Etanol celulósico: desarrollo de una tecnología óptima para la producción semi-continua

PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA E INGENIERÍA AGROALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS TESIS DOCTORAL: ETANOL CELULÓSICO: DESARROLLO DE UNA TECNOLOGÍA ÓPTIMA PARA LA PRODUCCIÓN SEMI-CONTINUA Presentada por Patricia Portero Barahona para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Dr. Jesús Martín Gil Dr. Enrique Javier Carvajal i DEDICATORIA A mi ángel, Carlos Francisco ii AGRADECIMIENTOS Un agradecimiento especial a mis directores Dr. Jesús Martín Gil y Dr. Javier Carvajal por su paciencia y apoyo constante en el desarrollo del trabajo doctoral. Porque a pesar de todos los impasses en este proceso aún siguen conmigo, guiándome y acompañándome. Al Dr. Pablo Martín-Ramos, por su paciencia, apoyo y guía. Por su profesionalismo y buena predisposición de ayuda. Al Dr. Luis Manuel Navas, por darme la apertura en la UVA para el programa doctoral, y sobre todo por su colaboración en todo el proceso. A la Dra. Adriana Correa por ser una buena anfitriona en el laboratorio de la UVA. Y por el cariño brindado en mi estancia en Palencia. Agradecer hoy y siempre a mi familia. A mis padres Francisco y Guadalupe, hermanos Paco y Vanne, cuñada Pao y sobrino Nico, por su amor y apoyo incondicional. Y sobre todo por creer y confiar en mí. A Carlos mi querido esposo, por su amor, por estar junto a mi y darme la fuerza y fortaleza que a veces necesito. Gracias por hacer mi vida de colores. A Bernardo, por su amistad sincera. Por ser siempre tú. Al equipo CNIB, que en todos estos años me han acompañado en este proceso A Iosody y Marciabella que fueron mis compañeras de laboratorio en Palencia. A Iosody que hasta el último momento me ha brindado su ayuda. A la comunidad UVA que de una u otra forma han contribuido en el desarrollo de este trabajo doctoral. iii ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS ..................................................................................................... vi ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. vii RESUMEN ...................................................................................................................... ix 0 MÉRITO CIENTÍFICO ................................................................................................ xi 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 1.1 MATERIAS PRIMAS PARA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL .......................... 3 1.1.1 Fuente de azúcar .................................................................................................. 3 1.1.2 Fuente de almidón ............................................................................................... 4 1.2 CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS EN DIFERENTES MATERIAS PRIMAS ................................................................................................................................... 5 1.2.1 Azúcares mono y disacáridos .............................................................................. 5 1.2.2 Almidón ............................................................................................................... 5 1.2.3 Biomasa lignocelulósica ...................................................................................... 6 1.3 BIOETANOL DE PRIMERA GENERACIÓN ........................................................ 9 1.3.1 Bioetanol a partir de fuente de azúcar ................................................................. 9 1.3.2 Bioetanol a partir de fuentes de almidón ........................................................... 10 1.4 BIOETANOL DE SEGUNDA GENERACIÓN ..................................................... 10 1.4.1 Bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica ................................................... 11 1.5 PRODUCCIÓN DE ETANOL LIGNOCELULÓSICO ......................................... 11 1.5.1 Técnicas de pretratamiento de biomasa ............................................................. 11 1.5.2 Sacarificación de polímeros de glucosa............................................................. 19 1.5.3 Fermentación ..................................................................................................... 22 1.6 ENFOQUES TECNOLÓGICOS PARA MEJORAR EL RENDIMIENTO Y PRODUCTIVIDAD DEL ETANOL ...................................................................... 27 1.6.1 Proceso de fermentación e hidrólisis por separado (SHF) ................................ 28 1.6.2 Proceso de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) ............................. 28 1.6.3 Proceso de sacarificación y co-fermentación simultánea (SSCF) ..................... 29 1.6.4 Bioproceso consolidado (CBP) ......................................................................... 29 1.7 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 31 1.8 OBJETIVOS ............................................................................................................ 34 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 36 2.1 MATERIALES ........................................................................................................ 36 2.1.1 Reactivos ........................................................................................................... 36 iv 2.1.2 Equipos .............................................................................................................. 36 2.1.3 Softwares ........................................................................................................... 37 2.2 SELECCIÓN DE LEVADURAS PARA FERMENTACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL CELULÓSICO ...................................................... 38 2.2.1 Cepas de Levaduras ........................................................................................ 38 2.2.2 Identificación de levaduras a nivel de especie................................................ 38 2.2.3 Pruebas de asimilación y fermentación de azúcares ....................................... 40 2.2.4 Efecto de la fuente y concentración inicial de nitrógeno en el perfil de consumo de glucosa de S. cerevisiae ......................................................................... 41 2.2.5 Concentración mínima de nitrógeno requerida para la fermentación............... 42 2.2.6 Co-fermentaciones de diferentes cepas de S. cerevisiae con reutilización de biomasa celular ........................................................................................................... 43 2.2.7 Cinética de producción de etanol y consumo de glucosa .................................. 44 2.3 CARACTERIZACIÓN DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR ...................... 45 2.3.1 Materia prima: Bagazo de caña de azúcar ........................................................ 45 2.3.2 Análisis químico del bagazo de caña de azúcar ................................................ 45 2.4 PRETRATAMIENTO FÍSICO-QUÍMICO DE LA BIOMASA LIGNOCELULÓSICA ............................................................................................ 46 2.4.1 Preparación de la muestra ................................................................................. 46 2.4.2 Pretratamientos químicos con reactor de presión .............................................. 46 2.4.3 Pretratamientos químicos con irradiación de microondas ................................. 47 2.5 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA FRACCIÓN DE HOLOCELULOSA DE BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR ...................................................................... 48 2.6 FERMENTACIÓN EN BATCH ............................................................................. 49 2.7 SISTEMA DE FERMENTACIÓN SEMI-CONTINUO ACOPLADO A SACARIFICACIÓN SIMULTÁNEA (SFSS) ........................................................ 50 2.7.1 Pretratamiento de biomasa lignocelulósica ...................................................... 51 2.7.2 Pre-hidrólisis enzimática ................................................................................... 52 2.7.3 Acondicionamiento del sistema de fermentación semi-continuo acoplado a sacarificación simultánea (SFSS) ............................................................................... 52 2.8 MÉTODOS ANALÍTICOS ..................................................................................... 53 2.8.1 Determinación de azúcares reductores totales (TRS) ....................................... 53 2.8.2 Análisis de HPLC .............................................................................................. 54 2.8.3 Análisis de ATR-FTIR ...................................................................................... 55 2.8.4 Análisis estadístico ............................................................................................ 55 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 56 3.1 SELECCIÓN DE LEVADURAS PARA PRODUCCIÓN DE ETANOL CELULÓSICO ........................................................................................................ 56 v 3.1.1 Identificación molecular a nivel de especie de levaduras.................................. 57 3.1.2 Caracterización fisiológica de levaduras en base a la utilización de diferentes fuentes de carbono ...................................................................................................... 58 3.1.3 Efecto de la fuente y concentración inicial de nitrógeno en el perfil de consumo de glucosa de S. cerevisiae ......................................................................................... 64 3.1.5 Co-fermentación de diferentes cepas de S. cerevisiae con reutilización de biomasa celular ........................................................................................................... 68 3.1.6 Cinética de fermentación ................................................................................... 71 3.2 CARACTERIZACIÓN DE LA MATERIA PRIMA .............................................. 73 3.3 CONDICIONES DE PRETRATAMIENTO FÍSICO-QUÍMICO .......................... 74 3.3.1 Pretratamientos álcali y ácidos en reactor de presión ..................................... 75 3.3.2 Pretratamiento alcalino con organosolvente en microondas ............................. 80 3.4 SACARIFICACIÓN ENZIMÁTICA DE LA FRACCIÓN HOLOCELULÓSICA DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR ............................................................. 86 3.5 FERMENTACIÓN DE AZÚCARES ..................................................................... 90 3.6 SISTEMA DE SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEA SEMICONTINUA (SFSS) ...................................................................................... 92 4. CONCLUSIONES ................................................................................................... 96 REFERENCIAS ........................................................................................................... 100 vi ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Ventajas y desventajas que presentan los sistemas combinados de producción de bioetanol: SHF, SSF, SSCF y CBP. ....................................................................... 30 Tabla 2. Respuestas de asimilación y fermentación de diferentes fuentes de carbono de 150 cepas de Saccharomyces cerevisiae ................................................................ 60 Tabla 3. Efecto de diferentes fuentes y concentración de nitrógeno en el consumo de glucosa de levaduras ............................................................................................... 66 Tabla 4. Concentración de etanol y rendimiento teórico de etanol de diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. Condiciones de fermentación: 34°C, 200 rpm por 24 horas. ...................................................................................................................... 73 Tabla 5. Composición del bagazo de caña de azúcar (estudio y referencias) ................ 74 Tabla 6. Fracción sólida (%) obtenida después de pretratamiento de bagazo de caña de azúcar ...................................................................................................................... 78 Tabla 7. Resultados de la prueba de Tukey (HSD). Análisis de las diferencias entre los dos medios de reacción con un intervalo de confianza del 95% (TRS (%) rendimiento). "1" significa el medio de pretratamiento con sulfolane-TiO2 y "2" para el medio sin este ..................................................................................................... 81 Tabla 8. Producción de TRS a partir de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar para diferentes temperaturas, concentraciones de NaOH y tiempos de reacción con y sin sulfolane-Tio2 ................................................................................................. 83 Tabla 9. Producción de TRS a partir de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar para pretratamientos alcalinos con diferentes temperaturas y tiempos con reactor de presión .................................................................................................................... 85 Tabla 10. Prueba de Tukey (HSD) para el pretratamiento de mw + sulfolane-TiO2. Análisis de las diferencias entre las categorías con un intervalo de confidencia de 95% (rendimiento TRS (%)) para temperatura (arriba), concentración de NaOH (centro) y tiempo (abajo) ........................................................................................ 85 Tabla 11. Composición de sacáridos obtenidos a partir de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar pretratado ................................................................................... 88 Tabla 12. Etanol y rendimiento de etanol producido por fermentación de bagazo de caña de azúcar pretratado ................................................................................................ 91 vii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Producción mundial de etanol (2007 – 2017) ................................................... 1 Figura 2. Ilustración de la estructura de lignocelulosa: celulosa, hemicelulosa y lignina 7 Figura 3. Reacción de la lignocelulosa con NaOH ......................................................... 16 Figura 4. Acción del complejo enzimático de celulasas ................................................. 21 Figura 5. Acción del complejo enzimático de xilanasas ................................................ 22 Figura 6. Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae a partir de glucosa durante la fermentación ........................................................................................................... 24 Figura 7. Metabolismo de Zymomonas mobilis a partir de glucosa durante la fermentación. .......................................................................................................... 25 Figura 8. Sistemas de fermentación: discontinuo (batch), alimentado (fed-batch) y continuo .................................................................................................................. 27 Figura 9. Esquema de los sistemas SHF, SSF, SSCF y CBP. ........................................ 30 Figura 10. Región ITS del ADN ribosomal, que comprende gen 5.8S y espaciadores intergénicos ITS1 e ITS2 ........................................................................................ 40 Figura 11. Plano isométrico de la biorrefinería CNIB-PUCE ........................................ 52 Figura 12. Esquema general del proceso SFSS .............................................................. 53 Figura 13. Perfil de restricción de la región ITS. Carril 1: ladder 100 pb; carril 2: región its (800 pb); carril 3: digestión de ITS con la enzima HhaI (390 pb, 380 pb, 270 pb); carril 4: digestión de ITS con la enzima HaeIII (305 pb, 260 pb, 200 pb, 170 pb); y carril 5: digestión de ITS con la enzima HinfI (350 pb) .............................. 57 Figura 14. Glucosa consumida por diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae después de 24 horas de fermentación a diferentes concentraciones de hidrolizado de levadura (0; 0,2; 0,3 y 0,4 gN/l) ......................................................................... 67 Figura 15. . Patrones de restricción del DNA mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae. Carriles: 1 y 16 marcador 1000 bp. Cepas tipo:CLQCA-10-099 (carril 2), CLQCA-INT-001 (carril 3), CLQCA-INT-005 (carril 4) y UCLM (carril 5). Cepas (carril 6 -15). .............................................................................................. 69 Figura 16. Reutilización de biomasa celular en co-cultivo de cepas de Saccharomyces cerevisiae por ciclos de fermentación (ciclo de fermentación: 24 horas) .............. 71 Figura 17. Concentración de glucosa y etanol durante la fermentación con diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. Condiciones 34°C, 160 rpm por 24 horas. ... 72 viii Figura 18. Espectro de ATR-FTIR de la fracción sólida recuperada después de pretratamientos álcali y ácidos a 160°C for 20 min en reactor de presión. ............ 80 figura 19. Cinética sfss de bagazo de caña de azúcar usando Saccharomyces cerevisiae: concentración de etanol (% v/v) y concentración de glucosa (%) .......................... 