Optimización de la producción de biopolímeros a partir de gases de efecto invernadero

UNIVERSIDAD DE VALLADOLID ESCUELA DE INGENIERIAS INDUSTRIALES Grado en Ingeniería Química Optimización de la producción de biopolímeros a partir de gases de efecto invernadero Autor: Dña. Silvia García Casado Tutor 1: D. Raúl Muñoz Torre Tutor 2: Dña. Yadira Rodríguez Muñoz Valladolid, Julio 2021 RESUMEN El presente trabajo tuvo como objetivo la producción de polihidroxibutirato (PHB) empleando la cepa Methylocystis hirsuta CSC1, biogás como fuente de carbono y energía y nitrato como fuente de nitrógeno en un sistema de dos etapas en continuo. Se realizaron tres ensayos con diferentes cargas de N-NO3- y velocidades de dilución, para determinar las condiciones óptimas de operación en el reactor de tanque agitado (STR) y en la columna de burbujeo (BCB), destinados al crecimiento de la biomasa y acumulación de PHB, respectivamente. El empleo de una carga media de N-NO3- (~43 mg N-NO3- L-1 d-1) y una velocidad de dilución de 0,013 h-1 en el STR permitió obtener condiciones estables de operación, aunque se logró una mayor productividad (~140 g PHB m-3 d-1) en la BCB a velocidades de dilución inferiores (0,011 h-1). La alta acumulación de PHB en el STR cuestiona los beneficios de operar sistemas en dos etapas. Palabras clave: Biogás, eliminación gases de efecto invernadero, metanótrofos, producción de PHB, sistema en dos etapas. ABSTRACT The present study investigated polyhydroxybutyrate (PHB) production in a two-stage continuous system inoculated with Methylocystis hirsuta CSC1 and fed with biogas as a carbon and energy source and nitrate as a nitrogen source. Three different tests were carried out varying the N-NO3- loading rate and dilution rate to determine the optimal operational conditions in the stirred tank reactor (STR) and the bubble column bioreactor (BCB), which were devoted to biomass growth and PHB accumulation, respectively. A moderate N-NO3- loading rate (~43 mg N-NO3-L-1d-1) and a dilution ratio of 0,013 h-1 in STR resulted in stable operating conditions, although higher PHB productivities (~140 g PHBm-3d-1) were achieved under a lower dilution ratio (0,011 h-1) in the BCB. The high PHB accumulation obtained in the STR under nitrogen sufficient conditions challenge the benefit of two-stage systems for PHB production compared to one-stage systems. Keywords: Biogas, GHG abatement, methanotrophs, PHB production, two-stage system. Índice 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1 1.1. Estado del arte del biogás ........................................................................................... 1 1.1.1. La digestión anaerobia. Composición y producción del biogás. ....................... 1 1.1.2. Situación actual y perspectivas globales ............................................................ 6 1.1.3. Usos convencionales............................................................................................ 9 1.1.4. Productos de valor añadido partir de biogás....................................................11 1.2. Metanótrofos para la degradación del CH4 ..............................................................13 1.2.1. Clasificación ........................................................................................................13 1.2.2. Rutas metabólicas de oxidación aerobia del metano ......................................14 1.2.3. Metanótrofos tipo II ............................................................................................16 1.3. Producción de biopolímeros a partir de biogás - Polihidroxibutirato (PHB) ............19 1.3.1. Tipos y propiedades de los PHAs ......................................................................20 1.3.2. Síntesis de PHB a partir de biogás ....................................................................22 1.3.3. Aplicaciones de los PHAs ...................................................................................23 1.4. Tecnologías para la bio-conversión del metano .......................................................25 1.4.1. Biorreactores de biomasa suspendida .............................................................26 1.4.2. Otras configuraciones ........................................................................................28 1.5. Estrategias de operación para la producción de PHB .............................................29 1.5.1. Operación en una etapa ....................................................................................30 1.5.2. Operación en dos etapas ...................................................................................32 1.6. Justificación del trabajo fin de grado ........................................................................33 2. OBJETIVOS ..........................................................................................................................37 3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................39 3.1. Materiales ...................................................................................................................39 3.2. Métodos ......................................................................................................................40 3.2.1. Procedimiento experimental ..............................................................................40 3.2.2. Métodos analíticos .............................................................................................46 3.2.3. Cálculos ...............................................................................................................48 4. RESULTADOS ......................................................................................................................51 4.1. Test 1: Operación en continuo con alta carga de nitrógeno ...................................51 4.1.1. Capacidad de eliminación, producción volumétrica y concentración de sólidos….. ............................................................................................................................51 4.1.2. Nitrógeno total, N-NO3- y N-NO2- ........................................................................54 4.1.3. Productividad de PHB ........................................................................................56 4.2. Test 2: Operación en continuo con baja carga de nitrógeno ..................................58 4.2.1. 1.2.1 Capacidad de eliminación, producción volumétrica y concentración de sólidos….. ............................................................................................................................58 4.2.2. Nitrógeno total, N-NO3- y N-NO2- ........................................................................62 4.2.3. Productividad de PHB ........................................................................................65 4.3. Test 3: Operación en continuo con carga media de nitrógeno ...............................68 4.3.1. Capacidad de eliminación, producción volumétrica y concentración de sólidos….. ............................................................................................................................68 4.3.2. Nitrógeno total, N-NO3- y N-NO2- ........................................................................72 4.3.3. Productividad de PHB ........................................................................................75 5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................................................79 5.1. Efecto de concentración de N-NO3- sobre el desempeño del sistema ....................79 5.2. Efecto de concentración de N-NO3- sobre la acumulación de PHB .........................81 5.3. Influencia de la velocidad de dilución .......................................................................82 6. CONCLUSIÓN ......................................................................................................................85 7. BIBLIOGRAFÍA .....................................................................................................................87 ANEXOS .......................................................................................................................................95 ANEXO I: Curvas de calibrado ................................................................................................95 ANEXO II: Imágenes del sistema ...........................................................................................97 Índice Figuras Figura 1. Esquema de producción de biogás a partir de residuos y aguas residuales mediante digestión anaerobia ........................................................................................ 2 Figura 2. Esquema de un CSTR (A) y un UASB (B) (Hamilton y otros, 2019) ............. 3 Figura 3. Esquema de las fases de la digestión anaerobia (Wilkinson, 2011)........... 4 Figura 4. Crecimiento relativo de psicrófilos, mesófilos y termófilos (Neczaj y otros, 2019) ................................................................................................................................ 5 Figura 5. Evolución de la producción de energía eléctrica procedente de biogás en el mundo (IRENA, 2019) ................................................................................................. 7 Figura 6. Evolución del número de plantas de generación de biogás y la energía eléctrica instalada (A) y la producción de biogás (B) en Europa en los últimos 10 años (EBA, 2020) ............................................................................................................ 8 Figura 7. Aplicaciones energéticas del biogás (Cuesta Santianes y otros, 2017) ..... 9 Figura 8. Ruta de la oxidación aerobia del metano (Strong y otros, 2015) .............. 15 Figura 9. Ciclo de la serina en MOB II (Hanson & Hanson, 1996) ............................. 17 Figura 10. Esquema de la ruta metabólica del nitrógeno (Cai y otros, 2016) .......... 19 Figura 11. Estructura general de los PHAs y el homopolímero polihidroxibutirato (PHB) ............................................................................................................................... 21 Figura 12. Ciclo de la serina y ruta metabólica para la síntesis del PHB en MOB II (López y otros, 2019) ................................................................................................... 22 Figura 13. Aplicaciones de los PHAs a nivel industrial ............................................... 23 Figura 14. Capacidad de producción global de bioplásticos en 2020 (European Bioplastics, 2020) ......................................................................................................... 25 Figura 15. Esquema de un STR (López y otros, 2019) ............................................... 26 Figura 16. Esquema de una BCB (López y otros., 2019) .......................................... 27 Figura 17. Esquema de un reactor Airlift (López y otros, 2019) ............................... 28 Figura 18. Esquema de patrón de flujo de Taylor en el interior de tubos capilares . 29 Figura 19. Esquema experimental de producción de PHB en dos etapas (Du y otros, 2001) .............................................................................................................................. 33 Figura 20. Inóculo de Methylocysthis hirsuta .............................................................. 40 Figura 21. Esquema (A) e imagen (B) del sistema experimental ............................... 43 Figura 22. Evolución de la biomasa medida según OD600 (Δ) y TSS (▲), EC (□) y PCO2 (⬛) en el interior del STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 1 .............................................................................................................................. 53 Figura 23. Evolución de la concentración de TN (x), N- NO3- (•) y N- NO2- (o) junto con el aporte de nitrógeno diario en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 1 .............................................................................................................. 55 Figura 24. Evolución del porcentaje de PHB (◊) y la concentración de N- NO3- (•) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 1 ............................... 57 Figura 25. Evolución de la biomasa medida según OD600 (Δ) y TSS (▲), EC (□) y PCO2 (⬛) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 2 ......... 61 Figura 26. Evolución de la concentración de TN (x), N- NO3- (•) y N- NO2- (o) junto con el aporte de nitrógeno diario en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 2 .............................................................................................................. 64 Figura 27. Evolución del porcentaje de PHB (◊) y la concentración de N- NO3- (•) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 2 ............................... 