Evaluación de métodos para la imputación de valores no detectados en datos de expresión de citoquinas
Abstract
Grado en Estadística
Full text
TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Estadística Evaluación de métodos para la imputación de valores no detectados en datos de expresión de citoquinas Autor: Eduardo Herrero Velasco Tutora: Itziar Fernández Martínez
2 ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... 3 ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................ 4 ACRÓNIMOS EMPLEADOS EN LA MEMORIA .............................................. 6 RESUMEN ....................................................................................................... 7 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 8 1.1 El problema biológico ............................................................................... 8 1.1.1 ¿Qué es una citoquina? ...................................................................... 8 1.1.2 Las citoquinas en lágrima como biomarcadores ................................ 9 1.1.3 ¿Cómo se miden las citoquinas? ........................................................ 9 1.1.4 ¿Por qué se producen mediciones fuera de rango? ......................... 10 1.1.5 Implicaciones de tener este tipo de medidas fuera de rango ........... 10 1.2 Métodos de imputación de valores no detectados ................................. 11 1.2.1 Método de sustitución ....................................................................... 11 1.2.2 Método ROS (Regresion on Order Statistics) ................................... 12 1.2.3 Método de Kaplan-Meier .................................................................. 13 2. OBJETIVOS ................................................................................................ 15 3. RESULTADOS ............................................................................................. 16 3.1 Estudio de simulación ............................................................................ 16 3.1.1 Medidas de evaluación del estudio de simulación ............................ 16 3.1.2 Los dos grupos igualmente expresados ........................................... 18 3.1.3 Doble expresión en uno de los grupos ............................................. 20 3.1.4 Cuatro veces más de expresión en uno de los grupos ..................... 23 3.1.5 Ocho veces más de expresión en uno de los grupos ...................... 26 3.2 Estudio con datos reales de citoquinas en lágrima ............................... 29 3.2.1 Citoquinas evaluadas ...................................................................... 29 3.2.2 Transformación de los niveles de concentración de citoquina ........ 31 3.2.3 Métodos estadísticos para evaluar el cambio de expresión entre grupos de enfermedad ................................................................................... 31 3.2.4 Resultados ...................................................................................... 32 4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 45 REFERENCIAS ............................................................................................... 47
3 ÍNDICE DE FIGURAS Figura1:ECMparalosdatossimuladoscondosgruposigualmenteexpresadosy tamañomuestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuosporgrupoy(C)100 individuosporgrupo. ........................................................................................... 20 Figura2:ECMparalosdatossimuladoscondobleexpresiónenunodelosgruposy tamañomuestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuosporgrupoy(C)100 individuosporgrupo. ........................................................................................... 22 Figura3:ECMparalosdatossimuladosconcuatrovecesmásdeexpresiónenunode losgruposytamañomuestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuospor grupoy(C)100individuosporgrupo .................................................................... 25 Figura4:ECMparalosdatossimuladosconochovecesmásdeexpresiónenunodelos gruposytamañomuestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuosporgrupoy (C)100individuosporgrupo ................................................................................ 28 Figura5:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaEGF ......................................................................................................................... 36 Figura6:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquina IL1RA ................................................................................................................ 37 Figura7:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIL6. ......................................................................................................................... 38 Figura8:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIL8. ......................................................................................................................... 39 Figura9:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIP10 ......................................................................................................................... 40 Figura10:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquina MMP9 ............................................................................................................... 41 Figura11:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquina RANTES ............................................................................................................. 42 Figura12:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquina VEGF ................................................................................................................. 43
4 ÍNDICE DE TABLAS Tabla1:TablaresumendelosdiferentesmétodosdeimputacióndevaloresNDquese comparanenestetrabajo ................................................................................... 14 Tabla2:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladoscondosgruposigualmente expresados ........................................................................................................ 19 Tabla3:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladoscondobleexpresiónenunode losgrupos .......................................................................................................... 21 Tabla4:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladosconcuatrovecesmásde expresiónenunodelosgrupos ........................................................................... 24 Tabla5:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladosconochovecesmásde expresiónenunodelosgrupos ............................................................................ 27 Tabla6:Expresióndiferencialdelasdiferentescitoquinasanalizadasparala enfermedaddeojosecosegúnlosresultadosobtenidosenelmeta‐ánalisis(Rodaetal, 2020) ................................................................................................................ 30 Tabla7:TasadevaloresNDparacadacitoquina,deformatotalyporgrupos ......... 33 Tabla8:Descriptivosdelas9citoquinasseleccionadas,diferenciandogrupoymétodo ......................................................................................................................... 34 Tabla9:P‐valoresajustadosporcomparacionesmúltiplesdeloscontrastesglobalesdel ANOVAporcitoquinaymétodo ........................................................................... 35 Tabla10:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaEGF .................................................................................................... 36 Tabla11:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaIL1RA .................................................................................................. 37 Tabla12:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaIL6 ...................................................................................................... 38 Tabla13:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaIL8 ...................................................................................................... 39 Tabla14:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaIP10 .................................................................................................... 40
5 Tabla15:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaMMP9 ................................................................................................ 41 Tabla16:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaRANTES ............................................................................................... 42 Tabla17:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparala citoquinaVEGF .................................................................................................. 43
6 ACRÓNIMOS EMPLEADOS EN LA MEMORIA ANOVA, Análisis de la varianza. ECM, Error cuadrático medio. EGF, Epidermal growth factor FDR, False Discovery Rate FWER, Family-Wise Error Rate IC, Intervalo de confianza. IFNg, Interferon gamma. IL1b, Interleukin 1 beta. IL1RA, Interleukin 1 receptor antagonist. IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL9, IL10, IL13, IL17: Interleukin (nº). IL12p70, Interleukin 12 (p70). IP10, Interferon gamma induced protein 10. KM, Kaplan-Meier. LLOD, Lower limit of detection. LOD, Limit of detection. Log2, Transformación logaritmo en base 2. MMP9, Matrix metallopeptidase 9 ND, No detectados. RANTES, Regulated on activation normal T cell expressed and secreted. RECM, Raíz del error cuadrático medio. ROS, Regression on Order Statistics. SDL, Sustitución por el límite de detección. SDL2, Sustitución por el límite de detección/2. S0, Sustitución por el valor 0. TNFa, Tumour necrosis factor alpha. VEGF, Vascular endothelial growth factor.
7 RESUMEN El análisis estadístico de datos inmunológicos puede resultar complicado dado que en ocasiones no se pueden determinar niveles cuantitativos precisos. En su lugar, es habitual tener que trabajar con valores que están por debajo de un límite de detección (valores no detectados). El objetivo de este trabajo es evaluar diferentes métodos para imputar valores no detectados en diferentes situaciones que aparecen frecuentemente en este contexto y cuya aplicación es importante para obtener resultados apropiados. Se comparan cinco métodos: sustitución por un valor sencillo considerando 0, el límite de detección, y la mitad del límite de detección, extrapolación por el método ROS (Regresion on Order Statistics) y Kaplan-Meier. Para ello, se llevan a cabo, en primer lugar, un estudio de simulación que nos permite evaluar el comportamiento de los cinco métodos en diferentes escenarios. Posteriormente se analizan datos reales de expresión de citoquinas proporcionados por el Instituto de Oftalmología Aplicada (IOBA) de la Universidad de Valladolid (UVa). Con los resultados obtenidos en la simulación y en el análisis de datos reales, se puede concluir que, (i) los métodos de sustitución no son una buena elección, (ii) que el método de Kaplan-Meier funciona bien en el caso de que no exista expresión diferencial, y, (iii) que el método ROS es el que, en general, presenta los resultados más satisfactorios en diferentes escenarios, siendo una buena opción cuando el porcentaje de valores no detectados es menor que el 50%. ABSTRACT The statistical analysis of immunological can be difficult because determining precise quantitative levels is occasionally not possible. In practice, however, it is usual to see observations whose values are under a detection limit (nondetects values). The purpose of this work is to evaluate different methods to impute nondetected values in different situations that appear frequently in this context and whose use is relevant to obtain proper conclusions. Five methods are compared: single value substitution with 0, detection limit and half detection limit, extrapolation by ROS (Regression on Order Statistics) method and Kaplan-Meier. For that, first a simulation study is carried out to assess the five methods behaviors in different scenarios. Then, actual cytokines expression data provided by the Instituto de Oftalmología Aplicada (IOBA) from the Universidad de Valladolid (UVa) are analyzed. Finally, the outcome of these two analyzes allows us to conclude that (i) substitution methods are not a good option, (ii) the Kaplan-Meier method works well when there is no differential expression and (iii) the ROS method presents the most satisfactory results in different scenarios, being a good option when the non-detected value ratio is below 50%.
