Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyces en Tempranillo

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍAS AGRARIAS GRADO EN ENOLOGÍA Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyces en Tempranillo Alumna Martín de la Higuera, Sara Tutora Ruipérez Prádanos, Violeta Palencia, 2022 Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 1 de 33 ÍNDICE RESUMEN .................................................................................................................... 2 ABSTRACT .................................................................................................................. 2 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 3 1.1. Levaduras no-Saccharomyces ........................................................................... 3 1.2. Selección de levaduras ...................................................................................... 5 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ............................................................................... 6 3. MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 7 3.1. Aislamiento y selección ...................................................................................... 7 3.1.1. Toma de muestra en viñedo ........................................................................ 7 3.1.2. Aislamiento en el laboratorio ........................................................................ 7 3.1.3. Selección de levaduras ................................................................................ 9 3.2. Identificación de levaduras ................................................................................. 9 3.2.1. Crecimiento en medio lisina ......................................................................... 9 3.2.2. Actividad enzimática .................................................................................. 10 3.2.3. Crecimiento en medio agar nutriente WL ................................................... 10 3.2.4. Secuenciación ........................................................................................... 11 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................ 12 4.1. Aislamiento y selección .................................................................................... 12 4.2. Identificación de levaduras no-Saccharomyces ................................................ 12 4.2.1. Crecimiento en medio lisina ....................................................................... 13 4.2.2. Actividad enzimática .................................................................................. 14 4.3. Identificación de especies no-Saccharomyces ................................................. 18 4.3.1. Crecimiento en agar nutriente WL .............................................................. 19 4.3.2. Secuenciación ........................................................................................... 21 4.3.3. Especies no-Saccharomyces aisladas ....................................................... 22 5. CONCLUSIONES ................................................................................................... 25 6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 26 ANEXOS ..................................................................................................................... 30 Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 2 de 33 RESUMEN En los últimos años se ha demostrado la aportación de características organolépticas diferentes de las levaduras no-Saccharomyces en el vino, mejorando así la calidad y/o el perfil aromático de los vinos. Por otro lado, ya que el cambio climático ha afectado mucho al sector vitivinícola, en las últimas décadas, se está buscando el empleo de estas levaduras para, por ejemplo, la disminución del grado alcohólico provocado por el aumento de la concentración de azúcares en las uvas. Los estudios de estas levaduras comparten la finalidad de innovar positivamente en el ámbito enológico para el interés de cada bodega, aportando variabilidad y tipicidad a los vinos, con características aromáticas únicas, facilitando el proceso de elaboración o mejorando las características finales del vino, y todo ello adaptándose a la variedad de uva a utilizar. En este estudio se realizó un aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyces procedentes de un viñedo de variedad Tempranillo ubicado en Pesquera, identificando las levaduras con posible interés enológico para modular y mejorar las características finales del vino. ABSTRACT In the last few years, there has been demonstrated the contribution of non- Saccharomyces yeasts to organoleptic characteristics of wine, improving the quality and/or the aromatic profile of wines. Besides that, since climate change has greatly affected the wine sector in recent decades, the use of these yeasts is being sought for, for example, the decrease in alcohol content caused by the increase in the concentration of sugar in grapes. The studies of these yeasts share the purpose of innovating positively in the oenological field for the interest of each winery, providing variability and authenticity to the wines, with unique aromatic characteristics, facilitating the winemaking process or improving the final characteristics of the wine, and all of this with the adaptation to the grape variety used. In this study it was carried out the isolation and selection of non-Saccharomyces yeasts from a Tempranillo vineyard located in Pesquera, identifying yeasts of possible oenological interest to modulate and improve the final characteristics of the wine. Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 3 de 33 1. INTRODUCCIÓN En la actualidad, el cambio climático es un factor importante que afecta a la industria vitivinícola, provocando un aumento del contenido de azúcares en el mosto, y por consiguiente el aumento del grado alcohólico en el vino como uno de los problemas más importantes. El contenido de etanol en el vino ha aumentado de manera considerable en los últimos 20 años, tanto por el impacto del cambio climático en la producción como por buscar nuevos estilos de vino que requieran mayor madurez de la uva. Hay estudios que cuantifican el impacto del aumento de la temperatura y la luz en el rendimiento de la uva, el contenido y la acumulación de azúcares (Abeysinghe et al., 2016). Además, su influencia en la fenología de la planta y la composición de la uva da lugar a una reducida acidez, la alteración de la maduración fenológica y el contenido en taninos (Ciani et al., 2016). La creciente demanda de nuevos productos está abriendo puertas a muchas levaduras distintas del género Saccharomyces (Benito S., 2018). En este sentido, algunas especies de levaduras no-Saccharomyces son capaces de reducir el contenido inicial de etanol en un 1 – 2 % (v/v) dependiendo de las condiciones de fermentación (Ciani et al., 2016; Röcker et al., 2016; Contreras et al., 2014). En el proceso de fermentación no solo es importante la transformación de azúcares en etanol, sino también la formación de diferentes metabolitos secundarios que dan las características organolépticas que caracterizan y distinguen a un vino de calidad, dándole autenticidad. Tradicionalmente, las levaduras no-Saccharomyces se han considerado microorganismos no deseados porque podían generar compuestos desfavorables. Sin embargo, se ha demostrado que, dependiendo de la especie, son capaces de aportar propiedades interesantes y, como se ha mencionado en el párrafo anterior, incluso reducir el contenido de etanol (Binati et al., 2020). Por lo tanto, en la actualidad las levaduras no-Saccharomyces son de interés enológico por su potencial contribución positiva a la complejidad sensorial, a través de una producción de aromas y otros compuestos agradables sensorialmente (Ciani et al., 2016; Binati et al., 2020). 1.1. Levaduras no-Saccharomyces Durante varias décadas, se consideraba que muchas de las especies de levaduras no- Saccharomyces eran microorganismos asociados con las características desfavorables que pudiera presentar el vino, por lo que el género Saccharomyces era la única opción que se consideraba a la hora de elaborar el vino. Estas levaduras suelen estar más presentes en las primeras etapas de la fermentación alcohólica (Padilla et al., 2016), antes de ser desplazadas por levaduras de género Saccharomyces (Di Maro et al., 2007), ya que estas son más tolerantes al etanol y se adaptan mejor a las condiciones del mosto como anaerobiosis, bajo pH, altas temperaturas, maceración, adición de anhídrido sulfuroso (a excepción de algunos géneros como Schizosaccharomyces), etc. En general, los géneros de levaduras con una baja resistencia al etanol predominan en la primera etapa de arranque de la fermentación (Hanseniaspora, Candida, Rodotorula, Pichia), aquellos con resistencia moderada persisten más tiempo (Lachancea, Torulaspora), y por último el género Saccharomyces domina el medio hasta que se metabolizan por completo en etanol todos los azúcares fermentables (Röcker et al., 2016; Manzanares et al., 2011; Benito, Á. et al., 2019; Liu et al., 2016). Por lo tanto, las levaduras no-Saccharomyces tienen un papel importante en las fermentaciones espontáneas hasta que el nivel de etanol Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 4 de 33 alcanza el 4 % (v/v), una concentración que la mayoría de especies no- Saccharomyces no toleran (Benito, Á. et al., 2019; Calderón et al., 2019; Hierro et al., 2006; Liu et al., 2016). Sin embargo, hay géneros de no-Saccharomyces, como Hanseniospora o Candida, que pueden estar presentes hasta el final de la fermentación, y en consecuencia influir positivamente mejorando propiedades aromáticas y creando perfiles complejos, si se les aplica una disminución de la temperatura. (Di Maro et al., 2007). En los últimos años se ha demostrado que algunas cepas de no-Saccharomyces influyen positivamente en ciertos parámetros como puede ser la calidad, los aromas, la acidez, el color, etc. (Benito, Á. et al., 2019) Las levaduras no-Saccharomyces constituyen una herramienta alternativa a los métodos químicos para paliar los desequilibrios de acidez causados por el cambio climático. Se ha demostrado que el uso de algunas levaduras no-Saccharomyces puede llegar a reducir el pH o incrementarlo en 0,5 unidades. También algunas especies de no-Saccharomyces pueden producir vinos con contenidos de ácido acético más bajos que S. cerevisiae, como T. delbrueckii o L. thermotolerans (Calderón et al., 2019). Estas levaduras tienen la capacidad de producir ciertas enzimas que pueden llegar a facilitar algunas operaciones en el proceso de vinificación (maceración, filtración o clarificación), aumentar el rendimiento y extracción de color, y mejorar las características del vino, especialmente aportando aromas (influencia en los aromas primarios y secundarios de los vinos). Los estudios demuestran que algunas especies de