67 Figura 28. Evolución de la biomasa medida según OD600 (Δ) y TSS (▲), EC (□) y PCO2 (⬛) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 3 ........ 71 Figura 29. Evolución de la concentración de TN (x), N- NO3- (•) y N- NO2- (o) junto con el aporte de nitrógeno diario en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 3 .............................................................................................................. 74 Figura 30. Evolución del porcentaje de PHB (◊) y la concentración de N- NO3- (•) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 3 ............................... 77 Índice Tablas Tabla 1. Composición del biogás (%) según el tipo de biomasa (Chen y otros, 2015) .......................................................................................................................................... 1 Tabla 2. Propiedades del biogás (FAO y otros, 2011) ................................................. 10 Tabla 3. Procesos de producción de hidrógeno a partir de metano .......................... 11 Tabla 4. Productos de alto valor añadido derivados de la actividad de los metanótrofos (Cantera y otros, 2018) ......................................................................... 12 Tabla 5. Clasificación y características de los metanótrofos (López y otros, 2019; Strong y otros, 2015) ................................................................................................... 14 Tabla 6. Rango de valores de diferentes propiedades de los PHAs (Bugnicourt y otros, 2014) ................................................................................................................... 21 Tabla 7. Producción de PHB con diferentes cultivos puros (López y otros, 2019) ... 22 Tabla 8. Estrategias de operación en ciclos reportadas por Rodríguez y otros (2021) ........................................................................................................................................ 31 Tabla 9. Composición del medio mineral NMS y la solución buffer .......................... 39 Tabla 10. Resumen de las tres estrategias de operación empleadas ...................... 46 6 inferiores aumentan el riesgo de inhibición por presencia de amonio (Nsair y otros, 2020). ▪ Tiempo de retención hidráulico (TRH): Es uno de los parámetros de diseño más importantes a la hora de trabajar con procesos biológicos, y hace referencia al tiempo medio que pasan tanto el sustrato como los microorganismos dentro del digestor. Su importancia radica en que debe establecerse un equilibrio entre su valor y el tiempo de duplicación celular de los microorganismos del reactor, puesto que operar con tiempos de retención altos incrementan la producción de metano, pero conllevan un mayor volumen de reactor y un mayor coste de inmovilizado (Nelson, 2010). Por el contrario, trabajar a tiempos de retención bajos disminuye la eficiencia de tratamiento del sustrato y aumenta el riesgo de lavado de los microorganismos. Por lo general, se trabaja con un TRH que oscila entre los 10 y 25 días (Sarker y otros., 2019). ▪ Inhibidores: El inhibidor principal de este proceso es el amonio (NH4+), cuya presencia se encuentra ligada a la temperatura de operación y a la relación C/N: trabajar a altas temperaturas supone un aumento de la concentración de este compuesto, al igual que operar con relaciones de C/N bajas. Por otro lado, la presencia de AGVs también produce la disminución de la actividad de las bacterias metanogénicas; su aparición se relaciona con valores bajos de pH, por lo que la capacidad buffer del medio de reacción es fundamental para neutralizar su acumulación (Dobre y otros, 2014). 1.1.2. Situación actual y perspectivas globales La transición hacia el empleo de energías limpias y renovables ha promovido el uso del biogás como forma de generación de energía eléctrica verde a nivel mundial (Figura 5). Hasta el año 2015 puede observarse un continuo crecimiento en este campo, donde los datos reportados en los últimos 10 años muestran que Europa es el mayor productor de energía generada a partir de biogás, alcanzando los 61 807 GWh en 2018, seguida por Estados Unidos. 7 Figura 5. Evolución de la producción de energía eléctrica procedente de biogás en el mundo (IRENA, 2019) Este crecimiento continuo viene principalmente impulsado por las políticas actuales en materia de energía. Las alarmantes predicciones acerca del cambio climático y sus consecuencias futuras hicieron que en el año 2015 se elaborase el Acuerdo de París, donde se estableció uno de los primeros acuerdos jurídicos universales en referencia al cambio climático. Teniendo este acuerdo como base, en los últimos años se han ido impulsando diferentes estrategias hasta llegar al Pacto Verde Europeo, elaborado en septiembre de 2020 y que tiene objetivo reducir las emisiones de gases de efecto hasta al menos el 55% de las registradas en el año 1990; para alcanzar este objetivo, el aumento de la eficiencia energética y el uso de energías renovables es un aspecto fundamental (European Comission, 2020). Dentro de estas energías renovables se encuentra el biogás, registrándose a finales de 2019 un total de 18 943 plantas de generación de esta mezcla gaseosa en Europa (Figura 6A), incrementándose un 4% respecto del año anterior (EBA, 2020). La mayoría de ellas se encuentran situadas en Alemania, aunque también destaca la apertura de nuevas plantas en Reino Unido y Francia a lo largo del 2019 (EBA, 2020). 8 Figura 6. Evolución del número de plantas de generación de biogás y la energía eléctrica instalada (A) y la producción de biogás (B) en Europa en los últimos 10 años (EBA, 2020) Gran parte del biogás generado en estas plantas se ha destinado a la producción de energía eléctrica, con una capacidad media de 100-500 kW por planta (Scarlat y otros, 2018). Por ello, el aumento en el número de plantas europeas ha ido ligado al aumento de la capacidad de generación de este tipo de energía, registrándose una capacidad total instalada de 11,1 GW en 2019 (Figura 6A). Sin embargo, a pesar del crecimiento observado entre los años 2011 y 2015 en todos estos aspectos, en los últimos 5 años puede comprobarse que la producción de biogás se ha estabilizado (Figura 6B). La generación de energía eléctrica a partir de este biocombustible tampoco ha variado entre 2018 y 2019, un cambio de tendencia negativo respecto a años anteriores. La reducción de incentivos A) B) 9 económicos debida al bajo coste de otras fuentes de energía renovable es la principal causa de esta disminución en la demanda de biogás (Rodríguez y otros, 2020), de forma que estudiar alternativas a los usos energéticos convencionales, como son las biorrefinerías y la generación de productos de alto valor añadido, es fundamental para volver a incentivar el crecimiento de este mercado. 1.1.3. Usos convencionales El empleo del biogás como forma de producción de energía es la aplicación más extendida. Puesto que esta mezcla gaseosa procede de la degradación de materia orgánica es considerado un biocombustible renovable y, debido a que su componente principal es el metano, sus aplicaciones energéticas son muy similares a las que presenta el gas natural, siendo necesario que presenten distintos grados de pureza respecto al CH4, como se muestra en laFigura 7. De todos ellos, la producción de calor y electricidad son los usos más comunes en la actualidad, pero existe un creciente interés por el desarrollo de tecnologías que faciliten su implantación en el resto de los ámbitos. Figura 7. Aplicaciones energéticas del biogás (Cuesta Santianes y otros, 2017) La aplicación energética más desarrollada es la generación de energía eléctrica a través de biogás, empleando para ello turbinas o motores de combustión. Éstos últimos destacan por ser la tecnología más empleada, pudiendo emplearse tanto motores de gasolina como de diésel, eliminando previamente impurezas que puedan afectar al rendimiento. Por otro lado, las turbinas se caracterizan por ser una forma de producción de energía más respetuosa con el medio ambiente, de fácil y rápida 10 implantación, pero cuya potencia y rendimiento se ve afectada por parámetros como la humedad o la presión (Cuesta Santianes y otros, 2017). Seguida de la generación de electricidad, el uso más común es la generación de calor por combustión directa, abasteciendo a las calefacciones y generando agua caliente tanto en zonas residenciales como industriales. El principal problema que se presenta esta aplicación es la necesidad de que el lugar de la combustión se encuentre próximo a la zona de consumo debido al bajo poder calorífico de biogás (Tabla 2), lo que conlleva grandes pérdidas de calor en su distribución (Lisowyj y otros, 2020). Tabla 2. Propiedades del biogás (FAO y otros, 2011) Contenido energético 6-6,5 kWh m-3 Equivalente de combustible 0,6-0,65 L petróleo m-3 biogás Límite de explosión 6-12% de biogás en aire Temperatura de ignición 650-750 ºC Densidad 1,2 kg m-3 Cabe destacar que una alternativa de gran interés es el empleo del biogás en sistemas de cogeneración, donde se produce calor y electricidad de forma simultánea, de forma que esta última puede ser introducida en las redes de suministro eléctrico mientras que el calor generado puede ser aprovechado en los sistemas de calefacción urbanos (Lisowyj y otros, 2020). Otra aplicación de interés viene dada por la gran cantidad de metano presente en el biogás, de forma que este puede ser purificado para obtener biometano y ser integrado en la red de gas natural o empleado como combustible de vehículos. Esta última opción es una de las aplicaciones más prometedoras de cara al futuro, donde el empleo del biogás sería equivalente a los actuales modelos de coches que funcionan con gas natural, puesto que sólo se requiere un proceso de refinado previo que permita alcanzar una composición del 95% de CH4 (Kadam y otros, 2017). También dentro de la industria del automóvil, aunque aún se encuentra en fase de desarrollo, aparece el uso del biogás en pilas de combustible, sistemas electroquímicos capaces de conseguir que la energía de una reacción se transforme en energía eléctrica sin necesidad de recargas (Cuesta Santianes y otros, 2017). Su 11 fundamento es el contrario al de la electrólisis del agua: la reacción entre el hidrógeno y el oxígeno permite obtener electricidad con una eficacia mayor al empleo de combustibles fósiles y emitiendo exclusivamente vapor de agua. 𝐻2+ 𝑂2→ 𝐻2𝑂+𝑒𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑖𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 Para emplear biogás en este proceso, es necesaria su transformación a hidrógeno, lo que se consigue mediante los procesos de reformado con vapor, oxidación parcial y autorreformado (Tabla 3). De todos ellos, los dos últimos son los que presentan una mayor eficacia energética, mientras que el reformado produce una mayor cantidad de H2 por unidad de combustible (Cuesta Santianes y otros, 2017). Tabla 3. Procesos de producción de hidrógeno a partir de metano REACCIÓN PROCESO REFORMADO CON VAPOR DE AGUA 𝐶𝐻4+ 𝐻2𝑂 → 𝐶𝑂+3𝐻2 Mezcla de CH4 con vapor de agua a alta temperatura OXIDACIÓN PARCIAL 𝐶𝐻4+ 1 2𝑂2→ 𝐶𝑂+2𝐻2 Reacción del CH4 con una cantidad de O2 inferior a la estequiométrica AUTO-REFORMADO 𝐶𝐻4+ 𝐻2𝑂 → 𝐶𝑂+3𝐻2 𝐶𝐻4+ 2𝐻2𝑂 → 𝐶𝑂2+4𝐻2 𝐶𝑂+ 𝐻2𝑂 → 𝐶𝑂2+𝐻2 𝐶𝐻4+ 2𝑂2→ 𝐶𝑂2+2𝐻2𝑂 Combinación de los anteriores 1.1.4. Productos de valor añadido partir de biogás En la actualidad, existe un gran interés científico por buscar formas de empleo del biogás diferentes a las aplicaciones energéticas. Una de las alternativas que se encuentra en desarrollo es la generación de productos de valor añadido. Puesto que el componente principal de esta mezcla gaseosa es el CH4, desarrollar biotecnologías basadas en la bioconversion de este compuesto a través de microrganismos que puedan emplearlo como fuente de carbono y energía supone una gran alternativa a los usos convencionales y una forma de incentivar el empleo en el sector del biogás. Este tipo de bacterias degradadoras de CH4, denominadas metanotróficas, son capaces de generar una gran variedad de compuestos de alto valor (Tabla 4) que pueden ser empleados en varios ámbitos (Cantera y otros, 2018). 