Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍAS AGRARIAS GRADO EN ENOLOGÍA Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Alumna: Izquierdo Calvo, Lucía Tutoras: Vila Crespo, Josefina Ruipérez Prádanos, Violeta Palencia, 2019 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología ÍNDICE ABSTRACT ................................................................................................................................................... 1 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 1 2. ANTECEDENTES ................................................................................................................................ 4 3. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS .......................................................................................................... 5 4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................ 5 4.1. Microorganismos ........................................................................................................... 5 4.1.1. Levaduras no-Saccharomyces ................................................................................................ 5 4.1.2. Mantenimiento y cultivo de microorganismos ......................................................................... 7 4.1.3. Observación al microscopio .................................................................................................... 7 4.1.4. Estimación de células para siembra ........................................................................................ 7 4.2. Medios de cultivo ........................................................................................................... 7 4.2.1. Mosto ...................................................................................................................................... 7 4.2.2. Medio YPD .............................................................................................................................. 8 4.2.3. Medio actividad β-glucosidasa ................................................................................................ 8 4.2.4. Medio actividad proteasa ........................................................................................................ 8 4.2.5. Medio actividad β-glucanasa ................................................................................................... 8 4.2.6. Medio actividad β-liasa ............................................................................................................ 8 4.2.7. Medio test killer y sensible ...................................................................................................... 9 4.3. Caracterización enzimática ........................................................................................... 9 4.3.1. Ensayo β-glucosidasa ................................................................................................................. 9 4.3.2. Ensayo proteasa ......................................................................................................................... 9 4.3.3. Ensayo β-glucanasa ................................................................................................................. 10 4.3.4. Ensayo β-liasa .......................................................................................................................... 10 4.4. Caracterización bioquímica ......................................................................................... 11 4.4.1. Cinética fermentativa ................................................................................................................ 11 4.4.2. Poder fermentativo y vigor fermentativo .................................................................................... 11 4.4.3. Azúcares reductores ................................................................................................................. 12 4.4.4. Ensayo killer .............................................................................................................................. 12 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................... 13 5.3. Actividad enzimática .................................................................................................... 13 5.3.1. Ensayo β-glucosidasa ............................................................................................................... 15 5.3.2. Ensayo proteasa ....................................................................................................................... 15 5.3.3. Ensayo β-glucanasa ................................................................................................................. 16 5.3.4. Ensayo β-liasa .......................................................................................................................... 16 5.4. Cinética fermentativa ................................................................................................... 18 5.5. Ensayo killer ................................................................................................................ 24 6. CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 25 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................. 26 ANEXOS ..................................................................................................................................................... 29 ANEXO 1. Observación y tabla de resultados test killer ......................................................... 