Recuperación de péptidos y monosacáridos de fangos aerobios generados en plantas de tratamiento de aguas residuales

TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos. FACULTAD DE CIENCIAS “RECUPERACIÓN DE PÉPTIDOS Y MONOSACÁRIDOS DE FANGOS AEROBIOS GENERADOS EN PLANTAS DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES.” Autora: Chacón Ruiz, Saray Dirigido y tutorizado por Filipigh, Ángel Alejandro y Bolado Rodríguez, Silvia 2022-2023 Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 2 Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 3 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Composición de los fangos primarios y secundarios. ............................................................ 12 Tabla 2. Composición (%w/w) de la biomasa seca (en base seca sin cenizas). ................................... 22 Tabla 3. Condiciones experimentales de hidrólisis. ............................................................................. 23 Tabla 4. Degradaciones de los carbohidratos detectados. .................................................................... 32 LISTA DE FIGURAS Figura 1. EC de ciclo cerrado en una planta de tratamientos de aguas residuales urbanas. ................. 11 Figura 2. Esquema de la línea de aguas y fangos en una planta de depuración de aguas residuales. .. 11 Figura 3. Esquema del tratamiento hidrotérmico (Xiao & Zhou, 2020). ............................................. 14 Figura 4. Esquema del tratamiento (bio) químico (Xiao & Zhou, 2020). ............................................ 19 Figura 5. Fango secundario (RS). .......................................................................................................... 22 Figura 6. Esquema de hidrólisis química de fangos. AC: ácida, empleando HCl y ALK: alcalina, usando NaOH. ....................................................................................................................................... 25 Figura 7. Esquema de las Hidrólisis hidrotérmicas y combinaciones. ................................................. 25 Figura 8. Esquema hidrólisis enzimática.............................................................................................. 27 Figura 9. Esquema general del proceso de valorización de fangos aerobios generados en plantas de tratamiento de aguas residuales. ............................................................................................................ 28 Figura 10. Esquema y equipo experimental para la determinación de proteínas por el método NKT. 30 Figura 11. Equipo HPLC Marca: Shimadzu, modelo: LC-2050C. ...................................................... 32 Figura 12. Cromatogramas de los patrones de glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa. ....................... 33 Figura 13. Análisis de aminoácidos libres mediante el método de ninhidrina. .................................... 34 Figura 14. Sistema de electroforesis (SDS-PAGE) para la determinación del tamaño molecular de las proteínas recuperadas. ........................................................................................................................... 35 Figura 15. Rendimiento de solubilización (SY, %) de proteínas y carbohidratos en referencia a la masa de proteínas y carbohidratos presentes en la biomasa inicial (RS). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar de 4 determinaciones analíticas (ensayos de hidrólisis analizada en réplica). La desviación estándar de las medias se representa mediante líneas de intervalo verticales. .................... 38 Figura 16. Rendimiento de recuperación de péptidos (%) en referencia al contenido de proteínas en la biomasa inicial (RS). Las barras discontinuas muestran los rendimientos de solubilización (%) de proteínas en referencia al contenido de proteína inicial. Las barras discontinuas presentan en el rendimiento de solubilización (SY, %) de proteínas respecto al contenido inicial. Los datos se proporcionan como medias ± desviaciones estándar de 4 determinaciones analíticas (ensayos de Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 4 hidrólisis analizado en réplica). La desviación estándar de las medias se representa mediante líneas de intervalo verticales. ............................................................................................................................... 44 Figura 17. Grado de hidrólisis (DH, %) y contenido de aminoácidos libres en los péptidos recuperados (RY, %) tras los diferentes tratamientos de hidrólisis aplicado a la biomasa. Los resultados se expresan como la media ± la desviación estándar de 4 determinaciones analíticas (etapa de hidrólisis analizada en réplica). Las líneas de intervalo vertical representan la desviación estándar de las medias. ................. 46 Figura 18. Tamaño de péptidos, en kDa, en las fracciones recuperadas tras los diferentes tratamientos de hidrólisis aplicado a la biomasa ........................................................................................................ 47 Figura 19.Perfil de aminoácidos de algunas fracciones líquidas. ......................................................... 50 Figura 20. Rendimientos de recuperación (RY %) y solubilización (SY %) de carbohidratos en referencia a la masa de carbohidratos totales en la biomasa inicial. La diferencia entre SY y RY proporciona las pérdidas de carbohidratos debido a la etapa de hidrólisis. Los resultados se expresan como la media ± la desviación estándar de 4 determinaciones analíticas (etapa de hidrólisis analizada en réplica). Las líneas de intervalo vertical representan la desviación estándar de las medias. ................. 52 Figura 21. Compuesto de degradación detectados: A) Biomasa inicial, B) HE; C) AH, D) HT+ALK. . 54 Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 5 ABREVIATURAS AGV Ácidos orgánicos volátiles AH Autohidrólisis ALK Hidrólisis alcalina RS Biomasa de fangos aerobios brutos DA Digestión anaerobia EAa Aminoácidos esenciales EDAR Estación de depurada de aguas residuales EH Hidrólisis enzimática EPS Sustancias poliméricas extracelulares HPLC Cromatografía líquida de alta resolución HT Hidrólisis hidrotérmica HT+ALK Hidrólisis combinada termo-alcalina NEAa Aminoácidos no esenciales NKT Nitrógeno total Kjeldahl PHA Polihidroxialcanoatos RID Detector de índice de refracción RY Rendimientos de recuperación de componentes SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida ST Sólidos totales SV Sólidos volátiles WAS Fangos activos residuales - Waste actived sludge AC Hidrólisis ácida HT+AC Hidrólisis combinada termo-acida Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 6 ÍNDICE 1 Introducción ...................................................................................................................................... 9 1.1 PROBLEMÁTICA ASOCIADA A LA GENERACIÓN DEL FANGO ................................. 9 1.2 FANGOS SECUNDARIOS GENERADOS EN LA EDAR .................................................. 11 1.3 ESTRATEGIAS DE VALORIZACIÓN DE BIOMASAS RESIDUALES ........................... 13 1.3.1 Hidrólisis hidrotérmica ................................................................................................... 14 1.3.2 Hidrólisis química........................................................................................................... 15 1.3.3 Hidrólisis térmica en medio químico .............................................................................. 17 1.3.4 Hidrólisis (bio) química .................................................................................................. 19 2 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 21 3 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 22 3.1 FANGO AEROBIO de EDAR ............................................................................................... 22 3.2 METODOLOGÍA DE HIDRÓLISIS APLICADA A LA BIOMASA .................................. 22 3.2.1 Hidrólisis química........................................................................................................... 24 3.2.2 Hidrólisis hidrotérmica y combinado hidrotérmica-química .......................................... 25 3.2.3 Hidrólisis enzimática y autohidrólisis ............................................................................ 26 3.3 CÁLCULOS ........................................................................................................................... 27 3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS .................................................................................................... 28 3.4.1 Análisis de sólidos totales, volátiles y cenizas ............................................................... 28 3.4.2 Análisis de nitrógeno total y proteínas ........................................................................... 29 1.1.1. Análisis de carbohidratos ................................................................................................ 31 3.4.3 Análisis de aminoácidos libres ....................................................................................... 33 3.4.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) .................................................... 