8 1. INTRODUCCIÓN En esta sección se introduce, en primer lugar, el problema biológico que ha motivado este trabajo, y en segundo lugar, se hace una breve descripción de los métodos de imputación que serán comparados. 1.1 El problema biológico 1.1.1 ¿Qué es una citoquina? Las citoquinas son proteínas de bajo peso molecular que tienen una gran importancia para controlar la actividad y el crecimiento de numerosas células del sistema inmunitario. Se encargan de la comunicación intercelular, es decir que cuando se liberan envían información de una célula a otra para que esta cumpla una determinada función. Son de gran interés, puesto que van a estar implicadas en numerosos procesos biológicos, además de tener un papel fundamental en la respuesta inflamatoria e inmune. En condiciones normales, las citoquinas no se producen en cantidades importantes, siendo necesaria la activación de las células para que se produzcan en cantidades suficientes para ejercer sus efectos biológicos. Básicamente, existen dos tipos de citoquinas: (i) proinflamatorias, encargadas de activar el sistema inmunológico y (ii)antiinflamatorias, que se encargan de comunicar a nuestro organismo que se ha eliminado una amenaza y hay que volver a la normalidad. Es importante que exista un equilibrio entre los dos tipos de citoquinas para que el sistema inmune funcione correctamente. Algunas citoquinas proinflamatorias son: IL-1, IL-6 o TNF, mientras que IL-4, IL-10 o TGF son ejemplos de citoquinas antiinflamatorias. A raíz de la COVID-19, se ha puesto de moda el término “tormenta de citoquinas”, que consiste en una respuesta inflamatoria ante una infección que se descontrola, en la que las citoquinas antiinflamatorias no son capaces de contrarrestar la cantidad de citoquinas proinflamatorias, pudiendo dañar órganos de nuestro cuerpo como el pulmón, hígado e incluso el corazón. En este caso es más peligrosa la respuesta inmune de nuestro organismo contra una infección que la propia amenaza. Las citoquinas son producidas por muchos tipos de células y sus niveles de expresión pueden medirse en diferentes tejidos, entre ellos la lágrima.
9 1.1.2 Las citoquinas en lágrima como biomarcadores Los biomarcadores son características biológicas, fisiológicas o bioquímicas medibles, capaces de identificar procesos biológicos, patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Un buen biomarcador debe tener una alta capacidad de predicción, debe ser sensible y específico, no invasivo, fácil, económico y rápido de medir, además de aportar información relevante para la toma de decisiones. Se ha demostrado que la lágrima es una fuente importante de material biológico, ya que contienen moléculas que incluyen proteínas, electrolitos y lípidos entre otros (Tamhane et al, 2019). Por otra parte, los métodos utilizados para obtener lágrima son mínimamente invasivos, fáciles y económicos. Además, la proximidad de la lágrima a la superficie ocular, hace que sea muy útil como fuente de biomarcadores de enfermedades oculares cuyos síntomas se manifiestan en esta parte del ojo, como por ejemplo la enfermedad de ojo seco, el síndrome de Sjögren, alergias oculares o la enfermedad de injerto contra huésped ocular, entre otras (Enriquede-Salamanca & Calonge, 2008). También se han utilizado en patologías extraoculares con afectación ocular, como la artritis reumatoide (Quingnon & Alfonso, 2009). 1.1.3 ¿Cómo se miden las citoquinas? La expresión y actividad de las citoquinas se puede medir de forma cuantitativa a partir de muestras biológicas muy variadas: plasma, suero, lágrima, sobrenadantes de cultivo celular, etc. Existen diferentes técnicas para cuantificar los niveles de citoquinas. Entre ellas, destacan los inmuno-ensayos, basados en el principio de que un determinado anticuerpo se unirá específicamente a las moléculas de interés. El más popular y de uso más frecuente en los laboratorios es el ensayo inmuno-enzimático ELISA, que permite cuantificar la concentración de una citoquina. Es un método muy fiable, aunque lento, necesita de muestras biológicas grandes y no es posible cuantificar distintas citoquinas simultáneamente. Una alternativa rápida y eficiente, cada vez más extendida, son los inmuno-ensayos multiplex, que, mediante técnicas basadas en citometría de flujo, permiten hacer una cuantificación masiva de citoquinas.
16 3. RESULTADOS 3.1 Estudio de simulación El propósito de este estudio de simulación es evaluar el efecto de los métodos de imputación evaluados a la hora de detectar la diferencia de expresión entre dos grupos. En adelante, se identificará a las distintas aproximaciones utilizando la siguiente notación: sustitución por 0 (S0), sustitución por LOD/2 (SDL2), sustitución por el LOD (SDL), método ROS (ROS) y método de Kaplan Meier (KM). Para llevar a cabo la simulación, se generan conjuntos de datos con tamaños muestrales por grupo de 20, 50 y 100 individuos. Para cada tamaño muestral, se consideran cuatro escenarios atendiendo al porcentaje de no detección, concretamente se consideran el 10%, 30%, 50% y 70% de valores ND. Además, en términos de expresión diferencial se consideran cuatro situaciones: los dos grupos igualmente expresados, la expresión en uno de los grupos es 2, 4 y 8 veces mayor que en el otro. Para cada escenario se generan 1000 conjuntos de datos. Se generan los datos a partir de una distribución normal, con una media en el grupo de referencia de 8 y desviación típica común a los dos grupos de 1, similar a lo observado en datos reales (en escala logarítmica). 3.1.1 Medidas de evaluación del estudio de simulación Se denota por 𝐵 el número de réplicas llevadas a cabo para cada uno de los escenarios de simulación propuestos. Como medidas de evaluación se consideran las siguientes. 1. Sesgo en la estimación de la diferencia de medias. Sea 𝛿 la diferencia de medias entre los dos grupos y 𝛿 la diferencia de medias estimada en la réplica 𝑏, 𝑏1,…,𝐵, la estimación de Monte-Carlo para el sesgo está definida como:
17 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜1 𝐵𝛿𝛿 2. Probabilidad de cobertura del intervalo de confianza del 95% para la diferencia de medias. Asumiendo varianzas iguales, el intervalo de confianza de 1𝛼100% para la diferencia de medias puede construirse como: 𝛿∈𝛿𝑡; 𝑆2 𝑛 donde 𝑛 es el tamaño de cada grupo, 𝑡; es el percentil 1 de una t-Student con 2𝑛1 grados de libertad y 𝑆𝑛1𝑆𝑛1𝑆 2𝑛1 𝑆𝑆 2 es una estimación de la desviación típica común a ambos grupos obtenida a partir de las varianzas de las dos muestras, 𝑆 y 𝑆. Se define el estimador de Monte-Carlo de la probabilidad de cobertura de este intervalo como: 𝑝1 𝐵𝐼𝛿𝑡; 𝑆2 𝑛𝛿𝛿 𝑡; 𝑡; 𝑆2 𝑛 donde 𝐼 representa la función indicador con valor 1 si su argumento es verdadero y 0 en caso contrario.