29 ANEXO 2. Observación al microscopio ................................................................................... 30 ANEXO 3. Tabla de poder fermentativo .................................................................................. 31 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología RESUMEN En los últimos años ha aumentado enormemente el interés por investigar el papel de las levaduras no-Saccharomyces en la producción de vinos y su selección para fermentaciones controladas junto con Saccharomyces, pasando de ser consideradas como microrganismos indeseables, a ser levaduras que podrían aportar características positivas y tener una gran utilidad para la mejora de la calidad y el perfil aromático de los vinos. En el presente trabajo se ha realizado una caracterización de varias levaduras no- Saccharomyces aisladas en una bodega de la D.O. Rueda, en Verdejo, durante las vendimias de los años 2010 y 2012. Por un lado, una caracterización enzimática buscando la producción de cuatro enzimas relacionadas con el aroma y la calidad del vino, a través del empleo de los medios de cultivo específicos. Y, por otro lado, una caracterización bioquímica mediante el conocimiento de características como la cinética fermentativa o el carácter killer con influencia en el proceso fermentativo. ABSTRACT In the last few years there has been an increasing interest in investigating non- Saccharomyces role in the production of wine and their selection for controlled fermentation with Saccharomyces, going from being considered as undesirable microorganisms, to yeasts that could contribute with positive characteristics and have great usefulness for the enhancement of wine quality and its aromatic profile. In the present study a characterization of several non-Saccharomyces yeasts isolated from Verdejo grapes harvested in vineyards of the D.O. Rueda in 2010 and 2012 has been carried out. On the one hand, an enzymatic screening for the production of four enzymes related to wine aroma and its final quality, by means of the use of specific culture media. On the other hand, a biochemical characterization through the knowledge of characteristics as fermentation kinetics or the killer character which influence the fermentative process. Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 1/31 1. INTRODUCCIÓN La fermentación alcohólica espontánea donde se transforma el mosto de uva en vino, está llevada a cabo fundamentalmente por una sucesión de levaduras de diferentes especies presentes en el mosto, siendo Saccharomyces cerevisiae el microorganismo de mayor importancia (Ciani, Comitini, Mannazzu, & Domizio, 2010). Sin embargo, también participan en el proceso, las levaduras no-Saccharomyces, un grupo de levaduras muy heterogéneo que juegan un papel crucial durante los primeros momentos de la fermentación, pero que de forma habitual acaban muriendo progresivamente dejando paso al dominio de S. cerevisiae (Nikolaou, Soufleros, Bouloumpasi, & Tzanetakis, 2006). Las fermentaciones espontáneas son empleadas, en general, por los enólogos para aumentar la complejidad aromática de los vinos, buscando una mayor expresión varietal para la obtención de unos vinos únicos y diferenciados del resto (Liu, Lu, Duan, & Yan, 2016). A pesar de que las cepas aisladas durante el proceso de fermentación espontánea pueden estar mejor adaptadas a las condiciones asociadas a una determinada región productora, y que la actividad metabólica obtenida con una mayor diversidad microbiológica puede producir vinos con cualidades o aromas distintivos, para evitar los riesgos y la impredecibilidad de los procesos espontáneos en muchos casos se recurre al uso de las levaduras comerciales (Tristezza et al., 2012). Tradicionalmente, las levaduras no-Saccharomyces han sido consideradas microbiológicamente problemáticas y productoras de metabolitos negativos durante los procesos de fermentación. Durante mucho tiempo se buscaba evitar su presencia en el vino, pero en los últimos años se ha incrementado el interés por su participación beneficiosa en el proceso de vinificación y por su gran potencial enzimático (Belda et al., 2017). Actualmente existe una demanda creciente hacia la selección de cepas de levaduras de fuerte implantación en la zona que aseguren la permanencia y/o mejora de las características organolépticas consideradas como representativas de una determinada región vitícola (Tristezza et al., 2012). Por este motivo las levaduras no- Saccharomyces se emplean en las bodegas buscando la tipicidad y una mayor complejidad de sus vinos que únicamente se consigue con una mayor diversidad microbiana a nivel de cepa (Belda, Ruiz, Alastruey-Izquierdo, et al., 2016). Actualmente el sector del vino se encuentra enormemente globalizado y existe una gran competencia. Los enólogos se enfrentan a la necesidad de satisfacer las necesidades del mercado y la creciente demanda existente hacia productos innovadores, con autenticidad y diferenciación varietal. Por lo tanto, el empleo de levaduras no- Saccharomyces puede ser una oportunidad para la elaboración de vinos únicos pero realizando su producción en un proceso controlado y con un menor riesgo (Padilla, Gil, & Manzanares, 2016; Francesca et al., 2016). Varios estudios han evidenciado las características enzimáticas de diversas levaduras implicadas en el proceso de fermentación. No obstante, la mayoría de las levaduras S. cerevisiae no presentan las citadas actividades enzimáticas que son de gran interés o lo hacen de forma muy