Repositorio Institucional de Documentos

2014 100 Ana Luisa Morales Moya Expresión de oncogenes, receptores hormonales esteroideos y marcadores de proliferación en el carcinoma endometrial Departamento Director/es Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Morandeira García, María José Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Ana Luisa Morales Moya EXPRESIÓN DE ONCOGENES, RECEPTORES HORMONALES ESTEROIDEOS Y MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN EL CARCINOMA ENDOMETRIAL Director/es Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Morandeira García, María José Tesis Doctoral Autor 1997 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento Director/es Director/es Tesis Doctoral Autor Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE MEDICINA EXPRESIÓN DE ONCOGENES, RECEPTORES DE HORMONAS ESTEROIDEAS Y MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN EL CARCINOMA ENDOMETRIAL ANA LUISA MORALES MOYA Tesis Doctoral 1997 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE MEDICINA EXPRESIÓN DE ONCOGENES, RECEPTORES DE HORMONAS ESTEROIDEAS Y MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN EL CARCINOMA ENDOMETRIAL Memoria presentada por ANA L. MORALES MOYA para optar al grado de DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGÍA Autora: Ana Luisa Morales Moya Directores: Dra. Mª José Morandeira García Dr. Joaquín Soria Navarro AGRADECIMIENTOS: Deseo expresar mi sincero y profundo agradecimiento a todas aquellas personas e instituciones que han hecho posible la culminación de este proyecto: A la Dra. Dña. Mª José Morandeira García, directora de esta tesis, por su valiosa labor de dirección, su estímulo, su dedicación y su consejo constante. Al Dr. D. Joaquín Soria Navarro, director de esta tesis por su inestimable ayuda, sus valiosas ideas y su apoyo tanto moral como científico. A Dña. Sara Serrano Hernández y D. Alfonso Cóndor Güemes por su inestimable dedicación en el trabajo de laboratorio y en la realización de las técnicas inmunohistoquímicas. A todos los profesores, personal técnico y personal administrativo del servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario “Lozano Blesa”, que me han facilitado en todo momento el acceso al material de esta tesis. Al Dr. D. Félix La Mata por su colaboración en el tratamiento estadístico de los datos obtenidos en este trabajo. A D. Luis Correas Subías por su colaboración en la elaboración del material fotográfico. A mis amigos, especialmente a Fernando, Ana y Mayte por sus consejos, su estímulo y su ayuda incondicional. A mi familia por toda su ayuda, su afecto y su preocupación en cada momento. A mis padres, mis hermanos y a Fernando. ÍNDICE I INDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN 1.1. CARCINOMA DE ENDOMETRIO 2 1.1.1. Epidemiología 2 1.1.2. Factores de riesgo 2 1.1.3. Clínica 5 1.1.4. Diagnóstico 6 1.1.4.1. Exploración ginecológica 6 1.1.4.2. Exploraciones complementarias 6 1.1.4.3. Diagnóstico de extensión locorregional 8 1.1.5. Anatomía patológica 8 1.1.5.1. Macroscopía 8 1.1.5.2. Microscopía 9 1.1.5.3. Clasificaciones del carcinoma de endometrio 13 1.2. CONCEPTOS GENERALES DE INMUNOLOGÍA 17 1.2.1. Concepto de antígeno 18 1.2.2. Concepto de anticuerpos 18 1.2.3. Estructura de las inmunoglobulinas 19 1.2.4. Anticuerpos policlonales 20 1.2.5. Anticuerpos monoclonales 21 1.3 TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA 23 1.3.1. Métodos inmunoenzimáticos 25 1.3.1.1. Método directo 25 1.3.1.2. Método indirecto 25 1.3.1.3. Método peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) 26 1.3.1.4. Método de avidina-biotina (ABC) 26 1.4. BASES MOLECULARES DE CÁNCER DE ENDOMETRIO 27 1.4.1. Receptores esteroideos: receptores de estrógenos y receptores de progesterona 28 Introducción 3 conforme aumentaba la edad hasta los 60-64 años, mientras que a partir de esta edad se mantenía la incidencia (249). Se puede considerar que el aumento de la vida media de la mujer es una de las causas que ha contribuido al incremento de este tumor (84, 209). - ALTO NIVEL SOCIOECONÓMICO: Las mujeres de elevado nivel socioeconómico tienen mayor riesgo de carcinoma de endometrio que las de bajo nivel socioeconómico. Esto podría ser debido a una mayor disponibilidad de estrógenos exógenos (243, 84). - OBESIDAD: la obesidad se ha asociado al adenocarcinoma de endometrio por la hiperestrogenia que se genera en la conversión periférica de los precursores androgénicos (delta 4-androstendiona) en estrógenos (estrona) mediante su aromatización. Conversión que aumenta en la grasa corporal en las mujeres posmenopáusicas. Cuanto mayor es el peso, más alta será la síntesis de estrógenos. En las mujeres premenopáusicas, el hiperestrogenismo está favorecido por un déficit relativo de progesterona que se produce en el ciclo ovárico de las obesas (150, 243, 23, 84). - DEPENDENCIA HORMONAL: El estímulo estrogénico prolongado y mantenido, sin ser equilibrado por una secreción adecuada de progesterona, constituye un factor etiológico importante en la génesis del adenocarcinoma de endometrio. Así la hiperplasia endometrial, que es consecuencia de un nivel de estimulación estrogénica anormalmente alto y prolongado, tiene una especial relación con el carcinoma endometrial, sobre todo la hiperplasia compleja o adenomatosa y la hiperplasia atípica. Circunstancias donde se ha encontrado asociación con el hiperestrogenismo: •Menopausia tardía y menarquia temprana, son mujeres que han estado sometidas durante más tiempo a la influencia de los estrógenos (23, 243, 84). Introducción 4 •Nulíparas, al no haber tenido embarazos también han estado expuestas durante mayor tiempo a los estrógenos (211, 150, 62). Por consiguiente se puede decir que el embarazo es un factor protector del adenocarcinoma de endometrio, ya que se interrumpe la continua estimulación del endometrio por los estrógenos (211, 209, 84). •Mujeres con ciclos anovulatorios (23). Tienen largos periodos de acción estrogénica sobre el endometrio. •Mujeres con síndrome de Stein Leventhal: La patología que suele producir es una hiperplasia de endometrio, que cura con tratamiento médico, aunque se han descrito casos de carcinoma de endometrio que suelen ser bien diferenciados (84, 62). •Adenomiosis, que suelen coincidir con niveles altos de estrógenos (84). •Miomas, también se acompañan de niveles altos de estrógenos (84) •Tumores secretores, producen normalmente estrógenos (84, 62). •Tratamiento con tamoxifen. Recientemente, varios autores (2, 67, 112, 218, 113) han sugerido que mujeres que padecen carcinoma de mama y son tratadas largo tiempo con tamoxifen, tienen un mayor riesgo para padecer un carcinoma de endometrio, además hay estudios en los que se relaciona con tumores poco diferenciados y un peor pronóstico. •Tratamiento con estrógenos exógenos. Debemos recordar que el tratamiento con estrógenos exógenos administrados durante los años 1960-1970, fueron un factor dentro de la patogenia del carcinoma de endometrio. En la actualidad, gracias a la prescripción de tratamientos combinados de estrógenos y progesterona, la incidencia del carcinoma endometrial ha disminuido. Sin embargo, según Rose 1996 (211), el carcinoma de endometrio aún aparece en mujeres sometidas a tratamientos sustitutorios en los que se administra progesterona durante menos de 12 días, que es lo recomendado. Introducción 5 Tenemos que señalar, que existe un grupo de pacientes con cáncer de endometrio que no muestra signos de hiperestrogenismo. - TABACO: No está clara la acción del tabaco sobre el cáncer de endometrio. Hay autores, como Lesko o Burke que tras diversos estudios estimaron que las fumadoras postmenopáusicas habituales presentaban un riesgo disminuido de desarrollar cáncer de endometrio (243). Sin embargo Daniells, al igual que otros autores, publicó un estudio en 1993 en el que sugería que las mujeres fumadoras con cáncer de endometrio se encontraban en un estadío más avanzado (44). - OTROS FACTORES que debemos tener en cuenta en el adenocarcinoma de endometrio son: diabetes, hipertensión, historia familiar, dieta rica en grasas, etc. 1.1.3. CLÍNICA La manifestación inicial del carcinoma de endometrio es con gran frecuencia una hemorragia uterina. En las mujeres postmenopáusicas, las hemorragias se presentan como pérdidas irregulares. Cuando la mujer es premenopáusica, habitualmente la pérdida de sangre es intermenstrual, hay ocasiones menos frecuentes en que aparecen como reglas abundantes y prolongadas (menorragias) (84). Después de las hemorragias, el síntoma más frecuente es la leucorrea mezclada con sangre y a veces de aspecto purulento (150). Otros síntomas menos frecuentes son: dolor, pérdida de peso, anemia, etc. (150, 84). Hay ocasiones en que los adenocarcinomas de endometrio son asintomáticos. Introducción 6 1.1.4. DIAGNÓSTICO Como ya hemos comentado anteriormente, ante toda mujer postmenopáusica con hemorragias uterinas y en mujeres premenopáusicas con hemorragias intermenstruales, debemos pensar en un carcinoma de endometrio, pero debemos descartar previamente otros procesos que pueden producir hemorragias, como pólipos endometriales, hiperplasia de endometrio, metrorragias funcionales, etc. Para el diagnóstico utilizaremos diferentes pruebas: 1.1.4.1. Exploración ginecológica La exploración bimanual vagino-abdominal suele detectar un útero agrandado de volumen, aunque no debemos olvidarnos de que el tamaño del útero puede ser normal e incluso puede estar disminuido (84, 150). 1.1.4.2. Exploraciones complementarias Las exploraciones complementarias más frecuentemente utilizadas son las siguientes: - Citología cérvico-vaginal: Es la técnica empleada para el despistaje de cáncer de cérvix. Pero desafortunadamente en el caso del adenocarcinoma de endometrio sólo un 30% de los casos nos dan un frotis de Papanicolau con células compatibles con el carcinoma (150). - Citología endometrial: La sensibilidad para el diagnóstico del adenocarcinoma de endometrio oscila entre el 80 y 90%, llegando a una especificidad del 95%. La citología endometrial es difícil de interpretar, por lo que requiere citólogos muy expertos (150). - Biopsia de endometrio: Es la técnica que nos da el diagnóstico de certeza. Para obtener material endometrial podemos utilizar varios Introducción 7 métodos: Microlegrado, biopsia dirigida por histeroscopia y legrado fraccionado (endocérvix y endometrio) (150, 84). Para hacer un legrado uterino fraccionado, debemos hacer primero un legrado uterino cuidadoso de todo el endocérvix, depositándolo en un frasco con líquido fijador. A continuación, dilatamos el cuello uterino y legramos toda la cavidad corporal, y se deposita al material del cuerpo en otro frasco separado del material del cuello uterino. En ocasiones durante la realización de un legrado surgen complicaciones como por ejemplo la perforación del útero. Cuando esto ocurre nos orienta hacia un posible carcinoma de endometrio (84). El legrado fraccionado es el método más eficaz para el diagnóstico de certeza del carcinoma de endometrio, sin embargo la información que aporta en cuanto a la clasificación quirúrgica y al pronóstico es insuficiente. Por esta razón algunos autores como Lanzón consideran la histeroscopia de gran importancia en la exploración rutinaria de las metrorragias (150). - Histeroscopia: Esta técnica tiene una especificidad casi del 88%, y unos falsos negativos de 0´5%. La histeroscopia permite visualizar, localizar la lesión y observar su extensión hacia el endocérvix. Tiene varias ventajas con respecto al legrado endometrial: se puede realizar de forma ambulatoria, sin anestesia general, permite realizar la biopsia bajo visión directa y diferencia otros procesos que producen hemorragias uterinas como pólipos, miomas submucosos, hemorragias por atrofia, etc. (150). - Ecografía (ECO): La ECO endovaginal se utiliza para valorar el grosor de la línea endometrial y para estudiar lesiones asociadas como miomas, tumores de otras localizaciones, etc. (150). Osmer (187), realizó un estudio en el cual no encontró adenocarcinoma ni hiperplasia cuando el grosor del endometrio era menor de 4mm. A raíz Introducción 8 de este estudio, hoy día se debe biopsiar toda mujer postmenopáusica cuando el endometrio tenga un grosor mayor o igual a 4mm. 1.1.4.3. Diagnóstico de extensión locorregional Para valorar la extensión del tumor a órganos vecinos se pueden utilizar diversas técnicas: - Tomografía axial computerizada: Podemos valorar la presencia y tamaño de los ganglios linfáticos y permite valorar la extensión pélvica y abdominal. - Resonancia magnética nuclear: Es útil para valorar el grado de invasión miometrial y vaginal. - Radiografía de tórax: Se utiliza como prueba preoperatoria y además descarta metástasis pulmonares. - Marcadores tumorales: CEA y Ca 125 (150). 1.1.5. ANATOMÍA PATOLÓGICA 1.1.5.1. Macroscopía Los carcinomas de endometrio normalmente se originan a partir del epitelio endometrial del cuerpo uterino, siendo más frecuentes en la pared posterior que en la anterior (225). El tamaño del útero esta normalmente agrandado, aunque puede tener un tamaño normal e incluso estar disminuido (225, 62). El carcinoma de endometrio puede ser circunscrito, presentando un crecimiento exofítico, fungoso hacia la luz endometrial, o bien puede afectar difusamente al endometrio. En este caso tiende a invadir el miometrio, pudiendo en casos avanzados ocupar todo el miometrio, e incluso formar nódulos subserosos y serosos (62, 209). Introducción 9 A la sección, el tumor tiene una coloración blanca-grisácea, aunque en ocasiones muestra áreas marrón rojizas (hemorragias) o amarillentas (necróticas). El tumor puede infiltrar por contigüidad el cérvix, y una vez ha roto la serosa infiltra estructuras peritoneales por continuidad directa, además puede producir metástasis ganglionares y alcanzar por vía hematógena pulmón, hueso y otros órganos (209, 225). 1.1.5.2. Microscopía Según Robbins (209) y Pardo-Mindán (192), la mayoría de los carcinomas de cuerpo uterino (aproximadamente el 85%) son adenocarcinomas endometrioides. Para otros autores como Fariña (62) y Ackerman (210) los adenocarcinomas de endometriales suponen un 80%. En estudios realizados sobre el carcinoma de endometrio en la población de Zaragoza, el 81´7% de los casos también fueron de tipo adenocarcinoma endometrioide (249). Los carcinomas endometriales se caracterizan por un patrón más o menos definido, formado por células epiteliales cilíndricas, estratificadas y malignas (209). Las glándulas endometriales son muy numerosas, con escasa cantidad de tejido conjuntivo interglandular como podemos ver en la figura 1b. La morfología de las glándulas es muy diversa. En ocasiones mantienen una morfología similar al endometrio normal, aunque su número está muy aumentado. En otros casos las glándulas tienen una forma muy irregular, con dilataciones, ramificaciones y deformidades que les da un aspecto polimorfo (Figura 2). Las glándulas están revestidas por un epitelio que muestra grados diversos de desviación de las células cilíndricas del epitelio normal. El epitelio está formado por células poliédricas u ovoideas con núcleos situados en distintos niveles, aunque normalmente se disponen formando varias hileras celulares. Se observa en mayor o menor proporción, desdiferenciación y anaplasia celular. Los núcleos pueden tener diferente morfología, tamaño distinto, aclaramiento nuclear Introducción 10 con acúmulo de cromatina a lo largo de la membrana nuclear, pueden ser hipercromáticos y mostrar mitosis normales y anormales. La atipia y el número de mitosis están directamente relacionados con el grado malignidad. Los citoplasmas pueden ser de escaso volumen, estando aumentada la relación núcleo-citoplasma, dando la impresión de estar los núcleos muy próximos entre sí (225). Según la diferenciación histopatológica podemos diferenciar tres grados: Grado 1, aquel que tiene 5% o menos de patrón sólido y el resto de patrón tubular, (tanto en la figura 3 como en la 4 podemos apreciar dos ejemplos de carcinoma endometrial grado G1). Grado 2, aquel que tiene entre 6-50% de patrón sólido que no sea escamoso ni morular (Figura 5 y 6). Grado 3, el que tiene más del 50% de patrón sólido que no sea ni escamoso ni glandular (Figura 8). El estroma suele ser escaso, puede ser más o menos celular y con mayor o menor cantidad de fibras de colágena. A veces también se pueden encontrar leucocitos y células redondas (84). El tejido benigno adyacente al cáncer de endometrio puede ser atrófico (como muestra la figura 1), proliferativo o hiperplásico. El examen del tejido que rodea al carcinoma de endometrio es importante porque la presencia de hiperplasia se asocia a un mejor pronóstico (7, 49). A veces el diagnóstico diferencial entre una hiperplasia de endometrio y un adenocarcinoma bien diferenciado, resulta difícil. Para su estudio nos basamos en la presencia de invasión estromal y se reconoce por: reacción desmoplásica o fibroblástica del estroma, arquitectura glandular confluente o en criba, arquitectura papilar (192). Formas de carcinoma endometrioide: - Adenoacantoma: Es un carcinoma de endometrio que contiene focos de diferenciación escamosa (metaplasia). Las células se agrupan en mórula sin atipia citológica importante (192). Introducción 11 - Carcinoma adenoescamoso: Es un carcinoma de endometrio con focos de metaplasia, pero el componente escamoso es atípico e invasivo (192). Otros tipos de carcinomas de cuerpo uterino: - Carcinoma seroso papilar: Es el más frecuente de los subtipos de carcinoma de endometrio. Según algunos estudios, entre un 5-10% corresponden a este tipo de carcinoma. Un ejemplo de esta variedad podemos observarlo en la figura 9. (225). Se caracteriza por una compleja forma de crecimiento, es un modelo papilar con un alto grado de atipia en la citología, con pleomorfismo, hipercromasia, nucleolos gigantes, numerosas mitosis, extensa necrosis, cuerpos de psamoma (30% de los casos) y una importante invasión miometrial (210, 225). El carcinoma