18 3. Potencia estadística. En cada réplica se considera el contraste t-Student para dos muestras independientes basado en el estadístico test, 𝑇𝑋𝑋 𝑆2 𝑛 ⎯ ⎯ 𝑡 donde 𝐻:𝜇𝜇. El estimador de Monte-Carlo de la potencia estadística de este contraste para detectar una diferencia significativa se calcula como: 𝛽1 𝐵𝐼|𝑡|𝑡; donde 𝑡 representa el valor del estadístico test en la réplica 𝑏. Sólo se estima en aquellos escenarios en donde existe expresión diferencial. En todos los casos, se calcula el error del estimador de Monte-Carlo como la desviación estándar del estimador de Monte-Carlo correspondiente. Además, como medida global se calcula el error cuadrático medio (ECM) definido como: 𝐸𝐶𝑀𝑉𝑎𝑟1 𝐵𝛿 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 3.1.2 Los dos grupos igualmente expresados En la tabla siguiente (Tabla 2) se muestran los resultados obtenidos en los diferentes escenarios de simulación cuando no hay expresión diferencial entre los dos grupos. Además de los resultados con cada uno de los métodos de imputación, se muestran los resultados con los datos completos, es decir con un porcentaje del 0% de valores ND para que sirva de referencia. Además, se representa gráficamente el ECM de cada simulación.
19 n % de ND Medida S0 SDL2 SDL ROS K‐M Completos 20 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜0.0213±0.8156 0.0145±0.5199 0.0078±0.2851 ‐0.0191±0.2969 ‐0.0082±0.2886 0.0103±0.3101 𝑝 0.946±0.2261 0.95±0.2181 0.955±0.2074 0.958±0.2007 0.948±0.2221 0.954±0.2096 𝐸𝐶𝑀0.6656 0.2705 0.0813 0.0885 0.0834 0.0962 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜‐0.0349±1.2843 ‐0.0194±0.7344 ‐0.0039±0.2404 ‐0.1655±0.2744 0.005±0.2486 ‐0.0128±0.3174 𝑝 0.93±0.2553 0.94±0.2376 0.949±0.2201 0.915±0.279 0.929±0.257 0.947±0.2241 𝐸𝐶𝑀1.6507 0.5397 0.0578 0.1027 0.0618 0.1009 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜‐0.0687±1.4059 ‐0.0381±0.7731 ‐0.0075±0.1856 ‐0.3478±0.2436 0.0086±0.2062 ‐0.0097±0.3139 𝑝 0.958±0.2007 0.954±0.2096 0.951±0.216 0.747±0.4349 0.911±0.2849 0.956±0.2052 𝐸𝐶𝑀1.9813 0.5992 0.0345 0.1803 0.0426 0.0986 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜0.0453±1.333 0.0251±0.7159 0.0049±0.1266 ‐0.53±0.2476 ‐0.0083±0.1901 0.0071±0.3104 𝑝 0.916±0.2775 0.925±0.2635 0.962±0.1913 0.338±0.4733 0.7898±0.4077 0.958±0.2007 𝐸𝐶𝑀1.7791 0.5132 0.016 0.3422 0.0362 0.0964 50 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 0.0136±0.5254 0.953±0.2117 0.2762 0.0105±0.3306 0.955±0.2074 0.1094 0.0073±0.1759 0.958±0.2007 0.031 ‐0.03±0.1826 0.958±0.2007 0.0342 ‐0.0084±0.1771 0.955±0.2074 0.0314 0.0081±0.194 0.953±0.2117 0.0377 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 ‐0.0297±0.7761 0.951±0.216 0.6032 ‐0.0151±0.4423 0.956±0.2052 0.1959 ‐6e‐04±0.1461 0.96±0.1961 0.0213 ‐0.1779±0.1659 0.843±0.364 0.0592 ‐5e‐04±0.1478 0.95±0.2181 0.0219 ‐0.004±0.1967 0.958±0.2007 0.0387 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 ‐0.0113±0.8674 0.948±0.2221 0.7525 ‐0.0078±0.4762 0.949±0.2201 0.2268 ‐0.0044±0.112 0.955±0.2074 0.0126 ‐0.3612±0.1537 0.414±0.4928 0.1541 0.0061±0.1169 0.941±0.2357 0.0137 ‐0.0055±0.1935 0.956±0.2052 0.0375 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 0.0224±0.8523 0.944±0.23 0.7269 0.0112±0.4587 0.948±0.2221 0.2105 0±0.0836 0.941±0.2357 0.007 ‐0.5588±0.1747 0.023±0.15 0.3428 ‐7e‐04±0.099 0.897±0.3041 0.0098 0.0089±0.2015 0.946±0.2261 0.0407 100 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 0.0117±0.3706 0.942±0.2339 0.1375 0.0096±0.2376 0.948±0.2221 0.0565 0.0075±0.1314 0.949±0.2201 0.0173 ‐0.0342±0.1355 0.941±0.2357 0.0195 ‐0.0077±0.1317 0.947±0.2241 0.0174 0.0086±0.1443 0.948±0.2221 0.0209 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 0.0312±0.534 0.965±0.1839 0.2861 0.0204±0.304 0.965±0.1839 0.0928 0.0096±0.1006 0.962±0.1913 0.0102 ‐0.1709±0.1148 0.745±0.4361 0.0424 ‐0.0095±0.1009 0.963±0.1889 0.0103 0.0128±0.1317 0.962±0.1913 0.0175 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 0.0189±0.6105 0.95±0.2181 0.3731 0.0105±0.3364 0.949±0.2201 0.1133 0.0021±0.081 0.951±0.216 0.0066 ‐0.3565±0.1094 0.121±0.3263 0.1391 ‐0.002±0.0829 0.946±0.2261 0.0069 0.0056±0.1377 0.951±0.216 0.019 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝐸𝐶𝑀 0.0117±0.6036 0.947±0.2241 0.3644 0.0065±0.3238 0.945±0.2281 0.1049 0.0012±0.0564 0.965±0.1839 0.0032 ‐0.5722±0.1354 0±0 0.3458 ‐0.0018±0.0643 0.925±0.2635 0.0041 0.0026±0.1436 0.943±0.232 0.0206 Tabla2:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladoscondosgruposigualmenteexpresados. Fijándonos en el ECM representado en la Figura 1, se observa que el peor método para cualquier tamaño y porcentaje de ND es el de sustitución por el valor 0, con ECM muy grandes. El método ROS tiende a infra-estimar la diferencia de medias cuando aumenta el porcentaje de ND, viéndose muy afectada la probabilidad de cobertura, que sufre un acelerado descenso a medida que aumenta este porcentaje. Esto se traduciría en un mayor número de falsos positivos en el contraste de comparación de medias, especialmente con un porcentaje de ND superior a 50.
20 Los dos mejores métodos en este escenario con dos grupos igualmente expresados son Kaplan-Meier y el método de sustitución por el LOD, con resultados muy similares. (A) (B) (C) Figura1:ECMparalosdatossimuladoscondosgruposigualmenteexpresadosytamaño muestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuosporgrupoy(C)100individuospor grupo. 3.1.3 Doble expresión en uno de los grupos Se simula la situación en la que uno de los grupos tiene el doble de expresión que el otro.
