza dirigido por el Profesor Jesús de la Osada. 2. ANIMALES Los animales de experimentación utilizados pertenecen a tres tipos de ratas de uso habitual en numerosas líneas de investigación biomédica sobre diabetes y obesidad y que representan las características de la población humana a estudio: − Ratas Sprague-Dawley (Grupo SD, n=5), que representan la población sana, sin diabetes ni obesidad. − Ratas Zücker (Grupo Z, n= 5) que representan la población con obesidad, sin diabetes mellitus. − Ratas Zücker obesas y diabéticas (Grupo ZDF, n=28). Dentro de este grupo se formaron varios subgrupos: o en dos de ellos dejamos evolucionar la enfermedad sin tratamiento. Grupos Vehículo o placebo (ZDFV n=8), y el grupo Control (ZDFC n=4). o otro grupo fue el de las ratas sometidas a dieta hipocalórica para valorar el efecto de medidas higiénico-dietéticas sobre las lesiones en órganos diana; grupo Dieta (ZDFD, n=8) 70 o y un tercer grupo de ZDF tratado con Telmisartán, un fármaco antiproteinúrico, antagonista de los receptores AT-1 de la Angiotensina-II con demostrado efecto agonista PPAR-gamma (ZDFT, n=8) Los animales (machos) fueron suministrados por la empresa Charles River (Charles River Laboratories International, Inc. USA). Llegaron al estabulario con 8 semanas de vida, unos 250gr. de peso aproximadamente, y fueron puestos en cuarentena durante 2 semanas. Se mantuvieron en la Unidad Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza (Animalario registrado ES 50290012007), en jaulas de makrolón, transparentes y autoclavables, provistas de tapa del mismo material con filtro (BIOSIS S.L.) El lecho estaba formado por un granulado de madera con un tamaño de 1000 a 3000 micras obtenido de BedCo. Los animales estuvieron en un microclima controlado, con una temperatura máxima de 23º C y mínima de 20º C, humedad máxima del 60% y mínima del 50% y con una relación de ciclo luz-oscuridad de 12 horas para cada una de las fases. Los animales se manipularon de acuerdo a las condiciones sobre protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos (Real Decreto 1201/2005) siguiendo las recomendaciones del Comité de Ética para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza. Las dietas normal (pienso estándar para mantenimiento según el tipo de animal) e hipocalórica 30% fueron suministradas por la firma comercial Purina (Nestlé Purina PetCare España S.A) y el contenido de las mismas valorado por un veterinario experto en Nutrición que colabora con la Unidad Mixta de Investigación. Las muestras de orina se recogieron tanto de orina de 24 horas como de muestras de orina reciente de la mañana mediante el uso de jaulas metabólicas. La obtención de muestras sanguíneas realizadas a lo largo del estudio fueron extraídas bien de la parte proximal de la cola del animal (dorsal) o bien, si no era posible o la muestra era escasa, por punción femoral. El último día del modelo experimental se mantuvo a los animales 18 horas en ayuno, tras lo cual se les anestesió con Fluorane líquido sol. inhalatoria 100% (Isoflurano) de Abbott Laboratories +O 2 . Todo el procedimiento se realizo bajo anestesia. 77 Triglicéridos +3H 2 O lipasa Glicerol + Ácidos grasos Glicerol + ATP Glicerol quinasa Glicerol-3-fosfato+ ADP Glicerol-3-fosfato+O2 glicerol-3-fosfato Dihidroxiacetona-fosfato + H 2 O 2 deshidrogenasa 4-aminofenazona + 4-clorofenol + H 2 O 2 peroxidasa 4-(p-benzoquinona-monoimino)- fenazona + H 2 O + HCl Separación de lipoproteínas por cromatografía líquida de gel de filtración Reactivos Tampón de elución PBS pH 7,4 (NaCl 136mM, KCl 0,2g/l, Na2HPO4 1,44g/l y KH2PO4 0,24 g/l). Tampón de almacenamiento PBS pH 7,4, 0,1% NaN3 . Columna cromatográfica HR 10/30 (GE Healthcare). Matriz Superose 6B (GE Healthcare). Equipo de FPLC (GE Healthcare). Colector de fracciones (GE Healthcare). Tubos Centricon nº 10 (Amicon Inc. Beverly, MA, USA). Procedimiento La cromatografía en gel se utilizó para separar las lipoproteínas según su tamaño. La matriz de la columna está formada por pequeñas esferas porosas formadas por un polímero entrecruzado de agarosa, con poros de tamaño seleccionado para un rango de separación óptima de 5x103–5x106 de peso molecular. Esto permite la entrada de proteínas de un cierto tamaño las cuales son retenidas temporalmente, mientras que las moléculas mayores no pueden penetrar y son eluidas más rápidamente. La salida de las proteínas de la columna cromatográfica se detecta normalmente por absorción de la luz, a una longitud de onda de 280 nm. Debido a la composición de sus aminoácidos, las proteínas absorben dicha radiación y utilizando un espectrofotómetro se puede detectar las proteínas eluidas en la cromatografía. Los datos se registran en lo que se denomina diagrama de elución indicando la posición de las proteínas que se han separado. Después pueden realizarse estudios de actividad biológica, enzimática, etc. de las proteínas fraccionadas. 78 Calibrado de la columna Para calibrarla fue necesario el cálculo del volumen de vacío de la misma, volumen que rodea a las bolitas del gel y es el único accesible a las moléculas grandes o excluidas y el cálculo del volumen total accesible sólo para moléculas muy pequeñas y que sería la suma del volumen de vacío y del volumen del gel. Para ello se utilizaron azul dextrano (Pm 2.000.000) de Pm tan elevado que es excluido de la columna y ferricianuro potásico (Pm 329) que penetra en cualquiera de los poros del gel. Análisis del perfil lipoproteico Para analizar el perfil lipoproteico del plasma, se cargaron 100 μl de muestra procedente de un pool de los animales de cada grupo en la columna. La filtración se realizó con un volumen de flujo de 0,3 ml/min y se recogieron fracciones de 0,5 ml en un colector. El colesterol contenido en cada una de las fracciones lipoproteicas obtenidas se cuantificó según el método del apartado III.4.a o b pero utilizando un volumen de muestra de 100 μl ya que las muestras se habían diluido al pasarlas por la columna. Las fracciones fueron concentradas por centrifugación mediante tubos Centricon 10 anotándose el volumen final y cuantificándose la concentración proteica por el método de Bradford. 7. DETERMINACIÓN DE APO A-I Y APO A-IV Determinación de la concentración plasmática de apolipoproteínas mediante técnica de immunoenzimática (ELISA) Reactivos Tampón fosfato salino: PBS (pH 7,4) (NaCl 136mM, KCl 0,2g/l, Na2HPO4 1,44g/l y KH2PO4 0,24 g/l) Tampón de bicarbonato 0,2 M (pH 9,6) Tampón de dietanolamina al 10% en MgCl2 0,5mM (pH 9,8) TPBS: PBS con Tween 20 al 0,2% (pH 7,4) Solución de bloqueo: PBS con leche en polvo desnatada al 5% (pH 7,4) Placas de 96 pocillos de poliestireno MAXISORP (Nunc) Solución de revelado: p-nitrofenilfosfato al 0,1% en tampón de dietanolamina. Anticuerpos primarios: Inmunoglobulina anti apoA-I de ratón generada en conejo ref K23001R (Biodesign, Saco, ME), inmunoglobulina anti apoA-IV de ratón generada en cabra (Santa Cruz Biotechnology). Anticuerpos secundarios: Inmunoglobulina anti IgG de conejo unido a fosfatasa alcalina (Sigma), inmunoglobulina anti IgG de cabra unido a fosfatasa alcalina (Sigma) 79 Procedimiento Las diluciones del plasma total utilizadas para cada ensayo fueron las siguientes: DILUCIÓN MUESTRA AC PRIMARIO AC SECUNDARIO APOA-I 1/25.000 1/800 1/10.000 APOA-IV 1/20.000 1/500 1/5.000 Se dispusieron 100 μl de la muestra diluida en tampón bicarbonato por pocillo y se incubaron toda la noche a 4º C. Se invirtió la placa para eliminar la muestra no fijada y se añadieron 200 μl/pocillo de la disolución de bloqueo y se dejó agitando a temperatura ambiente durante 30 min. Posteriormente se hizo un lavado para eliminar el bloqueo. Se añadieron 200 μl/pocillo de TPBS dejándolo 5 minutos con agitación a temperatura ambiente repitiendo tres veces el proceso. Posteriormente se añadieron 200 μl por pocillo del anticuerpo correspondiente diluido en TPBS dejándolo actuar durante 1h 30 min a 37º C. Una vez terminada la incubación se realizó un lavado igual que el anterior. A continuación, se incubó con 200 μl/pocillo de anticuerpo secundario unido a fosfatasa alcalina diluido en TPBS durante 1h 30 min a 37º C. Una vez realizado el lavado se añadieron 200 μl/pocillo de la solución de revelado, preparado extemporáneamente, dejando que se formara color durante 30 min. Se detuvo la reacción añadiendo 50μl de NaOH 1M en cada pocillo y tras 10 min en agitación para estabilizar el color y permitir que desaparecieran las burbujas se midió la absorbancia a 430 nm utilizando el SPECTRAfluor Plus (Tecan). Aislamiento de RNA Reactivos Agua tratada con Dietilpirocarbonato (DEPC) 0,05% (v/v), dejar que actúe el DEPC durante una noche y posteriormente autoclavar durante 1 hora a 1 atmósfera. Tris/HCl 1 M (pH 8). Na2EDTA 0,5 M (pH 8.0). Solución de Etanol al 75%. 