seroso además de por su frecuencia es importante por su alta agresividad, con gran tendencia a invadir el miometrio y una rápida diseminación más allá del útero, tanto por vía linfática como hematógena (225). La supervivencia de este tipo de tumor se correlaciona con: a) la invasión vascular linfática, b) la diseminación peritoneal, c) el contenido nuclear de ADN (ploidía), d) la expresión de P53. El carcinoma seroso se diferencia del carcinoma endometrioide por la demostración de aneuploidía, amplificación del proto-oncogén c-myc, y bioquímicamente por la ausencia de receptores de estrógenos y progesterona (225). - Adenocarcinoma de células claras: Este tipo de adenocarcinomas de endometrio supone aproximadamente el 4% de los carcinomas y al igual que otros carcinomas de endometrio suele ocurrir en mujeres postmenopáusicas (225). Introducción 12 Es una variante de tumor mülleriano (derivado de restos de los tubos de Müller, a partir de los cuales se forma el útero) (62, 210). Microscópicamente, este tipo de tumor se caracteriza por la presencia de células tumorales largas con citoplasmas claros en técnicas de hematoxilina-eosina, y otras técnicas como Schif o carmín de Best. Los exámenes ultraestructurales demuestran también el aspecto claro del citoplasma, que es el resultado de un masivo acúmulo de glucógeno (225, 62). También encontramos en estos tumores otras células denominadas células en tachuela (al estar los núcleos localizados en el polo apical de la célula protuyen como clavos hacia la luz glandular) (225, 210, 62). Estas células pueden ser más numerosas que las células claras que dan nombre a este tumor. Otros rasgos a señalar son hialinización del estroma y mucina extracelular. Este tipo tumoral se ha asociado a un alto grado de malignidad y a un peor pronóstico (225, 62). No se han relacionado con el dietilestilbestrol, a diferencia de otros tumores de células claras como el de cérvix y vagina (210, 62). Estos tumores pueden ser difíciles de diferenciar del carcinoma seroso, incluso puede haber lesiones en las que ambos tumores coexistan (225, 62). - Adenocarcinoma mucinoso: Es un carcinoma endometrial infrecuente, algunas series hablan de 1% de los tumores endometriales malignos, sin embargo no es tan extraño encontrar áreas de esta diferenciación mucosecretora en los carcinomas endometrioides (62). Una muestra de este tumor podemos observarla en la figura 10. Histológicamente se pueden observar células cilíndricas altas de aspecto mucosecretor, con núcleos de situación basal y poca tendencia a la pseudoestratificación, además suelen estar bien diferenciados (62). Introducción 19 El linfocito B puede activarse por dos mecanismos: activación del linfocito B por Ag T dependiente (antígeno linfocito T dependiente), o activación del linfocito B por Ag-T independiente. En la primera, el linfocito B se activa cuando tras la unión del Ag al receptor del Linfocito B, se produce una segunda señal relacionada con el linfocito T helper (por medio de la liberación de citocinas, especialmente la Interleukina 4). En la otra el antígeno es capaz de activar al linfocito B sin necesidad del linfocito T. Los antígenos son grandes moléculas poliméricas con determinantes antigénicos repetidos que entrecruzan masivamente las Inmunoglobulinas de membrana del linfocito B, activándolo. Muchos de ellos cuando se encuentran a concentraciones elevadas, activan al linfocito B de forma policlonal inespecífica. Una vez que el linfocito B esta activado, se diferencian a células secretoras de anticuerpo que migran a médula ósea donde completa su maduración a célula plasmática, así da lugar a una clona o grupo de células que proceden de una sola célula madre y produce el mismo tipo de anticuerpos. 1.2.3. ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Denominamos inmunoglobulinas (Ig) a las moléculas con actividad de anticuerpo. Por sus propiedades fisicoquímicas e inmunológicas se dividen en 5 clases principales; IgG, IgA, IgM, IgE e IgD, y varias subclases, 4 de las IgG y 2 de las IgA. (100) La estructura básica de todas las inmunoglobulinas, la forman cuatro cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro. De estas, dos son de bajo peso molecular, aproximadamente 23.000 daltons, son las cadenas ligeras o light (L), y las otras dos son de alto peso molecular, entre 50.000 y 70.000 daltons, son las cadenas pesadas o heavy (H). La forma molecular de las inmunoglobulinas IgG, IgE e IgD es un monómero, mientras que la IgM forma un pentámero unido por la cadena J, y la IgA puede estar formada por una, dos o tres unidades. Introducción 20 Tanto las cadenas ligeras como las pesadas constan de dos partes bien definidas y diferenciadas. La parte constante está constituida por un número semejante de aminoácidos, sea cual sea la inmunoglobulina a la que pertenece. La parte variable está constituida por gran variabilidad de aminoácidos. La parte constante corresponde al extremo carboxílico, mientras que la variable al extremo amínico. (100) Los dos extremos de las inmunoglobulinas tienen funciones bien definidas: el denominado Fab (fragmento de la Ig que se une al antígeno) se encarga de reconocer los antígenos específicos y el Fc (fragmento cristalizable de las cadenas pesadas de las Ig) es capaz de unirse a diversos elementos, como el complemento, las células inflamatorias u otro Fc. Dentro del extremo Fab existe una zona hipervariable, que es la que se une al antígeno y es la responsable de la especificidad y afinidad de las inmunoglobulinas. Además de la función de defensa inmunológica, los anticuerpos han sido utilizados en los últimos tiempos con fines diagnósticos y terapéuticos, por lo que ha sido necesario encontrar técnicas que llevaran a la obtención de los antígenos y anticuerpos. Para ello se idearon las técnicas de anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales (100). 1.2.4. ANTICUERPOS POLICLONALES Burnet y sus colaboradores desarrollaron en 1950 la teoría de selección policlonal. Para la obtención de anticuerpos policlonales, inmunizaban un organismo huésped con una molécula específica (inmunógeno), en el que se encuentra el antígeno frente al cual se pretende obtener un anticuerpo (75). El organismo produce una reacción humoral (linfocitos B) frente al inmunógeno, generando anticuerpos que se pueden recolectar obteniendo suero. Esta técnica nos lleva a la obtención de unos anticuerpos policlonales, ya que los linfocitos B estimulados de esta forma, producen diversos tipos de anticuerpos derivados del gran número de clones de células B estimuladas. Introducción 21 Los anticuerpos son poliespecíficos, ya que en el antisuero obtenido se encuentran anticuerpos contra distintos determinantes antigénicos o epítopos de una misma estructura. Son poliafines, ya que las fracciones del anticuerpo que reaccionan con el mismo determinante antigénico, se unen a él con distinta afinidad. Son heterogéneos, ya que diferentes anticuerpos contenidos en el antisuero variarán de un animal a otro, o en las distintas extracciones de un mismo animal. Son sensibles, ya que al contener anticuerpos que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos de una estructura, resulta difícil que se produzcan falsos negativos. Además son económicos, ya que la infraestructura tecnológica necesaria para su producción, no es costosa. Sin embargo, a pesar de estas características, los anticuerpos policlonales tienen varios inconvenientes en su empleo para el diagnóstico o terapéutica, como: a) La imposibilidad de reproducir los resultados; esto es debido a que la respuesta inmune varía de unos individuos a otros, e incluso dentro de un mismo individuo según el momento en que se encuentra. b) Obtención de cantidades limitadas. c) Purificación del antisuero se realiza mediante absorción con moléculas o células afines a las empleadas para inmunizar al animal. Tiene por objeto eliminar los Ac que reaccionan de forma cruzada no específica y esto es laborioso. d) Incapacidad para discriminar determinantes antigénicos diferentes dentro de una misma molécula o célula (75, 117). 1.2.5. ANTICUERPOS MONOCLONALES En 1975, Köhler y Milstein desarrollaron la técnica de obtención de Ac (anticuerpos) monoclonales. Realizaron una fusión entre las células de un mieloma murino y los esplenocitos (linfocitos procedentes del bazo) de un ratón Introducción 22 inmunizado, con hematíes de carnero. Los cultivos celulares resultantes de esta fusión, llamados “hibridomas”, son capaces de producir inmunoglobulinas, que reconocen a los antígenos empleados en la inmunización. El hibridoma tiene dos propiedades fundamentales: tiene capacidad de crecimiento ilimitado, y además capacidad de sintetizar y secretar inmunoglobulinas (Las inmunoglobulinas que producen son del mismo tipo y especificidad que las codificadas por el linfocito B). El híbrido resultante de la fusión entre la célula de un mieloma murino y un linfocito B específico para un antígeno problema, da origen, después de varias divisiones, a un clon; la totalidad de cuyos híbridos poseen el mismo tipo de inmumoglobulinas (75). Podemos definir anticuerpo monoclonal como el producto de una sola clona de células secretoras de inmunoglobulinas. Por ello, todas las moléculas de inmunogloibulinas producidas presentan idénticas características inmunológicas: especificidad, afinidad, carga, peso molecular, isotipo y propiedades. Dentro de las ventajas de los anticuerpos monoclonales debemos destacar: •Son homogéneos y no varían con cada inmunización o sangría realizada al animal; •Además no requiere el uso de Ag purificados •Los cultivos permanentes pueden proporcionar el Ac de forma ilimitada. Como inconvenientes debemos destacar la poca sensibilidad, ya que al reaccionar con un único determinante antigénico pueden ocasionar falsos negativos, principalmente cuando se trata de reconocer estructuras antigénicas complejas. Además esta técnica resulta cara. Los anticuerpos monoclonales tienen múltiples aplicaciones en biología. Algunas de las más importantes son comentadas a continuación. Son útiles para el diagnóstico de laboratorio. Gracias a su homogeneidad y a que se obtienen de forma ilimitada, ha hecho que se utilicen en pruebas de Introducción 23 radioinmunoensayo para la obtención de hormonas, fármacos y enzimas. Se pueden homologar entre los diversos laboratorios, usando el anticuerpo más adecuado. También pueden aplicarse al diagnóstico bacteriológico y virológico, empleando técnicas inmunohistoquímicas. Estos reactivos además son muy importantes en el tipaje de los antígenos HLA (complejo principal de histocompatibilidad humana), de importancia capital en el trasplante de órganos (75, 117). Investigación básica con los anticuerpos monoclonales se ha podido identificar todas las subpoblaciones linfoides, numerosos marcadores tumorales etc. Este hecho adquiere gran importancia sobre todo porque con los anticuerpos policlonales, no era posible distinguir entre dos proteínas de membrana distintas de un mismo tipo celular. También tiene gran importancia en el campo de la terapéutica y diagnóstico clínico. (75) a) Protección frente al rechazo de órganos, administrando Ac monoclonales frente a células T citotóxicas. b) Localización de metástasis, de tumores empleando Ac específicos antitumor marcados radiactivamente. c) Tratamiento de tumores si se usan unidos a toxinas o citotóxicos. 1.3. TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Las técnicas inmunohistoquímicas sirven para detectar antígenos celulares o tisulares, mediante reacciones Ag-Ac (antígeno contra anticuerpo). Para poder ver el lugar donde se produce la reacción Ag-Ac es preciso emplear un marcador o trazador. El marcaje puede realizarse con fluorocromos, como rodamina, fluoresceina, (técnicas de inmunofluorescencia), enzimas como peroxidasa, Introducción 24 fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc. (técnicas inmunoenzimáticas), iones metálicos en forma coloidal (técnicas de inmuno-oro) o isótopos radiactivos (75). Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales se pueden unir a moléculas marcadoras que permiten visualizar el lugar de reacción con sus respectivos antígenos. El uso de estos Ac marcadores es el fundamento de las técnicas de inmunolocalización, muy útiles en las técnicas de biología en general y del diagnóstico histopatológico. El Ag puede detectarse tanto por marcaje directo del Ac (técnicas directas), como por algunos de los múltiples métodos secundarios. Las técnicas de inmunolocalización que utilizan como marcador un enzima, fueron desarrolladas por Nakane y Pierce en 1967, y posteriormente fueron perfeccionadas por Arrameas, Mason, Sternberger et al, consiguiendo superar las dificultades que presentaban las técnicas de inmunofluorescencia (117) Esta técnica nos permite ver el lugar donde se produce la reacción Ag-Ac, al añadir al final de la reacción el sustrato del enzima, más una sustancia llamada cromógeno. Al actuar la enzima sobre el sustrato, interactúa a su vez sobre el cromógeno y da lugar a un precipitado insoluble y coloreado. Distintos tipos de enzimas fueron utilizados como trazadores: peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa. Pero de ellas la más utilizada es la peroxidasa por las ventajas que presenta, como ser visualizada fácilmente con microscopio de luz, poder utilizarse en secciones teñidas con tinciones histológicas de rutina, tolerar la deshidratación en alcohol y xilol. (117) La peroxidasa es un enzima que se obtiene del rábano picante y puede emplearse en técnicas directas, indirectas y sin marcar (técnicas de peroxidasaantiperoxidasa) (75). Introducción 25 1.3.1. MÉTODOS INMUNOENZIMÁTICOS Diferentes métodos inmunoenzimáticos han sido desarrollados y poco a poco mejorados. 1.3.1.1. Método directo El método directo es una técnica de anticuerpos marcados. El trazador va unido de forma covalente al anticuerpo (117). Es el método más simple, pero también el menos sensible para la detección de antígenos. El anticuerpo o antisuero primario se conjuga directamente con la enzima peroxidasa (75). 1.3.1.2. Método indirecto Esta técnica fue desarrollada por Nakane y Pierce. En primer lugar, el anticuerpo primario o específico sin conjugar se une con el antígeno presente en la sección del tejido. En una segunda fase, se añade un anticuerpo marcado con el trazador enzimático (peroxidasa), también llamado anticuerpo secundario, obtenido de un animal diferente al primario y específico para el animal y la clase de inmunoglobulina que constituye el anticuerpo primario (75). El complejo así formado puede visualizarse incubando el corte de tejido con un sustrato cromógeno adecuado. Este método es más sensible que el método directo, y además, el anticuerpo secundario puede utilizarse para todos los antisueros primarios posibles obtenidos de la misma especie (75). Ambos métodos, directo e indirecto, tienen una sensibilidad mayor que la inmunofluorescencia. Introducción 26 1.3.1.3. Método Peroxidasa-Antiperoxidasa (PAP) Este procedimiento fue desarrollado por Sternberger en 1960 (117, 75), como un perfeccionamiento de la técnica de inmunoperoxidasa indirecta (117). Esta técnica utiliza como trazador inmunocomplejos formados por la enzima peroxidasa, y anticuerpos específicos frente a ella, en lugar de anticuerpos marcados. La peroxidasa se inocula en un animal para obtener los Anticuerpos dirigidos frente a la enzima. De esta forma, al poner en contacto “in vitro” los Anticuerpos con peroxidasa, se forman complejos Ag-Ac (complejos peroxidasaantiperoxidasa o complejo PAP), a través de una reacción de precipitación. Esta técnica consta de tres pasos: en el primero, se pone en contacto el tejido con el Anticuerpo primario semejante a los empleados en las técnicas de inmunoperoxidasa directa e indirecta. En un segundo paso se añade el Anticuerpo secundario, y para terminar, en un tercer paso se añade el complejo PAP a la reacción; estos complejos están formados por tres moléculas de peroxidasa y dos de Anticuerpos antiperoxidasa (75, 117). Al final, por cada molécula de Anticuerpos primario ligada al Antígeno, existen al menos tres de peroxidasa en el complejo final; esto le da una alta sensibilidad a esta técnica (75). 1.3.1.4. Método de Avidina-Biotina (ABC) Tratando de solucionar los problemas que la técnica de peroxidasaantiperoxidasa producía, Arrameas et al en los años setenta introdujeron la técnica Avidina-Biotina pero posteriormente Hsu et al en 1980 la perfeccionaron (117). Es una técnica muy sensible que utilizan anticuerpos marcados, y se basa en la gran afinidad que entre sí poseen las moléculas de Avidina y las de Biotina, de forma que se genera un fuerte enlace no inmune (75). La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular que está presente en la clara de huevo y en la bacteria actinomyces avidinii. En ambos casos la Introducción 27 molécula está formada por cuatro subunidades, que configuran una estructura terciaria con cuatro regiones hidrofóbicas de unión con la biotina (75). La avidina puede unirse covalentemente con una gran variedad de proteínas, glicoproteínas y polisacáridos, y al oro coloidal (75). La biotina es una vitamina de bajo peso molecular que pertenece al complejo B (Vitamina H), y se localiza en la yema de huevo. Se conjuga fácilmente con anticuerpos y enzimas marcadoras (75). La técnica Avidina–Biotina es un proceso que se realiza en tres pasos: en el primero se incuba el tejido con el anticuerpo primario; en el segundo paso se añade el anticuerpo secundario unido a biotina, y en un tercer paso se forma un complejo Avidina-Biotina, conjugado con peroxidasa (117). Un gran número de moléculas de biotina, pueden unirse a un Anticuerpo único por lo que la proporción trazador/anticuerpo es muy elevada (75). Por esto la sensibilidad de esta reacción es muy alta. 1.4. BASES MOLECULARES DE CÁNCER DE ENDOMETRIO Como ya sabemos, el factor pronóstico más importante en el carcinoma de endometrio es el estadío quirúrgico, determinado por el nivel de penetración miometrial y el compromiso extracorporal (159). Sin embargo no debemos olvidar la gran importancia del tipo histológico, el grado de diferenciación, la atipia nuclear, etc. Hay además otros factores que también se han relacionado con el pronóstico del tumor, estos son: - Presencia de receptores de estrógenos (RE) y receptores de progesterona (RP) que van a tener un particular interés en el pronóstico del cáncer de endometrio (estos marcadores se han relacionado con menor grado de malignidad y mejor pronóstico). Introducción 28 - Índice proliferativo Ki-67 (Mib1). - Presencia de una mutación del gen supresor como el p53. - Expresión del oncogen Bcl-2. - Presencia de amplificación de oncogenes como el c-erbB-2. 