Acortamiento de los telómeros en el Síndrome de Down y parálisis cerebral

ACORTAMIENTO DE LOS TELÓMEROS EN EL SÍNDROME DE DOWN Y PARÁLISIS CEREBRAL TRABAJO DE FIN DE GRADO 2018-2019 AUTOR: MARTA DE URIBE VILORIA TUTOR: JUAN JOSÉ TELLERIA ORRIOLS Este trabajo no hubiera sido posible sin la dedicación y apoyo recibidos de Juan José Telleria, y la paciencia y comprensión de Nieves Viloria. ÍNDICE TÍTULO ........................................................................................................................................ 1 ABSTRACT ................................................................................................................................. 1 RESUMEN ................................................................................................................................... 1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 2 SUJETOS Y MÉTODOS ........................................................................................................... 4 Pacientes, familias y controles ......................................................................................... 4 Extracción de DNA ............................................................................................................... 4 Medición de los Telómeros mediante PCR en tiempo real (rtPCR) ........................ 5 Genotipado de TERT y TERC ............................................................................................ 5 Análisis Estadístico ............................................................................................................. 5 RESULTADOS ........................................................................................................................... 6 DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 12 CONCLUSIÓN .......................................................................................................................... 15 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 16 ANEXOS .................................................................................................................................... 19 Tablas .................................................................................................................................... 19 Tablas opcionales .............................................................................................................. 24 Figuras y leyendas ............................................................................................................. 25 Marta de Uribe Viloria 1 TÍTULO Acortamiento de los Telómeros en el Síndrome de Down y Parálisis Cerebral ABSTRACT Intellectual disability has a global prevalence between 1-3%. Down syndrome and Cerebral Palsy are two entities associated to intellectual disability with high impact on society and easy to diagnose. In recent decades, life expectancy in people with intellectual disability has increased which has been accompanied by premature aging whose genetic cause is unknown. Telomere shortening is involved in the cellular and body aging. We have studied, by quantitative real time PCR, the telomere length in subjects with Down syndrome and Cerebral Palsy and compared with a control group searching for differences that could explain the accelerated aging of both groups. We found differences between subjects with Down syndrome and cerebral palsy and healthy subjects matched by age (p<0.001 in all cases). The analysis of the genotype distribution of two polymorphisms associated with a low telomerase activity: TERT-1327C>T (rs2735940) and TERC-63G>A (rs2293607) did not show any difference between groups. Analysis of telomere length in siblings with a similar age of subjects with cerebral palsy and their parents show shorter telomeres length that control subjects with same age suggesting that telomere shortening in these families could increase susceptibility to cerebral palsy. RESUMEN La Discapacidad Intelectual se presenta con una prevalencia global del 1-3%. El Síndrome de Down y la Parálisis cerebral son dos entidades de diagnóstico sencillo, asociadas a discapacidad intelectual, con gran impacto