12 Tabla 4. Productos de alto valor añadido derivados de la actividad de los metanótrofos (Cantera y otros, 2018) Tipo de producto Propiedades de interés Campos de aplicación Ectoína Iminoácido cíclico Estabilizante de enzimas, complejos de ADN-proteína y ácidos nucleicos Medicina, nutrición y cosmética Proteína unicelular (SCP) Proteína Alto contenido en aminoácidos esenciales Nutrición Biodiesel Lípidos Pueden ser transesterificados para formar biocombustibles Combustibles Polisacáridos extracelulares Polímeros Propiedades adhesivas y coloidales Industria alimentaria, farmacéutica, textil… Bioplásticos Polímeros Propiedades mecánicas similares a los plásticos derivados del petróleo Envasado, medicina, agricultura… La producción de bioplásticos en forma de PHAs, llevada a cabo por microorganismos capaces de sintetizar este biopolímero en condiciones de limitación de nitrógeno, suscita un gran interés y se prevé que sea el sustituto de los plásticos derivados del petróleo, puesto que sus propiedades mecánicas son similares, además de ser biodegradables. El principal problema que presenta la producción a gran escala de este biopolímero es el alto coste asociado al proceso de producción, donde la fuente de carbono empleada supone un 50% del coste total (Raza y otros, 2018). Buscar fuentes de carbono que abaraten este proceso de producción es fundamental para poder competir contra los plásticos convencionales. Una alternativa de interés es emplear el CH4 presente en el biogás como fuente de carbono para que bacterias metanotróficas produzcan PHAs bajo condiciones de limitación de nutrientes (Pérez y otros, 2020). Emplear un producto de la digestión anaerobia con el fin de obtener productos de alto valor añadido pertenece al grupo de procesos sostenibles con los que se busca trabajar en las biorrefinerías. Este tipo de industria surge con la idea emplear biomasa para obtener biocombustibles, energía y productos químicos, buscando competir con la refinería actual basada en el uso del petróleo (Cherubini, 13 2010). En concreto, la versatilidad que presenta el biogás hace que su aplicación dentro de las biorrefinerías sea fundamental, ya que puede ser empleado tanto para producir energía y calor como en aplicaciones menos convencionales. Dentro de estas últimas, la valorización de sus productos surge como una de las alternativas con mayor potencial y con la que se busca incrementar el valor de las materias primas de partida, reduciendo la cantidad de sustrato empleada (Hagman y otros, 2018). 1.2. Metanótrofos para la degradación del CH4 Los metanótrofos se caracterizan por ser microorganismos capaces de oxidar el metano, empleándolo como fuente de carbono y energía, generalmente bajo condiciones aerobias, aunque también existen especies capaces de acoplar este proceso a la reducción de compuestos como sulfato, nitrato, nitrito, etc. en ausencia de oxígeno. La mayoría de los metanótrofos pertenecen al filo de las bacterias gran negativa, concretamente a los grupos γ y α-proteobacterias, que en el medio ambiente pueden encontrarse en humedales, sedimentos marinos, aguas subterráneas, suelos de vertederos, etc. Por lo general, los microorganismos metanótrofos tienden a situarse en la interfase de zonas aerobias y anaerobias, donde hay flujos considerables de CH4 y O2 (López y otros, 2019; Strong y otros, 2015). 1.2.1. Clasificación Atendiendo a las características morfológicas y fisiológicas, entre otras, los metanótrofos pueden clasificarse en tres grandes grupos (Tabla 5): tipo I (MOB I, γproteobacterias), tipo II (MOB II, α-proteobacterias) y tipo X (MOB X), siendo considerados estos últimos un subgrupo de los MOB I. 14 Tabla 5. Clasificación y características de los metanótrofos (López y otros, 2019; Strong y otros, 2015) MOB I MOB II MOB X Ruta de asimilación del carbono Ribulosa Monofosfato (RuMP) Serina Ribulosa Monofosfato (RuMP) Ácidos grasos fosfolípidos Cadenas de 14-16 carbonos Cadenas de 18 carbonos Características comunes a MOB I y MOB II Disposición de la membrana Haces de discos vesiculares Alineada a lo largo de la periferia de la célula Capacidad para fijar N2 Ciertos géneros Sí Géneros Methylomonas Methylobacter Methylosarcina Methylococcus Methylocystis Methylosinus Methylocella Methylocapsa Methylococcus 1.2.2. Rutas metabólicas de oxidación aerobia del metano El proceso de degradación del CH4 por parte de los metanótrofos comienza con su conversión en metanol (CH3OH), gracias a la acción de la enzima metano monooxigenasa (MMO). Esta enzima, que actúa como catalizador en esta hidroxilación, aparece en dos formas distintas: particulada (pMMO) y soluble (sMMO). La primera de ellas se encuentra en la membrana citoplasmática de la mayoría de metanótrofos, mientras que la sMMO aparece en el citoplasma y es característica de los MOB II, puesto que se han identificado muy pocos MOB I capaces de sintetizarla (López y otros, 2019). Obtenido el metanol, la enzima metanol deshidrogenasa (MeDH) cataliza la oxidación de este a formaldehído, que es empleado tanto para la producción de biomasa y metabolitos (siguiendo la ruta de la serina o de la RuMP) como para su mineralización hasta formar CO2 (Figura 8). 15 Figura 8. Ruta de la oxidación aerobia del metano (Strong y otros, 2015) Respecto a la ruta metabólica que permite el crecimiento de la biomasa, la estequiometría de esta reacción puede expresarse en función de la fracción de electrones requeridos (López y otros, 2019; Rostkowski y otros, 2013). Al producirse la oxidación del CH4, una fracción de los electrones obtenidos es empleada para reducir el O2 a H2O (r1), mientras que la fracción restante se destina al crecimiento de biomasa (r2). Por lo tanto, en este proceso el oxígeno actúa como aceptor final de electrones para producir energía, mientras que el metano actúa como donante de electrones. 𝑹𝒆𝒅𝒖𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝑶𝟐 (𝒓𝟏): 1 4 ⁄ [𝑂2+4𝐻++4𝑒−→2𝐻2𝑂] 𝑶𝒙𝒊𝒅𝒂𝒄𝒊ó𝒏 𝑪𝑯𝟒 (𝒓𝟐): 1 4 ⁄ [𝐶𝐻4+𝑂2→𝐶𝑂2+4𝐻++4𝑒−] También debe tenerse en cuenta la influencia de los macro y micronutrientes dentro del proceso. En el caso de emplear nitrato (NO3-) como fuente de nitrógeno, la reacción de síntesis de biomasa vendrá dada por la siguiente expresión (r3). 𝑺í𝒏𝒕𝒆𝒔𝒊𝒔 𝒅𝒆 𝒃𝒊𝒐𝒎𝒂𝒔𝒂 (𝒓𝟑): 1 28 ⁄ [5𝐶𝑂2+𝑁𝑂3 −+29𝐻++28𝑒− → 𝐶5𝐻7𝑂2𝑁+11𝐻2𝑂] La reacción estequiométrica de biodegradación del metano llevada a cabo por los metanótrofos se obtiene de la combinación de r1, r2 y r3: 𝑩𝒊𝒐𝒅𝒆𝒈𝒓𝒂𝒅𝒂𝒄𝒊ó𝒏 𝒅𝒆 𝒎𝒆𝒕𝒂𝒏𝒐: 1 4 ⁄𝐶𝐻4+( 1 4 ⁄ +𝑟14 ⁄ )𝑂2+𝑟14 ⁄𝑁𝑂3 − +(29 28 ⁄ 𝑟3+𝑟1−1)𝐻+ → ( 1 4 ⁄ −528 ⁄𝑟3)𝐶𝑂2+(𝑟12 ⁄ +11 28 ⁄ 𝑟3)𝐻2𝑂+𝑟328 ⁄ 𝐶5𝐻7𝑂2𝑁 22 1.3.2. Síntesis de PHB a partir de biogás La generación de PHB por parte de los metanótrofos tipo II es llevada a cabo a través de una ruta metabólica alternativa a la de la serina, empleando el acetil-CoA obtenida en ella (Figura 12). Este ciclo se inicia gracias a la acción de la enzima β-cetotiolasa, que transforma el acetil en acetoacetil-CoA, pasando después a obtenerse la hidroxiacil-CoA al actuar la correspondiente enzima reductasa. Finalmente, la enzima PHA sintasa cataliza la formación de PHA a través de la esterificación del 3- hidroxibutiril-CoA a PHA. Tabla 7. Producción de PHB con diferentes cultivos puros (López y otros, 2019) Cepa empleada Nutriente limitado Máximo contenido de PHB (%) Máximo rendimiento de PHB (g PHB g-1 CH4) Referencia M. parvus N 68 0,67 (teórico) Asenjo y otros, 1986 Methylocystis sp. GB25 P 51 - Wendlandt y otros, 2001 M. hirsuta N 45-50 0,42-0,46 López y otros, 2018 M. parvus OBBP N 49,4 - Sundstrom y otros, 2015 Figura 12. Ciclo de la serina y ruta metabólica para la síntesis del PHB en MOB II (López y otros, 2019) 23 En el caso de las MOB II, el único tipo de PHA que pueden producir al emplear el metano como fuente de carbono y energía es el PHB, donde la limitación de nutrientes como nitrógeno, fósforo o magnesio es fundamental para que pueda llevarse a cabo esta ruta metabólica (Raza y otros, 2018) (Tabla 7). Es necesario tener en cuenta la función del PHB dentro de la célula, que es actuar como almacén de energía y ser empleado para poder continuar el crecimiento celular cuando la fuente de nitrógeno se encuentre disponible de nuevo. Trabajos previos con la cepa Methylocystis parvus demostraron que el PHB acumulado se consume cuando hay disponibilidad de nitrógeno, siendo empleado por la célula para sintetizar proteínas sin que se lleve a cabo la duplicación celular, siempre que no exista aporte de CH4. Por el contrario, el aporte simultáneo de CH4 y N da lugar a crecimiento celular con mayores tasas de crecimiento que cuando existe PHB almacenado. En este proceso el metano es empleado como fuente de energía y el PHB como fuente de carbono (Pieja y otros, 2011). 1.3.3. Aplicaciones de los PHAs Las características que presentan este tipo de biopolímeros hacen que puedan ser empleados en diversas áreas, desde la medicina hasta la agricultura o producción de envases, como se muestra en la Figura 13. Figura 13. Aplicaciones de los PHAs a nivel industrial 24 Su similitud con los plásticos de baja densidad como el polietileno, que se caracterizan por ser fácilmente moldeables, hacen que puedan emplearse para formar fibras o films. Su flexibilidad y su impermeabilidad permiten su uso en multitud de envases, como botellas, tapones, etc. proporcionando envases desechables y biodegradables. Además, la combinación de PHB junto con otro tipo de compuestos mejora sus prestaciones, como puede ser la adición de resinas de poli acetato de vinilo para mejorar sus propiedades físicas (Poltronieri y otros, 2017). Por otro lado, destaca su aplicación en la agricultura en forma de fertilizante, aprovechando su biodegradabilidad: al introducir el fertilizante en el interior de una cobertura de PHAs y colocarse en el suelo, su liberación se hace de forma gradual, lo que reduce los costes de fertilización y aumenta su eficacia (Poltronieri y otros, 2017). Uno de los campos más prometedores de aplicación de estos biopolímeros es la medicina. El PHB, junto con el PHBV, pueden emplearse como matrices en las que llevar a cabo la proliferación in vitro de células humanas, puesto que existen estudios que demuestran que se consigue una buena adhesión entre células de diferentes partes del cuerpo y estos polímeros. También destaca su aplicación dentro de la liberación de fármacos gracias a su biocompatibilidad y biodegradabilidad, empleando para ello esferas de PHAs de tamaño micro y nano en cuyo interior se encuentra el fármaco que se desea suministrar (Raza y otros, 2018). Finalmente, otro campo en desarrollo donde se emplean PHAs es en la producción de cosméticos, puesto que sus efectos son similares a los ácidos carboxílicos empleados en el cuidado de la piel. De esta forma, aquellos PHAs que presenten al menos un grupo carboxilo en posición α pueden ser empleados en este tipo de productos gracias a sus beneficios en la piel (Kornhauser, 2010). Cabe destacar que el interés por desarrollar y trabajar con este tipo de bioplásticos se ha ido incrementando en los últimos años. A pesar de representar apenas el 1% de los más de 368 millones de plásticos generados anualmente, existe un creciente interés por el desarrollo y aplicación de los bioplásticos (European Bioplastics, 2020). En el caso concreto de los PHAs, en el año 2020 suponen un 1,7% de la capacidad 25 de producción global de los bioplásticos (Figura 14), y se espera que en los próximos cinco años este valor se vea incrementado. Figura 14. Capacidad de producción global de bioplásticos en 2020 (European Bioplastics, 2020) 1.4. Tecnologías para la bio-conversión del metano La degradación del CH4 llevada a cabo mediante procesos biotecnológicos se basa en la oxidación enzimática de este compuesto por la acción de la MMO presente en los metanótrofos. Para ello, pueden emplearse tanto reactores de lecho empacado como de biomasa suspendida, que se caracterizan ambos por contener una fase acuosa en la que se encuentran los compuestos necesarios para el crecimiento y mantenimiento celular, al igual que actúa como medio en el que se llevan a cabo las reacciones necesarias para la degradación del CH4 (López y otros, 2019). Las condiciones de operación empleadas, junto con su gran efectividad y bajo impacto ambiental, han hecho que en los últimos años aumente el interés por desarrollar y mejorar este tipo de tecnologías. El mayor reto que presentan las tecnologías de bioconversión de metano es mejorar la transferencia de materia entre la fase líquida y gaseosa debido a la baja solubilidad del CH4 y O2 en agua, cuyas constantes de Henry son 1,4 10-5 y 1,3 10-5 mol m-3 Pa-1 respectivamente (Sander, 2015). Actualmente, conseguir altas eficacias de biodegradación de metano conlleva trabajar con tiempos de residencia altos para aumentar los tiempos de contacto entre la fase gas y la fase líquida, lo que implica altos volúmenes de trabajo e incrementa los costes de inversión; es por ello que es fundamental desarrollar 26 diferentes estrategias que permitan trabajar con reactores más compactos y una alta transferencia de materia (López y otros, 2019). 