Estudio de la biopsia de endometrio en pacientes con fallo repetido de implantación en la Unidad de Reproducción del Hospital Clínico Universitario de Valladolid

Trabajo Fin de Grado: Estudio de la biopsia de endometrio en pacientes con fallo repetido de implantación en la Unidad de Reproducción del Hospital Clínico Universitario de Valladolid. Presentado por: Miguel Ángel Ángel Miñarro. Dirigido por: Dra. Laura Barrero Real. Valladolid, Junio de 2019 II III ÍNDICE Introducción 1 Metodología 4 Resultados 6 Discusión 10 Conclusiones 13 Bibliografía 14 Anexos 17 IV INTRODUCCIÓN 1 INTRODUCCIÓN La implantación embrionaria es un proceso de extraordinaria complejidad que requiere un embrión de buena calidad que sea capaz de ello y un endometrio receptivo, así como el establecimiento de una buena comunicación entre ambos[1]. Teniendo en cuenta todo lo anterior, actualmente se define como fallo repetido de implantación (FRI) la no consecución del embarazo en mujeres menores de 40 años, tras haber transferido al menos 4 embriones de buena calidad, procedentes de al menos dos ciclos de estimulación, repartidos en un mínimo 3 trasferencias, incluyendo tanto las realizadas en fresco como las de embriones criopreservados [2]. La transferencia de embriones de buena calidad morfológica, en un útero anatómica y funcionalmente receptivo es esencial para lograr el embarazo. Por ello es importante conocer que el diagnostico de FRI se realiza por exclusión, ya que implica tanto factores embrionarios como maternos, y es preciso un estudio detallado de todos ellos, además de una minuciosa técnica de transferencia [3]. En base a los estudios recientes, el éxito de una implantación depende por un lado de la receptividad endometrial, que puede verse alterada por anomalías de la cavidad uterina, un endometrio poco proliferado, una expresión anómala del patrón de receptividad (genómico o molecular), endometritis, factores inmunológicos o trombofilias [4]. Por otro lado, depende de un adecuado desarrollo embrionario en relación con anomalías cromosómicas, endurecimiento de la zona pelúcida o condiciones subóptimas de cultivo. También puede depender de otras causas multifactoriales como son la endometriosis, el hidrosalpinx o la estimulación folicular subóptima. Las parejas que no consiguen el embarazo después de tratamientos de fecundación in vitro, requieren una orientación multidisciplinar realizando una serie de estudios diagnósticos dirigidos a encontrar una causa que justifique el FRI. Hoy en día disponemos de técnicas de biología molecular y genética que nos permiten analizar embriones. La existencia de un embrión aneuploide es una de las principales causas del fallo de implantación [5], por lo que a todas estas parejas que padecen FRI se les solicita un estudio del cariotipo a ambos en sangre periférica. Ante un resultado normal, se puede ofrecer a la pareja la realización de un screening genético preimplantacional de aneuploidias para asegurar la transferencia de un embrión euploide. INTRODUCCIÓN 2 Adicionalmente, se realiza un estudio de los trastornos de la coagulación sanguínea en la mujer ya que pueden obstaculizar la implantación. Qublan et al. [6] sugirió que en los casos de FRI se debe solicitar un estudio de trombofilias pues la prevalencia aproximada en la población europea es del 15%, siendo la causa mas frecuente la resistencia a la proteína C activada por la mutación del Factor V Leyden. La receptividad endometrial requiere de una valoración múltiple ya que, podría verse disminuida por alteraciones anatómicas (pólipos, miomas, sinequias o malformaciones uterinas), hormonales (niveles elevados de progesterona), genómicas, moleculares, infecciosas (endometritis), inflamatorias o inmunológicas. Por ello es necesario el estudio de imágen del útero mediante ecografía y ante cualquier sospecha de patología a través de la histeroscopia. La histeroscopia se considera el estándar para el diagnostico de patología intrauterina y nos permite la confirmación visual del estado del canal cervical y de la cavidad uterina., así como la extirpación o biopsia de dicha patología orgánica. El estudio del endometrio se completa con una biopsia dirigida durante la histeroscopia o simplemente con una biopsia a ciegas en consulta con cánula de Cornier, también conocido como “Scratch endometrial”. Este método además de ser diagnóstico parece ser una