35 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 37 4.1 Solubilización de proteínas y carbohidratos ........................................................................... 37 4.2 Recuperación de proteínas ...................................................................................................... 42 4.3 Análisis de aminoácidos y tamaño de péptidos recuperados .................................................. 45 4.4 Recuperación de carbohidratos ............................................................................................... 50 5 CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 55 6 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 57 Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 7 RESUMEN Los problemas ambientales son muy graves debido a que afectan al planeta en el que vivimos. Los fangos aerobios son residuos generados durante el tratamiento biológico de las aguas residuales, formados por microorganismos que acumulan los nutrientes en forma de proteínas y carbohidratos, así mismo. Los fangos tienen, por tanto, un importante potencial de valorización, ya que sus componentes pueden extraerse y ser utilizados en diversas industrias, como parte de las estrategias de economía circular (EC). Esta investigación pretende realizar una valorización fraccional de los fangos aerobios, recuperando las proteínas como péptidos y los carbohidratos como monosacáridos. Se estudia el uso de diferentes alternativas de hidrólisis, entre ellas, las hidrólisis químicas (alcalina con NaOH y ácida con HCl, hidrotérmica (121ºC), combinadas (termoalcalina y termoácida) y bioquímicas (autohidrólisis y enzimática, bajo diferentes condiciones de operación. Se compararon los distintos métodos de hidrólisis, en términos de rendimientos de solubilización (SY) y rendimientos de recuperación (RY) de los componentes mayoritarios de esta biomasa, las proteínas y los carbohidratos. Obteniéndose el máximo RY para la hidrólisis combinada termoalcalina (NaOH 1M, 121ºC, 60 min) y el máximo SY para la hidrólisis ácida (HCl 1M, 121ºC, 60 min). Además, se analizó la composición de aminoácidos y el tamaño de los péptidos recuperados de la biomasa. Siendo la hidrólisis combinada termoácida la mejor técnica para la obtención de aminoácidos libres, mientras que la hidrólisis combinada termoálcali, lo es para la obtención de péptidos de péptidos de gran tamaño. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 8 ABSTRACT Environmental problems are very serious because they affect the planet we live on. Aerobic sludge is waste generated during the biological treatment of wastewater, formed by microorganisms that accumulate nutrients in the form of proteins and carbohydrates, as well. Sludge therefore has an important potential for recovery, since its components can be extracted and used in various industries, as part of circular economy (CE) strategies. This research aims to carry out a fractional valorization of aerobic sludge, recovering proteins as peptides and carbohydrates as monosaccharides. The use of different hydrolysis alternatives is studied, including chemical hydrolysis (alkaline with NaOH and acid with HCl, hydrothermal (121ºC), combined (thermoalkaline and thermoacid) and biochemical (autohydrolysis and enzymatic, under different operating conditions. compared the different hydrolysis methods, in terms of solubilization yields (SY) and recovery yields (RY) of the major components of this biomass, proteins and carbohydrates. Obtaining the maximum RY for the combined thermoalkaline hydrolysis (1M NaOH, 121ºC, 60 min) and the maximum SY for the acid hydrolysis (1M HCl, 121ºC, 60 min). Furthermore, the amino acid composition and size of the peptides recovered from the biomass were analyzed. Thermoacid combined hydrolysis is the best technique for obtaining free amino acids, while thermoalkali combined hydrolysis is the best technique for obtaining large peptides. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 9 1 INTRODUCCIÓN 1.1 PROBLEMÁTICA ASOCIADA A LA GENERACIÓN DEL FANGO El aumento de la generación de fangos de las aguas residuales es un problema mundial en el contexto del crecimiento de la población y del saneamiento adecuado en las grandes estaciones de tratamiento de aguas residuales (EDAR). Esto se debe a que la creciente urbanización y la actividad industrial han llevado a un aumento significativo en la generación de aguas residuales y, por ende, de fango al tratarlas. La producción de fangos de depuradora en la Unión Europea, Estados Unidos y China oscila entre 18 y 33 millones de toneladas/año en peso seco (Ferrentino et al., 2023). Según datos del Registro Nacional de Fangos, en España, solo en 2019, se produjeron alrededor de 1,200,000 toneladas (en materia seca) de esta biomasa (INE, 2022). El coste del tratamiento asociado a su gestión y eliminación, el alto consumo energético y los impactos medioambientales asociados a los mismos suponen el mayor problema en el funcionamiento de las EDAR. Se ha estimado que la gestión de esta biomasa supone entre el 50% y 60% del coste total del funcionamiento de una EDAR (Cebrián, 2019). La creciente preocupación por la gestión adecuada de las aguas residuales y la necesidad de promover prácticas sostenibles ha llevado a una mayor atención hacia el tratamiento y la recuperación de subproductos valiosos a partir de las EDAR. Las EDAR son instalaciones cruciales para purificar las aguas residuales antes de su descarga al medio ambiente o su reutilización para consumo, pero también generan grandes cantidades de biomasa residual (fangos) que representan una oportunidad para la obtención de compuestos bioactivos de interés industrial y biotecnológico. Se han propuesto muchos métodos para el tratamiento de fangos procedentes de las EDAR municipales, por ejemplo, la aplicación agrícola como fertilizante, el vertido, la incineración, la digestión anaerobia (DA) y la pirólisis (Praspaliauskas & Pedišius, 2017) son los más comunes. Como los fangos de depuradora contienen nutrientes esenciales, por ejemplo, un 55% de carbono, un 15% de nitrógeno y un 3% de fósforo, pueden mejorar la calidad de los suelos tras un tratamiento adecuado (Thomsen et al., 2017). Sin embargo, el uso de esta biomasa como fertilizante agrícola crea muchos problemas ambientales debido a la presencia de metales pesados (Zn, Pb, Cu, Cr, Ni y Cd) y otras sustancias tóxicas, así como de microorganismos patógenos(Houillon & Jolliet, 2005). El vertido de fangos se ha visto limitado por la falta de emplazamientos seguros disponibles y por la generación de lixiviados y malos olores (Kelessidis & Stasinakis, 2012). La incineración de fangos secos se ha aplicado Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 16 Rodríguez et al., 2016). Generalmente, se suelen emplear el hidróxido de sodio (NaOH), el hidróxido de calcio (Ca(OH)2) (Czechowski & Marcinkowski, 2006) y el hidróxido de potasio (KOH) como compuestos alcalinos en este tipo de hidrólisis. Los álcalis pueden inducir la solubilización de las proteínas de la membrana, la saponificación de los lípidos de la membrana e inducir daño en las células microbianas (Mendonca et al., 1994). Se ha informado que el Ca(OH)2 es menos eficaz que el NaOH en la solubilización de proteínas, ya que el catión bivalente (Ca2+) puede conectar la célula con el EPS y provocar la reflotación de los polímeros orgánicos disueltos (Li et al., 2008). Sin embargo, se demostró su superioridad en términos de bajo coste, fácil almacenamiento, lenta solubilización para un largo tiempo de reacción y buena deshidratación de fangos. También se ha informado de que el KOH solubiliza menos proteínas que el NaOH, y el coste del KOH para obtener un contenido similar de proteínas era mayor que el del NaOH (Li et al., 2014; Rani et al., 2012). Sin embargo, una desventaja significativa de la hidrólisis alcalina está relacionada con las sales irrecuperables, y las altas concentraciones de sal residual que presentan un gran desafío para el postratamiento de los fangos restantes después de la solubilización de proteínas (Xiao & Zhou, 2020). La hidrólisis alcalina puede dirigirse a la hidrólisis de enlaces éster y enlaces de hidrógeno entre los componentes polisacáridos y no polisacáridos de la pared celular microbiana (Nitsos et al., 2020; Rojo, Filipigh, et al., 2023). A baja temperatura, la hidrólisis alcalina puede inducir un hinchamiento de la pared celular y una mejora de los rendimientos de extracción de proteínas (Phong et al., 2018). Mientras que, a temperaturas más altas, los enlaces glucósidos intramoleculares también se ven afectados, conduciendo a la hidrólisis de la pared celular y los carbohidratos intracelulares. Rojo et al. (2023) reportaron un incremento en los rendimientos de solubilización de proteínas de un 36.1% al 55% cuando una biomasa de microalgas-bacterias generadas en aguas residuales de purines fue tratada mediante hidrólisis alcalina (NaOH, 2M, 60 min) a 40ºC y 50ºC. Por otro lado, Hui et al. (2022) reportaron rendimientos de solubilización de proteínas y carbohidratos (SY) de 60.72% y 40% a partir de fangos activados liofilizados (20 g/L) después de hidrólisis alcalina a pH 3 y 70ºC durante 9 horas. La hidrólisis ácida (AC) también se ha utilizado para solubilizar los fangos para la liberación de proteínas y polisacáridos en procesos de DA. Por ejemplo, Devlin et