1.4.1. Biorreactores de biomasa suspendida A pesar de que los biorreactores de lecho empaquetado son los más empleados para el tratamiento de compuestos orgánicos volátiles (COVs), las bajas capacidades de eliminación reportadas para compuestos poco solubles en agua y el hecho de que los microorganismos se encuentren retenidos en la biopelícula formada sobre el relleno dificultando su extracción hacen que no sea la configuración más adecuada para la obtención de productos de valor añadido que se generan de forma intracelular (Koller, 2020; J. Rocha-Rios y otros, 2013). Por ello, los reactores de biomasa suspendida se presentan como la mejor opción, ya que la extracción de productos como el PHB puede realizarse de manera relativamente sencilla, al igual que puede operarse con ellos empleando diferentes estrategias para poder optimizar el proceso. Este tipo de reactores se caracterizan por presentar flujo turbulento, lo que permite incrementar la transferencia de materia. Los más empleados, por su fácil control y monitorización, son los reactores de tanque agitado y las columnas de burbujeo, que se caracterizan por mantener la biomasa suspendida en el medio de reacción, ya sea por métodos mecánicos o por el propio burbujeo de la fase gaseosa (de forma pneumática) (López y otros, 2019). • Reactores de tanque agitado (STRs) Los STRs son tanques que presentan agitación mecánica continua para asegurar condiciones de mezcla perfecta en su interior y mantener la biomasa suspendida (Figura 15). Además, esta agitación permite romper las burbujas del gas introducido por la parte inferior para aumentar su Figura 15. Esquema de un STR (López y otros, 2019) 27 área superficial, consiguiéndose así mejorar la transferencia del CH4 de la fase gas a la líquida, reportándose eficacias de eliminación (RE) de entre el 50-60% para tiempos de residencia de 4-10 min (José Rocha-Rios y otros, 2009). El principal inconveniente de este tipo de reactor son los altos requerimientos energéticos debido a la agitación, lo que encarece los costes de operación del proceso, y el posible estrés mecánico al que puede someterse al caldo de cultivo. • Columnas de burbujeo (BCBs) Las BCBs son tanques cilíndricos que carecen de agitación mecánica, de forma que la turbulencia es generada por la fase gaseosa al ser introducida a través de difusores porosos con un tamaño de poro de <2 μm (Figura 16). Reducir el tamaño de burbuja hace que el área superficial que éstas presentan sea mayor, lo que permite aumentar la transferencia de materia gas-líquido en el sistema. Este sistema presenta costes de operación más bajos al carecer de agitación mecánica con respecto a los STRs, aunque también pueden presentar algunas desventajas como una peor circulación de líquido y por tanto menor distribución de nutrientes, coalescencia de burbujas, etc. (Koller, 2020). Con el fin de aumentar la transferencia de materia en este tipo de sistemas sin encarecer el coste del proceso, la implementación de una recirculación interna de gas o la adicción de una segunda fase no acuosa con afinidad por el CH4 y O2 se presentan como dos alternativas prometedoras (López y otros, 2019). Recircular parte de la corriente gaseosa de salida es un método poco estudiado pero donde se ha demostrado que mejora la eficacia de eliminación del sistema, reportándose un aumento del 38 ± 4% al 79 ± 1% para un ratio de recirculación de 15 (García-Pérez y otros, 2018). Figura 16. Esquema de una BCB (López y otros., 2019) 28 1.4.2. Otras configuraciones Con el fin de incrementar la transferencia de materia gas-líquido, es fundamental estudiar nuevas configuraciones de biorreactores que presenten mejores prestaciones que los convencionales. La reducción de las necesidades energéticas que se consigue con los reactores airlift y la mejora de la transferencia de materia en los reactores de flujo de Taylor hace que se presenten como dos alternativas prometedoras para llevar a cabo la biodegradación del metano y que también facilitan la recuperación de la biomasa. • Reactor Airlift Esta configuración es muy similar a la de la columna de burbujeo, careciendo también de agitación mecánica (Figura 17). En este caso, la turbulencia se consigue al presentar un tubo concéntrico en el interior del biorreactor con el que se consigue generar un gradiente de densidad, favoreciendo la trasferencia de materia entre la fase gaseosa y líquida (López y otros, 2019). En los últimos años su diseño se ha visto modificado con el fin de aumentar las prestaciones de este biorreactor, generalmente implementando recirculaciones internas y externas. Estas novedosas configuraciones, denominada forced circulation loop biorreactor (FCLB), se caracterizan por presentar dos zonas distintas. En una de ellas, ambas fases se ponen en contacto para después separar las corrientes líquidas y gaseosas (López y otros, 2019). Figura 17. Esquema de un reactor Airlift (López y otros, 2019) 29 • Reactor de flujo de Taylor Esta configuración es la que más difiere del resto y pertenece al grupo de reactores monolíticos, donde se consigue incrementar la transferencia de materia empleando una estructura formada por varios canales, unidos o separados, con bajas pérdidas de carga y generando flujos de baja dispersión axial (J. Rocha-Rios y otros, 2013). En este tipo de reactores se compone de varios tubos capilares de entre 1-5 mm dispuestos entre sí de forma paralela, dentro de los cuales se pueden generar diversos patrones de flujo entre los que destaca el conocido como flujo de Taylor por presentar una mejor transferencia de la fase gaseosa a la fase líquida. Este patrón se consigue al generar un tren de burbujas cuando se pone en contacto la fase gaseosa con el líquido recirculante en co-corriente (Figura 18), reportándose coeficientes de transferencia de masa similares a los obtenidos en los STRs pero con menores requerimientos energéticos (J. Rocha-Rios y otros, 2013). Pruebas llevadas a cabo a escala laboratorio demuestran que las eficacias de eliminación para compuestos de baja solubilidad, como el CH4 o el O2, se ven incrementadas hasta en un 40% con un patrón de flujo de Taylor con respecto a una misma configuración que no presenta este patrón (J. Rocha-Rios y otros, 2013). El principal problema que presentan este tipo de sistemas es la acumulación de biomasa por el interior de los canales, pudiendo provocar su obstrucción (Ebrahimi y otros, 2005). 1.5. Estrategias de operación para la producción de PHB Junto con la selección de la fuente de carbono y el inconveniente supone la baja solubilidad del CH4 en agua, otro de los aspectos fundamentales que determina la productividad del proceso es la estrategia de operación empleada. Puesto que los metanótrofos tipo II se caracterizan por acumular PHAs en condiciones limitantes de Figura 18. Esquema de patrón de flujo de Taylor en el interior de tubos capilares 30 nitrógeno, es necesario establecer un equilibrio entre los periodos de suministro de nutrientes y de inanición para conseguir maximizar tanto la productividad de biomasa como del PHB, siendo posible trabajar tanto en una como en dos etapas. 1.5.1. Operación en una etapa Los sistemas en una única etapa pueden ser operados en batch, fed-batch y en continuo. La operación en batch, donde los nutrientes son introducidos al inicio del proceso sin ser posteriormente renovados, es la opción menos empleada ya que la densidad celular y la producción de PHB se encuentran limitadas por la concentración de sustrato inicial empleada (Blunt y otros, 2018). Para maximizar ambos valores, trabajar en fed-batch se presenta como la opción más prometedora, siendo posible alcanzar altas densidades de cultivo sin que exista limitación de nutrientes; es la estrategia que reporta las mayores productividades volumétricas de producción de scl y mcl-PHAs (Blunt y otros, 2018). En esta forma de operación, iniciada en batch, la introducción de medio mineral fresco se determina en función de los requerimientos del sistema. En el caso de trabajar con microorganismos donde la acumulación de PHAs no se encuentra asociada al crecimiento celular, que es el caso de los MOB II, debe elaborarse una estrategia de operación donde se combinen periodos de alimentación y hambruna, de forma que dentro del biorreactor se consiga la máxima acumulación de PHB sin comprometer el crecimiento de la biomasa. Una estrategia similar a la operación en fed-batch es el trabajo con ciclos, donde se consigue aumentar la productividad del proceso al reducirse las paradas asociadas a los procesos en discontinuo (Blunt y otros, 2018). Esta forma de operación se caracteriza por reemplazar parte del caldo de cultivo por medio fresco, manteniéndose así un volumen de trabajo constante, de forma que puede ser considerada una operación en semicontinuo donde los periodos de inanición vienen marcados por la ausencia de entradas y salidas en el biorreactor. Rodríguez y otros (2021) reportó diferentes estrategias para llevar a cabo esta forma de operación en un STR, trabajando con M. parvus como cepa acumuladora de PHB en ciclos de 24h, 24:24h y 24:48h (Tabla 8) iniciados con una etapa en batch de 72h para partir con 31 una cierta acumulación de PHB y concentración de biomasa en el sistema. Los ciclos de 24:24h son los que reportaron una mayor producción de PHB sin comprometer la estabilidad del sistema, aunque las capacidades de eliminación (EC) obtenidas (~25 g CH4 m-3 h-1) fueron inferiores a los trabajos previos realizados en condiciones similares (Muñoz y otros, 2018). Una EC similar se obtuvo en las primeras tres etapas de los ciclos de 24h, pero los valores de PHB acumulado reportados fueron inferiores (<7,5%); además, las condiciones de limitación de nitrógeno de las últimas dos etapas (6h:18h y 4h:20h) supusieron el deterioro del caldo de cultivo. Por otro lado, trabajar con ciclos de 24:48h reporta los máximos valores de acumulación respecto a las otras dos estrategias, pero la baja capacidad de eliminación alcanzada por el sistema hace que no se presente como una estrategia viable por la baja utilización del sustrato. Tabla 8. Estrategias de operación en ciclos reportadas por Rodríguez y otros (2021) Periodos de alimentación : inanición (h:h) Duración (d) Carga de nitrógeno diaria (mg d-1) EC promedio (g CH4 m-3 h-1) Máxima acumulación de PHB (%w/w peso seco) Ciclos 24h 11:13 7 75 25,2±0,6 0,4±0,0 8:16 7 84 25,5±1,6 7,5±0,7 6:18 7 41 25,3±2,1 8,0±1,0 4:20 7 27 8,8±1,4 <4,5 Ciclos 24:24h 24:24 24 68 24,9±1,5 21,6±2,8 Ciclos 24:48h 24:48 20 68 7,7±1,2 35,5±1 La operación en continuo surge como la opción más adecuada al reportar valores de productividad teóricos mayores a los procesos discontinuos. Esta forma de operar se caracteriza por presentar un aporte continuo de medio mineral fresco, extrayéndose caldo de cultivo en igual proporción del interior del reactor, alcanzándose unas condiciones estacionarias de concentración de sustrato, biomasa y productos que facilita elaborar una estrategia de control y estudiar la fisiología del proceso (Blunt y otros, 2018). Un parámetro de gran importancia a la hora de operar es la velocidad de dilución (D), que viene dada por el cociente entre el volumen útil del sistema y el caudal de trabajo y cuyo valor deberá ser inferior a la velocidad máxima de crecimiento de la biomasa para evitar el lavado del reactor. 38 39 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Materiales Para llevar a cabo los diferentes ensayos se empleó la cepa Methylocystis hirsuta CSC1 (DSM 18500) adquirida de la colección de cultivo Leibniz-Institut DSMZ (Alemania). En el medio mineral empleado (NMS) para su cultivo se empleó nitrato (NO3-) como fuente de nitrógeno. La composición de las diferentes soluciones y los volúmenes empleados para la preparación del medio NMS se detallan en la Tabla 9. Composición del medio mineral NMS y la solución buffer. El pH del medio se ajustó a 6.8 mediante la adición de una solución de buffer fosfato tras ser autoclavado a 121ºC durante 21 min. Tabla 9. Composición del medio mineral NMS y la solución buffer Solución I (Macronutrientes 10×) → 100 mL L-1 KNO3 10,0* g L-1 MgSO4·7H2O 10,8 g L-1 CaCl2·2H2O 2,0 g L-1 Solución II → 0,1 mL·L-1 Fe-EDTA 3,8 g L-1 Solución III → 0,5 mL·L-1 Na2MoO4·2H2O 0,5 g L-1 Solución IV (Elementos traza) → 1 ml·L-1 Na2EDTA·2H2O 0,3 g L-1 CuSO4·5H2O 1,0 g L-1 FeSO4·7H2O 0,5 g L-1 ZnSO4·7H2O 0,4 g L-1 H3BO3 0,015 g·L-1 CoCl2 0,03 g L-1 MnCl2·4H2O 0,02 g L-1 NiCl2·6H2O 0,01 g L-1 Solución V (Buffer)** → 10 ml·L-1 Na2HPO4·12H2O 82,8 g L-1 KH2PO4 26 g L-1 *Mientras no se especifique lo contrario **Adicionada tras la esterilización del medio una vez alcanzada temperatura ambiente 40 Para la elaboración de patrones y análisis del PHB se utilizaron el copolímero PHBPHV (88%PHB-12%PHV) (Sigma-Aldrich, EEUU), 1-propanol (C3H8O, 99,7%), ácido clorhídrico (HCl, 37% w/v), ácido benzoico (C7H6O2, ≥99,5%) y cloroformo (CHCl3, ≥99%). Todas las sales empleadas en la elaboración del medio mineral fueron adquiridas en PanReac AppliChem (Barcelona) exceptuando el KNO3, procedente de Cofarcas S.A. (Burgos). Por otro lado, los gases empleados fueron CH4 (≥99,995%), O2 (≥99,5%) y biogás sintético (70/30% v/v CH4:CO2), todos ellos suministrados por Abelló Linde S.A. (Barcelona). 