herramienta terapéutica, que consiste en provocar un daño intencionado al endometrio que, mediante los procesos de reparación posteriores, consigue mejorar la futura receptividad del embrión. Se trata de un efecto empírico que todavía está en estudio para intentar conocer su mecanismo de acción. Se han postulado diversos mecanismos que podrían estar implicados en el desarrollo de un endometrio con menor receptividad. La endometritis crónica es una inflamación persistente del endometrio caracterizada por la presencia de células plasmáticas creando un ambiente intrauterino subóptimo para la implantación. Se cree que los mediadores inflamatorios tipo citoquinas y agentes quimiotácticos, así como los propios microorganismos pueden provocar la apoptosis de las células del trofoblasto impidiendo la correcta implantacion del embrión. El método diagnóstico de la endometritis crónica todavía es objeto de debate entre la tinción de Hematoxilina- Eosina y la Inmunohistoquímica del CD138. Aunque datos recientes indican que esta última técnica podría ser el método diagnostico más adecuado, ya que con Hematoxilina-Eosina se identifican morfológicamente muchas células como plasmáticas que en realidad no lo son y por tanto, diagnosticando como falsa endometritis en muchos casos [7]. Diversos estudios [8], llegan a diagnosticar una endometritis crónica en el 30,3% al 57,5% de las pacientes con FRI. Además también INTRODUCCIÓN 3 han demostrado que el diagnóstico de endometritis crónica y su consiguiente tratamiento antibiótico mejora las tasas de embarazo espontáneo y las tasas de niños nacidos vivos en pacientes con FRI [9]. Tras estos hallazgos se han abierto nuevas líneas de investigación para lo cual es necesario contar con muestras procedentes de biopsias endometriales para ser procesadas en estos estudios. Además de los resultados específicos de cada estudio se ha visto empíricamente que el “endometrial scratching” (daño local del endometrio) parece incrementar la receptividad endometrial en las pacientes con FRI [10, 11], pues induce un incremento significativo de macrófagos (células HLA-DR+, CD11c+), de citoquinas proinflamatorias, TNF-α, oncogenes GRO-α, IL-15 y proteínas inflamatorias de macrófagos 1B (MIP-1B), que producen un efecto estimulante directo, con una correlación positiva sobre la probabilidad de embarazo. En conclusión, la respuesta inflamatoria inducida por la biopsia podría facilitar la preparación del endometrio para la una mejor implantación embrionaria. Siguiendo esta línea de investigación, el objetivo principal de nuestro estudio es determinar la incidencia de endometritis en las pacientes con FRI de la Unidad de Reproducción del Hospital Clínico Universitario y estudiar el efecto de la biopsia de endometrio sobre la receptividad uterina posterior en estas mujeres. METODOLOGÍA 4 METODOLOGÍA Estudio descriptivo, retrospectivo, analítico, de pacientes con FRI en ciclos de FIV/ICSI con transferencias de embriones de buena calidad en fresco y/o congelados, procedentes de al menos dos ciclos de estimulación, desde enero de 2017 hasta diciembre de 2018 en la Unidad de Reproducción del Hospital Clínico de Valladolid. Los datos han sido obtenidos de las historias clínicas, y del programa informático de la Unidad (SARA). Se recogen datos relativos a la edad de la mujer (<40años), tipo de transferencia (embriones congelados vs fresco), día de la transferencia y números de embriones transferidos, así como el resultado del test de embarazo y su evolución. En cuanto a las pruebas complementarias, a todas las parejas se solicitó un estudio de FRI que consiste en el estudio genético con los cariotipos de ambos miembros de la pareja, junto con un estudio en la mujer de trombofilias (alteraciones de la proteína C y S, homocisteina y mutación del gen MTHFR, mutación del factor V Leyden, gen 20210 protrombina), del síndrome antifosfolipídico y un estudio ecográfico detallado del útero. El estudio de FRI se completa con la realización de una biopsia de endometrio a ciegas en consulta con cánula de Cornier en la fase secretora del ciclo previo al que se va a realizar la transferencia embrionaria. Se coloca el especulo dentro de la vagina y se expone el orificio cervical externo, a través del cual se introduce la cánula hasta llegar al fondo del útero. Se extrae el émbolo hacia atrás y se aspiran varias muestras de endometrio que