10xTBE: Tris base 0,9 M, EDTA 0,5 M (pH 8,0), ácido bórico 0,9 M. 1xTE (pH 8,0): Tris/HCl 10 mM, (pH 8), EDTA 1 mM (pH 8.0). Tampón de carga de RNA: Azul de Bromofenol 0,25% (p/v), Xileno de cianol 0,25% (p/v), Glicerol 50% (p/v) EDTA 1 mM. Reactivo de extracción de RNA: Tri-Reagent (Sigma). Cloroformo. Isopropanol. Procedimiento 80 Antes de comenzar la extracción de RNA, se debe esterilizar todo el material y trabajar con guantes para conseguir una atmósfera lo más limpia posible y libre de RNasas que degradarían el RNA. Las muestras de hígado se transportaron en viales dentro de nitrógeno líquido o nieve carbónica para evitar la degradación del RNA. Con unas pinzas estériles, se tomó una alícuota del tejido de aproximadamente 100 mg y se introdujo inmediatamente en un tubo de cristal o polipropileno estéril que contenía 1 ml del reactivo de extracción. Se homogeneizó inmediatamente y se dejó 5 minutos a temperatura ambiente, transfiriéndolo a continuación a un tubo tipo Eppendorf. A cada tubo se le añadieron 200 µl de cloroformo, se agitaron vigorosamente por inversión y se dejaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se centrifugaron durante 20 minutos a 13000 rpm y 4º C recogiéndose la fase superior acuosa en un nuevo tubo, a la que se le añadió 0,5 ml de isopropanol. Se mezcló bien y se dejó a temperatura ambiente durante 7 minutos, pasados los cuales se centrifugó 15 minutos a 13000 rpm y 4º C. Posteriormente, se eliminó con cuidado el sobrenadante y se lavó el precipitado con 1 ml de etanol al 75%, centrifugando de nuevo durante 5 minutos a 13000 rpm y 4º C para adherir el precipitado. Se decantó de nuevo el sobrenadante y se dejó secar el precipitado resuspendiéndolo después en 100 µl de agua tratada con DEPC. La concentración de RNA, se determinó midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro a 260 y 280 nm, de tal modo que la relación 260/280 debe ser superior a 1,7 para tener un RNA libre de proteínas. La concentración del RNA se calculó teniendo en cuenta que 1 A260= 40 µg/ml. La calidad del RNA se verificó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1% en 1xTBE con bromuro de etidio poniendo en cada pocillo 500 ng de la muestra. El resultado se visualizó en un transiluminador de UV. Las muestras se almacenaron a -70ºC. Cuantificación del RNAm por RT-qPCR Tratamiento con DNasa Mezcla de reacción (50ul) 1 μl de Turbo Dnase AMBION 0,1 volúmenes de Turbo Dnase Buffer (5 μl) 0,1 volúmenes de Dnase Inactivation Reagent (5 μl) Agua libre de RNasas Procedimiento Para eliminar el posible DNA genómico contaminante se trató el RNA con la enzima TURBO DNAse de AMBION (AMBION Inc. Austin, TX, USA). Para ello, el volumen 81 correspondiente a 5ug de RNA total, medido espectrofotométricamente, se completó con agua libre de RNasas hasta un volumen de 39 μl. Se añadió 1 μl de la Dnasa (TURBO DNAse) y 5 μl del buffer de reacción (TURBO DNAse buffer). La mezcla se agitó suavemente y se incubó a 37º C durante 30 minutos. La inactivación de la enzima se produjo añadiendo 5μl del inactivador obteniéndose un volumen final de 50 μl, se mezcló bien y se dejó incubar 2 minutos a temperatura ambiente agitando dos o tres veces durante el proceso. Tras la incubación se centrifugó la muestra a 10.000g durante 1,5 minutos, el sobrenadante que contenía el RNA limpio se transfirió a un tubo limpio con cuidado de no arrastrar restos del pellet donde se encuentra el inactivador ya que podrían interferir en posteriores reacciones enzimáticas. Retrotranscripción. Obtención de cDNA Mezcla de reacción inicial 1 μl Random primers 50ng/ul (Invitrogen). 1 μl dNTP mix 10mM (Invitrogen). Volumen correspondiente a 500ng de RNA limpio con el kit Turbo Dnase Free. Agua hasta un volumen final de 12 μl. Se incuba la mezcla a 65º C durante 5 minutos y se enfría inmediatamente en hielo. Se recoge el contenido del tubo por centrifugación y a continuación se añade la siguiente mezcla: Mezcla de reacción de retrotranscripción 4 μl 5X First-Strand Buffer (Tris-HCl 250 mM (pH 8,3 a temperatura ambiente), KCl 375 mM, MgCl2 15 mM) (Invitrogen). 2 μl 0,1 M DTT (Invitrogen). Se agita suavemente y se incuba a 25 º C durante 2 minutos y se añade la enzima retrotranscriptasa : 1 μl SuperScript™ II RT (200 U/μl). (Invitrogen). Se incuba a 25 º C 10 minutos, 42º C durante 50 minutos y finalmente se inactiva la reacción calentando a 70º C durante 15 minutos. Preparación de la reacción de Real Time PCR (PCR a tiempo real) Se utilizaron cantidades iguales de RNA /cDNA en el análisis cuantitativo por real time PCR. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando el kit comercial Platinum SYBRGreen qPCR Supermix–UDG (Invitrogen, Madrid, Spain) y se preparó la siguiente mezcla de reacción: 12,5 μl de Supermix UDG 0,5 μl de ROX (50x) 9 μl de agua estéril para uso en PCR 0,5 μl de primer directo 82 0,5 μl de primer reverso Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados fueron las siguientes: Apoa1-directo, 5´-GCT GAA CCT GAA TCT CCT GGAA-3´ Apoa1-reverso 5´-ACT AAC GGT TGA ACC CAG AGT GTC-3´; Apoa4-directo, 5´- ACCCTCTTCCAGGACAAACTTG -3´ Apoa4-reverso 5´- CCTTGGTTAGATGTCCACTCAGTTG -3´; Ciclofilina B directo, 5´- GGA GAT GGC ACA GGA GGAA-3´ Ciclofilina B reverso 5´-GTA GTG CTT CAG CTT GAA GTTCTC AT-3´ Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el termociclador ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA) siguiendo el protocolo estándar. La cantidad relativa de todos los RNAms se calculó usando el método comparativo 2Δ Δ Ct . La ciclofilina B se utilizó como control interno de referencia. 8. ENSAYOS DE OXIDACIÓN DE LIPOPROTEÍNAS (DCF) Se estudió la capacidad de las HDL de prevenir la formación e inactivar fosfolípidos oxidados mediante el método de la diclorofluoresceína. Es un método rápido que no precisa cultivos celulares para analizar la capacidad de HDL para prevenir la formación o inactivar fosfolípidos oxidados. El compuesto diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceina (DCF) (Sigma) emite fluorescencia al reaccionar con especies reactivas del oxígeno. En este ensayo un sustrato oxidable (LDL) es incubada junto con DCF y transcurrido un tiempo se mide la fluorescencia que la oxidación de las LDL ha producido sobre el DCF. Las HDL al evitar la oxidación de la LDL evitan también la aparición de la fluorescencia, pudiendo medir así su capacidad antioxidante. Reactivos y procedimiento: diclorofluoresceína, 25 µg palmitiol, araquidonil-fosfatidil colina (Avanti), 1 µg de ácido hidroxiperoxioctadecadienoico (Cayman) se mezclan con 25 µl de HDL preparadas por FPLC. Se incuban a temperatura ambiente durante 8 horas en la oscuridad. La lectura de fluorescencia se lee con excitación a 485 nm y la emisión se recoge a 530 nm. El ensayo se realizó en microplacas de fluorímetro negras (Nunc) con 3 µg de apoB de LDL, 2 nmoles de fosfolípidos de HDL y 2 µg de DCF por pocillo en salino con 0,02% de azida en un volumen final de 150 µL. Después de un tiempo de incubación de 3 h a 37ºC se midió la fluorescencia con λ de excitación de 485 nm y λ de emisión de 530 nm. 83 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se estudiaron las diferencias en los valores medios obtenidos a lo largo de las mediciones efectuadas en las semanas 10, 14 y 19 o al final en las variables analizadas. Se obtuvieron en primer lugar los estadísticos descriptivos: la media, como índice de tendencia central por tratarse de variables cuantitativas; la desviación típica, como índice de variabilidad o de dispersión; el error típico de estimación del estadístico; el valor mínimo y el valor máximo. Para el análisis comparativo, inicialmente se decidió, tras comprobar el supuesto de homogeneidad de las varianzas necesario para la aplicación de métodos paramétricos de contraste de medias, realizar un ANOVA para muestras independientes de un solo factor y de efectos fijos para cada una de las variables medidas. Después, utilizando la prueba post-hoc de Tamhane de comparaciones múltiples sin asumir el supuesto de homogeneidad de las muestras, averiguar entre qué grupos se daban estas diferencias cuando las hubiera. Dado que en la prueba de homogeneidad de varianzas realizada sólo unas pocas de las variables del estudio cumplían dicho supuesto, se decidió utilizar los estadísticos robustos de igualdad de medias para el análisis comparativo, en concreto el test de Brown-Forsythe. Estos análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa SPSS15 (SPSS Inc.) para PC. 84 85 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 86 93 obesidad. Dicho de otra forma, la encontramos en la progresión hacia la severidad en todos los componentes del síndrome metabólico 205 . La microalbuminuria (MAU), hecho más precoz, se relaciona con la disfunción endotelial, punto crítico y precoz en el desarrollo de enfermedad cardiovascular. Estos cambios microvasculares pueden ser reversibles, y la microalbuminuria puede regresar con el control de la hipertensión y la obesidad/diabetes. En caso contrario, la microalbuminuria y el desarrollo progresivo de arteriosclerosis lleva a cambios estructurales, enfermedad macrovascular, albuminuria, y pérdida de función renal. Se podría considerar que la MAU es una señal que da el riñón sobre la presencia de alteraciones en la función endotelial (aumento de permeabilidad; alteración de la respuesta vascular), la predisposición a la arteriosclerosis generalizada y el riesgo cardiovascular que ello conlleva. Actualmente la MAU se considera un factor predictor de enfermedad y mortalidad cardiovasculares 206,207 independientemente de otros factores de riesgo cardiovasculares clásicos y de la función renal 208,209 . En nuestro estudio, y valorando la albuminuria como marcador de daño vascular, podemos considerar que estos resultados son esperables ya que los grupos de ratas obesas y diabéticas sin ningún tipo de intervención terapéutica tienen pérdidas mayores durante el seguimiento y ya desde las primeras semanas: - Los grupos SD y Z muestran menor incremento de albuminuria que los ZDF de los grupos no tratados ni con dieta ni con agonistas PPAR. Entre ellos, aunque con diferencias pequeñas, parece que el grupo de ratas obesas, pierde algo más de albúmina en orina. Quizá con más tiempo de evolución estas diferencias se vieran más grandes. - Las ratas ZDF poseen un fenotipo realmente proaterogénico y con predisposición al daño vascular precoz/microvascular 210 , así que los resultados de los grupos no tratados, V y C son los esperados, con incrementos significativamente mayores. - El Telmisartán es un potente fármaco antiproteinúrico y protector renal 211 , de ahí las diferencias significativas. Interesante remarcar, sobretodo, la precocidad con la que se observan estos cambios. - El grupo ZDFD se comporta de una forma similar a ZDFT aunque sin alcanzar la significación estadística. Parece que una dieta hipocalórica puede proteger o enlentecer la progresión de la enfermedad vascular precoz. 94 Kasike y colaboradores 212 estudiaron la función y la estructura renal en ratas Zücker obesas. Se basaban en experimentos previos en los que se observaba que la hiperfagia y la obesidad de ese tipo de ratas se asociaban con glomeruloesclerosis espontánea focal (FGS). El grupo de ratas obesas, frente a un grupo control de ratas delgadas desarrollaban expansión de la matriz mesangial glomerular a las 14 semanas de edad, independientemente del clearance de inulina y la fracción de filtración renal normales. A las 28 semanas de edad la FGS era evidente en 7 de 8 ratas, y todas, mostraban marcada FGS a las 68 semanas de estudio. Demostraban que la albuminuria y la expansión de la matriz mesangial precedían el desarrollo de FGS. El mismo grupo, unos años después, investigó el papel del metabolismo lipídico en el desarrollo de albuminuria y FGS precoz en ratas Zücker, mediante la administración de tratamiento hipolipemiante con dos fármacos diferentes (mevinolina, y ácido clofíbrico) 213 . Los grupos de tratamiento hipolipemiante redujeron el colesterol en ayunas (sólo la mevinolina redujo también los triglicéridos), y también la excreción de albúmina en orina frente al grupo vehículo. En estos grupos de intervención farmacológica se observaba una reducción de la albuminuria y de la expansión de la matriz mesangial y la celularidad. Además el porcentaje de FGS fue significativamente menor que en el grupo vehículo. Los resultados indicaban que un metabolismo lipídico anormal era importante en la patogénesis de la albuminuria y la FGS. Para investigar el efecto de la obesidad, la hiperinsulinemia, y la resistencia a la insulina en la barrera de filtración glomerular y el potencial efecto protector de las estatinas, WhaleyConnell y colaboradores diseñaron un experimento con ratas Zücker obesas y otras delgadas a las que se les administraba rosuvastatina o placebo durante 3 semanas 214 . Estudios en animales y en humanos señalan los efectos beneficiosos de las estatinas en la reducción de la albuminuria y sobre la progresión de la enfermedad renal crónica, por sus efectos hipolipemiantes así como reduciendo la inflamación y el estrés oxidativo a nivel glomerular 215 . Observaron un aumento importante de la glucemia y los niveles de insulina en los grupos de ratas obesas frente a las delgadas, sin que las obesas tratadas con el fármaco mostraran reducción en ninguno de los parámetros. Tampoco el peso de las obesas con o sin tratamiento difería significativamente. Analizaron la barrera de filtración mediante microscopía electrónica, y estudiaron su funcionalidad mediante la cuantificación de albuminuria. Observaron un incremento sustancial del ratio albúmina/creatinina en el grupo de ratas obesas no tratadas, frente a las tratadas con rosuvastatina, y también, en ambos grupos, frente a las Zücker delgadas. Los niveles bajos de β-N-acetylglucosaminidasa marcaban el origen de la albuminuria en la barrera de filtración y 95 no en el túbulo proximal. Observaron también la alta correlación de la insulinemia con la albuminuria, no así con la glucemia. No encontraron diferencias en el grosor de la membrana basal glomerular entre los controles obesos y delgados, aunque sí con el grupo de las obesas con fármaco, que mostraban un grosor significativamente menor. Observaron también un aumento de la amplitud de la base de los podocitos en las obesas control frente a las delgadas, y una tendencia hacia la disminución en el grupo de obesas con rosuvastatina, que se correlacionaba con la albuminuria y la insulinemia. Los resultados de este estudio sugieren un papel importante de la hiperinsulinemia y el estrés oxidativo en la patogenia del daño de podocitos/barrera de filtración y la albuminuria, independientemente de la hipertensión, demostrando la importancia de una actuación hipolipemiante, en este caso con estatinas. El efecto beneficioso de la dieta hipocalórica en nuestras ratas ZDF (que además de obesas son diabéticas) sobre la hiperlipidemia/dislipemia lo podríamos interpretar en este sentido. En el estudio de Buckingham y colaboradores donde se administraba un fármaco antidiabético del grupo de las tiazolidinedionas con actividad PPARγ (Rosiglitazona) 216 , la administración del fármaco retrasaba la aparición de proteinuria de los 3 a los 6 meses en el grupo prevención, y reducía la tasa de progresión de la misma en ambos grupos (prevención y tratamiento) una vez se establecía. La albuminuria tenía resultados superponibles. En el estudio histológico de los riñones y el páncreas del grupo prevención se observó la ausencia de glomeruloesclerosis focal, así como de hiperplasia de los islotes pancreáticos; ambos, hallazgos prominentes en el grupo Zücker obeso control. En el grupo tratamiento, los cambios morfológicos eran intermedios. Los mecanismos por los que la Rosiglitazona protegía frente al daño glomerular, y una vez establecido retrasaba su progresión, pudieran estar en relación con su actividad PPARγ, la mejora de la sensibilidad a la insulina, los efectos hipolipemiantes y el aumento de la disponibilidad de ácidos grasos en la membrana celular. Numerosos estudios epidemiológicos han mostrado la gran interrelación patológica y las complicaciones del fallo cardiorenal en población con diabetes tipo II 217 . Baynes y Murray investigaron la relación temporal entre la enfermedad cardiaca y la renal en el modelo de obesidad-diabetes de las ratas ZDF, para valorar el impacto del inicio de cada una de las enfermedades en la otra 218 . 