3.2. Métodos 3.2.1. Procedimiento experimental • Preparación del inóculo Para la preparación del inóculo se partió de un cultivo crecido de M. hirsuta (Figura 20) almacenado a 4ºC. Se tomaron 5 mL de dicho cultivo para inocular las botellas serológicas de 125 mL que contenían 45 mL de NMS bajo condiciones estériles, mientras que el espacio de cabezas (75 mL) estaba formado por una mezcla de O2:CH4 en una proporción de 2:1. Este cultivo fue incubado aproximadamente durante ~10 días con una agitación de 250 rpm a 30ºC (Thermo Fisher Scientific Inc., EEUU) reemplazando cada dos días el espacio de cabezas una vez se consumió todo el metano. Para ello, se pasó oxígeno puro durante 5 min para después intercambiar 25 mL de este gas por CH4 puro, filtrando ambos gases con filtros de 0,22 μm. Figura 20. Inóculo de Methylocysthis hirsuta 41 • Sistema experimental El montaje empleado para llevar a cabo la operación en dos etapas consistió en un quimiostato y una columna de burbujeo (BCB) conectados en serie en este mismo orden, destinándose el primero de ellos al crecimiento de la biomasa y el segundo a la acumulación de PHB (Figura 21). El quimiostato empleado fue el biorreactor Biostat ® A (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemania), formado por un vaso de vidrio de borosilicato con un volumen útil de 2,5 L y una torre de control con tres bombas peristálticas y diversos sensores que permitían el control continuo de pH, nivel y temperatura. El quimiostato, equipado con un impulsor de flujo radial (turbina de disco Rusthon), fue operado a 600 rpm para asegurar una mezcla completa y la ruptura de la burbujas de gas para favorecer el transporte gas-líquido. Además, dispone de una camisa térmica para mantener la temperatura a 30ºC. Por otro lado, la parte superior del reactor estaba equipado con cuatro conexiones a tuberías, destinadas a la entrada de medio fresco y de NaOH 4N para control de pH, a la toma de muestra y a la salida del efluente del reactor, junto con las conexiones de entrada y salida del gas, el sensor digital de pH y la sonda de nivel. La mezcla gaseosa, con una concentración de O2:CH4 del ~18%:9% v/v, se elaboró mediante la unión en una cámara de mezcla de las corrientes de aire comprimido y de biogás sintético suministrado mediante un controlador de flujo másico (GFC17, AalborgTM, EE. UU.). A la salida de la cámara de mezcla, la corriente gaseosa fue dividida en dos y regulada mediante dos rotámetros para suministrar en ambas etapas un caudal de 42 mL min-1, correspondiente a un tiempo de residencia (EBRT) de 60 min. La mezcla gaseosa, filtrada previamente con un filtro de 0,22 µm, se burbujeó de forma continua en el sistema a través de un difusor de acero inoxidable con un tamaño de poro de 2 μm (Supelco, EE. UU.) situado en el fondo del reactor. Respecto a la fase acuosa, este sistema se operó con medio NMS con un valor de pH de 7,07±0,12, variando la concentración de N en cada una de las estrategias llevada a cabo. Por otro lado, la segunda etapa se llevó a cabo en una columna de burbujeo de PVC con un volumen de trabajo de 2,5L (Plasthermar, España). Esta presentaba cuatro conexiones en la tapa, destinadas a la entrada y salida de las corrientes líquidas y gaseosas, y otra en la parte inferior del reactor, empleada para la toma de muestra 42 del caldo de cultivo. Como se ha indicado previamente, el flujo de la mezcla de aire y biogás sintético procedente de la cámara de mezcla se reguló con un rotámetro y se mantuvo a 42 mL min-1 (EBRT = 60 min). Esta corriente se hizo pasar por un filtro de aire para garantizar las condiciones de esterilidad. La entrada al sistema de la mezcla gaseosa se realizó a través de un set de tres difusores con microporos de acero inoxidable, como el descrito en el anterior sistema, colocados en la parte inferior del reactor. Con el fin de maximizar el aprovechamiento de la fuente de carbono y aumentar la transferencia de materia entre las fases líquida y gaseosa, se implementó un sistema de recirculación interna. La corriente de recirculación se hacía pasar por un condensador encamisado con agua a 10ºC para evitar problemas de condensación dentro de esta línea. Además, la agitación en el interior del reactor se complementó con un agitador magnético (Agimatic S, JP Selecta, España) a 500 rpm. Inicialmente, la columna de burbujeo se operó con medio sin nitrógeno (NFMS) para mantener las condiciones limitantes y favorecer así la acumulación de PHB. Una vez iniciada la operación, el efluente del Biostat fue introducido en este reactor empleando una de las bombas presentes en la torre de control anteriormente descrita, mientras que la corriente de salida fue regulada con una bomba Watson Marlon 120S (50 rpm), que se activaba durante 15 min cada hora del día empleando un temporizador. La temperatura de operación de la columna se mantuvo constante a 25ºC en una sala climatizada y se trabajó con un pH de 7,12±0,07 a lo largo de la experimentación. 43 Figura 21. Esquema (A) e imagen (B) del sistema experimental A) B) 44 • Estrategias de operación En la Tabla 10 se presenta un resumen con las principales características de los tres ensayos llevados a cabo en este trabajo fin de grado. Test 1: Operación en continuo con alta carga de nitrógeno Esta primera experiencia se inició con una etapa en batch en el Biostat previa a la operación en continuo. Para ello, el biorreactor fue inoculado al 2% v/v con 50 mL de M. hirsuta bajo condiciones estériles, en 2425 mL de NMS con una concentración de 2 g KNO3 L-1 y 25 mL de solución buffer fosfato, para obtener una concentración de biomasa inicial de 8 mg L-1. Consumido todo el nitrógeno (N-NO3-) presente en el sistema, tras 9 días de operación, se llevó a cabo el acople de la columna con un volumen inicial 2 L de NFMS. Una vez alcanzados los 2,5L que se mantendrían a lo largo de la experimentación gracias a la entrada de caldo de cultivo procedente del quimiostato, se operó con un caudal de 0,5 L d-1 en ambos reactores, resultando en una velocidad de dilución (D) de 0,008 h-1. De esta forma, 500 mL de caldo de cultivo del Biostat fueron reemplazados diariamente por medio mineral fresco con una concentración de 2 g KNO3 L-1, al igual que 500 mL de la BCB fueron reemplazados por el caldo de cultivo procedente del Biostat. Así, el único aporte de N-NO3- que recibía la columna era el presente en el caldo de cultivo del quimiostato. Test 2: Operación en continuo con baja carga de nitrógeno La estrategia de operación empleada fue análoga a la presentada en el Test 1. El Biostat fue inoculado al 2% v/v con M. hirsuta (concentración inicial de 11 mg L-1) en 2425 mL de medio NMS esta vez con una concentración de 1,35 g KNO3 L-1, bajo condiciones estériles. Tras una primera etapa en batch de 6 días de duración, donde se consumió prácticamente todo el N-NO3- presente en el sistema, se llevó a cabo el acople de la columna de burbujeo con 2L de medio NFMS, comenzando así la operación en continuo con un caudal de 0,5L d-1 y alcanzándose un volumen de trabajo de 2,5L en ambos sistemas. A diferencia del caso anterior, donde la concentración de KNO3 del NMS fue la misma tanto en el batch como en la operación 45 en continuo, el medio fresco con el que se renovaba el caldo de cultivo del Biostat presentaba una concentración de 1,045 g KNO3 L-1. Tras 14 días de operación en continuo con una D de 0,008 h-1, se aumentó la velocidad de dilución de ambos sistemas a 0,011 h-1, correspondiente a un caudal de 0,65 L d-1, aumentando así el aporte diario de N-NO3- al quimiostato. Esta segunda etapa de operación se mantuvo durante 7 días. Test 3: Operación en continuo con media carga de nitrógeno Para este último ensayo se optó por reducir el tiempo de operación en batch con el fin de evitar alcanzar condiciones limitantes de nitrógeno en el quimiostato y con ello inducir la acumulación de PHB en esta etapa. El Biostat fue inoculado bajo condiciones estériles con 50 mL de M. hirsuta en 2425 mL de NMS, lo que representó una concentración inicial de biomasa de 22 mg L-1. Para evitar la aparición de nitrito (NO2-) posiblemente asociada al exceso de N-NO3- en el sistema, la concentración de nitrato en esta primera etapa fue de 0,62 g KNO3 L-1. Esta etapa tuvo una duración de 3 días, lo que permitió alcanzar la fase de crecimiento exponencial de la biomasa e iniciarse el aporte externo de N-NO3- en el sistema mediante adición de medio mineral. Tras este periodo de tiempo, la columna de burbujeo se acopló al Biostat, inicialmente con 2 L de NFMS, alcanzando los 2,5L de volumen de trabajo al comenzar la operación en continuo con un caudal de 0,5 L d- 1. El medio NMS fresco introducido en el Biostat en esta etapa en continuo presentaba una concentración de 1,56 g KNO3 L-1. El aporte de medio mineral se mantuvo en 0.5 L d-1 hasta el día 14 de operación, donde se incrementó el caudal de operación a 0,75 L d-1 (D=0,013 h-1) y se pasó a operar con una concentración de KNO3 en NMS de 1 g L-1 para mantener el mismo flujo másico de nitrógeno diario que en la etapa anterior. Esta segunda etapa de operación se mantuvo durante 10 días. 46 Tabla 10. Resumen de las tres estrategias de operación empleadas Duración etapa en batch (d) NMS batch (g KNO3 L-1) NMS continuo (g KNO3 L-1) Aporte N diario etapa en continuo (g N d-1) Etapa 1 Etapa 2 Etapa 1 Etapa 2 Test 1 9 2,00 2,00 0,14 Test 2 6 1,35 1,045 0,07 0,09 Test 3 3 0,62 1,56 1,00 0,11 • Muestreo y monitorización diaria Se llevó a cabo un seguimiento diario tanto de la fase gas como de la fase líquida en ambos sistemas. Respecto a la fase gas, se determinaron las concentraciones de CH4, CO2 y O2 tanto en la entrada como en la salida de ambos reactores, así como el caudal de salida y la caída de presión en cada uno de ellos. Por otro lado, ~30 mL de caldo de cultivo se extrajeron del interior de cada sistema para llevar a cabo la monitorización diaria del pH, densidad óptica a 600 nm (1,5 mL), análisis de PHAs (triplicados de 1,5 mL) y sólidos suspendidos totales (en duplicado, 5-10 mL), junto con el análisis de la concentración de carbono orgánico total y nitrógeno total disuelto (TOC/TN, 15 mL) y de aniones (1,0 mL, Cl-, NO2-, NO3-, PO43- y SO42-). 3.2.2. Métodos analíticos El análisis de las muestras gaseosas se realizó mediante cromatografía de gases en un cromatógrafo Bruker 430 GC-TCD (Bruker Corporation, Palo Alto, EE. UU.) con un detector de conductividad térmica (TCD). Este se encontraba equipado con las columnas CP-PoraBOND Q (25m x 0,53 mm x 10 μm) y CP-Molsieve 5Å (15m x 0,53 mm x 15 μm), ambas adquiridas en Agilent (Santa Clara, EE. UU). Las temperaturas empleadas en el inyector, horno y detector fueron de 150ºC, 45ºC y 200ºC, respectivamente, empleando helio (He) como gas portador a una velocidad de 13,7 47 mL min-1. La inyección de las muestras gaseosas se llevó a cabo con una jeringa de gases de 100 μL (Hamilton Company, NV, EE. UU.) y la medida se realizó por duplicado, despresurizando previamente las muestras de la entrada, con un tiempo de análisis de 5 min por muestra. Por otro lado, la medida de caudal se llevó a cabo por desplazamiento de volumen de líquido, empleando una probeta de 250 mL cronometrando durante dos minutos el caudal de salida, mientras que la caída de presión a la entrada de ambos sistemas fue monitoreada mediante un sensor de presión digital (PN7097, Ifm Electronic, Alemania). Respecto al análisis del caldo de cultivo, la medida de pH se realizó empleando el pH-metro Basic 20 pH (Crison, España). La evolución del crecimiento de la biomasa se llevó a cabo tanto por medición de la densidad óptica como por la medida de sólidos suspendidos totales (TSS) del caldo de cultivo. Para la primera de ellas se empleó el espectrofotómetro SPECTROstar Nano (BMG LABTECH, Alemania), midiendo a 600 nm y empleando como blanco el medio NMS con la concentración correspondiente a cada una de las experiencias llevadas a cabo. Por otro lado, para el análisis de TSS se siguió el método estándar (APHA, 2018) donde las muestras eran filtradas a vacío, secándose el filtro en una estufa a 105ºC durante aproximadamente 24h; tras enfriarse a temperatura ambiente en un desecador durante 15 min, eran pesadas para determinar la cantidad de sólidos suspendidos por la diferencia de la masa del filtro antes y después de este proceso. La medida de aniones de interés, como el NO3- y NO2-, fue llevada a cabo por cromatografía líquida de intercambio iónico (HPLC-IC) con un detector de conductividad (Waters 432, Waters Corporation, EE. UU.), siendo las muestras previamente filtradas con filtros de nylon de 0,22 μm. Este equipo llevaba incorporado la columna IC-PAK Anion HC (4,6 mm x 150 mm) y una pre-columna IC-PAK (Waters, EE. UU.). Por otro lado, el carbono orgánico total (TOC) y nitrógeno total (TN) disueltos en el caldo de cultivo fueron monitoreados diariamente filtrando las muestras con filtros de 0,47 μm y siendo posteriormente medidas con el