se remiten para su estudio en formol a anatomía patológica. Esta prueba puede ser algo dolorosa y puede provocar un leve sangrado durante el día de realización de la misma, pero presenta buena tolerancia por parte de las pacientes [12]. Las muestras de la biopsia se remitieron al Servicio de Anatomía Patológica del HCUV. El estudio de las muestras se llevó a cabo por un mismo observador, mediante un estudio microscópico básico y un estudio específico de inmunohistoquímica para valorar la presencia de células plasmáticas. METODOLOGÍA 5 Una vez realizada la biopsia de endometrio, las muestras fueron procesadas y analizadas por el mismo patólogo, especialista en patología endometrial. Se fijaron con formol y a continuación se procedió a su parafinado para poder realizar el análisis histológico. Inicialmente, todas las biopsias se analizaron mediante la tinción de H&E en busca de células plasmáticas y aquellas preparaciones donde se sospechaba la presencia de ellas se sometieron a técnicas de inmunohistoquímica para confirmar la presencia del marcador de células plasmáticas syndecan-1 (CD138) que identifica la endometritis crónica. Syndecan-1 es un proteoglicano de superficie celular expresado por células plasmáticas muy útil para el diagnostico de endometritis crónica. La inmunohistoquímica de las muestras susceptibles se realizó mediante la incubación de las mismas con una dilución 1:100 de anticuerpos monoclonales de ratón contra sydecan-1, durante una hora a temperatura ambiente. Para considerar positivo el diagnóstico de endometritis crónica tendría que darse la presencia de 1-5 células plasmáticas/campo o un clúster de <20 células plasmáticas teñidas [13]. A los 14 días de realizar la transferencia embrionaria, tanto de embriones en fresco como de embriones congelados, si no ha tenido la menstruación, la paciente se realiza un test de embarazo en orina de primera hora de la mañana. Si el test en orina es positivo, se confirma el embarazo con la realización de los niveles de B-HCG en sangre periférica, considerando un embarazo bioquímico si los niveles son superiores a 50UI. Para el diagnóstico de embarazo clínico, se realiza una ecografía en consulta a las 7 semanas de gestación para confirmar la existencia de un embrión con latido cardíaco fetal positivo. El análisis estadístico se realiza utilizando el programa IBM SPSS Statistics 22.0 considerando una significación estadística una p<0.05. Se valora si el scratch endometrial mejora la tasa de implantación, así como un estudio de la prevalencia de patología endometrial, con especial hincapié en la endometritis. DISCUSION 12 embriones transferidos en fresco (31% de tasa de gestación) pero no alcanza la significación estadística, respecto al grupo control. Estos resultados confirman otros previamente descritos [3], concluyendo que podría ser favorable la criopreservación de embriones y posterior transferencia de los mismos, previa biopsia de endometrio. Este efecto positivo en relación con una transferencia de embriones diferida está apoyado por múltiples ensayos [24, 25] que incrementan la evidencia científica a favor de transferencias de embriones en un ciclo sin tratamiento de estimulación ovárica, ya que el ambiente uterino es más fisiológico y por tanto más adecuado para la implantación. En este trabajo publicamos por primera vez, la existencia de un infiltrado linfocitario CD3+ en el endometrio que parece tener un efecto beneficioso en la receptividad uterina, facilitando la implantación del embrión. Al comparar la tasa de gestación con los resultados de anatomía patológica, la mitad de las gestaciones tras el scratch han tenido lugar en endometrios con infiltrados linfocitarios CD3+, manteniéndose este efecto tanto en transferencias de embriones en fresco como en criotransferencias. Aunque no sepamos su repercusión real, ni su mecanismo de acción, parece un hallazgo interesante y se abre una nueva vía de estudio en este sentido. Para ello, son necesarios más estudios con un mayor tamaño muestral, que nos permita explicar estos resultados con más detalle. CONCLUSIONES 13 CONCLUSIONES A pesar de que la endometritis crónica es una entidad cada vez con más relevancia en el fallo repetido de implantación, ninguna de nuestras pacientes presentó esta patología tras una revisión exhaustiva de las muestras. Lo que es frecuente, es la existencia de linfocitos por lo que