social. En las últimas décadas la esperanza de vida de personas con discapacidad intelectual ha aumentado, acompañándose de un envejecimiento prematuro cuya causa genética se desconoce. El acortamiento telomérico, se ve involucrado en el proceso de envejecimiento celular y corporal. Mediante PCR cuantitativa en tiempo real (rtPCR), hemos estudiado la longitud telomérica en sujetos con síndrome de Down y Parálisis Cerebral, comparándolo posteriormente con un grupo Control, buscando diferencias que pudiesen explicar el envejecimiento acelerado de ambos grupos. Encontramos diferencias entre los sujetos con síndrome de Down y Parálisis Cerebral y Controles sanos tras emparejarlos por grupos de edad (p<0.001 en todos los casos). El análisis de la distribución genotípica de dos polimorfismos asociados con baja actividad telomérica: TERT-1327C>T (rs2735940) y TERC-63G>A (rs2293607) no mostró ninguna diferencia entre grupos. El análisis de la longitud telomérica en hermanos con edades próximas a los sujetos con Marta de Uribe Viloria 2 parálisis cerebral y sus padres, muestra longitudes teloméricas menores que en los Controles del mismo grupo de edad, lo que sugiere que el acortamiento telomérico en estas familias podía aumentar la susceptibilidad a padecer Parálisis Cerebral. INTRODUCCIÓN La Discapacidad Intelectual (DI) se caracteriza por limitaciones significativas de las funciones intelectuales, comportamiento y habilidades adaptativas a nivel conceptual, social y práctico. Se origina en menores de 18 años (AAIDD, Schalock et al,2010). Su prevalencia global es del 1-3 % (Roeleveld et al, 1997;Leonard and Wen, 2002) y en más del 60% de los casos, es de origen desconocido (Rauch et al,2006). Sin embargo podemos encontrar dos patologías relacionadas a discapacidad intelectual, que tienen características fenotípicas y clínicas claramente definidas: el síndrome de Down (SD) y la Parálisis Cerebral (PC). La esperanza de vida en personas con discapacidad intelectual se ha visto incrementada en las últimas décadas. Mientras que en la población general el proceso gradual de envejecimiento se ve acelerado a partir de los 65-70 años, en sujetos con discapacidad intelectual este aceleramiento se produce a los 40-50 años. En sujetos con SD este envejecimiento se ve antes, sobre los 35 años (Strax et al, 2010; Berjano and Garcia, 2010). Pese a que este envejecimiento prematuro se ve altamente influenciado por factores como el estilo de vida, déficits en el sistema sanitario, patologías concomitantes, medicación, etc. Es importante y de gran interés estudiar un posible origen genético. Los telómeros, son regiones de DNA no codificante situadas al final de los cromosomas eucariotas. En humanos, se componen de repeticiones en tándem de la siguiente secuencia de nucleótidos: TTAGGG. El DNA telomérico (tDNA) se combina en dos cadenas. Su extremo 3’ es rico en Guanina y Citosina de distribución asimétrica, formando una estructura secundaria en bucle, estabilizado por uniones proteicas específicas (Blackburn, 1991). En células germinales (Kim et al, 1994) y tejidos en desarrollo (Ulaner et al, 1998) se encuentra activo un mecanismo de replicación telomérica, la Telomerasa. Hay evidencias de su presencia en células endometriales (Kyo et al, 1999), la capa basal de la epidermis (Ueda et al, 1997) y el sistema hematopoyético (Norrback and Roos, 1997). La Telomerasa es un complejo formado por tres componentes principales: el TERT de la familia de la Transcriptasa inversa, el ácido ribonucleico TERC y una proteína auxiliar llamada Disquerina (DKC1) (Blackburn, 2000ª; Cohen et al, 2007). En células que Marta de Uribe Viloria 3 presentan Telomerasa activa, el tDNA se mantiene en un estado dinámico, conocido como “Telomere Homeostasis” (Blackburn, 2000b; Shampay and Blackburn, 1988). Sin embargo, en cada ciclo de división celular, la longitud de los telómeros se reduce pese a tener la maquinaria celular necesaria para completar su replicación. Si esto no ocurriera, la célula podría llegar a adquirir un estado de inmortalidad que supondría una proliferación celular excesiva (Wright and Shay, 1995). En las células somáticas, en