equipo TOC-LCSH/CSN acoplado a la unidad TNM-1 (Shimadzu, Japón). Para realizar la extracción y análisis de PHB se siguió el protocolo descrito por Chen y otros, 2020, que consistió en una propanólisis ácida con HCl para después medir las muestras en un cromatógrafo de gases Agilent 7820A (GC) acoplado a un 54 4.1.2. Nitrógeno total, N-NO3- y N-NO2- • Arranque STR (batch) Tras dos días de operación en batch en el STR el cultivo comenzó a consumir el N- NO3- presente en el medio hasta su total desaparición en el día 8 (Figura 23 A). En este periodo de tiempo (entre los días 3 y 8), donde ya no existió limitación biológica de la degradación de metano como en días anteriores, se llegó a alcanzar una tasa de consumo de 42,6 g N- NO3- L-1 d-1 (R2=0,99). En esta etapa prácticamente no se registró la presencia de nitrito (N-NO2-) en el caldo de cultivo, siendo 2 mg L-1 (día 3) el valor más alto observado. • Etapa I (continuo, D = 0,008 h-1) Con la entrada de medio fresco al iniciarse la etapa en continuo en el STR (Figura 23 A) pudo observarse que la concentración de N- NO3- aumentó diariamente siguiendo una tendencia lineal, reportándose una tasa de acumulación de 12,12 mg N-NO3- L- 1 d-1 (R2=0,99). Cuando esta acumulación sobrepasó los 54,08 mg L-1 N- NO3- (día 14) la cepa comenzó a desnitrificar, lo que se tradujo en la aparición de NO2- en el caldo de cultivo. La concentración de este anión aumentó de 1,00 mg L-1 N-NO2- en el día 14 hasta alcanzar los 31,07 mg L-1 N- NO2- en el día 17, coincidiendo con la disminución de EC, PCO2 y concentración de biomasa en el caldo de cultivo del STR. Por otro lado, a lo largo de toda la experimentación se observó una concentración de nitrógeno residual de 38,19 ± 1,78 mg L-1. En el caso de la columna de burbujeo (Figura 23 B) no se detectó la presencia ni de nitrato ni de nitrito a lo largo de toda la etapa en continuo. A pesar de que los resultados de TN mostraron un aumento continuo de la concentración de N en el interior del reactor, este se debió exclusivamente a la acumulación de nitrógeno orgánico residual. Por lo tanto, todo el N-NO3- presente en los 500 mL diarios de caldo de cultivo del STR que pasaba a la BCB era consumido por la biomasa presente en éste. Cabe destacar que en ambos reactores se operó con un valor de pH estable a lo largo de la experimentación sin necesidad de control externo. En el caso del CSTR se trabajó con un valor promedio de 7,07±0,24 durante la etapa en batch y 7,19±0,04 55 en la etapa en continuo. En el caso de la columna, se registró un valor promedio de 7,15±0,12 durante la etapa en continuo. Figura 23. Evolución de la concentración de TN (x), N- NO3- (•) y N- NO2- (o) junto con el aporte de nitrógeno diario en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 1 56 4.1.3. Productividad de PHB • Arranque STR (batch) La síntesis de PHB tuvo lugar en el STR durante la etapa en batch a pesar de la presencia nitrato. De este modo, en el día 4 de operación comenzó a observarse cierta acumulación, concretamente la biomasa acumuló un 1,75% (Ec. 7) de PHB en presencia de 164,19 mg L-1 N- NO3- (Figura 24 A). Este valor aumentó en los siguientes días de operación hasta alcanzarse una acumulación del 15,08 ± 0,60%, la máxima observada durante el arranque (día 9). • Etapa I (continuo, D = 0,008 h-1) Con el comienzo de la operación en continuo se detectó la presencia de PHB en ambos reactores. En el caso del CSTR (Figura 24 A) parte del PHB acumulado previamente se consumió tras dos días de operación en esta nueva etapa; sin embargo, a partir del día 11 se observó un cambio de tendencia con aumento en el contenido de PHB, alcanzándose una acumulación del 30,71 ± 1,23% en el último día de operación, la máxima obtenida a lo largo de la experimentación. En el caso de la BCB (Figura 24 B) la acumulación de PHB vino propiciada tanto por la ausencia de nitrógeno en el reactor como por la acumulación proveniente del STR. Pasados dos días desde el comienzo de la segunda etapa se alcanzó una acumulación del 30,24%, valor que se mantendría estable durante los siguientes cuatro días de operación (30,57 ± 0,98%) (desde día 12 a 16). Durante este periodo de tiempo se reportó la máxima productividad volumétrica (Ec. 8) con un valor de 126,68 ± 18,18 g PHB m-3 d-1. En los últimos dos días de operación parte de este PHB acumulado fue consumido, finalizándose el experimento con un porcentaje de PHB del 22,58±0,98% y una productividad volumétrica del 110,24±1,77 g PHB m-3 d-1, respectivamente. 57 Figura 24. Evolución del porcentaje de PHB (◊) y la concentración de N- NO3- (•) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 1 58 4.2. Test 2: Operación en continuo con baja carga de nitrógeno 4.2.1. 1.2.1 Capacidad de eliminación, producción volumétrica y concentración de sólidos • Arranque STR (batch) Inoculado el STR con la cepa M. hirsuta, se llevó a cabo una primera etapa en batch de seis días de duración donde prácticamente se consumió todo el N-NO3- presente en el sistema. De forma análoga al experimento anterior, se dio una primera fase de adaptación del cultivo (días 1 y 2) seguida de una fase de crecimiento exponencial de la biomasa (Figura 25 A). En esta fase, que se dio entre los días 2 y 5 de operación, se llegó a alcanzar una productividad volumétrica de 0,29 g biomasa L-1 d-1 (R2=0,99) resultando en una producción de 0,74 g biomasa d-1. La velocidad específica de crecimiento máxima fue de 0,81 d-1 (R2=0,99) y se finalizó la etapa en batch con una densidad de cultivo de 1,197±0,003 g L-1. Por otro lado, tanto la capacidad de eliminación de CH4 como la producción de CO2 se estabilizaron entre los días 3 y 6 de operación alcanzando un valor promedio de EC y PCO2 de 25,04 ± 0,33 g CH4 m-3 h-1 (correspondiente a una RE del 43,91 ± 0,45%) y 52,68 ± 2,26 g CO2 m-3 h-1, respectivamente (Figura 25 A). El valor de pH del caldo de cultivo en el STR también se mantuvo estable durante toda esta etapa (6,90±0,17), al igual que el ratio de PCO2 EC-1 (1,75±0,78 g CO2 (g CH4)-1). • Etapa I (continuo, D = 0,008 h-1) En el sexto día de operación se produjo el cambio de etapa, en la que se siguió observando un aumento de la concentración de biomasa que acabó estabilizándose en 1,71±0,03 g biomasa L-1 entre los días 10 y 13 (Figura 25 A). Esto indica que durante los primeros días de esta etapa la producción de biomasa fue mayor que la cantidad de biomasa diaria extraída del STR, llegándose posteriormente a un equilibrio entre lo extraído y lo generado en el reactor durante el estado estacionario. Respecto a los valores de EC y PCO2, cabe destacar que ambos se mantuvieron estables hasta el día 12 de operación (26,59±0,74 g CH4 m-3 h-1 y 54,36±2,32 g CO2 m-3 h-1 respectivamente), valores muy similares a los alcanzados durante la etapa en batch. El ratio PCO2 EC-1 resultante en esta primera etapa en continuo tuvo un valor 59 promedio de 1,99±0,13 g CO2 (g CH4)-1. Finalmente, en los dos últimos días (días 13 y 14) se produjo la caída de EC y PCO2, finalizando la etapa con una capacidad de eliminación de CH4 de 18,83 g CH4 m-3 h-1, correspondiente a una eficacia de eliminación del 29,20%, y una producción de CO2 de 37,31 g CO2 m-3 h-1. También se observó una ligera disminución de la densidad del caldo de cultivo, de forma que se llegó al día 14 de operación con una concentración de biomasa de 1,64 ± 0,00 g L-1. En la columna de burbujeo (Figura 25 B) se registró un aumento continuo de la densidad del caldo de cultivo en el reactor, alcanzándose una concentración máxima de biomasa al final de la etapa de 1,68±0,02 g biomasa L-1. Los valores de EC y PCO2 variaron a lo largo de los ocho días, dándose sus valores máximos en momentos distintos del experimento. La mayor capacidad de eliminación se reportó en los días 12 y 13 de operación, con un valor promedio de 10,45 ± 0,41 g CH4 m-3 h-1 (RE=17,36±0,54%), coincidiendo con la menor producción de CO2 (4,63±0,89 g CO2 m-3 h-1). Por el contrario, fue en los días 9 y 10 cuando este último parámetro alcanzó su máximo valor, de 11,96±1,35 g CO2 m-3 h-1, coincidiendo con el menor valor de EC reportado (6,07±0,54 g CH4 m-3 h-1). La menor capacidad de eliminación se registró en el día 14 de operación, último de esta etapa, con un valor de 4,18 g CH4 m-3 h-1 (RE=7,57%). El ratio de PCO2 EC-1, debido a las fluctuaciones observadas en estos dos parámetros, varió entre 0,4 y 2 g CO2 (g CH4)-1. • Etapa II (continuo, D = 0,011 h-1) El paso a la segunda etapa, donde se aumentó la velocidad de dilución del sistema, propició la disminución de biomasa presente en el STR (Figura 25 A). De esta forma, a lo largo de los siete días de operación con esta configuración se observó una tendencia decreciente en la evolución de la concentración de la biomasa, sin alcanzar un valor estacionario, finalizando el experimento con un valor de 0,631±0,003 g biomasa L-1. Los valores de EC y PCO2 también disminuyeron con el cambio de etapa, observándose en los últimos tres días un valor promedio de 6,80±1,44 g CH4 m-3 h-1 (RE=11,21±5,51%) y 11,85±2,40 g CO2 m-3 h-1, respectivamente. Las condiciones empleadas en esta etapa resultaron en una ligera disminución del ratio de mineralización del metano (1,86±0,21 g CO2 (g CH4)-1). 60 Sin embargo, este cambio de etapa tuvo un impacto positivo durante los primeros días de operación en la BCB (Figura 25 A). La concentración de biomasa se estabilizó en 1,72±0,00 g biomasa L-1 entre los días 14 y 16, aunque en los días siguientes este valor disminuyó hasta una concentración de 0,54 g biomasa L-1 en el último día de operación. Respecto a la capacidad de eliminación de este biorreactor, se observó una cierta recuperación hasta situarse en 10,33±1,88 g CH4 m-3 h-1, un valor promedio similar al valor máximo reportado en la etapa anterior. Por el contrario, la producción de CO2 presentó un aumento continuo hasta el día 18 de operación, alcanzándose los 37,40 g CO2 m-3 h-1. Ambos parámetros disminuyeron los dos últimos días del experimento, que finalizó con un valor de EC y PCO2 de 5,11 g CH4 m-3 h-1 y 10,57 g CO2 m-3 h-1, respectivamente. En cuanto al ratio de mineralización se observó una gran variación en los valores obtenidos (0,2-4,4 g CO2 (g CH4)-1), similares a los de la etapa anterior. 61 Figura 25. Evolución de la biomasa medida según OD600 (Δ) y TSS (▲), EC (□) y PCO2 ( ⬛ ) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 2 62 4.2.2. Nitrógeno total, N-NO3- y N-NO2- • Arranque STR (batch) Junto con el crecimiento de la biomasa en el STR se inició el consumo de N- NO3- presente en el caldo de cultivo (Figura 26 A) hasta finalizar la etapa con 18,3 mg L-1 N- NO3-, consumiéndose así el 91% del nitrógeno presente en el reactor. Entre los días 2 y 6 de operación se dio la mayor tasa de consumo, con un valor de 36,18 mg N-NO3- L-1 d-1 (R2=0,99). Además, durante estos seis días de operación no se detectó presencia de nitrito y el pH se mantuvo en un valor estable (6,92±0,17). • Etapa I (continuo, D = 0,008 h-1) Tras el inicio de la primera etapa en continuo, se consumió todo el N-NO3- presente en el STR (Figura 26 A). A pesar de la entrada diaria de medio fresco, prácticamente no se detectó la presencia de nitrógeno en forma de nitrato a lo largo de esta etapa en continuo, observándose solamente de forma esporádica (6,8 mg L-1 N-NO3- en el día 8). Por lo tanto, todo el N-NO3- alimentado diariamente era consumido por la biomasa presente en el caldo de cultivo, sin apreciarse actividad desnitrificante. La diferencia entre los resultados obtenidos por el análisis de aniones y TN revelaron que la concentración de nitrógeno orgánico residual era de 36,66±4,26 mg L-1 N. El valor de pH se mantuvo estable a lo largo de esta etapa, con un valor promedio de 7,07±0,05. La ausencia de N- NO3- en el STR durante esta etapa hizo que no llegara nitrógeno en forma de nitrato a la columna (Figura 26B). Por lo tanto, los resultados proporcionados por el TN se debieron exclusivamente a la presencia de nitrógeno orgánico residual, a excepción del día 12 donde se observó un valor de 1,8 mg L-1 N- NO3-. Tampoco se detectó la presencia de nitrito durante esta etapa. El valor promedio de pH fue de 7,05±0,23. • Etapa II (continuo, D = 0,011 h-1) Con el aumento de la velocidad de dilución en la segunda etapa, se pasó de operar con un aporte de nitrógeno diario de 72,5 mg d-1 N a 95 mg d-1 N, lo que propició la acumulación de nitrógeno en forma de NO3- en el STR (Figura 26 A). Esta acumulación presentó una tendencia lineal, con una tasa de acumulación de 11,05 63 mg N L-1 d-1. De forma análoga al experimento anterior, la acumulación de N-NO3- en el caldo de cultivo favoreció la aparición de nitrito (<2 mg L-1 N- NO2-). La acumulación de N-NO3- en el STR originó la llegada de este compuesto a la columna (Figura 26 B), que fue consumido en su totalidad entre los días 15 y 16 de operación. Sin embargo, a partir del día 17 el N-NO3- empezó a acumularse, finalizando la experimentación con 36,8 mg L-1 N- NO3- Además, se observó la presencia de nitrito, con un valor estable de 1,37±0,28 mg L-1 N- NO2- a lo largo de toda la etapa, y una gran acumulación de nitrógeno orgánico residual en el sistema, que llegó a alcanzar una concentración de 31,03 mg L-1 N (día 21). 