limitada (Belda, Ruiz, Navascués, et al., 2016). Es por este motivo que existe una tendencia hacia los estudios centrados en levaduras no- Saccharomyces capaces de producir una serie de enzimas endo y exocelulares que pueden resultar muy útiles para procesos enológicos (Escribano et al., 2017). Por lo tanto, pueden tener un gran impacto en la calidad final del vino, modificando algunas de sus propiedades, enriqueciendo el perfil aromático o las propiedades tecnológicas Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 2/31 mediante estabilización del color (Tolosa & Prieto, 2018). Además, las levaduras no- Saccharomyces podrían ser una fuente potencial para la producción comercial de enzimas para su uso en los procesos de elaboración vínica (Strauss, Jolly, Lambrechts, & Van Rensburg, 2001). El uso de levaduras productoras de enzimas en lugar de únicamente enzimas comerciales permite optimizar al máximo las propiedades de las distintas cepas, ya que las levaduras permiten mejorar la calidad de los vinos blancos, contribuyendo a una diferenciación aromática produciendo un mayor contenido de compuestos volátiles (Samoticha, Wojdyło, Chmielewska, Politowicz, & Szumny, 2017). Entre las enzimas con una mayor relevancia para el proceso enológico, destacan aquellas que tienen influencia en la mejora aromática y/o el proceso tecnológico. Por un lado, las enzimas con mayor implicación en la liberación de compuestos aromáticos a partir de compuestos no volátiles; la β-glucosidasa, implicada en la liberación de monoterpenoles mediante hidrólisis de los precursores y la β-liasa con intervención en la liberación de precursores volátiles aromáticos (Belda, 2016; Padilla, 2016). Por otro lado, las actividades enzimáticas que tienen interés tanto tecnológico como en la mejora aromática; la β-glucanasa, una enzima encargada de la degradación de la pared de las células contribuyendo a la liberación de precursores aromáticos y facilitando procesos como la clarificación y filtración del vino y la proteasa relacionada con la mejora de diferentes características tecnológicas y sensoriales de los vinos (Schwentke, Sabel, Petri, König, & Claus, 2014). Las levaduras con actividad β-glucosidasa pueden jugar un papel importante en la liberación de sustancias volátiles a partir de precursores no volátiles (Tolosa & Prieto, 2018). Los terpenos son un tipo de compuestos aromáticos que contribuyen beneficiosamente a la mejora del aroma de los vinos. La liberación de estos aromas volátiles es particularmente importante en el caso de los vinos blancos (Belda et al., 2017). La β-glucosidasa rompe la unión que tienen muchos terpenos con moléculas de azúcar formando compuestos no aromáticos, liberando el terpeno en su forma aromática (Escribano et al., 2017). Dependiendo de los azúcares unidos al complejo precursor puede requerirse un primer paso con la actuación de las enzimas α-L- arabinofuranosidasa, α-ramnosidasa, β-xilosidasa o β-apiosidasa. A continuación, la βglucosidasa liberaría los monoterpenoles, incrementando de este modo el aroma de los vinos que pasan a tener perfiles aromáticos más agradables y varietales (Cordero Otero et al., 2003). Figura 1: Hidrólisis enzimática de terpenoles por la acción de la βglucosidasa. Fuente: Tolosa et al., 2018 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 3/31 La actividad β-liasa incrementa los niveles de compuestos como el 4-metil-4- sulfanilpentan-2-ona (4-MSP) o el 3-sulfanilhexan-1-ol (3-SH) que se liberan durante la fermentación y que se encontraban en las uvas en forma de precursores no volátiles unidos a una cisteína (Belda et al., 2017). La actividad β-liasa rompe el precursor aromático liberando los correspondientes tioles volátiles, y modificando el perfil aromático de los vinos, revelando aromas cuyos descriptores son los de fruta de la pasión, frutas tropicales, cítricos y notas vegetales como el boj (Belda, Ruiz, Navascués, et al., 2016). La actividad β-liasa es una característica dependiente de la cepa, sin embargo, los estudios sobre levaduras no-Saccharomyces capaces de liberar estos tioles volátiles en el vino son muy escasos (Belda, Ruiz, Alastruey-Izquierdo, et al., 2016). La capacidad de las levaduras para producir enzimas proteasas ha sido estudiada por diferentes autores por su implicación en varios procesos tecnológicos de la vinificación. La importancia de estas enzimas se basa en su potencial de degradación de enlaces peptídicos (Tolosa & Prieto, 2018). Esta actividad proteasa puede contribuir a la degradación de las proteínas causantes de los problemas de inestabilidad proteica especialmente importantes en el caso de los vinos blancos. De este modo se podría evitar o limitar la adición de productos como la bentonita, una práctica muy extendida que sirve para evitar las quiebras proteicas pero que tiene un gran impacto negativo en las características organolépticas de los vinos (Belda, Ruiz, Alastruey-Izquierdo, et al., 2016). Por otro lado, otro aspecto dependiente de las proteasas es la posibilidad de su uso para facilitar la liberación de compuestos fenólicos que ayuden a mejorar los procesos tecnológicos como la clarificación y la filtración (Belda, Ruiz, Alastruey- Izquierdo, et al., 2016). La acción de la enzima exocelular β-glucanasa produce el aumento de ciertos compuestos que incrementan el aroma mediante la hidrólisis de precursores glicosilados. Además, la enzima facilita los procesos de filtración por su capacidad, en unas determinadas condiciones, de hidrolizar los glucanos con poder