las que el sistema de la Telomerasa está suprimido, cada replicación y división celular subsecuente resulta en la pérdida de entre 100 y 200 pares de bases en el extremo 5’ de la secuencia telomérica que se corresponde con el espacio dejado por el fragmento de Okazaki. Por ello, tras un número determinado de divisiones (entre 40 y 70) la longitud del telómero llega a un punto crítico (2.5Kb) alcanzando el punto de Hayflick (Hayflick, 1968). Este proceso lleva a la célula a entrar en un estado de senescencia en el cual es metabólicamente activa y viable, pero no puede continuar proliferando (Martin et al, 1970). Este mecanismo es irreversible y se acompaña de cambios morfológicos y de la expresión genética que contribuyen al envejecimiento del cuerpo (Thomas et al, 2008). El objetivo del estudio ha sido el análisis de las diferencias entre la longitud de los telómeros de sujetos con síndrome de Down o Parálisis Cerebral con los de un grupo de sujetos sin ningún tipo de discapacidad intelectual. Marta de Uribe Viloria 4 SUJETOS Y MÉTODOS Pacientes, familias y controles Obtuvimos 167 muestras de células bucales (67 mujeres y 100 varones, de edades comprendidas entre 11 y 80 años, con una media de edad de 35.57 años): 113 muestras fueron de pacientes con síndrome de Down (47mujeres y 66 varones, con edades comprendidas entre 11 y 69 años, con una media de edad de 37.20 años) (tabla 1), y 54 muestras procedentes de pacientes con Parálisis Cerebral (20 mujeres y 34 varones, con edades comprendidas entre 11 y 80 años, con una media de edad de 32.70). La Parálisis Cerebral se había producido a consecuencia de distress fetal perinatal en 31 sujetos, 2 casos habían sufrido meningitis, en un caso se atribuye a un traumatismo cráneo encefálico, en otro caso aislado se atribuyó a una malformación cerebelosa, en 19 sujetos es de etiología desconocida y un único caso fue secundario a un proceso quirúrgico. Las muestras fueron recogidas en colegios y residencias especialmente adaptadas para personas con discapacidad intelectual pertenecientes a Castilla y León (España). La recogida de muestras se realizó tras la obtención del Consentimiento Informado, de acuerdo a los estándares legales Españoles para Estudios Clínicos y el comité ético del hospital de Salamanca y Valladolid (Castilla y León, España). Desarrollamos un protocolo consistente en 10 items para reglar la recogida de información, datos clínicos y epidemiológicos de cada uno de los participantes en el estudio. Así mismo contactamos con las familias y tras conseguir el consentimiento informado de 10 de ellas, recogimos muestras de células bucales. En estas familias nos centramos en analizar a los hermanos de sujetos con Parálisis Cerebral con edades que no difirieran en más de 10 años entre ellos. También recogimos información clínica y epidemiológica de estos sujetos. Por otro lado también se obtuvieron muestras de saliva pertenecientes a 115 sujetos sin discapacidad intelectual (60 mujeres y 54 varones, con edades comprendidas entre 17 y 80 años, con una media de edad de 46.50 años) en el Hospital Universitario de Salamanca (Castilla y León, España). Extracción de DNA Se extrajo DNA de alto peso molecular de las células de la mucosa oral obtenidas mediante torundas secas (sin medio) y estériles (Aptaca). La extracción del DNA se llevó a cabo empleando Buffer Fornace, EDTA, proteinasa K y SDS. La mezcla se incubó a 55oC tras lo cual se procedió a la extracción y purificación del DNA mediante tratamiento de la mezcla con fenol-cloroformo, CIAA (cloroformo isoamil alcohol 24:1) y etanol. Marta de Uribe Viloria 5 Medición de los Telómeros mediante PCR en tiempo real (rtPCR) La longitud telomérica se midió mediante PCR en tiempo real comparativa y cuantitativa. Como gen de control endógeno se escogió el gen 36b4. El método empleado se basó en el de Gil y Coetzer (Gil and Coetzer, 2004) empleando los mismos primers desarrollados por Cawthon (Cawthon, 2002) y el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlusTM (Applied Biosystems) con Software 2.1 StepOne (Applied Biosystems). Para ajustar las condiciones de temperatura y la calidad de cada