95 xv y celobiosa pueden acumularse en el medio, produciendo un efecto inhibidor sobre las enzimas celulasas ( 6 ); siendo este el principal problema en el proceso de SHF. Por otro lado, en el proceso de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) descrito en el estado de la técnica, la glucosa liberada (sacarificación enzimática) puede fermentarse rápidamente en etanol mediante la utilización simultánea de levaduras. Este consumo continuo de productos (glucosa) minimiza la inhibición de la actividad enzimática, previene el estrés osmótico en las células de levadura y reduce el riesgo de contaminación por transformación inmediata de azúcares en etanol, manteniendo bajos niveles de azúcar y una alta concentración de etanol ( 7 ). Sin embargo, esta SSF presenta desventajas, principalmente en términos de la temperatura a la que se debe ejecutar el proceso; la temperatura óptima para la hidrólisis enzimática es de 50-55°C, mientras que la temperatura adecuada para la fermentación está entre 35-37°C 8 . Por lo que se debe establecer una temperatura óptima que no afecte la actividad enzimática y de fermentación durante el proceso. Con estos antecedentes, esta invención se ha centrado en modificar ciertas etapas del proceso, a fin de hacerlo más rentable y tecnológicamente más factible. Respecto al estado de la técnica de patentes; se puede apreciar que todos los documentos descritos están relacionados con el proceso de pretratamiento de la biomasa seguida de una etapa de sacarificación y fermentación simultánea (SSF). 6 ALFANI F., GALLIFUOCO A., SAPOROSI A., SPERA A. & CANTARELLA M., “Comparison of SHF processes for the bioconversion of steam-exploded wheat Straw”. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2000. 7 DAHNUM D., TASUM S.O., TRIWAHYUNI E., NURDIN M. & ABIMANYU H., “Comparison of SHF and SSF Processes Using Enzyme and Dry Yeast for Optimization of Bioethanol Production from Empty Fruit Bunch”. Energy Procedia. 2015. ALBERNAS-CARVAJAL Y., CORSANO G., GONZÁLEZ CORTÉS M. & GONZÁLEZ SUÁREZ E., “Preliminary design for simultaneous saccharification and fermentation stages for ethanol production from sugar cane bagasse”. Chemical Engineering Research and Design. 2017. 8 OLOFSSON K., BERTILSSON M. & LIDÉN G., “A short review on SSF – an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks”, Biotechnological Biofuels. 2008. xvi Las solicitudes de patentes ES2382575, CU23986, US2017321231, US2017044329, WO2004046333, ES2559177, ES2427731, WO2009025547, US2011171710, WO2010098694 y US20100035318, consideradas las más cercanas a la invención, describen procesos de sacarificación y fermentación simultánea (SSF), sin embargo ninguno de ellos hace referencia a un sistema de cultivo semi-continuo (SSFSCC) como una etapa esencial que se incorpora en esta invención; así como también, el estado de la técnica no describe características esenciales ni condiciones específicas utilizadas en esta invención, para lograr la optimización del proceso de producción de bioetanol, como se verá más adelante. Adicionalmente, se encuentran artículos científicos que dan cuenta de investigaciones relacionadas solamente con procesos de hidrólisis y fermentación por separado (SHF) y/o sacarificación y fermentación simultánea (SSF), o una combinación de las mismas, pero en ningún caso describen –como parte de sus procesosetapas de cultivo semi-continuo (SSFSCC). Para superar los problemas anteriormente mencionados, esta invención trabaja en el efecto de varias modificaciones en el proceso destinadas a lograr un aumento en la productividad y en el rendimiento del etanol. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un proceso de sacarificación y fermentación simultánea en un sistema de cultivo semi-continuo (SSFSCC), que implica la optimización de los procesos para la producción de etanol de segunda generación mediante la implementación de un sistema de cultivo semi-continuo; a condiciones específicas para su desarrollo. xvii PROCESO DE SACARIFICACIÓN ENZIMÁTICA Y FERMENTACIÓN SIMULTÁNEA EN CULTIVO SEMI-CONTINUO (SSFSCC) Este proceso comprende las siguientes etapas: 1. Pretratamiento de la biomasa lignocelulósica y prehidrólisis (licuefacción) de la fracción celulósica; 2. Aclimatación de las cepas de levadura de Saccharomyces cerevisiae; de preferencia, cepas de levadura de Saccharomyces cerevisiae CLQCAINT-005, perteneciente a la Colección de Levaduras Quito Católica, CLQCA-PUCE; 3. Sacarificación enzimática y fermentación simultánea en cultivo semicontinuo (SSFSCC). 1. Pretratamiento de la biomasa lignocelulósica y prehidrólisis (licuefacción) de la fracción celulósica Pretratamiento físico-químico: La biomasa lignocelulósica se tritura y tamiza para luego pretratarla con soluciones de hidróxido de sodio (1%, p/v) a 160°C durante 20 minutos. El proceso se lleva a cabo en un reactor a presión. Como resultado se obtiene la biomasa lignocelulósica pretratada. Este pretratamiento físico-químico es un paso previo en el proceso SSFSCC, y no es materia de protección de esta invención. xviii Prehidrólisis (licuefacción): Se añade en el biorreactor del 10%-30% de la fracción celulósica de la biomasa lignocelulósica pretratada (producto obtenido del pretratamiento físico-químico) con una solución tampón a fin de llevar la mezcla a un pH 4,5; posteriormente se añade entre el 1-8 UPF/g de enzimas celulasas/hemicelulasas y se incuba por un periodo de tiempo de 2-6 horas a 55°C a 200 rpm. Finalmente, a esta mezcla licuada (prehidrolizada) se añade del 5%-15% de la fracción celulósica de la biomasa lignocelulósica pretratada, para alcanzar una concentración de sólidos entre el 15 al 45%. En esta etapa se obtiene la fracción celulósica hidrolizada a partir de la biomasa lignocelulósica pretratada 2. Aclimatación de las cepas de levadura Se aclimatan cepas de Saccharomyces cerevisiae; en particular cepas de Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005 (perteneciente a la Colección de Levaduras Quito Católica, CLQCA-PUCE), en medios de hidrolizado de biomasa pretratada (producto obtenido en la etapa 1.) y medio de cultivo YPD (extracto de levadura, peptona y de dextrosa) en relación: 0,25:0,75; 0,5:0,5; 0,75:0,25 v/v, respectivamente. En esta etapa se obtienen cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae aclimatadas; en particular, cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005 aclimatadas. 3. Sacarificación enzimática y fermentación simultánea en cultivo semi-continuo (SSFSCC) La sacarificación y fermentación simultánea en cultivo semi-continuo (SSFSCC) se lleva a cabo en un biorreactor donde se añade la mezcla de la fracción celulósica hidrolizada a xix partir de la biomasa lignocelulósica (producto obtenido en la etapa 1.) con 1x106 – 1x109 células/mL de la levadura Saccharomyces cerevisiae aclimatada; de preferencia, cepas de Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005 (producto obtenido en la etapa 2.), y se lleva a una temperatura de 30°C y 100 rpm por 25 días. Cada 24 horas o menos, se retira el 10% (del volumen total) de la mezcla del biorreactor y se añade el 10% de la mezcla de fracción celulósica hidrolizada a partir de la biomasa lignocelulósica pretratada (producto obtenido en la etapa 1). ENSAYOS QUE SUSTENTAN LA INVENCIÓN 1. Análisis químico de la biomasa lignocelulósica Se caracteriza la biomasa lignocelulósica por tres métodos diferentes: (i) fibra detergente neutra FDN (Método MO-LSAIA-02.01); (ii) fibra detergente ácida: FDA (Método MOLSAIA -02.02); y, (iii) detergente ácido lignina: ADL (Método MO-LSAIA-02.03). La celulosa, la hemicelulosa y la lignina se cuantifican de acuerdo con McIntosh & Vancov (McIntosh & Vancov, 2011). 2. Medición del rendimiento de azúcar y etanol Las concentraciones de azúcar y etanol se analizan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), a 79°C, con H2SO4 a 5 mM como eluyente a un caudal de 0,6 ml/min y un volumen de inyección de 10 μL. Se usa una columna de intercambio iónico H + de ácido orgánico. Los azúcares y etanol se detectan por un detector de índice de refracción. Los compuestos se identifican por sus tiempos de retención relativa y se cuantifican sobre la base de una curva de calibración preparada con azúcares estándar y productos de fermentación. xx El rendimiento teórico de etanol (%) es calculado con la siguiente ecuación: Rendimiento de etanol (%) = (Cetanol / 0.51xCglucosa) x 100 Donde: Cetanol = concentración de etanol al final de la fermentación (en g/L); Cglucosa = concentración de glucosa en el comienzo de la fermentación (en g/L); y, 0,51 = es el factor de conversión para la glucosa a etanol basado en la bioquímica estequiométrica de la levadura. 3. Análisis estadístico Los datos obtenidos en los procesos de sacarificación enzimática y fermentación simultánea en cultivo semi-continuo (SSFSCC) se analizan en el software IBM SPSS Statistics. Los resultados se someten al análisis de varianza (ANOVA) y los medios se comparan mediante la prueba HSD de Tukey. RESULTADOS (Fig. 1). En el proceso de sacarificación y fermentación simultánea en un sistema de cultivo semicontinuo SSFSCC, la concentración del etanol cada 24 horas o menos se mantiene dentro del rango de 8 a 11% (v/v), mediciones realizadas durante un periodo de 25 días. Tabla 1. Resultados obtenidos de concentración de glucosa (g/L) y concentración de etanol (% v/v) en un período de 25 días: RESULTADOS Tiempo días Concentración de etanol Cetanol (% v/v)* Concentración de glucosa Cglucosa (g/L.)* 1 10,79 0,00 2 8,98 0,00 3 9,14 0,00 4 8,43 8,31 5 9,27 22,61 6 8,75 4,70 xxi 7 9,80 4,33 8 9,73 4,82 9 8,36 4,33 10 8,60 7,01 11 9,21 8,25 12 9,47 7,36 13 9,09 7,84 14 9,83 4,64 15 8,57 3,76 16 9,57 8,62 17 9,81 8,68 18 9,75 9,51 19 9,12 9,54 20 9,05 7,52 21 9,67 0,00 22 9,66 0,00 23 9,08 0,00 24 9,68 0,00 25 9,39 0,00 * Promedio de tres pseudorréplicas EJEMPLO DE REALIZACIÓN A continuación se describe un ejemplo de realización de esta invención, sin que ello implique o limite el alcance de protección de la misma: a) La biomasa lignocelulósica se tritura y tamiza para luego pretratarla con hidróxido de sodio (1% p/v) a una temperatura de 160°C por 20 minutos, en un reactor a presión. b) Se añade en el biorreactor el 30% de la fracción celulósica hidrolizada a partir de la biomasa lignocelulósica pretratada, con una solución tampón y se lleva a un pH 4,5; luego se añade a la mezcla 3 UPF/g. de enzimas celulasas/hemicelulasas, y se incuba por 4 horas a 55°C a 200 rpm. c) A esta mezcla licuada (prehidrolizada) se añade el 5% de la fracción celulósica hidrolizada a partir de la biomasa lignocelulósica pretratada d) Paralelamente, se aclimata cepas de Saccharomyces cerevisiae; de preferencia, cepas de Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005, en cuatro soluciones de xxii hidrolizado y medio de cultivo YPD (extracto de levadura, peptona y dextrosa) en relación: 0,25:0,75; 0,5:0,5; 0,75:0,25 v/v. e) La sacarificación y fermentación simultánea en cultivo semi-continuo (SSFSCC) se lleva a cabo en un biorreactor donde se añade la mezcla de la fracción celulósica hidrolizada a partir de la biomasa lignocelulósica pretratada con 1 x 106 UFC-mL- 1 de la levadura Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005 aclimatada, y se lleva a una temperatura de 30°C y 100 rpm por 25 días. f) Cada 18 horas, se retira el 10% del volumen de la mezcla del biorreactor (producto fermentado) y se añade el 10% de la fracción celulósica hidrolizada enzimáticamente a partir de la biomasa lignocelulósica pretratada VENTAJAS TÉCNICAS Este sistema en general ofrece una mayor eficiencia en la producción de etanol celulósico, debido a la reducción en el tiempo de producción, la optimización del espacio en los biorreactores; disminución en los tiempos de puesta en marcha de los reactores; y, lo más importante, el ahorro de enzimas. Todas estas mejoras apuntan a reducir los costos de producción industrial del etanol de segunda generación. De los resultados del proceso se obtiene una concentración de etanol (Cetanol) que se mantiene dentro del rango de 8 a 11% (v/v), en un periodo de tiempo de 24 horas o menos. Estos valores no han sido superados por el estado de la técnica en este tiempo (24 horas o menos), como se puede apreciar en la tabla 2: xxiii Tabla 2. Valores comparativos de los resultados de esta invención vs los resultados encontrados en el estado de la técnica: Proceso** Levaduras Enzimas UPF/g Tiempo (horas) Concentración de etanol Cetanol (% v/v) Referencias Bibliográficas SSFSCC Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005 1-8 24 h o menos 8-11 Esta invención S-SSF Saccharomyces cerevisiae comercial 15-50 18 horas de prehidrólisis enzimática, 60 horas de fermentación 4, 99 Jie Lu, et al (2013)9 SSCF Saccharomyces cerevisiae SyBE005 20 48 h. 24 – 96h. 3,15 2,53 – 3,80 Lei Qin, et al., (2017)10 SSF ---- ----- 29,5 – 45,5 h. 2,52 – 2,79 Yailet Albernas- Carvajal, et al., (2016)11 SSF Saccharomyces cerevisiae yeast No. 1701 (DER CIEMAT Culture Collection, Spain) ----- 30 – 50 h. 2,53 – 2,79 Yailet Albernas- Carvajal, et al., (2017)12 SSF Saccharomyces cerevisiae 10 180 (60x 6 tiempos) 72h. 11,14 Cheng Ningning, et al., (2017)13 SSF Saccharomyces cerevisiae JRC5 Saccharomyces cerevisiae JRC6 15 24 h. 2,90 2,85 Jairam Choudhary, et al., (2017)14 SHF SSF Saccharomyces cerevisiae 40 72 horas de fermentación por SHF 24 horas por SSF 4.74 6,05 Deliana Dahnum, et al., (2015)15 SSF Saccharomyces cerevisiae 15 48 h. 2,45 Jianlong He, et al., (2016)16 9 JIE LU, et al., “Fed-batch semi-simultaneous saccharification and fermentation of reed pretreated with liquid hot water for bio-ethanol production using Saccharomyces cerevisiae”. Table 2. Bioresource Technology. 2013 10 LEI QIN, et al., “Dual effect of soluble materials in pretreated lignocellulose on simultaneous saccharification and co-fermentation process for the bioethanol production”. Bioresource Technology. 2017 11 YAILET ALBERNAS-CARVAJAL, et al., “Preliminary desing for simultaneous saccharification and fermentation stages for ethanol production from sugar cane bagasse”. Chemical Engineering Research and Design. 2016. 12 YAILET ALBERNAS-CARVAJAL, et al., “Preliminary desing for simultaneous saccharification and fermentation stages for ethanol production from sugar cane bagasse”. Chemical Engineering Research and Design. 2017. 13 CHENG NINGNING, et al., “Optimization of Simultaneous Saccharification and Fermentation Conditions with Amphipathic Lignin Derivatives for Concentrated Bioethanol Production”, página 132. Bioresource Technology.2017 14 CHOUDHARY JAIRAM, et al., “Bioprospecting thermotolerant ethanologenic yeasts for simultaneous saccharification and fermentation from diverse enviroments”, página 345, Tabla 4. Vol. 123. Elsevier. 2017 15 DAHNUM DELIANA, et al., “Comparison of SHF and SSF processes using enzyme and dry yeast for optimization of bioetanol production from empty Fruit bunch”, página 115, ScienceDirect. Elsevier. 2015 16 JIANLONG HE, et al., “Optimization of prehydrolysis time and substrate feeding to improve ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation of furfural process residue”, página 1, abstract. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol xx, No. xx, 1-7. 2016 xxiv SSF Saccharomyces cerevisiae TISTR5048 123 96 h. 2,18 Sureeporn Kumneadklang, et al., (2015)17 SSF Saccharomyces cerevisiae As2.489 10-15 72 h. 1,93 Jingbo Li, et al., (2014)18 L+PSSF Saccharomyces cerevisiae KF-7 10-20 96h 48h 5,90 – 5,52 5,77 Hiroto Nishimura, et al., (2017)19 SSF 20 96 h 2,19 Hilares Ruly Terán, et al., (2017)20 SSF Saccharomyces cerevisiae 30 ---- 5,07 Holofsson Kim, et al., (2008)21 *Los valores de la concentración de etanol encontrados en el estado de la técnica son transformados de g/L. a %v/v **Proceso: SSFSCC: Sacarificación y fermentación simultánea en un sistema de cultivo semi-continuo S-SSF: Sacarificación y fermentación semi-simultáneo SSCF: Sacarificación y co-fermentación simultánea SSF: Sacarificación y fermentación simultánea SHF: Hidrólisis y fermentación por separado L+PSSF: Licuefacción sucesiva, pre-sacarificación, sacarificación y fermentación simultánea. Del pretratamiento de la biomasa lignocelulósica y prehidrólisis (licuefacción) de la fracción celulósica.- El objetivo de un pretratamiento y prehidrólisis (licuefacción) de la biomasa lignocelulósica -como una primera etapa de este proceso-, es facilitar el acceso de las enzimas celulasas para convertir la celulosa en azúcares fermentables mediante hidrólisis. Un pretratamiento y prehidrólisis adecuado puede aumentar la digestibilidad del material, generando un impacto en el rendimiento de etanol después de la fermentación. 17 SUREEPORN KUMNEADKLANG, et al., “Bioethanol production from oil palm frond by simultaneous saccharification and fermentation”, página 790. ScienceDirect. Elsevier. 2015. 18 JINGBO LI, et al., “One-pot simultaneous saccharification and fermentation: A preliminary study of a novel configuration for cellulosic etanol production”, páginas 176-177, Tabla 2, Figura 3. Bioresource Technology. 2014 19 HIROTO NISHIMURA, et al., “Production of etanol from a mixture of Waste paper and kitchen Waste via a process of successive liquefaction, presaccharification, and simultaneous saccharification and fermentation”, abstract. Waste Management. Elsevier. 2017 20 HILARES RULY TERÁN, et al., “Ethanol production in a simultaneous saccharification and fermentation process with interconnected reactors employing hydrodynamic cavitation-pretreated sugarcane bagasse as raw material”. Bioresource Technology. 2017 21 KIM OLOFSSON, et al., “A short review on SSF – an interesting process option for etanol production from lignocellulosic feedstocks”. Biotechnology for Biofuels. 2008 xxxi 2. Aclimatación de levadura Saccharomyces cerevisiae; de preferencia la cepa CLQCA-INT-005, perteneciente a la Colección de Levaduras Quito Católica, CLQCA-PUCE; 3. Sacarificación enzimática y fermentación simultánea en cultivo semi-continuo (SSFSCC). 