colmatante procedentes de uvas afectadas por Botrytis (Schwentke et al., 2014). Esta enzima está directamente relacionada con la estabilización del color y la clarificación de los vinos debido a su poder de degradación de polisacáridos de las paredes celulares, que además contribuyen a la liberación de precursores de las bayas al mosto. La actividad β-glucanasa influye aumentando la extracción de compuestos fenólicos y, por tanto, se incrementan el color y los compuestos aromáticos volátiles durante las maceraciones, obteniéndose de este modo vinos con un mejor perfil aromático, así como con un color más intenso y estable en el tiempo (Escribano et al., 2017). Además de la actividad enzimática hay que tener en cuenta ciertas características con relevancia en el proceso de vinificación como son la cinética fermentativa o el factor killer. Estas pueden servir como criterio de selección para escoger las levaduras que presenten unas propiedades más adecuadas (Nikolaou et al., 2006). Muchas de las levaduras no-Saccharomyces que han sido estudiadas presentan una lenta capacidad fermentativa o un metabolismo aeróbico, con una baja tolerancia a los niveles de etanol en fermentación que inhiben su crecimiento haciendo que únicamente permanezcan activas durante un corto periodo de tiempo (Segura-garcía, Taillandier, Brandam, & Gschaedler, 2015). El carácter killer de las levaduras tiene una gran influencia en la composición de la microbiota de una fermentación, se trata de un factor competitivo muy estudiado que favorece la implantación de las levaduras dotadas con el fenotipo killer sobre el resto y esto puede suponer una ventaja o un problema para la finalización de la fermentación (Izgü, Altinbay, & Yüceliş, 1997). Los distintos fenotipos respecto al carácter killer que se pueden encontrar son killer (K+R+), sensible (K-R-), neutra (K-R+) y suicida (K+R-). Las cepas con fenotipo killer producen una toxina que es letal para las sensibles, mientras que las neutras son resistentes. Por otro lado, las sensibles no son Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 4/31 resistentes a la propia toxina que ellas mismas secretan, y ni las cepas sensibles ni las neutras producen la toxina (Gutiérrez, Epifanio, Garijo, López, & Santamaría, 2001). Algunos estudios más recientes han comprobado que algunas cepas de Torulaspora delbrueckii con carácter killer pueden completar fermentaciones por sí mismas aunque de forma mucho más lenta que las realizadas por S. cerevisiae (Valera, Morcillo-parra, Zagórska, Mas, & Beltran, 2019). A pesar de su bajo poder fermentativo, su potencial enzimático convierte a las levaduras no-Saccharomyces en una útil herramienta para la mejora de las características organolépticas finales de los vinos (Belda, Ruiz, Alastruey-Izquierdo, et al., 2016). Algunos estudios indican que un posible uso podría partir de la inoculación secuencial de no-Saccharomyces y Saccharomyces para modular y diversificar las características del vino sin sufrir los problemas que aparecen cuando no-Saccharomyces son utilizadas de forma individual (Escribano-Viana et al., 2018). El uso de cultivos mixtos de levaduras S. cerevisiae y diferentes especies de no Saccharomyces representa una herramienta para la modificación y mejora de la composición de los vinos, pero evitando los problemas surgidos cuando estas levaduras menos convencionales se utilizan de forma aislada e incontrolada, como pueden ser la ralentización o parada del proceso fermentativo o la aparición de defectos sensoriales (Escribano-Viana et al., 2018). Por lo tanto, se trata de una alternativa a las fermentaciones espontáneas y a la inoculación de levaduras únicamente Saccharomyces donde se perderían las características específicas de las diferentes levaduras no-Saccharomyces (Ciani et al., 2010). En el presente trabajo se estudian a las características enzimáticas y bioquímicas para poder realizar una adecuada selección de cepas con una mayor producción de enzimas deseadas que permitan facilitar el proceso de vinificación y obtener vinos con mejores características organolépticas, pero que a su vez presenten una cinética y poder fermentativos correctos y un fenotipo killer o neutro que permita su supervivencia, así como también la posible posterior implantación de levaduras Saccharomyces. 2. ANTECEDENTES Para la realización del estudio se utilizó una colección de levaduras previamente aisladas en la E.T.S. de Ingenierías Agrarias de Palencia de uva de la variedad Verdejo procedente de tres parcelas diferentes durante las vendimias de 2010 y 2012 en una bodega de la Denominación de Origen Rueda. El aislamiento se realizó mediante la toma de muestras en distintas etapas del proceso de vinificación en la bodega, en mosto de uva recién estrujado (MURE), mosto desfangado (MDB), inicio de fermentación (IFB) fermentación tumultuosa (FTB) y final de fermentación (FFB). Posteriormente, se realizó una siembra en masa con el mosto en medio de cultivo, y transcurridas entre 48 y 72 horas de incubación en la estufa a 28ºC, se llevó a cabo una serie de siembras en estría y pases a placas con medio sólido hasta obtener los aislados. El total de aislados fue de 484 de los cuales únicamente 55 fueron no-Saccharomyces. Las levaduras aisladas se enviaron en placas de cultivo al Laboratorio de Técnicas Instrumentales de la Universidad de León para su identificación mediante métodos moleculares. Se aisló el ADN y por medio de la técnica PCR se realizó la amplificación de la región ribosomal D1/D2 del gen ARN 26S para su posterior secuenciación (RESOLUCIÓN OIV-OENO 408-2011). Después, la secuencia genética se comparó con Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 5/31 las existentes en la base de datos GenBank NCBI para identificar las levaduras a nivel de especie. Una vez que las levaduras fueron aisladas, secuenciadas e identificadas, se realizó una selección para eliminar del estudio todas las levaduras con características indeseables como la presencia de metabolismo oxidativo, la formación de velo, la producción de aromas negativos y en general las que no presentaban ningún tipo de interés enológico. De esta forma para el estudio sólo se escogieron las que podían presentar características de interés. 3. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS El objetivo principal del presente estudio es la caracterización de distintas cepas de levaduras no-Saccharomyces aisladas a lo largo de diferentes etapas del proceso de vinificación de uva de la variedad Verdejo en una bodega de la D.O. Rueda para valorar la existencia de posibles propiedades de interés para la mejora del proceso tecnológico y la calidad final de los vinos. Con el estudio se pretende una caracterización enzimática y bioquímica para lo cual se plantean los siguientes objetivos específicos: Caracterización enzimática de estas levaduras no-Saccharomyces para la determinación de actividades enzimáticas que pueden contribuir a la mejora del proceso de vinificación y el perfil aromático de los vinos. Estudio de las propiedades bioquímicas de estas levaduras no-Saccharomyces, prestando especial atención a su cinética fermentativa y carácter killer. Obtención de levaduras con características de interés para su aplicación enológica en base a su producción de enzimas y sus propiedades bioquímicas. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Microorganismos 4.1.1. Levaduras no-Saccharomyces Para la realización del estudio se utilizaron 36 cepas de levaduras no-Saccharomyces procedentes del aislamiento realizado previamente durante la vinificación de Verdejo englobadas dentro de 4 géneros (tabla 1). Las levaduras pertenecen a las especies Hanseniaspora meyeri, Hanseniaspora osmophila, Pichia guilliermondii, Pichia kudriavzevii, Torulaspora delbrueckii, y Wickerhamomyces anomalus. Figura 2: Levaduras del estudio Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 6/31 Tabla 1: Levaduras seleccionadas y las etapas de aislamiento en la vinificación. MURE; mosto de uva recién estrujado en bodega, MDB; mosto desfangado en bodega, IFB; inicio de fermentación en bodega, FTB; fermentación tumultuosa en bodega, FFB; final de fermentación en bodega. Como control, se utilizaron varias levaduras. Por un lado, las obtenidas directamente de la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) como Schizosaccharomyces pombe (CECT 11197) que se utilizó como control negativo en los ensayos enzimáticos y Torulaspora delbrueckii (CECT 1880) como control positivo para el ensayo de la β-liasa. Por otro lado, Wickerhamomyces anomalus, aislada en el laboratorio de microbiología de la ETSIIAA y posteriormente secuenciada, fue utilizada como control positivo de los ensayos de proteasa, β-glucosidasa y β-glucanasa. Para la realización del test killer se emplearon dos cepas de levaduras Saccharomyces obtenidas de la CECT, con fenotipo sensible S. cerevisiae CECT 1443 y S. cerevisiae CECT 1414 que posee fenotipo killer. Especie Designación Etapa de aislamiento W. anomalus WA1 IFB W. anomalus WA2 FFB W. anomalus WA3 MURE W. anomalus WA4 MURE W. anomalus WA5 MURE W. anomalus WA6 FFB W. anomalus WA7 MDB W. anomalus WA8 MDB W. anomalus WA9 MDB W. anomalus WA10 FTB W. anomalus WA11 FFB W. anomalus WA12 MDB W. anomalus WA13 MDB W. anomalus WA14 MDB W. anomalus WA15 MDB W. anomalus WA16 MDB P. kudriavzevii PK1 MURE P. kudriavzevii PK2 MURE P. kudriavzevii PK3 MURE P. kudriavzevii PK4 MURE P. kudriavzevii PK5 MURE P. kudriavzevii PK6 MURE P. kudriavzevii PK7 MURE P. kudriavzevii PK8 MURE P. kudriavzevii PK9 MURE P. kudriavzevii PK10 MURE P. kudriavzevii PK11 MURE P. kudriavzevii PK12 MURE P. kudriavzevii PK13 MURE H. osmophila HO1 MURE H. meyeri HM1 MDB P. guilliermondii PG1 FFB P. guilliermondii PG2 MURE T. delbrueckii TD1 MDB T. delbrueckii TD2 MDB T. delbrueckii TD3 MDB Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 13/31 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.3. Actividad enzimática Se llevaron a cabo distintos ensayos enzimáticos para medir la actividad de las diferentes levaduras. Las pruebas fueron realizadas por duplicado como se describe en el apartado 4.3. y fue necesaria la puesta a punto de los ensayos para determinar, de la forma más óptima posible, las actividades enzimáticas. Por un lado, se ajustó la temperatura de incubación de las levaduras a 26ºC para garantizar su adecuado crecimiento. En la práctica, dada la imposibilidad de obtener resultados concluyentes también fue necesario modificar la metodología utilizada para medir la actividad β-liasa como se describe posteriormente. En la Tabla 2 se recogen los resultados obtenidos en los ensayos de la actividad βglucosidasa, proteasa β-glucanasa y β-liasa. La actividad β-liasa alta y moderada, junto con la proteasa fueron las actividades más abundantes en las cepas estudiadas con una presencia en las levaduras del 66 y 50% respectivamente. Algo muy similar ocurre con la actividad β-glucosidasa, presente en la mitad de las levaduras del estudio, concretamente en la totalidad de las levaduras de la especie W. anomalus y en