no-Saccharomyces pueden mejorar la intensidad aromática, aumentar la liberación de aromas varietales, como terpenos o tioles, y pueden producir concentraciones más altas de ésteres afrutados o manoproteínas que S. cerevisiae (Padilla et al., 2016; Manzanares et al., 2011; Hierro et al., 2006; Binati et al., 2020). Cabe destacar que las levaduras no-Saccharomyces no tienen un alto poder fermentativo, por lo que es arriesgado su empleo como levadura única ya que no agota todos los azúcares, lo que supone dificultades de cara a la finalización de la fermentación (Manzanares et al., 2011; Di Maro et al., 2007). Estos finales de fermentación, junto con un pH alto, pueden aumentar el riesgo de paradas de fermentación. Este hecho también puede influir en los parámetros de calidad, e incluso producir compuestos indeseados o peligrosos para la salud humana como aminas biógenas y carbamato de etilo. Estudios científicos demuestran que hay microorganismos vinícolas no convencionales, como es el caso de algunas levaduras no-Saccharomyces, que se utilizan para eliminar el ácido málico de los productos ya fermentados y para estabilizar dichos vinos (Calderón et al., 2019). Por tanto, una opción acertada para solventar la baja actividad fermentativa de las levaduras no-Saccharomyces y a su vez obtener las influencias positivas que nos pueden aportar, sería recurrir a los cultivos iniciadores mixtos, de forma secuencial o simultánea, como alternativa a la fermentación espontánea o inoculación de cepas comerciales de S. cerevisiae. Esta combinación suele suponer un retraso fermentativo de unos pocos días en comparación con la inoculación exclusiva de S. cerevisiae (Binati et al., 2020; Padilla et al., 2016; Liu et al., 2016; Benito, Á. et al., 2019). Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 5 de 33 1.2. Selección de levaduras Un factor importante para conseguir una gran diversidad de vinos es emplear cepas seleccionadas procedentes de la zona vitivinícola de interés. Esta selección depende de la interacción de ciertas variables como la variedad de uva elegida, las condiciones que se emplean para el proceso de fermentación, el área de producción, la edad del viñedo, las condiciones climáticas, la integridad y técnica de la cosecha, el proceso de vinificación implantado y el tipo de vino producido, con variaciones posteriores de la calidad del vino dependiendo de la región o el año (Di Maro et al., 2007; Hart et al., 2019). En la actualidad, se han desarrollado estrategias para optimizar y mejorar la producción de los vinos. Entre ellas, se menciona el aislamiento y la selección de cepas nativas a través de técnicas de microbiología enológica, biología molecular, e incluso de ingeniería metabólica. La selección de cepas nativas o seleccionadas localmente favorece que estas levaduras estén bien adaptadas a las condiciones de la región productora de vino y a la composición del mosto de uva. Más importante aún, pueden influir en gran medida en los perfiles aromáticos finales del vino al generar un carácter regional único (Liu et al., 2016). Es por ello que ahora existe la ventaja de la inoculación de levaduras nativas seleccionadas, una opción para poder conseguir un vino más reproducible sin privarle de las características únicas que le confieren estas levaduras nativas (Miranda-Castilleja et al., 2015). La capacidad que tienen las levaduras no-Saccharomyces de secretar enzimas y producir metabolitos secundarios, etanol y glicerol, de liberar manoproteínas o de contribuir a la estabilidad del color, es específica de la especie y la cepa, por lo que es de gran importancia una selección de cuidadosa e inteligente de la cepa (Padilla et al., 2016). Por ello, es necesario un cribado amplio de las cepas para seleccionar las que posean atributos positivos y rechazar aquellas con impactos negativos, como sobreproducción de ácido sulfhídrico o ácido acético (Fleet, 2008). La combinación de cepas complementarias no-Saccharomyces o la inoculación de cultivos mixtos resulta una alternativa interesante, para lo que es necesaria la selección de dichas levaduras (Gutiérrez Fernández, 2018; Zhuang & Feng, 2022). Las cepas que se incluyen en el proceso de selección son aisladas preferentemente del mosto. Una vez aislado un número significativo se procede a la caracterización. Se comienza con un número elevado de cepas, por lo que, en las primeras fases de selección, hay que incluir criterios fáciles de evaluar para identificar y descartar más rápidamente cepas que no interesen. Dependiendo de autores, hay diferentes criterios de selección teniendo en cuenta las características particulares que se quieran obtener de cada cepa de levadura para el producto final (Escribano-Viana, 2021). El presente estudio está enfocado al aislamiento e identificación de levaduras no-Saccharomyces presentes en uva de la variedad Tempranillo mediante su caracterización enzimática y posterior identificación a nivel de especie. Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 6 de 33 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Actualmente, debido al cambio climático, los mostos pueden presentar un grado alcohólico probable alto, que conlleva difíciles finales de fermentación para los protocolos establecidos y la acidez generalmente se reduce en esos casos, lo que puede generar pH alto. La fermentación alcohólica convencional de mostos con alto grado alcohólico y elevado pH conlleva riesgos que pueden influir y/o deteriorar la calidad principal del vino, afectando a parámetros tales como acidez volátil, acidez total y azúcares residuales (Calderón et al., 2020). El aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyces principalmente pretende mejorar la calidad de los vinos y/o facilitar el proceso de elaboración. El empleo de levaduras autóctonas favorece la adaptación a las condiciones de la región y a la composición del mosto. Por otro lado, se busca la diferenciación de los vinos, lo que podría realizarse con fermentaciones espontáneas, o bien, seleccionando estas levaduras. La opción menos arriesgada sería la selección e inoculación de dichas levaduras para llevar a cabo la fermentación. Por lo tanto, el principal objetivo de este estudio es el aislamiento y selección de distintas levaduras no-Saccharomyces en las primeras etapas de la fermentación del mosto, donde estas levaduras predominan. Para ello se plantean estos objetivos secundarios:  Aislamiento en laboratorio de levaduras.  Selección de levaduras aisladas y obtención de cultivos puros.  Identificación de las especies aisladas mediante diferentes medios de cultivo y actividades enzimáticas características de levaduras no-Saccharomcyes. Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 7 de 33 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Aislamiento y selección 3.1.1. Toma de muestra en viñedo Para el estudio se realizó un muestreo en una parcela de un viñedo en Pesquera, Valladolid. No se necesitaba mucha uva, por lo que se consiguieron seleccionar uvas en su estado óptimo de maduración, midiendo el grado Brix de cada uno de los racimos seleccionados y seleccionando aquellos que presentaban un estado sanitario aparentemente idóneo. El muestreo se realizó cada dos líneas y tomando racimos de diferentes cepas de cada línea. En cada racimo seleccionado se cogieron uvas de la parte de la cola si éste era muy grande, y el racimo entero si era de tamaño mediano. Los racimos se trasladaron en bolsas estériles rápidamente al laboratorio de microbiología la ETSIIAA. 3.1.2. Aislamiento en el laboratorio 3.1.2.1. Mosto base El mosto utilizado para el estudio es de la variedad Tempranillo de la añada 2021. Las muestras tomadas del viñedo se estrujaron en un digestor y se retiró la pasta. Antes de coger muestras para el estudio de mosto recién estrujado, se realizó un análisis del pH, grado probable y acidez total. Tabla 1: Análisis del mosto base Analítica Resultado pH 3,64 Grado Brix 25,2 °Brix Grado alcohólico probable 14,9 %vol Acidez total 6,6 g/L TH 2 Para estos análisis se emplearon las siguientes metodologías e instrumentos:  pH: se utilizó un pH-metro (HACH Sesion + pH3) con una escala calibrada que permita mediciones con una precisión mínima de ± 0,01 uds. de pH. (Method OIV-MA-AS313-15).  Grado Brix: se utilizó un refractómetro (ATAGO, Hand refractometer ATC-1), que indique la concentración de azúcar mediante un índice de refracción. (Method OIV-MA-AS2-02).  Grado alcohólico probable (GAP): se calculó a partir de la determinación del grado Brix. GAP (%vol) = (0,6757 · °Brix) – 2,0839.  Acidez total: se utilizó el método potenciométrico en el que hay que llevar el mosto a pH 7 añadiendo una solución de NaOH 0,1N. (Method OIV-MA-AS313- 01). Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 8 de 33 3.1.2.2. Medios de cultivo de aislamiento Los medios para el aislamiento de las levaduras empleados fueron el medio sólido YPD, medio genérico para levaduras y medio CECT 138, recomendado para el cultivo de levaduras no-Saccharomyces. Medio YPD Es un medio de cultivo sólido muy completo con un alto valor nutritivo y es capaz de favorecer el desarrollo de la mayoría de microorganismos. Se suele usar para el crecimiento de levaduras. Medio YPD/YEPD (OIV/OENO 206/2010):  Glucosa 20 g/L (Labkem).  Peptona 20 g/L (Panreac).  Extracto de levadura 10 g/L (Labkem).  Agar 15 g/L (BactoTM,BD). Medio CECT 138 Según la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), este es un medio de cultivo sólido recomendado para el cultivo de levaduras no-Saccharomyces, no es específico ya que también pueden crecer levaduras del género Saccharomyces. Se usa para el aislamiento y el cultivo de levaduras, mohos y otros microorganismos acidúricos. Medio YM/CECT 138 (OIV/OENO 206/2010):  Glucosa 10 g/L (Labkem).  Peptona vegetal 5 g/L (Sigma-Aldrich).  Extracto de levadura 3 g/L (Labkem).  Extracto de malta 3 g/L (Scharlab).  Agar 20 g/L (BactoTM,BD). Los medios se esterilizaron en un autoclave a 121°C durante 15 minutos. 3.1.2.3. Fermentación Se tomó la primera muestra (Día 0) del mosto recién estrujado antes de introducirlo en la estufa a 26°C. La fermentación se llevó a cabo en un recipiente estéril. Se realizó una siembra en profundidad en placas Petri estériles con los medios YEPD y CECT 138 descritos en el apartado 3.1.2.3. Se sembraron placas con 1,0 mL y 0,1 mL del mosto recién estrujado por duplicado y para cada medio, por lo que se obtuvieron un total de 8 placas del día 0. Tres días después, al comienzo de la fermentación, se tomó la segunda muestra (Día 3), al igual que a los días 6 (fase tumultuosa) y 10 (fin de fermentación). De estos tres últimos días se realizaron diluciones de las muestras de mosto, hasta 10-8, y se realizaron siembras en profundidad de cada dilución para cada medio de cultivo. Se dejaron solidificar las placas y se incubaron en una estufa a 26°C durante una semana para su crecimiento. Se consiguió un total de 8 placas el día 0 y 16 placas del resto de días (día 3, día 6 y día 10). Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 15 de 33 enzimas de levaduras aisladas de los ecosistemas enológicos y del mosto son activas en las condiciones del vino y de su proceso de elaboración, teniendo una gran influencia las características fisicoquímicas del mosto/vino como pH, temperatura, etanol, azúcares, polifenoles, etc. (Palmeri & Spagna, 2007; Zhang et al., 2021; Gao et al., 2022). Este medio nos permite diferenciar entre especies de levaduras que presentan esta actividad y las especies de Saccharomyces cerevisiae, las cuales, según lo descrito en la bibliografía (Jolly et al., 2014; Suranská et al., 2016), no la presentan. Tabla 3: Resultado de las levaduras aisladas en medio de cultivo β-glucosidasa. Leyenda: - sin actividad, + actividad media, ++ mucha actividad. Día Microorg. Glucosidasa Día Microorg. Glucosidasa 0 T0.1 ++ 6 T6.9 - 0 T0.2 ++ 6 T6.10 - 0 T0.3 ++ 6 T6.11 - 0 T0.4 ++ 6 T6.12 - 0 T0.5 ++ 6 T6.13 - 0 T0.6 ++ 6 T6.14 - 0 T0.7 ++ 6 T6.15 - 0 T0.8 ++ 6 T6.16 - 0 T0.9 ++ 10 T10.1 + 3 T3.1 ++ 10 T10.2 - 3 T3.2 ++ 10 T10.3 - 3 T3.3 ++ 10 T10.4 - 3 T3.4 + 10 T10.5 - 3 T3.5 + 10 T10.6 ++ 3 T3.6 + 10 T10.7 + 3 T3.7 ++ 10 T10.8 - 3 T3.8 ++ 10 T10.9 - 3 T3.9 ++ 10 T10.10 - 3 T3.10 + 10 T10.11 - 3 T3.11 ++ 10 T10.12 - 3 T3.12 ++ 10 T10.13 - 3 T3.13 ++ 10 T10.14 - 3 T3.14 ++ 10 T10.15 - 3 T3.15 ++ 10 T10.16 - 6 T6.1 - 10 T10.17 - 6 T6.2 - 10 T10.18 - 6 T6.3 - 10 T10.19 - 6 T6.4 - 10 T10.20 - 6 T6.5 - 10 T10.21 - 6 T6.6 - 10 T10.22 + 6 T6.7 - 10 T10.23 - 6 T6.8 - 10 T10.24 - Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 16 de 33 En los primeros días (día 0 y 3) la mayoría de los aislados presentaron actividad βglucosidasa alta, ya que en las primeras etapas es donde se encuentran más levaduras no-Saccharomyces, las cuales pueden poseer esta actividad. El 43,7% de las placas se ennegrecieron, lo que quiere decir que la enzima β-glucosidasa ha hidrolizado la arbutina del medio (Lin et al., 2020). Alguna placa del día 3 empezó a tener menos actividad por su menor coloración negruzca. Los días siguientes de fase tumultuosa (día 6) y final de fermentación (día 10), no presentaron esta actividad enzimática, las placas permanecieron igual que el control (S. cerevisiae). Hubo excepciones en el día 10, ya que en principio las levaduras del género Saccharomyces no tienen esta actividad, es posible que el medio cambiase ligeramente de color por el tiempo transcurrido en la estufa, debido a contaminaciones, o a la presencia de levaduras no-Saccharomyces. Es importante destacar que la secreción de cada enzima varía significativamente dependiendo del género, especie y cepa de levadura analizada, y algunas cepas pueden no producir esta enzima en absoluto (Ganga & Martínez, 2003). La actividad β-glucosidasa está ampliamente extendida entre la mayor parte de las levaduras, aunque cabe destacar como potenciales candidatos para su uso en la liberación de terpenos las especies de Hanseniaspora spp., Wickerhamomyces anomalus, y Metschnikowia pulcherrima, en las cuales se ha detectado una intensa actividad (Belda et al., 2016; Mendes Ferreira et al., 2011). Figura 2: Resultado positivo (izquierda) y negativo (derecha) en medio β-glucosidasa 4.2.2.2. Actividad proteasa Desde un punto de vista enológico, la actividad proteasa es de interés debido a que las levaduras pueden librear enzimas proteasas, las cuales tienen la capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos de las proteínas en péptidos y/o aminoácidos libres, se pueden utilizar para mejorar la digestibilidad, el sabor del vino y el valor nutricional (descomposición de la proteína en aminoácidos) para prevenir de paradas de fermentación (Tolosa & Prieto, 2019; Toy et al., 2022). La inestabilidad proteica inducida por las altas concentraciones de alcohol y el bajo pH podría ser la fuente de formación de neblina en los vinos. Algunas levaduras no- Saccharomyces descritas al secretar proteasas, reducen el potencial de neblina fría. Por lo tanto, se han realizado estudios con el propósito de encontrar proteasas que pudieran reducir la inestabilidad proteica en los vinos mediante la eliminación de las proteínas antes de la fermentación alcohólica (Tolosa & Prieto, 2019; Guo et al., 2018). Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 17 de 33 Además, esta enzima también tiene un papel importante cuando se necesita un alto contenido en nitrógeno como nutriente para las levaduras, y poder fermentar todos los azúcares del mosto, ya que el contenido de estos cada vez es mayor (Escribano et al., 2017; Strauss et al., 2001). Este medio nos permite diferenciar entre especies de levaduras que presentan esta actividad y las especies de Saccharomyces cerevisiae, las cuales según lo descrito en la bibliografía, no la presentan (Strauss et al., 2001; Jolly et al., 2014). Tabla 4: Resultado de las levaduras aisladas en medio de cultivo proteasa. Leyenda: - sin actividad, + con actividad. Día Microorg. Proteasa Día Microorg. Proteasa 0 T0.1 + 6 T6.9 - 0 T0.2 + 6 T6.10 - 0 T0.3 + 6 T6.11 - 0 T0.4 + 6 T6.12 - 0 T0.5 + 6 T6.13 - 0 T0.6 + 6 T6.14 - 0 T0.7 + 6 T6.15 - 0 T0.8 + 6 T6.16 - 0 T0.9 + 10 T10.1 - 3 T3.1 + 10 T10.2 - 3 T3.2 + 10 T10.3 - 3 T3.3 + 10 T10.4 - 3 T3.4 + 10 T10.5 - 3 T3.5 + 10 T10.6 + 3 T3.6 + 10 T10.7 - 3 T3.7 + 10 T10.8 - 3 T3.8 + 10 T10.9 - 3 T3.9 + 10 T10.10 - 3 T3.10 + 10 T10.11 - 3 T3.11 + 10 T10.12 - 3 T3.12 - 10 T10.13 - 3 T3.13 + 10 T10.14 - 3 T3.14 + 10 