4. La concentración de etanol se mantiene dentro del rango de 8 a 11% (v/v), en un periodo de tiempo de 24 horas 1 1. INTRODUCCIÓN En la actualidad, la seguridad energética y ambiental son los principales problemas en el mundo que han impulsado la búsqueda de fuentes de energías alternativas y amigables con el ambiente. (Arevalo-Gallegos, Ahmad, Asgher, Parra-Saldivar, & Iqbal, 2017). El bioetanol es una de las alternativas más prometedoras para los combustibles fósiles, ya que éste puede ser producido a partir de diversas fuentes renovables. Algunos países, como Estados Unidos, Brasil, miembros de la Unión Europea (UE), China, Canadá y varios estados ya tienen en marcha programas de producción de bioetanol para reducir el consumo y dependencia de los combustibles fósiles. Estados Unidos y Brasil principalmente producen etanol a partir de maíz y caña de azúcar, respectivamente, siendo los mayores productores de etanol en el mundo (aproximadamente 85%). Es evidente el aumento de la producción de bioetanol con el tiempo, por ejemplo Estados Unidos ha incrementado drásticamente desde 175 millones de galones en 1980 hasta 16000 millones de galones e 2017 (Figura 1) (U.S. Department of Energy, 2017). Figura 1. Producción mundial de etanol (2007 – 2017) 2 El etanol (C2H5OH) es una fuente energética que presenta ventajas sobre la gasolina (C7H17). A pesar de que un litro de etanol contiene el 66% de energía en comparación con la energía proporcionada por la misma cantidad de gasolina, el bioetanol presenta algunas ventajas: i) tiene mayor octanaje en relación a la gasolina, permitiendo que se queme a una compresión más alta con menor tiempo de combustión; ii) presenta una alta entalpía de evaporación; iii) mayor velocidad de llama laminar; y iv) mayor calor de vaporización. Todas estas características garantizan la eficiencia volumétrica de la mezcla de etanol en comparación con la gasolina pura, mejorando la potencia de salida (Nigam & Singh, 2011). Por otro lado, el etanol contiene 34,7% de oxígeno, resultando en un 15% más eficiente en la combustión con relación a la gasolina, esto particularmente implica la disminución de la emisión de partículas y óxidos de nitrógeno. Además, el etanol contiene una cantidad insignificante de azufre, disminuyendo la emisión de óxido de azufre al ambiente (Nigam & Singh, 2011). De igual forma, se ha comprobado que el etanol es un sustituto seguro al metil terciario butil éter (MTBE) que se utiliza para potenciar el octanaje en la gasolina y para disminuir la producción de monóxido y dióxido de carbono. Por lo tanto, con todas las características mencionadas se corrobora que el etanol es un combustible eficiente alternativo a los combustibles fósiles. Las principales fuentes renovables utilizadas para la producción de bioetanol se clasifican en azúcares, almidón y biomasa lignocelulósica. El etanol obtenido de azúcares y almidón es referido a bioetanol de primera generación; mientras que a partir de la biomasa lignocelulósica se produce bioetanol de segunda generación (Vohra, Manwar, Manmode, Padgilwar, & Patil, 2014) 3 1.1 MATERIAS PRIMAS PARA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL 1.1.1 Fuente de azúcar Las materias primas a base de azúcar incluyen los cultivos energéticos de caña de azúcar, remolacha azucarera y sorgo dulce; frutas como la uva, dátiles, melón de agua y manzana; y los residuos de la refinación de azúcar como la melaza de la caña de azúcar y remolacha. Las ventajas de utilizar cultivos de azúcar como materia prima para la producción de bioetanol son el alto rendimiento de azúcar y los bajos costos de conversión; sin embargo su limitante es la disponibilidad estacional de los cultivos (Ferreira, Brancoli, Agnihotri, Bolton, & Taherzadeh, 2018) La caña de azúcar es una de las principales materias primas utilizada para la producción de etanol, tanto el jugo del tallo y el subproducto de las refinerías de azúcar (melaza) se han utilizado para producción de bioetanol a lo largo de muchos años, principalmente en Brasil. Esta es una planta C4 que tiene una alta capacidad para convertir energía solar en biomasa, y crece en países tropicales y subtropicales. El jugo de caña contiene azúcares fácilmente fermentables (alto contenido de sacarosa), además de nutrientes orgánicos y minerales. La disponibilidad del cultivo es alta, presentando una producción global de 360 millones de toneladas/año y un rendimiento del cultivo de 60–79,5 t/ha. Por otro lado, los residuos son una buena fuente para generar electricidad y bioetanol de segunda generación. Por lo tanto, la caña de azúcar se ha convertido en una materia prima prometedora para el bioetanol (Tyagi, Lee, Mulla, Garg, & Chae, 2019) (Khattab & Watanabe, 2019) 4 1.1.2 Fuente de almidón Los cultivos de almidón son ampliamente utilizados para la producción de bioetanol debido a su disponibilidad en todo el mundo, facilidad de conversión, capacidad de almacenamiento por períodos largos y alto rendimiento de etanol. Estas materias primas incluyen cereales (60–80% de almidón), tubérculos y raíces (60–90% de almidón), leguminosas (25–50% almidón), y frutas verdes e inmaduras (hasta un 70% de almidón). Los granos de maíz, sorgo, trigo, yuca, papas y camotes son fuentes conocidas de etanol combustible. El maíz es un importante cultivo de cereales ampliamente utilizado para la producción de bioetanol a escala comercial y su uso se ha incrementado en los últimos años. América del Norte, Asia, Europa y América del Sur, son los mayores productores de maíz. Estados Unidos es el productor principal de etanol a partir de maíz; en el 2014 produjo 14,3 billones de galones, y exportó 825 millones de galones de etanol a 51 países de todo el mundo. 1.1.3 Biomasa lignocelulósica La biomasa lignocelulósica puede dividirse en cultivos energéticos, plantas acuáticas, materiales forestales, residuos agrícolas y fracción sólida orgánica de desechos municipales. En general la biomasa lignocelulósica parece ser una fuente abundante en todo el mundo; la producción global de biomasa vegetal es aproximadamente 200×109 t/año, donde se pueden usar casi 8×109 - 20×109 toneladas para la producción de biocombustible. La mayoría de los residuos agrícolas provienen de los cultivos de maíz, trigo, arroz y caña de azúcar, mientras que el resto de residuos contribuye solo con una pequeña cantidad. 5 El residuo de maíz es uno de los residuos agrícolas más prometedores (tallos, hojas y mazorcas), con una producción de 4 toneladas/acre. Otro residuo importante es el bagazo obtenido del procesamiento del azúcar a partir de caña de azúcar, el cual ha sido estimado entre 317 – 380 millones de ton/año. 1.2 CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS EN DIFERENTES MATERIAS PRIMAS Los carbohidratos son los principales componentes fermentables para la producción de bioetanol, e incluyen a monosacáridos y disacáridos (azúcares solubles) y polisacáridos (almidón, celulosa y hemicelulosa). Los azúcares solubles son los componentes en las materias primas a base de azúcar; el almidón es el principal carbohidrato en los cultivos de almidón; y la celulosa y la hemicelulosa son los principales carbohidratos de la biomasa lignocelulósica. 1.2.1 Azúcares mono y disacáridos Los azúcares fermentables presentes en las materias primas de fuentes basadas en azúcar son principalmente monosacáridos como la glucosa y fructosa, y disacáridos como la sacarosa. Estos son azúcares solubles que pueden ser fácilmente fermentados y convertidos en etanol, por la acción de microorganismos fermentadores. En este caso la biomasa no requiere de un pretratamiento, ya que los azúcares están disponibles inmediatamente para ser metabolizados y transformados a etanol. 1.2.2 Almidón El almidón es la reserva de carbohidratos más abundante en las plantas y se encuentra en hojas, flores, frutos, semillas, tallos y raíces. El almidón es utilizado por las plantas como fuente de carbono y energía. La síntesis bioquímica del almidón involucra moléculas de 6 glucosa producidas en las células de la planta por fotosíntesis (Schmiele, Sampaio, & Pedrosa Silva Clerici, 2019). El almidón está formado por dos tipos de polímeros: amilopectina y amilosa. La amilopectina consiste en cadenas lineales de unidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos α-1,4 y es altamente ramificado en las posiciones α-1,6 en intervalos de 20 enlaces glucosídicos a lo largo del eje de la molécula (constituye entre 70 - 85% del almidón común). La amilosa es esencialmente un polímero lineal de alrededor de 1000 unidades de glucosa con enlaces α-1,4 de (constituye entre 15-30% de almidón común) (BeMiller, 2019). 1.2.3 Biomasa lignocelulósica La biomasa lignocelulósica es la fuente de crabono más abundante en la naturaleza; esta contiene cantidades variables de celulosa, hemicelulosa y lignina dependiendo del tipo de biomasa. La biomasa en general consiste entre 40 - 50% de celulosa, 25 - 30% de hemicelulosa; y 15 - 20% de lignina y otros componentes extraíbles (Figura 2). En conjunto, la celulosa y la hemicelulosa constituyen aproximadamente dos tercios del peso seco total de la biomasa, siendo los principales sustratos para el etanol (Menon & Rao, 2012). En la biomasa lignocelulósica, los polímeros de celulosa, hemicelulosa y lignina forman una matriz compleja, robusta y recalcitrante a la despolimerización. La recalcitrancia está asociada a las propiedades de la biomasa, e incluyen: la naturaleza cristalina de la celulosa, baja área de superficie disponible, lignina, y la naturaleza heterogénea de la biomasa (composición y estructura). 7 Figura 2. Ilustración de la estructura de lignocelulosa: celulosa, hemicelulosa y lignina 1.2.3.1 Celulosa La celulosa es el componente predominante de la biomasa lignocelulósica. La celulosa es un homopolímero lineal de glucosa unidas entre sí por enlaces glucosídicos -1,4. El dímero, dos residuos de glucosa con enlace -1,4, llamado celobiosa es la unidad repetitiva estructural de la celulosa. La celulosa contiene regiones cristalinas y amorfas. Por su parte, las fibrillas paralelas, alineadas y altamente ordenadas, son una propiedad característica de las moléculas de celulosa (región cristalina). La unidad fibrilar más pequeña (fibrilla elemental) tiene una sección transversal aproximada de 3,0-3,5 nm. Las fibrillas elementales, separadas por regiones menos ordenadas, están agrupadas formando microfibrillas con diámetros superiores a 25 nm (Nagarajan, Skillen, Irvine, Lawton, & Robertson, 2017). 8 El patrón de enlaces de hidrógeno entre las cadenas de celulosa difiere en la composición de las regiones cristalinas y amorfas, el enlace de hidrógeno inter-molecular O6-H-O3 es dominante en la forma amorfa, mientras que el O6-H-O2 es el principal enlace de hidrógeno inter-moleculares en la forma cristalina. Por otro lado, los enlaces intramoleculares de hidrógeno O3-H-O5 que existe entre las dos regiones, es responsable de la rigidez y forma lineal de las cadenas de celulosa. 1.2.3.2 Hemicelulosa La hemicelulosa es el componente más complejo de la pared celular de la biomasa vegetal. La hemicelulosa es un heteropolímero ramificado compuesto por diferentes monómeros de hexosas (-D-glucosa, -D-manosa, -D-galactosa) y pentosas (-D- xilosa, -L-arabinosa). Además, las cadenas de hemicelulosa pueden contener ácidos α– D–glucurónico, α–D–galacturónico y α–D–4–O–metilgalacturónico. La cadena principal de hemicelulosa está conformada por xilanos unidos por enlaces -1,4 de D-xilosa (90%, aproximadamente) y L-arabinosa (10%, aproximadamente) (Han, Guo, Liu, Xia, & Wang, 2019). La hemicelulosa tiene un bajo grado de polimerización (DP 80 – 200). Como resultado de su menor DP, también exhiben una menor estabilidad química y térmica y, en consecuencia, son más solubles y susceptibles a la hidrólisis. La composición de la fracción de la hemicelulosa (hexosas y pentosas) depende de la materia prima; la madera dura se compone principalmente de azúcares pentosas (xilosa y arabinosa), mientras que la madera blanda tiene una fracción mayor de azúcares hexosas (galactosa, manosa y glucosa) (Ajao, Marinova, Savadogo, & Paris, 2018). 9 1.2.3.3 Lignina La lignina está presente en la pared celular de las plantas; constituye una estructura rígida, impermeable y resistente a ataques microbianos y al estrés oxidativo. La lignina es un biopolímero aromático ramificado, complejo e hidrofóbico. Está compuesto principalmente por tres diferentes monómeros de fenilpropano o unidades de monolignol: alcohol p-coumaril, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico. La unidad de monolignol tiene una unidad de fenilpropano sustituida con un grupo (-OH) y metoxi (-OCH3), que se unen mediante enlaces para formar la estructura de la lignina (Van Dyk & Pletschke, 2012). 1.3 BIOETANOL DE PRIMERA GENERACIÓN El bioetanol de primera generación se produce directamente de cosechas que pueden ser utilizados para la alimentación humana o animal. Entre las ventajas de su producción se incluyen la accesibilidad a estos tipos de cultivos y la tecnología de transformación más simplificada. Sin embargo, presenta algunas desventajas que incluyen: el conflicto de uso ético-moral (cultivos para combustible o alimentación), uso intensivo de suelo, disminución de biodiversidad por mayores plantaciones destinadas a combustibles, entre otras (Naik, Goud, Rout, & Dalai, 2010). 1.3.1 Bioetanol a partir de fuente de azúcar Para la producción de etanol a partir de fuente de azúcar se ha investigado un sin número de materias primas, en función de mejorar la eficiencia y rentabilidad del proceso. Aproximadamente cerca del 40% de etanol se produce a partir de este tipo de fuente, siendo Brasil su principal productor a partir de caña de azúcar. A continuación se puede resumir el procedimiento tecnológico general: i) extracción de jugo de los cultivos de 16 Por otro lado, en condiciones alcalinas, ocurren reacciones de peeling lo cual produce la degradación de polisacáridos formando ácidos sacarínicos, así como ácidos láctico, fórmico, dihidroxi y dicarboxílico (Jönsson & Martín, 2016). Figura 3. Reacción de la lignocelulosa con NaOH (Soundarrajan, Vennison, Saraswathi, & Emmanuel, 2016) Pretratamiento con líquidos iónicos (IL) Los líquidos iónicos son disolventes orgánicos que están en estado líquido a baja temperatura (<100°C). Los ILs están compuestos por cationes orgánicos grandes y aniones inorgánicos pequeños. Los ILs no son volátiles, son termoestables (desde temperatura ambiente hasta 300°C) y tienen alta estabilidad química (da Costa Lopes et al., 2013). Los pretratamientos con ILs disuelven simultáneamente la lignina y los carbohidratos, los ILs forman enlaces de hidrógeno entre los protones hidroxilo del azúcar y los residuos no hidratados de los ILs con estequiometría 1:1; rompiendo la estructura de interacciones no covalentes de la lignocelulosa. Los pretratamientos con ILs son eficientes y no son tóxicos, sin embargo tienen un alto costo. El pretratamiento con IL implica mezclarlo con la biomasa en una proporción de 20:1 y luego calentarlo a 120°C durante 30 minutos. Posteriormente, se agrega agua desionizada a la mezcla para formar 17 una proporción de 5:1. La mezcla de IL/agua se filtra para separar la fracción sólida (Moniruzzaman & Goto, 2018). Pretratamiento con organosolvente Los pretratamientos con organosolvente generalmente utilizan un disolvente orgánico o mezclas de disolventes orgánicos con agua para la eliminación de lignina e hidrólisis de hemicelulosa llevando a una mejor digestibilidad enzimática de la fracción de celulosa. Los solventes comúnmente utilizados incluyen etanol, metanol, acetona y etilenglicol; además puede incluirse catalizadores como ácidos orgánicos e inorgánicos. Las temperaturas utilizadas pueden alcanzar los 200°C, sin embargo temperaturas más bajas pueden ser utilizadas dependiendo del tipo de biomasa y catalizador. El pretratamiento con organosolventes orgánicos actúa por ósmosis rompiendo y degradando los enlaces químicos internos de la celulosa y hemicelulosa, como resultado de este proceso, ambos polímeros son separados de la fracción de lignina (Zhao, Cheng, & Liu, 2009). 1.5.1.3 Pretratamiento físico - químico Pretratamiento con explosión de vapor La explosión de vapor (con o sin catalizador) es uno de los métodos físico-químicos más utilizados para los pretratamientos de biomasa lignocelulósica. Con este método, vapor de alta presión se inyecta en un reactor continuo o discontinuo que contiene la biomasa y se eleva la temperatura hasta 160-260°C (0,69 y 4,83 MPa). Finalmente la presión se reduce bruscamente produciendo una descompresión explosiva de la biomasa (fractura mecánica de las fibras) resultando en la degradación de la hemicelulosa y ruptura de la matriz de la lignina. Además, la alta temperatura y la alta presión destruyen los enlaces internos de hidrógeno y la región cristalina de la celulosa, promoviendo la transformación 18 de la hemicelulosa y la hidrólisis de lignina (Duque, Manzanares, Ballesteros, & Ballesteros, 2016). Pretratamiento AFEX El pretratamiento AFEX (ammonia fibre expansion) es una combinación de la explosión de vapor y tratamiento químico con álcali (amoniaco anhidro) a alta temperatura (90– 100°C) y alta presión (1–5,2 MPa) en un tiempo de reacción de aproximadamente 20 a 30 minutos. Después que ocurre el tratamiento en las condiciones antes indicadas la presión se libera rápidamente. Este método produce un cambio rápido de temperatura, después que se libera la presión, y el amoníaco que estaba atrapado en la biomasa se evapora. Este fenómeno físico produce un daño en la estructura, disminuyendo la cristalinidad de la celulosa, hidrolizando la hemicelulosa, despolimerizando la lignina e incrementando la porosidad, esto consecuentemente mejora la accesibilidad de la enzima (Bals, Rogers, Jin, Balan, & Dale, 2010). 1.5.1.4 Pretratamiento biológico El pretratamiento biológico involucra la utilización de hongos (Ceriporiopsis subvermispora, Pleurotus ostreaus, Ceriporia lacerata, Cyathus stercolerus, Pycnoporus cinnarbarinus, y Phanerochaete chrysosporium), y bacterias para degradar la lignina. El pretratamiento biológico de lignocelulosa presenta algunas ventajas como bajo consumo de energía y ausencia de contaminación. Sin embargo, el tiempo requerido es largo, y parte de la celulosa y hemicelulosa son utilizados como fuente de carbono para los hongos (Sharma, Xu, & Qin, 2017). 