todas las del género Hanseniaspora. La actividad enzimática más extendida, como muestra la Tabla 2 fue la β-liasa, en relación con este grupo de enzimas se vio que se encontraba concretamente en el 100% de las levaduras de la especie T. delbrueckii y el género Hanseniaspora. De forma contraria, la enzima βglucanasa se encontraba mucho menos extendida, únicamente 4 levaduras del estudio de las especies W. anomalus y H. meyeri fueron productoras de la enzima. Las levaduras que producen un número más importante de enzimas exocelulares están incluidas en el género Wickerhamomyces puesto que todas fueron capaces de producir las enzimas proteasa y β-glucosidasa, y adicionalmente algunas de ellas también βglucanasa y β-liasa. Por tanto, mostraron un gran potencial enzimático que deberá ir acompañado de una correcta fermentación para su posterior selección. Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 14/31 Tabla 2: Actividades enzimáticas de las levaduras del estudio. La actividad positiva está indicada con +; La actividad negativa se indica con -. La actividad β-liasa alta +++, moderada ++ y baja +. Levaduras Actividades enzimáticas β-glucosidasa β-glucanasa Proteasa β-Liasa HM 1 - + + +++ HO 1 - - + +++ PG 1 + - - ++ PG 2 + - - ++ PK 1 - - - + PK 2 - - - ++ PK 3 - - - + PK 4 - - - ++ PK 5 - - - ++ PK 6 - - - ++ PK 7 - - - ++ PK 8 - - - ++ PK 9 - - - ++ PK 10 - - - ++ PK 11 - - - ++ PK 12 - - - ++ PK 13 - - - ++ TD 1 - - - +++ TD 2 - - - +++ TD 3 - - - +++ WA 1 + - + + WA 2 + - + + WA 3 + + + + WA 4 + + + + WA 5 + + + + WA 6 + - + + WA 7 + - + ++ WA 8 + - + + WA 9 + - + + WA 10 + - + ++ WA 11 + - + ++ WA 12 + - + +++ WA 13 + - + ++ WA 14 + - + ++ WA 15 + - + ++ WA 16 + - + + Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 15/31 5.3.1. Ensayo β-glucosidasa En relación con este grupo de enzimas los resultados indicaron que las levaduras de los géneros P. guilliermondii y W. anomalus presentaban actividad β-glucosidasa a diferencia de las especies T. delbrueckii, H. meyeri, H. osmophila o P. kudriavzevii donde la actividad β-glucosidasa era inexistente. Previamente algunos trabajos mencionan la existencia de actividad β-glucosidasa en levaduras de la especie P. guilliermondii (da Silva et al., 2019) o de P. anomalus (ahora denominada como W. anomalus) (Spagna, Barbagallo, Palmeri, Restuccia, & Giudici, 2002). Por el contrario, otros indican la ausencia de actividad β-glucosidasa en las levaduras de la especie T. delbrueckii (Chen, Yap, & Liu, 2015; Belda, Ruiz, Alastruey- Izquierdo, et al., 2016) o P. kudriavzevii (Mónaco, Rodríguez, & Lopes, 2016). 5.3.2. Ensayo proteasa La totalidad de las levaduras de la especie W. anomalus presentaron este tipo de actividad. Esto concuerda con estudios recientes donde observaron como algunas cepas de P. anomalus presentaban actividad proteasa, así como el potencial de W. anomalus para la producción de enzimas proteolíticas en general (Escribano et al., 2017) y más concretamente su actividad proteasa, según señalan otros autores (Tolosa & Prieto, 2018). En cuanto a las levaduras del género Hanseniaspora, todas presentaban halo alrededor de la levadura debido a su capacidad para sintetizar enzimas proteolíticas, resultado que concuerda con lo descrito con anterioridad por otros autores (Tolosa & Prieto, 2018). Por tanto, las levaduras de este género presentan un gran potencial para la eliminación de proteínas y así prevenir la formación de quiebras en vinos blancos, a diferencia de otros géneros estudiados previamente (Porter et al., 2019). Figura 11: Resultados positivo y negativo βglucosidasa Figura 10: Resultados positivos y negativos β-glucosidasa Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 16/31 Sin embargo, no se detectó actividad en las especies P. kudriavzevii, contrariamente a los resultados de alta actividad proteasa asociada a las levaduras de esa especie en el estudio de Mónaco et al., (2016). Otras levaduras que podemos considerar con interés enológico como es el caso de especies menos abundantes en el viñedo como T. delbrueckii tampoco presentaron actividad proteasa de acuerdo a lo observado en estudios anteriores (Belda, Ruiz, Alastruey- Izquierdo, et al., 2016). 5.3.3. Ensayo β-glucanasa Se detectó actividad β-glucanasa únicamente en algunas levaduras de la especie W. anomalus como WA3, WA4 y WA5, confirmando los resultados mostrados en el estudio previo de Schwentke et al., 2014 donde las levaduras de la especie W. anomalus presentaban actividad β-glucanasa. Del mismo modo, la levadura HM1 de la especie H. meyeri mostró producción de la enzima β-glucanasa. No así en el resto de las levaduras del estudio. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en estudios previos en los levaduras como T. delbrueckii no presentaba actividad β-glucanasa (Escribano et al., 2017). 