T10.15 - 3 T3.15 + 10 T10.16 - 6 T6.1 - 10 T10.17 - 6 T6.2 - 10 T10.18 - 6 T6.3 - 10 T10.19 - 6 T6.4 - 10 T10.20 - 6 T6.5 - 10 T10.21 - 6 T6.6 - 10 T10.22 - 6 T6.7 - 10 T10.23 - 6 T6.8 - 10 T10.24 - Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 18 de 33 En total, el 37,5% de los aislados fueron capaces de sintetizar proteasas y formaron halos más claros alrededor de las colonias (Lin et al., 2020), la gran mayoría de ellas en el día 0 y día 3, donde hay más probabilidad de encontrarnos con levaduras no- Saccharomyces, por estar en las primeras etapas de la fermentación (Ganga & Martínez, 2003). La muestra T3.12 dio negativo en esta prueba. Los días siguientes de fase tumultuosa (día 6) y final de fermentación (día 10), no presentaron esta actividad enzimática, las placas permanecieron igual que el control (S. cerevisiae). Hubo excepciones en el día 10, T10.6 dio positivo en actividad proteasa. Figura 3: Resultado positivo en medio proteasa Los resultados obtenidos del crecimiento en medio lisina y de las actividades enzimáticas de los aislados para la identificación de levaduras no-Saccharomyces, apuntan a que los días 0 y 3, siendo en las primeras etapas de la fermentación y habiendo dado positivo en medio lisina y actividades enzimáticas de β-glucosidasa y proteasa, sean levaduras no-Saccharomyces. Por el contrario, los días 6 y 10, siendo etapas posteriores de la fermentación, con un alto nivel de etanol, podrían considerarse del género Saccharomyces por su mínimo crecimiento o nulo en medio lisina y resultados negativos en actividades enzimáticas de β-glucosidasa y proteasa. T10.6 da resultados que no concuerdan con características del género Saccharomyces, ya que, aunque no creció en medio lisina, posee actividad enzimática de β-glucosidasa y proteasa, por lo que no se descarta la posibilidad de que esta levadura sea no-Saccharomyces. Por otro lado, T3.12 da resultados que no concuerdan con características de levaduras no-Saccharomyces, ya que no creció en medio lisina siendo un aislado de las primeras etapas de la fermentación, ni presentó actividad proteasa, pero presenta actividad enzimática β-glucosidasa, por lo que sería necesaria una identificación a nivel de especie para concretar estos dos aislados. 4.3. Identificación de especies no-Saccharomyces Para identificar a nivel de especie los aislados que previamente se han preclasificado como posibles no-Saccharomyces, se empleó inicialmente el crecimiento de estas levaduras en el medio agar nutriente WL. Posteriormente se realizó una secuenciación de levaduras de interés para identificar las levaduras a nivel de especie. Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 19 de 33 4.3.1. Crecimiento en agar nutriente WL Como ya se mencionó en el apartado 3.2.4., este medio permite la detección de diferencias morfológicas entre especies (Lin et al., 2020). Las morfologías de las colonias de las levaduras presentes en la superficie de la uva y en los mostos en fermentación son lo suficientemente singulares como para ser identificadas hasta el género/especie por medio de placas. Por ello, se trataron de identificar los aislados mediante este método visual, el cual no pretende una identificación de especies a gran escala, puede suponer una forma rápida y barata de prever el género de algunas levaduras, es una primera aproximación a lo que se puede encontrar. No cubre todas las especies posibles aisladas en el vino. Según la resolución OIV/OENO 206/2010 Anexo 6 de reconocimiento de colonias de levadura con agar nutriente WL, basándose en Pallman et al., 2001 y Cavazza et al., 1992, se evaluaron las morfologías de las colonias: Tabla 5: Descripción de los aislados y posible género/especie de levadura en medio agar nutriente WL. * = Levadura aislada distinta del resto en los días 6 y 10 Día Microorg. Morfología Posible levadura 0 T0.1 azul grisáceo claro Pichia spp. 0 T0.2 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 0 T0.3 crema un poco verdoso Zygosaccharomyces bailii 0 T0.4 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 0 T0.5 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 0 T0.6 azul grisáceo claro Pichia spp. 0 T0.7 crema un poco verdoso Zygosaccharomyces bailii 0 T0.8 azul grisáceo claro Pichia spp. 0 T0.9 crema un poco verdoso Zygosaccharomyces bailii 3 T3.1 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 3 T3.2 azul grisáceo oscuro Pichia spp. 3 T3.3 azul grisáceo oscuro Pichia spp. 3 T3.4 crema rosa borde marrón Metschnikowia spp. 3 T3.5 verde claro Torulaspora spp. 3 T3.6 verde claro Torulaspora spp. 3 T3.7 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 3 T3.8 azul oscuro Pichia anomala 3 T3.9 azul grisáceo oscuro Pichia spp. 3 T3.10 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 3 T3.11 azul claro granulado polvo Pichia membranifaciens 3 T3.12 verde guisante Candida stellata 3 T3.13 crema rosa borde marrón Metschnikowia spp. 3 T3.14 crema rosa borde marrón Metschnikowia spp. 3 T3.15 crema claro un poco rosa Metschnikowia spp. 6 y 10 - crema verde pálido Saccharomyces spp. 10 T10.6* algunas crema, otras azuladas Pichia anomala Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 20 de 33 Las descripciones de referencia para identificar levaduras no-Saccharomyces indican que, de las 64 levaduras aisladas, el 14,06% podrían pertenecer al género Pichia spp., pudiendo ser a nivel de especie dos de ellas Pichia anomala y una de ellas Pichia membranifaciens. El 15,62% de las levaduras