96 En el grupo de las ratas obesas, observaron que la excreción de albúmina en orina aumentaba de forma muy marcada a partir de las 24 semanas de edad, mientras que los niveles de creatinina en orina disminuían significativamente desde el inicio del estudio frente al grupo de delgadas, posiblemente por el efecto dilutorio (el consumo de agua y el volumen de orina era superior). La ratio albúmina/creatinina, un indicador de microalbuminuria, se mantenía constante en las delgadas pero se incrementaba significativamente a partir de las 10 semanas en las obesas y diabéticas. En nuestro estudio, también las ratas sin intervención (grupos vehículo y control) muestran incrementos progresivos de albuminuria en orina muy superiores que las ratas delgadas del grupo SD y que las Zücker que no son diabéticas. Coimbra, y colaboradores 219 estudiaron la evolución de los cambios bioquímicos y morfológicos que conducían al fallo renal en la diabetes tipo II y que precedían a la proteinuria manifiesta, la glomerulosclerosis y el daño tubulointersticial en ZDF. Inicialmente las diferencias de peso eran significativas (mayor en las obesas), y en su caso, se mantenían así durante todo el estudio. El aumento de peso era progresivo y paralelo a la hiperinsulinemia y a la hiperlipemia (principalmente a expensas de un incremento de los triglicéridos en plasma y del colesterol asociado a las HDL) del grupo obeso, que ya mostraban diferencias significativas con el grupo delgado desde el principio. La hiperglucemia se desarrollaba a partir de las 14 semanas de edad en las ratas fa/fa. Hasta las 60 semanas de edad las lecturas de tensión arterial de ambos grupos eran comparables y se mantuvieron en el rango de la normalidad. La función renal, medida como concentración de creatinina y de urea en plasma se mantuvo normal hasta la semana 40. Se observó un progresivo aumento de la proteinuria en las ratas obesas, significativamente superior a los controles delgados, sobretodo a partir de la semana 18. La enfermedad renal progresiva de las ratas obesas y diabéticas se caracterizaba por un daño precoz a los podocitos seguido de la infiltración glomerular de leucocitos, de daño tubulointersticial y de hipertrofia glomerular por depósito de fibronectina y colágeno, sin todavía proliferación celular mesangial, que formaría parte, entre otros procesos, de la vía común más tardía de enfermedad renal por otras causas. Sobre la patogenia que llevaba al daño inicial de los podocitos, proponían un mecanismo combinado entre la hiperinsulinemia y la hiperlipidemia. El mismo grupo, había observado que la rata hiperinsulinémica GK (Goto-Kakizaki) con diabetes tipo II no desarrollaba glomerulosclerosis ni albuminuria pero sí daño a nivel de podocitos 220 . El exceso de insulina precisaba de otro estímulo para el daño en podocitos y fallo 97 renal en las ratas fa/fa, que sugerían era la hiperlipidemia. Se había descrito para entonces que, in vivo las hipercolesterolemia en ratas se asociaba a glomerulosclerosis; la hipertrigliceridemia aislada, a albuminuria, daño podocitario y glomerulosclerosis; y que la reducción de hiperlipidemia con intervenciones dietéticas o con fármacos reducía la glomerulosclerosis 221 . También en nuestro estudio, los dos grupos de ratas obesas y diabéticas sometidas a tratamiento con Telmisartán o con dieta, muestran niveles significativamente inferiores de albuminuria. Si bien no disponemos de un estudio morfológico de los glomérulos de estos animales que confirme el incipiente daño podocitario, otros lo han hecho, con el mismo tipo de animales en condiciones similares, y los resultados de albuminuria de sus ratas concuerdan con los de nuestros grupos control y vehículo. El efecto de la dieta en comparación con el vehículo/control es paralelo al de variables como los triglicéridos y colesterol, remarcando la importancia del metabolismo lipídico en la aparición de albuminuria. El efecto del Telmisartán podría estar en relación tanto con su actividad sobre el sistema angiotensina-aldosterona, como por su actividad PPARγ y la modulación del metabolismo de los ácidos grasos. Observamos una correlación moderadamente positiva entre triglicéridos e incremento de albuminuria (r= 0,52 p<0,05) y ligeramente positiva entre colesterol total e incremento de albuminuria (r= 0,32 p<0,05), como se muestra en las gráficas. Figura 19. Análisis de asociación entre diversos parámetros COLESTEROL 12,5010,007,505,002,500,00 Diferencia Albuminuria diaria 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 -100,00 Sq r lineal = 0,1 TRIGLICERIDOS 2500,002000,001500,001000,00500,000,00 Diferencia Albuminuria diaria 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 -100,00 Sq r lineal = 0,267 98 SEGUIMIENTO DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE GLUCOSA EN LOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTALES Figura 20. Incremento de la glucemia media RATA ZDFDZDFCZDFVZDFTZSD Media de Diferencia Glucemias 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 213,88 307,25 416,67 218,60 38,40 9,60 Tabla 10. Comparación del incremento de glucemia media N Media Desviación típica Mínimo Máximo SD 5 9,6 36,5 -34,0 53,0 Z 5 38,4 71,7 -28,0 154,0 ZDFT 5 218,6 a 121,5 110,0 413,0 ZDFV 6 416,7 a,b 103,5 229,0 540,0 ZDFC 4 307,5 a,b 83,9 211,0 402,0 rZDFD 8 213,8 a 130,2 71,0 368,0 Diferencia Glucemias Total 33 205,3 169,6 -34,0 540,0 Los datos se muestran como medias (mg/dL ), desviación típica y valores mínimo y máximo. Se utilizó el test de Brown-Forsythe como prueba robusta de igualdad de varianzas y la prueba post-hoc de Tamhane de comparaciones múltiples. Existen diferencias significativas en función de los distintos tratamientos, p< 0.05 ( a versus SD, b versus Z) El incremento de glucemias en el grupo SD es significativamente inferior al incremento en ZDFV. También el incremento de glucemias en el grupo Z es significativamente inferior a ZDFV, aunque ya no a los grupos intervención. Por su parte, en los grupos de ratas obesas y 99 diabéticas no existen diferencias entre los incrementos de ZDFT, ZDFV, ZDFC y ZDFC a lo largo de las 19 semanas aunque sí valores más elevados en aquellos animales que reciben vehículo o simplemente son controles. Los cambios que se producen entre los grupos ZDF, en concreto ZDFT y ZDFD con ZDFV, no son estadísticamente significativos, pero sí que muestran una tendencia a la diferencia: las ratas desarrollan diferentes grados de hiperglucemia en función de la dieta que reciben, y el Telmisartán parece que puede proteger de ello. Clark y colaboradores fueron los primeros en obtener una línea de ratas diabéticas no insulindependientes a partir de una colonia de ratas Zücker obesas en 1980 en la Universidad de Indiana. La rata Zücker obesa (fa/fa) se debe a un gen recesivo autonómico, y está caracterizada por ser hiperinsulinémica pero euglucémica. Se realizaron determinaciones de glucemia a dos ratas macho Zücker que observaron que orinaban excesivamente. Tenían una glucemia en ayuno de 544 mg/dL y 474 mg/dL, que disminuyó en 3 semanas con dieta restrictiva (únicamente 15g/día) a 184 mg/dL y 175 mg/dL, respectivamente 222 . Además de la incidencia de diabetes en la descendencia de las Zücker obesas (observaron que en caso de que se tratara de un rasgo monogénico, no estaba ligado al gen fa y se comportaba como dominante) estudiaron en plasma y posteriormente en tejido (hígado, páncreas y músculo) el comportamiento de la glucosa y la insulina con sobrecargas orales de glucosa; así como ácidos grasos, colesterol y triglicéridos; comparando grupos de ratas obesas diabéticas con y sin restricción dietética, frente a otras ratas únicamente obesas y otras delgadas. Observaron que los animales diabéticos eran siempre obesos y típicamente con una edad de aparición de hiperglucemia en ayuno de 6 meses (hecho que se observa de forma mucho más precoz en nuestro experimento y en otros previos). Los niveles plasmáticos basales de insulina de los animales diabéticos estaban tan elevados como los de los obesos no diabéticos y euglucémicos (y ambos superiores a las ratas delgadas). Sin embargo, los test de tolerancia a la glucosa mostraron que los animales obesos y diabéticos no experimentaban un marcado aumento de niveles de insulina en plasma en respuesta a la carga oral de glucosa; indicando un estado mayor de resistencia a la acción de la hormona a nivel tisular. En el estudio de los tejidos, observaron que las ratas obesas tenían un contenido de insulina pancreática hasta 5 veces superior que las obesas diabéticas, con concentraciones similares a las delgadas. Así, además de una sensibilidad tisular a la insulina disminuida, su capacidad secretora de insulina también era menor, como ocurre en la diabetes tipo II en humanos. Como se especifica en la ficha del suministrador, las ZDF macho (nuestro modelo) desarrollan hiperglucemia alrededor de las 7 semanas de vida con la dieta adecuada. Leonard y 100 colaboradores 223 describieron las alteraciones metabólicas del estado de resistencia a la insulina en ratas Zücker diabéticas frente a un fenotipo delgado, usando el método de la “pinza hiperinsulinemia-euglucemia”. Las ZDF, precisaban un 89% menos de glucosa infundida para mantener la los valores normales de glucosa en plasma. También mostraban una captación de glucosa mediada por insulina en músculo esquelético significativamente menor. Así la cantidad de glucógeno en músculo esquelético y cardiaco era significativamente menor, aunque al revés en hígado, en comparación con el grupo de ratas delgadas. El estudio fue realizado con ratas de 10 semanas de edad y claramente mostraba la resistencia a la insulina de las ZDF para entonces, dada la menor o nula capacidad