70 días, con un valor promedio de 16,46±0,84 g CH4 m-3 h-1 (RE=27,7±1,3%) y 30,15±2,21 g CO2 m-3 h-1, respectivamente, al igual que lo hizo el valor del ratio PCO2 EC-1 (1,83±0,08 g CO2 (g CH4)-1)), que apenas varió con el cambio de etapa. En el caso de la BCB (Figura 28 B), se observó una caída continua de la concentración de biomasa, finalizándose la experimentación con un valor de 0,52±0,03 g biomasa L-1. Sin embargo, la capacidad de eliminación de CH4 y la producción de CO2 observadas en este sistema aumentaron. La EC pasó de un valor de 3,69 g CH4 m-3 h-1 (día 23) a estabilizarse en un valor promedio de 12,69±1,17 g CH4 m-3 h-1 desde el día 30 hasta el final del experimento. Por otro lado, la PCO2 presentó un aumento durante esta última etapa en continuo, la cual finalizó con un valor de 41,73 g CO2 m-3 h-1. El comportamiento del ratio de mineralización del metano fue similar al reportado en la etapa anterior, con valores que fluctuaron entre 2,9 y 4,2 g CO2 (g CH4)-1). 71 Figura 28. Evolución de la biomasa medida según OD600 (Δ) y TSS (▲), EC (□) y PCO2 ( ⬛ ) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 3 72 4.3.2. Nitrógeno total, N-NO3- y N-NO2- • Arranque STR (batch) El consumo de nitrógeno se inició tras unas 24 h de fase de latencia, llegando a consumirse un 46% del nitrógeno en forma de nitrato al finalizar este periodo (Figura 29 A). Asimismo, la presencia de N-NO2- fue despreciable. • Etapa I (continuo, D = 0,008 h-1) Esta etapa en continuo se inició con 49,51 mg L-1 N- NO3- en el caldo de cultivo del STR, una concentración que se mantendría estable durante los siguientes cuatro días de operación, por lo que todo el N-NO3- proporcionado en la alimentación fue consumido por el cultivo metanotrófico presente en el interior del reactor (Figura 29 A). Fue a partir del día 7 cuando el sistema comenzó a demandar una mayor cantidad de N respecto a lo aportado, lo que se tradujo en una disminución de la concentración de N- NO3- hasta los 18,13 mg L-1 en el día 12 de operación. En los días siguientes se observó un cambio de tendencia y el nitrógeno comenzó a acumularse en el interior del STR, finalizando la etapa con una concentración de 76,03 mg L-1 N-NO3-. Cabe destacar que sólo se registró la presencia de nitrito entre los días 6 y 9 de operación (<2,33 mg L-1 N-NO2-), y en los dos últimos días de esta primera etapa en continuo, la cual finalizó con una concentración de 2,99 mg L-1 N- NO2-. Además, durante esta etapa se detectó una cantidad de nitrógeno orgánico residual que varió entre los 8,60 y 22,59 mg L-1 N. En la columna de burbujeo, apenas se detectó la presencia de nitrógeno en forma de NO3- y NO2- (Figura 29 B). La concentración N-NO3- presentó valores muy bajos entre los días 3 y 19 de operación, alcanzándose un valor máximo de 6,4 mg L-1 N- NO3-, que fue consumido al día siguiente. Sólo se observó una cierta acumulación de N-NO3- durante los cuatro últimos días de esta etapa, propiciada por la acumulación que se estaba produciendo en el STR, hasta alcanzar los 19,42 mg L-1 N-NO3- en el día 23. Por otro lado, similar a lo observado en el STR, apenas se detectó la presencia de nitrito en este reactor, observándose un pico en el día 23 de operación (2,77 mg L-1 N-NO2-). Cabe destacar la gran cantidad de nitrógeno orgánico residual que se originó en la BCB, que llegó a alcanzar un valor promedio de 44,41±1,85 mg L-1 N 73 durante los últimos cuatro días de operación en esta etapa, duplicando el valor máximo alcanzado en el STR. • Etapa II (continuo, D = 0,013 h-1) En esta segunda etapa en continuo se mantuvo el aporte de nitrógeno diario de la etapa I con una menor concentración de nitrato pero una mayor velocidad de dilución (Figura 29 A). Estas condiciones dieron lugar a una estabilización del N-NO3- a partir del segundo día de operación, y su concentración se mantuvo en un valor promedio de 72,63±2,98 mg L-1 N-NO3-, siendo consumido todo el nitrógeno aportado en el sistema con la entrada de medio fresco. Además, tanto la concentración de N-NO2- como de nitrógeno orgánico residual se mantuvieron en un valor estable de 1,68±2,98 mg L-1 N-NO2- y 13,38±3,76 mg L-1 N, respectivamente. En el caso de la BCB, a pesar de operar con una velocidad de dilución mayor, se continuó observando la acumulación de nitrógeno en forma de nitrato como en los últimos días de la etapa anterior (Figura 29 B). Este aumento de la concentración de N-NO3- se produjo hasta el día 28 de operación, donde se alcanzaron 44,02 mg L-1 N-NO3-, iniciándose después un periodo de mayor consumo que duraría hasta día 34, finalizando el experimento con 12,88 mg L-1 N-NO3-. Se registraron concentraciones de nitrito estables (2,00±0,95 mg L-1 N-NO2-) similares a las observadas en el STR. Además, se continuó dando gran acumulación de nitrógeno orgánico residual, ya observada en la etapa anterior, alcanzando los 70,35 mg L-1 N en el día 33 de operación. Durante las tres etapas se operó con un valor de pH estable en los dos reactores. En el caso del STR se obtuvieron valores del 7,05±0,05, 7,23±0,06 y 7,14±0,05 en el batch, primera y segunda etapa en continuo, respectivamente. Similares fueron los valores de pH medidos en la columna, de 7,14±0,15 en la primera etapa y 7,21±0,06 en segunda. 74 Figura 29. Evolución de la concentración de TN (x), N- NO3- (•) y N- NO2- (o) junto con el aporte de nitrógeno diario en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 3 75 4.3.3. Productividad de PHB • Arranque STR (batch) La acumulación de PHB en el STR se inició durante la etapa en batch (Figura 30 A), alcanzándose un porcentaje del 25,94% en el día 3 de operación. • Etapa I (continuo, D = 0,008 h-1) En esta etapa prosiguió la acumulación de PHB, alcanzándose un valor máximo del 42,16% en el día 5 (Figura 30 A). En los cinco días siguientes éste comenzó a caer, reduciéndose su valor hasta el 3,92%. Entre los días 9 y 13 se mantuvo el contenido de PHB en valores bajos (5,33±1,27%), coincidiendo con el periodo en el que el sistema consumía todo el nitrógeno aportado con la entrada de medio fresco. Inesperadamente, desde el día 13 de operación se observó un cambio de tendencia, donde se reduce el consumo de N-NO3- aportado y se observó nuevamente síntesis de PHB hasta alcanzar una acumulación máxima de 48,21% en el día 22 de operación. Sin embargo, en los dos días siguientes este valor cae hasta el 27,94%, coincidiendo con el aumento de la velocidad de dilución. En el caso de la BCB se observaron dos fases claramente diferenciadas de síntesis y consumo de PHB a lo largo de esta etapa en continuo (Figura 30 B). Por un lado, la entrada de caldo de cultivo procedente del STR, cuya biomasa presentaba una cierta cantidad de PHB, hizo que su acumulación fuera representativa prácticamente desde el inicio de la operación, reportándose un valor del 26,00% en el día 5. Este valor se incrementó en los tres días siguientes hasta alcanzar un 47,14% de acumulación de PHB en el reactor (día 8), el valor máximo de toda la etapa, correspondiente a una productividad volumétrica del 89,11 g PHB m-3 d-1. Prácticamente todo este PHB fue consumido, llegando a un valor del 3,07% en el día 13 de operación. En los dos días siguientes se observó una ligera recuperación para después volver a caer la acumulación hasta el 2,39% (día 15). Entre los días 15 y 18 de operación, se observó nuevamente acumulación, alcanzándose en el día 18 un porcentaje de PHB acumulado del 26,75% y una productividad volumétrica similar a la máxima alcanzada (87,68 g PHB m-3 d-1). De forma similar a lo ocurrido previamente, este PHB se consumió en los días siguientes hasta alcanzar un 1,94% en el día 21 de 76 operación, el mínimo valor de toda la etapa. En los dos días siguientes se observó una ligera recuperación, finalizando la etapa con un 5,29% de PHB acumulado en la columna. • Etapa II (continuo, D = 0,013 h-1) En el inicio de la segunda etapa, se observó un aumento del porcentaje acumulado tras una ligera caída inicial (Figura 30 A), llegándose a un valor promedio del 40,20±2,68% hasta el día 33 de operación, último día del experimento. En la columna continuó aumentando el porcentaje de PHB acumulado hasta observarse un valor estable entre los días 25 y 28 de operación del 8,51±0,44%, correspondiente a una productividad de 21,42±3,88 g PHB m-3 d-1 (Figura 30 B). Sorprendentemente, este aumento se produjo a la par que el incremento de N-NO3- presente en el reactor, al igual que se observó el consumo de ambos entre los días 28 y 33 de operación, finalizando así el experimento con un 2,75% de PHB acumulado en el reactor. 77 Figura 30. Evolución del porcentaje de PHB (◊) y la concentración de N- NO3- (•) en el STR (A) y en la columna de burbujeo (B) a lo largo del Test 3 78 79 5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 5.1. Efecto de concentración de N-NO3- sobre el desempeño del sistema La operación en batch llevada a cabo en los Test 1 y 2 sirvió para dilucidar la relación entre el consumo de nitrógeno experimental y el valor teórico calculado a partir de la EC (Ec. 1). En ambos casos, se observó que la demanda de N-NO3- por parte del sistema fue ~1,5 veces superior al valor teórico estimado. Esta discrepancia revela que, además del consumo de nitrógeno por asimilación, tienen lugar otras reacciones disimilatorias, con la consecuente producción de óxidos de nitrógeno (Cai y otros, 2015). Por otro lado, la alta carga de nitrógeno que se empleó inicialmente en los Test 1 y 2, con el fin de evitar que la limitación de nutrientes afectara a la actividad metanogénica, no indujo la acumulación de nitrito a pesar de la aparente actividad desnitrificante. En el Test 1 los valores de EC y PCO2 se mantuvieron constantes tras la caída de éstos, observado en los días finales de la etapa en batch, posiblemente causado por la falta de N-NO3- en el caldo de cultivo. A lo largo de la operación en continuo la EC en el CSTR presentó un valor promedio de ~30 g CH4 m-3 h-1, ligeramente inferior a los valores reportados en otros trabajos con STR y una agitación de 600 rpm (42.5±5.4 g CH4 m-3 h-1)(Muñoz y otros, 2018), empleando un consorcio de microorganismos metanotróficos. Para este valor de EC la demanda teórica de nitrógeno (Ec. 1) fue de 34 mg N-NO3- L-1 d-1, inferior al aporte diario de N-NO3- (55 mg N-NO3- L-1 d-1). Esto provocó que el N-NO3- que no era consumido se acumulara favoreciendo la actividad desnitrificante (Bordel y otros, 2019). Cuando se alcanzó una concentración de 25 mg N-NO2- L-1, sustancia inhibidora de la actividad metanotrófica (Strong y otros, 2015), se observa un descenso en los valores de EC, PCO2 y concentración de biomasa. Estos resultados muestran que el cultivo, bajo estas condiciones,presentó una menor tolerancia al N-NO2- que la reportada en trabajos previos, donde la inhibición se observa a partir de los ~60 mg N-NO2 L-1 (Rodríguez y otros, 2020). Respecto a la BCB, no se detectó la presencia ni de N-NO3- ni de N-NO2-, por lo que el bajo valor de EC promedio alcanzado en este reactor (~20 g CH4 m-3 h-1) respecto a los ~40 g CH4 m-3 h-1 reportados en trabajos análogos (Rodríguez y otros, 2020) no puede relacionarse con la presencia de nitrito en el reactor sino como deficiencias metabólicas debidas a la limitación por nitrógeno. 