21 n % de ND Medida S0 SDL2 SDL ROS K‐M Completos 20 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜0.9776±0.6516 0.4501±0.451 ‐0.0774±0.3067 ‐0.0381±0.3261 ‐1.9231±0.3092 0.0057±0.3209 𝑝 0.877±0.3286 0.917±0.276 0.923±0.2667 0.926±0.2619 0.917±0.276 0.942±0.2339 𝛽 0.656±0.4753 0.79±0.4075 0.87±0.3365 0.855±0.3523 0.871±0.3354 0.874±0.332 𝐸𝐶𝑀1.3803 0.406 0.1001 0.1078 3.7939 0.103 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜2.2982±1.1576 1.0026±0.6689 ‐0.293±0.2486 ‐0.2512±0.3253 ‐1.6967±0.2606 ‐0.002±0.3119 𝑝 0.552±0.4975 0.701±0.458 0.778±0.4158 0.859±0.3482 0.734±0.4421 0.953±0.2117 𝛽 0.73±0.4442 0.767±0.423 0.83±0.3758 0.641±0.4799 0.824±0.381 0.87±0.3365 𝐸𝐶𝑀6.6219 1.4527 0.1476 0.1689 2.9468 0.0973 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜2.8111±1.404 1.1569±0.7711 ‐0.4973±0.192 ‐0.5682±0.3119 ‐1.4535±0.2248 0.0053±0.3183 𝑝 0.449±0.4976 0.674±0.469 0.294±0.4558 0.579±0.494 0.2345±0.4239 0.946±0.2261 𝛽 0.761±0.4267 0.78±0.4145 0.746±0.4355 0.218±0.4131 0.6563±0.4752 0.872±0.3343 𝐸𝐶𝑀9.8737 1.933 0.2842 0.4201 2.1631 0.1013 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜2.3501±1.2175 0.8208±0.6519 ‐0.7086±0.1266 ‐1.0557±0.2308 ‐1.4516±1.7183 0.0107±0.3087 𝑝 0.523±0.4997 0.822±0.3827 0.011±0.1044 0.11±0.313 0.0094±0.0963 0.958±0.2007 𝛽 0.752±0.4321 0.739±0.4394 0.588±0.4924 0.006±0.0773 0.4468±0.4975 0.879±0.3263 𝐸𝐶𝑀7.0054 1.0987 0.5182 1.1677 5.0598 0.0954 50 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 0.9495±0.4151 0.549±0.4978 0.971±0.1679 1.0739 0.4301±0.2868 0.759±0.4279 0.992±0.0891 0.2672 ‐0.0894±0.1969 0.897±0.3041 0.997±0.0547 0.0468 ‐0.0653±0.2102 0.915±0.279 0.995±0.0706 0.0484 ‐1.9121±0.198 0.895±0.3067 0.997±0.0547 3.6952 ‐0.0065±0.2044 0.946±0.2261 0.999±0.0316 0.0418 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 2.2552±0.7477 0.195±0.3964 0.979±0.1435 5.6449 0.9795±0.4302 0.421±0.494 0.991±0.0945 1.1445 ‐0.2962±0.157 0.498±0.5002 0.993±0.0834 0.1124 ‐0.2896±0.2041 0.671±0.4701 0.951±0.216 0.1256 ‐1.6985±0.1586 0.472±0.4995 0.994±0.0773 2.9101 ‐0.0127±0.1965 0.952±0.2139 0.999±0.0316 0.0388 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 2.7935±0.8609 0.126±0.332 0.984±0.1255 8.5446 1.1464±0.4748 0.358±0.4797 0.987±0.1133 1.5396 ‐0.5007±0.1243 0.028±0.1651 0.983±0.1293 0.2662 ‐0.6112±0.185 0.14±0.3472 0.488±0.5001 0.4078 ‐1.4827±0.1348 0.024±0.1531 0.965±0.1839 2.2165 0.0037±0.1994 0.951±0.216 0.999±0.0316 0.0398 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 2.2233±0.7793 0.215±0.411 0.966±0.1813 5.5502 0.753±0.4199 0.619±0.4859 0.974±0.1592 0.7433 ‐0.7173±0.0846 0±0 0.946±0.2261 0.5216 ‐1.1003±0.1434 0±0 0.022±0.1468 1.2313 ‐1.2406±0.3268 0.001±0.0317 0.7685±0.422 1.6459 ‐0.0058±0.2011 0.951±0.216 0.999±0.0316 0.0405 100 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 0.9603±0.2875 0.223±0.4165 1±0 1.0049 0.44±0.1992 0.519±0.4999 1±0 0.2333 ‐0.0803±0.1371 0.892±0.3105 1±0 0.0252 ‐0.0644±0.1465 0.904±0.2947 1±0 0.0256 ‐1.9205±0.1372 0.892±0.3105 1±0 3.707 0.0032±0.1433 0.944±0.23 1±0 0.0205 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 2.3001±0.5147 0.016±0.1255 1±0 5.5553 1.0107±0.2974 0.113±0.3168 1±0 1.11 ‐0.2786±0.1102 0.274±0.4462 1±0 0.0898 ‐0.2824±0.1397 0.472±0.4995 0.999±0.0316 0.0992 ‐1.7198±0.1115 0.26±0.4389 1±0 2.97 0.008±0.1373 0.947±0.2241 1±0 0.0189 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 2.7407±0.6174 0.011±0.1044 1±0 7.8926 1.1191±0.341 0.098±0.2975 1±0 1.3686 ‐0.5026±0.089 0.001±0.0316 1±0 0.2605 ‐0.6274±0.1308 0.009±0.0945 0.778±0.4158 0.4107 ‐1.4881±0.091 0.001±0.0316 1±0 2.2228 ‐0.0016±0.1419 0.945±0.2281 1±0 0.0202 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 2.2326±0.5511 0.032±0.1761 0.999±0.0316 5.288 0.7585±0.2955 0.361±0.4805 1±0 0.6627 ‐0.7155±0.0573 0±0 1±0 0.5153 ‐1.1038±0.0979 0±0 0.052±0.2221 1.228 ‐1.2593±0.0691 0±0 0.976±0.1531 1.5907 ‐0.0042±0.1423 0.951±0.216 1±0 0.0203 Tabla3:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladoscondobleexpresiónenunodelos grupos.
22 (A) (B) (C) Figura2:ECMparalosdatossimuladoscondobleexpresiónenunodelosgruposytamaño muestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuosporgrupoy(C)100individuospor grupo. Observando la Tabla 3 se puede comprobar el aumento que se produce en el sesgo al usar cualquiera de los métodos respecto a la situación anterior, donde había dos grupos igualmente expresados. Los métodos de sustitución por 0 y Kaplan-Meier son los que mayor aumento sufren, siendo el sesgo de estos dos métodos muy superior al del resto de métodos, sobre todo cuando el porcentaje de ND es bajo.
23 Se puede ver en las tablas que cuando el porcentaje de ND aumenta, la probabilidad de cobertura del método ROS disminuye rápidamente. Como cabía esperar, a medida que aumenta el tamaño se produce un aumento en la potencia estadística obtenida con cualquiera de los métodos de imputación. Una diferencia importante que se puede apreciar en el gráfico del ECM es que los métodos que mejores resultados proporcionan cuando el porcentaje de ND es < 50% son el método de ROS y el método de sustitución por el LOD. Cuando el porcentaje de ND es alto (70%) y se trabaja con grupos grandes, el método de sustitución por el LOD/2 mejora mucho y llega a ser una buena opción junto a la sustitución por el LOD. Con grupos más grandes, el método de Kaplan-Meier proporciona un ECM mucho menor al trabajar con un porcentaje de ND elevado (70%) que el que se obtenía con grupos de tamaño 20. Cuando se usa este método, la probabilidad de cobertura es muy pequeña, salvo con porcentajes de ND bajos y tamaños muestrales pequeños. 3.1.4 Cuatro veces más de expresión en uno de los grupos Se simula la situación en la que uno de los grupos tiene cuatro veces más de expresión que el otro. De aquí en adelante en las figuras se representa 𝑅𝐸𝐶𝑀 √𝐸𝐶𝑀, ya que existen ECM con valores muy elevados que no permiten apreciar bien las diferencias. Los peores métodos son la sustitución por 0 y el método de Kaplan-Meier, ambos con un sesgo y un ECM grande. Cuando la tasa de no detección es del 70% Kaplan-Meier tiene un ECM muy alto, llegando a ser el peor método cuando se trabaja con grupos de tamaño 20 o 50. Destacar el gran descenso que se produce en el ECM con este método a medida que aumenta el tamaño de los grupos, incluso cuando el porcentaje de ND es alto (70%).