1.4.1. RECEPTORES ESTEROIDEOS: RECEPTORES DE ESTRÓGENOS Y RECEPTORES DE PROGESTERONA 1.4.1.1. Introducción Aunque todas las células del organismo humano están expuestas a las hormonas esteroideas, sus acciones fisiológicas se limitan a aquellos tejidos que contienen proteínas de acción intracelular, denominados receptores. Estas proteínas se unen específicamente y con alta afinidad, a clases individuales de hormonas esteroideas y transmiten la señal esteroidea a genes sensibles. El tipo de respuesta inducido es por tanto dependiente del estado de desarrollo y diferenciación del tejido diana. Los receptores también aparecen involucrados en el control de diversas fases finales de proliferación celular, muerte celular, actividad secretora y movilidad celular. Los receptores hormonales sexuales se han encontrado en muchos tejidos del organismo humano. Además de su presencia en los tejidos efectores clásicos, como la mama, la vagina, el endometrio y la hipófisis, se han identificado actualmente en otros tejidos humanos como el tejido del sistema nervioso, endocrino, cardiovascular, respiratorio, urinario, óseo, piel e hígado (189, 34). Además, las hormonas esteroideas se han relacionado con diversas enfermedades, resaltando entre ellas el desarrollo de tumores malignos en tejidos sensibles hormonalmente a los esteroides; de forma especial el cáncer de mama, el tracto genital femenino y la próstata (32, 42, 36), así como en otras localizaciones: pulmón, tracto gastrointestinal, páncreas, tumores intracraneales (63). Introducción 35 expresión de sus genes respectivos y de la velocidad con que los Rs son eliminados (189). El número de Rs varía ampliamente entre los diferentes tejidos. Esta distribución celular desigual condiciona la respuesta a la hormona, lo que ha dado pie al concepto de célula diana (189). La propia hormona actúa regulando negativamente la transcripción del gen del receptor, sobre todo cuando es usada en exceso. Esto hace que disminuya la cantidad de proteína en el interior de la célula. Aunque esto ocurre de manera general, hay algunas excepciones. Así dosis fisiológicas de estrógenos o andrógenos inducen la síntesis de sus propios receptores (189, 26). Existen numerosos ejemplos de que una hormona puede regular los Rs de otra, como la síntesis de Rs de progesterona que es inducida por los estrógenos en endometrio uterino y en células de cáncer de mama en cultivo. En el endometrio juega un papel decisivo en el proceso que regula la transición de la fase proliferativa a la secretora en el ciclo menstrual. En el cáncer de mama, es una propiedad que se utiliza para determinar la capacidad de respuesta celular a los estrógenos (189). El destino de los receptores tras su activación es un tema aún sin aclarar. Parece que los receptores sufren un proceso de destrucción (por medio de proteolisis) o procesamiento, inducido por la hormona. También se ha comentado la posibilidad del reciclaje de los Rs, pero sólo ha sido confirmada en el caso de los glucocorticoides (189, 26). 1.4.1.5. Algunas funciones de los receptores hormonales nucleares Aunque existen algunas diferencias respecto a la organización celular de determinados receptores hormonales esteroides, al final todos actúan estimulando o reprimiendo la producción de ARN de genes sensibles, conduciendo a cambios en la síntesis proteica y de la función celular. Los receptores hormonales nucleares acumulan en una sola molécula varias funciones: Introducción 36 - Son capaces de reconocer y unirse con alta afinidad a pequeñas moléculas, como los esteroides, con un alto grado de especificidad. - Son capaces de reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN, que están presentes sólo en los genes objeto de su regulación. - Son capaces de interactuar con otras proteínas que participan en la maquinaria de transcripción genética, e iniciar o modificar la expresión de genes específicos. 1.4.1.6. Técnicas de estudio de los receptores esteroideos Los receptores hormonales fueron descubiertos a principios de los sesenta, cuando la tecnología para marcar radiactivamente los esteroides fue factible. Así, Elwood Jensen, en Chicago (USA), al obtener estradiol tritiado pudo demostrar la existencia de un componente protéico intracelular que se unía específicamente a esa hormona (116). Durante muchos años, la única tecnología disponible para determinar la concentración de receptores esteroideos, y poder estudiar sus propiedades estuvo basada en el uso de ligandos (esteroides) marcados radiactivamente. Esto permitió obtener datos bioquímicos acerca del propio receptor, e información acerca de su número y su afinidad (24, 189). Esta técnica tenía un gran inconveniente, se trabajaba con homogenados de tejido donde era imposible discriminar entre receptores en tejido maligno del tejido no maligno. Además este método era laborioso y el equipo necesario caro (94, 203). Las primeras técnicas inmunohistológicas que se usaron para demostrar RE en secciones de tejido, utilizaron anticuerpos policlonales para estradiol (132) aplicados también en secciones de tejido fresco congelado (37) o en secciones de tejido fijado en formol e incluido en parafina (37). Este método tenía algunos inconvenientes, como la falta de especificidad o la dificultad a la hora de ser reproducida, por lo que se buscó una técnica inmunohistoquímica con más especificidad para demostrar receptores estrogénicos. Introducción 37 En los años 80, Green et al (88) desarrollaron unos anticuerpos monoclonales altamente específicos para receptores esteroideos y un método inmunoperoxidasa monoclonal, para receptores de estrógenos en secciones congeladas, que ha permitido identificar al receptor sobre cortes de tejido o medirlo directamente a partir de homogenados. Pero este método no permitía realizar estudios retrospectivos debido a que se necesitaba tejido congelado. Por otra parte, esta técnica fue la primera que determinó la localización de los RE en el núcleo (203). Unos años después, Pascal et al (193) desarrollaron una nueva técnica inmunoperoxidasa utilizando anticuerpos policlonales anti E2, la cual permitía detectar RE en tejido fijado en formol. Los métodos inmunohistoquímicos posibilitan identificar, sobre un corte de tejido, los tipos celulares que acumulan receptores, e incluso en función de la intensidad de la señal, obtener una valoración semicuantitativa de la población disponible (189, 94, 182). Este dato es muy importante ya que permite monitorizar la expresión del factor en cuestión según las oscilaciones hormonales del ciclo y, por tanto, obtener información de su estatus en función del equilibrio hormonal. Gracias a esta técnica se puede hacer una valoración semicuantitativa de la intensidad de tinción y del número de células afectadas, y puede emplearse también para la obtención de índices que correlacionarían adecuadamente los datos tradicionales obtenidos a partir de homogenados tisulares (189). Otra técnica que ha venido a completar la técnica anterior es la genética molecular, que permite valorar la funcionalidad de los receptores identificados (189, 102, 115). Los métodos inmunohistoquímicos a partir de anticuerpos antirreceptores, sólo permiten informar de la existencia y magnitud de la población de receptores sobre tejidos o células. La disponibilidad de ADN recombinante para cada tipo de receptores ha permitido identificar el ARN específico y, a partir de la construcción Introducción 38 de cadenas apropiadas de nucleótidos, detectar si la transcripción es activa, es decir, si hay expresión funcional. La hibridación in situ es una técnica que permite, sobre cortes de tejido, identificar si en dicho tejido existe ARNm específico del receptor, es decir, si hay transcripción activa. También la electroforesis ha sido utilizada para identificar el ARN. 1.4.1.7. RE y RP en el endometrio El sistema genital femenino, al igual que la mama, es un órgano diana primario de las hormonas esteroideas, estrógenos y progesterona. Los receptores esteroideos están representados a lo largo de todo el tracto reproductor en ovarios, útero, cérvix y vulva. La dependencia hormonal es particularmente marcada en el endometrio, con una elevada expresión en la mujer premenopáusica de ambos receptores: estrogénicos y de progesterona. Al igual que en la mama normal, los receptores en el endometrio varían notablemente su concentración, con las fluctuaciones que ocurren en sus respectivos ligandos a través de todo el ciclo menstrual. En común también con la mama, los receptores de hormonas esteroideas se mantienen en el sistema reproductor femenino durante el proceso neoplásico, y de forma similar desaparecen conforme disminuye la diferenciación tumoral (91). Gracias a las técnicas inmunohistoquímicas se ha podido estudiar la expresión de RE y RP a través del ciclo menstrual (189). En relación con los RE, se ha visto que el epitelio glandular expresa mayor intensidad de RE que el estroma, lo que hace que destaquen las glándulas sobre un fondo homogéneo del estroma. Otra característica que se puede destacar, es la heterogeneidad encontrada entre las glándulas, e incluso dentro de las mismas glándulas; lo que traduce distintos niveles de expresión de RE en áreas vecinas. Introducción 39 En relación a estas características, una observación frecuente es el escalonamiento en la intensidad de tinción, casi siempre a favor del estrato basal del endometrio, con pérdida progresiva de la señal a lo largo del estrato funcional. También las muestras del fundus uterino tienden a presentar una expresión más rica que las obtenidas en áreas cercanas al segmento (189). Los niveles de RE en las glándulas son indetectables a comienzos del ciclo, pero van progresivamente ascendiendo, y resultan máximos al final de la fase proliferativa, después se produce un descenso a lo largo de la fase secretora, con desaparición a partir de la mitad de la misma (189, 175). En situaciones especiales como el embarazo, en que los niveles de progesterona siguen altos, el índice de RE se encuentra bajo (189). El estroma sigue oscilaciones similares, aunque al comienzo del ciclo acumula RE en mayor medida que el epitelio, y al final de la fase secretora su disminución es menos marcada (189). El miometrio muestra siempre una tinción leve o negativa (189). Respecto a los RP tienen un patrón similar que el descrito para los RE. En el estroma y en el miometrio se encuentra homogeneidad, sin embargo a nivel de las glándulas endometriales se puede observar heterogeneidad, aunque con menor frecuencia que para los RE (189). Se mantiene la diferencia entre la intensidad de tinción en glándulas, estroma y miometrio, y hay una tendencia a mayor intensidad de tinción en la basal endometrial. El comportamiento a nivel de las glándulas es paralelo al de los RE, cuando la expresión de los RE es alta, también muestra una alta expresión para RP. La heterogeneidad en los casos de los RP hace que en ocasiones puedan aparecer glándulas con áreas negativas y/o con tinción máxima (189) La expresión de los RP disminuye en la fase luteínica (secretora), e incluso puede llegar a desaparecer a partir del día 21 del ciclo (189). Introducción 40 El estroma muestra un aumento ligero de la tinción sobre lo observado para los RE y también sigue un patrón homogéneo. Se ha observado también una acumulación de tinción en las regiones periglandulares (como ya ocurría con los RE) (189). A diferencia de lo que ocurría con los RE, los RP no disminuyen significativamente en el estroma al inicio de la fase secretora y sus niveles son altos en la fase final de dicha fase. Estos niveles continúan altos en condiciones especiales como el embarazo o la administración crónica de gestágenos (189). El miometrio sigue un patrón homogéneo y con tinción más intensa que la encontrada para los RE. Las paredes de los vasos intramiometriales muestran en general negatividad aunque se encuentra algún caso aislado positivo. En resumen, podemos decir que la fase proliferativa se acompaña de un enriquecimiento de ambos tipos de receptores, con preponderancia para los RP en glándulas y estroma a lo largo de la fase proliferativa del ciclo, mientras que la fase secretora, ya en un periodo avanzado, se acompaña de pérdida de señal para ambos receptores en el epitelio, pero no en el estroma (189, 182, 20, 154, 216, 19). El tejido epitelial y estromal del endometrio es influido considerablemente por las hormonas sexuales tanto endógenas como exógenas. A partir de estudios experimentales y de observación parece que los estrógenos endógenos y exógenos pueden asociarse a un mayor riesgo de hiperplasia y carcinoma del endometrio. Aquellos procesos clínicos que cursan con niveles de estrógenos en suero persistentemente elevados (sin la influencia cíclica de la progesterona) como obesidad, síndrome del ovario poliquístico y tumores de células granulosas, se acompañan de un mayor riesgo de cáncer de endometrio. Mediante la adición cíclica de progestagenos se estimula la maduración y la secreción del endometrio proliferativo. Tras la supresión de la administración del progestágeno, el endometrio maduro se descama dando lugar a la llamada hemorragia por Introducción 41 deprivación. La maduración y la descamación cíclica de la superficie endometrial evitan una proliferación continuada (e hiperplasia), como se observa en el climaterio a través de la estimulación con estrógenos endógenos, y en la postmenopausia a través de la estimulación con estrógenos exógenos (189). En mujeres no histerectomizadas, la terapéutica de sustitución con estrógenos sólo aumenta el riesgo de cáncer e hiperplasia de endometrio, y por consiguiente, debe añadirse un progestágeno (189). La frecuencia de hiperplasia en el curso del tratamiento hormonal sustitutivo combinado (THS combinado) depende de la dosis y de la duración del tratamiento con progesterona (189). Debemos considerar también la importancia de los receptores hormonales esteroideos a la hora del tratamiento endocrino de los adenocarcinomas endometriales. Actualmente se sabe que es esencial la integridad del sistema de receptores hormonales y de los acontecimientos potsrecepción para que dichos tumores respondan al tratamiento endocrino. Es posible que algunas pacientes afectadas por adenocarcinoma de endometrio, aun teniendo receptores hormonales positivos, no respondan el tratamiento endocrino, debido a que dichos receptores no son funcionales o a que la transformación neoplásica puede haber producido alteraciones en el proceso después de la interacción hormona-receptor o bien en la función postranscripcional (178, 49). 