al. (2011) informaron que, tras un pretratamiento ácido a pH 1 (HCl), la producción de biogás se incrementó hasta un 15% respecto al fango sin tratar (249 mL/g DQO) debido a un incremento en la solubilización de proteína del 88% y de carbohidratos del 90%. Sin embargo, Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 17 normalmente se informó que la hidrólisis ácida era menos eficaz que la hidrólisis alcalina para hidrolizar las células de biomasa en fangos activados residuales (Liu et al., 2008). El ácido sulfúrico es el más utilizado para la hidrólisis ácida debido a su bajo coste y eficacia, pero por su efecto oxidante podría degradar los compuestos liberados. También se han probado otros ácidos, como el ácido nítrico y el ácido clorhídrico. El ácido nítrico se ha descartado ya que se ha observado una reducción significativa del rendimiento a mayores concentraciones de ácido (Nitsos et al., 2020). Esto es probablemente el resultado de la acción oxidativa del ácido nítrico que degradaría las moléculas liberadas. Se ha informado que el tratamiento ácido es más favorable para la obtención de carbohidratos que el tratamiento alcalino (Martin Juárez et al., 2021; Martín-Juárez et al., 2019; Rojo, Filipigh, et al., 2023). El ácido clorhídrico dio resultados superiores de sacarificación en comparación con el ácido sulfúrico y el ácido nítrico en concentraciones que van de 0.2 M a 2 M, en la hidrólisis de la biomasa de H. tetrachotoma para la producción de bioetanol (Kassim & Bhattacharya, 2016). Por otro lado, Rojo et al., (2023) consiguieron un rendimiento de solubilización de carbohidratos de hasta un 65% a 40ºC empleando HCl 2M. Sin embargo, bajo las mismas condiciones los rendimientos de solubilización de proteínas a partir de consorcio de microalgas-bacterias fueron solo del 19%. Martin Juárez et al. (2021), trabajando con biomasa microalgal cultivada en aguas residuales de purines con alta carga bacteriana, obtuvieron una relación proteínas/carbohidratos solubilizados de 0.77 tras hidrólisis ácida con HCl 2M (60 min, 121ºC) mientras que esta relación disminuyó a 0.66 cuando la hidrólisis ácida se realizó con HCl 0.5 M en las mismas condiciones. A este respecto, el tratamiento con ácidos diluidos suele ser más eficaz en la liberación de polisacáridos, mientras que el tratamiento con álcalis puede inducir el hinchamiento de la pared celular microbiana con la consiguiente solubilización simultánea de proteínas y carbohidratos y la eliminación de sustancias incrustantes (celulosa, hemicelulosa y lignina) presentes en la biomasa de fangos (Chishti et al., 1992). Si bien, debido a la naturaleza agresiva de los ácidos, se requiere una cuidadosa optimización de las condiciones de hidrólisis para evitar la degradación de las moléculas extraídas, especialmente las proteínas, antioxidantes y pigmentos (Khanra et al., 2018; Rojo et al., 2023). 1.3.3 Hidrólisis térmica en medio químico El tratamiento de biomasas con soluciones diluidas de ácidos inorgánicos o bases a altas temperaturas (>100ºC) puede considerarse una variante de tratamiento hidrotérmico. La velocidad de las reacciones hidrolíticas a temperaturas elevadas en agua se ven potenciadas Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 18 por la adición de un catalizador ácido o básico (Nitsos et al., 2020). Se pueden conseguir altos rendimientos de carbohidratos, lípidos y proteínas a temperaturas más bajas y tiempos de reacción más cortos (inferiores a 60 minutos). La concentración de ácido empleada suele estar entre el 1 y el 5 % y se han registrado temperaturas entre 110 °C y 150 °C. Por otro lado, una diferencia fundamental entre el tratamiento hidrotérmico ácido o básico se refiere a las condiciones operativas. La combinación de los tratamientos térmico y alcalino está especialmente adaptada para temperaturas más bajas (por debajo de 120 °C) y un tiempo de tratamiento más largo (Cho et al., 2013). Este método se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de biomasa lignocelulósica (Bolado-Rodríguez et al., 2016). Se ha informado de que el método termoquímico combinado mejora la solubilización de las proteínas en numerosas biomasas residuales (Bolado-Rodríguez et al., 2016; Cho et al., 2013; J. Gao et al., 2021; Rojo et al., 2023; Xu et al., 2014). Por ejemplo, Cho et al., (2013) informaron que las proteínas y los carbohidratos solubilizados después de la hidrólisis combinada termo-alcalina (NaOH 4N, 100ºC, 60 min) era 2.4 y 5.1 veces mayores que la de los fangos no tratados (1 g/L y 0.14 g/L de proteínas y carbohidratos) y 2.1 y 4.1 veces mayores que utilizando únicamente la hidrólisis alcalina (2.10 y 0.58 g/L) a pH 12 a 60ºC y 60 min. Liu et al. (2008) obtuvieron un 68% más de ácidos grasos volátiles (AGV) con tratamiento termo-alcalino (HT+ALK) (pH 12, 90ºC, 2h) que con los lodos sin tratar tras 252 h de fermentación. La proteína soluble (61.6%) fue la principal fuente de producción de AGV. Assawamongkholsiri et al. (2013) emplearon fangos activados (10% ST) procedentes de la planta de tratamiento de aguas residuales de la industria cervecera como sustrato para la producción de hidrógeno mediante cultivos anaerobios mixtos en un proceso de fermentación. El tratamiento combinado térmico-ácido (0.5% (p/v) HCl, 110 °C, 6 h) resultó en la DQO soluble (sCOD) más alta de 1785.6 mg/L, pero con recuperaciones de péptidos y monosacáridos reducidas, 8.1 y 38.5 mg/L, respectivamente. Martin Juárez et al. (2021) informaron de una solubilización del 98.2%, 75.5 % y 55.5 % en carbohidratos, proteínas y lípidos a partir de biomasa basada en microalgas de Scenedesmaceae crecidas en un fotobiorreactor de tratamiento de aguas residuales de purines tras un tratamiento ácido con HCl 2M a 121ºC y 60 min. Sin embargo, las solubilizaciones disminuyeron hasta un 71%, 47.3% y 28.2% empleando HCl 0.5 M en las mismas condiciones. Por otro lado, Rojo et al., (2023) trabajando con consorcio de microalgas-bacterias informaron que en la hidrólisis alcalina (NaOH, 2M, 60 min), el aumento de la temperatura mejoró la solubilización de la proteína de 36.1% a 40ºC a 54.1% a 60ºC y el rendimiento máximo (≈ 90%) a 120ºC. La hidrólisis ácida (HCl, 2M, 60 min) dio lugar a las solubilizaciones proteicas más bajas, con Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 19 valores en torno al 19% a 60ºC y a 40ºC, mientras que a 120ºC la solubilización de las proteínas se vio incrementada hasta un 75%. 1.3.4 Hidrólisis (bio) química La hidrólisis biológica (hidrólisis enzimática o microbiana) se ha considerado un método atractivo para solubilizar los lodos en comparación con los métodos químicos o físicos. Las suaves condiciones de operación de este método evitan la degradación de los componentes solubilizados incrementándose, en muchos casos, los rendimientos de recuperación y la selectividad con un bajo consumo energético. La hidrólisis se puede conseguir añadiendo enzimas (hidrólisis enzimática. EH) o induciendo la actividad enzimática inherente a los microorganismos que forman parte de la biomasa bacteriana (autohidrólisis, AH). El tratamiento enzimático puede ser aún más específico para la obtención de un metabolito de interés. Dado que, en la biomasa de fangos aerobios, aproximadamente el 37% son proteínas, resulta lógico que el empleo de proteasas sea una buena estrategia para la recuperación de este componente. Varios estudios han informado de la eficiencia del método enzimático en la obtención de productos de altos valor añadido como son las proteínas y los carbohidratos. Por ejemplo, Rojo et al. (2021) consiguieron hasta un 38.5% de carbohidratos y un 32.7% de proteínas solubilizadas a partir de biomasa algal generada en fotobiorreactores que trataba aguas residuales porcinas tras 5h de hidrólisis enzimáticas empleando la enzima comercial Protamex. Además, informaron de la presencia de polipéptidos con tamaños de hasta 135 kDa mientras que utilizando Alcalasa 2.5 L el tamaño de los péptidos fueron inferiores a 10 kDa. En este sentido, emplear Protamex sería una buena estrategia para la obtención de proteínas con propiedades tecno-funcionales. Sin embargo, una desventaja del empleo de enzimas es su elevado coste, y es necesario optimizar la combinación de enzimas y la dosis enzima:sustrato para conseguir altas recuperaciones. Figura 4. Esquema del tratamiento (bio) químico (Xiao & Zhou, 2020). Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 20 Por otro lado, la autohidrólisis es un tratamiento biológico-enzimático que consiste en someter a las biomasas con alto contenido bacteriano bajo condiciones que permitan a los microorganismos del fango liberar las enzimas hidrolíticas contenidas en su propio sistema metabólico, lo que en última instancia conduce a la solubilización de la biomasa. Las enzimas hidrolíticas de los lodos activados pueden localizarse en la fase soluble o en el flóculo de lodo. El tratamiento por autohidrólisis utiliza efectos sinérgicos producidos por la temperatura (35 o 55ºC) y el pH aplicado (4.5o 6.5), y las enzimas hidrolíticas liberadas, obteniendo así un tratamiento con un proceso de operación simple y bajo requerimiento de una fuente de energía externa. Carvajal et al. (2013) hallaron que el tratamiento por autohidrólisis a 55ºC y 12 h, en condiciones de alta concentración de sólidos (8%) y ambiente microaeróbico, aumentó en un 40% la solubilización de la materia orgánica, mejoró la productividad de metano en un 23% y se produjo una mejora general de la fluidez de los fangos. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 21 2 OBJETIVOS El objetivo global del presente Trabajo Fin de Máster es comparar diferentes métodos de hidrólisis para la valorización fraccional de fangos secundarios generadas en las plantas de tratamiento de aguas residuales. La investigación se centra en la recuperación de la fracción mayoritaria y de mayor valor de esta biomasa, la proteica, pero también evaluando la influencia de los diferentes parámetros de hidrólisis en la fracción de carbohidratos. El estudio pretende comparar la solubilización de proteínas y carbohidratos, pero también las pérdidas de los componentes liberados en cada uno de los métodos y condiciones de hidrólisis. Se determinarán, por tanto, los rendimientos finales de recuperación de proteínas en forma de péptidos, y de carbohidratos como monosacáridos, evaluando el efecto de cada hidrólisis en la composición y tamaño de los péptidos recuperados. Explícitamente, empleando como sustrato fango secundario de plantas de tratamiento de aguas residuales, se persiguen los siguientes objetivos específicos: • Determinar las solubilizaciones de proteínas y carbohidratos obtenidas mediante diferentes tipos de métodos de hidrólisis: ácido, alcalino, hidrotérmico, autohidrólisis, enzimático, termo-ácido y termo-alcalino, bajo diferentes severidades de las condiciones de operación. • Conocer las perdidas por degradación de las proteínas y carbohidratos solubilizados en cada uno de los métodos y condiciones de operación ensayados. • Comparar las recuperaciones de proteínas como péptidos y de carbohidratos como monosacáridos en cada uno de los métodos y condiciones de operación ensayados. • Establecer el posible efecto del tipo y condiciones de la hidrólisis en la composición y tamaño de los péptidos recuperados. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 22 3 MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 FANGO AEROBIO DE EDAR La biomasa de fangos crudos utilizada en este estudio se recogió tras la unidad de decantación secundaria de la EDAR urbana local de Valladolid, España, y se concentró mediante centrifugación para reducir el contenido de humedad del 99.3% al 93.3%. La fracción sólida procedente de centrifugación (RS) fue homogeneizada, obteniéndose 25.4 ± 0.2 g de cenizas, siendo su composición química (en base seca libre de ceniza) la expuesta en la Tabla 2. El RS se almacenó a 4 ± 0.5ºC para trabajar con lodo fresco en los experimentos de hidrólisis y evitar cualquier actividad biológica (Malhotra & Garg, 2020). Figura 5. Fango secundario (RS). Tabla 2. Composición (%w/w) de la biomasa seca (en base seca sin cenizas). Composición (g/100g) Proteínas 47.9 ± 2.5 Carbohidratos 20.4 ± 0.8 Glucosa 17.4± 0.6 Xilosa 2.5 ± 0.2 Celobiosa 1.7 ± 0.1 Arabinosa < 1 Lípidos 10.3 ± 1.1 Ácido húmico 9.6 ± 0.6 3.2 METODOLOGÍA DE HIDRÓLISIS APLICADA A LA BIOMASA Se compararon diferentes métodos para la solubilización de proteínas y carbohidratos y la recuperación de péptidos y monosacáridos de la biomasa de RS (Tabla 3). Las condiciones de hidrólisis se seleccionaron de acuerdo con la experiencia previa del grupo de valorización Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 23 de biomasa con biomasa algal procedente de aguas residuales (Bolado-Rodríguez et al., 2016; Lorenzo-Hernando et al., 2019; Martín-Juárez et al., 2019; Rojo et al., 2023), los trabajos previamente publicados dirigidos a mejorar la etapa de hidrólisis de fangos en la DA donde el aspecto frecuentemente evaluado es la producción de biogás (Carvajal et al., 2013; Chiu et al., 1997; H. Li et al., 2013; Tian et al., 2016; Zhen et al., 2017) y las escasas referencias sobre la solubilización de macrocomponentes a partir de biomasa de fangos aerobios (Hui et al., 2022; Hwang et al., 2008; Y. Liu et al., 2009; Yan et al., 2020). Para evaluar la contribución de cada tratamiento individual a la solubilización y recuperación de macrocomponentes en la hidrólisis de métodos combinados, se llevaron a cabo experimentos de tratamiento individual en todas las condiciones de operación. Tabla 3. Condiciones experimentales de hidrólisis. Hidrólisis Reactivo Concentración (M) Temperatura (ºC) Tiempo (min) HIDROTÉRMICO (HT) Agua - 121 30 60 ALCALINO (ALK) NaOH 0.5 50 180 1 0.5 50 60 1 HIDROTÉRMICO + ALCALINO (HT+ALK) NaOH 0.5 121 30 1 0.5 121 60 1 M ACIDO (AC) HCl 0.5 50 180 1 HIDROTÉRMICO + ÁCIDO (HT+AC) HCl 0.5 121 60 1 AUTOHIDRÓLISIS (AH) Agua pH 6.5 50 180 60 ENZIMÁTICO (EH) Protamex 0.5% 50 180 1% Para este estudio, todos los experimentos se realizaron por duplicado empleando matraces Erlenmeyer de 250 mL utilizando un volumen útil de 150 mL de suspensión de biomasa RS con una concentración al 4% (g/g en base seca) a fin de mejorar la fluidez de los fangos centrifugados (Carvajal et al., 2013; Liu et al., 2008). Para comparar los diferentes métodos de hidrólisis, la mayoría de los experimentos se realizaron a 50ºC durante 60 y 180 min, Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 24 excepto los experimentos en condiciones más severas que evalúan el efecto de la temperatura, que se realizaron a 121ºC durante 30 y 60 min. Después de cada tratamiento, el hidrolizado se centrifugó a 10,000 rpm (Thermo ScientificTM Sorvall X4Pro) durante 10 min a 4ºC para separar las fracciones líquidas y sólidas. Tanto las fracciones sólidas (FS) como las líquidas (FL) fueron pesadas tras los diferentes métodos de hidrólisis aplicado. Se analizó el contenido en sólidos totales (ST) y volátiles (SV), nitrógeno total y carbohidratos en la fracción sólida a fin de evaluar el rendimiento de solubilización de los componentes. Para evaluar los rendimientos de recuperación se analizaron los péptidos y la composición en monosacáridos sobre la FL. Además, a mayores, se analizaron la cantidad de aminoácidos libres, el perfil de aminoácidos de algunos experimentos y el tamaño de los péptidos recuperados en todos los ensayos. Todos los análisis e hidrólisis se realizaron por duplicado. Todos los reactivos y estándares utilizados en este estudio (HCl, NaOH, glucosa, xilosa, celobiosa, arabinosa, metanol, cloroformo, ácido sulfúrico, ácido húmico, ninhidrina), con una pureza superior al 95% o grado reactivo fueron adquiridos a Sigma Aldrich (España) y Panreac Applichem (España).2 3.2.1 Hidrólisis química Para la hidrólisis química, se añadieron al RS volúmenes adecuados de solución de NaOH y HCl trabajando con matraces Erlenmeyer de 250 mL con un volumen útil de 150 mL para obtener una suspensión con una concentración al 4% (g solido seco/100 g suspensión). Se seleccionó ácido clorhídrico (HCl) como reactivo ácido para evitar la degradación oxidativa de los componentes liberados en comparación con el ácido nítrico o sulfúrico mientras el hidróxido de sodio (NaOH) fue seleccionado como el reactivo básico ya que es el más utilizado para la recuperación de proteínas a partir de biomasas generadas en aguas residuales como microalgas (Rojo et al., 2023). Los ensayos con NaOH han mostrado mejores efectos de solubilización de fangos aerobios (Xiang et al., 2017; Xu et al., 2014) en comparación con otros álcalis como el Ca(OH)2 o KOH, tal y como se indicó en la sección 1.3.2. Dado que la pared microbiana de los flóculos de fangos es bastante débil (Liu & Fang, 2002; Sommers, 1977) en comparación con otras biomasas residuales como la biomasa de algas (D’Hondt et al., 2017) o la biomasa lignocelulósica (Bolado-Rodríguez et al., 2016) se consideraron dos niveles de concentración relativamente bajos (0.5 M y 1 M) para los ensayos con NaOH y HCl para mantener la integridad de los componentes liberados. Los ensayos se realizaron en un agitador rotatorio (Comecta-Ivymen, Spain) a 200 rpm y 50 ºC con un tiempo de hidrólisis de 60 y 180 min (incluyendo el tiempo de calentamiento inicial) para el ensayo Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 25 alcalino (ALK). Sin embargo, para el ensayo ácido (AC), orientado a la liberación de carbohidratos, el ensayo se realizó solamente a 180 min (Rojo et al., 2023). Figura 6. Esquema de hidrólisis química de fangos. AC: ácida, empleando HCl y ALK: alcalina, usando NaOH. 3.2.2 Hidrólisis hidrotérmica y combinado hidrotérmica-química La combinación de altas temperaturas (121ºC) como método hidrotérmico (HT) y medios ácidos (AC) o alcalinos (ALK) han proporcionado altos rendimientos de solubilización con tiempos de reacción cortos (Nitsos et al., 2020) en diversas biomasas residuales como fangos aerobios (García et al., 2017; Pham et al., 2021), microalgas (Martin Juárez et al., 2021; Martín- Juárez et al., 2019; Rojo et al., 2023) y biomasa lignocelulósica (Bolado-Rodríguez et al., 2016). Además, ha mostrado un efecto esterilizante en biomasas con alto contenido bacteriano, que puede ser de gran interés para evitar la degradación metabólica de los productos liberados (Fuentes et al., 2016; Martin Juárez et al., 2021). Las severas condiciones de este tratamiento han evitado la presencia de bacterias viables en los hidrolizados que podrían degradar los componentes solubilizados y competir con los microorganismos de fermentación en