24 n % de ND Medida S0 SDL2 SDL ROS K‐M Completos 20 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜1.2601±0.3823 0.5637±0.3342 ‐0.1328±0.3127 ‐0.0473±0.3227 ‐3.866±0.3129 ‐0.0186±0.3092 𝑝 0.883±0.3216 0.937±0.2431 0.902±0.2975 0.942±0.2339 0.901±0.2988 0.955±0.2074 𝛽 0.996±0.0632 0.997±0.0547 1±0 1±0 1±0 1±0 𝐸𝐶𝑀1.7341 0.4294 0.1154 0.1063 15.0439 0.096 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜3.8977±0.7468 1.7139±0.4715 ‐0.47±0.2907 ‐0.1997±0.3496 ‐3.5125±0.3001 0.005±0.2988 𝑝 0.054±0.2261 0.224±0.4171 0.498±0.5002 0.872±0.3343 0.469±0.4993 0.969±0.1734 𝛽 0.999±0.0316 1±0 1±0 0.999±0.0316 1±0 1±0 𝐸𝐶𝑀15.7501 3.1597 0.3054 0.1621 12.4278 0.0893 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜5.1424±1.1859 2.0696±0.6597 ‐1.0031±0.2237 ‐0.7502±0.3401 ‐2.9174±0.732 ‐0.0149±0.3173 𝑝 0.027±0.1622 0.144±0.3513 0.018±0.133 0.413±0.4926 0.0086±0.0924 0.941±0.2357 𝛽 0.998±0.0447 0.998±0.0447 0.999±0.0316 0.964±0.1864 0.9645±0.1851 1±0 𝐸𝐶𝑀27.8506 4.7186 1.0563 0.6784 9.0469 0.1009 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜3.6911±0.8115 1.0787±0.4319 ‐1.5337±0.1218 ‐1.6679±0.1739 ‐7.0728±5.112 ‐0.0178±0.3198 𝑝 0.141±0.3482 0.576±0.4944 0±0 0.002±0.0447 0±0 0.949±0.2201 𝛽 0.997±0.0547 0.997±0.0547 0.979±0.1435 0±0 0.9179±0.2748 1±0 𝐸𝐶𝑀14.2828 1.3501 2.3671 2.8122 76.1567 0.1026 50 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 1.3032±0.2246 0.111±0.3143 1±0 1.7488 0.6003±0.2106 0.572±0.495 1±0 0.4048 ‐0.1025±0.2071 0.883±0.3216 1±0 0.0534 ‐0.0295±0.2136 0.922±0.2683 1±0 0.0465 ‐3.8969±0.2068 0.883±0.3216 1±0 15.2282 0.0072±0.2062 0.933±0.2501 1±0 0.0426 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 3.8681±0.4939 0±0 1±0 15.206 1.693±0.3147 0.009±0.0945 1±0 2.9652 ‐0.4821±0.188 0.184±0.3877 1±0 0.2678 ‐0.2576±0.2283 0.692±0.4619 1±0 0.1185 ‐3.5118±0.1901 0.177±0.3819 1±0 12.3686 ‐0.0066±0.1985 0.962±0.1913 1±0 0.0395 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 5.1962±0.6978 0±0 1±0 27.4871 2.0987±0.3903 0.003±0.0547 1±0 4.557 ‐0.9987±0.1387 0±0 1±0 1.0166 ‐0.7928±0.1948 0.036±0.1864 1±0 0.6665 ‐2.953±0.1585 0±0 1±0 8.7453 0.0091±0.2027 0.949±0.2201 1±0 0.0412 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 3.7094±0.5368 0.002±0.0447 1±0 14.0481 1.092±0.2881 0.231±0.4217 1±0 1.2755 ‐1.5254±0.0825 0±0 1±0 2.3336 ‐1.6959±0.1101 0±0 0.04±0.1961 2.8884 ‐4.0843±3.9223 0±0 0.8539±0.3535 32.0659 ‐0.0104±0.2035 0.955±0.2074 1±0 0.0415 100 por grupo 10% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 1.2903±0.1604 0.003±0.0547 1±0 1.6906 0.5904±0.1502 0.181±0.3852 1±0 0.3712 ‐0.1094±0.1475 0.833±0.3732 1±0 0.0337 ‐0.0438±0.1526 0.91±0.2863 1±0 0.0252 ‐3.891±0.1474 0.833±0.3732 1±0 15.1612 8e‐04±0.1463 0.95±0.2181 1±0 0.0214 30% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 3.887±0.3421 0±0 1±0 15.2259 1.7087±0.2181 0±0 1±0 2.9671 ‐0.4697±0.1324 0.039±0.1937 1±0 0.2381 ‐0.2634±0.1576 0.509±0.5002 1±0 0.0942 ‐3.5281±0.1333 0.037±0.1889 1±0 12.4651 0.0043±0.1355 0.956±0.2052 1±0 0.0184 50% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 5.1289±0.5197 0±0 1±0 26.5758 2.0648±0.2895 0.002±0.0447 1±0 4.3474 ‐0.9992±0.1032 0±0 1±0 1.0091 ‐0.8302±0.1409 0±0 1±0 0.709 ‐2.9782±0.1096 0±0 1±0 8.8815 ‐0.0051±0.1396 0.955±0.2074 1±0 0.0195 70% 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑝 𝛽 𝐸𝐶𝑀 3.7177±0.3701 0±0 1±0 13.9579 1.0975±0.1983 0.021±0.1435 1±0 1.2438 ‐1.5227±0.0584 0±0 1±0 2.322 ‐1.7093±0.0732 0±0 0.459±0.4986 2.9271 ‐2.5733±1.5471 0±0 0.9341±0.2483 9.0155 0.0011±0.1392 0.952±0.2139 1±0 0.0194 Tabla4:Resultadosobtenidosparalosdatossimuladosconcuatrovecesmásdeexpresiónen unodelosgrupos.
25 (A) (B) (C) Figura3:ECMparalosdatossimuladosconcuatrovecesmásdeexpresiónenunodelos gruposytamañomuestralde(A)20individuosporgrupo;(B)50individuosporgrupoy(C)100 individuosporgrupo. Todos los métodos tienen una potencia estadística muy elevada en los diferentes casos, a excepción del método ROS cuando el porcentaje de datos ND es del 70%. En este caso en el grupo de no expresión, prácticamente todos los valores serán ND y se imputan utilizando los datos del otro grupo, por lo que es esperable que la diferencia entre ellos sea menor, lo que afecta a la potencia.
32 como variable respuesta la concentración de dicha citoquina y como factor el grupo, con cuatro niveles (Genser et al, 2007). Las condiciones de aplicación de esta metodología incluyen: - Independencia, que está garantizada por el diseño muestral. - Normalidad, que se ha verificado en todos los casos usando el contraste de Shapiro-Wilk. - Homogeneidad de varianza, para cuya evaluación se utiliza el test de Fligner. Esta condición es esencial en este caso, puesto que los grupos no están balanceados, por tanto, si no es posible asumirla se utiliza la corrección de Welch a la hora de realizar el ANOVA. Para llevar a cabo las comparaciones post-hoc y determinar entre que pares de grupos se encuentran las diferencias estadísticamente significativas, se utiliza el contraste T-Student para dos muestras independientes con la corrección de Bonferroni para solucionar el problema de las comparaciones múltiples. El análisis citoquina a citoquina requiere realizar un ANOVA por cada una de las moléculas evaluadas, y esto hace que vuelva a aparecer el problema de las comparaciones múltiples. A medida que aumentan el número de contrastes, la probabilidad de que se obtengan falsos positivos aumenta y esto debe ser corregido. Existen dos opciones para corregir este problema. La primera es controlar la FWER (Family-Wise Error Rate), definida como la probabilidad de tener uno o más falsos positivos en el conjunto de contrastes realizados. La segunda tiene que ver con controlar la FDR (False Discovery Rate) (Benjamini y Hochberg, 1995), definida como la proporción de falsos positivos entre todas las citoquinas inicialmente identificadas como diferencialmente expresadas. Los criterios basados en el control de FWER pueden ser muy restrictivos debido al gran número de contrastes realizados, por lo que en este contexto es más popular el control de la FDR. En este trabajo, se utilizará esta corrección para ajustar los p-valores obtenidos. 3.2.4 Resultados En las Tabla 7 se muestra la tasa de valores ND para cada citoquina y grupo. Es importante aclarar que en esta base de datos el número de individuos para los que se dispone de niveles de concentración de cada citoquina es variable. La razón es que los individuos no han sido analizados a la vez en el tiempo, y en algunos experimentos no se han determinado todas las citoquinas.