19 1.5.2 Sacarificación de polímeros de glucosa La sacarificación o hidrólisis es necesaria para convertir los polímeros de glucosa (almidón, celulosa y hemicelulosa) en azúcares fermentables. Los métodos utilizados pueden ser ácidos o enzimáticos, siendo los últimos los más utilizados. 1.5.2.1 Sacarificación de almidón La sacarificación del almidón consiste en la conversión bioquímica de las moléculas de amilosa y amilopectina para producir azúcares solubles. Esta hidrólisis ocurre en dos fases: licuefacción y sacarificación, en donde actúan las enzimas amilasas ( y ) y glucoamilasas, respectivamente. Las -amilasas (α-1, 4-glucano-glucanohidrolasa), degradan los enlaces glucosídicos -1,4 de la región central de la cadena de amilosa y amilopectina produciendo oligosacáridos. Las -amilasas (1, 4-α-D-glucano- maltohidrolasa; glicogenasa; amilasa sacarogénica) hidrolizan el penúltimo enlace -1,4 en los extremos no reductores de la cadena, resultando en moléculas de maltosa. Posteriormente, actúan las glucoamilasas hidrolizando los enlaces  – 1,4 y  - 1,6 liberando una molécula de glucosa a partir de los oligosacáridos producto de la licuefacción del almidón. La disponibilidad del almidón durante la hidrólisis enzimática depende de su estructura y esta a la vez influye el rendimiento de azúcar y consecuentemente el rendimiento final de etanol (Kumar & Singh, 2019). 1.5.2.2 Sacarificación de celulosa y hemicelulosa La sacarificación o hidrólisis de holocelulosa (celulosa y hemicelulosa) de la biomasa lignocelulósica es requerida para convertirla en azúcares solubles. En la mayoría de los pretratamientos de biomasa lignocelulósica, se producen dos fracciones: una sólida insoluble que contiene celulosa y lignina; y una líquida que contiene hemicelulosa y 20 azúcares. La conversión de la hemicelulosa depende de las condiciones de los pretratamientos, la hidrólisis completa produce azúcares monoméricos y la despolimerización parcial genera oligosacáridos. Por el contrario la mayoría de celulosa no sufre ningún cambio, por lo que se requiere de hidrólisis para la conversión a glucosa. La conversión de celulosa y hemicelulosa, puede ocurrir por vía química (ácidos) o enzimática. La hidrólisis ácida presenta inconvenientes como altas temperaturas de reacción, corrosión de equipos y principalmente producción de inhibidores de fermentación por la degradación de azúcares. Por lo tanto la hidrólisis enzimática ha prestado más interés (Rastogi & Shrivastava, 2017). La conversión de la celulosa y hemicelulosa mediante enzimas produce azúcares fermentables entre 45 – 55°C. Para ello se utiliza sistemas de complejos enzimáticos de celulasas y hemicelulasas (xilanasas). Las celulasas actúan sinérgicamente e incluyen a endo-glucanasas, exo-glucanasas y -glucosidasas. Las endo-glucanasas actúan aleatoriamente en los enlaces  – 1,4 glucosídicos de las cadenas D-glucano de las regiones amorfas de la celulosa, resultando en cadenas de extremos libres. Las exoglucanasas continúan la acción de las endoglucanasas sobre la misma cadena. La acción de la endo y exo-glucanasa liberan como el dímero de glucosa, la celobiosa. Finalmente la β-glucosidasa actúa convirtiendo la celobiosa en glucosa (Figura 4) (Patel, Chapla, & Shah, 2017). 21 Figura 4. Acción del complejo enzimático de celulasas Debido a la estructura compleja de la hemicelulosa su degradación requiere de un sistema múltiple enzimático que incluyen endo-xilanasa, exo–xilanasa, β–xilosidasa, α– arabinofuranosidasa, α–glucoronisidasa, acetil xilano esterasa y ácido ferúlico esterasa. Las endo y exo – xilanasas, actúan sobre las cadenas de xilanos generando cadenas más pequeñas. La β–xilosidasa ataca a los xilo-oligosacáridos produciendo xilosa. Por otro lado, las enzimas α–arabinofuranosidasa y α–glucoronisidasa actúan en el esqueleto del xilano resultando en la remoción de arabinosa y ácido 4-O-metilglucurónico, respectivamente. Las enzimas acetil xilano esterasa, actúan en las sustituciones de acetilo en los residuos de xilosa y las enzimas ácido ferúlico esterasa hidroliza los enlaces éster entre las sustituciones de arabinosa y ácido ferúlico (Figura 5) (Manju & Singh Chadha, 2011). 22 Figura 5. Acción del complejo enzimático de xilanasas 1.5.3 Fermentación La fermentación es un proceso metabólico que convierte azúcares solubles en etanol. Algunos microorganismos (bacterias y levaduras) son capaces de fermentar monosacáridos (glucosa y fructosa) y disacáridos (maltosa y sacarosa) resultando en la producción de etanol y dióxido de carbono. Los principales azúcares para la producción de etanol de primera generación son sacarosa (fuente de azúcar), glucosa y maltosa (fuente de almidón); mientras que para el etanol de segunda generación son hexosas y pentosas (biomasa lignocelulósica) (Lopes et al., 2016) . Un microorganismo etanologénico debe cumplir con algunas características, tales como, altas tasas de crecimiento en medios simples y baratos, alto rendimiento de etanol (> 90% teórico), tolerancia a una alta concentración de etanol (> 40,0 g/L), buena productividad de etanol (> 1,0 g/L/h) y alta tolerancia osmótica. Los microorganismos Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis han sido ampliamente utilizados para la obtención de etanol a partir de una gran variedad de fuentes de azúcar principalmente hexosas. Además, se han reportado microorganismos que fermentan pentosas como Pachysolen 23 tannophilus, Pichia stipitis, Kluyveromyces marxianus y Candida shehatae (Dasgupta, Ghosh, Bandhu, & Adhikari, 2017) (Lee, Jin, Cha, & Seo, 2017). La especie de levadura Saccharomyces cerevisiae presenta algunas características atractivas para la fermentación a etanol. Entre ellas podemos mencionar una mayor eficiencia de conversión de azúcares a etanol y alta tolerancia al mismo; capacidad de floculación (facilitando la separación de la biomasa celular después de fermentación) y finalmente es un microorganismo generalmente reconocido como seguro (GRAS) (Jansen et al., 2017). La glucólisis es la vía metabólica anaerobia utilizada por Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación. La glucólisis ocurre en el citoplasma de las células de levadura, y a partir de una molécula de glucosa se obtiene dos moléculas de piruvato. En ausencia de oxígeno, cada molécula de piruvato se reduce resultando en una molécula de etanol y una molécula de CO2 (Figura 6). Las dos moléculas de ATP producidas como ganancia neta a partir de la glucólisis siendo utilizadas para la biosíntesis de macromoléculas en el crecimiento celular. El balance de la utilización de la fuente de carbono y energía a partir de azúcares corresponde al 95% de azúcares metabolizados a etanol y CO2, 1 % convertido a materia celular de levaduras y 4%s es convertido en subproductos solubles (glicerol). A continuación se muestra la ecuación de la reacción de conversión de glucosa a etanol, a partir de esta se puede calcular el rendimiento teórico de etanol; 100 kg de glucosa pueden producir 51,1 kg de etanol y 48,8 kg de CO2 (Stanbury, Whitaker, & Hall, 2017). C6H12O6 + H2O + Levadura 2CO2 + 2C2H5OH + H2O + calor (100 Kg) (48,8 Kg) (51,1 Kg) (1700BTU) 24 Figura 6. Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae a partir de glucosa durante la fermentación La especie de bacteria Zymomonas mobilis, es otro microorganismo utilizado para la fermentación de etanol a partir de azúcares. Se ha reportado que Z. mobilis tiene una alta tolerancia a etanol, mayor consumo de glucosa y alto rendimiento de etanol. Sin embargo, tiene un limitado rango de sustratos. La bacteria Z. mobilis utiliza la vía metabólica Entner-Doudoroff para catabolizar glucosa a piruvato (Figura 7), a diferencia del metabolismo de S. cerevisiae, Z. mobilis tiene una ganancia neta de una molécula de ATP a partir de una molécula de glucosa, esto ocasiona una disminución en el rendimiento de biomasa celular, sin embargo el crecimiento celular y la fermentación no están relacionados en este tipo de bacterias (Cazetta, Celligoi, Buzato, & Scarmino, 2007). 25 Figura 7. Metabolismo de Zymomonas mobilis a partir de glucosa durante la fermentación. La utilización de microorganismos nativos en la fermentación de etanol presenta limitaciones en la optimización de un proceso a escala industrial. Los microorganismos S. cerevisiae y Z. mobilis utilizan sólo azúcares solubles como glucosa, fructosa y sacarosa para metabolizarlos a etanol, lo cual implica un paso previo para convertir los polímeros de carbohidratos (almidón, celulosa y hemicelulosa). Por otro lado, los microorganismos no tienen la capacidad de fermentar eficientemente ambos azúcares hexosas y pentosas a partir de celulosa y hemicelulosa, respectivamente (biomasa lignocelulósica). Para solucionar estos inconvenientes, se ha utilizado la tecnología del ADN recombinante, aumentando el rendimiento de azúcares y consecuentemente el etanol. Algunas cepas de levadura recombinantes han sido desarrolladas, tanto para convertir el almidón directamente en etanol (con co-expresión de enzimas amilolíticas) como para co-fermentar azúcares hexosas y pentosas; en ambos casos presentando altos rendimientos (Lee et al., 2017). 32 diferencia de los biocombustibles que provienen de una fuente renovable, la biomasa. Principalmente, la biomasa vegetal (de origen forestal, agrícola o urbano) es un material de interés debido a que son fuentes de carbono disponibles, que pueden emplearse con fines energéticos (An, Wilhelm, & Searcy, 2011; Azapagic & Stichnothe, 2011; Biofuels, the Green alternative, 2012; Brito Cruz, Souza, & Barbosa Cortez, 2014; Connelly, 2014). En la última década, la producción mundial de biocombustibles ha incrementado de 37429 a 84121 miles de toneladas equivalentes de petróleo, con un aumento anual de 3.5% en 2017, siendo el más rápido en los últimos tres años. Los principales biocombustibles producidos incluyen bioetanol y biodiesel de primera y segunda generación. En la actualidad los principales productores de bioetanol son Estados Unidos y Brasil con 58% y 26% de la producción mundial, respectivamente (“World Fuel Ethanol production,” 2017) Debido a que los biocombustibles de primera generación se obtienen de productos agrícolas con valor alimenticio estos han sido sujetos a polémica de índole social, económica y ética (Mohr & Raman, 2013; RFA, 2014). Por lo tanto los biocombustibles de segunda generación aparecen como una alternativa para la producción de bioetanol y otros derivados con valor agregado en la optimización y aprovechamiento de residuos agrícolas e industriales. Sin embargo, la producción industrial de biocombustibles de segunda generación también han presentado desventajas que incluyen i) proceso complejo que requiere múltiples pasos incluyendo pretratamiento, sacarificación enzimática y fermentación (recalcitrancia de lignocelulosa), ii) fermentación de azúcares pentosas derivados de hemicelulosa, iii) altas dosis de enzimas, iv) alta concentración de solidos (lodos celulósicos), y v) tiempo de producción. Por ello, se hacen esfuerzos en la investigación de estrategias que ayuden a superar los factores que desafían la aplicación competitiva en costos de la tecnología de etanol de segunda generación. 33 Estados Unidos tiene la mayor capacidad instalada para la producción biocombustible de segunda generación, seguido de China, Canadá, Unión Europea (UE) y Brasil. Los proyectos de producción comercial en estos países varían significativamente tanto en sus enfoques tecnológicos como en las materias primas utilizadas. En el año 2014, se evidenció un incremento en la producción de bioetanol de segunda generación. Las empresas Abengoa, Dupont, POET-DSM y Quad County Corn Processors fueron los pioneros en la producción industrial de bioetanol de segunda generación (RFA, 2014). A nivel mundial una gran cantidad de biomasa residual lignocelulósica se genera. Siendo la celulosa, considerada uno de los biopolímeros más abundantes del planeta, esta es una fuente importante de carbono para ser utilizada en la producción de biocombustibles. La caña de azúcar es uno de los principales cultivos a nivel mundial. Actualmente es cultivada por más de 100 países en aproximadamente 26 millones de hectáreas en el mundo, en donde se producen aproximadamente 1.8 billones de toneladas de caña (FAO, 2013). El aumento en el cultivo de caña de azúcar se debe principalmente a la alta demanda de azúcar tanto para el consumo alimentario como para la producción de bioetanol. Una tonelada de la caña que se procesa en una planta produce aproximadamente 0.3 toneladas (húmedo) de bagazo de caña. El bagazo es el residuo fibroso de los tallos de la caña de azúcar de los procesos de refinamiento de azúcar (Hofsetz & Silva, 2012). El bagazo de caña de azúcar se compone de 48 % de celulosa, 31 % de hemicelulosa (principalmente xilosa y galactosa) y un 19 % de lignina, aproximadamente. El bajo contenido de cenizas (alrededor de 2-3 %) y el rendimiento de masa/área de cultivo (aproximadamente 80 toneladas/hectárea) en comparación con otros residuos de cosechas generan ventajas competitivas en los procesos tecnológicos para producción de energía y/o bio-productos. Por lo tanto, la valorización de este tipo de residuo lignocelulósico 34 junto con la aplicación de nuevas tecnologías de aprovechamiento energético son potenciales para la obtención de biocombustibles de segunda generación. 1.8 OBJETIVOS Este trabajo apunta a la optimización de los procesos involucrados en la producción de etanol celulósico mediante el empleo de una nueva estrategia que implica la obtención de mostos concentrados gracias a un proceso de pre-digestión de la biomasa, seguido de sacarificación y fermentación simultánea. A esto se incorpora además un proceso de fermentación continua, lo que redundará en la mayor eficiencia en la producción de etanol reflejado en mayores contenidos de etanol; la reducción del tiempo de producción de etanol; la optimización del espacio en fermentadores por el empleo de cultivos continuos; el ahorro de enzimas; y, la consecuente optimización en los costos de producción. Para cumplir el objetivo general de la tesis, se ha planificado la investigación en tres fases experimentales: Selección de una cepa de levadura con habilidades de fermentación para producción de etanol celulósico, determinación y establecimiento de las condiciones más adecuadas de pretratamiento del bagazo de caña de azúcar en función de los rendimientos que se obtengan tanto en sacarificación, como en fermentación y el diseño de un nuevo proceso con mejor rendimiento para la producción de etanol celulósico con miras a escalamiento industrial. A continuación se describen los objetivos específicos:  Determinar la fuente y concentración óptima de nitrógeno requerida por levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae para procesos de fermentación de etanol  Evaluar la dominancia en co-cultivos de diferentes cepas de levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae con reutilización de biomasa celular. 35  Determinar el efecto de la reutilización de biomasa celular en co-fermentaciones discontinuas (batch) con diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae.  Estudiar la cinética de fermentación en batch y el rendimiento de etanol, con las mejores condiciones pre-establecidas de concentración de nitrógeno.  Seleccionar una cepa de levadura en función de las características más adecuadas para procesos de fermentación: dominancia y mejor rendimiento de producción de etanol  Determinar el efecto de diferentes catalizadores, temperaturas, tiempos de reacción y sistemas de calentamiento en los pretratamientos de biomasa lignocelulósica  Definir las condiciones más adecuadas de pretratamiento de biomasa lignoceluósica en relación a la sacarificación de polímeros y fermentación de azúcares solubles  Establecer un modelo completo y estandarizado del proceso de sacarificación y fermentación simultánea semi-continua (SFSS) 36 2. MATERIALES Y MÉTODOS En esta sección se resumen los materiales, equipos y softwares utilizados en la presente investigación. Además, se detallan las técnicas de caracterización, procesos y ensayos; y métodos de análisis estadísticos, entre otros. Todo lo mencionado anteriormente conforma la parte metodológica y experimental utilizada en el desarrollo de la tesis 2.1 MATERIALES 2.1.1 Reactivos  Enzimas Cellic® CTec2 y HTec2 donadas por Novozymes  Hidróxido de sodio, NaOH (No. CAS 1310-73-2; ≥97%) de Sigma Aldrich  Ácido sulfúrico, H2SO4 (No. CAS 7664-93-9; 98%) de Merck  Ácido maleico, C4H4O4 (No. CAS 110-16-7) de Merck  Ácido oxálico, H2C2O4 (No. CAS 144-62-7) de Merck  Dióxido de titanio, TiO2 (No. CAS 1317-70-0, anatase, 99.7%)  Ácido fosfórico, H3PO4 (No. CAS 7664-38-2; 85%) de Panreac  Sulfolane, C4H8O2S (No. CAS 126-33-0; 99%) 2.1.2 Equipos  Espectrofotómetro Spectronic Helios Beta de Thermo Fisher Scientific  Microscopio de contraste de fases Olympus BX51  Termociclador Techne TC-412  Cámara de electroforesis Enduro de Labnet 37  NanoDrop 2000c de Thermo Scientific  Cromatógrafo líquido de alta eficiencia (HPLC) de Agilent con una columna Rezex ROA-Organic acid H+. Condiciones: 79°C; fase móvil: H2SO4 0.005 N; flujo: 0.6 mL·min-1)  Termobloque de VWR Scientific products  Incubadora con agitación horizontal Labnet 311DS  Ultracentrífuga Sorvall RC6  Microcentrífuga Sigma 1-15K  Molino de bolas Retsch MM400  Reactor de Presión Parr 4848  Espectrómetro FTIR Nicolet iS50 de Thermo Scientific equipado con un sistema de reflexión Total Atenuada (ATR) de diamante  Reactor de presión de Biorrefinería CNIB-PUCE  Bioreactor Bioflo & Celligen 310 de New Brunswick Scientific  Microondas Milestone Ethos-One  Sonicador model CSA 20-S500 2.1.3 Softwares  IBM SPSS 38 2.2 SELECCIÓN DE LEVADURAS PARA FERMENTACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL CELULÓSICO 2.2.1 Cepas de Levaduras Se trabajó con 150 aislados de levaduras de Saccharomyces cerevisiae provistas por la Colección de Levaduras Quito Católica. Estas levaduras incluyeron principalmente aislados de levaduras relacionadas a bebidas fermentadas, levaduras recuperadas de vasijas arqueológicas (método utilizado RHM, secreto industrial PUCE), levaduras comerciales (vino, cerveza y destileras) y levaduras aisladas a partir de sustratos naturales (insectos, material vegetal, suelo, cuerpos de agua y material en descomposición). 