1.4.1.8. Expresión de RE y RP en tumores de endometrio La presencia de receptores de hormonas esteroideas ha sido ampliamente estudiada tanto en el endometrio normal como en el patológico. En la mayoría de los casos la presencia del receptor de estrógenos en el tejido endometrial se correlaciona con la diferenciación del mismo, por lo que dicho receptor va desapareciendo a medida que los tumores son más indiferenciados. Así, en el adenocarcinoma de endometrio podría considerarse la presencia de receptores de estrógenos como un indicador de buen pronóstico del desarrollo tumoral (60). Introducción 42 Greastman (86) estudió el valor pronóstico que tenían los receptores hormonales en el cáncer de endometrio. Evaluó los niveles de receptores de esteroides, en 270 pacientes con carcinoma de endometrio en estadío I y II, y comparó con otros factores pronósticos con análisis univariantes y multivariantes. Como resultado obtuvo que las pacientes con receptores positivos tenían una mayor supervivencia que otras pacientes con receptores negativos, por lo que determinó que los receptores hormonales en el carcinoma endometrial parecen ser un importante factor pronóstico. Igualmente, examinó la relación de los receptores hormonales con otros factores clínico-patológicos como el estadío precoz, el grado histológico, la profundidad de invasión, la afectación del cérvix, la presencia de metástasis extrauterinas o nódulos linfoides o la presencia de células malignas en el lavado peritoneal. Investigó cada uno de los receptores independientemente con cada uno de los factores y vio que la presencia de RE se asociaba significativamente (P<0´01) con diferenciación histológica, diferenciación nuclear, y menor número de metástasis extrauterinas. Sin embargo, no encontró relación significativa entre los RE y la invasión miometrial, la afectación cervical y la citología peritoneal. También vio que había menos RE positivos en lesiones de los adenocarcinomas papilares y los carcinomas de células claras. Los RP resultaron tener una asociación significativa (P<0´05) con el subtipo histológico y diferenciación histológica. El resto de los factores clínicos no se asociaron con los receptores de progesterona. Al estudiar conjuntamente los RE y RP encontró una asociación significativa (P<0´05) con la diferenciación histológica, la citología peritoneal positiva, las metástasis demostradas histológicamente y la categoría histológica. Al analizar los receptores esteroideos por separado (RE, RP y RE/RP), se vio que cuando las lesiones eran positivas para dichos marcadores, había una mayor supervivencia libre de enfermedad que cuando los receptores eran negativos. Introducción 43 Parece que los niveles de receptores son un importante predictor de cómo responderá el tumor a los tratamientos con progesterona. Friberg y Norén (70) hicieron un estudio prospectivo sobre el valor pronóstico de los receptores esteroideos para una supervivencia de 5 años en el estadío II del cáncer de endometrio. Se utilizó la técnica de DCC (dextrano coated charcol). Se examinaron 57 pacientes con estadío II de carcinoma de endometrio, de ellas un 16% bien diferenciados (Grado 1), un 45% moderadamente diferenciados (Grado 2) y un 39% pobremente diferenciados (Grado 3). Todas las pacientes recibieron tratamiento radioterápico intracavitario o cobaltoterapia en el canal cervical y vagina durante 4 semanas tras la cirugía o el legrado y 37 de estas pacientes recibieron irradiación externa. Según este estudio, 3 pacientes mostraron negatividad para los RE (1 de grado 2 y 2 de grado 3) las cuales tenían también RP negativos. Un total de 19 pacientes mostraron negatividad para los RP (2 de grado1, 3 de grado 2 y 14 de grado 3). La supervivencia total a los 5 años fue de 82% (47 de 57 pacientes). Se encontró correlación entre la concentración de receptores y el grado tumoral, con una diferencia significativa entre grado 1 y 2 con los de grado 3. Todas las pacientes con RE negativos sobrevivieron al igual que todas las pacientes con RP negativos en los grados 1 y 2. De las pacientes con grado 3 que murieron, 4 de las 6 tenían RP negativos y de las pacientes con grado 3 que sobrevivieron 10 de las 16 tenían RP negativos. Como conclusión vieron que no había diferencias significativas entre la concentración de RE y RP entre las mujeres que sobrevivían a los 5 años y las que morían. Carcangiu (25) y Chambers (30) investigaron la correlación entre los factores clínicos e histológicos con los receptores de estrógenos y progesterona por métodos inmunohistoquímicos. Para el estudio revisaron una serie de 183 Introducción 44 casos de carcinoma primario endometrial y se valoró en cada uno de los casos la expresión de RE y RP en el componente benigno y maligno de cada una de las piezas (epitelio benigno, estroma y miometrio), que fue examinado separadamente así como la intensidad de la tinción tumoral. Los adenocarcinomas endometrioides demostraron tener el más alto grado de positividad para ambos receptores seguido por carcinomas adenoescamosos, carcinoma seroso y carcinoma de células claras. La positividad para RE y RP del componente maligno fue correlacionado estadísticamente con el estadío de la FIGO (P<0´001) y el grado nuclear (P<0´0001) de los tumores. No encontró asociación entre la profundidad de invasión miometrial y cada uno de los receptores en el componente maligno. Hubo una asociación significativa entre la presencia de invasión de los vasos linfáticos y la positividad para los receptores de progesterona. Los resultados de este estudio indican que los análisis inmunohistoquímicos de receptores esteroideos ofrecen una excelente alternativa al proceso bioquímico estándar. En un estudio realizado por Henrick et al (98), examinaron la correlación entre RE y RP, y el tipo histológico, el estadío, la edad de las pacientes, los años desde la menopausia y el uso previo de estrógenos, todo ello en relación al carcinoma de endometrio. Para valorar los RE y RP utilizaron técnicas bioquímicas o inmunohistoquímicas.. Como resultado obtuvieron que los RE y RP determinados por técnicas bioquímicas o inmunohistoquímicas tenían una relación inversa (P<0´001) con respecto a la clasificación de la FIGO y con el grado tumoral. Además encontraron una correlación inversa (P<0´0001) entre el estadío clínico y los valores de receptores por métodos bioquímicos, que fue independiente del grado de la FIGO. La edad de las pacientes, los años transcurridos desde la menopausia Introducción 51 mediante formol y parafina. Muchos otros investigadores como Key (127), Shi et al, (223), trataron de mejorar la técnica inicial de Gerdes et al, pero serían Cattoretti et al (27) quienes en 1992, consiguieron teñir los núcleos de las células, en muestras de tejido fijado en formol e incluido en parafina, utilizando un proceso de calentamiento en microondas. Con las técnicas actuales de inmunohistoquímica, el antígeno Ki-67 se detecta a nivel nuclear independientemente del tipo celular en que se exprese y del punto del ciclo celular en que se encuentre, excepto en las fases de mitosis que el marcaje se extiende al citoplasma y en la fase G0 de reposo que está ausente. Actualmente se están utilizando técnicas microscópicas y no microscópicas para estudios de proliferación celular. Entre ellas tenemos: a) Técnicas no microscópicas: - Citometría de flujo. - Medición de incorporación de nucleótidos radioactivos en replicación de ADN por recuento de líquido centelleante. b) Técnicas microscópicas: - Autorradiografía. - Inmunocitoquímica. - Contaje de mitosis. En general, las técnicas microscópicas son usadas para determinar en el tejido la cantidad de células y la localización de las células en proliferación. Sin embargo, las técnicas no microscópicas permiten un simple análisis cuantitativo de la proliferación celular y crecimiento celular. Las técnicas de autoradiografía, emplean fósforo radiactivo y timidina tritiada, que son incorporadas a las células que duplican su ADN (fase S del ciclo celular) y juegan un papel fundamental en el estudio del ciclo celular. Dada su alta sensibilidad, estas técnicas permiten no sólo la localización de las células en Introducción 52 replicación en el tejido, sino que además también determinan varios parámetros cinéticos en células en renovación. Sin embargo las técnicas que utilizan nucleótidos radiactivos tienen algunos inconvenientes, como el peligro que conlleva la manipulación del material, o la imposibilidad de su aplicación en tejido humano. La identificación de proliferación, relacionado con antígenos, junto con la producción de anticuerpos específicos para su detección, abre nuevas perspectivas en el estudio del ciclo celular. Así, la detección inmunoquímica de antígenos de proliferación es fácil de realizar, rápida y además de alta resolución. Estos métodos también se pueden utilizar para detectar marcadores endógenos de proliferación tales como el antígeno Ki-67 y el antígeno de proliferación nuclear y pueden ser aplicadas en tejidos humanos. Existen marcadores exógenos de proliferación, como el bromo y el yododesoxiyuridina, los cuales han sido utilizados para obtener detalles cinéticos en pacientes terminales, pero los efectos mutagénicos de estos nucleótidos en células eucariotas restringe su aplicación en humanos. Una interesante posibilidad que ofrecen los métodos inmunohistoquímicos microscópicos es la detección simultánea de múltiples antígenos en el mismo caso o en la misma sección de tejido. La técnica inmunocitoquímica y la citometría de flujo son técnicas inmunoquímicas complementarias. Las técnicas inmunocitoquímicas demuestran dónde y cuales son las células en proliferación, pero la cuantificación de los resultados puede ser difícil o costar mucho tiempo su realización. La utilización de técnicas de citometría de flujo, permite correlacionar la expresión del ciclo celular relacionado con antígenos, con el contenido nuclear de ADN, el cual es el parámetro básico para evaluar la posición de la célula en el ciclo. Además los análisis de citometría de flujo, proporcionan fácilmente detalles cuantitativos. Sin embargo puede perderse alguna información concerniente a la posición de la célula dentro del tejido. Introducción 53 Método inmunohistoquímico utilizando el anticuerpo Mib-1, reconoce el antígeno Ki67 en material fijado e incluido en parafina, por lo que resulta idóneo para calcular la fracción de proliferación de una población celular. Al utilizar dichos anticuerpos se expresa el antígeno Ki 67 en el núcleo de las células positivas. Este sistema aporta rapidez y sencillez técnica y permite la aplicación de análisis de imagen para cuantificar la fracción de proliferación (41). Inmunohistoquímicamente actualmente se utiliza el anticuerpo Mib-1 para la demostración del antígeno Ki 67 en secciones incluidas en parafina. La localización de la proteína es a nivel del núcleo independientemente de la extirpe celular en la que se expres, y del punto del ciclo celular en que se encuentre, a excepción de la fase G0 en la que como ya hemos señalado se encuentra ausente, y en la fase de mitosis en la que el marcaje se extiende al citoplasma. El patrón de tinción nuclear es habitualmente granular, con reforzamiento nucleolar ocasional (232). En los últimos años, se están realizando múltiples estudios respecto a la proliferación de diferentes tumores buscando implicaciones tanto diagnósticas como pronósticas. 1.4.2.4. Expresión de Ki-67 en algunos tumores El marcador de proliferación Ki-67 ha sido demostrado a nivel nuclear en múltiples tumores, como en el carcinoma de mama (4), carcinoma colo-rectal (197), linfoma de Hodgkin (80), tumores de piel (232), el carcinoma de cérvix (76). El aspecto más interesante del estudio de la determinación de la expresión del antígeno Ki-67, reside en la posibilidad de poderlo establecer como factor pronóstico en diferentes neoplasias. Además también se ha relacionado con otros factores, tanto clínicos como histológicos, que influyen en el pronóstico de los tumores (127). Al revisar la bibliografía existente sobre el índice de proliferación Ki-67, hemos encontrado algunos estudios en relación con algunos tumores, pero Introducción 54 desgraciadamente no hemos podido localizar ninguno en que estudiara la relación entre este marcador y el carcinoma endometrial, al cual nos referimos en nuestra investigación. Soyer (232) investigó sobre la relación del índice de proliferación Ki-67 en tumores de piel. Para ello utilizó una muestra de 145 tumores melanóticos, de los cuales 38 eran nevus, 72 melanomas primarios y 35 melanomas malignos con metástasis. Todos ellos fueron teñidos con anticuerpo monoclonal Ki-67 con la técnica de los tres pasos de inmunoperoxidasa y se valoró a nivel de positividad de Ki-67 en el núcleo. Determinó que cuanto mayor es el grado de densidad de Ki-67, mayor es el grado de malignidad de los tumores melanóticos. Encontró también una relación significativa con el índice de Breslow, el nivel de invasión de Clark´s y el grado de mitosis. Por otro lado demostró que existían diferencias significativas entre el índice pronóstico Ki-67 y la supervivencia libre de enfermedad y el mismo índice con la aparición de metástasis. Después del seguimiento de los pacientes durante 24 meses, encontró que cuanto mayor era la expresión de Ki-67, menor era la supervivencia y además era más frecuente encontrar metástasis Garzetti et al (76) estudiaron el significado pronóstico de la inmunotinción con Mib-1 y el carcinoma cervical escamoso estadío I, con respecto al tamaño tumoral, la propagación linfática y secuencias clínicas. Por otra parte investigaron también la posible relación entre el índice Mib-1 y la actividad de los Natural Killer. Para su estudio utilizaron 34 casos con carcinoma cervical escamoso estadío I, y encontraron una relación significativa entre la inmunotinción Mib-1 con el tamaño tumoral. En particular, los tumores de tamaño mayor de 3 cm tenían un mayor índice de Mib-1, comparando con los tumores menores de 3 cm. Además se encontró relación significativa entre el índice de proliferación y la extensión linfática. Por el contrario, no se comprobó relación entre al grado de diferenciación histológica y la inmunotinción Mib-1. Introducción 55 Por otra parte, el análisis de Cox mostró una relación significativa entre la inmunotinción y el tiempo de supervivencia libre de enfermedad, independientemente del tumor y la invasión linfática y vascular. En resumen, se encontró correlación significativa entre tamaño tumoral, invasión vascular y linfática y supervivencia libre de enfermedad. No se demostró relación respecto al grado histológico. Wintzer et al (259) estudiaron la relación entre el marcador de proliferación Ki-67 (Mib-1) y la mama, tanto en la mama sana, como con lesiones benignas y malignas. Sus resultados determinaron que la positividad de Ki-67 era más baja para los tejidos normales y benignos que para los carcinomas. Además, dentro de los carcinomas resultó que la positividad a dicho marcador aumentaba conforme mayor era el tamaño del tumor, mayor era el grado del tumor y cuando los ganglios linfáticos estaban afectados. Sin embargo no encontraron relación entre el Ki-67 y el tipo histológico, ni con el estado premenopáusico, perimenopáusico o postmenopáusico o con las metástasis. Por otra parte, sus resultados mostraron que el Ki-67 se correlacionaba inversamente con el nivel de progesterona (RP). Respecto a la asociación de estos marcadores con la supervivencia no pudieron establecer si había o no asociación, ya que según el método estadístico que utilizaban, obtenían diferentes resultados. Gerdes (80) relacionó el marcador Ki-67 con los linfomas no-Hodgkin, y determinó que dicho marcador tiene valor pronóstico en dichos linfomas. Porschen et al (197) estudiaron el marcador de proliferación Ki-67 en los carcinomas colorectales, pero no encontraron relación entre dicho marcador y otros parámetros clínico-patológicos, como la edad, el sexo, el tamaño del tumor, la diferenciación tumoral o el estadío del tumor. Tampoco encontraron diferencias entre la zona periférica del tumor, la zona intermedia o la zona central. Introducción 56 1.4.3. PROTEÍNA SUPRESORA TUMORAL P53 La molécula P53 fue descrita por primera vez en 1979 por Lane y Crawford (146, 24) como una proteína de 53 KDa de origen no vírico, presente en células transformadas por el virus SV40 (Simian Virus 40), y desde el comienzo se relacionó con la transformación celular (24). Pronto otros autores como Liezer (24, 162), confirmaron este estudio. Además, también se encontró esta proteína en células infectadas por el virus Epstein Barr (EBV) (24, 164) y por adenovirus (24, 215), así como en células transformadas por medios físico-químicos (24, 47) y en células tumorales primarias (24). Por otra parte la P53 se encontró en células normales no transformadas como timocitos y células embrionarias. Aunque los niveles son muy bajos en comparación con los encontrados en las células transformadas. Este hallazgo hizo pensar que la presencia de la P53 no sólo se limitaba a la transformación celular, sino que también debía tener una función habitual dentro de la fisiología celular (24). Esta proteína se expresa en todas las células del cuerpo, encontrándose los niveles más elevados en el timo, los testículos y el ovario (órganos que tienen un sistema activo de recombinación) (158). La proteína P53 se encuentra en escasa cantidad en las células normales debido a su corta vida, entre 6 y 20 minutos dependiendo del tipo celular (24, 185). Así, la P53 mediadora de la actividad transcripcional se encuentra baja o ausente en células normales (158). En el año 1983 se clonó y secuenció el gen de la P53 de ratón (24, 186) y un año más tarde se aisló el gen humano (24, 166). El gen p53 humano, comprende 20 KB de ADN en el brazo corto del cromosoma 17 en posición 17p13.1 (158). Este hallazgo permitió relacionar este Introducción 57 gen con diferentes patologías en las que existía evidencia de alteración de este cromosoma. El gen está formado por 11 exones. Inicialmente la P53 fue considerada una oncoproteína. A partir de 1989 Green (87) sugirió la posibilidad de que la P53 fuese en realidad un miembro de la familia de los antioncogenes, (tumor supresor de genes, oncogén recesivo o antioncogén), familia integrada básicamente por el gen del retinoblastoma (RB) (24, 87). La diferencia esencial entre un oncogén y un antioncogén consiste en que mientras en el primer caso es la presencia del producto lo que determina la transformación (oncogén dominante); en el segundo, la causa del proceso de transformación es su ausencia o inactivación (oncogén recesivo) (24). La existencia de este tipo de genes se sospechaba desde principios de la década de los setenta (24, 131). Esta suposición estaba basada en estudios de genética clásica, ya que los pacientes con retinoblastoma hereditario heredaban un alelo mutante inactivo (24, 132). Por lo tanto, el tumor aparece cuando el alelo normal sufre una deleción o una mutación que lo inactive. A mediados de la pasada década se identificó el gen responsable de la susceptibilidad para padecer retinoblastoma: el gen RB (24, 71). Posteriormente, se demostró que la inactivación del gen RB también puede contribuir a la génesis de otros tipos de neoplasia como osteosarcomas, carcinoma de pulmón, mama y vejiga (24, 71, 108). La capacidad del p105-RB como antioncogén quedó patente cuando se demostró que la reintroducción de un gen RB normal en células de osteosarcoma y retinoblastoma suprime el fenotipo neoplásico (24, 109). La p105-RB se identificó como una de las dianas celulares de los virus oncogénicos, principalmente adenovirus y SV40, al igual que ocurre con la P53. En el caso del virus SV40, el antígeno T forma complejos tanto con P53 (24, 146, 162) como con p105-RB (24, 46). Los adenovirus poseen dos oncogenes dominantes, E1A y E1B, que interaccionan con p105-RB y P53 respectivamente Introducción 58 (24, 215, 258). Para Green, uno de los mecanismos por los cuales estos virus inducen transformación sería el secuestro de estas proteínas celulares mediante la formación de complejos con ellas. Al revisar los clones de p53 utilizados en los experimentos de cotransformación (24, 119, 191) se ha demostrado que eran variantes con mutaciones puntuales, lo que ponía en cuestión los experimentos de transformación realizados hasta el momento. Paralelamente, se realizaron otros estudios de transfección, llevados a cabo con las variantes normales no mutadas (Wild-tipe) que han demostrado ser incapaces de inducir inmortalización o cotransformación con el oncogén ras (24, 171). Las formas mutantes del gen p53 parecen diferenciarse de las normales en los siguientes aspectos: a) la capacidad de unión al antígeno T de SV40 disminuye o desaparece; b) formación de complejos con la proteína de 70 KDA de la familia heat shock proteins, hsc70, y c) en el caso murino, desaparece el epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal Pab246 (24, 65, 236). Varios grupos han demostrado que estos mismos p53 mutantes que forman complejos con la proteína hsc70 son capaces de formar complejos estables con la P53 normal (24, 57, 135). Las mutaciones se localizan en una de las zonas más conservadas de la proteína, es decir, en una zona de probable importancia para su actividad bioquímica. 