33 Citoquina Severos Moderados Leves Sanos Total N %ND N %ND N %ND N %ND N %ND EGF 29 6.90% 121 7.43% 104 13.46% 54 5.56% 308 9.09% Eotaxin 8 37.5% 23 52.17% 57 80.70% 33 87.88% 121 74.38% Fractalkina 15 0% 59 10.17% 82 8.54% 53 13.21% 209 9.57% IFNg 28 60.71% 93 67.74% 90 80% 34 88.24% 245 74.29% IL1b 28 53.57% 93 63.44% 90 55.56% 53 43.40% 264 55.68% IL1RA 28 0% 93 1.08% 90 1.11% 52 1.92% 263 1.14% IL2 25 68% 85 75.29% 80 66.25% 41 58.54% 231 68.40% IL4 12 41.67% 28 57.14% 31 45.16% 38 78.95% 109 59.63% IL5 3 100% 8 87.50% 41 58.54% 31 58.06% 83 62.65% IL6 29 10.34% 121 23.14% 104 37.50% 54 44.44% 308 30.52% IL8 29 0% 121 2.48% 104 5.76% 54 1.85% 308 3.24% IL9 3 100% 8 100% 10 100% 12 100% 33 100% IL10 928 42.86 93 52.69% 90 57.78% 53 58.49% 264 54.55% IL12p70 25 32% 85 61.18% 80 65% 22 77.27% 129 60.85% IL13 15 46.67% 36 50% 41 78.05% 31 80.65% 123 66.67% Il17 28 85.71% 93 90.32% 90 85.56% 34 97.06% 245 88.98% IP10 28 3.57& 93 3.22% 90 1.11% 34 0% 245 2.04% MMP9 14 0% 57 8.77% 30 20% 22 18.18% 123 12.20% RANTES 28 7.14% 93 17.20% 90 26.67% 34 38.24% 245 22.45% TNFa 28 39.29% 93 62.37% 90 76.67% 53 69.81% 264 66.29% VEGF 16 18.75% 65 24.62% 90 41.11% 34 64.71% 205 78% Tabla7:TasadevaloresNDparacadacitoquina,deformatotalyporgrupos. N:númerodeindividuosevaluados.
34 Como se ha visto en las simulaciones, no tiene mucho sentido imputar los valores ND en los casos en los que su tasa de ND es superior al 50%, por tanto, de entre las 21 citoquinas inicialmente consideradas, se seleccionan las 9 moléculas cuya proporción de ND es menor que el 50%. Concretamente: EGF, Fractalkina, IL1RA, IL6, IL8, IP10, MMP9, RANTES y VEGF. Los niveles de expresión observados para cada citoquina, grupo y método de imputación se muestran en la Tabla 8. Tabla8:Descriptivosdelas9citoquinasseleccionadas,diferenciandogrupoymétodo. Citoquina Grupos S0 SDL2 SDL ROS K‐M EGF Severo 8.0812±2.7195 8.2452±2.2421 8.4092±1.8466 8.567±1.6013 8.4413±1.7859 Moderado 8.9860±3.1369 9.1459±2.6958 9.3059±2.3122 9.4707±2.0035 9.2717±2.387 Leve 8.7111±3.709 9.0655±2.8921 9.4199±2.1578 9.5772±1.8481 9.5905±1.8197 Sano 9.376±2.6081 9.5396±2.0346 9.7032±1.5507 9.7255±1.4998 9.7718±1.3984 Fractalkina Severo 10.1117±1.3185 10.1117±1.3185 10.1117±1.3185 10.1117±1.3185 10.1117±1.3185 Moderado 8.4955±3.298 8.8121±2.5137 9.1287±1.8943 9.1575±1.8404 8.9582±2.2054 Leve 8.3784±2.9483 8.6805±2.1376 8.9827±1.5652 8.9638±1.581 8.8539±1.852 Sano 8.3883±3.641 8.8867±2.5296 9.3851±1.6934 9.2608±1.8605 9.1077±2.1061 IL1RA Severo 12.8209±3.6158 13.1175±2.7658 13.4141±2.6744 13.0538±2.898 13.2957±2.6982 Moderado 11.9639±2.7813 11.9833±2.7019 12.0028±2.6334 12.0993±2.4831 12.0281±2.5624 Leve 11.5357±2.8265 11.655±2.4563 11.7742±2.394 11.7242±2.2931 11.7422±2.3069 Sano 10.4963±2.4988 10.5621±2.2496 10.6279±2.0803 10.6258±2.0843 10.6362±2.0661 IL6 Severo 5.3535±2.4031 5.5272±2.0299 5.7008±1.7344 5.6768±1.7728 5.703±1.7344 Moderado 4.4126±2.77 4.6984±2.3505 4.9843±2.0412 5.1153±1.7691 5.1819±1.6782 Leve 3.2339±2.7102 3.7232±2.1542 4.2125±1.7084 4.251±1.5917 4.4816±1.3526 Sano 3.2426±3.4541 3.9846±2.7857 4.7267±2.248 4.5391±2.3622 4.5012±2.4034 IL8 Severo 10.4147±2.5971 10.4147±2.5971 10.4147±2.5971 10.4147±2.5971 10.4147±2.5971 Moderado 8.1309±2.6697 8.1723±2.5528 8.2137±2.4581 8.2346±2.4196 8.2235±2.4294 Leve 7.7313±2.7634 7.8177±2.5342 7.9041±2.3404 7.9741±2.1959 7.9294±2.2791 Sano 7.8488±1.8371 7.8673±1.7599 7.8858±1.6901 7.9273±1.5659 7.9304±1.5589 IP10 Severo 12.439±4.2724 12.7818±3.4152 13.1245±3.0952 13.2848±2.5041 13.1678±2.729 Moderado 14.3602±3.0647 14.418±2.7955 14.4758±2.5378 14.6792±1.7947 14.6691±1.8217 Leve 14.6564±2.714 14.6766±2.6098 14.6963±2.5155 14.7681±2.2754 14.7478±2.3259 Sano 13.9309±1.6872 13.9309±1.6872 13.9309±1.6872 13.9309±1.6872 13.9309±1.6872 MMP9 Severo 10.3328±5.969 12.0053±3.0745 13.6778±2.3166 12.0974±3.0495 13.0153±2.5688 Moderado 8.5311±3.8631 8.7069±3.4927 8.8827±3.1828 8.9537±3.0788 8.937±3.1041 Leve 7.0245±4.1728 7.4458±3.4675 7.8671±2.8471 7.8597±2.8617 7.9808±2.7132 Sano 6.7783±3.8363 708035±3.2952 7.3823±2.8034 7.6339±2.4605 7.2611±3.0092 RANTES Severo 5.3782±2.0839 5.4981±1.7886 5.618±1.563 5.7148±1.4679 5.6316±1.5454 Moderado 4.6513±2.546 4.939±2.0445 5.2266±1.6379 5.4016±1.5175 5.051±1.8783 Leve 3.8893±2.7649 4.4567±2.0555 5.0242±1.7009 4.6734±1.8096 4.6486±2.1072 Sano 3.3331±2.9013 4.4732±1.6585 5.6132±1.1875 4.4805±1.6588 5.0043±1.4254 VEGF Severo 7.9438±4.0911 8.3891±3.1983 8.8346±2.4082 9.2105±1.6401 9.4016±1.3726 Moderado 6.659±4.0118 7.3867±2.8299 8.1145±1.8535 8.2933±1.5445 8.0517±1.8515 Leve 5.2904±4.5478 6.5435±3.0991 7.7966±1.7844 7.8784±1.6894 7.7049±1.8263 Sano 3.1761±4.4157 5.3575±2.81 7.5389±1.2816 7.3794±1.4720 6.9666±1.7112
35 En la Tabla 9 se recogen los p-valores ajustados de los contrastes globales del ANOVA por citoquina y método de imputación. Citoquina S0 SDL2 SDL ROS K‐M EGF 0.327 0.202 0.0604 0.0353 0.0203 Fractalkina 0.259 0.112 0.0923 0.129 0.1608 IL1RA <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 IL6 0.0002 0.0004 0.001 0.001 0.0005 IL8 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 IP10 0.088 0.066 0.048 0.013 0.0099 MMP9 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 RANTES 0.00516 0.0593 0.171 0.0052 0.1016 VEGF 0.0003 0.0017 0.1274 0.0012 0.0001 Tabla9:P‐valoresajustadosporcomparacionesmúltiplesdeloscontrastesglobalesdelANOVA porcitoquinaymétodo Todas las citoquinas, salvo Fractalkina, muestran diferencias significativas entre alguno de los grupos y métodos utilizados. Cualquier método de imputación detecta diferencias globales entre grupos para los niveles de IL1RA, IL6, IL8 y MMP9. En el caso de EGF e IP10, los métodos de sustitución no detectan diferencias estadísticamente significativas. Las diferencias en RANTES son detectadas con el método se sustitución por 0 y con el método de ROS. Por último, en el caso de VEGF, el método de sustitución por el LOD es el único a partir del cual no se detecta expresión diferencial. Para evaluar entre que grupos de severidad se encuentran las diferencias significativas en las Tablas 10-17, se recogen los resultados de la comparación por pares de las 8 moléculas que mostraron un efecto global significativo con alguno de los métodos de imputación. En cada celda de las tablas se muestra el log2(FC), su IC del 95% y el p-valor corregido del contraste correspondiente. Además, se representan gráficamente el log2(FC) el grupo de individuos sin ninguna patología ocular (sano) vs el resto de grupos, individuos que presentan algún grado de ojo seco.