2.2.2 Identificación de levaduras a nivel de especie Las levaduras fueron caracterizadas a nivel de especie mediante técnicas moleculares: se utilizó la técnica de RFLPs de la región ITS del ADN ribosomal. 2.2.2.1 Extracción de ADN Para la extracción de ADN, se resuspendió la biomasa celular obtenida a partir de un cultivo de 48 horas (medio YPD) en 500 µL de tampón de lisis (Tris 50mM, NaCl 250 mM, EDTA 50 mM pH8, SDS 0,3% y aforar con agua a 200 mL) y 0,4 g de microesferas de vidrio. La mezcla se agitó durante 3 minutos en vórtex a máxima velocidad y se incubó a 65°C por 1 hora. Luego, la mezcla se agitó nuevamente por 3 minutos y se centrifugó a 7000 rpm por 15 minutos. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se conservó el ADN a -20°C. 39 2.2.2.2 Amplificación de la región ITS del ADN ribosomal Se amplificó la región ITS (gen 5,8S y los espaciadores ITS1 e ITS2) (Figura 10). El amplificado se digirió con tres enzimas de restricción (HhaI, HaeIII y HinfI). El perfil de digestión obtenido permitió identificar las especies de acuerdo al patrón específico de cada especie (Sanguandeekul, Chanprasartsuk, & Prakitchaiwattana, 2018). Con el objetivo de confirmar el género y determinar la especie de los aislados de levaduras se realizó la amplificación de la región ITS con los primers ITS1 (5´-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3) e ITS4 (5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´). Para la amplificación de la región ITS se preparó un mix con volumen final de 50 µL que contenía: 1X de tampón Go Taq Reaction, 1,5 mM de MgCl2, 0,8 mM de dNTPs, 0,3 uM de cada primer, 2 U de taq polimerasa, 28,1 µL de agua libre de nucleasa y 30 ng de ADN molde. Las condiciones de la PCR fueron: una desnaturalización inicial de 94°C por 5 minutos, seguida de 40 ciclos a: 93°C por 1 minuto, 55°C por 2 minutos, 72°C por 2 minutos; y una extensión final a 72°C por 10 minutos. 2.2.2.3 ITS-RFLPs La región amplificada ITS se digirió independientemente con las enzimas de restricción: HhaI (5´GCG C 3´), HaeIII (5´GG CC 3´) y HinfI (5´G ANTC 3´). El mix de digestión que contiene 10 µL de producto de PCR, 4X de tampón de React®2, 8U de la enzima respectiva y 2,2 µL de agua libre de nucleasa fue incubado a 37°C por 8 horas. Para identificar las levaduras a nivel de especie, el tamaño del amplificado de la región ITS junto con los tamaños de los fragmentos obtenidos de la digestión con enzimas de restricción se compararon con la base de datos de la Colección de Levaduras Quito Católica, CLQCA (www.cnib.com.ec). 40 La amplificación del ITS junto con los fragmentos de digestión se evidenciaron en geles de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio (8,5 ug/mL). El ladder de ADN 100 bp fue utilizado como escalera de pesos moleculares. Los geles fueron visualizados en transiluminador UV y procesados en un sistema de fotodocumentación. Figura 10. Región ITS del ADN ribosomal, que comprende gen 5.8S y espaciadores intergénicos ITS1 e ITS2 2.2.3 Pruebas de asimilación y fermentación de azúcares Las pruebas de asimilación y fermentación de azúcares permitieron evaluar la capacidad de degradación de diferentes azúcares y especialmente su habilidad para fermentarlos. Los sustratos probados fueron: glucosa, xilosa, sacarosa, galactosa, fructosa, lactosa, rafinosa y maltosa. Las pruebas se hicieron en tubos de 10 mL con tapa rosca, los cuales contenían una campana Durham invertida para colectar el CO2 desprendido durante la fermentación. El medio contenía 20 g/L de cada azúcar y 6,7 g/L de YNB (Yeast Nitrogen Base). Este medio fue inoculado con 10 µL de un pre-cultivo de levadura en crecimiento exponencial. 41 La respuesta de asimilación se determinó en base a la turbidez generada por el crecimiento de las levaduras, mientras que la fermentación se determinó en base al CO2 desprendido. En ambos casos, la asimilación y la fermentación de azúcares se evaluó a los 3, 7, 14 y 21 días. En donde se realizó un análisis del comportamiento de las levaduras para poder determinar el grado de respuesta: (+) positivo, (S) positivo lento, (W) positivo débil, (L) positivo retardado y (-) negativo (Kurtzman, C, Fell, J, & Boekhout, T, 2010). Adicionalmente, se evaluó la respuesta de asimilación y fermentación de cada cepa a las 24 horas de la prueba. Esto nos permitió seleccionar aquellas levaduras de rápida respuesta en asimilación y fermentación de azúcares (glucosa) 2.2.4 Efecto de la fuente y concentración inicial de nitrógeno en el perfil de consumo de glucosa de S. cerevisiae Para este estudio se trabajó con cuatro cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae: CLQCA–INT–001, CLQCA–INT–005 y CLQCA–10–099 provistas por la Colección de Levaduras Quito Católica del Ecuador (CLQCA) y UCLM 325 provista por el Laboratorio de Biotecnología de Levaduras de la Universidad de Castilla la Mancha. Estas levaduras fueron escogidas entre 150 cepas de Saccharomyces cerevisiae; en relación a su habilidad fermentativa a las 24 horas. Para la preparación del inóculo de levaduras, en un matraz de fermentación de 250 mL se agregó 100 mL de medio de cultivo (glucosa 50 g/L, peptona 10 g/L y extracto de levadura 10 g/L) y 2 asadas de colonias de cada cepa de Saccharomyces cerevisiae a partir de cajas de Petri con medios de cultivo sólidos (YPD). Los matraces fueron incubados a 30°C, con agitación continua a 200 rpm durante 48 horas. Para la formulación de los medios, se probó diferentes fuentes y concentraciones de nitrógeno: fosfato de amonio (1 y 2 gN/L), amoníaco (1 y 2 gN/L) e hidrolizado de 48 2.5 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA FRACCIÓN DE HOLOCELULOSA DE BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR La hidrólisis enzimática libera azúcares fermentables a partir de los polisacáridos de celulosa y hemicelulosa. Para ello se utiliza complejos enzimáticos de celulasas y hemicelulasas. Se utilizaron las enzimas Cellic®Ctec2 y Htec2 de Novozymes. El complejo enzimático de Ctec2 incluye: celulasas (exo y endoglucanasas), -glucosidasas y hemicelulasas. Mientras que el complejo de Htec2 está conformado por endoxilanasas. Ambas, Ctec2 y Htec2 actúan sinérgicamente, mejorando la hidrólisis de la celulosa. La hidrólisis enzimática se llevó a cabo en frascos de 100 mL, se adicionó biomasa seca y tampón citrato de sodio 0,05 M a pH 4,5, en un relación líquido a sólido; 1,5:10. Finalmente, se adicionó a la mezcla 10 FPU de Ctec2 y el 20% del volumen total de Ctec2 se agregó de Htec2. La reacción se incubó a 55°C, siendo esta la temperatura óptima de acción de ambos complejos enzimáticos, con una agitación de 200 rpm por 72 horas. El hidrolizado (fracción líquida) fue recuperado por centrifugación a 5000 rpm por 10 minutos. Finalmente el hidrolizado, fue almacenado en congelación. Para el análisis del hidrolizado por HPLC, una alícuota de 1 mL fue nuevamente centrifugada (10000 rpm por 5min), filtrada (0,22 µm) y diluida en fase móvil (H2SO4). Mediante HPLC se cualificó y cuantificó azúcares como glucosa, celobiosa y celotriosa; como productos de la hidrólisis de la celulosa; y xilosa como producto de la hidrólisis de la hemicelulosa. El rendimiento de sacáridos a partir del hidrolizado de bagazo de caña de azúcar pretratado se calculó con la ecuación 4. Rendimiento de sacáridos (%)=(Cglucosa×0.9 Celulosa +Cxilosa×0.88 Hemicelulosa)×fracción sólida Csustrato ×100 Ecuación 4 49 Donde: Cglucosa: concentración de glucosa en el hidrolizado (en g/L) Cxilosa: concentración de xilosa del hidrolizado (en g/L) 0,9: factor de conversión de glucano a glucosa 0,88: factor de conversión de xilano a xilosa Csustrato: concentración de sustrato (en g/L) Celulosa: composición inicial en el bagazo de caña de azúcar (en g/g) Hemicelulosa: composición inicial en el bagazo de caña de azúcar (en g/g) 2.6 FERMENTACIÓN EN BATCH Todos los procedimientos se realizaron en condiciones de esterilidad para evitar contaminación. El material utilizado en la fermentación se autoclavó a 121°C por 15 minutos. La cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae CLQCA-INT-005 fue utilizada en la fermentación. La levadura fue sembrada en medio sólido YM (Yeast malt) e incubada a 30°C por 72 horas. Posteriormente se inoculó una colonia en un frasco con 50 mL de medio líquido YPD e incubó a 30°C a 200 rpm por 48 horas. Las células de levadura fueron aclimatadas en el medio de hidrolizado de bagazo de caña de azúcar por un período de 96 horas. Se realizaron cultivos sucesivos de las células de levadura en medios líquidos de YPD e hidrolizado; se utilizó proporciones crecientes graduales de hidrolizado (25% a 100%) cada 24 horas, y se incubaron a 30°C en agitación a 200 rpm. Finalmente, la biomasa de células de levadura se lavó por centrifugación (5000 rpm por 5 minutos) con agua destilada estéril. 50 La fermentación se realizó en tubos con 5 mL de hidrolizado de bagazo de caña de azúcar y 0,67% (p/v) de YNB (Yeast Nitrogen Base) como suplemento de fuente de nitrógeno. Este medio de cultivo (hidrolizado + fuente de nitrógeno) se esterilizó por filtración; para ello se utilizó un filtro millipore de 0,22 µm. A esta mezcla se inoculó 1×108 células/ mL de levadura de S. cerevisiae previamente aclimatada. La incubación se llevó a cabo a 30°C, a 100 rpm por 72 horas. Finalmente, el producto de fermentación fue centrifugado (7000 por 10 minutos), y la fracción líquida se recuperó para el análisis por HPLC. Para el análisis del producto de fermentación por HPLC, una alícuota de 1 mL fue nuevamente centrifugada (10000 rpm por 5 min), filtrada (0,22 µm) y diluida en fase móvil (H2SO4). Mediante HPLC se cualificó y cuantificó el etanol como producto de la fermentación. El rendimiento de etanol teórico se calculó con la ecuación 5. Rendimiento de etanol (%)=( Cetanol 0.51×Cglucosa)×100 Ecuación 5 2.7 SISTEMA DE FERMENTACIÓN SEMI-CONTINUO ACOPLADO A SACARIFICACIÓN SIMULTÁNEA (SFSS) El sistema de SFSS permite aumentar el rendimiento de etanol con menor tiempo de operación y costos de producción. Por lo tanto, para la producción de etanol celulósico fue necesario optimizar todas las fases del proceso incluyendo: pretratamiento de biomasa lignocelulósica, sacarificación de polisacáridos y fermentación de azúcares solubles (principalmente glucosa). Una vez determinadas las condiciones óptimas de operatividad se propone el sistema SFSS como una alternativa de producción de etanol celulósico a escala industrial. 51 2.7.1 Pretratamiento de biomasa lignocelulósica Una vez determinadas las condiciones óptimas de pretratamiento en el laboratorio se escaló a planta piloto en la Biorrefinería del Centro Neotropical para Investigación de la Biomasa de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (CNIB-PUCE) (Figura 11). El bagazo de caña de azúcar fue cortado y molido, con molino de martillos y discos de piedra, respectivamente. El polvo obtenido fue directamente agregado en el reactor de presión (400 L, volumen de capacidad). El catalizador utilizado para el pretratamiento fue NaOH (1%, p/v). La solución de NaOH fue preparada en una tolva (400 L), y luego se agregó al reactor de presión en una relación sólido a líquido de 1:10. El sistema de calentamiento del reactor es por aceite térmico, el mismo que es calentado en un caldero a 200°C. El equipo emplea un control PID y sensores de temperatura lo cual evita fluctuaciones de temperatura que puedan interferir en el proceso. Una vez alcanzada la temperatura de reacción (160°C) se contabilizó el tiempo de reacción (20 minutos). El producto del pretratamiento alcalino de bagazo de caña de azúcar, fue transferido a un filtro prensa mediante un sistema de bombas neumáticas. La fracción sólida fue separada de la líquida por filtración y fue lavada con agua destilada hasta alcanzar pH neutro. La biomasa fue secada y molida hasta obtener partículas menores de 100 µm. 52 Figura 11. Plano isométrico de la biorrefinería CNIB-PUCE 2.7.2 Pre-hidrólisis enzimática Un paso de pre-hidrólisis es requerido para aumentar la carga de sólidos en un proceso de sacarificación enzimática. El bagazo de caña de azúcar pretratado fue añadido en frascos en conjunto con una solución de tampón citrato 0,05 M (pH 4,5). Además, se agregó 6 FPU de la enzima Cellic ® Ctec2 y Htec2 (que constituyó el 20% del volumen de la celulasa incorporada a la mezcla). La primera carga de sólidos (10%, p/v) fue incubada a 55°C con agitación (200 rpm) por 4 horas. Luego, la segunda carga de sólidos fue agregada a la mezcla, alcanzando el 25% de sólidos totales. 2.7.3 Acondicionamiento del sistema de fermentación semi-continuo acoplado a sacarificación simultánea (SFSS) El sistema de SFSS fue llevado a cabo en un biorreactor de 2 litros en condiciones estables de temperatura, agitación y pH; 30°C, 100 rpm y pH 4,5, respectivamente. Se añadió 1 litro de hidrolizado de bagazo de caña de azúcar con un cultivo iniciador de levaduras aclimatadas de S. cerevisiae (1×108 células/mL). Cada 24 horas, el 10% del volumen 53 total fue retirado del biorreactor e inmediatamente fue alimentado el sistema con el 10% de prehidrolizado de bagazo de caña de azúcar, completando el volumen final. Se estableció la cinética de producción de etanol y consumo de glucosa por un período de 30 días. Para ello, una alícuota del producto de sacarificación y fermentación simultánea fue centrifugado, filtrado y analizado por HPLC, para determinar la concentración de etanol; y glucosa u otros sacáridos. Se presenta un esquema del proceso de SFSS en la Figura 12: Figura 12. Esquema general del proceso SFSS 2.8 MÉTODOS ANALÍTICOS 2.8.1 Determinación de azúcares reductores totales (TRS) El método de Miller es el más conocido para la cuantificación de azúcares reductores (total reducing sugar, TRS). Este es un método colorimétrico, que en determinadas condiciones el ácido 3,5 – dinitrosalicílico, DNS (color amarillo) es reducido a 3-amino, 5-nitrosalicílico (pardo oscuro) en presencia de azúcares reductores (azúcares con grupos carbonilos libres). Este cambio de color se usa para cuantificar los azúcares reductores mediante espectrofotometría UV-VIS a 540 nm. La curva de calibración se realiza con diluciones del estándar de glucosa, y relaciona la absorbancia con la concentración de azúcares. El reactivo de DNS se preparó según la bibliografía. En un tubo se mezclan 2 mL de la disolución de la muestra con 2 mL del reactivo de DNS, luego se incuba en un baño maría 54 en ebullición por 10 minutos e inmediatamente se sumerge el tubo en un baño de hielo. Finalmente se agrega 10 mL de agua destilada. La absorbancia de la solución fue medida a 540 nm. El rendimiento de TRS se calculó con la siguiente ecuación 6: TRS (%)= Concentración of TRS (g∙L−1) Concentración de biomasa inicial (g∙L−1) ×100 Ecuación 6 2.8.2 Análisis de HPLC La cromatografía líquida de alta eficiencia es una técnica utilizada para separar componentes de una mezcla. La separación cromatográfica es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra (que es llevada por una fase móvil) y una fase estacionaria empaquetada dentro de una columna. Los productos de hidrólisis enzimática y fermentación fueron analizados por un equipo de HPLC marca Agilent Technologies, 1200 Series, que tiene una bomba cuaternaria, automuestreador, horno de columna con control de temperatura y detector de índice de refracción. La columna de intercambio iónico utilizada fue Rezex ROA-Organic Acid H+. El análisis por HPLC se realizó con una solución de H2SO4 0,005 N como fase móvil. Las condiciones de operación fueron las siguientes: 79°C y flujo de 0.6 mL/min. El volumen de muestra inyectada fue de 10 µL y el tiempo de corrida fue de 30 minutos. Los compuestos fueron identificados por su tiempo de retención específico y la concentración fue cuantificada en relación a la curva de calibración realizada con los estándares de glucosa, xilosa, celobiosa, celotriosa, celodextrina, etanol, glicerol, ácido acético y ácido láctico. 55 2.8.3 Análisis de ATR-FTIR Un análisis vibracional del bagazo de caña de azúcar con y sin pretratamiento se realizó con un espectrómetro FTIR (Thermo Scientific, Nicolet iS50 (Waltham, MA, USA) equipado con un sistema de diamante de reflexión total atenuada (ATR). El espectro fue colectado en el rango de 400-4000-1 con una resolución de 1 cm-1 a temperatura ambiente; un total de 64 scans fue co-añadido, y el interferograma resultante fue promediado. Este método provee información acerca de enlaces químicos y la estructura molecular del material. 2.8.4 Análisis estadístico Se realizó ANOVA para la sacaraficación enzimática, fermentación y SFSS; y la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 0.05. 56 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En este apartado se presentan los resultados de la investigación. En el escalamiento de procesos a nivel industrial para la producción de bioetanol (principalmente de segunda generación), continuamente se busca superar las barreras de producción enfocándose en el pretratamiento de la biomasa lignocelulósica y fermentación de azúcares solubles. En ambos casos, es necesario encontrar soluciones en relación a la operatividad y costos de producción que hagan el proceso más viable. Con lo mencionado anteriormente, los resultados de este estudio muestran las condiciones de pretratamientos más adecuados en función del incremento de la digestibilidad enzimática de los polímeros de celulosa resultando en el mejoramiento de los rendimientos de sacáridos. Por otro lado, se seleccionó una cepa de Saccharomyces cerevisiae con las características más óptimas que incluyen mejores rendimientos de etanol, adaptación y dominancia en co-cultivos, lo cual garantiza las habilidades de producción de etanol y una fuerte implantación en procesos de fermentación. Finalmente, una vez establecidas las condiciones de pretratamiento y fermentación, se propone un sistema estable y eficiente en la producción continua de bioetanol. 