1.4.3.1. Estructura de la proteína P53 La P53 es una proteína fosforilada de 53 KDA, de localización nuclear y con una secuencia conocida de 393 aminoácidos. Una característica de esta proteína es su alto contenido en prolina (10%), que es responsable de la diferencia observada entre el peso molecular real (43-45 KDa) y su movilidad electroforética, mucho más lenta que la que le correspondería por su peso (50-54 KDa) (24, 267). La proteína P53 humana es heterogénea, mientras que la P53 murina tiene una movilidad electroforética homogénea. La P53 humana se presenta bajo la Introducción 59 forma de dos proteínas que migran con diferente movilidad, pudiendo coexistir ambas formas en una misma célula, como ocurre con ciertas líneas celulares linfoides (24, 37, 240). Posteriormente se descubrió que la diferencia observada en la movilidad electroforética de la P53 humana es debida a la existencia de dos alelos, que se distinguen por la presencia de una arginina o una prolina a nivel del residuo 72. La presencia de una prolina en esta posición hace que la proteína migre más lentamente que cuando se trata de una arginina (24, 95, 167), mientras que la presencia de un doblete de P53 en la misma célula se explica por la coexistencia de dos alelos diferentes en ella. Los 393 aminoácidos están distribuidos en 11 exones. Las regiones que codifican las proteínas se extienden desde el principio del exon 2 hasta el primer tercio del 11 (93, 24). En las regiones codificantes se encuentran cinco dominios altamente conservados que están codificados por los exones 2, 4, 5, 7 y 8, que son esenciales para la actividad funcional de la P53 y es donde se producen la mayoría de las mutaciones. Posee un núcleo hidrofóbico altamente conservado, flanqueado en los terminales amino y carboxi por otros dominios de mayor carga. La porción central tiene una conformación flexible y es donde se localiza el lugar de unión para el antígeno T del SV40. Los dominios de unión al ADN, localizados en el carboxi terminal y encargados de la transcripción, probablemente, quedan fuera de las zonas donde más frecuentemente se producen las mutaciones, pero seguramente, con estas se altera la conformación nativa de la proteína, la cual es esencial para una función apropiada de la misma (68). La proteína P53 tiene la capacidad de formar polímeros por sí misma, función que reside en el término carboxilo, de interactuar con algunas oncoproteínas víricas (proteína T del virus Simio 40 o SV 40, la E1 del adenovirus, la E6 del virus papiloma humano) y de interactuar con proteínas celulares (la proteína del shock por calor 70 o hsp70, la murina double minute 2 o MDM-2). Estas interaciones afectan a la actividad de la P53 y/o a su degradación. Introducción 60 Al ser la P53 una proteína fosforilada tanto en el término amino como carboxilo, la fosforilación en los diferentes residuos aminos se realiza mediante varias proteinkinasas. Los diferentes fenotipos inmunológicos de la P53 hallados en las células tumorales humanas podrían estar causados por diferencias en la fosforilación de la P53. La P53 se ha encontrado en todos los vertebrados estudiados pero no en otras especies (156). La proteína P53 está dividida en tres estructuras y dominios funcionales. El residuo del aminoácido terminal 1-42 interactúa con la maquinaria transcripcional de la célula. Cuando los residuos 1-42 se unen con una proteína (gal 4) que contiene un dominio de unión al ADN, la proteína híbrido intensifica la transcripción de un gen test, conteniendo secuencias de gal4, unido a ADN. Los residuos de P53 aminoácidos 22 y 23 que mediante este contacto con los componentes de la transcripción basal en una célula son residuos los cuales se unen a una TATA uniendo factores asociados a proteínas o TAF de 31,000 MN (TAF-31). Así, el residuo amino terminal P53 contacta el componente de la proteína TAF-31 de la TFIID factor basal de la transcripción y regula positivamente la transcripción de esta forma. 1.4.3.2. Funciones de la proteína P53 La proteína P53 se ha asociado con múltiples funciones a parte de su papel oncogénico. Se le ha implicado en casi todas las formas de estimulación e inhibición del crecimiento celular con funciones específicas, dependiendo de las especies y tejidos estudiados. Parece ser que la P53 es requerida en los pasos más precoces de la inducción de la proliferación celular (147). También es una proteína reguladora de la transcripción, capaz tanto de estimular como reprimir la expresión de diversos genes (148, 157). Introducción 67 La P53 no es esencial para la progresión de la célula a través del ciclo celular y tampoco tiene un papel relevante en los procesos de desarrollo y diferenciación celular en condiciones fisiológicas. Esto se ha demostrado mediante la obtención de ratones genéticamente modificados en los que no se expresa este gen y la observación de que su desarrollo es normal (96). Sin embargo, la P53 regula negativamente el crecimiento y la división celular (165). La gran diferencia observada entre los ratones que no expresan P53 y los ratones normales es que los primeros son mucho más susceptibles al desarrollo de tumores y poseen un comportamiento probablemente más agresivo del esperado (96). Esto confirma el papel de la proteína P53 como supresora de la transformación neoplásica celular. La P53, mediante su unión a secuencias específicas de ADN, es capaz de inhibir la transcripción de genes adyacentes y así prevenir la proliferación celular incontrolada (82). Un exceso de P53 normal en la fase G1 tardía del ciclo celular impediría el paso a la fase S. También es posible que niveles normales de P53 puedan actuar en otros momentos del ciclo celular regulando negativamente la división celular. A pesar de esta influencia reguladora parece poco posible que la ausencia o pérdida de la P53 normal por sí sola, sea suficiente para desencadenar una división celular incontrolada. De hecho, algunas células tumorales pueden presentar una pérdida de su integridad genómica a pesar de tener los dos alelos del P53 normales, lo que sugiere que debe haber vías alternativas que permitirían saltar el papel de guardián del genoma de la P53. La expresión de la proteína P53 está regulada en células no transformadas, por el propio “turnover” de la proteína y por los niveles de su RNAm. Las células transformadas tienen alterada esta regulación lo que supondría una alteración del control de la división de dichas células. Introducción 68 1.4.3.5. Determinación inmunohistoquímica de la P53 La proteína P53 ha sido objeto de numerosos estudios inmunohistoquímicos en los últimos años. Ello se ha debido principalmente a la disponibilidad de varios anticuerpos monoclonales y policlonales, la mayoría de ellos con posibilidad de uso en tejidos incluidos en parafina. De forma genérica se ha aceptado que la proteína detectada con estos anticuerpos era la forma mutante, ya que el incremento en su vida media es capaz de causar una acumulación nuclear detectable con métodos inmunohistoquímicos (255). Poseemos muchos anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, frente a epítopos diferentes de la proteína P53, y su reconocimiento puede verse afectado en gran medida por la conformación de la proteína. Algunos anticuerpos tienen más afinidad por la proteína normal (Mab 421), otros por algunas formas mutadas (Pab 240 y Mab 240) y otros reconocen ambas (Pab 1801, Mab 1801, Pab 421, CM-1, DO-1,2 y 7, BP53-12). Hay que tener en cuenta, que al igual que en todos los procedimientos de laboratorio, y en concreto en inmunohistoquímica, las condiciones de fijación y procesamiento de la muestra, el anticuerpo utilizado y la técnica empleada pueden inducir variaciones en el resultado final (66). 1.4.3.6. Estudios de la expresión de la proteína P53 en carcinomas de endometrio Ito et al (114) investigaron la posible relación entre la sobreexpresión de la proteína P53 y el pronóstico del carcinoma de endometrio. Para ello estudiaron 221 casos de cáncer endometrioide. Encontraron una relación estadísticamente significativa entre la sobreexpresión de P53 y la recurrencia de enfermedad. Introducción 69 Al realizar un estudio multivariante, se encontró que la sobreexpresión de P53 era un factor de riesgo independiente cuando lo comparaban con el estado clínico, el grado nuclear y la edad de las pacientes. Para estos autores sus descubrimientos indican que la sobreexpresión de P53 puede ser un importante instrumento para identificar pacientes con alto riesgo de recurrencia, quienes de otra forma no son detectados por la clínica general y la evaluación patológica, especialmente en tumores en estado precoz. Por tanto, podría servir para planear el seguimiento y tratamiento de estos tumores. Hamel et al (93) estudiaron el valor pronóstico de la expresión de P53 y del antígeno de proliferación nuclear celular (PCNA). Revisaron 221 casos de carcinoma de endometrio. En su estudio no encontraron evidencias que concluyan que la supervivencia libre de enfermedad difiera con respecto a la expresión de PCNA. Por el contrario, la intensa expresión de P53 (66% o más del área nuclear teñida) fue significativamente asociada con compromiso del tiempo de supervivencia libre de enfermedad. Además la intensa expresión de P53 fue significativamente asociada con otros indicadores pronósticos, incluyendo el estadío, el grado, la profundidad de invasión miometrial, el subtipo histológico, la ploidia del ADN y la expresión de HER-2/neu. Estudios multivariantes realizados identificaron cuatro factores pronósticos independientes para el tiempo de supervivencia libre de enfermedad en el carcinoma de endometrio: la intensa expresión de p53, el subtipo histológico, el estado de ploidia de ADN y la expresión de HER-2/neu. Llegaron a la conclusión de que cuando ninguno de estos cuatro factores pronóstico estaban presentes de forma independiente, la supervivencia a los cuatro años era del 96%. Por el contrario, la supervivencia es del 63% cuando uno de estos factores está presente (P<0´001) y del 40% cuando dos o más factores están presentes (P<0´001). Introducción 70 Yu et al (265) estudiaron también la expresión del antígeno de proliferación celular nuclear y de la proteína P53 en el endometrio humano con alteraciones benignas y malignas. La inmunotinción del PCNA mostraba que la proporción media de células epiteliales glandulares era significativamente menor en hiperplasia atípica que en adenocarcinoma invasivo. La inmunorreactividad de P53 fue detectada en el 47% de los adenocarcinomas invasivos, y en una pequeña proporción de endometrios que mostraban hiperplasia simple e hiperplasia atípica, en estos casos de hiperplasia la tinción sólo fue focal. Strang et al (235) estudiaron la mutación de la proteína P53 como un predictor de supervivencia en cáncer de endometrio. Estudiaron 183 mujeres con carcinoma de endometrio, de ellas un 55% fueron negativas, un 15% mostraron tinción débil, un 2% tinción moderada y un 28% fuerte. La expresión fuerte de P53 (>75% de tinción celular) fue más frecuente en carcinomas papilares serosos de útero y en carcinomas de células claras que en otros subtipos de tumores de endometrio (P<0´001). También mostraron una fuerte expresión de P53 los tumores pobremente diferenciados (P<0´01) y los tumores con grado nuclear 3 (P<0´0001). En análisis multivariantes la fuerte expresión de P53 fue altamente predictivo de peor supervivencia con una P= 0´006. Así, encontraron tanto en estudios univariantes como multivariantes que la fuerte expresión de la P53 nos indica un peor pronóstico. Kohler et al (133) estudiaron la sobreexpresión y mutación de la P53 en el cáncer de endometrio. Para ello estudiaron 107 pacientes y vieron que se producía sobreexpresión de la proteína P53 en el 20% de los adenocarcinomas de endometrio. En los tumores que expresaban P53, la mayoría de las células epiteliales malignas mostraron tinción nuclear y las células del estroma que rodean al tumor eran siempre negativas. En los casos con endometrio benigno no se observó sobreexpresión de P53. Se vio que la sobreexpresión era mayor en los casos de peor pronóstico: con Introducción 71 citología peritoneal positiva, tumor con extensión dentro del endocérvix, metástasis extrauterinas, etc. Bur et al (22) también estudiaron la expresión de P53 en neoplasias del cuerpo uterino. Encontraron que la P53 se expresa en carcinomas endometriales y sarcomas y encontraron que los casos de fuerte expresión de P53 correspondían a los casos con estadío avanzado y alto grado. Además, observaron que detectaron más frecuentemente en carcinomas papilares serosos que en carcinomas endometrioides de cuerpo. Riethdorf et al (208) evaluaron la presencia y distribución de la P53 en adenocarcinomas endometrioides de diferentes grados y estadíos, y la compararon con endometrio normal y con varios grupos con diferentes grados de hiperplasia. Los casos de endometrio normal fueron negativos para la P53. Con el incremento de grado de malignidad aumenta el acúmulo de P53. Encontraron un rango de positividad del 9% al 18% en hiperplasias, hasta un 25% en carcinomas de grado bajo o G.1, y hasta un 69% en carcinomas de alto grado G.3. Este incremento también se vio cuando se estudiaba por estadíos (Ia 17%, Ic 72%). Kihana et al (128) estudiaron la relación entre la mutación y la pérdida de alelos del gen p53 en el carcinoma de endometrio. Investigaron la alteración del gen p53 en resecciones quirúrgicas de carcinoma de endometrio y demostraron que el gen p53 era un marcador genético significativo de un peor pronóstico para pacientes con este tumor. Examinaron la incidencia de ambas mutaciones del gen p53 entre el exon 5 al 8, y la pérdida del alelo del locus del gen p53. Sólo examinaron la mutación del gen p53 en el exon 5-8 porque el 95% de las mutaciones se encuentran en esta región. Como conclusión estos autores sugieren que la alteración del gen p53, las mutaciones y la pérdida de heterocigocidad, pueden acumularse a través de varios pasos de la tumorogénesis endometrial, con genes alterados que causan mayor agresividad en el desarrollo del tumor y peor pronóstico. Por otro lado, Zheng et al (268), hicieron un estudio para ver la sobreexpresión de P53 y la persistencia de bcl-2 en carcinoma de endometrio. Introducción 72 Compararon el carcinoma papilar seroso y el carcinoma endometrioide. Para ello recogieron 42 casos, de los cuales 21 eran carcinomas papilar serosos y otros 21 carcinomas endometrioides. Para cada uno de los 42 casos utilizaron técnicas inmunohistoquímicas para P53 y bcl-2. Al comparar los carcinomas endometrioides (28´6% positivos) y los carcinomas papilares serosos (71% positivos), se vio una diferencia significativa en la sobreexpresión de P53 (P=0´005). No se encontraron diferencias significativas al comparar el grado nuclear de ambos tumores con la sobreexpresión de P53. Sin embargo sí que se apreció que en los carcinomas papilares serosos había un brusco cambio en las glándulas morfológicamente benignas que no se teñían, en comparación con las regiones intraepiteliales del carcinoma con una positividad nuclear de P53 uniforme. Por otra parte se observó en los carcinomas endometriales que había diferencias significativas en la inmunotinción con P53 entre tumores en estadío precoz y estadío tardío (P=0´01). Estos autores sugirieron que las alteraciones de P53 pueden ser un suceso precoz en el desarrollo de carcinomas papilares serosos, y pueden también relacionarse con su agresividad clínica. En cambio, esto es un acontecimiento tardío en los carcinomas endometrioides. La detección precoz de acúmulo de P53 nuclear puede ayudar a identificar lesiones precursoras de carcinoma papilar seroso. Respecto a lo referente a la proteína bcl-2 en relación con el carcinoma de endometrio nos referiremos en su capítulo específico. Tashiro et al (239) estudiaron la relación entre la mutación del gen p53 y el carcinoma seroso. El carcinoma seroso es un tipo raro de carcinoma endometrial altamente agresivo, el cual se ha asociado con rápida progresión y peor pronóstico. El carcinoma seroso y su precursor el carcinoma intraepitelial, demostraron una fuerte sobreexpresión de p53 con técnicas de inmunohistoquímica, lo que sugiere que las alteraciones del gen p53 están relacionadas con su patogenia. Introducción 73 En este estudio analizaron 21 carcinomas serosos y 9 carcinomas intraepiteliales y examinaron la mutación del gen p53. Encontraron que el 90% de los carcinomas serosos y el 78% de los carcinomas intraepiteliales contenían esta mutación. La presencia de mutación del gen p53 en el carcinoma endometrioide sugiere además, que la alteración de p53 juega un papel importante en la patogenia hacia el carcinoma seroso, posiblemente justificando el comportamiento biológico agresivo. Berchuck et al (11) estudiaron la mutación de P53 en el carcinoma de endometrio. Encontraron que en su estudio se producía sobreexpresión de la proteína mutada P53 en 20% de los adenocarcinomas endometriales. Además, se observó que la sobreexpresión de P53 se asociaba a un estadío avanzado y una peor supervivencia. Sin embargo, no se encontró sobreexpresión de P53 en los casos de hiperplasia. Esto nos hace pensar que la sobreexpresión de P53 es un acontecimiento tardío en la carcinogénesis endometrial. Reinartz et al (207) hicieron un estudio en el