36 Tabla10:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparalacitoquinaEGF. Figura5:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaEGF. Citoquina Grupos SO SDL2 SDL ROS K‐M EGF Leve ‐ Sano ‐0.664907 (‐1.7833,0.4535) ~1 ‐0.1813 (‐1.3462,0.3980) ~1 ‐0.2833 (‐1.1811,0.181) ~1 ‐0.1483 (‐0.724,0.4274) ~1 ‐0.1813 (‐0.7407,0.3782) 0.4902 Moderado ‐ Sano ‐0.390008 (‐1.3542,0.5742) ~1 ‐0.5 (‐1.2050,0.4177) ~1 ‐0.3973 (‐0.8348,0.4723) ~1 ‐0.2548 (‐0.8568,0.3472) ~1 ‐0.5 (‐1.1892,0.1891) 0.1335 Severo ‐ Sano ‐1.2948 (‐2.5073,‐0.0822) 0.046 ‐1.3304 (‐2.2603,‐0.3285) 0.02 ‐1.2941 (‐2.0904,‐0.5705) 0.038 ‐1.1585 (‐1.8619,‐0.4551) 0.036 ‐1.3305 (‐2.0374,‐0.6235) 0.001 Moderado ‐ Leve 0.2749 (‐0.6417,1.1915) ~1 ‐0.0538 (‐0.7047,0.5971) ~1 ‐0.114 (‐0.9394,0.7114) ~1 ‐0.1118 (‐0.6355,0.4118) ~1 ‐0.3188 (‐0.876,0.2384) 0.259 Severo ‐ Leve ‐0.6298 (‐1.9046,0.6449) ~1 ‐0.9451 (‐1.8488,0.0414) 0.830 ‐1.0108 (‐1.8361,0.0185) 0.137 ‐1.0055 (‐1.7320,‐0.2789) 0.046 ‐1.1492 (‐1.9206,‐0.3778) 0.004 Severo ‐ Moderado ‐0.9048 (‐2.0927,0.2832) ~1 ‐0.8913 (‐1.7815,0.0012) 0.59 ‐0.8967 (‐1.7206,0.0728) 0.24 ‐0.8936 (‐1.6206,‐0.1666) 0.041 ‐0.8304 (‐1.6422,‐0.0186) 0.0453
37 Tabla11:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparalacitoquinaIL1RA. Figura6:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIL1RA. Citoquina Grupos SO SDL2 SDL ROS K‐M IL1RA Leve ‐ Sano 1.0394 (0.1056,1.9733) 0.0416 1.0929 (0.2722,1.9136) 0.0473 1.1463 (0.3595,1.9332) 0.0470 1.0984 (0.3341,1.8627) 0.0348 1.106 (0.3407,1.8713) 0.0098 Moderado ‐ Sano 1.4676 (0.5489,2.3863) 0.0095 1.4212 (0.5485,2.294), 0.0084 1.3749 (0.5361,2.2136) 0.0083 1.4736 (0.6697,2.2775) 0.0051 1.3919 (0.5714,2.2125) 0.0024 Severo ‐ Sano 2.3246 (0.9554,3.6938) <0.0001 2.5554 (1.4164,3.6943) <0.0001 2.7862 (1.7113,3.861) <0.0001 2.4281 (1.3093,3.5469) <0.0001 2.6595 (1.584,3.735) 0.0006 Moderado ‐ Leve 0.2436 (‐0.5466,1.0338) ~1 0.2289 (‐0.5203,0.9781) ~1 0.2286 (‐0.5102,0.9674) ~1 0.2418 (‐0.488,0.9715) ~1 0.2318 (‐0.4883,0.9519) 0.4294 Severo ‐ Leve 1.6938 (0.5143,2.8733) 0.0208 1.6509 (0.4885,2.8134) 0.0161 1.6398 (0.4807,2.7989) 0.0135 1.63604 (0.478,2.7941) 0.0124 1.6177 (0.464,2.7715) 0.0157 Severo ‐ Moderado 1.4502 (0.2562,2.6442) 0.047 1.422 (0.2396,2.6044) 0.0472 1.4113 (0.2326,2.59) 0.0490 1.3943 (0.2206,2.568) 0.041 1.3859 (0.2143,2.5575) 0.0434
38 Citoquina Grupos SO SDL2 SDL ROS K‐M IL6 Leve ‐ Sano ‐0.0086 (‐0.9972,0.98) ~1 ‐0.2614 (‐1.0524,0.5297) ~1 ‐0.5142 (‐1.1466,0.1183) 0.6989 ‐0.2881 (‐0.914,0.3378) ~1 ‐0.0196 (‐0.6096,0.5703) 0.9559 Moderado ‐ Sano 1.17 (0.2022,2.1379) 0.0461 0.7138 (‐0.0911,1.5187) 0.3812 0.2576 (‐0.4229,0.9381) ~1 0.5762 (‐0.0601,1.2125) 0.4540 0.6807 (0.0574,1.304) 0.0477 Severo ‐ Sano 2.1109 (0.6767,3.5451) 0.0086 1.5425 (0.3745,2.7105) 0.0271 0.9741 (0.0191,1.9291) 0.0483 1.1377 (0.1406,2.1347) 0.045 1.2018 (0.1962,2.2074) 0.0282 Moderado ‐ Leve 1.1787 (0.4526,1.9048) 0.0131 0.9153 (0.3283,1.5024) 0.0121 0.7717 (0.2759,1.2675) 0.0197 0.9696 (0.4087,1.5305) 0.0096 0.7003 (0.2994,1.1013) 0.003 Severo ‐ Leve 2.1195 (1.0556,3.1835) 0.0028 1.7598 (0.9243,2.5954) 0.0017 1.4883 (0.7446,2.2319) 0.0019 1.5326 (0.5662,2.499) 0.0054 1.2214 (0.5079,1.9349) 0.0046 Severo ‐ Moderado 0.9409 (‐0.1087,1.9905) 0.6691 0.8445 (‐0.011,1.689) 0.5282 0.7166 (‐0.0448,1.478) 0.4566 0.563 (‐0.3944,1.5204) ~1 0.5211 (‐0.209,1.2511) 0.1858 Tabla12:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparalacitoquinaIL6. Figura7:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIL6.