reactivo, se llevó a cabo un experimento inicial obteniendo las curvas estándar de cada reacción. Finalmente las PCRs presentaron una eficiencia del 88.915% y un coeficiente de determinación de 0.976 para la amplificación del gen 36b4, así como una eficiencia de 76.665% y un coeficiente de determinación de 0.974 para los Telómeros. Se empleó una concentración de DNA de 10ng DNA/reacción. La amplificación telomérica se llevó a cabo con 1µl de “forward” primer (5µM) y 2.33µl de “reverse” primer (5µM), la amplificación del gen 36b4 se realizó con 0.4µl de cada primer (5µM). Se llevaron a cabo 40 ciclos tanto para valorar la longitud telomérica como para la amplificación del gen 36b4, con una temperatura de anillado (annealing temperature) de 60oC durante 30 segundos. Genotipado de TERT y TERC Analizamos los polimorfismos TERT -1327C>T (rs2735940, C_1839086_10) y TERC - 63G>A (rs2293607, C_16184740_10) mediante discriminación alélica en PCR en tiempo real, empleando un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlusTM (Applied Biosystems). El programa de amplificación para ambos polimorfismos presentaba una temperatura de anillado (annealing) de 60oC durante 1 minuto y se realizó en 40 ciclos. Análisis Estadístico El análisis estadístico de la longitud de los telómeros se calculó empleando los siguientes programas: el software StepOne 2.1 (Applied Biosystems), Excel 12.0 (Office 2007), y Genex 5.2.1 Enterprise (MultiD Analyses AB). Toda la información estaba desapareada y dependiendo de su distribución, paramétrica o no paramétrica, aplicamos t-test o U-Mann-Whitney test respectivamente. El análisis estadístico de los polimorfismos TERT y TERC se realizó empleando SPSS v.18 para PC. Todas las variables fueron cualitativas. Se empleó el análisis chi-cuadrado (X2) para determinar las diferencias en la distribución genotípica y alélica entre los diferentes grupos. Los valores P (Pvalues) p<0.05 se consideraron significativos. Marta de Uribe Viloria 6 RESULTADOS La longitud media de los telómeros de cada grupo se representa en la tabla 2. Se emplea el test estadístico U-Mann-Whitney para comparar los grupos con discapacidad intelectual y el grupo control, obteniendo resultados significativos (p<0.001). Del mismo modo también se obtuvieron resultados significativos al comparar los grupos con síndrome de Down y Parálisis Cerebral de forma independiente con el grupo control (p<0.001 y p<0.001 respectivamente) y entre ellos (p<0.001). Resultados en cada grupo Grupos Número de sujetos Medias Relarivas STDEV Tipo de distribución Controles 115 6.71 2.32 No paramétrica Discapacidad intelectual 167 3.94 1.49 No paramétrica SD 113 3.94 1.17 No paramétrica PC 54 3.94 2.00 No paramétrica Tabla 2: número de sujetos, medias relativas, STDEV y tipo de distribución de cada grupo. STDEV: desviación estándar. PC: Parálisis Cerebral. SD: Síndrome de Down. A continuación se dividió cada grupo por rango de edad para poder analizar así el acortamiento de los telómeros en relación con el incremento de edad. Al comparar en el grupo de control los rangos de edad menores de 35 años y mayores de 35 años no se encontraron diferencias significativas, al igual que al comparar en este mismo grupo los rangos de edad menores y mayores de 40, 50 incluso 60 años. Lo que sí se pudo observar fue que a partir de los 60 años, en el grupo control, la longitud de telómeros empieza a decrecer. En el grupo de pacientes con síndrome de Down se observaron diferencias al comparar la longitud de los telómeros entre los rangos de edad menores de 35 años y mayores de 35 años (p=0.023). Se pudo objetivar que con el aumento de edad la longitud telomérica disminuía. No fue posible realizar una comparativa significativa entre las medias de los rangos paciente con SD menores de 60 años y pacientes con SD mayores de 60 años, pues este último estaba constituido por menos de 6 pacientes. En cuanto al grupo de sujetos con Parálisis Cerebral el estudio mostró una disminución de la longitud de los telómeros a partir de los 35 años (p=0.009) y tras los 40 años (p=0.02). No se pudieron obtener resultados significativos al comparar los rangos de Marta de Uribe