que examinaban la expresión de la P53, el factor de transformación de crecimiento alfa (TGF alfa), el receptor del factor de crecimiento epidermal (TGF) y el c-erbB-2 en carcinomas de endometrio. Encontraron que el aumento de la tinción de p53 y TGF mostraba una correlación estadísticamente significativa con la disminución de la supervivencia (P<0´0017 y P<0´0013 respectivamente). Además, la inmunoreactividad de P53 se correlacionaba con el tipo tumoral, el grado y el estadío. El factor de crecimiento transformado no se correlacionó con la duración de supervivencia u otras variables pronósticas. El marcador c-erbB-2 se correlacionó con el grado de tumor. En el análisis multivariante, la tinción con P53 y TGF alfa no fue un factor predictor de supervivencia independiente cuando otras variables eran tenidas encuenta (grado, estadío, tipo tumoral, presencia de invasión vascular y profundidad de invasión). El grado y el estadío fueron los únicos predictores independientes de supervivencia cuando se utilizaba el modelo de Cox. Estos resultados fueron compartidos por Bur (22) y Kohler (133). Introducción 74 1.4.3.7. Relación de la proteína P53 con otros tumores Purdie et al (201) estudiaron la expresión de P53 en tumores de colon. Vieron que había una asociación entre la aparición de expresión de P53 y el comportamiento infiltrativo del tumor, pero no con el grado de progresión del mismo (incluyendo metástasis). Wibstuba et al (260) estudiaron la sobreexpresión de la proteína P53 en lesiones premalignas y carcinomas invasores de vejiga, y además correlacionaron la expresión de P53 con el tipo histológico, el grado de diferenciación y el nivel de invasión del tumor. Para el estudio se utilizaron 52 carcinomas de vejiga, 47 carcinomas in situ, 34 displasias y 10 sujetos con tejido normal con colecistitis. La sobreexpresión de P53 fue encontrada en el 65´4 % de los carcinomas, en 44´7% de carcinomas in situ y en 32´4 % de las displasias. No se encontraron diferencias significativas en la expresión de P53 en lesiones premalignas asociadas con carcinoma invasivo y otros que no lo eran. El epitelio normal y metaplásico no expresaron proteína P53. En adenocarcinomas, no se encontró correlación entre la sobreexpresión de proteína P53 y el subtipo histológico, el grado de diferenciación o el nivel de invasión. La alta incidencia de sobreexpresión en carcinomas de vejiga y su presencia en displasia, incluso en especímenes sin carcinoma invasor, sugieren que esta anormalidad es un importante y precoz acontecimiento en la patogénesis del tumor. El progresivo incremento en la incidencia de sobreexpresión de P53 observada de lesiones premalignas a tumores invasivos, proporciona una ayuda añadida para ver que es una ruta normal para el desarrollo de carcinoma de vejiga infiltrante. 1.4.4. ONCOPROTEÍNA Bcl-2 El gen bcl-2 fue originalmente identificado en el punto de la translocación entre los cromosomas 14 y 18, t(14; 18) comúnmente encontrada en linfomas de Introducción 75 células B (83, 33). En estudios posteriores se detectó también el gen bcl-2 en estos tumores aun sin dicha translocación (38). Mediante técnicas de Southern Blot, se vio que esta anormalidad citogenética se localiza en el brazo largo del cromosoma 18, en el segmento 21 (18q21) (33). La proteína que este gen codifica es estructural y funcionalmente única, y no tiene homología significativa con otras proteínas celulares conocidas (188, 152). Además se ha visto que contribuye a la expansión de células malignas primarias, por prolongar la supervivencia celular, más que por incrementar la proliferación celular (16). El mecanismo específico por el cual la proteína Bcl-2 prolonga la supervivencia celular es aún un enigma. Lo que sí se ha podido comprobar es que el alto nivel de proteína Bcl-2 retarda o bloquea en varias circunstancias la muerte celular programada (apoptosis) (103). 1.4.4.1. Apoptosis El concepto de apoptosis nació en Australia en 1971, refiriéndose a una forma de muerte celular observada en la atrofia. Pero fueron Kerr, Wyllie y Currie quienes juntos, en 1972, propusieron el término apoptosis para un tipo de muerte celular diferente a la necrosis (126, 174). La apoptosis es una forma activa de suicidio o muerte celular, la cual ocurre tanto en condiciones fisiológicas (en las que la apoptosis es esencial), embriogénesis, crecimiento y diferenciación, como en condiciones patológicas, daño tóxico, infecciones virales, respuesta inmune o en tumores (254). La cantidad de células que hay en los tejidos es regulada por un equilibrio balanceado entre proliferación, diferenciación y pérdida celular por apoptosis. Cuando este equilibrio se pierde, aparecen alteraciones de los mecanismos de apoptosis o de diferenciación terminal, causantes de la aparición de atrofia, hiperplasia y cáncer. Introducción 76 Actualmente se conocen dos mecanismos operativos en la activación de la apoptosis: • Muerte por defecto: en este caso la muerte se produce por un método pasivo, cuando faltan los contactos intercelulares requeridos o por ausencia de factores tróficos necesarios para suprimir la apoptosis. • Suicidio activo: en este caso la activación de la apoptosis es un proceso activo, mientras que las señales que aumentan con el grado apoptóico inducen la muerte celular rápida. El proceso de la apoptosis se ha subdividido en tres diferentes fases: fase de iniciación, fase efectora y fase de degradación. La familia de la Bcl-2 parece que está implicada en la fase efectora de la apoptosis (138). La regulación genética de la apoptosis aún no se conoce con exactitud. Los genes más conocidos implicados en su control son el c-myc, p53 y bcl-2 (18). La expresión de Bcl-2 va unida a una resistencia a la apoptosis (205). La familia de la Bcl-2 incluye a un grupo de proteínas que pueden ser divididas en dos clases. Un grupo que son antagonistas de la muerte celular al sufrir la apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bfl-1, BraG.1, Mcl-1 y A-1) y otro grupo que son agonistas de la misma (Bax, Bak, Bcl-XS, Bad, Bid, Bik y Hrk) (138, 31, 104). La dimerización parece que es esencial en la función de estas proteínas como antagonista o agonista de la muerte celular. Por tanto, es la proteína derivada del oncogén Bax, la que permite la activación de otros genes para inducir apoptosis. Además, cuando se producen asociaciones de algunos genes, como BaG.1 o Raf-1, con Bcl-2 se facilita la presencia de mutaciones y la transformación maligna. La proteína Bax es capaz de formar heterodímeros con Bcl-2 que inhiben la apoptosis. El Bax homodímero promueve la apoptosis, sin embargo el Introducción 83 La proteína c-erbB-2 es una proteína transmembrana con actividad tirosinakinasa extracelular, transmembrana e intracelular (153, 42) y se expresa en todas las células epiteliales (153). La activación del gen para la producción de neoplasias en las ratas parece deberse a una simple mutación puntual, un cruce de A-T (adenina-timidina) (52, 3, 42). Sin embargo, en tumores humanos se ha visto que se produce una alteración en la amplificación y en la expresión del c-erbB-2 (42, 52, 228), aunque casi siempre compromete casi exclusivamente la amplificación del gen (153). La amplificación del gen nos lleva a una repetida duplicación de una secuencia del gen, dando lugar a múltiples copias del mismo dentro de cada célula (153), lo que nos lleva a la sobreexpresión del gen. Por ello se dice que hay una buena correlación entre la amplificación del c-erbB-2 y la sobreexpresión (59, 85, 153). 1.4.5.2. Técnicas de estudio del C-erbB-2 El c-erbB-2 puede ser estudiado por varias técnicas: la amplificación del gen puede ser detectada por Southern Blot (153, 176, 229), Slot Blot (153, 229), PCR (protein chain reaction) (153, 163), etc. La sobreexpresión RNA puede ser detectada por Nothern Blot, RT-PCR, etc. (153, 176, 163, 230); mientras que la sobreexpresión de proteínas es más conveniente detectarla con técnicas de inmunohistoquímica o Western Blot y citometría de flujo (153, 176, 198, 160). 1.4.5.3. Expresión del oncogén C-erbB-2 en el carcinoma de endometrio Respecto al endometrio muchos estudios han ido encaminados a demostrar su asociación con la expresión del oncogén c-erbB-2 (42, 207, 252). Berchuck et al (13) fueron los primeros que estudiaron la expresión del HER 2/neu en el endometrio. En este estudio se comparó el nivel de expresión del HER 2/neu en el carcinoma de endometrio con el endometrio normal. También se Introducción 84 examinó la relación entre el nivel de expresión del HER 2/neu y los factores clínico-patológicos del cáncer. Como resultado encontraron que la alta expresión del HER 2/neu se asociaba a una menor supervivencia. Igualmente se vio que la alta expresión del HER 2/neu era inversamente proporcional a los valores de receptores de estrógenos. En este estudio todas las pacientes con alta expresión del HER 2 /neu tenían receptores de estrógenos ausentes. Sin embargo no se encontró relación aparente con los receptores de progesterona. Bigsby et al (15) estudiaron la expresión del HER 2/neu, de receptores esteroideos y de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tanto en endometrio normal como en endometrio maligno. Respecto a la expresión del HER 2/neu en endometrio normal, no encontraron diferencias significativas entre la expresión en fase secretora y en fase proliferativa, debido al pequeño número de muestras estudiadas. Al contrario que Berchuck et al, Bigsby et al explicaron que la alta expresión del HER 2/neu aparecía en carcinomas de endometrio bien diferenciados, en comparación con los pobremente diferenciados, estadíos III y IV, cuya expresión era baja. Por este motivo, apuntaron que la sobreexpresión de la oncoproteína HER 2/neu puede ser importante en el inicio y en la rápida progresión de algunos cánceres de baja malignidad, al igual que para los de alto grado de malignidad. Además, Bigsby et al observaron una relación inversa entre la expresión de HER-2/neu y los receptores de progesterona. Monk et al (172) relacionaron la sobreexpresión de la proteína HER-2/neu con estadío avanzado del tumor, con la disminución de la supervivencia y un intervalo más corto libre de enfermedad en pacientes con cáncer de endometrio. Reinantz et al (207) correlacionaron el c-erbB-2 con el tipo de tumor y encontraron que había asociación, sobre todo, con el carcinoma de células claras, pero no encontraron relación con el pronóstico ni con la supervivencia. Introducción 85 Wang et al (252) realizaron un estudio en el que se intentaba ver la correlación de la expresión de la proteína c-erbB-2 y el EGFR con los factores clínico-patológicos y los receptores esteroideos. No se encontraron diferencias significativas entre el estadío quirúrgico del cáncer de endometrio y la sobreexpresión del c-erbB-2. Además, en los casos de endometrio hiperplásico, las glándulas también mostraban una fuerte expresión de la proteína c-erbB-2. Estos hallazgos sugirieron que la expresión de la proteína c-erbB-2, normalmente se mantiene durante el proceso de carcinogénesis endometrial, y que el significado de la alta expresión de c-erbB-2 en el cáncer de endometrio aún resulta indeterminada. En un estudio realizado por Czerwenka (42) se estudiaron tres grupos de mujeres, uno con endometrio normal, otro con hiperplasia de endometrio y otro grupo con carcinoma de endometrio. Se encontró que conforme mayor grado de malignidad presentaban estos tumores mayor expresión del c-erbB-2 tenían, incluso, dentro del grupo de hiperplasia, fue más prevalente en la hiperplasia compleja y atípica que en la hiperplasia simple. En los casos de hiperplasia compleja y atípica la amplificación del c-erbB-2 estaba próxima a la de los casos con carcinoma de endometrio. Esteller et al (59) buscaban la relación entre la amplificación del c-erbB-2 y el adenocarcinoma de endometrio, pero no encontraron una asociación directa entre la amplificación del gen con sobreexpresión y la progresión del tumor. Berchuck et al (11) estudiaron la sobreexpresión del oncogén Her-2/neu con respecto el carcinoma de endometrio. En su estudio vieron que un 10% de los carcinomas endometriales mostraban sobreexpresión de Her-2/neu y además se correspondía con casos con menor supervivencia. Todos estos hallazgos nos llevan a pensar que, aunque aún faltan muchos estudios que confirmen estas conclusiones, la sobreexpresión de HER-2/neu o c-erbB-2 parece ser un factor pronóstico en los cánceres del aparato reproductor femenino: de mama, de ovarios y de endometrio. Introducción 86 1.4.5.4. Expresión del oncogén del C-erbB-2 en otros tumores Debido al gran interés que todo esto ha provocado, diversos estudios han ido dirigidos a ver la relación entre la expresión y amplificación del c-erbB-2 con algunos tumores tanto del aparato genital femenino, como el de mama (153, 202, 52, 238), de ovario (90, 214, 226, 122, 63), de endometrio (42); como en otras localizaciones como el estomago (264), la próstata (253), el pulmón (125), etc. Slamon (228) fue el primero que sugirió que la amplificación del c-erbB-2 constituía un marcador de mal pronóstico en pacientes con carcinoma de mama y glangios linfáticos axilares afectados. Mostró que el oncogén c-erbB-2 se encuentra amplificado en aproximadamente un 30% de carcinomas primarios de mama y esta amplificación es un factor pronóstico independiente, de baja supervivencia e intervalos libres de enfermedad cortos en pacientes con nódulos linfáticos afectados. Posteriormente, múltiples trabajos han encontrado resultados variables y en ocasiones contradictorios entre la amplificación del gen y niveles altos de expresión de oncoproteinas y parámetros morfológicos (261, 97). Algunos de los parámetros estudiados han sido: el tipo histológico (para el cual muchos autores han encontrado alta positividad inmunohistoquímica para c-erbB-2 en carcinomas intraductales sobre todo comedocarcinoma) (12, 18), el tamaño del tumor, el grado histológico mayor, el alto grado de mitosis, la alta actividad proliferativa, las metástasis, etc. (238). La mayoría de los estudios están de acuerdo en que los carcinomas de mama con alta expresión de c-erbB-2, se asocian a un peor pronóstico de supervivencia (42, 52, 238). Todos estos estudios nos llevan a la conclusión de que a pesar de asociarse en muchas ocasiones el c-erbB-2 con factores pronósticos desfavorables y con una supervivencia global disminuida (238), por si mismo, en el cáncer de mama no es un factor de peor pronóstico (153, 238). Introducción 87 La sobreexpresión del c-erbB-2 es también un predictor de la respuesta al tratamiento habiéndose visto que responden peor a la quimioterapia (153). Otro carcinoma que ha sido correlacionado con la amplificación del c-erbB2 ha sido el de ovario. Autores como Slamon (229), Berchuck (12) y Felip (63), encontraron en sus estudios una correlación de la amplificación del c-erbB-2 con una menor supervivencia en tumores de ovario. Sin embargo otros autores no obtuvieron estos resultados, Haldane (90), Kacinsky (122), Singleton (226) y Rubin (214). HIPÓTESIS DE TRABAJO, JUSTIFICACIÓN DEL TEMA Y OBJETIVOS Hipótesis de Trabajo, Justificación del Tema y Objetivos 89 2.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y JUSTIFICACIÓN DEL TEMA El cáncer, enfermedad de aparición altamente frecuente en nuestra sociedad, es objeto de continuos estudios, guiados actualmente desde una perspectiva molecular. Esto nos permite realizar nuevas aproximaciones a la patología tumoral, buscando criterios de correlación entre los parámetros útiles conocidos, y los recién instaurados. De estos últimos surge el concepto actual del cáncer, encuadrado como la enfermedad genética más común en el hombre. El término genética se utiliza en un sentido restrictivo, referido a los cambios que tienen lugar en distintos genes, los cuales aparecen involucrados en la transformación de una célula normal a maligna. El resultado de la acumulación de dichas alteraciones estructurales genéticas, implica la aparición de productos que juegan un papel esencial en el control del crecimiento y diferenciación celular. Según esta hipótesis, el balance entre protooncogenes y antioncogenes (o genes supresores del crecimiento) es destruido por la acumulación de mutación en estos tipos de genes. El estudio de la expresión de oncogenes y marcadores de proliferación, nos pareció especialmente interesante en el cáncer de endometrio (primer tumor más frecuente ginecológico sin contar la mama), en los que el papel de los receptores de estrógenos y progesterona en los mecanismos de desarrollo tumoral es bien conocido. Por todo ello, nos propusimos realizar este trabajo tratando de cumplir los siguientes objetivos. Hipótesis de Trabajo, Justificación del Tema y Objetivos 90 2.2. OBJETIVOS En nuestro trabajo nos propusimos estudiar y valorar en 99 carcinomas endometriales, procedentes de biopsias de enfermas cuyo estudio anatomopatológico había sido realizado en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa” de Zaragoza, los siguientes parámetros: 1. Estudio de los receptores hormonales en la fase diagnóstica: receptores de estrógenos y progesterona y correlación entre ambos. 2. Valoración del marcador de proliferación Mib-1 (Ki-67) y de la proteína supresora P53 en las distintas áreas tumorales y no tumorales. 3. Expresión de oncogenes, Bcl-2 y C-erbB-2, en patología tumoral de endometrio, valorando el grado de positividad y porcentaje en los distintos grupos neoplásicos. 4. Trataremos de obtener un patrón de diferenciación de la expresión tanto en endometrio tumoral como no tumoral, de los distintos marcadores. 