5.3.4. Ensayo β-liasa El ensayo de la β-liasa se realizó por duplicado tanto en el medio sólido como en el medio líquido. Inicialmente con la prueba en medio sólido no obtuvimos resultados diferenciables, el crecimiento resultaba demasiado homogéneo como para determinar con claridad si existían variaciones entre las levaduras. Figura 14: Ensayo de la liasa en medio sólido Figura 13: Presencia de halo, resultado positivo β-glucanasa Figura 12: Presencia de halo alrededor de la levadura. Actividad proterasa Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 17/31 Por este motivo se modificó la metodología descrita en el apartado 4.3.4. para tratar de obtener diferencias en la producción de esta enzima. El ensayo se realizó en medio líquido y el crecimiento se estimó mediante medida de la densidad óptica a 600 nm. Los datos se expresan como la media aritmética de las medidas de absorbancia obtenidas. El error se indica como la desviación estándar de la muestra (fig. 15). Figura 15: Resultados de la actividad β-liasa. Absorbancia de las distintas muestras a 600nm Consideramos como control positivo a T. delbrueckii (CECT 1880) con gran actividad βliasa, puesto que se ha demostrado que esta cepa de levadura aumenta la liberación de tioles volátiles (Benito, 2018). Todas las levaduras del estudio presentaron crecimiento y, por tanto, son productoras de β-liasa. Se consideró que las levaduras presentaban una actividad β-liasa alta en torno a un valor de densidad óptica a 600 nm igual o superior a 0,5, correspondiendo con el valor de la densidad obtenida con la medida del control positivo; actividad moderada cuando la densidad era de en torno a 0,3 y baja cuando no alcanzaban este último valor de densidad. Podemos ver en la figura 15 que la actividad β-liasa se encuentra presente y de forma moderada en la mayoría de las levaduras estudiadas destacando el caso de HO1 y HM1 del género Hanseniaspora o W12 de la especie W. anomalus. De forma muy importante, entre las especies de no-Saccharomyces sobresale la actividad de las levaduras TD1, TD2 y TD3 de T. delbrueckii. Estos resultados confirman lo que ya habían visto otros autores, cuyos estudios indican que T. delbrueckii tiene una gran actividad β-liasa (Belda, Ruiz, Navascués, et al., 2016), que sería de interés, como ya indican varios estudios donde se confirma que esta actividad tienen una influencia en el aumento de la concentración de los tioles volátiles que hacen más complejo el aroma de los vinos blancos (Belda et al., 2017). 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 W11 W12 W13 W14 W15 W16 PK1 PK2 PK3 PK4 PK5 PK6 PK7 PK8 PK9 PK10 PK11 PK12 PK13 HO HM PG1 PG2 TD1 TD2 TD3 Control + D.O. 600nm Levaduras Actividad liasa Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 18/31 5.4. Cinética fermentativa Se llevaron a cabo una serie de ensayos para la determinación de la cinética fermentativa de las levaduras del estudio con el objetivo de, entre las levaduras que presenten unas buenas propiedades enzimáticas, seleccionar las que presenten un rápido inicio de la fermentación y una estabilización en la producción de CO2 lo más pronta posible. Como resultado de la determinación de la cinética fermentativa observamos que a la temperatura de 21ºC no todas las levaduras finalizan la fermentación a los 22 días de acuerdo con las curvas de cinética fermentativa de las figuras 16 a 23. Puesto que las levaduras no-Saccharomyces no son capaces de finalizar el proceso de fermentación, se hace necesaria una inoculación secuencial que se realizaría dentro de las primeras 72 horas. Los ensayos de cinética fermentativa se realizaron por triplicado y los resultados se expresan como la media aritmética de las medidas obtenidas. El error se indica como la desviación estándar de la muestra. A continuación, se muestran los gráficos con la cinética de fermentación de las levaduras estudiadas a 21ºC expresado en g de CO2 producido/L frente al tiempo de fermentación en días (figuras 15-22). Figura 16: Cinética fermentativa a 21ºC frente al tiempo de fermentación. Levaduras de la especie W. anomalus 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 g de CO2 producido/l Días de fermentación Cinética fermentativa WA1 WA2 WA3 WA4 WA5 WA6 WA7 WA8 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 19/31 Las figuras 16 y 17 muestran la cinética fermentativa de las 16 levaduras del estudio de la especie W. anomalus mostrando diferencias de producción de CO2 entre todas ellas, mientras la WA15 y WA16 libera únicamente unos 10 g de CO2/l, o las W5 y WA9 unos 15 g de CO2/l, las levaduras WA8, WA10 y WA3 liberan aproximadamente 20 g más, es decir, son capaces de fermentar más gramos de azúcar. Esto supone una variación en el poder fermentativo de más de 1 % vol. (tabla 4). Las levaduras W1, WA2, WA4, WA5, WA6, WA7, WA11, WA12, WA13 y WA14 se mueven en torno a los 20 g de CO2/l liberados, y presentan poder fermentativo de alrededor de 2,5 % vol. De cualquier forma, todas tienen una baja producción de CO2 (fig. 16 y 17) y un poder fermentativo muy reducido (tabla 4). En cuanto al vigor fermentativo de estas levaduras, destaca el caso de WA8, WA9 y WA10 con un arranque de fermentación a las 24-48 horas, el resto no inician la fermentación hasta las 72 horas. Figura 17: Cinética fermentativa a 21ºC frente al tiempo de fermentación. Levaduras de la especie W. anomalus 0 5 10 15 20 25 30 35 012345678910111213141516171819202122 g de CO2 producido/l Días de fermentación Cinética fermentativa WA9 WA10 WA11 WA12 WA13 WA14 WA15 WA16 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 20/31 El género Wickerhamomyces presenta grandes diferencias tanto en su cinética fermentativa, como en la actividad enzimática (tabla 2). La WA3, WA4 y WA5 con una liberación de CO2 intermedia, presentan una mayor actividad de las enzimas más relacionadas con la clarificación y filtración de los vinos, como son la β-glucanasa y proteasa, además de la actividad β-glucosidasa de gran interés para la obtención de vinos con un perfil terpénico marcado. Mientras que la WA12, con una cinética similar, destaca por presentar una actividad β-liasa elevada. Las levaduras WA8 y WA9 con un arranque de fermentación rápido, presentan actividad proteasa y