las posteriores etapas de valorización (Fuentes et al., 2016; Martin Juárez et al., 2021). Figura 7. Esquema de las Hidrólisis hidrotérmicas y combinaciones. H+ Cl- H+ Cl- H+ Cl- Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 32 Figura 11. Equipo HPLC Marca: Shimadzu, modelo: LC-2050C. Tabla 4. Degradaciones de los carbohidratos detectados. Los principales monosacáridos se cuantificaron en las FL (las obtenidas tras los experimentos de hidrólisis aplicada y las procedentes de la AC de los sólidos) utilizando una columna de exclusión iónica Aminex® HPX-87H (Bio-Rad) (300 x 7,8 mm, 9 µm de tamaño de partícula, 8% de enlace cruzado, rango de pH 1-3) instalada en un módulo de separación Shimadzu LC-2050C. Se utilizó un detector de índice de refracción (RID) para cuantificar la concentración de monosacáridos utilizando una fase móvil isocrática constituida por una solución de ácido sulfúrico 25 mM (calidad HPLC) a un flujo de 0.6 mL/min. La columna y el RID se mantuvieron a 50ºC. Se preparó una solución de calibración multiestándar por dilución de estándares individuales (glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa) disponibles comercialmente con una pureza > 95% (Sigma, Aldrich, España). Además, con el propósito de considerar cualquier descomposición que pudiera haber ocurrido durante la AC de los monosacáridos, se aplicó el tratamiento de AC utilizando H2SO4 a los estándares de glucosa, arabinosa, celobiosa y xilosa, para calcular los factores de corrección necesarios (Tabla 4). En última instancia, el cálculo del contenido de carbohidratos se efectuó sumando las cantidades de todos los monosacáridos (glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa). Monosacárido F. Degradación Glucosa 1.05 Xilosa 1.04 Arabinosa 1.04 Celobiosa 0.72 Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 33 Figura 12. Cromatogramas de los patrones de glucosa, xilosa, arabinosa y celobiosa. 3.4.3 Análisis de aminoácidos libres Los aminoácidos libres en las FL se determinaron mediante el método de reacción de la ninhidrina, empleando el hidrato de tricetohidrindeno (Sigma-Aldrich). Este reacciona solo con aquellos aminoácidos que tengan un grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y de anhídrido carbónico, por reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. Esta última reacciona a su vez con el amoniaco y con otra molécula de ninhidrina, generando un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, a excepción de la prolina, la cual muestra una coloración amarillenta debido a que el grupo amino en esta amina se encuentra sustituido. El derivado coloreado alcanza su máxima de absorción en torno a los 570 nm. Esta reacción tiene lugar en condiciones de calor y a un rango de pH comprendidos entre 4 y 8. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 34 Figura 13. Análisis de aminoácidos libres mediante el método de ninhidrina. Se procedió experimentalmente siguiendo el protocolo descrito por el fabricante Sigma- Aldrich: se tomaron 2 mL de cada muestra y se añadió 1 mL de ninhidrina bajo atmósfera inerte de nitrógeno. Dicha atmósfera, se estableció mediante la introducción de nitrógeno a través de un tubo dentro del reactivo mientras este se encontraba abierto. La mezcla contenida en el tubo se agitó, posteriormente, se incubó durante 10 minutos a 100ºC y, por último, se enfrió a temperatura ambiente. Para concluir, se incorporaron 5 mL de etanol al 95% en cada tubo y se midió la absorbancia a una longitud de onde de 570 nm. La cuantificación se realizó mediante una recta de calibrado de ácido glutámico (aminoácido mayoritario en la biomasa RS) preparada diariamente (Friedman, 2004; Trigueros et al., 2021). El porcentaje de enlaces peptídicos hidrolizados, el grado de hidrólisis (DH), se evaluó según lo propuesto por Adler-Nissen et al., (1983) descrito en detalle en Trigueros et al. (2021) de acuerdo con la Ec. 4. DH (%) = H HTOT·100 Ec. 4 donde “H” es el número de enlaces peptídicos equivalentes hidrolizados, expresado como meq glutámico/g proteína y HTOT es la cantidad total de milimoles de aminoácidos individuales por gramo en la proteína no hidrolizada que puede evaluarse a partir del perfil de aminoácidos. R4 Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 35 La determinación del perfil de aminoácidos de la biomasa inicial se llevó a cabo según los estándares analíticos internos del Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI-UVa) según el método de Moore & Stein (1948). La muestra se hidroliza con HCl 6 N. A continuación, se elimina el medio ácido utilizando una corriente de N2 hasta sequedad. Las muestras se resuspenden nuevamente en HCl 0.1 N y la solución se filtra empleando filtros de nylon de 0.22 µm. Las muestras se someten a una derivatización pre-columna con ortoftalaldehído (OPA) y cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC). La determinación se llevó a cabo utilizando un equipo de HPLC con detector UV empleando una columna Zorbax Eclipse AAA (4.6 x 150 mm, 3.5 µm). La fase móvil estaba constituida por un gradiente de NaH2PO4-H2O a pH 7.8 y (ACN-MeOH-H2O) en proporción 45:45:10. 3.4.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) El peso molecular, en kDa, de las proteínas recuperadas se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) según el método descrito por (Rojo et al., 2021). La electroforesis SDS-PAGE con Tris-Glicina se realizó utilizando una unidad de electroforesis Mini-PROTEAN (Bio-Rad, EE.UU.) y un gel Mini-PROTEAN 10-20% Tris- Glicina-SDS (Bio-Rad, EE.UU.). La separación de proteínas se llevó a cabo según las especificaciones del fabricante (BIORAD). Las muestras de las FL (20 μL) se mezclaron con 20 μL de una solución compuesta por Laemmli y 50 mM de reactivo de Cleland (DTT, ditiotreitol) y se calentaron a 100 °C durante 5 minutos. Posteriormente, se cargaron 30 μL en los geles pre-fabricados de la unidad de electroforesis llenos de running buffer 1x Tris/Glicina/SDS (25 mM de Tris, 192 mM de glicina y 0,1% de SDS, pH 8.3). Las condiciones de funcionamiento se ajustaron a una tensión constante de 200 V. La corriente eléctrica fue disminuyendo con el tiempo, pasando de 60 mA, inicialmente, a 30 mA. Se utilizó el marcador proteico PageRuler Plus Prestained (Thermo Scientific) como marcador molecular con un rango de tamaño de proteínas de 10 - 250 kDa. Figura 14. Sistema de electroforesis (SDS-PAGE) para la determinación del tamaño molecular de las proteínas recuperadas. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 36 Tras la electroforesis las bandas de proteínas se fijan con una solución fijadora (40% v/v de metanol y 10% v/v de ácido acético) durante 30 minutos. A continuación, se tintaron con una solución de tinción (0.1% en peso de Coomassie Blue R-250, 40% v/v de metanol y 10% v/v de ácido acético) durante 1 h. Para finalizar, los geles se destiñen con una solución compuesta por metanol: ácido acético: agua en proporción 40:10:50 (v/v). Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 37 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 SOLUBILIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y CARBOHIDRATOS La Figura 15 muestra los rendimientos de solubilización de proteínas y carbohidratos obtenidos tras los diferentes métodos de hidrólisis aplicados a la biomasa de fangos aerobios en referencia a la masa de proteínas y carbohidratos inicial (RS) calculados a partir de la Ec. 1. Los resultados muestras una clara tendencia en cuanto a la solubilización de los dos principales componentes de la biomasa, las proteínas y los carbohidratos, durante la hidrólisis química: los mayores rendimientos de solubilización de proteínas se obtuvieron para aquellos métodos de base alcalina siendo el máximo rendimiento de proteínas del 92.6% para la combinación termo-alcalina (HT+ALK) a 121 ºC con NaOH 1 M tras 60 min mientras que, en el caso de los carbohidratos, las condiciones más severas (HCl 1 M, 121ºC, 60 min) dieron lugar a la máxima solubilización del 94.2%. Esta tendencia ya fue reportada anteriormente por Martin Juárez et al. (2021) comparando diferentes tratamientos de hidrólisis, incluida la ALK y AC empleando biomasa algal cultivada en aguas residuales. En dicho trabajo, la ALK a 120 ºC durante 60 min proporcionó la mayor solubilización de proteínas (hasta un 90%) mientras que la AC logró la mayor solubilización de carbohidratos (hasta un 98%). Sin embargo, ellos emplearon una concentración de reactivo 2 M debido a que la biomasa algal presenta una resistente pared celular. Los reactivos básicos pueden hidrolizar de enlaces éster y enlaces de hidrógeno entre los componentes polisacáridos y no polisacáridos de la pared celular microbiana, especialmente a bajas temperaturas (Nitsos et al., 2020; Rojo et al., 2023). A baja temperatura la base puede inducir un hinchamiento de la pared celular y una mejora de los rendimientos de extracción de proteínas (Phong et al., 2018). En este sentido, incluso la ALK, como tratamiento único a 50 ºC, produjo una notable solubilización de proteínas. A baja concentración de álcali (0.5 M de NaOH) el tiempo de hidrólisis tuvo una importante influencia en la solubilización de las proteínas con incrementos del 31.6% al 53.5% cuando el tiempo de hidrólisis se vio incrementado de 60 a 180 min. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 38 Figura 15. Rendimiento de solubilización (SY, %) de proteínas y carbohidratos en referencia a la masa de proteínas y carbohidratos presentes en la biomasa inicial (RS). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar de 4 determinaciones analíticas (ensayos de hidrólisis analizada en réplica). La desviación estándar de las medias se representa mediante líneas de intervalo verticales. Por otro lado, a alta concentración de álcali (1 M), la influencia del tiempo de hidrólisis fue mucho más moderados con un incremento de apenas el 4% en la solubilización de las proteínas. Para la fracción de carbohidratos, el mayor rendimiento de solubilización (51.9%) se encontró para el ensayo con menor concentración de álcali. Hui et al. (2022) reportaron rendimientos de solubilización de proteínas y carbohidratos de 60.72% y 40% a partir de fangos activados liofilizados después de hidrólisis alcalina a pH 13 y 70 ºC, pero tras 9h de hidrólisis a partir de 20g/L. En la biomasa de fangos, las proteínas y los carbohidratos son los principales constituyentes del EPS y las condiciones alcalinas provocan disociación y repulsión entre los grupos ácidos cargados negativamente del EPS, aumentando la solubilidad de proteínas y carbohidratos (Liu & Fang, 2002). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5% 1% 30 min 60 min 60 min 180 min 30 min 60 min 180 min 60 min pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH > 12 pH > 12 pH < 2 pH < 2 60 min 180 min 180 min 121ºC 50ºC 121ºC 50ºC 121ºC 50ºC HT ALK HT + ALK AC HT+AC AH EH Hidrólisis Térmica Hidrólisis alcalina Hidrólisis termoalcalina Hidrólisis ácida Hidrólisis termoácida Hidrólisis Enzimática Solubilización de proteínas y carbohidratos (%) SY Proteinas (%) SY Carbohidratos (%) Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 39 Las altas temperaturas pueden aumentar la cantidad de sustrato accesible solubilizando biomoléculas más grandes, como las proteínas, tanto en fangos aerobios como anaerobios (Song et al., 2019). El ALK es particularmente eficaz cuando se combina con el método HT (Neyens et al., 2004). En este sentido, tanto la adición de álcali como la temperatura tuvieron una influencia notable en la solubilización de las proteínas y, en menor medida, en los carbohidratos. Esta misma tendencia ha sido reportada por otros autores a partir de biomasa algal (Martin Juárez et al., 2021; Rojo et al., 2023), fangos aerobios (Kim et al., 2003; Tan et al., 2012; Xu et al., 2014) y biomasa lignocelulósica (Bolado-Rodríguez et al., 2016). Por un lado, un incremento de la temperatura de 50 ºC a 121 ºC permitió solubilizar el mismo porcentaje (≈ 75.3% y ≈ 75.8%) de las proteínas y carbohidratos contenidos en la biomasa inicial reduciendo el tiempo de hidrólisis de 180 min a 30 min y, tras 60 min a 121 ºC se llegó a solubilizar prácticamente la totalidad de las proteínas (92.6%) y una parte importante de los carbohidratos (89%). Por otro lado, el calentamiento en ausencia de álcali (HT) condujo a una solubilización de proteínas y carbohidratos de solo el 61.6% y 52.7% (prácticamente idénticas a las obtenidas con ALK tras 180 min), tras 60 min a 121ºC, rendimientos muy inferiores a los 87.2% y 92.6% de proteínas solubilizadas con HT+ALK tras 60 minutos a la misma temperatura, pero en medio alcalino (NaOH 0.5 y 1 M). Una tendencia similar se observó en la fracción de carbohidratos, sin adición de álcali, la solubilización de carbohidratos fue solo de un 52.7% tras 60 min de hidrólisis a 121ºC, prácticamente un 1% y un 6% inferior al conseguido con ALK 0.5 y 1 M tras 180 min y 50 ºC mientras que bajo condiciones combinadas (HT+ALK) la solubilización se vio incrementada hasta un 75% en 30 min de hidrólisis y hasta un 89% en 60 min. Durante el tratamiento HT+ALK, el pH de las muestras de fangos aumentaría y la superficie bacteriana se cargaría cada vez más negativamente. Como resultado, se pueden desorber más EPS de los flóculos de fango debido a la alta repulsión electrostática (Katsiris y Kouzeli-Katsiri, 1987). Además, a valores de pH extremadamente altos (> 11), puede producirse la lisis celular al no poder mantener una presión de turgencia adecuada (Kim et al., 2003; Tan et al., 2012). Mahdy et al. (2014) informaron de un rendimiento de solubilización de carbohidratos del 43.5% (NaOH 5%, 50 ºC, 48h) y del 36% (KOH 2%, 120 ºC, 120 min) para las microalgas Scenedesmus sp y Tetraselmis suecica crecidas en medio sintético. Rojo et al. (2023), compararon tratamientos alcalinos (NaOH 2M, 60 min) de biomasa algal crecida en agua residual, observando también un aumento de la solubilización de proteínas con la temperatura de 36.1% a 40 ºC a 54.1% a 60ºC y a 90% a 120 ºC. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 40 Los escasos resultados publicados hasta la fecha sobre la combinación de temperatura y tratamiento alcalino en biomasa de fangos aerobios se han obtenido en condiciones más suaves (Hui et al., 2022; Liu et al., 2008). Por ejemplo, Cho et al., (2013) informaron que las proteínas y los carbohidratos solubilizados después de la hidrólisis combinada termo-alcalina (NaOH 4N, 100 ºC, 60 min) era 2.4 y 5.1 veces mayores que la de los fangos no tratados (1 g/L y 0.14 g/L de proteínas y carbohidratos) y 2.1 y 4.1 veces mayores que utilizando únicamente la hidrólisis alcalina (2.10 y 0.58 g/L) a pH 12 a 60 ºC y 60 min. Liu et al., (2008) obtuvieron un 68% más de AGV con tratamiento HT+ALK (pH 12, 90 ºC, 120 min) que con los lodos sin tratar tras 252 h de fermentación. La proteína soluble (61.6%) fue la principal fuente de producción de AGV. Desafortunadamente, este estudio no proporcionó datos sobre la fracción de carbohidratos. En cuanto al tratamiento ácido, las condiciones combinadas de AC y HT (HCl a 121 °C y 60 min) proporcionaron altos rendimientos de solubilización de carbohidratos (94.2% HCl 1 M y 81.4% HCl 0.5 M), pero menores rendimientos de solubilización de proteínas (≈ 71.7%). Tendencia similar, pero con menores rendimientos de solubilización se encontró en los experimentos de AC individual (HCl, 180 min a 50 °C). La adición de HCl incrementó los rendimientos de solubilización de carbohidratos en un 35% (0.5 M) y 44% (1 M) mientras que para las proteínas los incrementos en los rendimientos de solubilización fueron más moderados (entre un 12% y un 15%) en comparación a la hidrólisis térmica (HT) sin adición de ácido a pH 6.5 y 60 min. En este sentido, las condiciones de hidrólisis ácida solubilizaron preferentemente la fracción de carbohidratos en comparación con los experimentos en condiciones alcalinas. Esta tendencia también se observó en lodos anaerobios y aerobios (Assawamongkholsiri et al., 2013; J. Gao et al., 2020) y consorcios de microalgas-bacterias procedentes de aguas residuales porcinas (Martin Juárez et al., 2021; Rojo et al., 2023) bajo condiciones ácidas y alcalinas. Martin Juárez et al. (2021) reportaron relaciones de rendimientos de solubilización proteína/carbohidrato de 0.77 y 1.52 después de 60 min de AC y ALK con HCl y NaOH a 121 °C. A este respecto, el tratamiento AC diluido suele ser más eficaz en la liberación de polisacáridos debido a una asociación más débil con los flóculos de lodo en comparación con las proteínas (Wilson & Novak, 2009) mientras que el tratamiento ALK puede inducir el hinchamiento de la pared celular microbiana con la consiguiente solubilización simultánea de proteínas y carbohidratos (Rojo et al., 2023). Por otro lado, los métodos bioquímicos fueron menos eficaces que los químicos en la solubilización de los carbohidratos y las proteínas. Como puede observarse en la Figura 15, los rendimientos de solubilización de proteínas se encontraron entre un 25.4% y un 33.3% Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 41 mientras que las de carbohidratos fueron ligeramente superiores, aunque no significativamente diferentes (26.3% y 37%, respectivamente) cuando la EH se llevó a cabo con la enzima comercial Protamex en concentración creciente de 0.5% al 1% tras 180 min de incubación. Incluso incrementando el tiempo de incubación a 240 min y la dosis de enzima hasta un 4%, Gao et al. (2020) informaron de un rendimiento de solubilización del 35% de proteínas a partir de fangos aerobios espesados utilizando una proteasa alcalina (AOBOX, 6500 U/g) mientras que Rojo et al. (2023) alcanzaron un rendimiento del 19.8% y 38% de proteínas y carbohidratos de biomasa algal-bacterial tras 60 min a 50 ºC con la enzima Protamex (1:100). Los bajos rendimientos de solubilización de proteínas a partir de biomasa algal mediante hidrólisis enzimática han sido reportados previamente. Martin Juárez et al. (2021) realizaron una EH con Celluclast 1.5 L y Novozyme 188 a biomasa algal-bacteriana (Scenedesmaceae) cultivada en purín de cerdo obteniendo una solubilización proteica de alrededor del 10%, mientras que Rojo et al. (2021) realizaron una EH con Protamex a una biomasa algal con alto contenido bacteriano, logrando un ≈ 25% de solubilización de proteínas y carbohidratos tras 300 min de incubación mientras que en la biomasa algal pura (sin bacterias) la solubilización fue de hasta un 40% de proteínas y 20% de carbohidratos. Asimismo, Sedighi et al. (2019) obtuvieron bajos rendimientos de solubilización de proteínas (20%) tras