Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria

PROGRAMA DE DOCTORADO EN FÍSICA TESIS DOCTORAL: Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Presentada por Coral Salvo Comino para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Prof. Dra. María Luz Rodríguez Méndez Prof. Dra. Ana Cristina García Cabezón ………………….………………….. Agradecimientos Cuando comencé a escribir, cuando me enfrenté a una hoja en blanco que tenía que rellenar con toda mi trayectoria como investigadora, cuando me llené de agobios e inseguridades, me propuse como recompensa escribir estas páginas una vez redactada mi humilde aportación a la ciencia…Y llegó el ansiado momento, agradecer a todas las personas que han contribuido a mi formación y a los que han ido quitando piedras de mi travesía. Y finalmente, de dedicar mi trabajo, dedicar esta parte de mi vida, que para mí ha sido tan importante. Tengo que comenzar agradeciendo a mis directoras, las Profesoras María Luz Rodríguez Méndez y Cristina García Cabezón por abrirme las puertas como a una más desde el primer día, por todo lo que me han enseñado y por dejarme volar cada vez más alto. También les agradezco su cercanía y sobre todo su paciencia. De la misma manera, quiero agradecer a todas y cada una de las personas que forman o han formado parte del grupo UVaSens. Uno de los peores inconvenientes que tiene trabajar en un grupo de investigación de estas características, es que el personal no suele ser permanente y por ello la gente va y viene constantemente. Lo bueno, que suele ser gente maravillosa. Y lo más bueno aún, que gracias a este grupo ahora forman parte de mi vida. A todos vosotros, gracias, gracias y gracias. Gracias por haberme acompañado durante este camino, haberme enseñado, haberme escuchado, haber reído conmigo (y también llorado), haber confiado en mí, haberme hecho brillar en ocasiones en las que no encontraba mi luz, pero, sobre todo, gracias por haber hecho de una relación laboral, relaciones de amistad de las que algunas serán eternas. Así mismo, agradecer a todas las personas que hayan contribuido al desarrollo de esta Tesis Doctoral en cualquiera de sus etapas. Desde los que me han traído dulces para amenizar mis tardes hasta los que se han peleado con los resultados, o los que han dedicado tanto tiempo a enseñarme a entender los equipos o incluso a ordenar bibliografías. A la Profesora Nicole Jaffrezic-Renault y todo su grupo de investigación. Personas magníficas que me acogieron como a una más desde el primer momento en que llegué a Francia para realizar mi estancia pre-doctoral. Cuando me propusieron la idea de comenzar una Tesis Doctoral, lo vi inviable, no creía en mí, era un mundo demasiado complicado para el que yo no tenía llave. Sin embargo, mis directores, tutores y muchos de los integrantes del grupo en el que realicé mi Trabajo de Fin de Máster me cosieron usas hermosas alas para volar, y hoy es el momento de devolvérselas en forma de agradecimiento, porque si no me hubieran ayudado en todos los sentidos, no estaría aquí. Por ello a mis queridas Profesoras Paloma Yáñez-Sedeño Orive, Araceli González Cortés y Susana Campuzano Ruiz y mi querido Profesor José Manuel Pingarrón Carrazón, así como al resto de compañeros, les mando unas gracias infinitas por haberme apoyado. Así mismo, agradezco a todas las entidades financieras que han hecho posible que pueda formarme con todo lujo de instrumentos, equipos y materiales, así como permitiéndome la asistencia a cursos, congresos y cualquier actividad formativa que ha sido imprescindible para el desarrollo de esta Tesis Doctoral. Hoy vuelvo la vista unos años atrás, y la nostalgia me hace esbozar una sonrisa. He pasado momentos muy bonitos durante estos años, momentos nutritivos de alma y mente. La vida me ha regalado la oportunidad de crecer en tantos aspectos de la vida que me siento inmensamente afortunada, pero…el sentido real, la razón que me ha permitido sentirme así, sois vosotros, aquellos que hoy sois felices por mí, aquellos que estáis leyendo estas palabras tan moñas (porque ya sabéis que lo soy) para ver si tenéis un hueco en mi “hijo de papel”. Y claro, claro que le tenéis, pero me vais a permitir que no dé nombres, y el motivo es sencillo. Tú, que hoy estás sintiendo un hormigueo en la tripa porque sabes que yo estoy “atacaita”, tú, tienes tu hueco aquí …y en mi corazón. Gracias a todos los que me habéis dado un pedacito vuestro para que yo me construya. Finalmente escribo a mi familia, y aquí sí voy especificar: MAMÁ Y PAPÁ GRACIAS. Gracias y perdón. Decir que sois mis referentes no es suficiente. Durante estos años, durante toda mi vida, habéis sido vosotros los que pegabais los trocitos de mi alma cada vez que se rompía, habéis sido vosotros mi refugio en momentos de vulnerabilidad. Pero también habéis sido mi escuela y mi universidad, me habéis mostrado valores tan necesarios en este mundo… El agradecimiento que le hago a la vida es tan inmenso por haberme regalado unos padres tan especiales como vosotros que no existen Tesis, ni trabajos suficientes para poder expresarlo. Y perdón, perdón por no haber estado a la altura en tantas ocasiones que los nervios no me dejan pensar con claridad y habéis sido vosotros mi blanco, y con los brazos abiertos habéis recibido mis tiros de desesperación, para después, acogerme en vuestro regazo como si nada. Os quiero tanto que duele. A Dani, por dejar una vida para comenzar otra conmigo cuando le dije que empezaría a trabajar en Valladolid. Por todo lo que hemos vivido estos años, lo bueno y lo malo. Pero, sobre todo, por el regalo más grande que has podido darme, nuestra niña. Gracias por todo este tiempo y lo que hemos aprendido juntos. Te quiero infinitamente. Y finalmente, me gustaría dedicar unas palabras a mi hija: Lucía, a ti te agradezco haber llegado a nuestras vidas en un momento en el que el mundo se paró. Todos nuestros planes se descolocaron cuando llego la pandemia, todos sentíamos tanto temor…pero fuiste tú la que nos trajo tanta fuerza y tanta paz. Tú eres la última pieza que cierra esta Tesis. Hija quiero dedicarte todo el esfuerzo que aquí se refleja, y con ello quiero decirte que en la vida te tropezarás con circunstancias que te llevarán al límite y que te harán dudar de todo, pero por favor cariño mío, nunca dudes de ti misma y de tu luz. No hay nada más poderoso que el esfuerzo, el esfuerzo combinado con la confianza en ti misma, harán de ti una persona excepcional. Y… recuerda hija mía, yo estaré aquí y te impulsaré a volar, pero cuando tengas dudas, no olvides que, en mí, siempre tendrás tu hogar. Te quiero hija mía, como nunca imaginé que se podía querer. A mi hija, Por iluminar mi mundo Cuando el mundo parecía dormido. Cuando el miedo se apoderó de mí. Cuando todo parecía perdido, comenzaste a latir Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria VI Tyr: tirosinasa UHT: tratamiento a altas temperaturas UV-vis: espectroscopía ultavioleta visible ZnPc: ftalocianina de zinc β-gal: β-galactosidasa Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry application VII Listado de tablas y figuras Tablas Tabla 1: Sensores y biosensores electroquímicos basados en la detección de fenoles en distintas variedades de vino blanco y/o tinto…………………………………..………..35 Tabla 2: Sensores y biosensores electroquímicos basados en la detección de carbohidratos en distintas variedades de leche……………………………………….…42 Figuras Figura 1: Representación esquemática del método de desarrollo de diferentes técnicas de recubrimiento de sensores……………………………………………………………....21 Figura 2: Representación esquemática de diferentes métodos de deposición directa de materiales sobre la superficie de electrodos……………………………………………24 Figura 3: Representación esquemática de diferentes métodos de deposición de películas ultra-finas y nanoestructuradas sobre la superficie de electrodos…………………….…27 Figura 4. Representación esquemática de una lengua electrónica…………………..…43 Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria VIII Resumen La presente Tesis doctoral, plantea el desarrollo de sensores y biosensores para el análisis de alimentos, empleando diferentes materiales y nanomateriales sensibles. Se trata de sensores y biosensores electroquímicos que permiten detectar compuestos de interés en alimentos líquidos tales como leches o vinos. Los sensores se han diseñado empleado diferentes materiales sensibles y tecnologías relacionadas con la Nanociencia, con el propósito de mejorar parámetros analíticos como son: selectividad, sensibilidad, reproducibilidad y repetitividad. Los sensores y biosensores se han utilizado para desarrollar redes de sensores que forman lenguas electrónicas y bioelectrónicas. La preparación y caracterización de los sensores y biosensores desarrollados, así como sus respuestas electroquímicas y su funcionamiento como parte de lenguas electrónicas, se discuten mediante los artículos científicos, indexados en revistas internacionales, incluidos en esta Tesis Doctoral. Estos trabajos se presentan agrupados en tres bloques, cada uno de ellos con una temática común: En el primer bloque se aborda en profundidad el desarrollo de biosensores electroquímicos voltamétricos basados en películas nanoestructuradas preparadas mediante la técnica Layer by Layer, utilizando distintas combinaciones de materiales (polímeros conductores, líquidos iónicos, nanopartículas metálicas, ftalocianinas y enzimas). El objetivo es seleccionar las nanoestructuras con mejor respuesta electroquímica en función de la composición de las películas, para la detección de compuestos de interés en la industria alimentaria. A partir de las plataformas seleccionadas, se ha desarrollado una lengua bioelectrónica capaz de clasificar y discriminar entre distintas variedades de leche de vaca con diferentes características. El segundo bloque de trabajos, tratan el desarrollo de biosensores voltamétricos basados en combinaciones de nanomateriales de plata (nanopartículas y nanohilos) con enzimas específicas para compuestos presentes en vino (tirosinasa) o leche (glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y β-galactosidasa). En estos trabajos se describe la preparación de los sensores y se analiza la influencia de la relación de aspecto de las nanoestructuras de plata en la capacidad de los nanomateriales como mediadores electrónicos, así como en los mecanismos de detección electroquímica. En algunos casos se han observado mecanismos de transferencia electrónica directa, lo que demuestra el gran potencial de esta tecnología. Finalmente, se ha realizado un estudio comparativo de las lenguas bioelectrónicas generadas a partir de ambas nanoestructuras evaluando la capacidad de discriminación y clasificación de leches con diferentes características nutricionales. Se han alcanzado excelentes correlaciones entre los datos obtenidos con las lenguas bioelectrónicas desarrolladas y parámetros químicos utilizados habitualmente en el control de calidad de leches Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry application IX El tercer bloque de esta Tesis Doctoral, pone de manifiesto la capacidad de sensores no enzimáticos para alcanzar especificidad frente a determinados compuestos fenólicos gracias a la aplicación de la técnica de polímeros de impresión molecular (MIPs). Los MIPs desarrollados se obtienen mediante la electrodeposición de un biopolímero natural, el quitosano, así como en combinaciones de quitosano y nanotubos de carbono decorados con nanopartículas, con los que se ha desarrollado una plataforma específica capaz de detectar determinados fenoles en vino en presencia interferentes. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, han permitido desarrollar sensores avanzados que, una vez combinados en forma de redes de sensores, suponen un avance en el campo de las lenguas electrónicas y bioelectrónicas dedicadas al análisis de alimentos. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria X Summary This Doctoral Thesis proposes the development of sensors and biosensors for food analysis, using different sensitive materials and nanomaterials. These are electrochemical sensors and biosensors that allow the detection of compounds of interest in liquid systems such as wines or milk. The sensors have been designed using different sensitive materials and technologies related to Nanoscience, with the purpose of improving analytical parameters such as selectivity, sensitivity, reproducibility and repeatability. Sensors and biosensors have been used to develop sensor arrays that form electronic and bioelectronic tongues. The preparation and characterization of the developed sensors and biosensors, as well as their electrochemical responses and their functioning as part of electronic tongues, are discussed through the scientific articles, indexed in international journals, included in this Doctoral Thesis. These works are presented grouped into three section, each with a common topic: The first section deals in depth with the development of voltammetric electrochemical biosensors based on nanostructured films prepared using the Layer by Layer technique, with different combinations of materials (conductive polymers, ionic liquids, metallic nanoparticles, phthalocyanines and enzymes). The objective is to select the nanostructures with the best electrochemical response based on the composition of the films, for the detection of compounds of interest in the food industry. From the selected platforms, a bioelectronic tongue capable of classifying and discriminating between different varieties of cow's milk with different characteristics has been developed. The second section deals with the development of voltammetric biosensors based on combinations of silver nanomaterials (nanoparticles and nanowires) with specific enzymes for compounds present in wine (tyrosinase) or milk (glucose oxidase, galactose oxidase and β-galactosidase). In these works, the preparation of the sensors is described and the influence of the aspect ratio of silver nanostructures on the ability of nanomaterials as electronic mediators, as well as on electrochemical detection mechanisms, is analyzed. In some cases, direct electronic transfer mechanisms have been observed, which demonstrates the great potential of this technology. Finally, a comparative study of the bioelectronic tongues generated from both nanostructures has been carried out, evaluating the discrimination and classification capacity of milks with different nutritional characteristics. Excellent correlations have been achieved between the data obtained with the bioelectronic tongues developed and chemical parameters commonly used in milk quality control. The third section of this Doctoral Thesis highlights the ability of non-enzymatic sensors to achieve specificity against certain phenolic compounds thanks to the application of the molecular imprinted polymers (MIPs) technique. The developed MIPs are obtained by electrodeposition of a natural biopolymer, chitosan, as well as in combinations of chitosan and carbon nanotubes decorated with nanoparticles, with which a specific platform capable of detecting certain interfering phenols in wine has been developed. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry application XI The results obtained in this Doctoral Thesis have allowed the development of advanced sensors that, once combined in the form of sensor arrays, represent an advance in the field of electronic and bioelectronic tongues dedicated to food analysis. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria XII Contexto de la Tesis Doctoral La presente Tesis Doctoral titulada “Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria” se ha escrito como un compendio de publicaciones, y por ello los resultados obtenidos se presentan recogidos en siete artículos científicos publicados en revistas internacionales indexadas en JCR. Asimismo, esta Tesis cumple con los requisitos necesarios para ser acreditada con Mención Internacional, dado que parte del trabajo se ha realizado en el Instituto de Ciencias Analíticas, en Lyon (Francia), bajo la supervisión de la Prof. Nicole Jaffrezic-Renault. La parte fundamental de esta Tesis, se ha realizado en el grupo UVaSens de la Universidad de Valladolid, supervisada por la Prof. María Luz Rodríguez Méndez y la Prof. Ana Cristina García Cabezón. El grupo en el que se ha desarrollado la Tesis, trabaja en una línea de investigación básica, enfocada al desarrollo de sensores y biosensores electroquímicos nanoestructurados, y en una línea de investigación aplicada, en la que se combinan los sensores desarrollados para fabricar lenguas electrónicas (LEs) empleadas en la caracterización de alimentos y bebidas. Estos trabajos se realizan en colaboración con organismos y empresas, que proporcionan las muestras que se han analizado en este trabajo. Cabe destacar la colaboración con la Estación Enológica de Castilla y León, que ha proporcionado las muestras de vino y la empresa Calidad Pascual, que ha suministrado las muestras de leche. La motivación central de esta Tesis es la integración de nuevos materiales y nanomateriales en el desarrollo de sensores y biosensores electroquímicos. La idea central es combinar materiales y nanomateriales utilizando distintas técnicas, con el fin de desarrollar novedosas membranas y películas sensibles, con propiedades sensibles mejoradas. La incorporación de enzimas específicas frente a azúcares, fenoles u otros compuestos presentes en leches y vinos, ha de permitir mejorar el desempeño del sensor en términos de selectividad y sensibilidad. Además, estos nuevos sensores y biosensores con mejores prestaciones, pueden incorporarse a redes de sensores para obtener lenguas electrónicas y bioelectrónicas que puedan utilizarse para analizar muestras de interés en las industrias vitivinícola y láctea, fomentando la viabilidad de su integración para aplicaciones de campo en la Industria 4.0. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry application XIII Mencionar que, como ya se ha indicado, parte de esta investigación se ha realizado en la Universidad de Lyon (Francia) mediante una estancia pre-doctoral. Durante dicha estancia, se han desarrollado novedosos sensores basados en la tecnología de impresión molecular, con la que se generan plantillas específicas para ciertos compuestos, lo cual permite reemplazar a biorreceptores que son costosos y frágiles, por polímeros en los que se imprime la huella de las moléculas a detectar. La estructura que sigue la presente Tesis Doctoral es la siguiente: Capítulo 1- Justificación y objetivos. En el que se describe la justificación y motivación de esta Tesis, así como los objetivos perseguidos durante su realización. Capítulo 2- Estado del arte. Este capítulo recoge una introducción general a los sensores y biosensores electroquímicos, que pretende dar una amplia visión del tema tratado. Para ello se describen los métodos de detección electroquímica, las diferentes técnicas y métodos de desarrollo de sensores basados en materiales y nanomateriales sensibles, así como el concepto de biosensores enzimáticos. También se presentan algunos trabajos previos destacables en el campo de las lenguas electrónicas. Capítulo 3- Resultados. Se presentan los resultados de las investigaciones realizadas y los artículos científicos publicados en revistas indexadas internacionales mediante tres subcapítulos: -Biosensores electroquímicos basados en LbL. Efectos sinérgicos. Se presentan tres artículos con una temática común. Se inicia con los objetivos y motivación perseguidas. A continuación, se describen los resultados obtenidos en dos trabajos dedicados al desarrollo de biosensores electroquímicos basados en películas nanoestructuradas preparadas mediante la técnica de Layer by Layer. Estas películas se han obtenido utilizando combinaciones de nanomateriales y enzimas, y se han dedicado a la detección de catecol, un compuesto de interés en la industria alimentaria. En una línea más aplicada, también se presenta un trabajo sobre el desarrollo y puesta a punto de una lengua bioelectrónica (bioLE) a partir de los biosensores nanoestructurados Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria XIV desarrollados aplicada a la industria láctea. Finalmente se muestran los artículos publicados en revistas indexadas. -Biosensores electroquímicos basados en nanomateriales de plata. Influencia de la relación de aspecto. Se presentan dos artículos en los que se ha desarrollado biosensores enzimáticos voltamétricos basados en diferentes nanoestructuras de plata. Se muestra una breve introducción que describe la motivación y los objetivos planteados. Se indaga sobre la influencia de la relación de aspecto de las nanoestructuras de plata en los mecanismos de detección electroquímica de compuestos de interés en la industria alimentaria mediante el diseño de dos bioLEs que se han utilizado para clasificar, discriminar y predecir parámetros de interés en muestras de leche con diferente contenido nutricional. Finalmente se muestran los artículos publicados en revistas indexadas internacionales. -Sensores electroquímicos basados en MIP. Se presentan dos artículos realizados a partir de las investigaciones realizadas durante la estancia internacional. Se detalla la motivación y los objetivos perseguidos en el desarrollo de sensores basados en polímeros de impresión molecular (MIPs) para la detección de compuestos fenólicos. Se resumen los hitos de los artículos desarrollados. Finalmente se muestran los artículos publicados por dos revistas internacionales. Capítulo 4- Conclusiones y perspectivas futuras. En este capítulo se recogen las conclusiones a las que se ha llegado tras analizar los resultados experimentales obtenidos a lo largo de la presente Tesis Doctoral. También se contemplan las aplicaciones y proyecciones futuras de las investigaciones desarrolladas. Capítulo 5- Bibliografía. En este capítulo se encuentran las referencias bibliográficas en las que se apoya esta Tesis Doctoral. Capítulo 6- Anexos. Se recogen las publicaciones, asistencia a congresos o cursos, participación en proyectos, certificación de estancia pre-doctoral en el extranjero de la autora de la Tesis Doctoral, becas e informes de evaluadores externos. . Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry application Capítulo1 Justificación y objetivos En este capítulo se presenta la justificación de esta Tesis. Para ello se desarrolla una breve descripción del marco científico e industrial actual en lo relativo a la investigación en el desarrollo y uso de sensores, biosensores basados en nanomateriales, así como de los avances requeridos en el campo de las lenguas electrónicas y su aplicación en la industria de la alimentación, específicamente en la industria láctea y vitivinícola. Finalmente se presentan los objetivos específicos planteados en esta Tesis doctoral. This chapter presents the justification for this Thesis. To do so, a brief description of the current scientific and industrial framework in terms of research in the development and use of sensors, biosensors based on nanomaterials and electronic tongues and their application in the food industry, specifically in the dairy and wine industry, is presented. Finally, the specific objectives set out in this doctoral Thesis are presented. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores y su aplicación en la industria alimentaria Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2 Estado Del Arte El empleo de nanomateriales como materiales sensibles en sensores y biosensores electroquímicos ha sido objeto de numerosos estudios en los últimos años. A lo largo de este capítulo se presentan los principales principios y las metodologías utilizadas para la incorporación de nanomateriales en sensores, biosensores y sistemas multisensores electroquímicos, así como sus aplicaciones en la industria alimentaria. Se evalúa el papel de la incorporación de nanomateriales o mezclas de nanomateriales y los beneficios de los efectos sinérgicos que se generan. Se discuten los efectos electrocatalíticos de los nanomateriales como soportes para la inmovilización de enzimas en biosensores. Finalmente, se revisa la aplicación de sensores, biosensores y lenguas electrónicas en la industria alimentaria. The use of nanomaterials as sensitive material for electrochemical sensors and biosensors has been the subject of numerous studies in recent years. In this chapter, the main principles and methodologies used for the incorporation of nanomaterials in electrochemical sensors, biosensors and multi-sensor systems are presented, as well as their applications in the food industry. The role of incorporating nanomaterials or mixtures of nanomaterials and the benefits of synergistic effects are evaluated. The electrocatalytic effects of nanomaterials as supports for the immobilization of enzymes in biosensors are discussed. Finally, the application of sensors, biosensors and electronic tongues in the food industry is reviewed. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 10 2.1. Sensores y biosensores electroquímicos Las técnicas electroquímicas son de gran interés para analizar diferentes compuestos presentes en alimentos y bebidas, como antioxidantes o azúcares, entre otros [17,21]. Además, brindan la posibilidad de trabajar en matrices complejas y pueden servir como alternativa a los métodos convencionales de análisis ya que son rápidos, poseen una elevada sensibilidad, permiten su aplicación in-situ y no requieren de operadores altamente cualificados [9]. En los siguientes apartados se describen los múltiples métodos de detección electroquímica en los que se basan los sensores electroquímicos, así como algunos de los materiales utilizados en la modificación de electrodos y las diferentes técnicas de preparación de películas que pueden ser empleadas en el desarrollo de sensores y biosensores electroquímicos utilizados en el control de calidad de vino y leche, que son los alimentos de interés en esta Tesis. 2.1.1. Métodos de detección electroquímica La elección del método de detección electroquímica con el que se pueden estudiar las reacciones que tienen lugar en la superficie del electrodo, depende fundamentalmente de las propiedades electroquímicas del sistema (sustrato, electrolito, analito). Generalmente, el proceso de medida involucra un sistema de tres electrodos (el electrodo de trabajo actúa como transductor de la reacción, el contraelectrodo mantiene contacto entre la disolución y la superficie del electrodo y permite aplicar corriente al electrodo de trabajo y el electrodo de referencia tiene un potencial de equilibrio estable y conocido y se utiliza para medir el potencial entre los otros dos electrodos) [22,23]. No obstante, existen sistemas de detección electroquímica en los que se utilizan dos electrodos, como en el caso de los sensores potenciométricos o los impedimétricos en los que no se precisa contraelectrodo [24]. Para garantizar un buen rendimiento electroquímico, la selección del electrodo de trabajo es esencial, por ello tal y como se ha reportado, la modificación de la superficie con materiales y nanomateriales, así como con material biológico, desempeña un papel realmente importante. Además de ello, es necesario solventar la necesidad de desarrollar sensores baratos y desechables para poder utilizar a nivel industrial, lo cual implica el desarrollo de nuevas estrategias como por ejemplo, el desarrollo de electrodos serigrafiados modificados con diferentes materiales [23]. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 11 Las técnicas electroquímicas ofrecen múltiples posibilidades de análisis dependiendo del método utilizado en la detección [17]. Entre ellos se incluyen la impedancia, la potenciometría, la amperometría y la voltamperometría [25,26]. A continuación, se presenta un breve resumen de los métodos de detección electroquímica comúnmente aplicados en el desarrollo de sensores para la industria alimentaria. Los sensores impedimétricos se basan en la detección de cambios en la interacción de la superficie del electrodo y el medio, es decir, registran los cambios de impedancia que ocurren como consecuencia de las interacciones que tienen lugar en la superficie de electrodos modificados químicamente y el medio de ensayo. Este método consiste en la aplicación de una señal sinusoidal de potencial, de pequeña amplitud en un rango de frecuencias determinado, entre el electrodo de trabajo y el auxiliar, registrándose una respuesta en forma de intensidad de corriente de diferente amplitud y fase que el potencial aplicado. La relación potencial/intensidad de corriente permite identificar los datos de impedancia que pueden representarse en un plano complejo como Z" (impedancia de la parte imaginaria) frente a Z' (impedancia de la parte real), denominados diagramas de Nyquist o bien el módulo de impedancias │Z│ y el desfase (θ) en función de las frecuencias aplicadas denominados diagramas de Bode. Además, es posible ajustar los datos a un circuito eléctrico equivalente para explicar los procesos electroquímicos donde ocurre transferencia de carga a través de la interfase sólido-líquido y a través del electrolito, así como los procesos de difusión [27,28]. Por ello, la inmovilización sobre el electrodo de una amplia variedad de materiales de detección, incluidos nanomateriales y elementos de biorreconocimiento, permite aumentar la especificidad de los sensores a elementos presentes en la disolución en función del cambio de impedancia que se registra en la interfase como consecuencia de su interacción con la superficie del electrodo [29– 31]. Actualmente, existe una gran variedad de (bio)sensores impedimétricos utilizados en el análisis de alimentos y bebidas cuyas aplicaciones industriales más comunes se basan en el control de calidad, dada su buena estabilidad, reproducibilidad y precisión [24,32]. Cabe destacar la capacidad de dichos sensores para discriminar muestras de vino en función del tipo de cosecha, viñedo, región o marca de vino. Concretamente se han desarrollado redes de sensores cuyas unidades de detección están basadas en películas Langmuir-Blodgett (LB) o LbL de polímeros, lípidos y una gran variedad de compuestos. También se han empleado técnicas de preparación de películas más sencillas como spin- Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 12 coating para la modificación de electrodos con polímeros conductores, nanopartículas y/o ftalocianinas [33,34]. De la misma manera, los sensores impedimétricos se han utilizado con éxito para el análisis de leche. Por ejemplo, utilizando microelectrodos interdigitados (IDE) recubiertos con polímeros conductores es posible detectar adulterantes como la tetraciclina en muestras de leche con distinto contenido graso. También se han usado sensores impedimétricos recubiertos de nanofibras conductoras para analizar muestras de leche sin necesidad de pretratar las muestras [35]. Los sensores potenciométricos se basan en la medida del potencial creado por especies con carga en la superficie de una membrana que actúa como material sensible. Este potencial se mide frente a un electrodo de referencia. El potencial registrado puede utilizarse entonces para determinar la concentración de las especies responsables de la aparición de la carga en la superficie de la membrana. Los sensores potenciométricos ofrecen la posibilidad de modificar la selectividad del sensor variando la naturaleza de los materiales que forman la membrana [36]. Existe una amplia variedad de electrodos potenciométricos selectivos de iones (ISE) que, modificados con membranas de diferentes composiciones (por ejemplo membranas compuestas por agentes quelantes) , permiten detectar selectivamente diversos iones, como por ejemplo Ca2+, Mg2+, NH4+ o urea generalmente presentes en la leche [37–39] o iones como, Na+, NH4+ o MnO4- presentes en bebidas como vino o cerveza [40,41]. Existen otros materiales empleados en el desarrollo de membranas que, al ser introducidos en una disolución, crean una doble capa cargada en la superficie de la membrana, carga que es proporcional a la presencia de ciertos compuestos. Estos materiales permiten la fabricación de sensores potenciométricos sólidos donde en la mayoría de los casos, las membranas están formadas por un polímero, un plastificante y un aditivo [42,43]. En esta configuración se reemplaza el electrolito interno de los electrodos ISE convencionales por un transductor de contacto sólido [44]. En estos sensores es relativamente sencillo inmovilizar enzimas. La acción enzimática provoca cambios en el potencial de membrana, lo que hace de los sensores potenciométricos unos excelentes biosensores con especificidad para una amplia gama de compuestos (urea, glucosa, etc). Los electrodos modificados mediante la combinación de polímeros con nanomateriales como nanopartículas, nanohilos o nanomateriales de carbono, entre Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 13 muchos otros, han demostrado ser sensores potencialmente eficientes debido a que la presencia de nanomateriales ofrece mayor estabilidad en el potencial del electrodo y aumenta la carga de la doble capa [43]. El uso de este tipo de sensores también ha sido utilizado por la tecnología de impresión molecular de polímeros (MIP), con el fin de obtener sensores potenciométricos ISE con una gran selectividad sin necesidad de inmovilizar enzimas en la membrana polimérica [45–47]. Una ventaja importante de los sensores potenciométricos es la posibilidad de miniaturización de forma sencilla, Así, el desarrollo de sensores potenciométricos miniaturizados de transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFETS) y de transistores de efecto de campo enzimático (ENFETS) ha demostrado ser una herramienta eficiente en el análisis de alimentos y bebidas [48,49]. Un transistor ISFET se basa en un MOSFET clásico (transistor de efecto de campo metal-óxido-semiconductor) donde la puerta metálica está conectada a un electrodo de referencia sumergido en una solución acuosa. El dispositivo es sensible a la presencia de portadores de carga en la superficie de la membrana y la señal producida es proporcional a la concentración de analito presente en una muestra [50]. Por otra parte, en el caso de los ENFET la puerta se modifica con una membrana enzimática [51]. Los sensores amperométricos se basan en el registro de la intensidad de corriente eléctrica que produce la oxidación o reducción de la especie de interés cuando se aplica un voltaje fijo (potencial) entre dos electrodos [52]. La señal obtenida es directamente proporcional a la concentración de analito. Se han utilizado diversos sensores amperométricos modificados con una gran variedad de materiales, nanomateriales y/o enzimas, para cuantificar el contenido de antioxidantes en los vinos [22] o componentes de interés en productos lácteos como lactosa o