3.1 SELECCIÓN DE LEVADURAS PARA PRODUCCIÓN DE ETANOL CELULÓSICO Uno de los objetivos del estudio es la selección de las levaduras más aptas y con mayor desempeño en la producción de etanol con el fin de utilizarla en la estrategia de sacarificación y fermentación simultánea en cultivo semi-continua SFSS propuesta en este estudio. 57 3.1.1 Identificación molecular a nivel de especie de levaduras Este estudio se basó principalmente en levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae. Por lo tanto su identificación es el primer paso para posteriores pruebas de fermentación. A pesar de que la bibliografía reporta a levaduras de Saccharomyces cerevisiae como microorganismos con gran poder fermentativo, existen diferencias entre sus habilidades fermentativas y desempeño en la producción de etanol. Estas diferencias se dan en parte por la fisiología de la levadura que está determinada por la variabilidad genética de las cepas. El análisis de ITS-RFLPs mostró el perfil de fingerprinting de los 150 aislados de levaduras (Figura 13). Todos coincidieron con los perfiles de la base de datos de la CLQCA, correspondiendo a la especie de Saccharomyces cerevisiae: los resultados mostraron una variación de 10 – 20 pb (pares de bases) en algunos casos. A continuación se muestra el patrón de bandas y el tamaño de la región ITS amplificada y los fragmentos generados por la digestión con enzimas de restricción. Figura 13. Perfil de restricción de la región ITS. Carril 1: Ladder 100 pb; carril 2: Región ITS (800 pb); carril 3: Digestión de ITS con la enzima HhaI (390 pb, 380 pb, 270 pb); 64 3.1.3 Efecto de la fuente y concentración inicial de nitrógeno en el perfil de consumo de glucosa de S. cerevisiae El primer factor que se analizó fue la fuente de nitrógeno utilizada por las levaduras. La fuente de carbono fue glucosa, y la concentración utilizada fue de 100 g/L en todas las pruebas. Las variables estudiadas fueron fuente y concentración de nitrógeno: fosfato de amonio (1 y 2 gN/L), amoníaco (1 y 2 gN/L) e hidrolizado de levadura (0,5; 1; 1,5; 2 y 2;5 gN/L). Se trabajó con cuatro cepas de levadura de la especie S. cerevisiae: CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001, CLQCA-INT-005 y UCLM325, las mismas que fueron seleccionadas en estudios previos por su rápida respuesta de fermentación. El análisis estadístico indica que hay diferencias significativas referentes a la fuente de nitrógeno utilizada. Las fuentes de nitrógeno que incluyen al fosfato de amonio y amoníaco, muestran ser menos eficientes cuando son añadidas a un medio de fermentación, provocando en las levaduras menor consumo de glucosa. En todos los casos, al aumentar la concentración de la fuente de nitrógeno, se observa un incremento en el consumo de glucosa, lo cual indica que la concentración de nitrógeno si influye en el metabolismo celular de la levadura (Tabla 3). Por otro lado, la adición de hidrolizado de levadura al medio de fermentación evidenció un mayor consumo de glucosa entre 78,2 y 99,9%. En este caso, no se observan diferencias significativas en la concentración de nitrógeno adicionadas al medio, lo cual indica que se podría utilizar la concentración mínima de nitrógeno probada (0,5 gN/L) siendo aún eficiente para el consumo de glucosa. El comportamiento de cada cepa de levadura de S. cerevisiae también fue demostrado. Las tres cepas CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001 y CLQCA-INT-005 fueron muy 65 similares en su capacidad de consumo de glucosa frente a las diferentes fuentes y concentraciones de nitrógeno. Por el contrario, la cepa UCLM 325, mostró ser menos eficiente. Esto responde al hecho, de que las cepas de levadura a pesar de pertenecer a la misma especie tienen diferentes requerimientos nutricionales y habilidades metabólicas. En un estudio similar, donde se evaluaron diferentes fuentes únicas de nitrógeno que incluían extracto de levadura, urea y sulfato de amonio a diferentes concentraciones en medios de fermentación; reportan que un suministro adecuado de nutrientes, incluido el nitrógeno, beneficia el crecimiento y mantiene la viabilidad de las células de levadura. Por lo tanto, el uso de una fuente y concentración de nitrógeno adecuada puede aumentar el metabolismo fermentativo (consumo de glucosa, rendimiento de etanol y eficiencia de fermentación) (Z. Li, Wang, & Shi, 2017). Otro estudio, coincide con lo mencionado anteriormente, en donde la adición de hidrolizado de levadura mejora la viabilidad celular, estimulando la tasa de fermentación y la producción de etanol (Bafrncová, šmogrovičová, Sláviková, Pátková, & Dömény, 1999). Esto también demuestra que el hidrolizado de levadura, proporciona polisacáridos, componentes de ácido nucleico y vitaminas que también pueden mejorar los procesos de fermentación. De esta manera se mejoran las condiciones óptimas para el crecimiento de la levadura y consecuentemente la fermentación. Estos resultados coinciden con los obtenidos en este estudio, que muestran que la adición de una fuente de nitrógeno asimilable en un proceso de fermentación es fundamental para el metabolismo del azúcar. 66 Tabla 3. Efecto de diferentes fuentes y concentración de nitrógeno en el consumo de glucosa de levaduras Consumo de glucosa (%) Fuente de nitrógeno UCLM 325 CLQCA-INT-001 CLQCA-10-099 CLQCA-INT-005 Fosfato de amonio, 1 gN/L 12,71,65 36,12,26 33,10,89 37,90,09 Fosfato de amonio, 2 gN/L 15,41,47 36,51,58 36,51,56 41,71,45 Amoníaco, 1 gN/L 5,91,42 18,30,71 14,20,79 24,31,63 Amoníaco, 2 gN/L 9,81,47 19,30,71 16,61,56 26,20,47 Hidrolizado de levadura, 0,5 gN/L 78,22,5 99,30,83 99,50,49 99,70,24 Hidrolizado de levadura, 1 gN/L 79,63,1 99,80,13 99,20,81 99,60,46 Hidrolizado de levadura, 2 gN/L 80,62,9 99,30,93 99,60,47 99,90,18 Hidrolizado de levadura, 2,5 gN/L 83,90,3 99,60,64 99,70,20 99,90,08 3.1.4 Concentración mínima de nitrógeno requerida para la fermentación El segundo factor que se analizó fue la concentración mínima de nitrógeno requerida para el consumo eficiente de glucosa. La concentración fue establecida en referencia al valor mínimo utilizado en la prueba anterior con hidrolizado de levadura. Para ello, se realizaron pruebas de fermentación con 0,2; 0,3 y 0,4 g N/L de hidrolizado de levadura. Este estudio es importante, considerando que el nitrógeno es una limitante en los mostos obtenidos a partir de biomasa lignocelulósica, y los costos de esta fuente influyen en la viabilidad económica del proceso en general. El estudio del efecto de la concentración de nitrógeno en el perfil de fermentación de las levaduras conllevará a la adición mínima de esta fuente sin que afecte el metabolismo de la levadura. 67 Figura 14. Glucosa consumida por diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae después de 24 horas de fermentación a diferentes concentraciones de hidrolizado de levadura (0; 0,2; 0,3 y 0,4 gN/L) Los resultados muestran que el consumo de glucosa es directamente proporcional con el incremento de la concentración de nitrógeno adicionado al medio, siendo más eficiente a 0,4 gN/L (Figura 14). Después de 24 horas de fermentación, las cepas de levadura CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001 y CLQCA-INT-005 muestran mayor consumo de glucosa 97,8%, 97,3 y 98,6%, respectivamente, en comparación con la cepa de levadura UCLM 325 con un consumo de glucosa de 88,3%. Estos resultados son similares a los presentados en la sección anterior, esto indica que los requerimientos de nitrógeno pueden estar relacionados fuertemente con la fisiología de la cepa de levadura, lo cual indica un grado de susceptibilidad a bajas concentraciones de nitrógeno además de necesidades específicas de esta fuente. En este sentido, se podría decir que las cepas CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001 y CLQCA-INT-005 tienen una baja demanda de nitrógeno, lo cual indica que estos niveles de concentración no afecta al metabolismo fermentativo de las levaduras; lo contrario ocurre con la cepa de levadura UCLM325, que posiblemente tiene una mayor demanda, 68 y esto se ve reflejado en un menor consumo de glucosa. Estos resultados sugieren que las cepas de levaduras pueden aprovechar de diferente forma el nitrógeno (Manginot, Roustan, & Sablayrolles, 1998) El ANOVA muestra diferencias altamente significativas en relación a las cepas de levadura y las concentraciones de nitrógeno de hidrolizado de levadura. La prueba se significación de Tuckey, indica que la cepa CLQCA-INT-005 y 0,4 gN/L, son los más óptimas para ser utilizadas en las siguientes pruebas. 3.1.5 Co-fermentación de diferentes cepas de S. cerevisiae con reutilización de biomasa celular El tercer factor que se estudió fue el comportamiento de las cuatro cepas de levadura en co-cultivos. Para ello se realizaron 4 ciclos de co-fermentación (cada uno de 24 horas), con la adición de la concentración mínima de nitrógeno previamente establecida (0.4 gN/L). En todos los casos, la biomasa celular de levaduras fue reutilizada con la reposición de medio de cultivo fresco. Al finalizar los cuatro ciclos de fermentación, se analizó la composición de la población de levaduras en el medio de fermentación. Los perfiles del análisis de restricción del ADN mitocondrial, mostraron que el 80% de la población corresponde a la cepa de levadura CLQCA-INT-005, 10% a CLQCA-INT-001 y 10% a UCLM325 (Figura 15). Por el contrario, la cepa CLQCA-10-099 fue completamente desplazada y su crecimiento fue inhibido; esto demuestra una baja competitividad con relación a las otras cepas de S. cerevisiae en co-cultivo. Ciani et al. (2016) reporta que S. cerevisiae en co-fermentación compite al inicio de la fermentación y solo aquellas que están mejor adaptadas prevalecen. En fermentaciones en co-cultivo existe una interacción entre las diferentes cepas de levaduras. Se ha reportado, diferencias en la expresión génica entre cepas dominantes y no-dominantes de 69 levaduras de S. cerevisiae en co-cultivos, mostrando una sobreexpresión de genes cuando las levaduras están en condiciones de competencia (Pérez-Torrado et al., 2017). La expresión de genes puede ser clave tanto para el ataque o protección de las células de levaduras en co-cultivos; siendo un factor crucial en la dominancia en un medio. Además, los factores extrínsecos (pH, temperatura, presión osmótica y productos metabólicos) así como factor killer y la densidad celular de levaduras influyen en el desempeño de cada cepa de levadura (Williams, Liu, & Fay, 2015). Por lo tanto, al finalizar la fermentación sólo aquellas levaduras que han logrado sobrepasar las limitantes que se generan por estrés en condiciones de competencia, sobreviven y dominan el medio de fermentación. En este estudio, la cepa CLQCA-INT- 005 mostró una alta dominancia en el medio al finalizar los cuatro ciclos de fermentación, evidenciando su alta predominancia y competencia entre las cepas que fueron probadas. Figura 15. . Patrones de restricción del DNA mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae. Carriles: 1 y 16 marcador 1000 bp. Cepas tipo: CLQCA-10-099 (Carril 2), CLQCA-INT- 001 (Carril 3), CLQCA-INT-005 (Carril 4) y UCLM (Carril 5). Cepas (Carril 6 -15). 70 El cuarto factor que se estudió fue el desempeño de las levaduras en fermentaciones sucesivas con reutilización de biomasa celular. Al finalizar cada ciclo de fermentación (24 horas) se determinó el consumo de glucosa. Como resultado de los experimentos se concluyó que las levaduras pueden utilizarse hasta 2 veces (ciclos) en las condiciones experimentales ensayadas, mostrando que más del 98% de la glucosa fue consumida del medio. Es notable que la habilidad de fermentación disminuye progresivamente en cada reutilización de biomasa celular, mostrando valores de consumo de glucosa de 96,97% y 95,79% en el tercer y cuarto ciclo de fermentación, respectivamente (Figura 16). En un proceso industrial, la levadura representa el 10% de los costos de producción. Después de un ciclo de fermentación aproximadamente entre 90 y 95% de las células pueden ser recuperadas y recicladas, lo cual significa una alta densidad de células que podrían ser reutilizadas haciendo el proceso económicamente más viable (Basso, Luiz C., Basso, Thiago., & Nitsche Rocha, 2011). Sin embargo, el desempeño de las células de levaduras depende de la viabilidad y capacidad metabólica al finalizar cada ciclo de fermentación. Por lo tanto, es necesario buscar cepas de levaduras que además de tener alta tolerancia a etanol, estas puedan resistir a las condiciones de estrés de fermentación impuestas por una reutilización celular. Teniendo en cuenta que los procesos de fermentación deben optimizarse en términos de rendimiento, productividad y costos de producción, el uso de altas densidades celulares y el reciclaje de células se considera una alternativa para mejorar la productividad del etanol (Verbelen, De Schutter, Delvaux, Verstrepen, & Delvaux, 2006). El reciclaje de células aumenta la productividad en la fermentación, siendo 4.6 veces mayor en comparación con fermentaciones donde no se recicla células de levadura (Palmqvist, Galbe, & Hahn-Hägerdal, 1998) . Sin embargo, el rendimiento depende de la 71 viabilidad de las levaduras al final de cada ciclo de fermentación. Generalmente, las cepas industriales están sometidas al estrés impuesto por la fermentación, y se intensifica con el reciclaje celular. Por lo tanto, la búsqueda de cepas tolerantes a etanol y más específicamente para el caso del reciclaje celular son factores determinantes en las fermentaciones industriales (Basso, Luiz C. et al., 2011). Figura 16. Reutilización de biomasa celular en co-cultivo de cepas de Saccharomyces cerevisiae por ciclos de fermentación (Ciclo de fermentación: 24 horas) 3.1.6 Cinética de fermentación Finalmente, se evaluó la cinética de fermentación en relación al consumo de glucosa y consecuente producción de etanol. Para estas pruebas se trabajó con las cepas de levadura CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001 y CLQCA-INT-005 debido a que estas presentaron el mejor perfil metabólico atribuido al consumo de glucosa. La cinética fue evaluada durante un periodo de 24 horas. Los resultados muestran que a las 7 horas de fermentación aproximadamente el 90% de la glucosa ha sido consumida. Además, los resultados muestran que hay diferencias en el grado y rapidez de consumo de glucosa, mostrando 72 un mayor consumo de glucosa la cepa de levadura CLQCA-10-099 (a las 7 horas). Sin embargo, en todos los casos a las 24 horas de fermentación se observa un consumo casi total de glucosa, sin mostrar diferencias significativas entre las cepas de levaduras probadas (Figura 17). Figura 17. Concentración de glucosa y etanol durante la fermentación con diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. Condiciones 34°C, 160 rpm por 24 horas. En relación a la producción y rendimiento teórico de etanol, los resultados muestran diferencias significativas referentes a las distintas cepas de levaduras utilizadas. En todos los casos, el rendimiento de etanol es mayor a 0,46 g de etanol por gramos de glucosa, y específicamente la cepa de levadura CLQCA-INT-005 evidencia el mejor rendimiento de etanol, 0,49 g de etanol por gramos de glucosa (Tabla 4). La relación entre el consumo de glucosa y la producción de etanol, reflejan diferencias entre las cepas de levaduras utilizadas, en donde cada una tiene aparentemente necesidades específicas y utilización diferenciada de la fuente de carbono tanto para crecimiento celular como para la fermentación. Esto indica, que el consumo de glucosa 73 no puede atribuirse sólo a la conversión a etanol, sino también a la utilización en el crecimiento celular. En estudios similares, en donde se estudió la habilidad de fermentación de cepas silvestres de S. cerevisiae para etanol de segunda generación, las cepas de levadura muestran rendimientos de etanol entre 0,421 y 0,451 g/g de glucosa, que corresponde a rendimientos de etanol teórico de 82,5 y 88,4%, respectivamente (H. Li et al., 2015). Por otro lado, estudios con cepas de levaduras de S. cerevisiae industriales muestran un rendimiento teórico de etanol de 94% (0.48 g de etanol por gramos de glucosa) (Pereira, Romaní, Ruiz, Teixeira, & Domingues, 2014). En este estudio, el rendimiento de etanol, calculado al final de la fermentación, fue obtenido por la cepa de levadura CLQCA-INT-005 mostrando 96,72 % de rendimiento teórico de etanol. Tabla 4. Concentración de etanol y rendimiento teórico de etanol de diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. Condiciones de fermentación: 34°C, 200 rpm por 24 horas. Cepas de S. cerevisiae Concentración de etanol (g/g) Rendimiento de etanol g etanol/g glucosa Rendimiento teórico de etanol (%) CLQCA-INT-001 51,820,12 0,470,01 91,931,03 CLQCA-INT-005 54,520,53 0,490,01 96,720,40 CLQCA-10-099 51,250,29 0,460,01 90,921,51 3.2 CARACTERIZACIÓN DE LA MATERIA PRIMA La caracterización del bagazo de caña de azúcar se realizó en el laboratorio de análisis físico químico de alimentos del INIAP. En la Tabla 5 se muestra los datos obtenidos a partir de FDN, FDA y ADL para la determinación de la celulosa, hemicelulosa y lignina. 80 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 1800 1700 1600 Absorbance (a.u.) Wavenumber (cm-1) Sodium hydroxide Sulfuric acid Oxalic acid Maleic acid Untreated SCB Figura 18. Espectro de ATR-FTIR de la fracción sólida recuperada después de pretratamientos álcali y ácidos a 160°C for 20 min en reactor de presión. 