tal vez es necesario consensuar los criterios anatomopatológicos y realizar cultivos de las muestras para poder hablar de los mismos términos y comparar los resultados. En el FRI el scratch endometrial mejora la tasa de gestación, manteniéndose el efecto tanto para transferencias de embriones en fresco como criotransferencias. La existencia de un infiltrado linfocitario en el endometrio parece tener un efecto beneficioso en la receptividad endometrial, pero son necesarios más estudios para poder explicar estos resultados con un mayor tamaño muestral. El fallo repetido de implantación, genera frustración en parejas y personal clínico. Por ello, debemos aunar nuestros esfuerzos en unificar criterios, y en la búsqueda de nuevas estrategias, que permitan incrementar nuestras probabilidades de éxito. BIBLIOGRAFIA 14 BIBLIOGRAFIA 1. Cha HH, Hwang JR, Kim HY, Choi SJ, Oh SY, Roh CR. 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Apéndice gráfico 1: tinción de H&E de las muestras de biopsia de endometrio a diferentes aumento (A: 10X; B: 20X; C: 40X) y tinción de inmunohistoquímica para células plasmáticas C138+ (D). Apéndice gráfico 2: cánula de Cornier y bote de recogida de muestra (A). Embrión en día 5 en estadio de blastocisto antes de la transferencia (B). A B C D A B ANEXOS 19 ANEXO II: Informe de solicitud de estudio de cariotipo. ANEXOS 20 ANEXO III: Informe de solicitud de estudio de trombofilias. ANEXOS 21 ANEXO IV: Abstract 1 y Certificado Póster. International IVIRMA Congress IS CHRONIC ENDOMETRITIS A POSSIBLE ETIOLOGY OF THE REPEATED IMPLANTATION FAILURE? INTRODUCTION To know why,embryos of good quality do not manage to implant in patients with uterus and endometriums with normal ultrasound scan,supposes a true challenge for the reproductive medicine of the XXI century. Multiple factors have been proposed as implicated in the repeated failure of implantation, among them the existence of a chronic endometritis. The objective is to assess the incidence of this entity in our patients. MATERIAL AND METHODS Descriptive,retrospective,analytical study of patients with at least three transfers of good quality embryos from at least two stimulation cycles (January 2017- December 2018). The data have been obtained from the clinical records,and the program Computer Unit(SARA),and analyzed statistically through the IBM-SPSS-22-program. In all the couples, a study of the implant failure was requested,consisting of the genetic study (both karyotypes) and the study of thrombophilias (alterations of the protein C and S,homocysteine and mutation of the MTHFR gene,mutation of Factor V Leyden,gene 20210th prothrombin) and antiphospholipid syndrome in women. The patients underwent an endometrial aspiration biopsy (Cornier-type cannula), during the secretory phase of the cycle prior to the transfer,to rule out the existence of a chronic endometritis and treat it if necessary. The AP study was carried out by a single observer,by means of microscopic study and subsequent use of immunohistochemistry to assess the presence of plasma cells. RESULTS: Of 101 cases founded,only 1 presented karyotype´s alterations,and 10 patients presented some type of thrombophilia. The anatomo-pathological study (n=100) reported: • Insufficient sample: 18 patients (18%) • Organic pathology (endometrial polyp): 6 patients (6%) • Secretory endometrium with neutrophils and eosinophils: 37 patients (37%) • CD3 + lymphocytes without plasma cells: 39 patients (39%). Understanding chronic endometritis as the persistent inflammation of the endometrial mucosa caused by bacterial pathogens and characterized by the presence under the microscope of abundant CD38+ plasma cells, none of our patients presented it. It´s believed that the presence of microorganisms, and consequently,of cytokines and inflammatory mediators,can cause apoptosis of the trophoblast cells,making their implantation difficult,recommending prior antibiotic treatment. CONCLUSIONS: Despite the fact that chronic endometritis is an increasingly important entity in the failure of implantation, none of our patients presented this pathology after an exhaustive review of the samples. What is frequent is the existence of lymphocytes so it may be necessary to reach a consensus on the anatomopathological criteria and perform cultures of them to be able to talk about the same terms and compare the results.