lactato a través del H2O2 generado en la reacción enzimática [53,54], así como para la determinación de aditivos o contaminantes en otros alimentos o bebidas entre los que incluyen hidracina, bisfenol A, ácido ascórbico, cafeína, ácido cafeico, sulfitos o nitritos [9]. Por lo general los sensores amperométricos se emplean en la detección electroquímica del analito, mientras que el comportamiento electroquímico del analito en la superficie del electrodo suele estudiarse a través de técnicas voltamperométricas. En los sensores voltamperométricos se aplica un barrido de potencial y se registra la corriente eléctrica producida por la oxidación/reducción del analito y/o de la especie Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 14 de interés en la superficie del electrodo. Durante estos procesos redox se produce una transferencia de electrones entre el electrodo de trabajo y la solución, que causan un aumento de la intensidad de corriente, donde la intensidad de los picos es proporcional a la concentración del analito [55]. Al igual que en los sensores amperométricos, en los sensores voltamétricos es posible modificar los electrodos con una amplia variedad de materiales, capaces de incrementar la selectividad y la especificidad del sensor de forma sencilla y efectiva. Otra ventaja importante de la voltametría es su versatilidad ya que existen diferentes formas de aplicar el barrido de voltaje. Estas diferentes técnicas, se detallan a continuación [56]: En la voltamperometría cíclica (CV) el potencial se aplica de forma cíclica y varía linealmente con el tiempo a una velocidad de barrido constante, desde un potencial inicial hasta un potencial máximo regresando al potencial inicial, un determinado número de ciclos. Al voltaje apropiado, las especies redox se oxidan o reducen en la superficie del electrodo, produciendo una corriente transitoria, cuya intensidad es proporcional a la concentración del analito. Es la técnica más empleada para obtener información cualitativa y cuantitativa de la presencia de especies con actividad redox. Dada su gran capacidad de detección electroquímica, la CV será la técnica aplicada en las investigaciones desarrolladas en esta Tesis para la cuantificación de los analitos estudiados. No obstante, existen otras técnicas voltamperométricas ampliamente usadas como son la voltamperometría diferencial de pulsos (DPV) o la voltamperometría de onda cuadrada (SWV) con las que también se ha trabajado en el desarrollo de investigaciones realizadas en esta Tesis. En DPV, la señal de excitación consiste en la aplicación de un barrido lineal de potencial a través de pulsos con una amplitud, duración e incremento de potencial constantes. La respuesta que se obtiene es un barrido de intensidad en el que se representa para cada pulso la diferencia entre las corrientes registradas inmediatamente antes del pulso y al final del pulso. Esta técnica minimiza las corrientes no faradaicas. De esta manera al representar la diferencia de las corrientes obtenidas, frente al potencial aplicado se obtienen respuestas donde la intensidad máxima de corriente faradaica es directamente proporcional a la concentración de la especie reaccionante con una mayor sensibilidad que otras técnicas como la voltametría cíclica. En SWV se aplican pulsos de potencial constantes entre el electrodo de trabajo y el de referencia en forma de onda cuadrada y se mide como en DPV la corriente dos veces Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 15 durante cada ciclo de la onda cuadrada, la primera al final del pulso directo y la segunda al final del pulso inverso, durante intervalos de tiempo muy cortos (periodos). En SWV como en DPV se representa la diferencia entre estas dos mediciones frente al potencial en escalera aplicado, esto es en condiciones de oxidación y en condiciones de reducción. Este método es más sensible y más rápido que la DPV ya que además de eliminar las corrientes faradaicas se consigue un amento en la intensidad de la señal debido a que la intensidad de la corriente obtenida en cada pulso es más elevada al ser la diferencia entre la corriente anódica positiva y la corriente catódica negativa. Por tanto la técnica SWV permite discriminar mejor la corriente faradaica de la corriente capacitiva, al tener en cuenta las dos corrientes mientras que en la técnica DPV se registra únicamente la corriente en el sentido anódico [56]. El uso de sensores voltamperométricos ha sido ampliamente abordado para la cuantificación de analitos en la industria alimentaria. Para ello se han utilizado desde los sensores más simples, fabricados con materiales conductores clásicos (carbono, oro, platino, etc.) hasta aquellos en los que la superficie del electrodo se ha modificado químicamente para mejorar la selectividad del sensor. Una gran variedad de materiales tales como los polímeros conductores, ciertos compuestos de coordinación, nanomateriales o nanomateriales derivados del carbono entre muchos otros han demostrado ser buenos materiales modificadores gracias a sus excelentes propiedades electrocatalíticas [14,57–62]. A su vez, estos electrodos químicamente modificados, permiten en muchos casos la inmovilización de biomateriales tales como enzimas, lo que permite inducir especificidad a los sensores [16,63–66]. A continuación, se describe la importancia de estos materiales y nanomateriales como materiales sensibles, así como soportes para la inmovilización de enzimas en la detección electroquímica. 2.1.2. Materiales y nanomateriales sensibles. Detección electroquímica La sensibilidad y selectividad de los sensores electroquímicos se puede optimizar modificando la superficie de los sensores (electrodos modificados químicamente) utilizando diversos materiales, nanomateriales o enzimas, cuyo uso ha demostrado ser extremadamente útil para mejorar las características de los sensores electroquímicos [9]. Los nanomateriales han atraído una gran atención por su actividad electrocatalítica y alta conductividad, su alta relación superficie/volumen y la posibilidad de ser modificados o funcionalizados [17]. Además, la biocompatibilidad de los nanomateriales les convierte Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 16 en una plataforma excelente para la inmovilización de biomateriales, favoreciendo la especificidad [67]. Asimismo, la combinación adecuada entre varios materiales electrocatalíticos puede mejorar el funcionamiento del sensor gracias a los efectos sinérgicos que aumentan la transferencia electrónica [68,69]. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen: metales y aleaciones convencionales, polímeros, moléculas orgánicas, compuestos de coordinación, materiales porosos o materiales carbonosos, entre otros [70,71]. Entre ellos, los que se han empleado en el desarrollo de esta Tesis son: polímeros como el quitosano, nanotubos de carbono (CNTs), líquidos iónicos (ILs), ftalocianinas (Pcs), y nanoestructuras metálicas como nanopartículas (NPs) o nanohilos (NWs) [72]. Existe una amplia variedad de polímeros que pueden emplearse como sustrato intermedio en la modificación de superficies de electrodos. Los polímeros naturales como el quitosano son materiales baratos, biocompatibles y aptos para desarrollar sensores o biosensores por las ventajas físicas y químicas que ofrecen (buena resistencia mecánica, estabilidad, hidrofilicidad y posibilidad de modificación química, entre otras). Los polisacáridos tienen un gran potencial en el desarrollo de sensores electroquímicos gracias a su capacidad para crear uniones con otros materiales, y con enzimas, lo que les convierte en una excelente plataforma para la inmovilización de materiales [73]. Así, la modificación de la superficie del electrodo con polisacáridos ha demostrado ser una excelente opción para aumentar el rendimiento analítico de sensores y biosensores [74]. Esta mejora se puede implementar mediante la combinación de estos polímeros con otros materiales, como NPs, ILs o derivados de carbono, que potencian la transferencia de electrones [75]. Dentro de la gran variedad de polímeros disponibles, el quitosano destaca por su amplia aplicación en el análisis de muestras ambientales, clínicas y alimentarias [74]. Los nanomateriales de carbono son ampliamente utilizados en el desarrollo de sensores electroquímicos debido a sus excelentes propiedades electrónicas y catalíticas, la gran ventana de potencial a la que pueden trabajar y a su bajo coste. Por ello, el uso de sensores y biosensores modificados con nanomateriales de carbono permite realizar análisis electroquímicos de analitos electroactivos con elevada precisión. La estructura geométrica de los nanomateriales de carbono puede variar entre tubos (nanotubos de carbono, CNTs), cuernos (nanocuernos de carbono), nanopartículas esféricas o elipsoidales (por ejemplo, fullerenos) y grafeno, pudiendo además funcionalizarse con Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 17 moléculas orgánicas o inorgánicas. Poseen excelentes propiedades, entre las que se incluyen una alta conductividad, alta relación superficie/volumen y su gran capacidad de adsorber materiales y biomateriales. La modificación de sensores electroquímicos con nanomateriales de carbono es una excelente opción en el desarrollo de biosensores al favorecer la inmovilización de la enzima con técnicas como adsorción física, reticulación o unión covalente [76–79]. Una parte de esta Tesis está enfocada al estudio del rol que desempeñan los nanotubos de carbono como mediadores electrónicos en la fabricación de sensores electroquímicos basados en sensores MIPs. En las últimas décadas, el empleo de líquidos iónicos (ILs) como modificadores de superficies ha despertado un gran interés en el desarrollo de sensores electroquímicos [80,81]. Los ILs son sales orgánicas que están compuestas por aniones y cationes, y suelen clasificarse según su solubilidad. Tanto los ILs hidrofóbicos como los hidrofílicos, se utilizan comúnmente en el desarrollo de películas. La integración de IL en el desarrollo de sensores y biosensores es una buena opción para incrementar la sensibilidad como resultado de su alta conductividad iónica, lo que mejora los procesos de transferencia de electrones desde el analito al electrodo. Además, se pueden depositar sobre la superficie de un electrodo mediante técnicas sencillas. En algunos trabajos, basados en la combinación de IL con otros materiales como metaloftalocianinas y grafeno, se ha determinado que la presencia del IL es crucial debido a que mejora la intensidad de las señales [82]. Además, se ha demostrado que los ILs tienen una buena compatibilidad con las biomoléculas, por lo que preparar películas combinando enzimas en ILs puede mejorar la actividad de la película sensible, debido a sus propiedades estabilizadoras y su capacidad para aumentar la transferencia de electrones y la reversibilidad en las reacciones electroquímicas. [83,84]. Dentro de la gran variedad de compuestos orgánicos que se pueden emplear en el desarrollo de sensores, cabe destacar el uso de macrociclos aromáticos, entre los que se encuentran las ftalocianinas (Pcs). Son sistemas aromáticos con estructuras altamente conjugadas, que se coordinan con iones metálicos, originando las metaloftalocianinas (MPcs). Una de las características más relevantes, es su versatilidad ya que pueden presentar sustituyentes en sus anillos aromáticos, lo que permite modular sus propiedades [85]. Tienen excelentes propiedades redox y electrocatalíticas, por lo que han sido Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 24 facilitar la evaporación de los precursores. En el caso de la técnica CVD, los precursores en fase vapor, se inyectan en una cámara y al alcanzar la superficie del electrodo, reaccionan, formándose una película del material producto de la reacción [113,115]. La técnica de serigrafía (screen–printed) es uno de los métodos más ampliamente utilizado en el desarrollo de sensores y biosensores electroquímicos. Consiste en la transferencia del material de impresión a los electrodos a través de una plantilla que presenta un patrón determinado. Una vez depositado, el material se sinteriza dando lugar a una película del mismo, que sigue el patrón de la plantilla. Con ello se obtienen películas gruesas del material de interés sobre el sustrato modificado. La técnica de la serigrafía ha tenido un gran éxito en el campo de los sensores electroquímicos. De hecho, existen varias compañías que comercializan dispositivos en los que se han serigrafiado los tres electrodos (referencia, contraelectrodo y electrodo de trabajo) a partir de diversos materiales. Además, permiten la deposición de nanomateriales o agentes biológicos directamente sobre las superficies de los electrodos, mejorando su rendimiento. Estos electrodos se han utilizado con éxito en el análisis de productos lácteos y vitivinícolas [22,37,111,116,117] entre otros. Figura 2: Representación esquemática de diferentes métodos de deposición directa de materiales sobre la superficie de electrodos. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 25 Finalmente, la modificación de los electrodos se puede llevar a cabo utilizando técnicas más sofisticadas, que permiten preparar películas nanoestructuradas de espesor controlado (Figura 3). La técnica self-assembled monolayers (SAMs) se basa en la preparación de monocapas bidimensionales altamente ordenadas mediante adsorción química sobre la superficie de los electrodos. La afinidad entre el electrodo y la molécula a depositar, es fundamental en el proceso de adsorción y autoensamblado. Actualmente, se han descrito diversos sistemas en los que se produce el fenómeno de autoensablado entre los que incluyen alquiltioles sobre oro o alquilsilanoles sobre vidrio. No obstante, existen otros sistemas compatibles con el desarrollo de SAMs. Además, es bien conocida la gran afinidad de los biomateriales (enzimas, anticuerpos o DNA) hacia el oro, lo que abre una interesante línea de investigación en el desarrollo de biosensores con aplicación industrial [118–120]. Layer by Layer (LbL) es un método simple y efectivo para obtener películas formadas por materiales como polímeros, biomoléculas o compuestos inorgánicos entre otros, utilizando interacciones electrostáticas [121]. Este método se basa en la adsorción de compuestos catiónicos y aniónicos o polielectrolitos iónicos alternando capas de diferente carga eléctrica en la superficie del electrodo formando multicapas. Este método de autoensamblaje es fácil, rápido y permite controlar con precisión la composición y grosor de las películas que conforman las monocapas. Otra ventaja de este método, es la posibilidad de trabajar con sustancias solubles en agua lo que permite la inmovilización directa de biomateriales, haciendo que los electrodos sean más sensibles y específicos [66,122–124]. Las estructuras SAMs o LbL a menudo dificultan el transporte de electrones entre el sustrato y el analito debido a su arquitectura compacta [125]. Es por este motivo que resulta imprescindible el aumento del área activa superficial. Además, la técnica permite utilizar combinaciones de materiales con funcionalidades complementarias, con el objetivo de mejorar las propiedades analíticas de los sensores, y en el caso de los biosensores, facilitar la transferencia electrónica para potenciar la actividad biocatalítica de las enzimas inmovilizadas en la superficie [126,127]. A lo largo de esta Tesis se demuestra la importancia de la selección de los componentes de las películas basadas en el método LbL, dónde las interacciones entre distintos materiales sensibles y/o electrocatalíticos resultan esenciales para favorecer los mecanismos de transferencia electrónica en la superficie del electrodo. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 26 Langmuir Blodgett (LB) es un método para formar multicapas nanoestructuradas, en el que se puede controlar el grosor y el orden de las películas en la superficie del electrodo. Este método consiste en la dispersión de moléculas, generalmente anfifílicas, sobre una superficie de agua. Las moléculas tienden a orientarse con las cabezas hidrofílicas hacia la superficie del agua y las colas hidrofóbicas lejos de ella. Tras la evaporación del disolvente, la monocapa formada se comprime para orientar las moléculas, de modo que se obtiene una monocapa ordenada en la interfase aire-agua. Esta monocapa se puede transferir a un electrodo que se sumerge en la fase acuosa que contiene la monocapa flotante ordenada. La inmersión del electrodo en la subfase de agua se puede repetir un determinado número de veces para desarrollar una película ordenada multicapa de espesor controlado. Este tipo de películas tiene la ventaja de que permite preparar películas con diversos componentes, lo que favorece sinergias. Además, las películas formadas se asemejan a la estructura de las membranas biológicas. Por esta razón, se puede utilizar para inmovilizar enzimas en un entorno biomimético en el que se preserva la funcionalidad enzimática [121,128–130]. La técnica basada en polímeros de impresión molecular (MIPs) es una técnica que permite reconocer una molécula huésped gracias a la presencia de cavidades específicas impresas en una membrana polimérica depositada en la superficie del electrodo. La película molde (host) se prepara por polimerización del monómero en presencia de la molécula plantilla (guest). Después de la impresión, se elimina dicha molécula de modo que se generan cavidades que mantienen su configuración, lo cual permite identificar posteriormente al analito en disolución. La electropolimerización de monómeros poliméricos es de especial interés en la detección electroquímica en la industria alimentaria porque permiten la inmovilización de materiales sensibles en la membrana, con un control preciso, lo que sirve para para mejorar el rendimiento analítico del sensor MIP. La gran ventaja de esta técnica, es que se consigue elevada especificidad sin necesidad de inmovilizar material biológico [18,19,131,132]. Para la construcción de MIPs, se necesitan polímeros que tengan afinidad por analitos de interés, que tengan posibilidad de acoger la molécula plantilla y que sean capaces de sufrir modificaciones químicas. Se han desarrollado varios tipos sensores utilizando MIPs, como sensores electroquímicos, colorimétricos, fluorescentes, etc [133]. Dado el éxito de los sensores electroquímicos basados en la técnica MIP debido a su simplicidad, sensibilidad, facilidad de implementación y costes de medición Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 27 generalmente bajos, en esta Tesis se han desarrollo sensores electroquímicos basados en la impresión molecular de quitosano. Estudios previos han informado de los buenos rendimientos obtenidos con sensores electroquímicos combinados con quitosano impreso molecularmente, dichos trabajos han mostrado una buena respuesta lineal con un límite de detección bajo, buena selectividad, reproducibilidad, estabilidad y capacidad de reutilización. Los procedimientos de preparación de los sensores son relativamente simples y proporcionan métodos de detección rápidos para diferentes analitos como pesticidas [134] medicamentos [135], metabolitos como la glucosa [136] urea [137] o compuestos fenólicos como el catecol [75,138]. Figura 3: Representación esquemática de diferentes métodos de deposición de películas ultra-finas y nanoestructuradas sobre la superficie de electrodos. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 28 2.2. Sensores en la Industria Alimentaria La industria de la alimentación necesita cumplir con los estrictos requisitos del sector en materia de calidad y seguridad. Además, debe adoptar medidas de control que permitan lograr la satisfacción del consumidor en todos los aspectos de seguridad, confianza, comodidad y calidad. Por ello, resulta necesario establecer controles de calidad que permitan procesar los productos alimenticios en tiempo real, de manera fácil y económica. Las técnicas de análisis químico clásico, son complejas, costosas y los análisis requieren tiempos largos [23]. Por esta razón, es necesario encontrar alternativas que permitan reducir los tiempos de análisis y llevarlos a cabo de manera on-line. Para cubrir esta necesidad, se están desarrollando dispositivos electroquímicos tales como sensores y biosensores, que son una alternativa interesante en el análisis de alimentos y bebidas debido a su portabilidad, capacidad de miniaturización y bajo precio [17]. En los últimos años, estamos asistiendo al desarrollo de nuevos avances en el campo de los sensores y biosensores electroquímicos, lo que incluye el uso de nanomateriales, la combinación de nanomateriales con enzimas y otros materiales biológicos y el diseño de lenguas electrónicas, en las que una red de sensores se combina con un software de reconocimiento de patrones. Dentro de la variedad de bebidas existentes en el mercado, aquí nos centraremos en dos productos de interés como son el vino y la leche con los que se ha trabajado a lo largo de esta Tesis Doctoral. A continuación, se reporta una breve revisión basada en el desarrollo de nuevos sensores y biosensores electroquímicos para el análisis de fenoles normalmente presentes en vinos y azúcares característicos de los productos lácteos. 2.2.1. Sensores y biosensores para la detección de compuestos fenólicos El vino es una matriz acuosa compleja que se obtiene de la fermentación alcohólica del zumo de uvas maduras. El vino contiene compuestos derivados de la uva y de los procesos bioquímicos involucrados en todos los procesos de vinificación (desde la fermentación alcohólica hasta el envejecimiento) donde las variaciones en factores como temperatura, pH, densidad o acidez, y deben cuantificarse íntegramente para garantizar la calidad y el sabor del vino. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 29 Para salvaguardar la calidad del vino, es necesario evaluar el producto final, por lo que se debe comprobar la composición y específicamente el contenido de componentes como etanol, glucosa, ácido málico, ácido láctico, fenoles, sulfitos, etc. [22]. Entre ellos, la presencia de antioxidantes en vino es de especial relevancia ya que no solo afecta a la calidad sino también a sus características organolépticas. Al mismo tiempo, aportan beneficios para la salud, ya que su consumo reduce el riesgo de trastornos cardiovasculares, debido a que son capaces de reducir el daño oxidativo en las células producido por los radicales libres. Por lo tanto, la cuantificación del contenido en compuestos fenólicos en los vinos es fundamental para poder determinar su calidad. Los compuestos fenólicos incluyen una gran diversidad de compuestos químicos que se caracterizan por poseer al menos un núcleo bencénico, sustituido con uno o varios grupos hidroxilos y una cadena lateral funcional. Su reactividad se debe tanto al carácter ácido de la función fenólica como al carácter nucleofílico que le otorga la alta densidad electrónica del anillo bencénico, lo que les confiere una marcada actividad antioxidante. Los compuestos fenólicos se clasifican en compuestos flavonoides y compuestos no flavonoides. Los compuestos flavonoides (antocianos, flavanoles flavonoles, flavonas,) y no flavonoides (ácidos fenólicos, ácidos hidroxicinámicos y estilbenos) son los fenoles más característicos presentes en vino [9,56,139]. La composición polifenólica de los vinos depende de la variedad de la uva y de otros factores que afectan al desarrollo de la uva, tales como el suelo, la localización geográfica y las condiciones climáticas, los métodos de vinificación utilizados, el tipo de envejecimiento, etc. Los compuestos fenólicos tienen un papel muy importante en los procesos de vinificación y los cambios en composición que se producen influyen en las características finales del vino. Aunque existen diversos métodos para detectar la presencia de fenoles y de la capacidad antioxidante de los vinos, dichas técnicas requieren largos tiempos de análisis y por tanto no son adecuadas para ensayos de rutina a nivel industrial. Estas limitaciones pueden ser solventadas con el uso de sensores y biosensores electroquímicos o con el de dispositivos multisensores [56]. Entre la amplia variedad de métodos electroquímicos empleados en el desarrollo de sensores y biosensores para la detección de fenoles, los métodos amperométricos o voltamperométricos son los más eficientes ya que en ellos los procesos de oxidación/reducción dan lugar a picos de corriente cuya la intensidad es proporcional a la concentración del analito. Son por ello una herramienta cuantitativa, Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 30 simple y rápida cuyos resultados son comparables a los obtenidos mediante otras técnicas analíticas como Folin-Ciocalteu o HPLC, demostrando una elevada sensibilidad y selectividad en su detección [140,141]. Los sensores más sencillos son los sensores amperométricos basados en electrodos metálicos [142,143] o en electrodos de carbono vítreo (GCE) que se han utilizado en el análisis de compuestos como ácido cafeico [144], ácido gálico [145], catequina [31], catecol [146], hidroquinona y resorcinol [147] entre otros. Sin embargo, en las últimas décadas se están desarrollando nuevos sensores y biosensores basados en la modificación química de una amplia diversidad de soportes. El hecho de poder modificar la superficie del sensor, permite mejorar la sensibilidad y la selectividad de los sensores electroquímicos. En el caso del análisis de los compuestos fenólicos, se han reportado sensores electroquímicos basados en una amplia variedad de materiales, que han permitido mejorar la respuesta electroquímica de las plataformas. Entre ellos cabe destacar el uso de materiales con propiedades electrocatalíticas tipo polímeros conductores como el polipirrol [142,148,149], las ftalocianinas [69,122,150,151] o los nanomateriales tales como nanomateriales de carbono (nanotubos, grafeno, óxido de grafeno, etc.) [13,151] o NPs metálicas o de óxidos metálicos [31,69,88,143]. Además, la combinación de materiales y/o nanomateriales puede dar lugar a efectos sinérgicos que pueden ocasionar un aumento notable de la sensibilidad y que permiten alcanzar límites de detección de fenoles extremadamente bajos [152]. La detección de fenoles por medios electroquímicos, también puede realizarse utilizando biosensores basados en enzimas tipo fenol-oxidasas (tirosinasa, lacasa, peroxidasa, etc.), que catalizan la oxidación de los fenoles a su forma quinoide y estos procesos redox se pueden detectar por métodos amperométricos [72]. La obtención de biosensores requiere inmovilizar la enzima en la superficie del sustrato, siendo ésta una etapa de máxima importancia, debido a que es necesario elegir un método que permita que la enzima mantenga su funcionalidad. Si el método no es apropiado, la actividad enzimática puede reducirse o incluso puede llegar a producirse su inactivación. Como ya se ha comentado, existen varios métodos para inmovilizar las enzimas sobre soportes sólidos, que incluyen entre otros, la deposición directa de la disolución sobre un sustrato de carbono vítreo o diamante [153,154], la incorporación de la enzima en una pasta de carbono [155], o métodos más sofisticados como el screen-printing [156] o la inmovilización covalente mediante entrecruzamiento [157]. También es posible depositar Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 31 las enzimas en películas nanoestructuradas tipo películas SAM [158], películas LbL [159], o películas LB [160–162]. Estas películas permiten la adsorción enzimática en membranas lipídicas semejantes a las membranas celulares, lo cual ayuda a preservar la actividad enzimática. Por ejemplo, se ha comprobado que la peroxidasa de rábano inmovilizada en una película LB aumenta su actividad un 23% respecto a la actividad observada en disolución [163]. Por otra parte, es bien conocido que la sensibilidad de los biosensores aumenta cuando se combina la enzima con un mediador electrónico, cuya misión es facilitar la transferencia electrónica entre la enzima y el sustrato. En la literatura se pueden encontrar numerosos ejemplos de materiales que actúan como mediadores electrónicos, como son las ftalocianinas (macrociclos aromáticos) [69,122,150,151,159,164] o los polímeros conductores [149,165–169]. Asimismo, muchos nanomateriales (nanopartículas, nanotubos de carbono, grafeno, etc) tienen una marcada capacidad electrocatalítica, facilitando la transferencia electrónica entre la enzima y el sustrato, a la vez que tienen una alta capacidad para adsorber las enzimas generando un entorno adecuado para su inmovilización. Es decir, tienen la doble función de atrapar e inmovilizar enzimas y actuar como mediadores electrónicos [13,31,69,143,151,169–171]. En los siguientes párrafos se recogen algunos ejemplos de sensores y biosensores electroquímicos modificados químicamente con materiales usados en esta Tesis utilizados en la detección de fenoles. Tal y como se ha argumentado en el apartado anterior, las metaloftalocianinas son un grupo de materiales sensibles que han sido ampliamente utilizados para la detección de fenoles gracias a sus excelentes propiedades electrocatalíticas. Entre los trabajos publicados, se pueden encontrar una amplia gama de ftalocininas coordinadas con diferentes metales centrales, normalmente metales de transición. En particular, las bisftalocianinas de lantánidos (como la bistalocianina de lutecio) han demostrado tener unas propiedades electrocatalíticas particularmente interesantes y han dado resultados excelentes como materiales sensibles para la detección de fenoles [172]. Se han desarrollado numerosos sensores electroquímicos en los que se combinan ftalocianinas con otros materiales electrocatalíticos como CNTs, o nanopartículas metálicas, habiéndose encontrado efectos sinérgicos que amplifican las señales de manera muy importante [164,173,174]. Dado el éxito de las ftalocianinas en la detección de fenoles, Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 32 estos materiales se han utilizado como material base de lenguas electrónicas para el análisis de vinos. Estos sensores se han preparado utilizando diferentes técnicas que van desde electrodos simples de pasta de carbono [175] o screen printed [176] a electrodos más sofisticados preparados mediante técnicas como Layer by Layer [151] o Langmuir- Blodgett [173], técnicas que han permitido introducir fenoloxidasas específicas para la detección de fenoles en un entorno biomimético [177]. Cabe destacar las investigaciones pioneras realizadas por nuestro grupo, en los que se han aplicado redes de sensores y lenguas electrónicas basadas en ftalocianinas al análisis de vinos en función de parámetros tales como: variedad de uva, añada de la vendimia o madurez de la uva [178], envejecimiento [179], tipo de barrica utilizada en la maduración[180], calidad de la uva [181] entre otros. Los nanotubos de carbono (CNTs), tanto de pared sencilla (SWCNT) como de pared múltiple (MWCNT) han demostrado ser unos excelentes modificadores debido a que aumentan la conductividad del sustrato y aumentan su relación superficie/volumen. Para solventar algunos problemas que surgen de la inmovilización de ciertos nanomateriales, como son los CNTs y su dificultad de dispersión en agua es recomendable su funcionalización con el fin de mejorar la transferencia electrónica y aumentar su superficie activa [171]. Pero su principal ventaja es que son extraordinarios mediadores electrónicos ya que facilitan los procesos de oxidación/reducción de fenoles y polifenoles, reduciendo el sobrepotencial, mejorando así la sensibilidad de los sensores [182,183]. El funcionamiento de los sensores basados en CNTs se puede mejorar mediante dopaje con nanopartículas metálicas o de óxidos metálicos ya que se establecen efectos sinérgicos entre ambos materiales. Estas mezclas proporcionan una mayor superficie de contacto a través de la cual, se generan más interacciones o canales de transporte entre el metal y los CNTs. Un reciente trabajo corrobora la sinergia entre AuNPs y CNTs en la preparación mediante SAMs de un composite de AuNPs-CNTs, para la detección de compuestos fenólicos como el catecol, hidroquinona, fenol y pnitrofenol en muestras acuosas [184]. También se ha evaluado la eficiencia de diferentes sensores voltamétricos basados en CNTs en la determinación del contenido polifenólico en vino tinto con el objetivo de determinar la influencia de la forma de la nanoestructura, demostrándose que los SWCNTs presentan los mejores resultados en el caso analizado [146]. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 33 En la literatura también se reporta que las NP metálicas presentan una alta actividad catalítica en la oxidación/reducción electroquímica de diferentes especies fenólicas. La modificación de electrodos con NPs proporciona una gran interacción química entre el electrodo y el electrolito reduciendo la resistencia interfacial. Técnicas como la electrodeposición o el autoensamblaje permiten la incorporación de una variedad de NPs metálicas y de óxidos metálicos con diferentes composiciones, tamaños y formas dando lugar a sensores altamente estables y eficientes para la determinación de compuestos fenólicos, no solo en disoluciones patrón [112,185], sino también en bebidas como el té o el vino [31]. Por otro lado, también en este caso, la combinación de NPs con otras nanoestructuras es útil para favorecer los efectos sinérgicos como los ya mencionados. Por ejemplo, se ha demostrado que la electrodeposición de un composite de Au/PdNPs y grafeno permite obtener sensores altamente eficientes para la determinación de ácido cafeico en muestras de vinos [60]. También se ha demostrado que la inclusión de AgNPs en estructuras mesoporosas, permite mejorar la sensibilidad [186]. Como ya se ha mencionado, los biosensores basados en fenoloxidasas tienen la ventaja de la selectividad mejorada. Se han publicado numerosos artículos en los que se han inmovilizado diferentes fenoloxidasas (tirosinasa, lacasa, etc) en la superficie de nanotubos, grafeno o nanopartículas metálicas, ya que las enzimas tienen una gran afinidad hacia estas nanoestructuras permitiendo inmovilizar los biomateriales de manera eficiente, favoreciendo la actividad catalítica sin perder la bioactividad [31,89]. Además estos nanomateriales, actúan como mediadores electrónicos que facilitan la transferencia de electrones entre la proteína y el electrodo [12]. Existen numerosos ejemplos de biosensores que combinan fenoloxidasas con nanomateriales para la detección de fenoles. Entre ellos cabe destacar la combinación de NPs metálicas con tirosinasa [153] o lacasa [187]. La combinación de dos tipos de nanomateriales, como las AuNPs con grafeno para favorecer la inmovilización de la lacasa [14,188], o de tirosinasa [189], o incluso la combinación de varios nanomateriales como MWCNTs, grafeno y AuNPs ha dado lugar a excelentes biosensores enzimáticos para la detección de fenoles [12]. Otra posibilidad para fijar las enzimas al sustrato, es la utilización de matrices poliméricas y biopolímeros como el quitosano, que ofrecen excelentes características como agentes reticulantes [133]. Se ha investigado el uso de quitosano para favorecer la inmovilización de enzimas que catalizan reacciones redox de compuestos fenólicos [190] Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 40 de la glucosa oxidasa, el pico catódico en torno a -0.4 V se asigna a la conversión de FAD a FADH2, mientras que el pico anódico en torno a -0.3 V se atribuye a la conversión de FADH2 a FAD [66,222–224]. Mientras que en el caso de los sensores de galactosa oxidasa, el potencial del pico anódico observado a aproximadamente 0.2 V y el potencial del pico catódico en torno a 0.1 V, se corresponden con los mecanismos del par redox del centro activo de la enzima (Cu2+/Cu+), lo que indica la transferencia directa de electrones entre la enzima y el electrodo modificado con nanomateriales, debido a que estos últimos consiguen disminuir la distancia entre el centro activo de la enzima y el electrodo y, por lo tanto, aceleran la transferencia de electrones [221,225,226]. Hasta ahora, se ha profundizado en el análisis de glucosa y galactosa. Por su parte la lactosa, es uno de los principales carbohidratos presentes en la leche. Por tanto, el contenido en lactosa, es un indicador básico en controles rutinarios. Además es una fuente de problemas en las personas con intolerancias alimentarias [198]. La determinación de lactosa por vía enzimática se puede llevar a cabo siguiendo diferentes estrategias. Por una parte, usando biosensores enzimáticos electroquímicos basados en la inmovilización de enzimas como la β-galactosidasa (comúnmente conocida como lactasa) o la celobiosa deshidrogenasa, que son capaces de hidrolizar los enlaces glicosídicos entre la glucosa y la galactosa. En este caso, los sensores detectan cambios en la composición de la disolución y esto da lugar a variaciones de la corriente de fondo que produce el sensor. Estos sensores son sencillos, pero bastante inespecíficos, ya que los cambios de composición pueden deberse a diferentes factores [101,208]. Por esta razón, se han desarrollado biosensores capaces de cuantificar lactosa por un método indirecto que consiste en utilizar sistemas multienzimáticos en cascada, en los que la β-galactosidasa promueve la hidrólisis de la lactosa en sus componentes, glucosa y galactosa, y posteriormente se analizan los productos de la hidrólisis, gracias a la actuación de las oxidorreductasas correspondientes, que catalizan la oxidación de la glucosa y galactosa obtenidas [53]. Al igual que en el resto de casos, el mecanismo de actuación de los biosensores electroquímicos enzimáticos para la determinación de lactosa ha progresado a lo largo de tres generaciones. Existe una gran cantidad de investigaciones que mediante sistemas Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 41 enzimáticos de primera generación son capaces de detectar los productos de hidrolisis de la lactosa en rangos de detección del orden milimolar en productos lácteos [208]. En cuanto a los biosensores de segunda generación para la detección de lactosa, el mecanismo de actuación consiste, por norma general, en una reacción enzimática en cascada basado en la inmovilización de la β-galactosidasa para la hidrólisis de la lactosa produciendo glucosa y galactosa, y la posterior actuación de la glucosa oxidasa o la galactosa oxidasa. Se han empleado distintos tipos de mediadores redox artificiales como azul de Prusia y polímeros conductores [124] o nanomateriales de carbono [227], capaces de mejorar los mecanismos de transferencia de electrones entre la glucosa oxidasa o la galactosa oxidasa y la superficie del electrodo y se continúa detectando el H2O2 generado o cualquier otro subproducto de la reacción. En el caso de la lactosa, solo se ha conseguido DET utilizando celobiosa deshidrogenasa gracias a la presencia de dos dominios redox en su interior. Esta enzima normalmente cataliza los procesos de degradación de la celulosa, no obstante, se ha demostrado su actividad catalítica en la degradación de carbohidratos como la lactosa. Sin embargo, los mecanismos son complejos y presentan numerosas dificultades [228]. En resumen, los trabajos comentados, indican la posibilidad de detectar lactosa, glucosa, galactosa u otros azúcares en muestras complejas como la leche y derivados con biosensores muy diferentes. Algunas de las investigaciones recientes basadas en la detección de carbohidratos en productos lácteos utilizando diferentes técnicas electroquímicas tanto en la deposición de materiales como en la propia determinación de analitos, se resumen en la Tabla 2. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 42 Tabla 2: Sensores y biosensores electroquímicos basados en la detección de carbohidratos en distintas variedades de leche. Composición del sensor Técnica Electroquímica Analito Sensibilidad (µA·µM-1) LOD (µM) Ref. CPE-rG-CuNPs CV/CA Manitol 0.0975 0.29 [57] Sacarosa 0.1247 0.42 Lactosa 0.1320 0.43 Glucosa 0.1033 0.37 Fructosa 0.1158 0.51 Au-[VO(acac)2]-PATP CA Glucosa 3.72·10-3 0.1 [62] GCE-Ni(OH)2/rGO– MWCNTs CA Glucosa 2.042 2.7 [61] grafito-PFLA-MWCNT-ZnPc- GOx CA Glucosa 3.78·10-3 18.0 [15] SPCE-MXene-PANI-Pt-LOx CV/CA Lactato 6.2·10-4 5.0 [54] ITO-(GPDDA/GPSS)1/(GPDDA- GOx)2 CA Glucosa 2.47·10-3 13.4 [66] ITO-P3HT/SA/GaOx CA Galactosa --- 5.5·10-4 [129] GCE-MWCNTs-BCS/Cu-GOx CA Glucosa 0.0477 2.0 [215] ITO-TiO2-AuNPs-g-C3N4-MnO2- GOx-β-gal fotoelectroquímico Glucosa 7.31·10-5 0.12 [216] Lactosa 7.88·10-5 0.23 GCE-MWCNTs-PEI/AuNPs- B(OH)2-GOx CV/CA Glucosa 3.26·10-3 0.8 [218] rG /PFLO/AuNPs-GOx CA Glucosa 3.85·10-4 81.0 [220] Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 43 2.3. Sistemas multisensores. Lenguas electrónicas Según la IUPAC, una lengua electrónica (LE) se define como un instrumento analítico que incluye una red de sensores químicos no selectivos con especificidad parcial para diferentes componentes, que funciona de forma conjunta con un software de reconocimiento de patrones, capaz de reconocer, discriminar y clasificar soluciones simples y complejas [229]. Las lenguas electrónicas tienen aplicación en la industria alimentaria como alternativa a técnicas analíticas tradicionales. Por ello, resultan ser una opción útil ya que permiten realizar una evaluación rápida de la calidad de los analitos [102,230]. Figura 4. Representación esquemática de una lengua electrónica. En los últimos años, se han realizado numerosos avances en el campo de lenguas electrónicas para el análisis de alimentos y bebidas tanto en lo referente a los sensores como en el campo del tratamiento de datos [230,231]. Así, mediante la adecuada selección de sensores y técnicas quimiométricas, se ha conseguido diseñar dispositivos con una elevada capacidad para discriminar, analizar y clasificar muestras complejas como vinos o leches. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 44 En cuanto a los avances en el campo de los sensores, los sensores electroquímicos (potenciométricos, amperométricos, voltamétricos o impedimétricos) son las unidades de detección más utilizadas para el análisis de alimentos [102,230]. Los trabajos pioneros utilizaban redes de sensores potenciométricos basados en membranas poliméricas de diferentes composiciones [232]. Recientemente, se han desarrollado una gran variedad de redes de sensores potenciométricos que incluyen nanomateriales como el grafeno o las nanopartículas metálicas en las membranas. También se han desarrollado sensores del tipo ISFET que han permitido miniaturizar las lenguas electrónicas mejorando su portabilidad [233]. En cuanto a las lenguas electrónicas basadas en sensores voltamperométricos e impedimétricos, se han realizado numerosos progresos utilizando electrodos químicamente modificados con una gran variedad de materiales electrocatalíticos como ftalocianinas o polímeros conductores [148,169,181,234]. Los mayores avances en este campo también se han realizado incorporando en las redes de sensores nanomateriales como materiales modificadores. Se ha demostrado que los nanotubos de carbono, el grafeno, o las nanopartículas metálicas, tienen unas excelentes propiedades electrocatalíticas que permiten mejorar la sensibilidad de los sensores de manera muy eficiente [235,236]. Por otra parte, se ha comprobado que, para mejorar las prestaciones de las lenguas electrónicas, es necesario desarrollar instrumentos para una aplicación concreta debido a las grandes diferencias que existen en la composición de las matrices a analizar (como el vino o la leche), así como a los diferentes problemas que hay que afrontar durante el análisis (como la presencia de etanol en el vino o de grasa en la leche). Por esta razón, en los últimos años se han desarrollado lenguas bioelectrónicas (bioLEs) que combinan sensores no específicos con biosensores específicos hacia ciertos compuestos químicos. Estas lenguas bioelectrónicas, proporcionan simultáneamente información global de la muestra (tal y como hacen las lenguas electrónicas clásicas), a la vez que proporcionan información específica sobre los compuestos diana de los biosensores incluidos en la red. Estos dispositivos tienen por tanto, la ventaja de cuantificar parámetros químicos concretos mediante la elección adecuada tanto de biosensores como de técnicas quimiométricas [237,238]. En este sentido, el grupo en el que se ha desarrollado esta Tesis, tiene experiencia en el desarrollo de bioLE para el análisis de vinos y mostos que combinan fenoloxidasas Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 45 y glucosa oxidasa con nanomateriales. Estos sistemas han demostrado tener una alta capacidad de discriminación entre muestras con diferentes características, a la vez que son capaces de determinar múltiples parámetros químicos (pH, contenido polifenólico total, glucosa, etc) de manera simultánea [234,239]. El desarrollo de sistemas multisensores formados por diferentes combinaciones de enzimas y nanomateriales es un campo de investigación muy activo y es en el que se encuadra esta Tesis. Como ya se ha comentado, una lengua electrónica consiste en una red de sensores acoplada a un sistema de tratamiento de datos multivariante. Las matrices de datos que se generan son muy complejas, contienen una gran cantidad de datos que han de ser simplificados para poder extraer la información útil del resto de datos superfluos, que no proporcionan información representativa de las muestras analizadas. Por esta razón, antes de realizar el tratamiento de datos propiamente dicho, se realiza un pre-procesado de los datos. En esta etapa se realizan procesos como el normalizado y/o escalado de la matriz de datos original para maximizar las variaciones más relevantes obtenidas mediante el sistema multisensor, así como la detección y eliminación de valores atípicos “outlaiers” y/o ruido. En algunos casos, la cantidad de datos obtenidos con los sensores es muy alta, lo que hace necesario reducir el número de variables. Existen varias técnicas para reducir el número de datos de la matriz sin perder información útil, como por ejemplo la utilización de kernels, algoritmos genéticos (GA), transformación por wavelet o por transformada de Fourier [143,240]. Una vez pre-procesada la señal, se emplean métodos estadísticos para realizar una reducción dimensional de variables. Gracias a ello, se reduce el número de variables iniciales y se generan nuevas variables latentes representativas de la varianza del sistema, reduciendo sus dimensiones para facilitar la identificación o clasificación de las muestras. Entre las técnicas más comunes empleadas en la reducción dimensional destacan métodos no supervisados como la utilización del Análisis de Componentes Principales (PCA), que permite discriminar entre muestras con distintas características. No obstante, los modelos de clasificación también pueden construirse utilizando técnicas supervisadas como es el análisis discriminante lineal (LDA), el modelado independiente de analogía de clases (SIMCA) o las redes neuronales artificiales (ANN), entre otras, capaces de resolver el problema de identificar una muestra desconocida y asignarla a un determinado conjunto Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 46 de muestras categorizadas previamente [241]. La reducción dimensional de los datos conseguida, se puede utilizar además con fines de predicción y/o regresión. En este sentido, las respuestas obtenidas por la red de sensores se representan mediante variables independientes frente a un segundo conjunto de variables (como son los parámetros físico-químicos de las muestras), para establecer modelos de regresión con el objetivo de predecir diferentes propiedades o parámetros físico-químicos. Los modelos más comunes establecidos para realizar este análisis son: mínimos cuadrados parciales (PLS), regresión de componentes principales (PCR), regresión de máquinas de vectores de soporte (SVMR) y regresión múltiple lineal (MLR) entre otros [242]. En los siguientes párrafos se recogen algunos ejemplos de redes de sensores y biosensores electroquímicos modificados químicamente para el análisis de muestras de vino y leche. Se presta especial atención a la importancia que tiene la modificación de la superficie de los electrodos con diferentes materiales sensibles en el funcionamiento y capacidades de los sistemas multisensores. 2.3.1. Lenguas electrónicas en la industria vitivinícola Durante el proceso de elaboración del vino, se requiere un control exhaustivo de todas las etapas para, de ese modo, poder garantizar la calidad del producto final. A pesar de la gran complejidad que presenta la composición química de los vinos, estos dispositivos han permitido discriminar y clasificar vinos en función de factores como la variedad, origen y estado de madurez de la uva, las reacciones que se producen durante el proceso de vinificación, el tratamiento post-fermentativo, la crianza del vino y la calidad del producto final, así como la identificación de la marca o la detección de adulteraciones [148,180,243]. A continuación se realiza una revisión de los trabajos realizados con lenguas electrónicas aplicadas en las distintas etapas del proceso de elaboración del vino desde el control de las uvas de origen, pasando por la preparación de los mostos, fermentación, envejecimiento hasta el embotellado de los vinos [244]. La calidad de la uva es un factor fundamental que determina la calidad del vino. Por este motivo, los controles rutinarios en la industria vitivinícola, comienzan por el análisis de las uvas, siendo parámetros fundamentales para el control de su calidad el contenido en azúcar y en polifenoles [20,230]. Estos parámetros se analizan normalmente por métodos químicos tradicionales. Sin embargo, en los últimos años se han desarrollado Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 47 lenguas electrónicas o bioelectrónicas aplicadas al control de la calidad de las uvas. Concretamente, se han usado diferentes tipos de lenguas electrónicas que incluyen lenguas potenciométricas [245] o voltamperométricas [88] para monitorizar su estado de madurez. Asimismo, se ha estudiado la calidad de uvas mediante la combinación de una lengua electrónica con un ojo electrónico, lo que permite analizar a la vez, el contenido polifenólico desde un punto de vista electroquímico y espectrofotométrico [246]. También, se han desarrollado métodos alternativos para monitorizar la madurez fenólica de las uvas, modificando electrodos con las propias pieles de uvas para obtener información sobre su contenido fenólico mediante técnicas voltamperométricas. Estos sensores han sido capaces de discriminar en función de la variedad y maduración de las uvas desde el envero hasta la cosecha, obteniéndose además muy buenas correlaciones con los valores químicos obtenidos por métodos clásicos [247]. Los trabajos más recientes y novedosos en este campo están relacionados con el desarrollo de lenguas electrónicas compuestas por redes de sensores y/o biosensores electroquímicos nanoestructurados. Como se ha descrito, estos dispositivos han permitido discriminar uvas en función del grado de madurez, la añada y la variedad de uva [178,181,248]. De este modo, ha sido posible monitorizar el grado de madurez de las uvas a partir de la concentración de azúcares y el contenido fenólico, mediante la modificación de las redes de sensores con nanomateriales como las NPs de óxidos metálicos, obteniendo límites de detección extremadamente bajos [88]. De la misma manera, la inclusión de fenoloxidasas, hace de las lenguas electrónicas, dispositivos capaces de discriminar en función del estado de las uvas según su grado de madurez [178]. Gracias a las lenguas bioelectrónicas que incluyen fenoloxidasas y glucosa oxidasa combinadas con AuNPs ha sido posible establecer correlaciones entre las señales de los sensores que forman la red y los datos del contenido fenólico y de azúcares, obtenidos mediante análisis químicos tradicionales. Esto ha permitido realizar una calibración capaz de predecir el contenido fenólico y de glucosa de las uvas en una sola medida. Además, estos sistemas brindan la posibilidad de establecer correlaciones entre las características de las uvas y las de los vinos elaborados a partir de