3.3.2 Pretratamiento alcalino con organosolv en microondas Una vez comprobado que las condiciones alcalinas de los pretratamientos presentan mayor ventaja en relación a los pretratamientos ácidos, se estableció un diseño experimental que permita ver el efecto del organosolvente (Sulfolane-TiO2) en condiciones alcalinas con irradiación de microondas. El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre los dos medios de reacción (Tabla 7), lo que indica que el sulfolane-TiO2 promovió la producción de TRS, logrando rendimientos de hasta 64,8% (vs. rendimientos de hasta 59,5% para el pretratamiento sin la adición de sulfolane-TiO2). Esta diferencia relativamente pequeña apunta al impacto muy positivo de la irradiación de microondas (MWI), independientemente del medio de reacción. 81 En los estudios realizados por Peng et al, (2013) y Peng et al, (2014), en los que se ensayó pretratamientos con irradiación de microondas en celulosa microcristalina, reportaron que tiempos significativamente más cortos de reacción son suficientes para alcanzar un rendimiento favorable de los sacáridos. Tabla 7. Resultados de la prueba de Tukey (HSD). Análisis de las diferencias entre los dos medios de reacción con un intervalo de confianza del 95% (TRS (%) rendimiento). "1" significa el medio de pretratamiento con sulfolane-TiO2 y "2" para el medio sin este Contraste Diferencia Diferencia estandarizada Valor crítico Pr > Dif Significancia 2 vs 1 -2,762 -20,155 1,967 < 0,0001 Yes Valor crítico de Tukey 2,781 Categoría Media LS Error estándar Valor mínimo (95%) Valor máximo (95%) Grupos 2 45,458 0,097 45,268 45,649 A 1 48,220 0,097 48,030 48,411 B Los resultados muestran un aumento en los rendimientos de TRS cuando la concentración de álcali se incrementó de 0,5 a 5%, en ambos casos, es decir con y sin adición de organosolv (sulfolane-TiO2) (Tabla 8). Esto se puede atribuir al hecho de que el NaOH es uno de los catalizadores alcalinos más fuertes, y su eficacia para el pretratamiento de la biomasa lignocelulósica se ha evidenciado por un mayor grado de hidrólisis enzimática en comparación con otros pretratamientos alcalinos reportados en la literatura (Singh, Shukla, Tiwari , & Srivastava, 2014) (Chang et al., 2017). Durante la reacción de pretratamiento con NaOH, el NaOH se disocia en ion hidróxido (OH-) e ion sodio (Na +) (Kim, Lee, & Kim, 2016b), y el aumento en la concentración 82 de iones hidróxido aumenta la velocidad de la reacción de hidrólisis. Esto es consistente con los resultados obtenidos en este estudio, en el cual el aumento en la producción de TRS fue evidente cuando la concentración de NaOH se incrementó a 3% y 5%, alcanzando rendimientos de hasta 61,1% y 64,8% respectivamente. Se encontraron diferencias significativas para ambos pretratamientos, con sulfolane- TiO2 y sin sulfolane-TiO2. En una investigación llevada a cabo por Hoşgün et al, (2017), los pretratamientos a diferentes concentraciones de NaOH en el rango del 2% al 10% (p/v) se probaron en material lignocelulósico (cáscaras de avellana). Los resultados evidenciaron que el aumento en la concentración de NaOH llevó a una mayor eliminación de lignina. Los rendimientos de TRS mejoraron hasta una concentración de NaOH del 6%, pero un aumento adicional resultó en una disminución en la producción de TRS. En este estudio se confirmó que la temperatura era un parámetro importante, dando como resultado diferencias significativas entre las temperaturas probadas. El aumento de la temperatura de 120°C a 140°C mejoró la formación de TRS a partir de la hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar pretratada en aproximadamente un 5%. En la hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica (tallos de sorgo dulce) pretratados con organosolv utilizando un catalizador ácido, Ostovareh et al, (2015) reportó que un aumento de la temperatura (100 a 160°C) mejoró la conversión enzimática. Sin embargo, Koo et al., (2011) mostró que la hidrólisis enzimática apenas se vió afectada a más de 140°C, lo que sugiere que el pretratamiento no debería realizarse a temperaturas más altas. Aunque también se encontraron diferencias significativas entre los cinco tiempos de reacción analizados (Tabla 10), es importante mencionar que es el parámetro con menor 83 influencia: el aumento en el tiempo de reacción de 5 a 60 minutos solo dió como resultado un aumento del 1,9% en rendimiento TRS. Wang et al, (2017) reportó que los pretratamientos con organosolvente (2-propanol) a temperaturas más altas (entre 200 y 220°C) y tiempos de reacción más largos (60 y 120 min) en un autoclave facilitaron la hidrólisis enzimática. En contraste, el uso de MWI – incluso en condiciones más suaves (en términos de temperaturas y tiempos de reacción, como los que se usan en este estudio) - aceleraría notablemente el proceso, dando como resultado rendimientos de TRS de hasta 62.9% en solo 5 minutos. En relación a los resultados mencionados anteriormente, NaOH 5%, 140°C y 5 min con organosolvente (sulfolane-TiO2) fueron las condiciones que mostraron mejor rendimiento de azúcares. Tabla 8. Producción de TRS a partir de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar para diferentes temperaturas, concentraciones de NaOH y tiempos de reacción con y sin sulfolane-TiO2 Pretratamiento T (°C) Alcalino TRS (%) 5´ 15´ 30´ 45´ 60´ Microondas (sin sulfolane-TiO2) 120°C NaOH 0,5% 29,7±1,08 29,5±2,13 30,0±0,92 30,7±1,28 31,0±2,43 NaOH 1% 35,2±1,21 35,3±0,33 36,4±1,02 36,9±1,34 37,4±1,11 NaOH 3% 49,0±2,47 49,3±0,51 50,9±1,50 52,0±0,58 52,2±1,04 NaOH 5% 53,5±1,99 53,0±2,36 54,4±0,19 55,8±0,92 56,1±0,51 130°C NaOH 0,5% 31,5±0,42 31,5±1,81 32,1±0,58 32,6±0,92 32,9±1,02 NaOH 1% 39,1±0,63 39,5±0,98 40,7±1,36 41,8±0,73 42,0±0,67 NaOH 3% 52,4±1,79 53,0±1,51 53,3±1,79 54,7±1,06 55,0±2,39 NaOH 5% 56,1±1,58 56,0±2,37 57,0±0,54 57,2±1,51 57,4±1,42 140°C NaOH 0,5% 35,0±1,27 35,0±1,20 35,4±1,67 35,7±0,19 36,2±0,26 84 NaOH 1% 40,8±0,73 40,6±0,70 41,9±0,98 42,6±0,33 43,3±1,04 NaOH 3% 53,3±0,51 53,0±0,17 54,2±0,75 55,7±0,60 56,3±1,44 NaOH 5% 58,0±0,26 57,6±0,29 59,0±0,35 60,0±0,98 59,5±1,60 Microondas + Sulfolane-TiO2 120°C NaOH 0,5% 30,4±1,75 30,6±1,94 31,2±0,67 31,6±0,77 32,0±2,07 NaOH 1% 36,9±0,70 36,8±0,42 37,9±0,19 38,3±0,79 38,5±0,26 NaOH 3% 52,4±0,77 52,0±0,51 53,4±0,60 54,7±0,88 55,0±0,17 NaOH 5% 55,3±0,67 56,7±0,48 57,8±0,33 58,0±0,96 57,8±0,88 130°C NaOH 0,5% 33,9±0,84 33,6±0,35 34,7±1,44 35,0±0,92 35,3±0,86 NaOH 1% 42,3±0,88 42,0±1,17 42,7±0,75 44,1±2,81 44,4±1,64 NaOH 3% 55,3±1,18 55,7±0,92 56,8±1,21 57,0±1,11 57,6±1,18 NaOH 5% 61,1±0,44 60,8±1,07 62,1±0,48 63,6±0,79 63,9±1,37 140°C NaOH 0,5% 35,9±0,95 36,2±0,92 36,5±0,60 37,1±0,77 37,8±1,34 NaOH 1% 44,2±0,92 43,7±0,63 44,1±0,63 45,1±0,39 44,9±0,86 NaOH 3% 56,1±0,19 56,5±0,77 57,6±0,93 58,0±0,60 61,1±0,79 NaOH 5% 62,9±0,77 62,8±0,77 64,1±0,58 64,6±0,87 64,8±0,35 Al comparar los resultados obtenidos con los pretratamientos alcalinos con microondas + organosolvente (sulfolane-TiO2), alcalinos con microondas y alcalinos con reactor de presión, se observa que los pretratamientos con reactor de presión muestran rendimiento de TRS más altos (Tabla 9). Estos resultados no coinciden con los obtenidos por Lai et al, (2014) y Podschun et al, (2017), en donde se reportan la comparación de pretratamientos de biomasa lignocelulósica combinados con catalizador alcalino y diferentes sistemas de calentamiento: explosión de vapor + NaOH, termoquímicos convencionales + NaOH e irradiación de microondas + NaOH. Los resultados demostraron que el MW-A era el método más eficaz que mejora la sacarificación enzimática sugiriendo que puede ser una alternativa debido a su menor consumo de 85 energía y tiempos de reacción más cortos, lo que lo hace económicamente viable en procesos a escala industrial. Tabla 9. Producción de TRS a partir de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar para pretratamientos alcalinos con diferentes temperaturas y tiempos con reactor de presión Pretratamiento T (°C) Alcalino TRS (%) 10´ 20´ 30´ Reactor de presión 130°C NaOH 1% 68,1±0,14 77±0,05 76±0,09 140°C NaOH 1% 82,1±0,14 76±0,09 80,2±0,17 150°C NaOH 1% 82,3±0,19 84,9±0,42 85,5±0,24 160°C NaOH 1% 86,2±1,13 84,2±0,95 81,6±2,68 170°C NaOH 1% 83,7±1,80 87,6±2,08 87,1±4,66 Tabla 10. Prueba de Tukey (HSD) para el pretratamiento de MW + sulfolane-TiO2. Análisis de las diferencias entre las categorías con un intervalo de confidencia de 95% (Rendimiento TRS (%)) para temperatura (arriba), concentración de NaOH (centro) y tiempo (abajo) Categoría Media Error estánd. Límite inferior (95%) Límite superior (95%) Grupos 120°C 44,865 0,139 44,590 45,140 A 130°C 49,094 0,139 48,819 49,369 B 140°C 50,702 0,139 50,427 50,977 C Categoría Media Error estánd. Límite inferior (95%) Límite superior (95%) Grupos 0,5% 34,116 0,161 33,799 34,434 A 1% 41,729 0,161 41,412 42,047 B 3% 55,951 0,161 55,633 56,268 C 5% 61,085 0,161 60,768 61,403 D Categoría Media Error estánd. Límite inferior (95%) Límite superior (95%) Grupos 5´ 47,226 0,180 46,871 47,581 A 15´ 47,285 0,180 46,930 47,640 A 86 30´ 48,241 0,180 47,886 48,596 B 45´ 48,924 0,180 48,568 49,279 B C 60´ 49,427 0,180 49,072 49,782 C 3.4 SACARIFICACIÓN ENZIMÁTICA DE LA FRACCIÓN HOLOCELULÓSICA DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR Para establecer las condiciones adecuadas de pretratamiento de bagazo de caña de azúcar, se analizó el rendimiento de sacáridos totales y el contenido de azúcares a partir del hidrolizado enzimático del bagazo previamente tratado. En la tabla 11 se observa la composición de los azúcares solubles y el rendimiento de los sacáridos obtenidos de hidrólisis enzimática del bagazo de caña de azúcar. Los resultados muestran que diferentes azúcares solubles fueron obtenidos de la sacarificación de los polímeros de celulosa y hemicelulosa. Los azúcares de glucosa, celobiosa y celotriosa obtenidos a partir de la hidrólisis de celulosa; y la xilosa obtenida de la hidrólisis de la hemicelulosa (Hassan, Williams, & Jaiswal, 2018). En todos los pretratamientos, los azúcares monómeros de glucosa y xilosa, fueron los principales componentes del hidrolizado enzimático. El análisis estadístico muestra diferencias altamente significativas en relación al catalizador químico utilizado. Los pretratamientos con NaOH, mostraron mayor cantidad de glucosa y xilosa entre 64,26 g/L – 87,68 g/L y 29,5 g/L – 35,90g/L, respectivamente. Se observó además la influencia de la severidad del pretratamiento (temperatura y tiempo), por lo tanto el aumento de la severidad resultó en el incremento de la cantidad de azúcares de glucosa y xilosa en el hidrolizado enzimático. Los resultados también muestran que la celulosa no fue completamente hidrolizada a su unidad de monómero (glucosa). Esto indica una parcial hidrólisis de este polímero, 87 mostrando valores entre 2,22 – 10,41 g/L de celobiosa y 0,47-4,83 g/L de celotriosa. En el caso de la celotriosa no hay diferencias con respecto al catalizador utilizado, mientras que la celobiosa si fue más evidente en los pretratamientos alcalinos. Los pretratamientos ácidos incluyeron ácidos inorgánicos (H2SO4) y ácidos orgánicos (ácido oxálico y maleico). No se observan diferencias notorias en los azúcares obtenidos con estos catalizadores, excepto para el ácido maleico en el cual se obtuvo mayor cantidad de xilosa en comparación con los otros pretratamientos ácidos. Es importante mencionar que posterior a un pretratamiento de biomasa lignocelulósica e hidrólisis enzimática de los polímeros de celulosa y hemicelulosa, se espera la mayor cantidad de azúcares fermentables. Es ampliamente conocido, que la glucosa es un azúcar fácilmente metabolizado y puede ser transformado a etanol por levaduras de la especie S. cerevisiae (Walker & Walker, 2018). Por otro lado, la xilosa liberada a partir de hemicelulosa también es un azúcar que podría mejorar el rendimiento, si esta es convertida a etanol por fermentación. Sin embargo, la fermentación de xilosa involucra otras vías metabólicas específicas de ciertas cepas de levaduras y bacterias, que no poseen la especie S. cerevisiae (Stanbury et al., 2017). Para poder aprovechar eficientemente estos dos azúcares, glucosa y xilosa, un sin número de estrategias han sido investigadas. Entre ellas podemos mencionar a cepas de levadura de S. cerevisiae genéticamente modificadas o procesos de co-fermentación con microorganismos con diferentes habilidades fermentativas, lo cual garantiza una mejora en el rendimiento global de producción de etanol. En este estudio se trabajó con una cepa de S. cerevisiae que sólo puede convertir glucosa a etanol, por lo tanto los cálculos del rendimiento de etanol fueron enfocados en la fermentación de la glucosa. 88 Se determinó el rendimiento de sacáridos totales en base a la glucosa y xilosa. El pretratamiento alcalino mostró valores mayores a 99% de rendimiento de sacáridos, siendo 55% mayor que los pretratamientos ácidos. Los resultados del rendimiento de sacáridos totales mostraron diferencias altamente significativas con relación al catalizador, temperatura y tiempo de reacción utilizados en los pretratamientos. De acuerdo a las pruebas de significación de Tukey el NaOH (15, p/v); 160°C y 170°C; y 20 y 30 minutos, son las mejores condiciones de pretratamiento. Por lo tanto, basados es estos resultados, la combinación de NaOH, 160°C y 20 minutos son las condiciones más adecuadas para el pretratamiento de bagazo de caña de azúcar. Tabla 11. Composición de sacáridos obtenidos a partir de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar pretratado Catalizador Temp (°C) Tiempo (min) Glu (g/L) Xil (g/L) Celot (g/L) Celob (g/L) Rendimiento de sacáridos (%) Hidróxido de sodio 130 10 64,26±0,20 29,50±0,14 2,64±0,04 5,72±0,65 91,14±0,00 20 70,12±0,10 35,70±0,10 2,95±0,09 6,68±4,67 99,68±0,00 30 70,78±0,10 34,20±0,10 2,65±0,10 6,31±1,82 99,14±0,00 140 10 78,05±0,20 32,00±0,08 3,25±0,17 9,66±5,47 99,73±0,00 20 73,52±0,20 32,50±0,08 2,33±0,21 5,48±2,31 99,64±0,00 30 75,43±0,10 33,40±0,11 2,66±0,14 8,88±1,57 99,34±0,00 150 10 78,33±0,10 33,20±0,18 2,84±0,22 9,25±6,13 99,85±0,00 20 80,47±0,60 33,10±0,07 3,15±0,20 10,41±13,56 99,52±0,00 30 79,79±0,20 35,90±0,18 4,43±0,07 8,16±9,75 99,31±0,00 160 10 84,66±0,30 34,10±0,10 3,19±0,10 6,68±2,50 99,50±0,00 20 83,56±2,10 29,40±1,88 4,04±0,17 6,37±1,41 99,77±0,00 30 83,07±1,20 29,80±0,24 3,03±0,21 6,22±2,88 98,78±0,00 170 10 82,66±1,10 30,90±0,07 2,97±0,09 6,79±2,39 98,33±0,00 20 86,93±1,20 35,40±0,39 2,94±0,25 7,13±1,26 99,92±0,00 30 87,68±1,50 33,60±0,43 2,76±0,54 7,23±6,47 99,18±0,00 Ácido sulfúrico 130 10 22,56±0,20 4,20±0,15 0,84±0,42 2,22±0,33 22,29±0,00 20 31,30±0,20 8,50±0,20 1,88±0,17 2,90±0,28 33,77±0,00 30 32,89±0,20 6,00±0,23 1,69±0,26 2,79±0,43 31,64±0,00 89 140 10 38,41±0,20 7,30±0,18 1,70±0,27 2,76±0,54 37,64±0,00 20 38,01±0,20 5,50±0,25 1,66±0,12 3,11±0,59 35,35±0,00 30 39,63±0,30 5,00±0,23 1,59±0,19 3,03±0,65 35,89±0,00 150 10 38,71±0,20 4,10±0,16 1,58±0,25 2,81±0,60 33,73±0,00 20 38,56±0,20 4,70±0,20 1,32±0,14 3,06±0,33 34,08±0,00 30 40,37±0,20 3,20±0,14 2,08±0,09 3,21±0,14 33,52±0,00 160 10 60,75±0,30 1,00±0,03 1,05±0,11 4,33±0,79 46,37±0,00 20 59,56±0,30 1,40±0,10 0,97±0,16 3,68±1,35 46,19±0,00 30 60,29±0,20 1,30±0,79 0,87±2,27 2,48±1,24 46,20±0,00 170 10 56,79±0,20 1,20±0,56 0,89±0,42 3,95±0,39 41,98±0,00 20 57,98±0,10 1,70±0,15 1,62±0,29 4,02±3,81 45,75±0,00 30 60,46±0,50 1,60±0,25 1,31±0,72 4,10±3,37 47,38±0,00 Ácido oxálico 130 10 33,72±0,10 6,80±0,14 2,48±0,07 3,96±0,35 35,98±0,00 20 29,58±0,20 5,40±0,10 1,82±0,21 3,44±0,50 30,94±0,00 30 36,26±0,10 5,80±0,20 2,03±0,16 3,73±0,43 36,55±0,00 140 10 42,02±0,00 6,60±0,13 1,96±0,12 3,32±0,12 41,86±0,00 20 42,89±0,20 6,50±0,13 1,96±0,19 3,91±0,43 42,09±0,00 30 43,58±0,20 6,50±0,23 2,01±0,12 3,79±0,33 43,26±0,00 150 10 42,12±0,10 3,90±0,07 1,98±0,19 3,33±0,41 38,59±0,00 20 42,69±0,10 5,00±0,00 0,00±0,13 3,61±0,17 39,93±0,00 30 42,78±0,20 4,30±0,13 1,52±0,25 3,63±0,53 38,88±0,00 160 10 52,76±0,10 1,00±0,67 1,76±0,26 4,25±2,72 41,82±0,00 20 47,85±0,10 0,80±0,31 0,81±0,58 3,48±1,67 38,31±0,00 30 47,99±0,10 0,60±0,11 1,01±0,28 4,00±1,51 39,97±0,00 170 10 55,98±0,10 0,70±0,08 1,07±0,56 4,24±1,63 42,86±0,00 20 58,14±0,10 0,50±0,08 0,94±0,01 4,23±0,57 44,33±0,00 30 57,11±0,10 0,60±0,36 0,95±0,60 4,07±1,88 43,41±0,00 Maleic acid 130 10 25,70±0,10 6,80±0,06 3,17±0,03 2,95±0,47 28,51±0,00 20 26,23±0,10 8,20±0,02 3,02±0,20 3,24±0,56 30,58±0,00 30 27,65±0,10 9,00±0,17 2,87±0,15 3,03±0,60 31,91±0,00 140 10 28,88±0,10 9,30±0,10 2,68±0,07 2,96±0,31 32,95±0,00 20 27,81±0,10 9,90±0,19 2,55±0,17 2,78±0,79 32,78±0,00 30 30,60±0,10 11,10±0,08 2,61±0,11 2,81±0,34 36,26±0,00 150 10 30,68±0,10 10,90±0,10 2,85±0,08 3,03±0,50 35,39±0,00 20 31,89±0,10 12,80±0,05 2,94±0,23 3,09±0,32 38,16±0,00 30 30,90±0,10 12,90±0,20 2,66±0,13 2,90±0,28 37,03±0,00 160 10 45,65±1,70 18,80±0,89 1,02±0,07 3,19±2,01 55,01±0,00 20 58,70±0,70 23,30±0,00 0,00±0,15 3,76±2,47 66,11±0,00 30 55,05±1,30 21,70±0,88 0,51±0,12 3,69±2,74 62,57±0,00 96 4. CONCLUSIONES De las 150 cepas de S. cerevisiae se seleccionaron 4 cepas de levadura (CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001, CLQCA-INT-005 y UCLM325) en relación a su habilidad de fermentación en menor tiempo. Esto nos lleva a la conclusión de que es necesario un screning de levaduras para poder evaluar el potencial metabólico que garantice la producción de etanol en función del aumento del rendimiento de etanol y disminución en tiempos de producción. Después del estudio de las diferentes fuentes y concentraciones de nitrógeno (Fosfato de amonio, 1 y 2 gN/L; amoniaco, 1 y 2 gN/L e hidrolizado de levadura, 0,2 – 2,5 gN/L) adicionadas a medios de fermentación se concluye que 0,4 gN/L es la concentración mínima necesaria de nitrógeno a partir de hidrolizado de levadura. La optimización en la utilización de recursos en la producción de etanol es crucial, por lo tanto la determinación de la concentración mínima de nitrógeno a partir de una fuente de fácil acceso es una alternativa a los procesos de fermentación industrializados. Una vez establecidas las condiciones de fermentación en función de los requerimientos mínimos de nitrógeno, se pudo evaluar la dominancia de diferentes cepas de S. cerevisiae en co-fermentaciones. El análisis de los perfiles de ADN mitocondrial mostró que la cepa CLQCA-INT-005 tuvo dominancia en co-cultivo en relación a las otras cepas de S. cerevisiae. Esto nos lleva a la conclusión de que la cepa CLQCA-INT-005 presenta mayores ventajas competitivas sobre las otras levaduras estudiadas reflejando un mejor desempeño en la fermentación. 