β-glucosidasa. Por otro lado, levadura W10, que resulta especialmente interesante debido a su actividad enzimática β-glucosidasa, proteasa y β-liasa, junto con un rápido arranque de fermentación. En las curvas de cinética de P. kudriavzevii (fig. 18 y 19) observamos un inicio de fermentación algo más retardado en todas las cepas e igualmente no detectamos una estabilización de la producción de CO2 una vez pasados 22 días de fermentación a excepción de la PK13. Además, todas las levaduras de este género presentan un arranque lento, unido a un grado final que va de los 4 hasta los 8%vol. (tabla 4). Figura 18: Cinética fermentativa a 21ºC frente al tiempo de fermentación. Levaduras de la especie P. kudriavzevii 0 10 20 30 40 50 60 70 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 g de CO2 producido/l Días de fermentación Cinética de fermentación P. kudriavzevii PK1 PK2 PK3 PK4 PK5 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 21/31 Podemos decir que las levaduras P. kudriavzevii no son interesantes por su lenta implantación en el mosto, su bajo poder fermentativo y su escasa producción de enzimas de interés, únicamente presentando actividad β-liasa de forma algo más moderada en el caso de PK4, PK5, PK7 y PK9 (tabla 2). Por otro lado, en la figura 20 se observa una mayor producción de CO2 que en el caso de las levaduras anteriores estudiadas, así como la estabilización de la curva mucho anterior que en otras levaduras. Además, las levaduras del género Hanseniaspora presentan un rápido vigor fermentativo ya que a las 24 horas ya presentaban inicio de fermentación y la levadura H. osmophila a las 48 horas ya estaba en su fase exponencial de crecimiento. Las levaduras de las especies H. osmophila y H. mereyi tienen un poder fermentativo algo más elevado, especialmente HO1, alcanzando un grado de 11,6 % vol. siendo las levaduras del estudio que más azúcar han consumido. Figura 19: Cinética fermentativa a 21ºC frente al tiempo de fermentación. Levaduras de la especie P. kudriavzevii 0 10 20 30 40 50 60 70 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 g de CO2 producido/l Días de fermentación Cinética fermentativa P. kudriavzevii PK7 PK8 PK9 PK10 PK11 PK12 PK13 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 22/31 Las levaduras del género Hanseniaspora presentan unas características correctas y deseables, con un rápido arranque en la fermentación, un poder fermentativo más significativo que el de otras levaduras del estudio, todo ello unido a una actividad enzimática relevante. La HO1 con producción de las enzimas proteasa y β-liasa de forma elevada, así como la HM también con actividad β-glucanasa, indicativo de la posible utilidad de esta levadura para vinos con mayor problemática a la hora de realizar los procesos de clarificación proteica. En la figura 21 se observa la cinética de las levaduras T. delbrueckii. Como ocurría con las del género Hanseniaspora la producción de CO2 es bastante elevada y bastante similar en todas las cepas. El inicio de fermentación ocurre de forma veloz, presentando producción de CO2 a las escasas 24 horas, presentando de este modo una rápida cinética fermentativa. Figura 20: Cinética fermentativa a 21ºC frente al tiempo de fermentación. Levaduras del género Hanseniaspora 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 g de CO2 producido/l Días de fermentación Cinética fermentativa HO1 HM1 Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 29/31 ANEXOS ANEXO 1. Observación y tabla de resultados test killer Tabla 3: Resultados del ensayo killer Levadura Test killer Test sensible Fenotipo WA 1 K- R+ Neutra WA 2 K- R+ Neutra WA 3 K- R+ Neutra WA 4 K- R+ Neutra WA 5 K- R+ Neutra WA 6 K- R+ Neutra WA 7 K- R+ Neutra WA 8 K- R+ Neutra WA 9 K- R+ Neutra WA 10 K- R+ Neutra WA 11 K- R+ Neutra WA 12 K- R+ Neutra WA 13 K- R+ Neutra WA 14 K- R+ Neutra WA 15 K- R+ Neutra WA 16 K+ R+ Killer PK 1 K- R- Sensible PK 2 K- R+ Neutra PK 3 K- R+ Neutra PK 4 K- R- Sensible PK 5 K- R+ Neutra PK 6 K- R+ Neutra PK 7 K- R- Neutra PK 8 K- R+ Neutra PK 9 K+ R+ Killer PK 10 K+ R+ Killer PK 11 K+ R+ Killer PK 12 K- R+ Neutra PK 13 K- R+ Neutra HO1 K- R+ Neutra HM 1 K- R+ Neutra PG1 K- R+ Neutra PG2 K- R+ Neutra TD1 K- R+ Neutra TD2 K- R+ Neutra TD3 K- R+ Neutra Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 30/31 ANEXO 2. Observación al microscopio Figura 23: Morfología apiculada de H. meyeri Objetivo 40X Figura 24: Morfología apiculada de H. osmophila Objetivo 40X Figura 25: Morfología esférica de W. anomalus Objetivo 40X Figura 26: Morfología esférica de T. delbrueckii Objetivo 40X Figura 27: Morfología ovoidal de P. guilliermondii Objetivo 100X Figura 28: Morfología en forma de bastón de P. kudriavcevi Objetivo 40X Caracterización enológica de levaduras no-Saccharomyces procedentes de la D.O. Rueda Izquierdo Calvo, Lucía UNIVERSIDAD DE VALLADOLID (CAMPUS DE PALENCIA) Grado en Enología 31/31 ANEXO 3. Tabla de poder fermentativo Tabla 4: Poder fermentativo Levadura Grado (%vol.) WA 1 2,5 ± 0,2 WA 2 2,5 ± 0,3 WA 3 3,6 ± 2,2 WA 4 2,7 ± 0,8 WA 5 1,9 ± 0,2 WA 6 2,3 ± 0,1 WA 7 2,2 ± 0,5 WA 8 3,3 ± 0,5 WA 9 1,9 ± 0,2 WA 10 2,5 ± 1,0 WA 11 2,3 ± 0,7 WA 12 2,8 ± 0,7 WA 13 2,8 ± 1,0 WA 14 2,3 ± 0,1 WA 15 1,4 ± 0,3 WA 16 1,6 ± 0,2 PK 1 4,0 ± 1,3 PK 2 4,8 ± 1,3 PK 3 2,8 ± 1,8 PK 4 7,8 ± 0,4 PK 5 7,2 ± 0,5 PK 6 7,2 ± 0,7 PK 7 5,7 ± 0,9 PK 8 6,5 ± 1,0 PK 9 6,2 ± 0,1 PK 10 7,6 ± 2,4 PK 11 6,7 ± 0,5 PK 12 7,7 ± 0,3 PK 13 8,2 ± 1,5 HO1 11,6 ± 2,5 HM 2 5,2 ± 1,5 PG1 1,9 ± 0,2 PG2 2,1 ± 0,9 TD1 8,9 ± 1,9 TD2 10,5 ± 1,1 TD3 11,2 ±1,3