ellas [234]. El vino, es el resultado de la fermentación del zumo de uva o de los mostos. Por ello, una vez evaluadas las características de las uvas, la siguiente etapa en el control de calidad, es el control de los procesos de fermentación. En el vino tinto, la fermentación Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 2: Estado Del Arte 48 consta de dos etapas, la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica. En la primera se transforma la glucosa en etanol, mientras que en la segunda el ácido málico se transforma en ácido láctico. Existen diversas investigaciones en las que se han desarrollado lenguas electrónicas para monitorizar los procesos de fermentación de los vinos [249–251]. Algunos autores, han combinado lenguas electrónicas y narices electrónicas con medidas ópticas para establecer correlaciones entre mostos con distintos grados de fermentación [251] . Una vez se ha llevado a cabo el proceso fermentativo del vino, la siguiente etapa, consiste en la maduración y envejecimiento del producto. Para mejorar sus características organolépticas, los vinos tintos son envejecidos en barricas de roble o utilizando astillas de madera en depósitos de acero inoxidable microoxigenados, antes de ser embotellados [230,232]. Por ello, el tiempo de envejecimiento, así como el tipo de barrica y su grado de porosidad son factores cruciales en la calidad del vino. Concretamente, las características organolépticas del vino están directamente relacionadas con la retención y liberación de compuestos volátiles durante el proceso de envejecimiento. Por este motivo, se han desarrollado lenguas electrónicas voltamperométricas capaces de monitorizar el envejecimiento de los vinos, y de clasificar y discriminar entre vinos en función de su grado de envejecimiento y tipo de barrica [180,252–254]. Entre ellos, algunos autores han puesto de manifiesto que la modificación de lenguas electrónicas con materiales electrocatalíticos como las bisftalocianinas, mejora la respuesta electroquímica frente a vinos [179,253]. Tras la evaluación de los procesos de envejecimiento del vino en barrica, es necesaria la revisión de la calidad de los vinos después de su embotellado. El empleo de lenguas electrónicas ha resultado muy útil para controlar los orígenes geográficos, variedades de vino, el año de cosecha, etc. [181,255–257]. Por otra parte, prácticas ilegales como la dilución con agua, la adición de sustancias exógenas (alcohol, azúcares, conservantes, colorantes), el uso de uvas de regiones diferentes a las declaradas o el uso de métodos de crianza no permitidos, que se realizan con el fin de reducir costes [148,258] hace necesario confirmar la veracidad de la información declarada en la etiqueta a los consumidores y las autoridades. Con este fin, los sistemas multisensores electroquímicos se han usado con éxito para detectar adulteraciones [232]. Por ejemplo, el empleo de redes de sensores basados en CPEs modificados con ftalocianinas y polímeros conductores ha Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 2: Estado Del Arte 49 sido de gran utilidad para determinar adulterantes como etanol, SO2, acetaldehído, sacarosa, ácido acético, tartárico o tánico en vino tinto [148]. En conclusión, la aplicación de las lenguas electrónicas en controles de calidad, permite obtener información cualitativa sobre la muestra y además permite predecir la concentración de determinados compuestos químicos o detectar determinadas características organolépticas. Debido a sus excelentes respuestas, resultan adecuadas para controlar todo el proceso de elaboración del vino desde la cosecha hasta el envejecimiento. Como se ha expuesto, las estrategias futuras pretenden incluir el diseño de redes de sensores o biosensores formadas por nuevos materiales con selectividad y sensibilidad mejoradas, en muchos casos vinculados a la nanotecnología. 2.3.2. Lenguas electrónicas en la industria láctea La leche es un producto complejo en el que coexiste un medio acuoso con una alta proporción de grasas además de proteínas y otros componentes. La alta concentración de grasas dificulta enormemente los análisis, ya que su presencia interfiere en muchas técnicas analíticas. Además, la calidad de la leche se altera rápidamente debido a diferentes fenómenos como la oxidación de ácidos grasos o la evaporación de compuestos volátiles además del crecimiento microbiano, que podrían afectar a la calidad del producto [244]. A pesar de estas dificultades, en los últimos años se han desarrollado lenguas electrónicas capaces de analizar la calidad de productos lácteos. La tarea no es fácil ya que la presencia de grasa altera la superficie de los sensores, y obliga a extremar los procesos de limpieza entre medidas. La complejidad del medio también limita el tipo de sensores a utilizar en la red y por esta razón, la mayoría de trabajos en este campo se han realizado utilizando redes de sensores potenciométricos, aunque también existen precedentes de éxito en los que se han utilizado lenguas electrónicas voltamperométricas. La aplicación de lenguas electrónicas permite determinar las diferencias en la composición de la leche según el origen animal [259], las tecnologías de procesamiento aplicadas durante la producción de leche [260], la marca [261,262], el contenido graso [263–265] o el tiempo de almacenamiento [263]. Otros estudios han demostrado la posibilidad de aplicar LEs para detectar y distinguir sustancias nocivas en la leche, que se utilizan como adulterantes en la industria con el fin de elevar su vida útil o aumentar el contenido de proteínas [266,267]. Los resultados obtenidos muestran que, a pesar de la Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 3: Resultados 56 Siguiendo la misma línea de trabajo, en el artículo 2, se ha evaluado la respuesta electroquímica de sensores basados en películas con una nueva composición. Concretamente, se han combinado monocapas de quitosano con películas alternas de dos materiales electrocatalíticos, AuNPs y CuPcs. Además, se han estudiado los efectos en la respuesta electrocatalítica del sensor en función de la enzima empleada. Para ello se han inmovilizado diferentes oxidorreductasas apropiadas para la detección de fenoles, la lacasa o la tirosinasa. Se ha evidenciado que la actividad óptima de ambas enzimas está ligada a la composición del sensor y, como era de esperar, la combinación de materiales ha resultado ser un punto crítico para favorecer la aparición de efectos sinérgicos que facilitan los procesos de transferencia electrónica. Este aspecto, ha sido evidenciado mediante la caracterización estructural de las películas mediante AFM, que ha revelado una gran variación estructural en función de las combinaciones propuestas para el desarrollo de las películas. La caracterización electroquímica, ha permitido determinar la composición óptima para mejorar la transferencia electrónica en la detección de catecol, así como la importancia en la elección de la enzima. Tras analizar los resultados, se ha determinado que la composición de las películas más favorable consiste en una bicapa de quitosano-AuNPs-quitosano-CuPc, es decir, cuando la última monocapa está formada por ftalocianina de cobre se mejora la transferencia de electrones entre la enzima y el electrodo, debido a que la superficie activa del sensor es mayor en comparación con aquellos en los que las AuNPs conforman la última capa y, por tanto, se favorece la adsorción enzimática. En cuanto a LOD se refiere, se ha conseguido obtener un valor de 8.5·10-10 M con el biosensor compuesto por tirosinasa, sin embargo, para la misma estructura, el valor de LOD al inmovilizar lacasa en el sensor, es dos órdenes de magnitud mayor, 1.8·10-8 M, concluyéndose, por tanto, la mayor efectividad de la enzima tirosinasa en la plataforma diseñada para la detección de catecol. Otra de las mejoras conseguidas con respecto al trabajo anterior ha sido la repetitividad, obteniéndose un coeficiente de variación de 1.07%. Con ambos trabajos se han conseguido desarrollar biosensores estructuralmente diferentes mediante la misma técnica y se ha demostrado que existe una fuerte interacción entre los componentes que forman la película nanoestructurada. Dado el excelente comportamiento de los biosensores, se ha examinado la posibilidad de integrarlos en una aplicación industrial siguiendo una línea de investigación aplicada. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 3: Resultados 57 En el artículo 3 se detalla la elaboración de una lengua electrónica para el análisis de muestras de leche. A este respecto, se ha seleccionado la estructura descrita en el artículo 1 para la preparación de la película, ya que, al comparar los resultados obtenidos con los del artículo 2 para la misma enzima, se obtuvo un LOD dos órdenes de magnitud inferior. Sin embargo, teniendo en cuenta la aplicación en el sector lácteo se ha elegido la galactosa oxidasa como enzima. El propósito de la red formada, ha consistido en la integración de un sensor no enzimático inespecífico junto con un biosensor específico, para la detección de galactosa. En cuanto a la caracterización estructural y electroquímica, se ha procedido de la misma manera que en los artículos previos, y se ha comprobado la eficiencia del método de deposición de los materiales, así como de la actividad electrocatalítica de ambos sensores. Se han calculado valores de LODs de 3.6·10-9 M para el sensor y de 9.4·10-11 M para el biosensor para la detección de galactosa, demostrándose la especificidad que supone la incorporación de la enzima en la determinación de este azúcar, traduciéndose en un aumento en la sensibilidad del biosensor. Finalmente, el sistema bi-sensor desarrollado se ha empleado en la clasificación y discriminación de muestras de leche con distinto contenido nutricional. Mediante un análisis quimiométrico, se ha podido discriminar entre muestras de leche basadas en su contenido en lactosa y además se han podido clasificar en función de su grado de envejecimiento. El sistema de detección elaborado ha conseguido ser un método de análisis simple, rápido, sensible y novedoso para discriminar matrices complejas sin pretratamiento previo, lo cual es indicativo de su gran capacidad para realizar análisis in-situ. En consecuencia, se propone la integración de estos sistemas como parte de los métodos de detección requeridos en la Industria 4.0 con el propósito de mejorar los métodos de análisis clásicos que aún muestran impedimentos para ser incorporados en la industria alimentaria. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 3: Resultados 58 3.1.1. Artículo 1 Promoting laccase sensing activity for catechol detection using LBL assemblies of chitosan/ionic liquid/ phthalocyanine as immobilization surfaces C.Salvo-Comino, C.Garcia-Hernandez, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez- Mendez, C. Garcia-Cabezon. Bioelectrochemistry, 132 (2020) 107407 DOI: 10.1016/j.bioelechem.2019.107407 Factor Impacto:5.373, Q1, Biophysi Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 3: Resultados 59 3.1.2 Artículo 2 Biosensors Platform Based on Chitosan/AuNPs/Phthalocyanine Composite Films for the Electrochemical Detection of Catechol. The Role of the Surface Structure C.Salvo-Comino, A. González-Gil, J. Rodriguez-Valentin, C. Garcia-Hernandez, F. Martin-Pedrosa, A. C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez-Mendez. Sensors, 20, (2020) 2152 DOI: 10.3390/s20072152 Factor Impacto: 3.576, Q1, Instrument and Instrumentation Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 3: Resultados 60 3.1.3. Artículo 3 Discrimination of milks with a Multisensor system based on Layer-by- Layer films C. Salvo-Comino, C.Garcia-Hernandez, C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez- Mendez. Sensors, 18 (2018), 2716-2728 DOI: 10.3390/s18082716 Factor Impacto: 3.302, Q1, Instrument and Instrumentation Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for industry applications Capítulo 3: Resultados 61 3.2. Biosensores electroquímicos basados en nanomateriales de plata. Influencia de la relación de aspecto A lo largo de este bloque se hace referencia a dos artículos, publicados en revistas indexada internacionales de alto impacto. Al igual que en el capítulo anterior, se han llevado a cabo dos líneas de investigación complementarias, una de ciencia básica y otra de aplicación industrial. En primera instancia, se ha investigado el desarrollo de biosensores voltamperométricos basados en la combinación de nanomateriales de plata con distinta relación de aspecto (superficie/volumen), nanohilos de plata (AgNWs) o nanopartículas de plata (AgNPs), capaces de proporcionar una gran interacción electroquímica entre el electrodo y el analito elevando la sensibilidad del sensor. Además de ello, con el fin de elevar la selectividad de los sensores, se han incorporado enzimas específicas para la detección de compuestos de interés industrial. En estos trabajos las técnicas de modificación de electrodos de ITO con nanomateriales empleadas han sido spin-coating y drop-casting. Se han determinado las propiedades analíticas de los biosensores en la detección de compuestos fenólicos y azúcares tanto en disoluciones patrón como en muestras de interés en la industria alimentaria. Posteriormente, se ha examinado la influencia del tipo de nanoestructura en las propiedades electrocatalíticas de los biosensores. En segunda instancia, se han desarrollado dos bioLEs, basadas en dichos nanomateriales y en diferentes enzimas de interés en la industria láctea, para así obtener dos redes de biosensores cuyo funcionamiento se ha podido comparar para evaluar los beneficios del empleo de AgNWs frente al de AgNPs. Se ha comprobado que la selección del material es esencial en la respuesta electroquímica y se han obtenido biosensores de tercera generación basados en mecanismos de transferencia electrónica directa (DET). La selección de nuevos materiales capaces de mejorar la intensidad de las señales, la especificidad y la sensibilidad de los sensores electroquímicos es un gran desafío científico al que intentamos dar respuesta. En algún trabajo se ha explorado el uso de NWs metálicos en la obtención de sensores y los resultados parecen apuntar que la alta relación de aspecto que presentan, podría ser una ventaja para la mejora de las prestaciones de los biosensores. Sin embargo, no existen trabajos previos en los que se hayan utilizado nanohilos de plata en la fabricación de biosensores dedicados al análisis Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 3: Resultados 62 de azúcares o fenoles en muestras alimentarias, con lo que la investigación llevada a cabo es ciertamente novedosa. El artículo 4 describe el desarrollo de un biosensor basado en la preparación de una película de AgNWs o AgNPs mediante spin-coating sobre la que se ha inmovilizado la enzima tirosinasa para la detección electroquímica de catecol. Una vez elaborados los biosensores, y caracterizada la estructura de las películas mediante diferentes técnicas se ha comprobado la correcta inmovilización enzimática sobre la superficie de los electrodos mediante AFM. La respuesta electroquímica de los biosensores construidos con AgNWs ha proporcionado un valor de LOD de 2.7·10-6 con una sensibilidad en torno a 200 µA·mM-1, mientras que para los desarrollados con AgNPs el valor superior de LOD, 3.2·10-5 M, confirma la mayor eficiencia de los AgNWs frente a las AgNPs como mediadores electrónicos. Además, se ha realizado un estudio de AFM acoplado con electroquímica que revela las capacidades de los AgNWs en la prevención de ensuciamiento de la superficie del electrodo tras la aplicación de sucesivos ciclos de voltaje, evitando adsorciones inespecíficas sobre el biosensor. Posteriormente, se ha evaluado la buena selectividad de los biosensores propuestos ante la presencia de diferentes interferentes fenólicos, así como su reproducibilidad y repetitividad, obteniéndose una desviación estándar inferior al 1.65% para los biosensores basados en AgNWs. Finalmente, a la vista de los resultados, los biosensores desarrollados se han utilizado para el análisis de catecol en muestras de vino. Gracias a los buenos resultados obtenidos con el biosensor desarrollado, se ha valorado la posibilidad de implementarlos en una bioLE para el análisis de matrices complejas como el vino o la leche. El artículo 5, continúa con la filosofía del trabajo anterior, si bien en una vertiente más práctica, se ha trabajado en el desarrollo de dos bioLEs basadas en AgNWs y AgNPs como materiales sensibles con el fin de seleccionar aquella que proporcione la mayor mejora en cuanto a la discriminación y clasificación de muestras de leche con diferentes características nutricionales. Para ello, se han estudiado los efectos de la relación superficie/volumen de los nanomateriales en la actividad de tres enzimas que catalizan las reacciones relacionadas con compuestos presentes en la leche como son: la galactosa, la glucosa y la lactosa. La investigación ha puesto de manifiesto que la actividad óptima de las enzimas está relacionada con la afinidad por la nanoestructura que compone el sensor, y, por ende, la selección del nanomaterial utilizado es decisiva en la capacidad de Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for industry applications Capítulo 3: Resultados 63 discriminación entre diferentes tipos de leche. También en este caso, se ha analizado la estructura de la superficie de los sensores mediante AFM, así como la conductividad de las películas mediante EIS. En cuanto a las respuestas electroquímicas de los biosensores, se ha comprobado que la presencia de AgNWs ha mejorado la actividad catalítica de las enzimas, aumentado el número de sitios activos y, en consecuencia, mejorando los mecanismos de transferencia electrónica directa (DET). Para la mayoría de los biosensores desarrollados, los valores de LOD obtenidos se encuentran en el rango nanoMolar, siendo más bajos para la red de sensores modificada con AgNWs. Finalmente, la capacidad de discriminación y clasificación de las dos redes de biosensores se ha analizado utilizando muestras de leche con diferente contenido graso y con distinto contenido nutricional. Mediante un análisis estadístico detallado utilizando análisis de componentes principales (PCA), se ha comprobado que, gracias a la especificidad conferida por las enzimas ambas redes tienen una buena capacidad para discriminar entre muestras de leche. Así mismo, se ha aplicado el análisis discriminante lineal (LDA) para desarrollar un modelo de clasificación predictivo para clasificar las muestras de leche. Finalmente, se han establecido modelos de correlación entre las respuestas electroquímicas de las redes de biosensores y los parámetros físico-químicos de la leche analizada mediante regresiones de máquinas de vectores de soporte (SVMR). Sin embargo, a pesar de que ambos dispositivos funcionan correctamente, se ha concluido que la utilización de AgNWs como material sensible es la mejor opción, puesto que la bioLE fabricada con AgNWs, presenta una mayor capacidad de discriminación y mejores correlaciones con parámetros físico-químicos medidos por métodos tradicionales en las leches que la fabricada con nanopartículas. De conformidad con los resultados obtenidos, tanto los biosensores electroquímicos individuales, como las bioLEs desarrolladas, satisfacen las estrictas necesidades de la industria alimentaria, no solo para fines de clasificación, sino también para obtener información cuantitativa del contenido de compuestos de interés en alimentos o bebidas mediante una única medida, siendo por tanto un método mucho más sencillo y rápido que los métodos tradicionales. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 3: Resultados 64 3.2.1 Artículo 4 Silver nanowires as electron transfer mediators in electrochemical catechol biosensors C.Salvo-Comino, F. Martín-Pedrosa, C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez- Mendez Sensors, 21, (2021), 899 DOI: 10.3390/s21030899 Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for their application in the food industry 65 3.2.2 Artículo 5 Improving the performance of a bioelectronic tongue using silver nanowires. Application to milk analysis C.Salvo-Comino, P. Martín-Bartolome, J.L. Pura, C Gonzalez-Perez, F. Martín- Pedrosa, C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez-Mendez Sensors and Actuators B-Chem, 364 (2022) 121877 DOI: 10.1016/j.snb.2022.131877 Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores y su aplicación en la industria alimentaria Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 4 Conclusiones y perspectivas futuras Este capítulo recoge las conclusiones extraídas de los resultados experimentales que, a su vez, confirman la consecución de los objetivos propuestos para esta Tesis Doctoral. Así mismo, se contemplan las perspectivas futuras de las investigaciones desarrolladas. This chapter contains the conclusions drawn from the experimental results that, in turn, confirm the achievement of the objectives proposed for this Doctoral Thesis. Likewise, the future perspectives of the developed investigations are contemplated. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 74 4.1. Conclusiones/ Conclusions Las conclusiones generales y específicas que comprenden el conjunto de resultados obtenidos en las investigaciones desarrolladas son: 1. Se ha desarrollado y puesto a punto una novedosa estrategia en la obtención de biosensores para la detección de compuestos de interés en la industria de la alimentación gracias a la combinación de materiales sensibles depositados mediante la técnica de Layer by Layer. 1.1. Películas delgadas nanoestructuradas de materiales con funcionalidades distintas han permitido desarrollar sensores electroquímicos para la detección de catecol. Para ello se han combinado materiales como líquido iónico (mejora la conductividad), ftalocianina de cobre o nanopartículas de oro (facilita la transferencia electrónica) y quitosano (mejora la inmovilización enzimática). Se ha demostrado la influencia del espesor de las películas, así como el orden y composición de las monocapas en la respuesta electroquímica. 1.2. Las películas nanoestructuradas obtenidas mediante LbL favorecen la inmovilización de dos enzimas oxidorreductasas, como son la lacasa y la tirosinasa, ya que facilitan la transferencia electrónica entre la superficie de los electrodos y las enzimas. 1.3. La mayor porosidad y rugosidad de la superficie de los electrodos permiten mejorar la absorción de las enzimas y favorecen los procesos de difusión, obteniéndose valores de límites de detección muy bajos, inferiores en el caso de los biosensores de tirosinasa, y un aumento notable de los sitios activos. 1.4. Esta estrategia ha sido igualmente útil en el diseño de biosensores nanoestructurados para la detección de azúcares como la galactosa. Para ello, tras la inmovilización de la enzima galactosa oxidasa, se ha confirmado una mejora en la respuesta electroquímica del biosensor modificado. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 75 1.5. Se ha diseñado una lengua electrónica a partir de sensores nanoestructurados mediante LbL enzimáticos y no enzimáticos para el análisis de leche. Se ha conseguido clasificar muestras de leche en función de su contenido en lactosa y de su grado de envejecimiento mediante PCA. Los modelos de correlación obtenidos mediante PLS entre las señales voltamétricas y sus parámetros físico-químicos, permiten predecir con muy bajo margen de error el contenido en lactosa y otros parámetros de interés como el contenido graso, acidez, etc. 2. Se ha comprobado la influencia que tiene la relación de aspecto de distintos nanomateriales de plata utilizados como mediadores electrónicos en la respuesta electroquímica de biosensores en la detección de fenoles y azúcares. 2.1. Electrodos de ITO modificados con nanohilos de plata presentan mayor afinidad por enzimas como la tirosina en comparación con los modificados con nanopartículas de plata en la detección de catecol. 2.2. La caracterización mediante AFM confirma una distribución homogénea de la enzima sobre los nanomateriales, lo cual maximiza la superficie de contacto. Se ha comprobado mediante análisis simultáneo de AFM acoplado con el estudio electroquímico que, los biosensores permanecen inalterados tras la aplicación de un número elevado de ciclos voltamétricos sin que se observen signos de ensuciamiento, ofreciendo excelentes valores de repetitividad y reproducibilidad. 2.3. La mayor relación superficie/volumen y la mayor conductividad de los nanohilos de plata en relación con las nanopartículas de plata promueven una mejora en la transferencia electrónica y como consecuencia se obtienen límites de detección inferiores. 2.4. Los biosensores de tirosinasa modificados con nanohilos de plata muestran una alta sensitividad a la molécula de catecol frente a interferentes como catequina, vainillina, quercetina y pirogalol, fenoles presentes en el vino. Asimismo, se ha comprobado su capacidad para detectar catecol en matrices complejas como el vino. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 76 2.5. Los nanomateriales de plata se han utilizado también de modo satisfactorio para la modificación de electrodos BDD. Se han desarrollado biosensores para la detección de azúcares y se ha demostrado que los biosensores modificados con nanomateriales tienen mejor sensibilidad que los electrodos modificados únicamente con enzimas tales como β-galactosidasa, glucosa oxidasa, y galactosa oxidasa. 2.6. La modificación de los sensores con nanopartículas y nanohilos de plata ha permitido obtener sensores de tercera generación con mecanismo de trasferencia directa de electrones (DET). Esta transferencia electrónica es más rápida en los sensores modificados con nanohilos de plata, lo que sugiere una vez más la importancia de la relación de aspecto. La modificación de los biosensores con nanohilos permite obtener límites de detección un orden de magnitud menor que los obtenidos con nanopartículas de plata. 2.7. Se han diseñado dos lenguas bioelectrónicas específicas para el análisis de leches a partir de los biosensores modificados en un caso con nanopartículas de plata y en otro caso con nanohilos de plata. Se ha observado mediante PCA que la capacidad de discriminación de la lengua bioelectrónica construida a partir de biosensores modificados con nanohilos es sensiblemente superior a la diseñada a partir de nanopartículas. 2.8. La lengua bioelectrónica diseñada a partir de nanohilos de plata y enzimas es capaz de discriminar entre nueve tipos de leches en función de su contenido graso y su contenido nutricional. Además, mediante SVM se han obtenido excelentes coeficientes de correlación entre los resultados electroquímicos de la lengua electrónica y los datos físico-químicos comúnmente utilizados en el control de calidad de la leche. Por tanto, la lengua bioelectrónica permite, además de discriminar y clasificar, predecir con muy bajo error múltiples parámetros físicoquímicos de interés de forma cuantitativa. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 77 3. Se ha diseñado y optimizado el desarrollo de sensores no enzimáticos basados en la técnica de polímeros de impresión molecular (MIP) para la cuantificación de catecol en muestras de vino. 3.1. La electrodeposición de un biopolímero, el quitosano, sobre electrodos BDD ha permitido la detección específica y selectiva de catecol en ausencia de material enzimático. Del mismo modo, se ha comprobado que la encapsulación de un material electrocatalítico en la red polimérica, concretamente nanotubos de carbono modificados con nanopartículas de oro, obstaculiza las respuestas electroquímicas, debido a que la rigidez estructural perturba la formación de las cavidades de reconocimiento de catecol, disminuyendo la sensibilidad del sensor. 3.2. Las capacidades analíticas de los sensores tipo MIP en presencia y ausencia de nanomateriales revelan una aceptable sensibilidad y reproducibilidad, así como una buena selectividad en la detección de catecol en presencia de interferentes, como el 4-tert-butilcatecol, 4-aminotiofenol, bisfenol-A, 2-nitrofenol o 4-nitrofenol. 3.3. Se ha demostrado una gran eficiencia durante los procesos de elución de la molécula plantilla, lo cual ha permitido la reutilización de los sensores sin pérdida de sensibilidad y selectividad en la detección de catecol. Además, la aplicación de los sensores en la cuantificación de catecol en muestras complejas como es el vino, ha permitido en todos los casos, estimar la concentración de catecol tras adiciones internas sobre la muestra, lo cual manifiesta las excelentes capacidades analíticas de los sensores. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 78 The general and specific conclusions that comprise the set of results obtained in the investigations carried out are: 1. A novel strategy has been developed and fine-tuned for obtaining biosensors for the detection of compounds of interest in the food industry thanks to the combination of sensitive materials deposited using the Layer by Layer technique. 1.1. Nanostructured thin films of materials with different functionalities have allowed the development of electrochemical sensors for catechol detection. For this, materials such as ionic liquid (improves conductivity), copper phthalocyanine or gold nanoparticles (facilitates electronic transfer) and chitosan (improves enzymatic immobilization) have been combined. The influence of the thickness of the films, as well as the order and composition of the monolayers on the electrochemical response has been demonstrated. 1.2. The nanostructured films obtained by means of LbL improve the immobilization of two oxidoreductase enzymes, such as laccase and tyrosinase, since they facilitate the electronic transfer between the surface of the electrodes and the enzymes. 1.3. The greater porosity and roughness of the surface of the electrodes improve the absorption of enzymes and favor diffusion processes, obtaining very low detection limit values, lower in the case of the tyrosinase biosensors, and a notable increase in active sites. 1.4. This strategy has been equally useful in the design of nanostructured biosensors for the detection of sugars such as galactose. For this, after the immobilization of the galactose oxidase enzyme, an improvement in the electrochemical response of the modified biosensor has been confirmed. 1.5. An electronic tongue has been designed from enzymatic and non-enzymatic LbL nanostructured sensors for milk analysis. It has been possible to classify milk samples according to their lactose content and their degree of aging by means of PCA. The correlation models obtained by means of PLS between the voltammetric signals and their physical-chemical parameters allow the lactose content and other Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 79 parameters of interest, such as fat content, acidity, etc., to be predicted with a very low margin of error. 2. The influence of the aspect ratio of different silver nanomaterials, used as electronic mediators in the electrochemical response of biosensors in the detection of phenols and sugars, has been verified. 2.1. ITO electrodes modified with silver nanowires have a higher affinity for enzymes such as tyrosine compared to those modified with silver nanoparticles in the detection of catechol. 2.2. Characterization by AFM confirms a homogeneous distribution of the enzyme on the nanomaterials, which maximizes the contact surface. It has been verified by means of simultaneous analysis of AFM, coupled with the electrochemical study, that the biosensors remain unchanged after the application of a high number of voltammetric cycles without signs of fouling being observed, offering excellent repeatability and reproducibility values. 2.3. The higher surface-to-volume ratio and higher conductivity of silver nanowires relative to silver nanoparticles promote enhanced electron transfer, resulting in lower detection limits. 2.4. Tyrosinase biosensors modified with silver nanowires show a high sensitivity to the catechol molecule against interfering agents such as catechin, vanillin, quercetin and pyrogallol, phenols present in wine. Likewise, its ability to detect catechol in complex matrices such as wine has been verified. 2.5. Silver nanomaterials have also been used successfully to modify BDD electrodes. Biosensors for the detection of sugars have been developed and biosensors modified with nanomaterials have been shown to have a better sensitivity than electrodes modified exclusively with enzymes such as β-galactosidase, glucose oxidase, and galactose oxidase. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 80 2.6. The modification of the sensors with silver nanoparticles and nanowires has made it possible to obtain third-generation sensors with a direct electron transfer (DET) mechanism. This electron transfer is faster in sensors modified with silver nanowires, again suggesting the importance of the aspect ratio. The modification of biosensors with nanowires allows detection limits an order of magnitude lower than those obtained with silver nanoparticles to be obtained. 2.7. Two specific bioelectronic tongues have been designed for the analysis of milk from biosensors, modified in one case with silver nanoparticles and in the other with silver nanowires. It has been observed, by means of PCA, that the discrimination capacity of the bioelectronic tongue built from biosensors modified with nanowires is significantly higher than that designed from nanoparticles. 2.8. The bioelectronic tongue designed from silver nanowires and enzymes is capable of discriminating between nine types of milk based on the fat and nutritional content. In addition, excellent correlation coefficients have been obtained using SVM between the electrochemical results of the electronic tongue and the physicalchemical data commonly used in milk quality control. Therefore, the bioelectronic tongue allows, in addition to discriminating and classifying, multiple physicochemical parameters of interest to be quantitatively predicted with very low error. 3. The development of non-enzymatic sensors based on the molecular imprinted polymer (MIP) technique for the quantification of catechol in wine samples has been designed and optimized. 3.1. The electrodeposition of a biopolymer, chitosan, on BDD electrodes has allowed the specific and selective detection of catechol in the absence of enzymatic material. Likewise, the encapsulation of an electrocatalytic material in the polymeric network, specifically carbon nanotubes modified with gold nanoparticles, hinders the electrochemical responses, because the structural rigidity disturbs the formation of catechol recognition cavities, decreasing the sensitivity of the sensor. Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 4: Conclusiones y perspectivas futuras 81 3.2. The analytical capabilities of MIP-type sensors, with and without the presence of nanomaterials reveal acceptable sensitivity and reproducibility, as well as good selectivity in the detection of catechol in the presence of interferents, such as 4-tert- butylcatechol, 4-aminothiophenol, bisphenol- A, 2-nitrophenol or 4-nitrophenol. 3.3. A high efficiency has been demonstrated during the elution processes of the template molecule, which has allowed the reusability of the sensors without loss of sensitivity or selectivity in the detection of catechol. In addition, the application of the sensors in the quantification of catechol in complex samples such as wine has allowed, in all cases, the concentration of catechol to be estimated after internal additions to the sample, which shows the excellent analytical capabilities of the sensors. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 5: Bibliografía 88 J. Environ. Res. Public Health. 17 (2020) 1–30. doi:10.3390/ijerph17145220. [33] A. Riul, H.C. De Sousa, R.R. Malmegrim, D.S. Dos Santos, A.C.P.L.F. Carvalho, F.J. Fonseca, O.N. Oliveira, L.H.C. Mattoso, Wine classification by taste sensors made from ultra-thin films and using neural networks, Sensors Actuators, B Chem. 98 (2004) 77–82. doi:10.1016/j.snb.2003.09.025. [34] C. Garcia-Hernandez, C. Salvo Comino, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez-Mendez, C. Garcia-Cabezon, Impedimetric electronic tongue based on nanocomposites for the analysis of red wines. Improving the variable selection method, Sensors Actuators, B Chem. 277 (2018) 365–372. doi:10.1016/j.snb.2018.09.023. [35] V.P. Scagion, L.A. Mercante, K.Y. Sakamoto, J.E. Oliveira, F.J. Fonseca, L.H.C. Mattoso, M.D. Ferreira, D.S. 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This section includes all the merits of the author of the Doctoral Thesis, among which are publications, attendance at conferences or courses, participation in projects, certification of pre-doctoral stay abroad, scholarships and external evaluator reports. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 6: Anexos 108 6.1. Publicaciones, congresos, cursos, participación en proyectos, estancia pre-doctoral y becas Publicaciones: 1. E. Sánchez-Tirado, C. Salvo, A. González-Cortés, P. Yáñez-Sedeño, F.Langa, J.M. Pingarrón. Electrochemical immunosensor for simultaneous determination of interleukin-1 beta and tumor necrosis factor alpha in serum and saliva using dual screen printed electrodes modified with functionalized double-walled carbon nanotubes. Analytica Chimica Acta, 959 (2017) 66-73. Factor Impacto:5.123, Q1, Chemistry Analytical 2. C.Salvo-Comino, C.Garcia-Hernandez, C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez- Mendez. Discrimination of milks with a Multisensor system based on Layer-by- Layer films. Sensors, 18 (2018), 2716-2728. Factor Impacto: 3.302, Q1, Instrument and Instrumentation. 3. C.Garcia-Hernandez, C.Salvo-Comino, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez- Mendez, C. Garcia-Cabezon. Impedimetric Electronic Tongue based on nanocomposites for the Analysis of red Wines. Improving the variable selection. Sensors and Actuators B. 277 (2018) 365-372. Factor Impacto: 3.302, Q1, Instrument and Instrumentation. 4. C.Salvo-Comino, C.Garcia-Hernandez, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez- Mendez, C. Garcia-Cabezon. Promoting laccase sensing activity for catechol detection using LbL assemblies of chitosan/ionic liquid/ phthalocyanine as immobilization surfaces. Bioelectrochemistry, 132 (2020) 107407. Factor Impacto:5.373, Q1, Biophysic. 5. C.Garcia-Hernandez, C.Salvo-Comino, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez- Mendez, C. Garcia-Cabezon. Analysis of red wines using an electronic tongue and infrared spectroscopy. Correlations with phenolic content and color parameters. LWT Food Science and Technology, 118 (2020) 108785. Factor Impacto: 4.952, Q1, Food, Science and Technology. 6. C. Salvo-Comino, I. Rassas, S. Minot, F. Bessueille, M.L. Rodriguez-Mendez, A. Errachid, N. Jaffrezic-Renault. Voltammetric sensor based on electrodeposited molecularly imprinted chitosan film on BDD electrodes for catechol detection in buffer and in wine samples. Materials Science and engineering C, 110 (2020) 110667. Factor Impacto: 7.328, Q1, Materials, Science, Biomaterials. 7. C. Salvo-Comino, I. Rassas, S. Minot, F. Bessueille, M. Arab, V. Chevallier, M.L. Rodriguez-Mendez, A. Errachid, N. Jaffrezic-Renault. Voltammetric sensor based on molecularly imprinted chitosan-carbon nanotubes decorated with gold nanoparticles nanocomposite deposited on Boron Doped Diamond electrodes for catechol detection. Materials, 13, 688, (2020) 1-11. Factor Impacto:3.623 Q2, Material Science (MIscellaneous) Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 6: Anexos 109 8. C. Salvo-Comino, A. González-Gil, J. Rodriguez-Valentin, C. Garcia-Hernandez, F. Martin-Pedrosa, A. C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez-Mendez. Biosensors Platform Based on Chitosan/AuNPs/Phthalocyanine Composite Films for the Electrochemical Detection of Catechol. The Role of the Surface Structure. Sensors, 20, (2020) 2152. Factor Impacto: 3.576, Q1, Instrument and Instrumentation. 9. C. Garcia-Cabezon, G. Gobbi Teixeira, L. Guimaraes Dias, C. Salvo-Comino, C. García-Hernandez, M.L. Rodriguez-Mendez, F. Martin-Pedrosa. Analysis of Phenolic Content in Grape Seeds and Skins by Means of a Bio-Electronic Tongue. Sensors, 20, (2020), 4176. Factor Impacto: 3.576, Q1, Instrument and Instrumentation. 10. C. Garcia-Cabezon, C. Salvo-Comino, C. García-Hernandez, M.L. Rodriguez- Mendez, F. Martin-Pedrosa. Nanocomposites of conductive polymers and nanoparticles deposited on porous material as a strategy to improve its corrosion resistance. Surface and Coatings Technology. 403 (2020) 126395. Factor Impacto: 4.158, Q1, Surface and Coating Technology. 11. C.Salvo-Comino, F. Martín-Pedrosa, C. Garcia-Cabezon, M-L. Rodriguez-Mendez. Silver nanowires as electron transfer mediators in electrochemical catechol biosensors. Sensors, 21, (2021), 899. 12. C. Pérez-Gónzalez, C. Salvo-Comino, L. Guimaraes-Dias, M.A. Rodriguez-Perez, C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez-Mendez. Analysis of milk using a portable potentiometric electronic tongue based on five polymeric membrane sensors. Frontiers in Chemistry, 9, (2021), 706460. 13. C. García-Cabezón, v. Godinho, C. Salvo-Comino, Y. Torres, F. Martín-Pedrosa. Improved corrosión behaviour and biocompatibility of porous titanium samples coated with bioactive chitosán-based nanocomposites. Materials, 14 (2021) 6322. 14. C. Salvo-Comino, P. Martín-Bartolome, J.L. Pura, C Gonzalez-Perez, F. Martín- Pedrosa, C. Garcia-Cabezon, M.L. Rodriguez-Mendez. Improving the performance of a bioelectronic tongue using silver nanowires. Application to milk analysis. Sensors and Actuators B-Chem, 364 (2022) 121877. Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 6: Anexos 110 Congresos: 1. C. Salvo-Comino, C. García-Hernández, J.A. de Saja, M.L. Rodríguez-Méndez. Sensores nanoestructurados por deposición de diferentes materiales sensibles. Técnica Layer by Layer. Ibernam. Tordesillas (España), 28-29/09/2017 (Póster) 2. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, M.L. Rodriguez-Mendez. Nanostructured sensor fabricated by Layer by Layer assembly for electrochemical detection of catechol. XVII Escuela Nacional de Materiales Moleculares. Málaga (España), 11- 15/02/2018 (Póster) 3. C. Garcia-Hernandez, C. Salvo-Comino, M.L. Rodriguez-Mendez. New Approach For Lysozyme Delivery Using AuNPs By Means Of Layer-By-Layer Technique. XVII Escuela Nacional de Materiales Moleculares. Málaga (España), 11-15/02/2018 (Oral) 4. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, M.L. Rodriguez-Mendez. Nanostructured sensor fabricated by Layer by Layer assembly for electrochemical detection of catechol. IV Jornada de Investigadoras de la UVa en Ciencia y Tecnología. Valladolid (España), 02/03/2018. (Oral) 5. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, M.L. Rodriguez-Mendez. Sensores nanoestructurados fabricados mediante ensamblaje layer by layer para la detección electroquímica de catecol. IX Reunión de Jóvenes Investigadores Iberoamericanos. Valladolid (España), 13/04/2018 (Póster) 6. C. Garcia-Hernandez, C. Salvo-Comino, M.L. Rodriguez-Mendez. New Approach For Lysozyme Delivery Using AuNPs By Means Of Layer-By-Layer Technique. IX Reunión de Jóvenes Investigadores Iberoamericanos. Valladolid (España), 13/04/2018 (Póster) 7. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, C. García-Cabezón, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodríguez-Méndez. Multisensor system based on layer by layer films. Discrimination of milks. IX Franco-Spanish Workshop IBERNAM-CMC2. Cataluña (España), 04-05/09/2018 (Oral) 8. C. Garcia-Hernandez, C. Salvo-Comino, C. García-Cabezón, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodríguez-Méndez. Synergy in nanostructured voltammetric sensors. Applications in the food industry. IX Franco-Spanish Workshop IBERNAM-CMC2. Cataluña (España), 04-05/09/2018 (Oral) 9. M.L. Rodríguez-Méndez, C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, C. García- Cabezón, F. Martín-Pedrosa. Complementary study of red wines combining voltammetric sensors and spectroscopic techniques. IX Franco-Spanish Workshop IBERNAM-CMC2. Cataluña (España), 04-05/09/2018 (Oral) 10. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, C. García-Cabezón, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez-Mendez. Nanostructured biosensors fabricated by layer by layer Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 6: Anexos 111 assembly for electrochemical detection of catechol. 11th Iberoamerican Conference Sensors. Cataluña (España),17-20/09/2018 (Oral) 11. C. Garcia-Hernandez, C. Salvo-Comino, C. García-Cabezón, F. Martín-Pedrosa, M.L. Rodriguez-Mendez. In situ synthesis, stabilization and activity of lysozymegold nanoparticles for biosensing application. 11th Iberoamerican Conference Sensors. Cataluña (España),17-20/09/2018 (P) 12. M.L. Rodriguez-Mendez. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, C, C.Fernández- Blanco, A. Ruiz-Carmuega, R. Gonzalez-Antón, C. García-Cabezón, F. Martín- Pedrosa, Y. Blanco. The role of synergy in nanostructured voltammetric sensors. Applications in the food industry. 11th Iberoamerican Conference Sensors. Cataluña (España),17-20/09/2018 (Oral) 13. C. Garcia-Hernandez, C. Salvo-Comino, C. Garcia-Cabezon, M.L Rodriguez- Mendez. Analysis of the Phenolic Content in Red Wines Using Three Multivariate Techniques: Electronic Tongue, FTIR and UV-Vis, 32nd Eurosensors Conference. Graz (Austria) 9-12/09/2018 (Póster) 14. A. Errachid, C. Salvo-Comino, I. Rassas, M.L Rodriguez-Mendez, Nicole Jaffrezic- Renault. Voltammetric sensor based on electrodeposited molecularly imprinted chitosán film on BDD electrodes for catechol detection. 9th International Workshop on Biosensors. Erfoud (Marruecos), 9-11/10/2019 (Póster) 15. C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, J. Rodriguez-Valentin, C. García-Cabezón, F. Martín Pedrosa, M.L. Rodriguez-Mendez. Enzymatic biosensor based on silver nanowires modified electrode for the electrochemical detection of catechol. XVI Ibernam Workshop. San Sebastian (España), 7-8/11/2019, (Póster y oral) 16. M.L. Rodriguez-Mendez, C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, C. García- Cabezón, F. Martín Pedrosa. Performance Improvement of an Impedimetric Electronic Tongue. XVI Ibernam Workshop. San Sebastian (España), 7-8/11/2019, (Póster y oral) 17. ML Rodriguez-Mendez, C. Salvo-Comino, C. Garcia-Hernandez, J. Rodriguez- Valentin, C. Garcia-Cabezon, F. Martin-Pedrosa, Multicomponent Layer-By-Layer Films of Chitosan/Phthalocyanine/AuNPs As Biosensing Platforms, 237th ECS Meeting with IMCS 2020 Montreal (Canadá) 10-14/05/ 2020 (Oral) 18. C. Salvo-Comino, C. Perez-Gonzalez, F. Martín Pedrosa, C. García-Cabezón, M.L. Rodriguez-Mendez. Nanohilos de Plata: Mediadores electrónicos en la determinación de catecol. VII Jornadas de Investigadoras de Castilla y León: La Aventura de la Ciencia y la Tecnología. Valladolid (España) 15-16/4/2021 (Oral) 19. C. Perez-Gonzalez, C. Salvo-Comino, F. Martín Pedrosa, C. García-Cabezón, M.L. Rodriguez-Mendez. Optimización de una lengua electrónica para la industria láctea. VII Jornadas de Investigadoras de Castilla y León: La Aventura de la Ciencia y la Tecnología. Valladolid (España) 15-16/4/2021 (Presentación Flash) 20. M.L. Rodriguez-Mendez, C. Salvo-Comino, C. Perez-Gonzalez, F. Martín Pedrosa, Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 6: Anexos 112 C. García-Cabezón, Multicomponent Layer-by-Layer films of chitosan/phthalocyanine/AuNPs as biosensing platforms. 239th ECS Meeting with the 18th International Meeting on Chemical Sensors (IMCS). Online 30/5/2021-3/6/2021 (Oral) 21. C. Pérez-González, C.Salvo-Comino, C.García-Cabezón, F. Martin-Pedrosa, ML Rodríguez Méndez Development of a bioelectronic tongue modified with gold nanoparticles for dairy analysis. CDE2021 (13th Spanish Conference on Electronic devices). Online, 9-11/06/2021 (Póster) 22. C. Salvo-Comino, C. Pérez-González, C. García-Cabezón, F. Martín Pedrosa, M.L. Rodríguez-Mendez. Silver nanomaterials as electron mediators in a bio-eletronic tongue dedicated to the analysis of milks. The role of the aspect ratio of nanoparticles vs. Nanowires. CSAC2021: 1st International Electronic Conference on Chemical Sensors and Analytical Chemistry. Online, 1-15/7/2021 (extended abstract) 23. C. Pérez-González, C. Salvo-Comino, C. García-Cabezón, F. Martín Pedrosa, M.L. Rodríguez-Mendez. Development of a bioelectronic tongue modified with gold nanoparticles for dairy analysis. CSAC2021: 1st International Electronic Conference on Chemical Sensors and Analytical Chemistry. Online, 1-15/7/2021 (extended abstract) 24. J.L. Pura Ruiz, C. Salvo-Comino C. Pérez-González, C. García-Cabezón, M.L. Rodríguez-Mendez. AFM characterization of AgNWs modified electrodes by Langmuir-Blodgett: the effect of electrochemical measurements. Symposium of the Spanish Royal Society of Chemistry 20212. Online, 27-30/9/2021 25. C. Pérez-González, C. Salvo-Comino, JL, F. Martin-Pedrosa, C.García-Cabezón , MLRodríguez Méndez. Development of a bioelectronic tongue with gold nanoparticles and enzymes dedicated to milk analysis. X Franco-Spanish Workshop IBERNAM-CMC2. Arcachon (Francia), 25-26/11/2021 (Oral) 26. C. Salvo-Comino, C. Perez-Gonzalez, J.L. Pura, F. Martin-Pedrosa C. Garcia- Cabezon, M.L Rodriguez-Mendez. Improving a bioET capabilities based on silver nanomaterials as electron mediators. The influence of the nanostructure in the analysis of milk. X Franco-Spanish Workshop IBERNAM-CMC2. Arcachon (Francia), 25-26/11/2021 (Póster) Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 6: Anexos 113 Cursos: 1. Curso: Movilidad del Investigador. Entidad organizadora: ESDUVa, Universidad de Valladolid. Fecha de inicio-fin: 22/05/2017 – 25/05/2017. 2. Curso: Aspectos Metodológicos de la Tesis Doctoral. Entidad organizadora: ESDUVa, Universidad de Valladolid. Fecha de inicio-fin: 29/05/2017 – 31/05/2017. 3. Curso: Nivel básico-unificación de firmas de autores, solicitar una corrección de artículo y firma de organizaciones. Entidad organizadora: FECYT Fecha de inicio-fin: 19/09/2017 4. Curso: buscar la producción científica de autores y la evaluación con métricos de cita. Entidad organizadora: FECYT Fecha de inicio-fin: 20/09/2017 5. Curso: Sesión de Formación “Gestor de Referencias Mendeley” Entidad organizadora: FECYT Fecha de inicio-fin: 14/09/2017 6. Comité organizador del ciclo de conferencias: Investigadoras de la UVA en La Aventura de la Ciencia y la Tecnología. Entidad organizadora: Universidad de Valladolid- Grupo UVASENS Fecha de inicio-fin: 2/03/2018 7. Escuela Nacional: XVII Escuela Nacional de Materiales Moleculares. Entidad organizadora: Grupo Especializado de Nanociencia y Materiales Moleculares de la RSEQ. Fecha de inicio-fin: 11/02/2018 – 15/02/2018. 8. Jornada: IV Investigadoras de la UVa en la aventura de la Ciencia y Tecnología. Entidad organizadora: Universidad de Valladolid. Departamento de Química Física y Química Inorgánica. Fecha de inicio-fin: 02/03/2018 - 02/03/2018. 9. Jornada: XI Reunión de Jóvenes Investigadores Iberoamericanos. Entidad organizadora: Universidad de Valladolid – Centro “Tordesillas” de Relaciones con Iberoamérica. Fecha de inicio-fin: 13/04/2018 - 13/04/2018. 10. Curso: The imposter syndrome. Entidad organizadora: ESDUVa, Universidad de Valladolid. Fecha Inicio-fin: 14/06/2018 11. Curso: Advanced use of Atomic Force Microscope on biological samples Entidad organizadora: ISOM (Politécnica de Madrid) Fecha Inicio-fin: 26/09/2018-27/09/2018 Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 6: Anexos 120 Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 6: Anexos 121 Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria Capítulo 6: Anexos 122 Electrochemical sensors and biosensors: new horizons and challenges in their integration in multisensor systems for food industry applications Capítulo 6: Anexos 123 Sensores y biosensores electroquímicos: nuevos horizontes y desafíos en su integración en sistemas multisensores para su aplicación en la industria alimentaria 124