Viloria 13 telomerasa otorga actividad anti-envejecimiento en mamíferos (Thomas-Loba et al, 2008). Siendo una interpretación posible de nuestros resultados que hubiese alteraciones en los componentes de la telomerasa o en el proceso de transporte de ribonucleoproteinas al núcleo. También es posible que en estas circunstancias se viera afectado el complejo que protege los telómeros, manteniéndolos “capped”, dejándolo consecuentemente desprotegido y con ello permitiendo un acortamiento acelerado. Es por esto que decidimos estudiar dos polimorfismos asociados a una actividad de la telomerasa reducida lo que conlleva un mayor acortamiento telomérico: TERT-1327C>T (rs2735940) y TERC-63G>A (rs2293607). El polimorfismo TERT-1327C>T se localiza en el promotor regulándolo, se ha podido observar que el alelo C se asocia a una disminución de la actividad en células endoteliales de las venas umbilicales, así como ocurre en leucocitos con genotipo C/C en pacientes sanos (Matsubara et al,2006). De forma semejante, en el polimorfismo TERC-63G>A (rs2293607), el alelo G se ha asociado al acortamiento telomérico en población caucásica en EEUU y UK (Njajou et al, 2010). En nuestro estudio, los resultados sugieren una posible participación del polimorfismo alélico TERC-63G>A en el acortamiento telomérico acelerado de sujetos con discapacidad intelectual, frente a sujetos del grupo de control. Pese a esto, no hubo diferencias significativas en el resto de resultados, ni en la frecuencia de aparición de los diferentes genotipos ni sus alelos. Es más, se seleccionaron los individuos con menor longitud telomérica en los diferentes grupos y tras compararlos, no se obtuvieron resultados significativos, lo que nos lleva a concluir que ninguno de los polimorfismos estudiados tiene relación con el acortamiento prematuro de los telómeros en nuestros pacientes. En la actualidad se conoce que algunas enfermedades como el Alzheimer (Thomas et al, 2008) y el síndrome del X frágil (Jenkins et al, 2008) se pueden asociar con el acortamiento prematuro de los telómeros. De igual manera, se ha demostrado, que en pacientes de edad avanzada con síndrome de Down, la longitud telomérica es un buen indicador del envejecimiento cognitivo (Jenkins et al, 2006). Podríamos suponer que en el caso de personas con síndrome de Down, el acortamiento telomérico podría ser consecuencia de cualquiera de los cambios genéticos ocasionados por la trisomía del cromosoma 21, sin embargo, en pacientes con Parálisis Cerebral y discapacidad intelectual es difícil concretar el origen de la alteración causante, por lo que se decidió medir la longitud de los telómeros en hermanos de paciente con PC de edades similares y en los progenitores de estos. Se pudo observar que la longitud de los telómeros de los hermanos de pacientes con PC era menor que Marta de Uribe Viloria 14 la de la población general de la misma edad. Para ser más exactos, era de una longitud similar a la de sus hermanos afectos con PC. Así mismos se vio que los progenitores presentaban longitudes teloméricas inferiores a las de la población general de su misma edad. Por lo tanto, estos resultados sugieren que podría haber una predisposición genética al acortamiento prematuro de los telómeros en pacientes con Parálisis Cerebral. Recientemente ha sido descrita la correlación entre estrés psicológico y ansiedad en la infancia y telómeros cortos (Kananen et al ,2010; Tyrka et al,2010). Se ha visto que la infancia en personas con síndrome de Down y Parálisis cerebral puede ser difícil, estando sujetos a diferentes grados de estrés al afrontar las adversidades que supone su enfermedad. Por otra parte, la alteración de ciertos procesos epigenéticos, tanto en personas que sufren Parálisis cerebral como síndrome de Down, puede influenciar el acortamiento telomérico. Recientemente se ha demostrado que la Metilación del DNA es un importante represor del DNA recombinante telomérico (Gonzalo et al, 2006). Sucesivas divisiones celulares producen acortamientos en la longitud de los telómeros y en base a estudios recientes, el origen del cambio de la conformación telomérica de “cerrada” a “abierta” puede residir