de la insulina para estimular el uso y almacenamiento de la glucosa, aunque el desarrollo de hiperglucemia siempre es posterior. La hiperglucemia de las ZDF fa/fa (no las cepas salvajes) se inicia sobre las 7 semanas de vida, y son completamente diabéticas entre la 10 y la 12 a medida que los niveles de insulina descienden. Ohneda y colaboradores 200 estudiaron el impacto que tenía la dieta no controlada en el desarrollo de diabetes en animales predispuestos, ZDF fa/fa, frente a delgados. Observaron que, las ZDF controles desarrollaban hiperglucemia, poliuria y glucosuria a las 8 semanas de edad, mientras que el grupo de ratas en tratamiento dietético se mantenían euglucémicas durante los 3 meses de seguimiento. Así, en las ratas control la estimulación de secreción de insulina era nula a las 12 semanas de edad y la cantidad de células beta pancreáticas GLUT-2 positivas había descendido un 30%. Por el contrario la restricción dietética durante 3 meses previno la pérdida de secreción de insulina estimulada por glucosa y la reducción de células beta pancreáticas GLUT-2 positivas. Concluyen los autores, que en las ratas ZDF, la incompetencia de las células beta y su reducción en número coinciden con la aparición de la hiperglucemia, y que las alteraciones metabólicas descritas, en su caso, ocurrían sólo cuando la ingesta calórica es excesiva (a pesar de ser un modelo de obesidad genética con tendencia a la diabetes). Corsetti y colaboradores 224 estudiaron el efecto de la cantidad de grasa de la dieta, en concentraciones crecientes, en el desarrollo de diabetes no insulinodependiente, dislipidemia, y alteraciones de marcadores séricos de disfunción orgánica en ratas ZDF obesas machos y hembras). Las ratas macho, incluso alimentadas con dietas con bajo contenido en grasa, desarrollaron diabetes, pero el proceso se mostraba mucho más acelerado en función del contenido de grasa de la dieta (hiperglucemia marcada y ya estadísticamente significativa a 101 partir de las 13 semanas entre los grupos alimentados con un 12,3 Kcal% de grasa y un 25,9 Kcal%). Las hembras por su parte, sólo desarrollaban hiperglucemia con dietas marcadamente lipídicas (48 Kcal%) –de una forma rápida y glucemias muy elevadas-, e hiperglucemia moderada a partir de las 9 semanas con la dieta 25,9 Kcal%. Por tanto en ZDF ratas machos como hembras la hiperglucemia y la progresión hacia la diabetes están en función del contenido en grasa de la dieta aunque de formas diferentes. También el incremento de la glucemia de nuestro grupo de ZDF con dieta hipocalórica (30%) es casi la mitad del que observamos para el grupo vehículo y control, aunque todavía muy superior a los que muestran las ratas no diabéticas delgadas y obesas. El mismo efecto que tiene la dieta hipocalórica parece que se observa en el grupo de ratas en tratamiento con Telmisartán. Brown y colaboradores 225 estudiaron el efecto del tratamiento con diferentes agonistas PPARγ (el compuesto GW1929 –agonista selectivo PPARγ - y una tiazolidinediona) sobre varios parámetros metabólicos (glucemia y hemoglobina glicosilada, ácidos grasos, triglicéridos, etc.), la sensibilidad a la acción de la insulina y sobre la estructura pancreática en ratas ZDF. EL agonista selectivo se mostró más potente que la tiazolidinediona. La administración de GW1929 durante 14 días consiguió un descenso significativo de la glucosa plasmática en ayunas en todos aquellos animales que recibían la dosis de 5 mg/Kg, en el 75% de los que recibían 1 mg/Kg, y en el 37.5% de los que recibían dosis de 0.5 mg/Kg. También la hemoglobina glicosilada HbA1 descendía significativamente comparándola con el grupo vehículo control. Tras dos semanas de tratamiento los niveles endógenos de insulina descendían significativamente (entre un 40 y un 70%) frente a los valores pretratamiento debido al fallo pancreático progresivo dependiente de la edad característico de las ratas ZDF. Al finalizar el periodo de tratamiento los niveles séricos de insulina de los grupos dosificados con 1 y 5 mg/Kg de GW1929 no eran significativamente diferentes del grupo vehículo; sin embargo la glucemia y la concentración de ácidos grasos eran inferiores. A pesar de niveles circulantes similares de insulina plasmática en ayuno, los animales que recibían tratamiento con el fármaco experimental agonista PPARγ, tenían una glucemia diaria más normalizada tal y como indicaban unos niveles de hemoglobina glicosilada significativamente inferiores al grupo vehículo. La sensibilidad tisular a la insulina, medida mediante la técnica de la “pinza euglucémica-hiperinsulinémica”, mostraba que los animales tratados con la dosis de 5mg/Kg de GW1929 eran significativamente más sensibles a la acción de la insulina que las ratas 102 tratadas con vehículo. El estudio funcional e histológico de los páncreas perfundidos demostró la preservación de la función de las células beta en las ratas ZDF tratadas con GW1929, así como de la morfología de los islotes pancreáticos. En nuestro estudio, el estado de resistencia a la insulina de las ratas Zücker obesas y diabéticas, seguidas durante 19 semanas explica las diferencias entre los grupos no diabéticos (SD y Z) y los diabéticos. Aunque sin diferencias significativas entre los grupos ZDF (son grupos pequeños), la tendencia de las ratas tratadas con dieta o con Telmisartán es clara frente a las ratas tratadas con vehículo o simplemente control, ya que estas muestran glucemias muy superiores. Esta observación está en consonancia con los resultados de los estudios previos mencionados, bien por el efecto de la reducción de la ingesta calórica, bien por el efecto que el agonista selectivo de PPARγ, Telmisartán, pueda tener sobre la sensibilidad a la acción de la insulina en tejidos. 109 concentración de colesterol total a cifras similares a las del grupo de ratas delgadas. También en el trabajo de Clark y Palmer el grupo de ratas ZDF con dieta restrictiva mostraba niveles de colesterol y triglicéridos muy inferiores a las obesas (no había grupo ZDF control), aunque ligeramente superiores a las ratas delgadas, como en nuestro caso. La concentración de colesterol total en el plasma de las ratas del estudio de Corsetti y colaboradores 224 aumentaba progresivamente a lo largo de las 19 semanas de estudio, más cuanto mayor era el contenido en grasa de la dieta, de una forma paralela a la disminución de insulina y el desarrollo de hiperglucemia. Mientras, los triglicéridos se mantenían constantes hasta la semana 19, cuando aumentaban de forma brusca, también más cuanto mayor era el contenido en grasa. Ya hemos visto cómo la respuesta a la dieta rica en aceite de pescado fue una disminución de la concentración de triglicéridos, pero sin embargo, ocurría lo contrario con el colesterol, que ya basalmente mostraba una concentración dos veces superior que el grupo de ratas delgadas, y además aumentaba en el grupo de ratas obesas que recibían ese tipo de dieta. En nuestro caso la dieta es hipocalórica sin cambiar el tipo de grasa con respecto a la dieta basal, sólo su cantidad. El hecho que el resultado del grupo de Telmisartán no sea significativo respecto a la dieta, puede ser efecto del fármaco pero no podemos decir en qué sentido. Parece que la tendencia es a que se comporte como los grupos Z y ZDFV, pero no sabemos si en grupos más grandes de ratas y/o de mayor edad podría tener efecto hipolipemiante con respecto al colesterol total. La adición de un agonista PPARγ como la Rosiglitazona desde las 6 semanas de edad (grupo prevención) a las ratas obesas diabéticas hacía disminuir de forma significativa las concentraciones de triglicéridos y colesterol analizadas a las 31 semanas frente a los grupos de ratas control y tratamiento (este recibía Rosiglitazona a partir de las 24 semanas de edad) 216 . El descenso de la concentración de colesterol del grupo prevención, fue significativo pero todavía persistía más elevado que en el grupo de ratas delgadas. En nuestro caso, no podemos asegurar que Telmisartán tenga efecto nulo como ocurría para los Triglicéridos, o si bien, como otros agonistas PPARγ, reduce el colesterol si el tratamiento se prolonga durante más tiempo. 