97 La reutilización de biomasa de levaduras en fermentaciones secuenciales mostró un efecto negativo a partir del tercer ciclo, disminuyendo la capacidad de consumo de glucosa gradualmente en cada ciclo de reutilización. Por lo tanto se concluye que la reutilización de biomasa no es aconsejable ya que las levaduras pierden la capacidad fermentativa disminuyendo los rendimientos de etanol requeridos para la producción de etanol. Mediante el estudio de la cinética de fermentación se pudo determinar el comportamiento de las cepas de levadura (CLQCA-10-099, CLQCA-INT-001 y CLQCA-INT-005) en función del consumo de glucosa y producción de etanol. Después de 24 horas de fermentación la levadura CLQCA-INT-005 mostró el mayor rendimiento de etanol, por lo tanto se concluye que existen diferencias entre las cepas de levadura de la misma especie en relación al metabolismo. El estudio de dominancia en co-cultivo y el estudio de cinética de fermentación revelaron resultados importantes en cuanto a la mejor cepa de Saccharomyces cerevisiae en la producción de etanol. En ambos casos, y en condiciones preestablecidas la cepa CLQCAINT-005 exhibió el mejor rendimiento de etanol y mostró una dominancia marcada en co-cultivo. Por lo tanto, se concluye que la cepa CLQCA-INT-005 es una levadura interesante para la producción de etanol celulósico a nivel industrial. El rendimiento de sacáridos totales y etanol con los pretratamientos alcalinos (NaOH) fue mayor en comparación a los pretratamientos ácidos con rector de presión. Por lo tanto, en relación a la elección del catalizador que consigue mejores rendimientos de sacarificación a partir de bagazo de caña de azúcar se concluye que es el NaOH (1%) el mejor candidato para pretratamientos de biomasa lignocelulósica. 98 La mayor producción de TRS por hidrólisis enzimática se consiguió con pretratamientos alcalinos en reactor de presión en comparación con los pretratamientos alcalinos con y sin organosolvente con irradiación de microondas. Por lo tanto se concluye que los pretratamientos en reactor de presión pueden ser utilizados con rendimientos iguales e incluso superiores a los de irradiación con microondas. En los pretratamientos alcalinos con irradiación de microondas se observaron diferencias entre los pretratamientos con y sin organosolvente (sulfolane-TiO2). Esto nos permite concluir que la adición del organosolvente mejora el rendimiento de sacarificación. En este sentido el microondas, el catalizador alcalino y organosolvente influyen directamente en el proceso. Con los resultados obtenidos, la combinación factorial de NaOH 1%, 160°C y 20 min exhibió el mejor rendimiento de sacarificación enzimática y fermentación, por lo tanto se concluye que estas son las condiciones más idóneas para hacer un proceso de producción de etanol más eficiente. El sistema de SFSS utilizado para la sacarificación y fermentación de bagazo de caña de azúcar pretratada, se ajustó a la utilización de alta carga de sólidos (25%) por su sistema de prehidrólisis. Además este mantuvo una producción de etanol continua cada 24 horas por un periodo de 30 días mostrando una concentración de etanol promedio de 9,07% durante todo el proceso. Por otro lado, la carga enzimática de celulasas se disminuyó en un 40%. Por lo tanto, con los resultados presentados en este trabajo de investigación podemos concluir que este es un sistema prometedor para la producción de bioetanol lignocelulósico, por sus ventajas de alta carga de sólidos, producción de etanol en menor tiempo y disminución en la utilización de enzimas; todas estas aportando a un proceso económicamente más viable. 99 100 REFERENCIAS 1. Adekunle, A., Orsat, V., & Raghavan, V. (2016). Lignocellulosic bioethanol: A review and design conceptualization study of production from cassava peels. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 64, 518–530. https://doi.org/10.1016/j.rser.2016.06.064 2. Aditiya, H. B., Mahlia, T. M. I., Chong, W. T., Nur, H., & Sebayang, A. H. (2016). Second generation bioethanol production: A critical review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 66, 631–653. https://doi.org/10.1016/j.rser.2016.07.015 3. Aguilar-Reynosa, A., Romaní, A., Ma. Rodríguez-Jasso, R., Aguilar, C. N., Garrote, G., & Ruiz, H. A. (2017). Microwave heating processing as alternative of pretreatment in second-generation biorefinery: An overview. Energy Conversion and Management, 136, 50–65. https://doi.org/10.1016/j.enconman.2017.01.004 4. Ajao, O., Marinova, M., Savadogo, O., & Paris, J. (2018). Hemicellulose based integrated forest biorefineries: Implementation strategies. Industrial Crops and Products, 126, 250–260. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.10.025 5. Alfani, F., Gallifuoco, A., Saporosi, A., Spera, A., & Cantarella, M. (2000). Comparison of SHF and SSF processes for the bioconversion of steam-exploded wheat straw. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 25(4), 184– 192. https://doi.org/10.1038/sj.jim.7000054 6. An, H., Wilhelm, W. E., & Searcy, S. W. (2011). Biofuel and petroleum-based fuel supply chain research: A literature review. Biomass and Bioenergy, 35(9), 3763–3774. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2011.06.021 7. Arevalo-Gallegos, A., Ahmad, Z., Asgher, M., Parra-Saldivar, R., & Iqbal, H. M. N. (2017). Lignocellulose: A sustainable material to produce value-added products with a zero waste approach—A review. International Journal of Biological Macromolecules, 99(Supplement C), 308–318. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.02.097 8. Azapagic, A., & Stichnothe, H. (2011). 3 - Life cycle sustainability assessment of biofuels. In R. Luque, J. Campelo, & J. Clark (Eds.), Handbook of Biofuels Production (pp. 37–60). Woodhead Publishing. Retrieved from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9781845696795500036 101 9. Bafrncová, P., šmogrovičová, D., Sláviková, I., Pátková, J., & Dömény, Z. (1999). Improvement of very high gravity ethanol fermentation by media supplementation using Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Letters, 21(4), 337–341. https://doi.org/10.1023/A:1005436816047 10. Bals, B., Rogers, C., Jin, M., Balan, V., & Dale, B. (2010). Evaluation of ammonia fibre expansion (AFEX) pretreatment for enzymatic hydrolysis of switchgrass harvested in different seasons and locations. Biotechnology for Biofuels, 3(1), 1. https://doi.org/10.1186/1754-6834-3-1 11. Basso, Luiz C., L. C., Basso, Thiago., T., & Nitsche Rocha, S. (2011). Ethanol Production in Brazil: The Industrial Process and Its Impact on Yeast Fermentation. In Biofuel Production-Recent Developments and Prospects. https://doi.org/10.5772/17047 12. BeMiller, J. N. (2019). 6 - Starches: Molecular and Granular Structures and Properties. In J. N. BeMiller (Ed.), Carbohydrate Chemistry for Food Scientists (Third Edition) (pp. 159–189). AACC International Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-812069-9.00006-6 13. Biofuels, the Green alternative. (2012). Retrieved from http://www.youtube.com/watch?v=T_S7Q3Uede4&feature=youtube_gdata_play er 14. Bondesson, P.-M., & Galbe, M. (2016). Process design of SSCF for ethanol production from steam-pretreated, acetic-acid-impregnated wheat straw. Biotechnology for Biofuels, 9(1), 222. https://doi.org/10.1186/s13068-016-0635- 6 15. Brito Cruz, C. H., Souza, G. M., & Barbosa Cortez, L. A. (2014). Chapter 11 - Biofuels for Transport. In T. M. Letcher (Ed.), Future Energy (Second Edition) (pp. 215–244). Boston: Elsevier. Retrieved from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780080994246000119 16. Brodeur, G., Yau, E., Badal, K., Collier, J., Ramachandran, K. B., & Ramakrishnan, S. (2011). Chemical and Physicochemical Pretreatment of Lignocellulosic Biomass: A Review [Research article]. https://doi.org/10.4061/2011/787532 17. Canilha, L., Chandel, A. K., Suzane dos Santos Milessi, T., Antunes, F. A. F., Luiz da Costa Freitas, W., das Graças Almeida Felipe, M., & da Silva, S. S. (2012). Bioconversion of Sugarcane Biomass into Ethanol: An Overview about 102 Composition, Pretreatment Methods, Detoxification of Hydrolysates, Enzymatic Saccharification, and Ethanol Fermentation [Research article]. https://doi.org/10.1155/2012/989572 18. Cazetta, M. L., Celligoi, M. A. P. C., Buzato, J. B., & Scarmino, I. S. (2007). Fermentation of molasses by Zymomonas mobilis: Effects of temperature and sugar concentration on ethanol production. Bioresource Technology, 98(15), 2824–2828. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2006.08.026 19. Chang, M., Li, D., Wang, W., Chen, D., Zhang, Y., Hu, H., & Ye, X. (2017). Comparison of sodium hydroxide and calcium hydroxide pretreatments on the enzymatic hydrolysis and lignin recovery of sugarcane bagasse. Bioresource Technology, 244(Part 1), 1055–1058. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.08.101 20. Chen, H., Liu, J., Chang, X., Chen, D., Xue, Y., Liu, P., … Han, S. (2017). A review on the pretreatment of lignocellulose for high-value chemicals. Fuel Processing Technology, 160(Supplement C), 196–206. https://doi.org/10.1016/j.fuproc.2016.12.007 21. Cheng, N., Koda, K., Tamai, Y., Yamamoto, Y., Takasuka, T. E., & Uraki, Y. (2017). Optimization of simultaneous saccharification and fermentation conditions with amphipathic lignin derivatives for concentrated bioethanol production. Bioresource Technology, 232, 126–132. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.02.018 22. Ciani, M., Capece, A., Comitini, F., Canonico, L., Siesto, G., & Romano, P. (2016). Yeast Interactions in Inoculated Wine Fermentation. Frontiers in Microbiology, 7. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00555 23. Connelly, R. (2014). Chapter 10 - Second-Generation Biofuel from High- Efficiency Algal-Derived Biocrude. In V. K. Gupta, M. G. Tuohy, C. P. Kubicek, J. Saddler, & F. Xu (Eds.), Bioenergy Research: Advances and Applications (pp. 153–170). Amsterdam: Elsevier. Retrieved from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780444595614000103 24. da Costa Lopes, A. M., João, K. G., Rubik, D. F., Bogel-Łukasik, E., Duarte, L. C., Andreaus, J., & Bogel-Łukasik, R. (2013). Pre-treatment of lignocellulosic biomass using ionic liquids: Wheat straw fractionation. Bioresource Technology, 142, 198–208. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2013.05.032 25. Dahnum, D., Tasum, S. O., Triwahyuni, E., Nurdin, M., & Abimanyu, H. 103 (2015). Comparison of SHF and SSF Processes Using Enzyme and Dry Yeast for Optimization of Bioethanol Production from Empty Fruit Bunch. Energy Procedia, 68, 107–116. https://doi.org/10.1016/j.egypro.2015.03.238 26. Dasgupta, D., Ghosh, D., Bandhu, S., & Adhikari, D. K. (2017). Lignocellulosic sugar management for xylitol and ethanol fermentation with multiple cell recycling by Kluyveromyces marxianus IIPE453. Microbiological Research, 200, 64–72. https://doi.org/10.1016/j.micres.2017.04.002 27. Deshavath, N. N., Dasu, V. V., Goud, V. V., & Rao, P. S. (2017). Development of dilute sulfuric acid pretreatment method for the enhancement of xylose fermentability. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 11(Supplement C), 224–230. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2017.07.012 28. Dias, M. O. de S., Maciel Filho, R., Mantelatto, P. E., Cavalett, O., Rossell, C. E. V., Bonomi, A., & Leal, M. R. L. V. (2015). Sugarcane processing for ethanol and sugar in Brazil. Environmental Development, 15, 35–51. https://doi.org/10.1016/j.envdev.2015.03.004 29. Duque, A., Manzanares, P., Ballesteros, I., & Ballesteros, M. (2016). Chapter 15 - Steam Explosion as Lignocellulosic Biomass Pretreatment. In S. I. Mussatto (Ed.), Biomass Fractionation Technologies for a Lignocellulosic Feedstock Based Biorefinery (pp. 349–368). Amsterdam: Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802323-5.00015-3 30. FAO. (2013). Statistical Yearbooks - World food and agriculture. Retrieved from http://www.fao.org/docrep/018/i3107e/i3107e.PDF 31. Ferreira, J. A., Brancoli, P., Agnihotri, S., Bolton, K., & Taherzadeh, M. J. (2018). A review of integration strategies of lignocelluloses and other wastes in 1st generation bioethanol processes. Process Biochemistry, 75, 173–186. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2018.09.006 32. Gonzales, R. R., Sivagurunathan, P., & Kim, S.-H. (2016). Effect of severity on dilute acid pretreatment of lignocellulosic biomass and the following hydrogen fermentation. International Journal of Hydrogen Energy, 41(46), 21678–21684. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2016.06.198 33. Han, X., Guo, Y., Liu, X., Xia, Q., & Wang, Y. (2019). Catalytic conversion of lignocellulosic biomass into hydrocarbons: A mini review. Catalysis Today, 319, 2–13. https://doi.org/10.1016/j.cattod.2018.05.013 34. Hassan, S. S., Williams, G. A., & Jaiswal, A. K. (2018). Emerging technologies 104 for the pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 262, 310–318. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.04.099 35. Hofsetz, K., & Silva, M. A. (2012). Brazilian sugarcane bagasse: Energy and non-energy consumption. Biomass and Bioenergy, 46, 564–573. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2012.06.038 36. Hoşgün, E. Z., Berikten, D., Kıvanç, M., & Bozan, B. (2017). Ethanol production from hazelnut shells through enzymatic saccharification and fermentation by low-temperature alkali pretreatment. Fuel, 196, 280–287. https://doi.org/10.1016/j.fuel.2017.01.114 37. IEA. (2013). CO2 EMISSIONS FROM FUEL COMBUSTION. Retrieved from http://www.iea.org/publications/freepublications/publication/CO2EmissionsFro mFuelCombustionHighlights2013.pdf 38. Jansen, M. L. A., Bracher, J. M., Papapetridis, I., Verhoeven, M. D., de Bruijn, H., de Waal, P. P., … Pronk, J. T. (2017). Saccharomyces cerevisiae strains for second-generation ethanol production: from academic exploration to industrial implementation. FEMS Yeast Research, 17(5). https://doi.org/10.1093/femsyr/fox044 39. Jönsson, L. J., & Martín, C. (2016). Pretreatment of lignocellulose: Formation of inhibitory by-products and strategies for minimizing their effects. Bioresource Technology, 199, 103–112. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.10.009 40. Karimi, K., & Taherzadeh, M. J. (2016). A critical review on analysis in pretreatment of lignocelluloses: Degree of polymerization, adsorption/desorption, and accessibility. Bioresource Technology, 203(Supplement C), 348–356. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.12.035 41. Khattab, S. M. R., & Watanabe, T. (2019). Chapter 10 - Bioethanol From Sugarcane Bagasse: Status and Perspectives. In R. C. Ray & S. Ramachandran (Eds.), Bioethanol Production from Food Crops (pp. 187–212). Academic Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813766-6.00010-2 42. Kim, J. S., Lee, Y. Y., & Kim, T. H. (2016a). A review on alkaline pretreatment technology for bioconversion of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 199, 42–48. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.08.085 43. Kim, J. S., Lee, Y. Y., & Kim, T. H. (2016b). A review on alkaline pretreatment technology for bioconversion of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 199(Supplement C), 42–48. 105 https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.08.085 44. Koo, B.-W., Park, N., Jeong, H.-S., Choi, J.-W., Yeo, H., & Choi, I.-G. (2011). Characterization of by-products from organosolv pretreatments of yellow poplar wood (Liriodendron tulipifera) in the presence of acid and alkali catalysts. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 17(1), 18–24. https://doi.org/10.1016/j.jiec.2010.10.003 45. Kootstra, A. M. J., Beeftink, H. H., Scott, E. L., & Sanders, J. P. M. (2009). Comparison of dilute mineral and organic acid pretreatment for enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biochemical Engineering Journal, 46(2), 126–131. https://doi.org/10.1016/j.bej.2009.04.020 46. Kumar, D., & Singh, V. (2019). Chapter 22 - Bioethanol Production From Corn. In S. O. Serna-Saldivar (Ed.), Corn (Third Edition) (pp. 615–631). Oxford: AACC International Press. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-811971-6.00022- X 47. Kumneadklang, S., Larpkiattaworn, S., Niyasom, C., & O-Thong, S. (2015). Bioethanol Production from Oil Palm Frond by Simultaneous Saccharification and Fermentation. Energy Procedia, 79, 784–790. https://doi.org/10.1016/j.egypro.2015.11.567 48. Kurtzman, C, Fell, J, & Boekhout, T. (2010). The Yeasts | ScienceDirect. Retrieved January 20, 2019, from https://www.sciencedirect.com/book/9780444521491/the-yeasts 49. Lai, C., Tu, M., Shi, Z., Zheng, K., Olmos, L. G., & Yu, S. (2014). Contrasting effects of hardwood and softwood organosolv lignins on enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Bioresource Technology, 163, 320–327. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.04.065 50. Lee, Y.-G., Jin, Y.-S., Cha, Y.-L., & Seo, J.-H. (2017). Bioethanol production from cellulosic hydrolysates by engineered industrial Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 228, 355–361. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.12.042 51. Li, H., Wu, M., Xu, L., Hou, J., Guo, T., Bao, X., & Shen, Y. (2015). Evaluation of industrial Saccharomyces cerevisiae strains as the chassis cell for secondgeneration bioethanol production. Microbial Biotechnology, 8(2), 266–274. https://doi.org/10.1111/1751-7915.12245 52. Li, X., Wei, Y., Xu, J., Xu, N., & He, Y. (2018). Quantitative visualization of