en modificaciones epigenéticas en regiones teloméricas y subteloméricas, por ejemplo, cuando se reduce la metilación de las secuencias teloméricas y subteloméricas,la conformación de la cromatina se encuentra en estado “abierto” lo que facilita el acceso del complejo proteico telomerasa a la estructura para poder llevar a cabo la elongación de los telómeros. Así mismo, un aumento de la acetilación favorece el mantenimiento de la conformación “abierta” y consecuentemente la elongación telomérica (Blasco, 2007). Esta teoría sugiere que en aquellos tejidos y/u organismos que presentan un acortamiento precoz de los telómeros podría coexistir un una modificación de los procesos epigenéticos causada por factores tan diversos como déficit de folatos, B12 y colina, que reducen la metilación en la secuencias subteloméricas (Gonzalo et al, 2006). Marta de Uribe Viloria 15 CONCLUSIÓN Nuestro estudio ha demostrado un acortamiento de la longitud telomérica acelerado en pacientes con Síndrome de Down, Parálisis Cerebral y discapacidad intelectual, que se manifiesta en el envejecimiento prematuro de estos individuos. El origen de este acortamiento prematuro es desconocido, aunque en nuestro estudio descartamos que los polimorfismos de la telomerasa TERT-1327C>T y TERC-63G>A tuvieran un papel relevante en el mismo. Por ello concluimos que es necesario continuar estudiando para determinar el significado biológico de estos hallazgos. Así mismo, creemos necesario continuar con un estudio en profundidad a nivel familiar, pues si, en base a los resultados de este estudio, suponemos una posible causa hereditaria se podría inferir que los progenitores y hermanos de estos pacientes mostrarán alteraciones semejantes. Marta de Uribe Viloria 16 BIBLIOGRAFÍA - Berjano, E. and García, E. (2009). Discapacidad intelectual y envejecimiento: Un problema social del siglo XXI. (Madrid, FEAPS). - Blackburn, E.H. (2000a). Telomere states and cell fates. Nature. 408, 53-56. - Blackburn, E.H. (2000b). The end of the (DNA) line. Nat. Struct. Biol. 7, 847-50. - Blackburn, E.H. (1991). Structure and function of telomeres. Nature. 350, 569- 573. - Blasco, M.A. (2007). The epigenetic regulation of mammalian telomeres. Nat. Rev. Genet. 8, 299-309. - Cawthon, R.M. (2002). Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleid. Acids. Res. 30, e47. - Cohen, S.B., Graham, M.E., Lovrecz, G.O., Bache, N., Robinson, P.J., Reddel, R.R. (2007). Protein composition of catalytically active human telomerase from immortal cells. Science. 315, 1850-3. - Craig, N., He, L., Jian-Qiu, W., Jun-Ping, L. (2011). Molecular regulation of telomerase activity in aging. Protein Cell. 2, 726-38. - Epel, E.S., Blackburn, E.H., Lin, J., Dhabhar, F.S., Adler, N.E., Morrow, J.D., Cawthon, R.M. (2004). Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 17312-5. - Gil, M.E. and Coetzer, T.L. (2004). Real time quantitative PCR of telomere length. Mol. Biotechnol. 27, 169-172. - Gonzalo, S., Jaco, I., Fraga, M.F., Chen, T., Li, E., Esteller, M., Blasco, M.A. (2006). DNA methyltransferases control telomere length and telomere recombination in mammalian cells. Nat. Cell. Biol. 8, 416-24. - Hayflick, L. (1968). Human cells and aging. Sci. Am. 218, 32-7. - Jenkins, E.C., Tassone, F., Ye, L., Gu, H., Xi, M., Velinov, M., Brown, W.T., Hagerman, R.J., Hagerman, P.J. (2008). Reduced telomere length in older men with premutation alleles of the fragile X mental retardation 1 gene. Am. J. Med. Genet. A. 146A, 1543-6. - Jenkins, E.C., Velinov, M.T., Ye, L., Gu, H., Li, S., Jenkins, E.C. Jr., Brooks, S.S., Pang, D., Devenny, D.A., Zigman, W.B. et al. (2006). Telomere shortening in T lymphocytes of older individuals with Down syndrome and dementia. Neurobiol. Aging. 27, 941-5. - Kananen, L., Surakka, I., Pirkola, S., Suvisaari, J., Lönnqvist, J., Peltonen, L., Ripatti, S., Hovatta, L. (2010). Childhood adversities are associated with shorter telomere length at adult age both individuals with an anxiety disorder and controls. PLoS. One. 5, e10826. Marta de Uribe Viloria 17 - Kim, N.W., Piatyszek, M.A., Prowse, K.R., Harley, C.B., West, M.D., Ho, P.L., Coviello, G.M., Wright, W.E., Weingrich, S.L., Shay, J.W. (1994). Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015. - Kyo, S., Kanaya, T., Takakura, M., Tanaka, M., Inoue, M. (1999). Human telomerase reverse transcriptase as a critical determinant of telomerase activity in normal and malignant endometrial tissues. Int. J. Cancer. 80, 60-3. - Leonard, H. and Wen, X. (2002). The epidemiology of mental retardation: challenges and opportunities in the new millennium. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8, 117-34. - Martin, G.M., Sprague, C.A., Epstein, C.J. (1970). Replicative life-span of cultivated human cells. Effects of donor's age, tissue, and genotype. Lab. Invest. 23, 86-92. - Matsubara, Y., Murata, M., Yoshida, T., Watanabe, K., Saito, I., Miyaki, K., Omae, K., Ikeda, I. (2006). Telomere length of normal leukocytes is affected by a functional polymorphisms of hTERT. Biochem. Biophys. Res. Commun. 341, 128-31. - Nakagawa, S., Gemmell, N.J., Burke, T. (2004). Measurement vertebrate telomeres: applications and limitations. Mol Ecol. 13, 2523-33. - Njajou, O.T., Blackburn, E.H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C.M., Kwok, P.Y., Spector, T.D., Newman, A.B., Harris, T.B., Cummings, S.R. et al. (2010). A common variant in the telomerase RNA component is associated with short telomere length. PLoS. One. 5, e13048. - Norrback, K.F. and Roos, G. (1997). Telomeres and telomerase in noDIal and malignant haematopoietic cells. Eur. J. Cancer. 33, 774-80. - Rauch, A., Hoyer, J., Guth, S., Zweier, C., Kraus, C., Becker, C., Zenker, M., Hüffmeyer, U., Thiel, C., Rüschendorf, F. et al. (2006). Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation. Am. J. Med. Genet. A. 140, 2063–74. - Roeleveld, N., Zielhuis, G.A., Gabreëls, F. (1997). The prevalence of mental retardation: a critical review of recent literature. Dev. Med. Child. Neurol. 39, 125- 32. - Samani, N.J., Boultby, R., Butler, R., Thompson, J.R., Goodall, A.H. (2001). Telomere shortening in atherosclerosis. Lancet. 358, 472-3. - Schalock, R.L., Borthwick-Duffy, S.A., Buntinx, W.H.E., Craig, E.M. (2010). Intellectual Disability: Definition, Classification, and Systems of Supports (11th Marta de Uribe Viloria 18 Edition). American Association on Intellectual and Developmental Disabilities (AAIDD). (Washington DC). - Shampay, J., Blackburn, E.H. (1988). Generation of telomere-length heterogeneity in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 85, 534-8. - Strax, T.E., Luciano, L., Dunn, A.M., Quevedo, J.P. (2010). Aging and developmental disability. Phys. Med. Rehabil. Clin. N. Am. 21, 419-27. - Thomas, P., O' Callaghan, N.J., Fenech, M. (2008). Telomere length in white blood cells, buccal cells and brain tissue and its variation with ageing and Alzheimer's disease. Mech. Ageing. Dev. 129, 183-90. - Tomás-Loba, A., Flores, I., Fernández-Marcos, P.J., Cayuela, M.L., Maraver, A., Tejera, A., Borrás, C., Matheu, A., Klatt, P., Flores, J.M. et al. (2008). Telomerase reverse transcriptase delays aging in cancer-resistant mice. Cell. 135, 609-622. - Tyrka, A.R., Price, L.H., Kao, H.T., Porton, B., Marsella, S.A., Carpenter, L.L. (2010). Childhood maltreatment and telomere shortening: preliminary support for an effect of early stress on cellular aging. Biol. Psychiatry. 67, 531-4. - Ueda, M., Ouhtit, A., Bito, T., Nakazawa, K., Lübbe, J., Ichihashi, M. Yamasaki, H., Nakazawa, H. (1997). Evidence for UV-associated activation of telomerase in human skin. Cancer Res. 57, 370-4. - Ulaner, G.A., Hu, J.F., Vu, T.H., Giudice, L.C., Hoffman, A.R. (1998). Telomerase activity in human development is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts. Cancer Res. 58, 4168-72. - Valdes, A.M., Andrew, T., Gardner, J.P., Kimura, M., Oelsner, E., Cherkas, L.F., Aviv, A., Spector, T.D. (2005). Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366, 662-4. - Valdes, A.M., Richards, J.B., Gardner, J.P., Swaminathan, R., Kimura, M., Xiaobin, L., Aviv, A., Spector, T.D. (2007). Telomere length in leukocytes correlates with bone mineral density and is shorter in women with osteoporosis. Osteoporos. Int. 18, 1203-10. - Vulliamy, T.J. and Dokal, I. (2008). Dyskeratosis congenita: the diverse clinical presentation of mutations in the telomerase complex. Biochimie. 