110 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE HDL-COLESTEROL EN LOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTALES Figura 24. Concentración plasmática de HDL-colesterol RATA ZDFDZDFCZDFVZDFTZSD Media de HDL_PLASMA 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0,317 0,717 0,487 0,926 0,088 Tabla 13. Comparación de la concentración plasmática de HDL-colesterol N Media Desviación típica Mínimo Máximo SD 5 ,08 ,087 ,03 ,24 Z 5 ,92 a ,26 ,54 1,27 ZDFT 8 ,48 a ,19 ,14 ,72 ZDFV 8 ,71 a ,40 ,14 1,37 ZDFD 8 ,31 a ,074 ,24 ,45 HDL_PLASMA Total 34 ,50 ,35 ,03 1,37 Los datos se muestran como medias (mmol/L), desviación típica y valores mínimo y máximo. Se utilizó el test de Brown-Forsythe como prueba robusta de igualdad de varianzas y la prueba post-hoc de Tamhane de comparaciones múltiples. Existen diferencias significativas en la concentración plasmática de HDL-colesterol en función de los distintos tratamientos, p< 0.05 ( a versus SD) Era de esperar que esta variable fuese muy similar a la del colesterol total, teniendo en cuenta que en ratas, la mayoría del colesterol en plasma se transporta en partículas de HDL. Así el grupo SD muestra la concentración menor con diferencias significativas respecto al resto, 111 y el grupo de las ZDF que recibe una dieta hipocalórica experimenta un descenso importante de HDL-colesterol comparado con los grupos de ratas obesas y obesas-diabéticas que se alimentan sin restricciones. El grupo de Telmisartán parece que se asemeja más al de la dieta que en las variables Triglicéridos y colesterol, como por otra parte era de esperar inicialmente. Sparks y colaboradores 229 estudiaron los anomalías en los parámetros lipídicos, lipoproteínas y apoproteínas en ratas ZDF de forma basal, en dos momentos de la evolución de la diabetes como ocurre en humanos (a las 10 semanas – hiperglucemia e hiperinsulinemiay a las 20 semanas – hiperglucemia insulinopénica-), y también tras tratamiento con insulina, en dos estudios diferentes. Al igual que otros, observaron que a lo largo de la evolución de la diabetes asociada a la obesidad (hacia la hiperglucemia franca y la disminución progresiva de insulina) aumentaba la concentración de todos los parámetros lipídicos y apoproteínas, con cambios en las composiciones relativas de las diferentes fracciones lipoproteicas. Existía un marcado aumento de los triglicéridos desde el inicio y tanto los ácidos grasos como el colesterol sérico se incrementaban principalmente a partir de la semana 10 de edad frente a un grupo control de ratas delgadas. A las 10 semanas, LDL y HDL eran similares en ambos grupos, con un aumento significativo a partir de entonces en las ratas obesas y diabéticas, mientras que la fracción VLDL ya se encontraba significativamente elevada en la semana 10. Así, la hiperlipemia de la fase hiperinsulinémica de las ratas ZDF era debida predominantemente a cambios en las lipoproteínas ricas en Triglicéridos (VLDL) con ligeros cambios en el resto de fracciones, y el aumento de las LDL y HDL se producía en la fase insulinopénica de los animales de 20 semanas, a expensas de un aumento del colesterol asociado a estas lipoproteínas. En nuestro caso, el análisis en la semana 19, muestra esto en las ratas que no reciben ningún tipo de intervención, un marcado incremento de HDL-colesterol frente a ratas delgadas. La disminución en el grupo de intervención con dieta hipolipemiante va en consonancia con los resultados previos de colesterol total; a menor contenido en grasa de la dieta, menor es la cantidad de colesterol y HDL-colesterol en plasma. 112 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE ÁCIDOS GRASOS NO ESTERIFICADOS (NEFA) EN LOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTALES Figura 25. Concentración plasmática de NEFA RATA ZDFDZDFCZDFVZDFTZSD Media de NEFA_ 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 44,19 42,41 37,46 39,16 25,24 Tabla 14. Comparación de la concentración de NEFA plasmáticos N Media Desviación típica Mínimo Máximo SD 5 25,24 3,24 21,95 29,75 Z 5 39,15 8,27 30,08 49,01 ZDFT 8 37,45 16,72 15,24 62,04 ZDFV 8 42,41 20,01 14,18 65,14 ZDFD 8 44,19 6,15 35,52 52,16 NEFA_ Total 34 38,66 14,15 14,18 65,14 Los datos se muestran como medias (mg/dL), desviación típica y valores mínimo y máximo. Se utilizó el test de Brown-Forsythe como prueba robusta de igualdad de varianzas y la prueba post-hoc de Tamhane de comparaciones múltiples. No existen diferencias significativas en la concentración plasmática de ácidos grasos no esterificados (NEFA) en función de los distintos tratamientos. Las ratas obesas Zücker, diabéticas o no, presentan niveles más elevados de NEFA en plasma, independientemente de dieta o tratamiento farmacológico, que el grupo de ratas delgadas. Quizá era de esperar que las ratas diabéticas y obesas tuvieran niveles superiores a 113 las que sólo son obesas dada la estrecha relación entre NEFA y resistencia a la insulina. También, que la dieta tuviera un efecto más evidente sobre la concentración de NEFA. El grupo de intervención farmacológica con Telmisartán parece que sí muestra una tendencia hacia una ligera disminución de la concentración de NEFA, como en el estudio de Benson y colaboradores. Los niveles basales de ácidos grasos en plasma de ratas Zücker obesas y diabéticas en el estudio de Leonard y colaboradores 223 eran superiores a los del grupo control de ratas delgadas. Durante la infusión de insulina y glucosa se producía un descenso significativo de los NEFA en el grupo de las delgadas y sin embargo se mantenían constantes sin apenas cambios en el grupo de las ZDF. El incremento de NEFA plasmáticos basales es uno de los factores que disminuyen la acción de la insulina y la captación tisular periférica de glucosa por el músculo, así como la tasa de extracción de glucosa hepática 230 . La ausencia de modificación de la concentración de NEFA en el grupo de obesas diabéticas durante la infusión glucosa/insulina refleja la incapacidad de la insulina para suprimir la lipólisis del tejido adiposo. En el estudio de Clark y colaboradores 222 , la concentración de ácidos grasos en plasma era significativamente superior en los grupos de obesas y obesas-diabéticas con dieta frente a los grupos delgadas y obesas con dieta. En tejido hepático, sin embargo, no se observaban esas diferencias y los grupos mostraban concentraciones de ácidos grasos similares. No se hizo ningún grupo de seguimiento de ratas obesas y diabéticas sin intervención dietética bien como control o con vehículo. En ambos estudios se cumple que el grupo de ratas delgadas (si bien no eran ratas Sprague-Dawley) muestra concentraciones en plasma y en tejido inferiores a los grupos de obesas y diabéticas, tanto de forma basal como tras estimulación con glucosa e insulina. En el grupo de sólo obesidad del experimento de Clark, la dieta reduce significativamente la concentración de NEFA, mientras que en las obesas que además padecen diabetes no tiene ese efecto (aunque no podemos comparar con un grupo ZDF sin dieta). También en nuestro estudio la concentración de ácidos grasos es menor en las delgadas, y parece que la dieta tiene un efecto nulo sobre la cantidad de NEFA circulantes en las ratas obesas diabéticas. 114 En el estudio de Upton y colaboradores 201 , las ratas Zücker obesas y diabéticas, así como las Zücker obesas, en tratamiento durante 3 semanas con una tiazolidinediona (MC-555) experimentaron una significativa mejoría de su sensibilidad a la insulina. La concentración de NEFA disminuyó significativamente en ambos grupos y en el grupo de las obesas, incluso los redujo por debajo de los valores plasmáticos basales de las ratas delgadas tratadas con vehículo. Este efecto hipolipemiante estaba en relación con la acción del fármaco sobre PPARγ, incrementando la expresión de genes que codifican enzimas reguladoras de la lipólisis en el tejido adiposo. El grupo de Oakes diseñó un estudio dinámico del metabolismo lipídico 231 . Utilizaron ratas delgadas, obesas, y obesas en tratamiento con dos fármacos con efecto PPARγ (rosiglitazona a dosis de 1 o 10 umol/Kg/dia; y darglitazona con una potencia similar a dosis altas de la rosiglitazona). Estudiaron la producción de VLDL/triglicéridos en el hígado, su aclaramiento, y la movilización y el destino de los ácidos grasos del plasma. En las ratas obesas sin tratamiento se observaba mayor disponibilidad sistémica de ácidos grasos, con niveles en plasma más elevados y mayor tasa de movilización que en el grupo de ratas delgadas. A diferencia de otros, el tratamiento con tiazolidinedionas incrementó esa disponibilidad de ácidos grasos, principalmente a expensas de una mayor movilización. Las TZD aumentaban el aclaramiento de los ácidos grasos en plasma, pero también la tasa de aparición, y así la concentración de NEFA en el plasma del grupo con TZD no disminuía como ocurría en otros experimentos. En nuestro caso ya se ha comentado que el grupo de ratas obesas presentan más NEFA en plasma que las delgadas, y por el contrario a este estudio (aunque en consonancia con otros), el Telmisartán provoca un descenso de esa concentración, posiblemente con ese balance aclaramiento/aparición de NEFA. 115 DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD DE APOLIPOPROTEÍNA PLASMÁTICA Y DE LA CANTIDAD DE RNAm EN TEJIDO HEPÁTICO