tratar cultivos puros de Spirulina platensis en medio sintético con serin-proteasa. Rojo et al. (2023) estudiaron la posibilidad de utilizar una combinación enzimática de proteasa+celulasa mediante un coctel enzimático comercial de Protamex + Celluclast para obtener un rendimiento de solubilización de proteínas y carbohidratos del 32.8% y 38.4%, respectivamente, a partir de biomasa algal-bacteria. Probablemente, la adición de Celluclast en ese trabajo no incrementó la solubilización de carbohidratos puesto que la enzima proteasa ya proporcionaba una extracción de carbohidratos superior (38.9%) a la celulasa sola. La presencia de la enzima Celluclast también podría promover otro tipo de reacciones que habrían reducido la actividad de la celulasa para la hidrólisis y extracción de carbohidratos. Por otro lado, Gao et al. (2020) solo observa un ligero incremento del 35.8% al 43% en la solubilización de proteínas cuando la hidrólisis enzimática se realizó combinando dos proteasas comerciales (AOBOX), proteasa neutra (6500 U/g) y alcalina (12160 U/g), en una ratio 1:3 a 55 ºC y 240 min a partir de fangos aerobios (0.64 g VSS/g TSS) procedentes de EDAR. Estos resultados de hidrólisis con enzimas fueron bajos y resultan costosos, por lo que en este trabajo se propone usar la AH estableciendo condiciones que permitan a los microorganismos que forman parte de la biomasa liberar las enzimas hidrolíticas contenidas Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 48 tratamiento HT a 121ºC sin adición de álcali donde solo se observaron 2 bandas de 100 kDa a 30 y 60 min. En cuanto a los hidrolizados obtenidos mediante hidrólisis (bio)- química, a pesar de que el DH se mantuvo por debajo del 10%, no se observaron prácticamente bandas identificables para el tratamiento AH a 180 min. Por otro lado, los hidrolizados de EH con la proteasa, mostraron bandas de proteínas muy difusas en la parte inferior del gel, las cuales no se pudieron identificar con claridad, aunque si se pueden observar algunas bandas interesantes entre los 15kDa y 70kDa. El resto de las bandas probablemente indicaban la presencia de péptidos de baja masa en el hidrolizado, con tamaños inferiores a 15 y 10kDa. Posiblemente, de acuerdo con lo descrito por Martin Juárez et al. (2021), bacterias viables presentes en este tipo de biomasa bacteriana hidrolizaron las proteínas solubilizadas a fin de mantener la estabilidad de la colonia. Rojo et al. (2023) tras una hidrólisis enzimática con Protamex (1%, 50ºC, 180 min) de biomasa algal-bacterial, obtuvieron péptidos con tamaños moleculares de alrededor de 11 kDa, 63 kDa, 75 kDa y 135 kDa. En comparación con la HT+AC, la HT+ALK fue más ventajosa para controlar la hidrólisis de proteínas. Para obtener aminoácidos, la combinación HT+AC fue claramente más ventajosa. Por lo tanto, podría emplearse tratamiento termo-ácido si la proteína recuperada se aplica a la producción de piensos Hwang et al. (2008) o fertilizantes líquidos, pero debe emplearse HT+AC, cuando se requieran propiedades surfactantes de la proteína extraída. Finalmente, la Figura 19 muestra el perfil de aminoácidos de algunas FL seleccionadas de acuerdo con sus rendimientos de recuperación, así como el perfil de aminoácidos de la biomasa inicial (RS). Los porcentajes de aminoácidos liberados en las FL se refieren a la masa total de aminoácidos. Además, en línea discontinua y continua, se muestran los porcentajes de aminoácidos esenciales (Eaa) y no esenciales (NEaa), respectivamente. La biomasa inicial (RS) contiene los 18 de los 20 tipos de aminoácidos que pueden medirse por el método analítico propuesto por Moore & Stein (1948) siendo los más abundantes el ácido glutámico (43.2%) y el ácido aspártico (38.9%) seguidos de alanina (33.8%), leucina (26.6%), lisina (19%), tirosina y valina (≈ 17%) y finalmente la fenilalanina, serina y cisteína se encontraron en torno al 16%. La relación entre los aminoácidos esenciales y los no esenciales (Eaa/NEaa) en la biomasa bruta fue de un 74.7%. Los Eaa predominantes en los RS eran la treonina (17.9%), la arginina (23.8%), la valina (17.3%), la fenilalanina (16%), la leucina (26.6%) y la lisina (19.3%). Las concentraciones de histidina (12.7%) y Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 49 metionina (7.3%) eran ligeramente inferiores a las recomendaciones de la OMS/FAO (Becker, 2007). Sin embargo, eran similares a las de otras biomasas residuales. Por ejemplo, Rojo et al. (2021) informaron de que los principales aminoácidos de un consorcio de microalgas/bacterias basado en S. almeriensis cultivado en aguas residuales porcinas eran también ácido glutámico (13.9%), ácido aspártico (10.5%), alanina (9.7%) y leucina (8.9%) con una relación Eaa/Neaa ≈ 40%. Chen et al. (2019) informaron de resultados similares para lodos deshidratados con 13.8% de ácido glutámico, 8.8% de ácido aspártico, 8.2% de alanina y 9.5% de leucina, pero una relación Eaa/Neaa de 80%. Dependiendo de las condiciones de tratamiento aplicadas a la biomasa, los perfiles de aminoácidos en los hidrolizados cambiaron. Todos los aminoácidos, excepto el triptófano, se encontraron en la FL tras la hidrólisis. El tratamiento con mayor recuperación de péptidos, HT+ALK 1 M, dio una relación Eaa/Neaa de 86.5%, siendo los aminoácidos más abundantes el ácido aspártico y glutámico (≈11%), la alanina (10.1%) y los aminoácidos esenciales leucina (8.8%), lisina (6.6%) y valina (5.9%). Cuando HT+ALK se llevó a cabo con 0.5M de NaOH el ratio de Eaa/Neaa solo disminuyó hasta un 81.9%, principalmente relacionado con una mayor presencia de ácido aspártico y glutámico (≈ 12%). Por otra parte, a bajas temperaturas (ALK), se recuperaron principalmente los Neaa en un 59% y 56% para las dos concentraciones (0.5 M y 1 M), respectivamente, tras 180 min de hidrólisis. Nuevamente, la alta concentración de álcali incrementó las ratios de Eaa/Neaa de 68.9% al 77% siendo los aminoácidos preferentes el ácido glutámico y ácido aspártico (≈ 16%), alanina (≈ 14.1%) para la hidrólisis con NaOH 0.5 M, mientras que con 1 M se encontraron preferentemente los aminoácidos esenciales leucina (9.6%) y arginina (6%). La HT combinada con ALK no solo permite recuperar altos porcentajes de proteínas, sino que, además, las proteínas recuperadas contienen cantidades sustanciales de los Eaa, incluso, sin adición de álcali (HT) el ratio Eaa/Neaa solo fue de un 72%, que podrían jugar un papel importante en aplicaciones como bio-estimulantes o bio-fertilizantes para plantas en agricultura (Izydorczyk et al., 2021; Rojo, et al., 2023) o, incluso, como aditivo en pienso de animales (Ahn et al., 2009; Hwang et al., 2008). Finalmente, para las hidrólisis biológicas, se encontraron altos contenidos de Neaa, 68% para la AH y 64.1% para la EH. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 50 Figura 19.Perfil de aminoácidos de algunas fracciones líquidas. 4.4 RECUPERACIÓN DE MONOSACÁRIDOS La figura 20 muestra el rendimiento de recuperación de monosacáridos obtenidos tras los diferentes métodos de hidrólisis aplicado a la biomasa. Además, las barras discontinuas muestras el rendimiento de solubilización de carbohidratos que da idea de las pérdidas de carbohidratos generados durante los diferentes métodos de hidrólisis. Se observa que la mayor recuperación de carbohidratos se corresponde a su vez con la técnica en la que hubo mayor solubilización de estos. Esta técnica es la HT + AC con HCl 1 M, dando unos valores muy elevados de 88.2 de recuperación y de 94.2 ± de solubilización. Con la HT + AC pero con HCl 0.5 M también se obtuvieron valores altos, tanto de recuperación como de solubilización de carbohidratos, siendo de 78.5 y 81.4, respectivamente. Estos resultados coinciden con los de Martín-Juárez et al. (2019) con biomasa algal, que demostraron que los tratamiento ácidos proporcionan una elevada recuperación de carbohidratos en forma de monosacáridos, especialmente a temperaturas elevadas (HT+AC). El efecto positivo de combinar tratamientos químicos y térmicos también había sido previamente demostrado con biomasa algal (Martin Juárez et al. (2021), Martín-Juárez et al. (2019) y Rojo et al. (2023)). Este efecto puede deberse a que las altas temperaturas pueden aumentar la cantidad de sustrato accesible, lo cual favorece la solubilización de la materia orgánica. En contraposición a lo que ocurría con las proteínas, el medio ácido bajo condiciones más severas favoreció significativamente la recuperación de carbohidratos, mientras que las condiciones alcalinas bajo suaves condiciones fueron más favorables. Bajo condiciones de hidrólisis alcalina, se observó un mayor rendimiento de recuperación de 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 180 min 180 min 60 min 180 min 180 min 60 min 60 min % AA (BS) pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 50 ºC 50ºC 121 ºC 121ºC 50ºC 50ºC 121ºC 0.5 M 1M 0.5 M 1M AH HE HT Alcalino (ALK) HT+ALK % DE AMINOÁCIDOS RECUPRADOS EN FL PRO LYS * LEU * ILE* PHE * TRP MET * VAL * CYS TYR ALA ARG * THR * GLY HIS* Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 51 carbohidratos para el método HT+ALK 0.5 M a 30 min, con un rendimiento máximo del 50.6%. Los elevados factores de pérdidas de carbohidratos, entre un 44% y 53% en los métodos de HT+ALK a mayor concentración de NaOH (1M) pusieron en peligro los altos rendimientos de solubilización que presentaron estos métodos. Martin Juárez et al., (2021) también obtuvieron altos factores de pérdidas (en torno al 70%) para el tratamiento ALK (NaOH, 121ºC, 2M) y la combinación alcalino-peróxido a partir de biomasa algal. Rojo et al. (2023), trabajando con consorcios de microalgas-bacterias cultivadas en aguas residuales porcinas, reportaron importantes pérdidas de glucosa (83.3% y 61%) tras hidrólisis ALK y HT+ALK (NaOH, 2 M, 120 y 60ºC). En un medio alcalino, los grupos funcionales de los carbohidratos, como los grupos hidroxilo, pueden ser más susceptibles a reacciones químicas y a la degradación, lo que puede resultar en una mayor pérdida de carbohidratos (Tan et al., 2012). Por otra parte, las recuperaciones de carbohidratos más bajas, con valores inferiores al 15%, se obtuvieron para las hidrólisis biológicas, tanto las AH como las EH, y para la HT a 30 minutos, esto puede deberse a que la enzima que se utiliza es Protamex y, por tanto, no resulta adecuada para extraer carbohidratos. También cabe destacar, que todos los valores de recuperación de carbohidratos son inferiores a los valores de solubilización de estos. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 52 Figura 20. Rendimientos de recuperación (RY %) y solubilización (SY %) de carbohidratos en referencia a la masa de carbohidratos totales en la biomasa inicial. La diferencia entre SY y RY proporciona las pérdidas de carbohidratos debido a la etapa de hidrólisis. Los resultados se expresan como la media ± la desviación estándar de 4 determinaciones analíticas (etapa de hidrólisis analizada en réplica). Las líneas de intervalo vertical representan la desviación estándar de las medias. Se obtuvieron rendimientos de recuperación de monosacáridos especialmente bajos a partir de HT (27.7%), ALK (25.7%), EH (11.5 %) y AH (23.2%) como resultado de la baja solubilización y las elevadas pérdidas de carbohidratos atribuibles al metabolismo activo de las bacterias presentes en la biomasa cruda (Fuentes et al., 2016; Liu et al., 2008). Para un consorcio de microalgas-bacterias formadas por Alphanothece sp y Scenedesmus obliquus con elevado contenido bacteriano crecidas en un fotobiorreactor alimentada con aguas residuales, Martín Juárez et al. (2016) reportaron un alto rendimiento de solubilización de carbohidratos bajo EH (81.7%) con una recuperación de monosacáridos tan baja como el 1%. Además, se reportaron cantidades importantes de subproductos como ácido acético, ácido fórmico, metanol, ácido succínico, y ácido butírico en los hidrolizados formadas 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5 M1 M 0.5% 1% 30 min 60 min 60 min 180 min 30 min 60 min 180 min 60 min pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH 6.5 pH > 12 pH > 12 pH < 2 pH < 2 60 min 180 min 180 min 121ºC 50ºC 121ºC 50ºC 121ºC 50ºC HT ALK HT + ALK AC HT+AC AH EH Hidrólisis Térmica Hidrólisis alcalina Hidrólisis termoalcalina Hidrólisis ácida Hidrólisis termoácida Hidrólisis Enzimática Perdidas solubilizadas Recuperación de monosacáridos (%) RY Monosacáridos (%) SY Carbohidratos (%) Perdidas (%) solubilizadas Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 53 probablemente debido a la acción oxidativa y fermentativa sobre los monosacáridos como la glucosa y la xilosa, a través de las diferentes rutas metabólicas de las bacterias presentes en este tipo de biomasa. A pesar de las elevadas pérdidas de carbohidratos obtenidas bajo las condiciones experimentales propuesta en este trabajo, los hidrolizados aún pueden tener potenciales aplicaciones como medio de cultivo rico en compuesto carbonoso (ácidos orgánicos, alcoholes, entre otros) útiles para producir compuestos valiosos por fermentación bacteriana. Estudios del grupo de investigación en el que se ha realizado este trabajo han demostrado recientemente la utilidad de los hidrolizados de microalgas-bacterias como sustrato para el crecimiento de Paraccocus denitrificans. Esta bacteria, en medios con déficit de nitrógeno, acumula polihidroxialcanoatos, compuestos base para la producción de bioplásticos. Aunque no se pudieron cuantificar estos subproductos de degradación de los carbohidratos recuperados si se pudieron identificar ciertos picos en los cromatogramas, utilizando un detector UV-Vis a 210 nm, que pueden dar una idea de algunos compuestos de degradación que no estaban presentes inicialmente en la biomasa RS (Figura 21 A). Algunos de los componentes de degradación que se detectora son el ácido láctico (13.4 min), ácido fórmico (14.7 min), ácido acético (15.9), ácido butírico (23 min), ácido levulínico (18.6 min) y metanol (19.4 min). Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 54 Figura 21. Compuesto de degradación detectados: A) Biomasa inicial, B) EH; C) AH, D) HT+ALK. A B C D Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 55 5 CONCLUSIONES Los resultados mostraron que mientras el máximo rendimiento de proteínas (92.6%) se obtuvo para el tratamiento HT+ALK (NaOH 1M, 121ºC, 60 min), la máxima solubilización de carbohidratos (94.2%) se consiguió con el tratamiento AC (HCl 1M 121ºC, 60 min). Por otro lado, tanto para el rendimiento de proteínas como para la solubilización de carbohidratos, se concluye que el proceso combinado HT+ALK da mejores resultados que utilizando las técnicas simples ALK o HT. Dentro de los métodos bioquímicos los resultados para el rendimiento de proteínas y la solubilización de carbohidratos fueron muy bajos, aunque el AH fue ligeramente mejor que el EH. En la solubilidad de nitrógeno mediante NKT se percibieron pérdidas bajas, inferiores al 10%, excepto para la AC (28%). Las pérdidas por degradación de proteínas dependen del tipo de hidrólisis realizado. Para el HT+ALK se obtuvieron pérdidas del 11%. Además, se demostró que la concentración de álcali no influye en las pérdidas ni en el tratamiento combinado ni en el ALK simple. Asimismo, las pérdidas de proteínas en la HT+AC y la AC tampoco dependen de la concentración de ácido utilizado durante la hidrólisis. Siendo las pérdidas de proteínas mayores en la HT+AC (121ºC, 60 min) que en la AC (50ºC, 180 min). Mientras que para las hidrólisis biológicas las pérdidas de proteínas fueron prácticamente despreciables (2%). Cabe destacar, que en la EH se observa un aumento en la recuperación de proteínas al aumentar el porcentaje de enzimas, manteniéndose el nivel de pérdidas. En comparación, la recuperación de proteínas es mayor en la AH que en la EH. Se detectaron aminoácidos libres en las FL a través del análisis de ninhidrina en todos los tipos de hidrólisis utilizados. Con respecto al tamaño de los péptidos, se observó que la AC no presentó ninguna banda en el gel de electroforesis, es decir, que con esta técnica se obtuvieron proteínas con un peso molecular < 10 kDa o aminoácidos libres. En la HT+ALK se comprobó que la concentración de álcali y el tiempo de hidrólisis no influyen en el tamaño de los péptidos recuperados, los cuales son de tamaño medio y alto (DH 20%). Mientras que, para la ALK, el DH si aumenta con respecto al tiempo de hidrólisis, aumentando así el fraccionamiento de los péptidos. Dentro de las hidrólisis biológicas, la AH no muestra bandas de interés, mientras que la EH, aunque presenta bandas difusas, también presenta bandas interesantes con un tamaño de 15 a 70 kDa y <10 kDa. Cabe destacar que, la HT+ALK es mejor que la HT+AC para controlar la hidrólisis de proteínas en la fase de polipéptidos, por lo que se puede utilizar para generar agentes Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 56 espumantes. Sin embargo, la HT+AC es mejor que la HT+ALK para la obtención de aminoácidos libres, por lo que se puede utilizar para producir piensos o fertilizantes líquidos. Por otro lado, los perfiles de aminoácidos también cambiaron según el hidrolizado empleado. Además, todos los aminoácidos se encontraron en la FL, excepto el triptófano. Tanto para la HT+ALK como para la ALK se observó un aumento en la relación Eaa/Neaa al aumentar la concentración de NaOH. Además, para la HT+ALK se observó un aumento en la recuperación de péptidos con cantidades sustanciales de Eaa. Para las hidrólisis biológicas, se observó un alto contenido de Neaa y una baja recuperación de carbohidratos (<15%). Por último, la mayor recuperación de carbohidratos coincidió con la mayor solubilización de los mismos, obtenidos para el método HT+AC. Con todo ello, se puede concluir que los distintos métodos de hidrólisis contemplados en este trabajo, unos son buenos para la obtención de péptidos y otros son mejores para la recuperación de carbohidratos y aminoácidos libres, y dependiendo del uso que se le quiera dar a la biomasa tratada, será mejor utilizar una técnica u otra. Máster en Técnicas Avanzadas en Química. Análisis y Control de Calidad Químicos 57 6 BIBLIOGRAFÍA Adler-Nissen, J., Eriksen, S., & Olsen, H. S. (1983). Improvement of the functionality of vegetable proteins by controlled enzymatic hydrolysis. Qualitas Plantarum Plant Foods for Human Nutrition, 32(3–4), 411–423. https://doi.org/10.1007/BF01091198/METRICS Ahn, J. H., Shin, S. G., & Hwang, S. (2009). Effect of microwave irradiation on the disintegration and acidogenesis of municipal secondary sludge. 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