5. Intentaremos relacionar estos patrones de expresividad con la mayor o menor malignidad tumoral. Correlacionando los datos anatomopatológicos con los obtenidos por inmunohistoquímica. MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 92 3.1. MATERIAL 3.1.1. MATERIAL BIOLÓGICO Para la realización de nuestro estudio, se han revisado los informes de todas las biopsias realizadas en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa” de Zaragoza, desde Enero del año 1994 hasta Diciembre de 1996 inclusive. De ellos se han seleccionado 99 casos diagnosticados de adenocarcinoma de endometrio anatomopatológicamente. El diagnóstico se realizó tras el estudio de material procedente de legrados fraccionados y/o piezas quirúrgicas de histerectomías realizadas en este mismo hospital, que fueron fijadas, procesadas e incluidas en parafina según las técnicas histológicas habituales (168). Para nuestro estudio hemos agrupado los 99 carcinomas de endometrio según la clasificación de la FIGO quedando distribuidos de la siguiente forma: - G.1. 60 casos - G.2. 26 " - G.3. 7 " - E. 6 " Según el tipo de carcinomas de endometrio, el diagnóstico anatomopatológico de los 99 casos, fue el siguiente: - Carcinomas Endometrioides (CE): 93 casos •Adenoacantoma (AAD) 6 casos •Carcinoma adenoescamoso (CAE) 4 " •Carcinoma endometrioide simple (CES) 80 " Material y Métodos 99 - Hidroximethylaminomethan (TRIS) • Meck, 8382. • Reactivo líquido usado en la preparación de la solución final del revelado. - Buffer Citrato • Solución empleada para el procesamiento de las piezas en el microondas. Se obtiene mezclando una solución 0´1 M de ácido cítrico con otra solución, también 0´1 M, de citrato sódico. - Bacto FA Buffer-Dried (PBS) • Difco code 231433-8. Es una mezcla de buffer fosfato-NaCl que, una vez rehidratada, proporciona una solución tamponada salina compensada al 0´85%, a un pH de 7´2. 3.1.3. SOLUCIONES DE LABORATORIO 3.1.3.1. Preparación de la solución para el gelatinado de los portaobjetos Para la preparación de la solución para el gelatinado de los portaobjetos son necesarias las siguientes sustancias: - Gelatina: 0´50 gr. - Alumbre de cromo: 0´40 gr. - Agua bidestilada: 100 ml. Se calienta los 100ml de agua bidestilada a 40 ºC, y se disuelven los 0´50 gr. de gelatina. Después se añaden los 0´40 gr. de alumbre de cromo. Se introducen los portaobjetos en el interior de la solución preparada, se sacan de la sulución y se dejan secar apoyados en una rejilla a temperatura ambiente. Material y Métodos 100 3.1.3.2. Procesado de las preparaciones en horno microondas El proceso de las preparaciones en horno microondas se lleva a cabo en tres fases consecutivas: 1º. Colocar las preparaciones en recipientes de plástico termo resistentes, las cuales contienen buffer citrato 10mM, pH 6´0: • ( a) Solución de ácido cítrico 0´1 M/21.01 gr C6H8O7 2H20 en 1000 ml. Solución stock: b) Solución de citrato sódico 0.1 M/29.41 gr NaC6H5O7 2H2O en 1000 ml. • Solución de trabajo 2º. Procesar las preparaciones en horno microondas, en tres ciclos de 5 minutos, cada uno de ellos a 750W. (Las preparaciones no deben secarse durante la incubación). : 9ml de a + 41 ml de b, diluido en un total de 500 ml.). 3º. Dejar enfriar las reacciones a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lavar las preparaciones en TBS (50mM, TRIS; 150mM, NaCl , pH 7´6). 3.1.3.3. Preparación de la solución tamponada de fosfatos (PBS) En un litro de agua bidestilada se añade el contenido de un vial de 10 g. de Bacto FA Buffer Dried, agitando hasta su disolución. Una vez preparada la solución debe conservarse a 2-8 ºC. 3.1.3.4. Preparación de la solución Buffer Citrato Requiere la preparación de dos soluciones: Material y Métodos 101 - Solución A: Se obtiene añadiendo 21´01 g. de ácido cítrico a 1 litro de agua bidestilada, obteniéndose una solución 0´1 M. - Solución B: Se obtiene añadiendo 29´41 g. de citrato sódico a 1 litro de agua bidestilada, obteniéndose una solución 0´1 M. El Buffer citrato resulta de la mezcla de 9ml de A con 41ml de B, diluyéndolo hasta un total de 500 ml con agua bidestilada. La solución resultante tiene un pH de 6´0. 3.1.3.5. Preparación de la solución substrato cromógeno (DAB) A 100 ml de TRIS clorhídrico con comprobación del pH a 7´6, se añaden 50 mg. de DAB. Después se añade a la solución 0´06 ml. de agua oxigenada. Se aconseja manipular esta sustancia con guantes y mascarilla, ya que se ha informado de su posible potencial cancerígeno. 3.1.3.6. Preparación de hematoxilina de Mayer Necesitamos: - Hematoxilina: 0´10 g. - Agua bidestilada: 100 ml. - Yodato potásico: 0´2 g. - Sulfato alumínico potásico: 5 g. Disolver la Hematoxilina en 20 ml. de agua bidestilada. Disolver el yodato potásico y el sulfato alumínico potásico en 80 ml. de agua bidestilada. Mezclar a continuación las dos soluciones (168). 3.1.3.7. Preparación del ácido per-iódico de Schiff (P.A.S) Se precisa: - Ácido Per-iódico al 0´5 por 100, en agua destilada. Material y Métodos 102 - Reactivo de Schiff: - Fucsina básica: 1gr. - Agua destilada: 200 ml. - Acido clorhídrico N (98´3 ml. HCl, P.E. 1´16 y agua destilada hasta completar 1 litro): 20 ml. - Bisulfito sódico anhidro: 1 gr. Se ponen a hervir los 200 ml de agua destilada, se añade la fucsina y se agita. Lo dejamos enfriar hasta 50ºC y se filtra. Después añadimos el HCl 1N, y se deja enfriar hasta 25ºC y se añade bisulfito. Debe mantenerse en la oscuridad (168). 3.1.4. OTROS MATERIALES QUE HAN SIDO UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO 3.1.4.1. Material para valorar resultados Microscopio óptico binocular con lentes adaptables para luz polarizada. Marca: Olympus AH-2. VANOX-T. 3.1.4.2. Material informático Utilizamos un ordenador de marca Packard Bell Pentium 133 MHZ, modelo 2020 VGA, con las siguientes aplicaciones: - Microsoft Word 97, como procesador de textos. - Microsoft Excel 97, como hoja de cálculo para el diseño de tablas y gráficos. - Stat View, para el estudio estadístico y diseño de los gráficos. - JMP 3.1, para la realización de estudios multivariantes. Material y Métodos 103 - Microsoft Power Point 97, para el diseño de las diapositivas. - Impresora Hewlett Packard, modelo Deskjet serie 690 C. 3.1.4.3. Material Fotográfico Para obtener el material fotográfico de nuestro trabajo, se ha utilizado un microscopio marca Olympus AH-2 VANOX-T, con cámara fotográfica incorporada, marca Olympus C-35AD-4. Los carretes fotográficos utilizados han sido del tipo Kodak Ektachrome 64 ASA. 3.2. MÉTODOS De los 99 bloques de parafina seleccionados correspondientes al tumor endometrial, se realizaron secciones de 5 micras de espesor empleando un microtomo tipo LEICA BIOCUT JUNG, obteniéndose de cada uno de ellos un total de 8 secciones. Con el fin de aumentar la adherencia de las secciones a los portas y evitar su desprendimiento durante las técnicas de inmunohistoquímica, fueron utilizados portaobjetos gelatinados. Sobre las secciones obtenidas de cada uno de los 99 bloques de parafina, se realizaron las siguientes técnicas: 3.2.1. TÉCNICAS DE RUTINA Se realizaron tinciones con Hematoxilina–Eosina (HxE) y con ácido periódico de Schiff (P.A.S.) para examen histológico de rutina, siguiendo los habituales procesos de tinción. (168). Material y Métodos 104 3.2.2. TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Sobre las 6 secciones restantes se aplicó la técnica inmunohistoquímica para la demostración de los siguientes marcadores. • RE • RP • Ki 67 • P 53 • Bcl-2 • C-erbB-2 Antes de comenzar con las técnicas inmunohistoquímicas se procede a un desparafinado de las secciones. Para ello colocamos los portaobjetos en canastillas especiales para portaobjetos, y los hacemos pasar por baños de Xilol y por una serie de alcoholes en orden decreciente de graduación. Posteriormente se introduce en agua destilada, y para terminar se da un baño de PBS. Tras el proceso de desparafinado ya se pueden aplicar las técnicas de inmunohistoquímica. - En primer lugar debemos inhibir la actividad enzimática endógena de los tejidos a analizar. Una vez que las secciones han sido desparafinadas el siguiente paso va a ser incluirlas en una solución de 100 cc. de alcohol metílico + 1´5 cc. de agua destilada durante 30 minutos. - Hidratación progresiva: •Alcohol 70ºC durante 5 minutos. •Agua destilada durante 5 minutos. Material y Métodos 105 3.2.2.1. Técnica de avidina-biotina peroxidasa (ABC) - Se introducen los portaobjetos en jarras plásticas termorresistentes con solución Buffer Citrato tal como hemos explicado anteriormente, y se lleva al microondas tres ciclos durante 5 minutos cada uno. - Tras sacarlo del microondas dejamos enfriar 20 minutos. - Una vez se hayan enfriado hacemos tres lavados con tampón PBS (solución tamponada de fosfatos). - Incubación en suero de conejo normal, diluido en PBS 1/5 durante 30 minutos a temperatura ambiente (evita reacciones inespecíficas). - Se decanta (sin lavar). - Se añade el anticuerpo primario. En nuestro estudio un corte de cada caso se incuba con cada uno de los siguientes antisueros: •Antisuero Receptores de estrógenos: Incubación durante 60 minutos con el anticuerpo primario anti receptores de estrógenos, clon 1D5 (DAKO M7047), diluido en PBS 1/100, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. •Antisuero Receptores de progesterona: Incubación durante 60 minutos con el anticuerpo primario anti receptores de progesterona, clon PR AT 4.14 (DAKO A-0098), diluido en PBS 1/50, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. •Antisuero Ki67: Material y Métodos 106 Incubación durante 60 minutos con el anticuerpo primario anti Ki 67, clon Mib-1 (Immunotech 0505), prediluido de forma comercial, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. •Antisuero P53: Incubación durante 60 minutos con el anticuerpo primario anti p53, clon DO-7, (DAKO M-7001), diluido en PBS 1/100, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. •Antisuero bcl-2: Incubación durante 60 minutos con el anticuerpo primario anti bcl-2, clon 124 (DAKO M-887), diluido en PBS 1/80, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. •Antisuero c-erbB-2: Incubación durante 60 minutos con el anticuerpo primario anti c-erbB-2, (DAKO A-0485), diluido en PBS 1/100, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. - Se elimina el sobrante y se hacen tres lavados de 5 minutos cada uno, con tampón PBS disuelto en agua. - Secamos las preparaciones a mano y procedemos a la incubación con el anticuerpo secundario biotinilado (anticuerpo de conejo antiinmunoglobulinas de ratón, ligado a biotina (Dakopatts E-354), a dilución 1:300 en PBS) durante 30 minutos, en cámara húmeda y a temperatura ambiente. - Se elimina el sobrante y se hacen tres lavados con tampón PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. - Incubación con el complejo ABC (Dakopatts X-335), durante 30 minutos en cámara húmeda y a temperatura ambiente. El complejo ABC debe prepararse 30 minutos antes de su uso, añadiendo a 5 ml. de PBS una Material y Métodos 107 gota del reactivo “A” y una gota del reactivo “B” en este orden, agitándolo después. - Se elimina el sobrante y se lava en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. - Lavado con TRIS tampón al 10%. Medimos el pH, que debe ser 7´6. - Revelado: 1.- 100 Tris + 50 mgr de DAB + 60 microl de H2O2. 2.- Lavar en agua y mirar al microscopio. - Como tinción de fondo, hemos utilizado Hematoxilina. Se introducen las preparaciones en la hematoxilina durante 10 segundos; luego lavamos en agua durante 10 minutos. - Deshidratamos para el montaje de las preparaciones: Alcohol 70º Durante 3-4 minutos. Alcohol 96º Durante 5 minutos. Alcohol 100º Dos ciclos de 5 minutos. - Xilol. - Montaje de las preparaciones con gelatina-glicerina. 3.2.3 MÉTODO PARA LA VALORACIÓN DE RESULTADOS Tras la realización de las técnicas anteriormente descritas, los resultados han sido valorados mediante el estudio de las secciones con microscopia óptica (OLYMPUS AH-2 VANOX-T). Las microfotografías de éstas se realizaron con un fotomicroscopio OLYMPUS AH-2 VANOX-T, CAMARA FOTOGRÁFICA INCORPORADA OLYMPUS C-35AD-4, utilizando película KODAK EKTACROME. Material y Métodos 108 3.2.3.1. Criterios de valoración en las técnicas de rutina Sobre las secciones teñidas con HxE y P.A.S. se realizó el estudio histopatológico rutinario en las que se valoraron los siguientes parámetros: - Tipo histológico de carcinoma de endometrio. (adenoacantoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células claras, carcinoma endometrioide simple, Carcinoma mucinoso, carcinoma secretor, y carcinoma papilar seroso). - Estadio según la clasificación de la FIGO (G.1, G.2, G.3). - Grado nuclear (1, 2, 3). - Invasión miometrial (My 0, My 1, My 2, My 3, My 4). - Invasión vascular (Si/ No/ No Valorable). - Hiperplasia endometrial en la mucosa adyacente al tumor (Si/ No/ NO Valorable). 3.2.3.2. Criterios de valoración de las técnicas inmunohistológicas En el revelado de la reacción inmunohistoquímica se utilizó una sustancia cromógena, la Diaminobencidina. Con este reactivo, las áreas donde se ha producido reacción entre el antígeno investigado y el anticuerpo primario muestran una coloración marronacea. La valoración porcentual de células inmunoteñidas para cada uno de los marcadores oncogénicos, receptores hormonales y de proliferación, fue subjetivamente analizada con un rango de aproximación del 5%. Todas las muestras fueron evaluadas independientemente por dos observadores. Consideramos como positivo aquellos elementos con intensidad media/alta y de distribución selectiva. Una media de 10 campos de gran aumento (x40) fue valorada en las secciones tumorales. Las áreas necróticas y artefactadas fueron obviadas del estudio. Resultados 115 4.3.1. RECEPTORES DE ESTRÓGENOS - La positividad para los receptores estrogénicos en la mucosa de las muestras fue de media el 80´45% para el estadío G.1, el 80´71% para el estadío G.2 y el 76´67% para el estadío G.3 de la clasificación de la FIGO (Tabla 8.2 y Gráfico 16). - Las diferencias de positividad para los receptores estrogénicos en la mucosa de las muestras, entre los grupos G.1-G.2, G.1-G.3 y G.2-G.3 no han sido significativas (Tabla 8.3). 4.3.2. RECEPTORES DE PROGESTERONA - En el estudio de la mucosa adyacente al tumor, la positividad para los receptores de progesterona fue el 82´50% de media para el estadío G.1 de la clasificación de la FIGO, el 74´41% para el estadío G.2 y el 70´00% para el estadío G.3 (Tabla 9.2 y Gráfico 17). - Las diferencias de positividad para los receptores de progesterona en la mucosa adyacente al tumor, no han sido significativas en ninguno de los casos, ni entre G.1-G.2, ni G.1-G.3 ni G.2-G.3 (Tabla 9. 3). 4.3.3. PROTEÍNA MIB-1 (Ki-67) - La positividad para la proteína Mib-1 encontrada en la mucosa adyacente al tumor ha sido para el estadío G.1 de 1´32% de media, para el G.2 de 0´53% y para el G.3 de 0´83% (Tabla 10.2 y Gráfico 18). - Las diferencias de positividad para la proteína Mib-1 en la mucosa de las muestras entre los grupos G.1-G.2, G.1-G.3 y G.2-G.3 no han sido significativas (Tabla 10.3). - La tabla de percentiles nos relaciona el marcador Mib-1 con la hiperplasia de endometrio en la mucosa adyacente al tumor. En este estudio hemos observado que la mayoría de los casos, con y sin hiperplasia de endometrio, se encuentran en el percentil 0 con respecto al marcador Mib-1, mientras que sólo unos pocos casos sin hiperplasia Resultados 116 de endometrio están en el percentil 5 y algunos de hiperplasia se encuentran en los percentiles 5, 10 y 20 (Gráfico 19). 4.3.4. PROTEÍNA P53 - Al hacer el estudio de la expresión de la proteína P53 en la mucosa adyacente al tumor no hemos encontrado ningún caso que exprese dicha proteína. 4.3.5. PROTEÍNA bcl-2 - La positividad para el marcador bcl-2 en la mucosa adyacente al tumor presentó para el estadío G.1 una media del 76´70%, para el estadío G.2 del 74´12% y para el estadío G.3 del 78´33% (Tabla 11.2 y Gráfico 20). - No se han encontrado diferencias significativas al estudiar la positividad de bcl-2 en la mucosa adyacente al tumor entre los grupos G.1-G.2, G.1G.3 y G.2-G.3 (Tabla 11.3). 4.3.6. PROTEÍNA c-erbB-2 - La positividad para la proteína c-erbB-2 en la mucosa adyacente al tumor ha sido nula en todos los casos estudiados. 4.4. COMPARACIÓN DE MEDIAS PAREADAS Hemos considerado la expresión de cada uno de los marcadores en el tumor como la variable independiente, mientras que dichos marcadores en la mucosa los hemos consideramos la variable dependiente. Resultados 117 4.4.1 COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE ESTRÓGENOS ENTRE LA ZONA TUMORAL Y LA MUCOSA ADYACENTE AL TUMOR Hemos encontrado diferencias significativas al comparar los receptores de estrógenos en la mucosa con los del tumor, ya que P<0´0001. Esto quiere decir que mientras en la zona de mucosa hay abundantes receptores de estrógenos, en la zona tumoral disminuyen significativamente estos receptores (Intervalo de confianza (-52´50, -35´92)) (Tabla 13 y Gráfico 22). 4.4.2. COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE PROGESTERONA ENTRE LA ZONA TUMORAL Y LA MUCOSA ADYACENTE AL TUMOR Al comparar los receptores de progesterona en la mucosa adyacente al tumor con los del propio tumor, estadísticamente podemos decir que se han obtenido diferencias significativas ya que P<0´0001. Esto quiere decir que mientras en la zona de mucosa hay abundantes receptores de progesterona en la zona tumoral disminuye significativamente la positividad de dichos receptores (Intervalo de confianza (-48´34, -31´36)) (Tabla 14 y Gráfico 23). 4.4.3. COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA MIB-1 (Ki-67) ENTRE LA ZONA TUMORAL Y LA MUCOSA ADYACENTE AL TUMOR Respecto a la proteína Mib-1, hemos observado diferencias significativas al comparar la mucosa adyacente al tumor y el propio tumor, ya que P<0´0001. Esto quiere decir que mientras en la zona de la mucosa existe muy baja positividad para dicha proteína, en la zona tumoral la expresión de la proteína Mib-1 es alta (Intervalo de confianza (13´73-25´07)) (Tabla 15 y Gráfico 24). Resultados 118 4.4.4. COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA P53 ENTRE LA ZONA TUMORAL Y LA MUCOSA ADYACENTE AL TUMOR Al comparar la expresión de la proteína P53 en la mucosa adyacente al tumor con la expresión del propio tumor, podemos decir que estadísticamente obtuvimos diferencias significativas, ya que P<0´0001. Esto quiere decir que mientras en la mucosa adyacente al tumor no hemos encontrado ningún caso con expresión de P53, en la zona tumoral sí que es elevada la expresión de dicha proteína (Intervalos de confianza (7´16, -20´75)) (Tabla 16.1-y Gráfico 25). 