39 Citoquina Grupos SO SDL2 SDL ROS K‐M IL8 Leve ‐ Sano ‐0.1174 (‐0.9417,0.7068) ~1 ‐0.0496 (‐0.8118,0.7127) ~1 0.0183 (‐0.6913,0.7279) ~1 0.0468 (‐0.6172,0.7108) ~1 ‐0.001 (‐0.6844,0.6825) 0.9975 Moderado ‐ Sano 0.2822 (‐0.5076,1.0719) ~1 0.305 (‐0.4504,1.0604) ~1 0.3279 (‐0.3992,1.0549) ~1 0.3074 (‐0.4012,1.016) ~1 0.2932 (‐0.4198,1.0061) 0.5837 Severo ‐ Sano 2.5659 (1.5899,3.5419) 0.0001 2.5474 (1.5911,3.5037) <0.0001 2.5289 (1.5901,3.4677) <0.0001 2.4874 (1.5787,3.3962) <0.0001 2.4843 (1.5772,3.3914) 0.0001 Moderado ‐ Leve 0.3996 (‐0.3218,1.1211) ~1 0.3424 (‐0.3179,1.0027) ~1 0.3095 (‐0.3257,0.9448) ~1 0.2869 (‐0.3495,0.9233) ~1 0.2941 (‐0.3303,0.9185) 0.223 Severo ‐ Leve 2.6834 (1.5502,3.8165) <0.0001 2.5682 (1.4627,3.6738) <0.0001 2.5106 (1.4165,3.6046) <0.0001 2.5035 (1.4114,3.5955) <0.0001 2.4853 (1.3965,3.5741) 0.0001 Severo ‐ Moderado 2.2837 (1.1778,3.3896) 0.0001 2.2258 (1.1327,3.3188) <0.0001 2.2010 (1.1122,3.2898) <0.0001 2.2166 (1.1251,3.3081) <0.0001 2.1912 (1.1039,3.2785) 0.0004 Tabla13:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparalacitoquinaIL8. Figura8:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIL8.
40 Citoquina Grupos SO SDL2 SDL ROS K‐M IP10 Leve ‐ Sano 0.7255 (‐3.0883,0.1044) ~1 0.7654 (‐0.1893,1.72) 0.998 0.7654 (‐0.15595,1.6902) 0.779 0.8372 (‐0.0125,1.687) 0.269 0.8169 (‐0.0486,1.6823) 0.0605 Moderado ‐ Sano 0.4292 (‐0.6688,1.5273) ~1 ‐0.5449 (‐0.4666,1.5564) ~1 0.5449 (‐0.3846,1.4744) ~1 0.7483 (0.0474,1.4491) 0.049 0.7382 (0.0293,1.4471) 0.0503 Severo ‐ Sano ‐1.4919 (‐3.0883,0.1044) ~1 ‐0.8064 (‐2.1389,0.5261) ~1 ‐0.8064 (‐2.0439,0.4311) ~1 ‐0.6461 (‐1.7153,0.4232) ~1 ‐0.7631 (‐1.895,0.3688) 0.2494 Moderado ‐ Leve ‐0.2963 (‐1.1459,0.5533) ~1 ‐0.2416 (‐1.0123,0.529) ~1 ‐0.2205 (‐0.9628,0.5218) ~1 ‐0.0996 (‐0.7099,0.5107) ~1 ‐0.0787 (‐1.1983,1.041) 0.7999 Severo ‐ Leve ‐1.66 (‐3.1549,‐0.165) 0.045 ‐1.5964 (‐2.9603,‐0.2325) 0.033 ‐1.5718 (‐2.8895,‐0.254) 0.024 ‐1.4143 (‐2.5226,‐0.3059) 0.011 ‐1.4681 (‐2.6233,‐0.3128) 0.0382 Severo ‐ Moderado ‐1.3637 (‐2.8854,0.158) 0.163 ‐1.3547 (‐2.7248,0.0154) 0.114 ‐1.3513 (‐2.6673,0.0352) 0.077 ‐1.3147 (‐2.381,‐0.2483) 0.02 ‐1.3894 (‐2.4993,‐0.2795) 0.0328 Tabla14:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparalacitoquinaIP10. Figura9:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaIP10.
41 Citoquina Grupos SO SDL2 SDL ROS K‐M MMP9 Leve ‐ Sano 0.2461 (‐2.0287,2.5209) ~1 0.3655 (‐1.5493,2.2802) ~1 0.4848 (‐1.1101,2.0796) ~1 0.2258 (‐1.2967,1.7483) ~1 0.7196 (‐0.8822,2.3215) 0.3847 Moderado ‐ Sano 1.7528 (‐0.1743,3.6799) 0.41 1.6266 (‐0.0927,3.3459) 0.33 1.5004 (‐0.041,3.0417) 0.27 1.3198 (‐0.1412,2.7808) 0.52 1.6758 (0.1372,3.2145) 0.0488 Severo ‐ Sano 3.5545 (0.2433,6.8657) <0.0001 4.925 (2.6929,7.1571) <0.0001 6.2954 (4.4696,8.1213) <0.0001 4.4636 (2.587,6.3402) <0.0001 5.7541 (3.7748,7.7335) 0.0001 Moderado ‐ Leve 1.5067 (‐0.3703,3.3836) 0.49 1.1279 (‐0.6322,2.8879) 0.58 1.0156 (‐0.3532,2.3844) 0.78 1.1505 (‐0.3595,2.6605) 0.53 0.9562 (‐0.3604,2.2729) 0.1779 Severo ‐ Leve 3.3083 (0.5325,6.7741) <0.0001 4.5595 (2.8195,6.2995) <0.0001 5.8107 (4.0642,7.5572) <0.0001 4.2377 (2.5377,5.9377) <0.0001 5.197 (3.484,6.91) 0.0001 Severo ‐ Moderado 1.8017 (0.3017,3.3017) <0.0001 3.2984 (2.0984,3.2984) <0.0001 4.7951 (3.1769,6.4133) <0.0001 3.1437 (1.5637,4.7237) <0.0001 4.1408 (2.5351,5.7464) 0.0004 Tabla15:Diferenciademedias,ICyp‐valordeloscontrastesporparesparalacitoquina MMP9. Figura10:Gráficolog2(FC)delgruposanovselrestodegruposusandolacitoquinaMMP9.
48 11. Quignon Santana, S., & Alfonso Sánchez, O. (2009). Principales manifestaciones oculares en la artritis reumatoide: modelos de diagnóstico y evaluación. MediSur, 7(6), 52-58. 12. Quintanilla Casas, B. (2017). Estadística en variables con censura. Aplicación a datos medioambientales. Obtenido de: http://openaccess.uoc.edu/webapps/o2/bitstream/10609/63786/6/bquinta nillacTFM0617memoria.pdf 13. Roda, M., Corazza, I., Bacchi Reggiani, M. L., Pellegrini, M., Taroni, L., Giannaccare, G., & Versura, P. (2020). Dry Eye Disease and Tear Cytokine Levels—A Meta-Analysis. International journal of molecular sciences, 21(9), 3111. 14. Sadegh, M. K. (2008). A note on the regression of order statistics. Communications in Statistics—Theory and Methods, 37(4), 475-480. 15. Shoari, N., & Dubé, J. S. (2018). Toward improved analysis of concentration data: embracing nondetects. Environmental toxicology and chemistry, 37(3), 643-656. 16. Tamhane, M., Cabrera-Ghayouri, S., Abelian, G., & Viswanath, V. (2019). Review of biomarkers in ocular matrices: challenges and opportunities. Pharmaceutical research, 36(3), 1-35.