aisladas tenían morfología de Metschnikowia spp., el 4,69% podrían ser Zygosaccharomyces bailii, el 3,12% Torulaspora spp. y una de ellas se asemeja a la especie Candida stellata. Por la morfología similar en todas las levaduras aisladas de los días 6 y 10, y no haber crecido en medio agar lisina, apunta a que se trata de Saccharomyces cerevisiae, un 60,94% del total de aislados, a excepción de T10.6, la cual dio positivo en actividades enzimáticas β-glucosidasa y proteasa pero no creció en agar lisina, siendo también su morfología en este medio diferente a la de Saccharomyces spp. pudiendo asemejarse a la especie Pichia anomala. Figura 4: Morfología de levaduras no-Saccharomyces en medio agar nutriente WL Figura 5: Morfología de levaduras no-Saccharomyces en medio agar nutriente WL Figura 6: Morfología de levaduras Saccharomyces en medio agar nutriente WL Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 21 de 33 Ante la incertidumbre y subjetividad de la identificación de la mayoría de los aislados mediante el medio agar nutriente WL, se enviaron muestras concretas a ser secuenciadas para comprobar la validez de estos resultados. 4.3.2. Secuenciación Las muestras de los días 0 y 3, con más probabilidad de pertenecer al género no- Saccharomyces y cuatro aislados elegidos al azar de los días 6 y 10 de entre las levaduras identificadas como Saccharomyces, fueron enviadas al Laboratorio de Técnicas Instrumentales de la Universidad de León para ser secuenciadas. La identificación de especies se llevó a cabo mediante biología molecular, según lo descrito en el método del apartado 3.2.4. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Tabla 6: Resultados de la identificación nivel especie por secuenciación de las muestras aisladas. Fuente: Laboratorio de Técnicas Instrumentales de la Universidad de León. Día Microorg. SECUENCIACIÓN 0 T0.1 Aureobasidium pullulans 0 T0.2 Aureobasidium pullulans 0 T0.3 Aureobasidium pullulans 0 T0.4 Aureobasidium pullulans 0 T0.5 Aureobasidium pullulans 0 T0.6 Aureobasidium pullulans 0 T0.7 Aureobasidium pullulans 0 T0.8 Aureobasidium pullulans 0 T0.9 Aureobasidium pullulans 3 T3.1 Aureobasidium pullulans 3 T3.2 Aureobasidium pullulans 3 T3.3 Aureobasidium pullulans 3 T3.4 Aureobasidium pullulans 3 T3.5 Metschnikowia pimensis 3 T3.6 Metschnikowia pimensis 3 T3.7 Aureobasidium pullulans 3 T3.8 Aureobasidium pullulans 3 T3.9 Aureobasidium pullulans 3 T3.10 Aureobasidium pullulans 3 T3.11 Hyphopichia pseudoburtonii 3 T3.12 Enterobacter hormaechei 3 T3.13 Aureobasidium pullulans 3 T3.14 Aureobasidium pullulans 3 T3.15 Aureobasidium pullulans 6 T6.7 Saccharomyces cerevisiae 6 T6.15 Saccharomyces cerevisiae 10 T10.7 Saccharomyces cerevisiae 10 T10.15 Saccharomyces cerevisiae Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 22 de 33 Como se puede observar, los resultados, con un porcentaje de similitud de > 99%, no concuerdan con los obtenidos en la prueba mediante agar nutriente WL. Sin embargo, sí concuerdan con los datos obtenidos de crecimiento en lisina y actividades enzimáticas. La gran mayoría de los aislados en los días 0 y 3 son Aureobasidium pullulans, menos T3.5 y T3.6 que pertenecen a la especie Metschnikowia pimensis y T3.11 que es una Hyphopichia pseudoburtonii. El resto de aislados identificados aleatoriamente de los días 6 y 10 pertenecen a la especie Saccharomyces cerevisiae. La levadura T10.6 es una levadura ovoide que no fue secuenciada y no es identificable por morfología. Los resultados no son concluyentes, por lo que sería interesante identificarla a nivel de especie para concretar. El aislado T3.12 se tuvo que identificar a parte por no pertenecer al grupo de los hongos. Se realizó una identificación de bacterias aislando su ADN y amplificando la región de interés (fragmento del gen rpoB) para su posterior secuenciación. Se introdujeron las secuencias en la base de datos GenBank NCBI, con el programa BLAST. Como se puede ver, el resultado obtenido fue la especie de bacteria Enterobacter hormaechei. Se repitió la observación al microscopio y se confirmó la presencia de bacterias, pudiéndose deber el error a una contaminación posterior o una visualización incorrecta al microscopio. 4.3.3. Especies no-Saccharomyces aisladas De las 63 levaduras aisladas, el 36,5% resultaron ser levaduras no-Saccharomyces. Se aislaron tres especies diferentes de levaduras no-Saccharomyces: Aureobasidium pullulans, Metschnikowia pimensis y Hyphopichia pseudoburtonii. Aureobasidium pullulans Aureobasidium pullulans fue la especie más abundante, representando el 86,9% de las especies aisladas no-Saccharomyces presentes en el mosto. Aureobasidium es uno de los géneros que más abundan en las primeras etapas de los mostos espontáneos. La presencia generalizada de A. pullulans se atribuye a su notable tolerancia a una amplia gama de tensiones ecológicas que incluyen ambientes ácidos, básicos, fríos e hipersalinos, así como a su flexibilidad nutricional asociada a su extenso perfil enzimático (Onetto et al., 2020). Hay estudios que han demostrado la capacidad de esta especie para sobrevivir en el mosto mientras produce polisacáridos, polímeros de ácido málico (ácido poli β-málico) y enzimas con actividad de pectinasa, β-glucosidasa, lipasa, proteasa y tanasa (Lin et al., 2020). Se ha reportado sobre todo actividad pectinolítica para la especie al crecer en mosto, donde tiene un impacto significativo en el color, las propiedades aromáticas y la eficiencia de clarificación del vino resultante (Merín & Morata de Ambrosini, 2015; Merín & Morata de Ambrosini, 2018). En general tiene muy poca resistencia al etanol, consumiendo cantidades mínimas de azúcar comparado con otras especies (Lin et al., 2020). Tiene variabilidad de resistencia al SO2 dentro del género. Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 23 de 33 Se ha demostrado que esta especie puede afectar a la cinética de fermentación, ya que compite por metales como Zn y Fe, afectando las capacidades de fermentación de especies como S. cerevisiae, y a parte, secreta Aureobasidina A (AbA), que es un compuesto que tiene una fuerte acción fungicida frente a levaduras del género Candida o Saccharomyces (Onetto et al., 2020). La abundancia de A. pullulans en mosto podría afectar al perfil aromático de los vinos, reduciendo la concentración de alcoholes superiores y aumentando la concentración de algunos ésteres etílicos agradables (Morata de Ambrosini & Merín, 2018). También se observan cambios en la concentración de ácidos volátiles, (Onetto et al., 2020; Merín & Morata de Ambrosini, 2015), por lo que se requieren más estudios sensoriales para determinar el impacto de esta especie en el perfil aromático de los vinos fermentados espontáneamente. En resumen, A. pullulans parece ser prometedor para aplicar a la vinificación a baja temperatura como cultivo adjunto a S. cerevisiae para mejorar la calidad del vino y el proceso de vinificación. Metschnikowia pimensis De las levaduras aisladas no-Saccharomyces presentes en el mosto, dos de ellas resultaron ser de la especie Metschnikowia pimensis. El género Metschnikowia es de los más abundantes en las primeras etapas de la fermentación. Sin embargo, géneros como este, pueden llegar a aparecer al final de la fermentación con S. cerevisiae, si se les aplica una disminución de la temperatura (Di Maro et al., 2007). Las levaduras del género Metschinikowia presentan un comportamiento oxidativo, por lo que no es de extrañar encontrarlo en cosechas de uva caracterizadas por climas húmedos y lluviosos. Estudios demuestran que especies del género Metschnikowia presenta actividad glucosidasa, pectinasa y glucanasa (Ganga & Martínez, 2003). Esta levadura tuvo diferentes resultados al resto de levaduras no-Saccharomyces del estudio, ya que tuvo menor crecimiento en medio lisina, menor actividad β-glucosidasa por su leve coloración del medio, y menor actividad proteasa ya que el halo más claro alrededor de la colonia no estaba muy marcado. Sin embargo, no se ha encontrado ninguna referencia bibliográfica que relacione específicamente a la especie Metschnikowia pimensis con la elaboración de vino (Kurtzman et al., 2011). Hyphopichia pseudoburtonii Aislamos una Hyphopichia pseudoburtonii de las especies no-Saccharomyces presentes en el mosto. El género Hyphopichia fermenta glucosa y otros azúcares (Kurtzman et al., 2011). Hyphopichia burtonii es la especie tipo del género y fue identificada como levadura con actividades amilolíticas, lipolíticas y/o proteolíticas (Tan Gana et al., 2014). Sin embargo, se le conoce como “moho de tiza” siendo una levadura de deterioro de alimentos relacionada con productos de panadería (Hocking, 2014). Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 24 de 33 Hyphopichia pseudoburtonii es una levadura de fermentación semianaeróbica. Puede utilizar como única fuente de nitrógeno la lisina y es capaz de hidrolizar la arbutina como se ha demostrado en el estudio (NCYC 3383). Rollero et al. (2018) comprobaron que esta levadura produce una ligera cantidad de H2S. Es una especie con la capacidad de fermentación baja y con tendencia a atascarse, tiene un consumo muy bajo de nitrógeno. No se han encontrado muchas referencias bibliográficas que relacionen a Hyphopichia pseudoburtonii con la elaboración de vino. Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 31 de 33 Continuación Tabla 7: Total de aislados en medio YEPD y CECT 138 de los días 0, 3, 6 y 10 y su nomenclatura T = 3 AISLADOS MEDIO CULTIVO MICROORGANISMO NOMENCLATURA 8 LM - - 9 LM - - 10 LM BACTERIA - 11 LM LEVADURA T3.14 12 LM LEVADURA T3.15 T = 6 AISLADOS MEDIO CULTIVO MICROORGANISMO NOMENCLATURA 1 YPD LEVADURA T6.1 2 YPD LEVADURA T6.2 3 YPD LEVADURA T6.3 4 YPD LEVADURA T6.4 5 YPD LEVADURA T6.5 6 YPD LEVADURA T6.6 7 YPD LEVADURA T6.7 8 YPD LEVADURA T6.8 9 YPD LEVADURA T6.9 10 YPD LEVADURA T6.10 11 YPD LEVADURA T6.11 12 YPD LEVADURA T6.12 1 LM BACTERIA - 2 LM LEVADURA T6.13 3 LM BACTERIA - 4 LM BACTERIA - 5 LM BACTERIA - 6 LM BACTERIA - 7 LM LEVADURA T6.14 8 LM BACTERIA - 9 LM LEVADURA T6.15 10 LM BACTERIA - 11 LM LEVADURA T6.16 12 LM BACTERIA - Aislamiento y selección de levaduras no-Saccharomyes en Tempranillo Martín de la Higuera, Sara UNIVERSIDAD DE VALLADOLID, CAMPUS DE PALENCIA Grado en Enología Página 32 de 33 Continuación Tabla 7: Total de aislados en medio YEPD y CECT 138 de los días 0, 3, 6 y 10 y su nomenclatura T = 10 AISLADOS MEDIO CULTIVO MICROORGANISMO NOMENCLATURA 1 YPD LEVADURA T10.1 2 YPD LEVADURA T10.2 3 YPD LEVADURA T10.3 4 YPD LEVADURA T10.4 5 YPD LEVADURA T10.5 6 YPD LEVADURA T10.6 7 YPD LEVADURA T10.7 8 YPD LEVADURA T10.8 9 YPD LEVADURA T10.9 10 YPD LEVADURA T10.10 11 YPD LEVADURA T10.11 12 YPD LEVADURA T10.12 1 LM LEVADURA T10.13 2 LM LEVADURA T10.14 3 LM LEVADURA T10.15 4 LM LEVADURA T10.16 5 LM LEVADURA T10.17 6 LM LEVADURA T10.18 7 LM LEVADURA T10.19 8 LM LEVADURA T10.20 9 LM LEVADURA T10.21 10 LM LEVADURA T10.22 11 LM LEVADURA T10.23 12 LM LEVADURA T10.24