4.4.5. COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNA bcl-2 ENTRE LA ZONA TUMORAL Y LA MUCOSA ADYACENTE AL TUMOR Estadísticamente, hemos encontrado diferencias significativas al comparar la expresión de la proteína bcl-2 en la mucosa adyacente al tumor y el propio tumor, ya que P<0´0001. Esto quiere decir que mientras en la mucosa hay una alta expresión de proteína bcl-2, en la zona tumoral disminuye significativamente dicha proteína (Intervalo de confianza (–57´66, -41´15)) (Tabla 17.1 y Gráfico 26). 4.4.6. COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA c-erbB-2 ENTRE LA ZONA TUMORAL Y LA MUCOSA ADYACENTE AL TUMOR Respecto a la expresión de la proteína c-erbB-2, hemos obtenido resultados estadísticamente significativos al comparar entre la mucosa adyacente al tumor y el propio tumor, ya que P<0´0001. Esto quiere decir que mientras en la mucosa hay muy baja expresión de c-erbB-2 en la zona tumoral la expresión de dicha proteína es más elevada (Intervalo de confianza (16´63, -30´86)) (Tabla 18.1 y Gráfico 27). Resultados 119 4.5. MATRIZ DE CORRELACIÓN Con la matriz de correlación intentamos investigar grados significativos de correlación estadística entre variables pareadas una a una. De su observación, encontramos que entre los RE y RP hay una correlación de 0´65, entre RE y Mib de -0´02, entre RE y Bcl-2 de 0´22, entre RE y P53 de -0´07, entre RE y C-erbB-2 de 0´02, entre RP y Mib-1 de -0´22, entre RP y Bcl-2 de 0´31, entre RP y P53 de - 0´25, entre RP y C-erbB-2 de -0´08, entre Mib-1 y Bcl-2 de –0´07, entre Mib-1 y P53 de 0´50, entre Mib-1 y c-erbB-2 de 0´41, entre Bcl-2 y P53 de –0´01, entre Bcl-2 y C-erbB-2 de 0´21 y entre P53 y c-erbB-2 de 0´45. Sólo hemos obtenido valores que se aproximan a ser significativos en la correlación estadística entre RE y RP con un coeficiente de correlación de Pearson de 0´65, y entre P53 y Mib-1 con un coeficiente de correlación de 0´50 (Tabla 19). Al realizar la recta de regresión no hemos encontrado relación significativa entre la correlación de RE-RP y Mib-1-P53 (Gráfico 29 y 28). 4.6. ESTUDIOS MULTIVARIANTES En el estudio multivariante asociamos los diversos grupos de tumores según la clasificación de la FIGO (G.1, G.2 y G.3) y los tipos anatomopatológicos de tumores de endometrio: adenoacantoma (AAC), carcinoma adenoescamoso (CAE), carcinoma endometrioide simple (CES), carcinoma mucinoso (CM), y carcinoma secretor (CS). También hemos estudiado como se expresan los diferentes marcadores. Debemos recordar que todos estos tumores pertenecen al grupo de los carcinomas endometrioides, pero en este estudio hemos querido ver como se comportan cada uno de ellos de una forma más específica. Algunos subtipos histológicos en la población general son muy poco frecuentes. Por ello al escoger nuestra muestra hemos podido obtener muy pocos Resultados 120 casos de los mismos. Este hecho nos lleva a que los resultados encontrados sólo nos permitirán observar la tendencia obtenida para cada uno de los tumores, tanto en la zona tumoral como en la mucosa adyacente al tumor. 4.6.1. RECEPTORES DE ESTRÓGENOS Para los RE, en los carcinomas endometrioides simples (CES) (de los cuales tenemos el mayor número de tumores), la tendencia que sigue este tipo de tumor es, a menor grado tumoral (según la clasificación de la FIGO), mayor expresión de RE. Sin embargo, para los tipos adenoacantoma (AAC) y carcinoma mucinoso (CM) a menor grado tumoral, menor expresión de RE. En los carcinomas mixtos debemos destacar que los carcinomas de grado G.2 tuvieron una alta expresión de RE. Debemos recordar que el número de tumores de AAC y CM son escasos, además no tenemos ninguno del grado G.3 de estos últimos. En el carcinoma adenoescamoso (CAE) los tumores de grado G.1 expresan RE, y el carcinoma secretor (CS) no ha presentado expresión de RE (Gráfico 30.1.). En la zona de mucosa adyacente al tumor hemos encontrado una alta expresión de RE. No podemos decir que cada uno de los tumores según su grado de malignidad sigan una tendencia determinada, pero sí que podemos afirmar que en la mucosa sana, los RE muestran niveles elevados en cualquier grado tumoral (Gráfico 30.2). 4.6.2. RECEPTORES DE PROGESTERONA Los RP en el carcinoma endometrioide simple(CES) siguen una tendencia similar a los RE, es decir, a menor grado tumoral mayor expresión de RP. Lo mismo sucede en los carcinomas adenoescamoso (CAE) y en el adenoacantoma (AAC), no siendo así en el carcinoma mucinoso (CM), en el cual a menor grado tumoral, menor expresión de RP. Debemos destacar que los carcinomas mucinosos (CM) de grado G.2 mostraron el mayor nivel de RP. En el carcinoma secretor (CS) no se ha demostrado expresión de receptores de progesterona (Gráfico 31.1). Resultados 121 Los RP en la mucosa adyacente al tumor siguen la misma tendencia que los RE. Tienden a ser elevados en todos los tipos anatomopatológicos de tumor y además en todos los grados. En los carcinomas endometrioides simples (CES) siguen una tendencia similar a la de la zona tumoral pero menos elevada, teniendo mayor expresión de RP en los tumores de menor grado y siendo similar en el adenoacantoma (AAC). Por el contrario en el carcinoma adenoescamoso (CAE) y en el carcinoma mucinoso (CM), a menor grado tumoral, menor expresión de RP. El carcinoma secretor (CS) se comporta con RP altos en la mucosa (Gráfico 31.2). 4.6.3. PROTEÍNA MIB-1 (KI-67) El marcador Mib-1 en el carcinoma endometrioide simple (CE) sigue una tendencia directamente proporcional al grado de malignidad tumoral según la clasificación de la FIGO. Es decir, a menor grado de malignidad, menor marcador de Mib-1. Podemos observar como en el grado G.3 la expresión de Mib-1 es muy elevada con respecto al resto de los grados y los diversos tipos. Lo mismo ocurre con los carcinomas mucinosos (CM). Sin embargo, no es así en los adenoacantomas (AAC), en los que la tendencia que siguen es a menor grado de malignidad, mayor tinción. Tampoco en el carcinoma adenoescamoso (CAE) que es igual para los grados G.1 y G.2. Los carcinomas secretores (CS) no se pueden valorar (Gráfico 32.1). En la mucosa adyacente al tumor, la expresión de Mib-1 sólo se ha demostrado en los carcinomas endometrioides simples (CES). La mayor expresión ha correspondido a los tumores de grado G.1, después a los de grado G.3 y la mínima expresión mostrada ha sido para los de G.2, aunque no se puede decir que marque una tendencia concreta. También se ha demostrado en el caso del carcinoma secretor (CS), en el que la expresión en la mucosa es muy alta en el grado G.1 (Gráfico 32.2). 4.6.4. PROTEÍNA P53 La expresión de la proteína P53 en el carcinoma endometrioide simple (CES) sigue una tendencia directamente proporcional al grado tumoral de la clasificación de la FIGO, esto es, a menor grado tumoral, menor expresión de la Resultados 122 proteína P53. Los adenoacantomas (AAC) mostraron el mismo nivel (bajo) de expresión en el grado G.1 que en el G.2, mientras que de los carcinomas mucinosos (CM) sólo mostraron expresión baja de P53 los de grado G.1. Por otro lado los carcinomas secretores no mostraron expresión (Gráfico 33.1). En la mucosa adyacente al tumor, no observamos expresión de P53 en ningún tipo, ni grado tumoral de los carcinomas endometriales que hemos estudiado. 4.6.5. PROTEÍNA bcl-2 La expresión de la proteína bcl-2 en el carcinoma endometrioide simple (CES) sigue una tendencia inversamente proporcional al grado tumoral según la clasificación de la FIGO, es decir, a menor grado de malignidad, mayor expresión de bcl-2. Igual ocurre con los adenoacantomas (AAC) y con el carcinoma adenoescamoso (CAE). El carcinoma mucinoso (CM) tiene muy poca expresión en el grado G.1, al contrario que el carcinoma secretor (CS) que muestra una expresión elevada en el grado G.1, la cual ha resultado ser la máxima expresión en nuestro estudio (Gráfico 34.1). En la mucosa adyacente al tumor, la expresión de bcl-2 en los carcinomas endometrioides simples (CES) es alta en todos los grados de la clasificación de la FIGO, aunque muestra escasas diferencias entre los tres grados tumorales. Los adenoacantomas (AAC) tienden a expresar mayor tinción de bcl-2 en el grado G.1 que en el grado G.2, al igual que en el carcinoma adenoescamoso (CAE), no siendo así en los carcinomas mucinoso (CM) en los que el G.1 expresa menor Bcl-2 que el grado G.2. Respecto al carcinoma secretor (CS) la expresión de Bcl-2 fue alta para el grado G.1 (la máxima) (Gráfico 34.2). 4.6.6. PROTEÍNA c-cerbB-2 La expresión de la proteína c-erbB-2 en los carcinomas endometrioides simples (CES), ha seguido una tendencia directamente proporcional al grado tumoral de la clasificación de la FIGO, es decir, a menor grado de malignidad, menor expresión. Lo mismo ocurre en los adenoacantomas (AAC), no siendo así Resultados 123 en los carcinomas adenoescamosos (CAE), los cuales muestran mayor expresión en el grado G.1 que en el grado G.2. Respecto al carcinoma mucinoso (CM) sólo los de grado 2 han mostrado expresión de c-erbB-2. Los carcinomas secretores (CS) no han mostrado expresión (Gráfico 35.1). En la mucosa adyacente al tumor, hemos encontrado expresión de c-erbB-2 tan sólo en algún caso aislado. 4.7. MANOVA 4.7.1. MEDIA DE LOS MARCADORES CONSIDERANDO TODOS LOS CASOS Hemos realizado un estudio multivariante en el que analizamos la expresión media de cada uno de los marcadores en todos los grados de la FIGO en conjunto y hemos obtenido los siguientes valores: para RE en el tumor hemos hallado una expresión media aproximada del 38%, para los RP una media aproximada de 39%, para Mib-1 una media aproximada del 20%, para bcl-2 una media aproximada del 31%, para P53 del 19% y para la proteína c-erbB-2 una media aproximada de 29% (Tabla 22.1 y Gráfico 36.1). 4.7.2. MEDIA DE LOS MARCADORES SEGÚN LA CLASIFICACIÓN DE LA FIGO Al estudiar la media de expresión de cada uno de los marcadores en cada uno de los grados de la clasificación de la FIGO por separado, hemos obtenido para el grado G.1, una expresión media de RE del 41´41%, de RP del 45´11%, de Mib-1 del 9´51%, de Bcl-2 del 33´91%, de P53 del 7´41% y de C-erbB-2 del 21´91%. En el grado G.2, encontramos una expresión media de RE del 30´23%, de RP del 27´88%, de Mib-1 del 27´57%, de Bcl-2 del 27´11%, de P53 del 32´34% y de C-erbB-2 del 37´15%. Para el grado G.3, obtuvimos una expresión media para los RE del 24´28%, para RP del 7´85, para Mib-1 del 71´42%, para Bcl-2 del 21´42%, para P53 del 58´57%, y para C-erbB-2 del 60%. Resultados 124 Al estudiar cada uno de los marcadores en los tres grados de la clasificación de la FIGO, comprobamos que tanto los RE como los RP y la proteína Bcl-2 son inversamente proporcionales al grado tumoral, por lo tanto a menor índice tumoral, mayor expresión de dichos marcadores. Por el contrario la proteína Mib1, la proteína P53 y el oncogén c-erbB-2 son directamente proporcionales al grado de malignidad, esto es, a mayor grado de malignidad, mayor expresión de dichos marcadores (Tabla 22.2 y Gráfico 36.2). 4.8. MEDIA DE LOS MARCADORES RESPECTO A CADA UNO DE LOS SUBTIPOS ANATOMOPATOLÓGICOS 4.8.1. MEDIA DE RE Y RP EN CADA SUBTIPO HISTOLÓGICO Dentro de los carcinomas endometrioides, hemos valorado cada uno de los subtipos histológicos. De este modo, los adenoacantomas han mostrado en la zona tumoral una expresión media de RE del 25´0% y para los RP del 26´6%, mientras que en la zona de mucosa próxima al tumor unos RE con expresión media del 72% y de RP del 80%. Para los carcinomas adenoescamosos hallamos una expresión media de RE del 12´5% y de RP del 20´5%; estos resultados no son significativos debido a que sólo uno de estos carcinomas ha mostrado positividad para estos receptores, y por tanto puede alterar los valores reales. Mientras que en la mucosa encontramos una expresión media de RE del 73´33% y de RP del 56´67%. Para los carcinomas endometrioides simples la expresión media de RE en la zona tumoral ha sido del 39´45% y para los RP del 39´63%. Mientras que en la zona adyacente al tumor, ha sido del 80´75% para los RE y del 80´63% para los RP. Tablas, Gráficos y Figuras 131 Tabla 1.1. Edad media Tabla 1.2. Edad media según la C. FIGO Cl Figo Nº de casos Edad media Desviación Edad E 6 67,67 6,41 G1 60 65,83 7,76 G2 26 64,54 10,64 G3 7 63,43 14,02 Total general 99 65,43 8,95 Edad media: 65,434 Desviación standard: 8,952 Error Standard: 0,900 Nº de casos: 99 Rango:[35;88] Gráfico 1. DISTRIBUCIÓN POR EDADES DE LA MUESTRA 0 10 20 30 40 50 60 Edad nº de casos Serie1 2 3 15 48 26 5 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 Tablas, Gráficos y Figuras 132 Gráfico 2. TIPO DE TOMA DE MUESTRA 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tipo de toma de muestra nº de casos Serie1 73 26 Histerect Legrado Gráfico 3. CASOS SEGÚN CLASIFICACIÓN DE LA FIGO 0 10 20 30 40 50 60 70 Clasificación de la FIGO nº de casos Total 60 26 7 G1 G2 G3 Tablas, Gráficos y Figuras 133 Tabla 26. Número de casos de los subtipos histológicos según la C. FIGO G1 G2 G3 AAC 4 2 0 6 6,67 7,69 0,00 CAE 2 2 0 4 3,33 7,69 0,00 CE 52 21 7 80 86,67 80,77 100,00 CM 1 1 0 2 1,67 3,85 0,00 CS 1 0 0 1 1,67 0,00 0,00 60 26 7 93 Gráfico 4. TIPO HISTOLOGICO 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tipo histológico nº de casos Serie1 6 4 2 80 2 4 1 AAC CAE CCC CE CM CPS CS Tablas, Gráficos y Figuras 134 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 G1 G2 G3 TO TAL TIPO C. FIGO CS CM CE CAE AAC Gráfico 5. CLASIFICACIÓN FIGO - TIPO HISTOLÓGICO Gráfico 6. GRADO NUCLEAR 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Grado nuclear nº de casos Serie1 Serie1 43 41 15 123 Tablas, Gráficos y Figuras 135 Gráfico 7. INVASIÓN MIOMETRIAL 0 10 20 30 40 50 60 Grado de invasión miometrial nº de casos Serie1 48 10 15 27 1 2 3 No valorables Gráfico 8. INVASIÓN VASCULAR 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Invasión vascular nº de casos Serie1 24 47 28 SI NO No valorable Tablas, Gráficos y Figuras 136 Gráfico 9. HIPERPLASIA ENDOMETRIAL 0 10 20 30 40 50 60 Hiperplasia endometrial nº de casos Serie1 25 20 54 SI NO No valorable Tablas, Gráficos y Figuras 137 Tabla 2.1. Análisis de la varianza de los RE en la zona tumoral. 2 3493,37 1746,69 1,45 ,2396 90 108290,63 1203,23 DF Sum of Squares Mean Square F-Value P-Value C. FIGO Residual Model II estimate of between component variance: 23,38 ANOVA Table for T. RE 60 41,42 35,00 4,52 26 30,23 34,56 6,78 7 24,29 32,07 12,12 Count Mean Std. Dev. Std. Err. G1 G2 G3 Means Table for T. RE Effect: C. FIGO 11,19 16,18 ,1730 17,13 27,52 ,2195 5,95 29,34 ,6883 Mean Diff. Crit. Diff P-Value G1, G2 G1, G3 G2, G3 Fisher's PLSD for T. RE Effect: C. FIGO Significance Level: 5 % Gráfico 10. Expresión media de RE según la C. FIGO. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 G1 G2 G3 Interaction Bar Plot for T. RE Effect: C. FIGO Error Bars: ± 1 Standard Deviation(s) Tabla 2.2. Expresión de RE según C. FIGO. Tabla 2.3. Diferencia de expresión de RE entre los grupos de C. FIGO. Tablas, Gráficos y Figuras 138 Tabla 3.1. Análisis de la varianza de los RP en la zona tumor. 2 12035,55 6017,78 6,25 ,0029 90 86649,69 962,77 DF Sum of Squares Mean Square F-Value P-Value C. FIGO Residual Model II estimate of between component variance: 217,44 ANOVA Table for T. RP 60 45,12 33,02 4,26 26 27,88 29,54 5,79 7 7,86 9,06 3,43 Count Mean Std. Dev. Std. Err. G1 G2 G3 Means Table for T. RP Effect: C. FIGO 17,23 14,47 ,0202 S 37,26 24,62 ,0034 S 20,03 26,25 ,1331 Mean Diff. Crit. Diff P-Value G1, G2 G1, G3 G2, G3 Fisher's PLSD for T. RP Effect: C. FIGO Significance Level: 5 % Gráfico 11. Expresión media de RP según la C. FIGO. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 G1 G2 G3 Interaction Bar Plot for T. RP Effect: C. FIGO Error Bars: ± 1 Standard Deviation(s) Tabla 3.2. Expresión de RP según C. FIGO. Tabla 3.3. Diferencia de expresión de RP entre los grupos de C.FIGO. Tablas, Gráficos y Figuras 139 Tabla 4.1. Análisis de la varianza del Ac. Mib-1 en la zona tumoral. 2 26545,21 13272,61 57,43 <,0001 90 20801,04 231,12 DF Sum of Squares Mean Square F-Value P-Value C. FIGO Residual Model II estimate of between component variance: 560,99 ANOVA Table for T. MIB 60 9,52 10,18 1,31 26 27,58 23,67 4,64 7 71,43 10,69 4,04 Count Mean Std. Dev. Std. Err. G1 G2 G3 Means Table for T. MIB Effect: C. FIGO -18,06 7,09 <,0001 S -61,91 12,06 <,0001 S -43,85 12,86 <,0001 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value G1, G2 G1, G3 G2, G3 Fisher's PLSD for T. MIB Effect: C. FIGO Significance Level: 5 % Gráfico 12. Expresión media de Ac. Mib-1 según la C. FIGO. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 G1 G2 G3 Interaction Bar Plot for T. MIB Effect: C. FIGO Error Bars: ± 1 Standard Deviation(s) Tabla 4.2. Expresión de Mib según C. FIGO. Tabla 4.3. Diferencias de expresión de Mib entre los grupos de C. FIGO. Tablas, Gráficos y Figuras 140 Tabla 5.1. Análisis de la varianza de la proteína P53 en la zona tumoral. 2 23588,61 11794,31 18,04 <,0001 90 58848,18 653,87 DF Sum of Squares Mean Square F-Value P-Value C. FIGO Residual Model II estimate of between component variance: 479,21 ANOVA Table for T. p53 60 7,42 16,94 2,19 26 32,35 37,35 7,33 7 58,57 34,24 12,94 Count Mean Std. Dev. Std. Err. G1 G2 G3 Means Table for T. p53 Effect: C. FIGO -24,93 11,93 <,0001 S -51,15 20,29 <,0001 S -26,23 21,63 ,0181 S Mean Diff. Crit. Diff P-Value G1, G2 G1, G3 G2, G3 Fisher's PLSD for T. p53 Effect: C. FIGO Significance Level: 5 % Gráfico 13. Expresión media de la proteína P53 según la C. FIGO. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 G1 G2 G3 Interaction Bar Plot for T. p53 Effect: C. FIGO Error Bars: ± 1 Standard Deviation(s) Tabla 5.2. Expresión de P53 según C. FIGO. Tabla 5.3. Diferencias de expresión de P53 entre los grupos de C. FIGO.