86 87 7. BIBLIOGRAFÍA Asenjo, J. A., & Suk, J. S. (1986). Microbial Conversion of Methane into poly-β- hydroxybutyrate (PHB): Growth and intracellular product accumulation in a type II methanotroph. Journal of Fermentation Technology. https://doi.org/10.1016/0385-6380(86)90118-4 Blunt, W., Levin, D. B., & Cicek, N. (2018). Bioreactor operating strategies for improved polyhydroxyalkanoate (PHA) productivity. En Polymers. https://doi.org/10.3390/polym10111197 Bordel, S., Rodríguez, E., & Muñoz, R. (2019). Genome sequence of Methylocystis hirsuta CSC1, a polyhydroxyalkanoate producing methanotroph. MicrobiologyOpen. https://doi.org/10.1002/mbo3.771 Bugnicourt, E., Cinelli, P., Lazzeri, A., & Alvarez, V. (2014). Polyhydroxyalkanoate (PHA): Review of synthesis, characteristics, processing and potential applications in packaging. Express Polymer Letters. https://doi.org/10.3144/expresspolymlett.2014.82 Cai, C., Hu, S., Guo, J., Shi, Y., Xie, G. J., & Yuan, Z. (2015). Nitrate reduction by denitrifying anaerobic methane oxidizing microorganisms can reach a practically useful rate. Water Research. https://doi.org/10.1016/j.watres.2015.09.026 Cai, Y., Zheng, Y., Bodelier, P. L. E., Conrad, R., & Jia, Z. (2016). Conventional methanotrophs are responsible for atmospheric methane oxidation in paddy soils. Nature Communications. https://doi.org/10.1038/ncomms11728 Cantera, S., Muñoz, R., Lebrero, R., López, J. C., Rodríguez, Y., & García-Encina, P. A. (2018). Technologies for the bioconversion of methane into more valuable products. En Current Opinion in Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2017.12.021 Chen, X., Rodríguez, Y., López, J. C., Muñoz, R., Ni, B. J., & Sin, G. (2020). Modeling of Polyhydroxyalkanoate Synthesis from Biogas by Methylocystis hirsuta. ACS Sustainable Chemistry and Engineering. https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.9b07414 88 Chen, X. Y., Vinh-Thang, H., Ramirez, A. A., Rodrigue, D., & Kaliaguine, S. (2015). Membrane gas separation technologies for biogas upgrading. En RSC Advances. https://doi.org/10.1039/c5ra00666j Cherubini, F. (2010). The biorefinery concept: Using biomass instead of oil for producing energy and chemicals. Energy Conversion and Management. https://doi.org/10.1016/j.enconman.2010.01.015 Cuesta Santianes, M. J., Martín Sanchez, F., Gema, V. C., & Villar Fernández, S. (2017). Situación actual de la producción de biogás y de su aprovechamiento. Colección de Informes de Vigilancia Tecnológica madri+d. http://www.madrid.org/media/mtec/17_Situacion_actual_produccion_biogas_ y_aprovechamiento.pdf Dobre, P., Nicolae, F., & Matei, F. (2014). Main factors affecting biogas production- An overview. Romanian Biotechnological Letters. Du, G., Chen, J., Yu, J., & Lun, S. (2001). Continuous production of poly-3- hydroxybutyrate by Ralstonia eutropha in a two-stage culture system. Journal of Biotechnology. https://doi.org/10.1016/S0168-1656(01)00266-8 EBA. (2020). EBA STATISTICAL REPORT 2020. Ebrahimi, S., Picioreanu, C., Xavier, J. B., Kleerebezem, R., Kreutzer, M., Kapteijn, F., Moulijn, J. A., & Van Loosdrecht, M. C. M. (2005). Biofilm growth pattern in honeycomb monolith packings: Effect of shear rate and substrate transport limitations. Catalysis Today. https://doi.org/10.1016/j.cattod.2005.06.051 European Bioplastics. (2020). BIOPLASTICS MARKET UPDATE 2020. https://docs.europeanbioplastics.org/conference/Report_Bioplastics_Market_Data_2020_short_vers ion.pdf European Comission. (2020). Marco sobre clima y energía para 2030 | Acción por el Clima. En European Comission. FAO, MINENERGIA, PNUD, & GEF. (2011). Manual del Biogás. En Proyecto CHI/00/G32. 89 García-Pérez, T., López, J. C., Passos, F., Lebrero, R., Revah, S., & Muñoz, R. (2018). Simultaneous methane abatement and PHB production by Methylocystis hirsuta in a novel gas-recycling bubble column bioreactor. Chemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.cej.2017.10.106 Hagman, L., Blumenthal, A., Eklund, M., & Svensson, N. (2018). The role of biogas solutions in sustainable biorefineries. Journal of Cleaner Production. https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2017.03.180 Hamilton, Doug; Graves, Robert; Gould, C. (2019). Types of Anaerobic Digesters. https://farm-energy.extension.org/types-of-anaerobic-digesters/ Hanson, R. S., & Hanson, T. E. (1996). Methanotrophic bacteria. En Microbiological Reviews. https://doi.org/10.1128/mmbr.60.2.439-471.1996 IDAE. (2007). Biomasa: Digestores anaerobios. En Instituto para la Diversificación y Ahorro de la Energía (IDAE). IRENA. (2019). Renewable Energy Statistics 2019. International Renewable Energy Agency. Kadam, R., & Panwar, N. L. (2017). Recent advancement in biogas enrichment and its applications. En Renewable and Sustainable Energy Reviews. https://doi.org/10.1016/j.rser.2017.01.167 Kalyuzhnaya, M. G., Puri, A. W., & Lidstrom, M. E. (2015). Metabolic engineering in methanotrophic bacteria. Metabolic Engineering. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2015.03.010 Kampman, B., Leguijt, C., Scholten, T., Tallat-Kelpsaite, J., Brückmann, R., Maroulis, G., Lesschen, J. P., Meesters, K., Sikirica, N., & Elbersen, B. (2017). Optimal use of biogas from waste streams - An assessment of the potential of biogas from digestion in the EU beyond 2020. Optimal use of biogas from waste streams. Kaur, G., & Roy, I. (2015). Lipopolystrategies for large-scale production of Polyhydroxyalkanoates. En Chemical and Biochemical Engineering Quarterly. https://doi.org/10.15255/CABEQ.2014.2255 90 Koller, M. (2020). The Handbook of Polyhydroxyalkanoates. En The Handbook of Polyhydroxyalkanoates. https://doi.org/10.1201/9781003087663 Koller, M., & Braunegg, G. (2015). Potential and prospects of continuous polyhydroxyalkanoate (PHA) production. En Bioengineering. https://doi.org/10.3390/bioengineering2020094 Kornhauser, A. (2010). Applications of hydroxy acids: classification, mechanisms, and photoactivity. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. https://doi.org/10.2147/ccid.s9042 Lisowyj, M., & Wright, M. M. (2020). A review of biogas and an assessment of its economic impact and future role as a renewable energy source. Reviews in Chemical Engineering. https://doi.org/10.1515/revce-2017-0103 López, J. C., Arnáiz, E., Merchán, L., Lebrero, R., & Muñoz, R. (2018). Biogas-based polyhydroxyalkanoates production by Methylocystis hirsuta: A step further in anaerobic digestion biorefineries. Chemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.cej.2017.09.185 López, J. C., Rodríguez, Y., Pérez, V., Lebrero, R., & Muñoz, R. (2019). CH4-based polyhydroxyalkanoate production: A step further towards a sustainable bioeconomy. En Biotechnological Applications of Polyhydroxyalkanoates. https://doi.org/10.1007/978-981-13-3759-8_11 Meegoda, J. N., Li, B., Patel, K., & Wang, L. B. (2018). A review of the processes, parameters, and optimization of anaerobic digestion. En International Journal of Environmental Research and Public Health. https://doi.org/10.3390/ijerph15102224 Muñoz, R., Soto, C., Zuñiga, C., & Revah, S. (2018). A systematic comparison of two empirical gas-liquid mass transfer determination methodologies to characterize methane biodegradation in stirred tank bioreactors. Journal of Environmental Management. https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2018.03.097 Murrell, J. C., & Dalton, H. (1983). Nitrogen fixation in obligate methanotrophs. Journal of General Microbiology. https://doi.org/10.1099/00221287-129-11- 3481 91 Neczaj, E., & Grosser, A. (2019). Biogas production by thermal hydrolysis and thermophilic anaerobic digestion of waste-activated sludge. En Industrial and Municipal Sludge: Emerging Concerns and Scope for Resource Recovery. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815907-1.00031-3 Nelson, R. (2010). Methane Generation from Anaerobic Digesters: Considering Different Substrates. Environmental Biotechnology. Nsair, A., Cinar, S. O., Alassali, A., Qdais, H. A., & Kuchta, K. (2020). Operational Parameters of Biogas Plants: A Review and Evaluation Study. En Energies. https://doi.org/10.3390/en13153761 Pérez, V., Lebrero, R., & Muñoz, R. (2020). Comparative Evaluation of Biogas Valorization into Electricity/Heat and Poly(hydroxyalkanoates) in Waste Treatment Plants: Assessing the Influence of Local Commodity Prices and Current Biotechnological Limitations. ACS Sustainable Chemistry and Engineering. https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.0c01543 Pérez, V., Mota, C. R., Muñoz, R., & Lebrero, R. (2020). Polyhydroxyalkanoates (PHA) production from biogas in waste treatment facilities: Assessing the potential impacts on economy, environment and society. Chemosphere. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2020.126929 Pieja, A. J., Sundstrom, E. R., & Criddle, C. S. (2011). Poly-3-hydroxybutyrate metabolism in the type II Methanotroph Methylocystis parvus OBBP. Applied and Environmental Microbiology. https://doi.org/10.1128/AEM.00509-11 Poltronieri, P., & Kumar, P. (2017). Polyhydroxyalcanoates (PHAs) in Industrial Applications. En Handbook of Ecomaterials. https://doi.org/10.1007/978-3- 319-48281-1_70-1 Rahnama, F., Vasheghani-Farahani, E., Yazdian, F., & Shojaosadati, S. A. (2012). PHB production by Methylocystis hirsuta from natural gas in a bubble column and a vertical loop bioreactor. Biochemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.bej.2012.03.014 Raza, Z. A., Abid, S., & Banat, I. M. (2018). Polyhydroxyalkanoates: Characteristics, production, recent developments and applications. En International 92 Biodeterioration and Biodegradation. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2017.10.001 Rocha-Rios, J., Kraakman, N. J. R., Kleerebezem, R., Revah, S., Kreutzer, M. T., & van Loosdrecht, M. C. M. (2013). A capillary bioreactor to increase methane transfer and oxidation through Taylor flow formation and transfer vector addition. Chemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.cej.2012.11.065 Rocha-Rios, José, Bordel, S., Hernández, S., & Revah, S. (2009). Methane degradation in two-phase partition bioreactors. Chemical Engineering Journal. https://doi.org/10.1016/j.cej.2009.04.028 Rodríguez, Yadira; García, Silvia; Pérez, Rebeca; Lebrero, Raquel; Muñoz, R. (2021). Optimization of nitrogen feeding strategies for improving polyhydroxybutyrate production from biogas by Methylocystis parvus OBBP in a stirred tank reactor. En revisión Rodríguez, Y., Firmino, P. I. M., Arnáiz, E., Lebrero, R., & Muñoz, R. (2020). Elucidating the influence of environmental factors on biogas-based polyhydroxybutyrate production by Methylocystis hirsuta CSC1. Science of the Total Environment. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.135136 Rodríguez, Y., Firmino, P. I. M., Pérez, V., Lebrero, R., & Muñoz, R. (2020). Biogas valorization via continuous polyhydroxybutyrate production by Methylocystis hirsuta in a bubble column bioreactor. Waste Management. https://doi.org/10.1016/j.wasman.2020.06.009 Rodríguez, Y., Pérez, V., López, J. C., Bordel, S., Igor Firmino, P., Lebrero, R., & Muñoz, R. (2020). Coupling Biogas with PHA Biosynthesis. En The Handbook of Polyhydroxyalkanoates. https://doi.org/10.1201/9780429296611-16 Rostkowski, K. H., Pfluger, A. R., & Criddle, C. S. (2013). Stoichiometry and kinetics of the PHB-producing Type II methanotrophs Methylosinus trichosporium OB3b and Methylocystis parvus OBBP. Bioresource Technology. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2012.12.129 Sander, R. (2015). Compilation of Henry’s law constants (version 4.0) for water as 93 solvent. Atmospheric Chemistry and Physics. https://doi.org/10.5194/acp-15- 4399-2015 Sarker, S., Lamb, J. J., Hjelme, D. R., & Lien, K. M. (2019). A review of the role of critical parameters in the design and operation of biogas production plants. En Applied Sciences (Switzerland). https://doi.org/10.3390/app9091915 Sayara, T., & Sánchez, A. (2019). A review on anaerobic digestion of lignocellulosic wastes: Pretreatments and operational conditions. En Applied Sciences (Switzerland). https://doi.org/10.3390/app9214655 Scarlat, N., Dallemand, J. F., & Fahl, F. (2018). Biogas: Developments and perspectives in Europe. En Renewable Energy. https://doi.org/10.1016/j.renene.2018.03.006 Stein, L. Y., & Klotz, M. G. (2011). Nitrifying and denitrifying pathways of methanotrophic bacteria. Biochemical Society Transactions. https://doi.org/10.1042/BST20110712 Strong, P. J., Xie, S., & Clarke, W. P. (2015). Methane as a resource: Can the methanotrophs add value? En Environmental Science and Technology. https://doi.org/10.1021/es504242n Sundstrom, E. R., & Criddle, C. S. (2015). Optimization of methanotrophic growth and production of poly(3-hydroxybutyrate) in a high-throughput microbioreactor system. Applied and Environmental Microbiology. https://doi.org/10.1128/AEM.00025-15 Takeda, K. (1988). Characteristics of a nitrogen-fixing methanotroph, Methylocystis T-1. Antonie van Leeuwenhoek. https://doi.org/10.1007/BF00588388 Tays, C., Guarnieri, M. T., Sauvageau, D., & Stein, L. Y. (2018). Combined effects of carbon and nitrogen source to optimize growth of proteobacterial methanotrophs. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02239 Trotsenko, Y. A., & Murrell, J. C. (2008). Metabolic Aspects of Aerobic Obligate Methanotrophy{star, open}. En Advances in Applied Microbiology. 94 https://doi.org/10.1016/S0065-2164(07)00005-6 Weiland, P. (2010). Biogas production: Current state and perspectives. En Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253-009-2246- 7 Wendlandt, K. D., Jechorek, M., Helm, J., & Stottmeister, U. (2001). Producing poly- 3-hydroxybutyrate with a high molecular mass from methane. Journal of Biotechnology. https://doi.org/10.1016/S0168-1656(00)00408-9 Wilkinson, K. (2011). Development of on-farm anaerobic digestion. BioCycle. https://doi.org/10.5772/17243 95 ANEXOS ANEXO I: Curvas de calibrado Figura A1. Curva de calibración de la concentración de CH4 Figura A2. Curva de calibración de la concentración de CO2