DE APO AI y APO AIV APO AI EN PLASMA Figura 26. Medias de Apo AI en plasma RATA ZDFDZDFCZDFVZDFTZSD Media de Apo Plasma I 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,802 0,94 0,782 0,654 0,298 Tabla 15. Cantidad de Apo AI en plasma N Media Desviación típica Mínimo Máximo SD 5 ,29 ,07 ,18 ,37 Z 5 ,65 a ,03 ,61 ,70 ZDFT 8 ,78 a ,14 ,48 ,92 ZDFV 8 ,94 a,b ,14 ,76 1,17 ZDFD 8 ,80 a,b ,06 ,72 ,88 Apo AI Total 34 ,73 ,22 ,18 1,17 Los datos se muestran como medias, desviación típica y valores mínimo y máximo. Se utilizó el test de BrownForsythe como prueba robusta de igualdad de varianzas y la prueba post-hoc de Tamhane de comparaciones múltiples. Existen diferencias significativas entre los grupos experimentales, p< 0,05 ( a versus SD, b versus Z) En nuestro estudio obesidad y diabetes parecen tener un efecto sumatorio para determinar la cantidad de Apo AI en plasma: las ratas delgadas del grupo SD tienen cantidades de apoproteína en plasma significativamente inferiores a todas las obesas, y las ratas del grupo 116 Z, únicamente obesas, también inferiores respecto a las ZDF, obesas y diabéticas, aunque sólo son significativas las diferencias frente a los grupos vehículo y dieta. En el caso de las ZDF, no se observan diferencias entre las ratas con o sin tratamiento del tipo que sea. Quizás se pueda sugerir que la tendencia de alguno de ellos (en este caso el grupo vehículo, con mayor cantidad) sea hacia diferencias más importantes con el resto. No existen estudios en ratas ZDF como el que presentamos, que analicen en profundidad la cantidad y la expresión de Apo AI en las condiciones en las que lo hacemos (bajo tratamiento con dieta o con fármacos agonistas PPARγ) en relación con capacidad antioxidante de HDL y la aparición de microalbuminuria como marcador de daño vascular. En relación a las diferencias que observamos entre el grupo SD y el grupo de ratas Zücker no diabéticas, otros como Blay-Peinado o Schonfeld y colaboradores, también habían descrito ese aumento en Apo AI sérica entre fenotipos delgados y obesos 232 . En el segundo caso, el incremento del nivel de Apo AI en plasma era hasta cuatro veces mayor, pero sin embargo la tasa de secreción hepática era similar entre las ratas obesas y las delgadas, sugiriendo un papel muy importante del intestino en ese incremento de la cantidad de apoproteína circulante. En el estudio de Sparks y colaboradores la cantidad global y el contenido relativo de algunas apoproteínas sufría modificaciones en los diferentes grupos 229 . Mientras que en las delgadas la mitad de la Apo E sérica se encontraba en las HDL (el resto entre VLDL y LDL a partes similares), a las 10 semanas el 75% de esa apoproteína se asociaba a VLDL y sólo un 8% a HDL, volviendo a algo menos del 20% a las 20 semanas de edad (40% en VLDL y algo más en LDL). En cuanto a Apo C dos tercios aproximadamente estaba presente en las HDL en el grupo de las delgadas, con una distribución totalmente diferente en las ZDF que pasaban de un 37% a valores similares al grupo delgado durante esas 20 semanas por traslocación desde las VLDL. El contenido en suero de Apo AI se debía principalmente a la cantidad asociada a las HDL, y lo hacía en todos los grupos de forma similar (90% aprox. tanto en delgadas, como en ZDF de 10 y 20 semanas). De forma global se observaba un incremento de la cantidad de Apo B y Apo C respecto a las ratas delgadas. Los cambios específicos que ocurrían en las ZDF entre las 10 (estado hiperinsulinémico) y las 20 semanas (estado insulinopénico) incluían un aumento significativo de Apo B100, un ligero déficit relativo de Apo E (el incremento en el grupo de las delgadas era algo mayor que en las ZDF) y un marcado incremento tanto de Apo AIV como de Apo AI, como ocurre en nuestro modelo. 117 Cuando, en otro estudio, hicieron un grupo de ZDF tratadas con insulina, observaron que ese marcado incremento de HDL y Apo AI a las 20 semanas, se producía sólo en las que no recibían tratamiento 233 . En ratas Sprague-Dawley, Murao y colaboradores habían observado que glucosa e insulina tenían efectos antagónicos sobre el promotor hepático del gen de Apo AI: la glucosa disminuía y la insulina aumentaba la actividad del promotor de Apo AI in vitro, y la acción combinada de ambos (se conseguía un estado de hiperglucemia e hiperinsulinemia sin otros trastornos metabólicos añadidos, alimentando a ratas SD con una dieta rica en fructosa) conseguía aumentar tanto a nivel de Apo AI RNAm como a nivel de proteína (la insulina activa el promotor y además es hipoglucemiante). Así, en nuestras ratas ZDF de 19 semanas era de esperar que la hiperglucemia y la falta de insulina resultaran en una disminución de Apo AI y no lo contrario. Aunque no disponemos de un modelo hiperglucémico/hiperinsulinémico para comparar. De momento conocemos que el rasgo “diabetes” genera un aumento de Apo AI en plasma frente a ratas delgadas o sólo obesas en consonancia con los primeros estudios mencionados de Blay-Peinado o Sparks. Destacar también el hecho de que estas diferencias entre Zücker y Zücker diabéticas no se dan para la variable HDL, sugiriendo la posibilidad de que el incremento de HDL en Zücker se deba a cambios en la composición relativa de otras apoproteínas, o que el aumento de Apo AI en plasma de las Zücker diabéticas se deba a la traslocación de ese aumento de apo a otras lipoproteínas por cambios en la contribución del intestino a esa cantidad circulante total. Apo AI es la proteína estructural fundamental de las HDL, con un papel muy relevante en todas las etapas del metabolismo de esta lipoproteína. Es el aceptor de fosfolípidos y colesterol, cofactor enzimático en su maduración, y ligando de receptores que median en la captación de ésteres de colesterol por el hígado y los órganos que sintetizan hormonas esteroideas. El déficit de Apo AI se asocia con deficiencia de HDL, así como la sobreexpresión da lugar a un incremento de HDL capaz de prevenir la arteriosclerosis en modelos animales predispuestos a ello 234 . Es un factor decisivo en la capacidad antioxidante de las HDL demostrado tanto in vivo como in vitro. El grupo de Navab y colaboradores 241,242 observó en cultivo de células de la pared arterial, que Apo AI era capaz de retirar moléculas “semilla” de las partículas de LDL y hacerlas resistentes a la oxidación. Cuando se añadía LDL al sistema de cultivo, quedaba 118 atrapada en el espacio subendotelial, produciéndose fosfolípidos oxidados que estimulaban la respuesta inflamatoria. Tras dos horas de incubación con Apo AI se observaba que LDL en contacto con el cultivo no se oxidaba. Ocurría lo mismo in vivo tanto en ratones como en humanos, a los que se les administraba Apo AI. Se incubaban las muestras de LDL en el cocultivo de células de la pared arterial a las pocas horas de la infusión de Apo AI, y se observaba su resistencia a la oxidación. En nuestro estudio, observamos que los grupos de ratas diabéticas son las que presentan unos niveles plasmáticos más elevados de Apo AI, sin que se aprecien diferencias importantes en los grupos de intervención farmacológica o dietética (existe un ligero aumento de la cantidad de apoproteína en el grupo vehículo). Sin embargo, si son importantes las diferencias en la capacidad antioxidante de las HDL de esos grupos como se observa en la menor fluorescencia que genera el grupo de ratas con dieta en el ensayo con DCF. Otros factores como las enzimas PON, PAF-AH… se han implicado en la protección antioxidante y frente al daño vascular de las HDL y no han sido determinadas en nuestro estudio. No sólo la señal fluorescente del ensayo con DCF es menor, sino que también lo es la cantidad de albúmina que se encuentra en la orina del grupo de ratas con tratamiento dietético, sugiriendo un papel protector a nivel vascular (a pesar de que el grupo con mayor cantidad de Apo AI en plasma es el vehículo). La implicación de otras enzimas y otros mecanismos no relacionados con la oxidación de las LDL podría explicar la menor albuminuria del grupo de Telmisartán, aún no mostrando una clara diferencia en su señal de DCF respecto al grupo vehículo. Por otra parte la menor cantidad de Apo AI en el grupo SD, no implica mayor daño vascular, porque además de un perfil lipídico menos aterogénico, se observó que ratones deficientes en Apo AI no tienen una susceptibilidad aumentada a la arteriosclerosis ni siquiera cuando son alimentados con dieta rica en grasa, sugiriendo la necesidad de un segundo factor predisponente 235 . 