90, 122-30. - Wright, W.E. and Shay, J.W. (1995). Time, telomeres and tumours: is cellular senescence more than an anticancer mechanism? Trends. Cell. Biol. 5, 293-7. Marta de Uribe Viloria 19 ANEXOS Tablas situación Número de sujetos con SD Residencia 31 Familia y Centro Ocupacional 61 Familia y Centro de Educación Especial 15 Familia y colegio 6 Tabla 1 Resultados en cada grupo Grupos Número de sujetos Medias Relativas STDEV Tipo de distribución Controles 115 6.71 2.32 No paramétrica Discapacidad intelectual: 167 3.94 1.49 No paramétrica DS 113 3.94 1.17 No paramétrica CP 54 3.94 2.00 No paramétrica Tabla 2: número de sujetos, medias relativas, STDEV y tipo de distribución de cada grupo. STDEV: desviación estándar. PC: Parálisis Cerebral. SD: Síndrome de Down Marta de Uribe Viloria 20 Longitud de los telómeros en cada subgrupo Rangos Sujetos Medias Relativas STDEV DI SD PC Controles DI SD PC Controles DI SD PC Controles 11-20 29 15 14 2 4.96 5.16 4.74 5.64 1.18 1.18 1.37 1.31 21-30 30 17 13 22 3.72 3.73 3.71 6.64 1.75 1.75 2.39 2.40 31-40 48 35 13 17 4.11 4.10 4.12 6.34 1.22 1.22 1.77 1.77 41-50 37 27 10 23 4.56 4.22 5.48 7.22 1.49 0.98 2.18 2.25 51-60 15 15 0 21 3.21 3.22 - 7.19 0.99 0.99 - 2.92 61-70 6 4 2 23 3.05 3.33 2.50 6.61 1.66 1.66 3.52 2.18 71-80 2 0 2 7 1.87 - 1.86 5.57 1.54 - 1.5 2.42 Tabla 3: Número de sujetos, Medias Relativas y STDEV de cada subgrupo obtenidas en los grupos de pacientes con discapacidad intelectual (Probandos) y población general (Controles) al hacer la división en rangos de edad de 10 años. STDEV: desviación estándar. DI: Discapacidad intelectual. SD: Síndrome de Down. PC: Parálisis Cerebral. En rojo se resalta el grupo con rango de edad 41 and 50 años. Agrupación genotípica en TERT-1327C>T Grupos TT+TC/CC TT/TC+CC Retraso Vs Controles p=0.314 OR=1.339 (C.I. 0.758-2.366) p=0.094 OR=0.598 (C.I. 0.327-1.096) SD Vs Controles p=0.300 OR=1.396 (C.I. 0.742-2.629) p=0.243 OR=0.676 (C.I. 0.349-1.308) PC Vs Controles p=0.563 OR=1.260 (C.I. 0.575-2.757) p=0.061 OR=0.485 (C.I. 0.226-1.042) SD Vs PC p=0.804 OR=1.109 (C.I. 0.491-2.504) p=0.373 OR=1.393 (C.I. 0.671-2.891) Tabla 4: Agrupación genotípica de TERT -1327C>T en sujetos con discapacidad intelectual, SD, PC y grupo de control. SD: Síndrome de Down. PC: Parálisis Cerebral. OR: odd ratio. T: Timina. C: Citosina. Marta de Uribe Viloria 21 Agrupación genotípica de TERC-63G>A Grupos AA+AG/GG AA/AG+GG Discapacidad intelectual Vs Controles p=0.034 OR=0.584 (C.I. 0.354-0.961) p=0.652 OR=0.790 (C.I. 0.284-2.202) SD Vs Controles p=0.131 OR=0.659 (C.I. 0.384-1.133) p=0.581 OR=0.736 (C.I. 0.247-2.194) PC Vs Controles p=0.038 OR=0.474 (C.I. 0.232-0.968) p=0.948 OR= 0.953 (C.I. 0.229-3.965) SD Vs PC p=0.804 OR=1.109 (C.I. 0.491-2.504) P=0.710 OR=0.772 (C.I. 0.196-3.034) Tabla 5: Agrupamiento de los genotipos TERC -63G>A en sujetos con discapacidad intelectual, SD, PC y el grupo de control. SD: Síndome de Down. PC: Parálisis Cerebral. OR: odd ratio. A: Adenina. G: Guanina Marta de Uribe Viloria 22 Estudio en familias Edad Etiología Longitud telomérica media STDEV Sujeto 1 5 Infecciosa 6.624399911 0.227086058 Sujeto 1 hermano 5 5.717993125 0.180507184 Sujeto 1 madre 45 4.101679561 0.331632042 Sujeto 1 padre 46 4.723639605 0.448656042 Sujeto 2 13 Secundario a malformación cerebelosa 5.190225502 0.265139272 Sujeto 2 hermano 18 5.992163222 0.027232927 Sujeto 2 madre 46 4.075286643 0.194717625 Sujeto 2 padre 50 3.336372611 0.271946542 Sujeto 3 15 distress fetal perinatal 6.095939502 0.079061212 Sujeto 3 hermano 18 5.647748024 0.122014368 Sujeto 4 27 Infecciosa 5.040669492 0.086029226 Sujeto 4b 20 distress fetal perinatal Sujeto 4 y 4b hermana 20 4.13445714 0.030314293 Sujeto 4 y 4b madre 51 7.52702141 0.153426424 Sujeto 5 22 distress fetal perinatal 8.018742795 0.190895861 Sujeto 5 hermana 17 4.114257884 0.063240751 Sujeto 5 madre 51 4.808356935 0.468853544 Sujeto 6 20 distress fetal perinatal 3.557990195 0.302487635 Sujeto 6 hermano 24 4.973428565 0.141687269 Sujeto 7 17 distress fetal perinatal 4.351185915 0.460130933