125 ANÁLISIS DE LAS PROPIEDADES ANTIOXIDANTES DE LAS HDL MEDIANTE EL ENSAYO CON DCF (diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceina) Figura 30. Protección de la oxidación de las LDL RATA ZDFDZDFCZDFVZDFTZSD 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00 -10,00 -15,00 -2,00 13,50 4,88 1,75 -13,50 Se representa el ensayo de oxidación y medida de fluorescencia de DCF, tal y como se describe en Material y Métodos. Vemos la gráfica de las diferencias medias de señal fluorescente entre muestras de LDL y LDL+HDL de los diferentes grupos. Se observa tendencia hacia las diferencias entre grupos, sobretodo entre SD, ZDFV y ZDFD El ensayo de incubación de LDL con diacetato de fluoresceína (DCF) desarrollado por el grupo de Navab 240 se basa en el hecho de que las especies reactivas generadas por las LDL oxidadas reaccionan con DCF emitiendo fluorescencia de una forma proporcional al grado de oxidación. Es un ensayo rápido que evita la necesidad de utilizar cultivos celulares para estudiar la habilidad de las HDL para prevenir la formación o inactivar los fosfolípidos oxidados de las LDL, y que muestra buena correlación con los resultados obtenidos los métodos de estudio en cultivos celulares (en un medio de cultivo de células endoteliales y musculares lisas en cultivo junto a LDL , por la acción de compuestos derivados del metabolismo de los ácidos linoleico y araquidónico, los fosfolípidos de las moléculas de LDL se oxidan e inducen una respuesta proinflamatoria como la transmigración de monocitos). Cultivaron LDL control en un medio con células de la pared arterial, junto HDL de pacientes con arteriosclerosis coronaria documentada, y también junto a HDL de un grupo control sano. La formación de LDL oxidadas por las células de la pared arterial, podía ser 126 inhibida por HDL “normales” 241,242 , que además inhibían la actividad quimiotáctica y la transmigración de monocitos. De la misma manera, utilizaron el ensayo con DCF para testar el HDL de esos pacientes frente al de los sujetos sanos ante la presencia de partículas LDL ligeramente oxidadas, y observaron un incremento significativo de la señal fluorescente con las HDL de los pacientes, indicativo de la incapacidad de estas para frenar y/o inactivar la oxidación de fosfolípidos. El mismo grupo de Navab observó cómo las HDL de ratones susceptibles a aterosclerosis inducida por la dieta, funcionaba de forma deficiente y era además proinflamatorio en comparación con el mismo grupo de ratones alimentado con una dieta pobre en grasa, y también frente a ratones apoE “knockout” resistentes a aterosclerosis 243 . Gowri y colaboradores 244 habían observado que la fracción de HDL 2 de sujetos diabéticos tipo II con mal control glucémico (con un mayor contenido en triglicéridos que HDL 3 ) carecía de efecto para prevenir la oxidación de LDL en un cultivo de macrófagos, y no así la fracción HDL 2 de sujetos sanos. En el grupo diabético tanto la Apo B100 de las LDL como Apo AI de las HDL mostraban cambios estructurales importantes. También observaron que existía correlación positiva entre la capacidad antioxidante de las HDL la actividad acetilhidrolasa (PAF-AH) sólo en los sujetos sanos; así como una correlación negativa entre la concentración de triglicéridos y esa capacidad antioxidante en el grupo de los diabéticos. La cantidad de HDL en plasma depende del colesterol total y muestra gran heterogeneidad en su composición, y como ya hemos visto no refleja su funcionalidad. Sin embargo, la capacidad de inhibir la peroxidación lipídica (así como la eficiencia en el transporte reverso del colesterol), permite valorar la integridad estructural y funcional de las partículas de HDL. Volviendo a nuestros resultados, el grupo de ratas delgadas y no hiperlipémicas, SD, muestra una señal de fluorescencia baja que indica menor oxidación de sus LDL. Es interesante ver la relación que existe entre las ratas obesas, y entre las que además de obesidad padecen diabetes: - Las HDL de las ratas ZDFV son más disfuncionantes que las de las SD y las de las ZDFD a la hora de evitar la formación de fosfolípidos oxidados en las LDL, o por inactivación de los mismos). Una dieta controlada e hipocalórica, pues, parece frenar los efectos de la obesidad/diabetes sobre las HDL. 127 - En el grupo de las ratas con Telmisartán la interpretación puede ir en ambas direcciones: el efecto del fármaco no es importante y la funcionalidad de las HDL se asemeja al grupo vehículo, o simplemente que su efecto es más lento que el efecto de una dieta hipocalórica. No hemos encontrado otros estudios que evalúen la capacidad antioxidativa y antiinflamatoria de las HDL en las situaciones que desarrollamos en este experimento, como son la de un grupo de ratas obesas y diabéticas (que, por similitud a los modelos murinos y humanos mencionados, tendrían unas partículas HDL poco eficientes y en cierto modo proaterógenicas) sometidas a dieta y/o bajo tratamiento con un fármaco modulador del metabolismo de los ácidos grasos como el Telmisartán. Atendiendo al resto de resultados, como vemos en las gráficas, parece existir correlación entre la actividad antioxidante de las HDL medida por DCF y la albuminuria (r= 0,64 p< 0,01), indicativo de ese papel protector frente al daño endotelial que provocarían las especies oxidadas de las LDL y la inflamación posterior. Igual que en el estudio de Gowri vemos una correlación positiva entre la concentración de triglicéridos y la señal DCF (r= 0,62 p<0,01). Figura 31. Asociación entre diferentes parámetros. 500,00400,00300,00200,00100,000,00-100,00 DCF_HDL_diferencial 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00 -10,00 -15,00 Sq r lineal = 0,414 2500,002000,001500,001000,00500,000,00 DCF_HDL_diferencial 15,00 10,00 5,00 0,00 -5,00 -10,00 -15,00 Sq r lineal = 0,39 128 Nuestro abordaje experimental nos ha permitido extraer conclusiones interesantes cuando se comprarn los grupos intervención frente al vehículo, y que se podrían resumir de una forma gráfica en la siguiente figura (se describen con más detalle en el correspondiente apartado de la discusión de cada una de las variables). albuminúria NEFA triglicéridos DCF HDL-c colesterol glucemia ZDF Dieta Vs Vehículo albuminúria NEFA triglicéridos DCF HDL-c colesterol glucemia ZDF Telmi Vs Vehículo Figura 32. Representación esquemática de los resultados en los grupos intervención. 129 CONCLUSIONES 130 131 1. La asociación de diabetes y obesidad en este modelo de rata ZDF genera una serie de alteraciones metabólicas desde etapas muy tempranas, con hiperglucemia y un tipo de dislipidemia no sólo caracterizado por el exceso de lípidos en sangre (hiperlipemia) sino por un perfil que se ha demostrado promueve el desarrollo de arteriosclerosis (dislipemia aterógena): hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, y aumento de ácidos grasos no esterificados en plasma. 2. La asociación de diabetes y obesidad en este modelo de rata ZDF genera una serie de alteraciones metabólicas, que ya desde la semana 10, provocan la aparición y un rápido incremento de microalbuminuria. 3. La intervención dietética y farmacológica con agonistas PPARγ (Telmisartán) en ratas ZDF revierte en algunos casos, o atenúa en otros, las alteraciones metabólicas que de forma espontánea genera la diabetes y la obesidad en este modelo animal. • La dieta hipocalórica disminuyó de forma significativa la concentración de colesterol total y colesterol-HDL respecto a los grupos vehículo y control. También consiguió disminuir la glucemia, la concentración de triglicéridos en plasma y la albuminuria. • El tratamiento con un fármaco con actividad agonista de PPARγ consiguió disminuir la albuminuria, y la glucemia a casi la mitad con respecto a los grupos vehículo y control. 4. La intervención dietética y farmacológica con agonistas PPARγ (Telmisartán) en ratas ZDF, mejora o enlentece el daño vascular y la aparición de microalbuminuria que de forma espontánea genera la diabetes y la obesidad en este modelo animal. 5. La obesidad pero sobretodo la asociación de diabetes y obesidad en este modelo de rata genera un tipo de lipoproteínas de alta densidad (HDL) disfuncionantes, con una menor capacidad de inhibir la oxidación de las partículas de baja densidad (LDL). 6. La intervención con una dieta hipocalórica mejora la capacidad de las HDL para inhibir la oxidación de las partículas de baja densidad (LDL) 7. Existe una correlación positiva media entre la señal de DCF, y por tanto la oxidación de las LDL y la alteración funcional de las HDL, con el daño endotelial precoz y la aparición de microalbuminuria. 132 133 BIBLIOGRAFÍA 134 141 178 Howard BV, Manson JE, Stefanick ML, Beresford SA, Frank G, Jones B, Rodabough RJ, Snetselaar L, Thomson C, Tinker L, Vitolins M, Prentice R. Low-fat dietary pattern and weight change over 7 years: the Women’s Health Initiative Dietary Modification Trial. JAMA 2006;295:39–49. 179 GISSI-Prevenzione Investigators. 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