Modelo de receptor de antígeno quimérico en la línea celular Jurkat

Modelo de receptor de antígeno quimérico en la línea celular Jurkat Autor: González López, Luis Alberto Tutor: De la Fuente García, Miguel Ángel 2 ÍNDICE Contenido RESUMEN ................................................................................................................................... 3 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 3 1.1. Introducción a la inmunoterapia contra el cáncer con células CAR-T ............ 3 1.2. Edición genética ............................................................................................. 4 1.2.1. Sistema CRISPR/Cas9 ...................................................................................... 4 1.2.2. Mecanismo HITI (Homology-independent targeted integration) ................. 6 1.3. Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) ......................................................... 7 1.3.1. Estructura del CAR ............................................................................................. 7 1.4. Estado actual de las terapias con células CAR-T ........................................... 8 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 10 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................... 11 3.1. Producción de los virus AAV ......................................................................... 11 3.2. Generación del complejo gRNA/Cas9 ........................................................... 12 3.3. Línea celular Jurkat ...................................................................................... 13 3.4. Transfección y transducción de células Jurkat .............................................. 13 3.4.1. Conteo celular ................................................................................................... 14 3.4.2. Lavado y resuspensión en buffer ................................................................... 14 3.4.3. Electroporación con el Nucleofector Neón® ................................................ 14 3.4.4. Adición del virus AAV. ...................................................................................... 15 4. RESULTADOS ................................................................................................................. 15 4.1. Obtención de los vectores virales ................................................................. 15 4.2. Comprobación de la edición por citometría de flujo ....................................... 17 5. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 18 6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 19 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 19 3 RESUMEN En este TFG se explicarán los pasos necesarios para conseguir la expresión de un receptor de antígeno quimérico (CAR) en la línea celular Jurkat, así como la generación de un doble knock-out en los genes TRAC y B2M (que codifican respectivamente para el receptor de antígeno del lifocito T, TCR y para la beta2- microblobulina, proteína que forma parte del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, MHC-I). Esto se llevará a cabo mediante una herramienta de edición génica, variante del sistema CRISPR/Cas9, que se basa en el vanguardista método de unión de extremos independiente de homología (HITI) y que permitirá seleccionar una diana para realizar el corte en la doble cadena de DNA (generando el knock-out en el gen predeterminado), posibilitando la integración del material genético donado por los vectores en el lugar de la escisión. La generación de células modificadas genéticamente, más concretamente linfocitos T, abre numerosas posibilidades para ofrecer terapias curativas en pacientes afectados por cánceres de diversa índole, ofreciendo además especificidad gracias al dominio extramembrana del CAR. 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Introducción a la inmunoterapia contra el cáncer con células CAR-T La inmunoterapia contra el cáncer es una terapia biológica que consiste en estimular el sistema inmune con el fin de eliminar las células tumorales, siendo uno de los avances más prometedores en lo que respecta al tratamiento de esta patología en los últimos años. (1) La ingeniería genética supone la base teórica sobre la que se sustenta la terapia biológica y su historia es muy breve. La profundización en este campo comienza a finales del siglo pasado, cuando en la década de los ochenta se realiza la primera transferencia de material genético a una célula empleando un retrovirus como vector. A partir de aquí se comienza un período de intensa investigación hasta llegar al punto en que nos encontramos hoy en día, en que somos capaces de insertar genes en el genoma con una especificidad muy alta y generar receptores quiméricos que abren la 4 posibilidad a un tratamiento altamente eficaz del cáncer y con efectos adversos cada vez menos graves y frecuentes. En este trabajo me centraré en un tipo de inmunoterapia que emplea células CAR-T, linfocitos T modificados genéticamente para expresar un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) que dirige la respuesta del linfocito T contra un antígeno tumoral de interés (2). Esta técnica se engloba dentro de la denominada Transferencia Celular Adoptiva, que consiste en manipular células del huésped ex vivo para incrementar su potencial antitumoral y su posterior infusión al paciente. Actualmente son terapias autólogas, es decir, los linfocitos T se obtienen del propio individuo que más tarde se beneficiará de la terapia. Sin embargo existen líneas de investigación que buscan mejorar la eficiencia de este tratamiento eliminando mediante ingeniería genética las moléculas MHC clase I y TCR (lo que evitaría el rechazo del huésped y la enfermedad injerto contra huésped, respectivamente), con lo que se conseguiría una terapia alogénica, es decir podrían utilizarse linfocitos T derivados de otros individuos. 1.2. Edición genética Pueden distinguirse dos variantes: la integración del material genético de forma aleatoria o dirigida. La primera es más sencilla y básica y puede realizarse mediante electroporación de ADN desnudo, sistemas de transposón/transponasa o transducción viral. En esta forma, al carecer de especificidad para la inserción del gen en el DNA de la célula huésped existe riesgo de activación oncogénica o inactivación de algún gen relevante(la llamada mutagénesis insercional). La segunda, más vanguardista y aún en desarrollo, emplea técnicas como meganucleasas, nucleasas con dedos de Zn o, la más novedosa de ellas y de la que me voy a ocupar en este trabajo, el sistema CRISPR/Cas9. 1.2.1. Sistema CRISPR/Cas9 El sistema CRISP (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), descubierto a finales del siglo pasado en una cepa de E.coli, supone en la actualidad una herramienta poderosa para la edición genética. Poco después se descubriría que estas secuencias palindrómicas se encontraban asociadas a proteínas con capacidad nucleasa (Cas), suponiendo una forma de inmunidad adaptativa para las bacterias, protegiéndolas frente a infecciones virales e incluso generando memoria inmunológica hacia infecciones futuras.(3,4) (5) 5 Las ventajas que demuestra este método frente otros es su gran especificidad a la hora de realizar cortes en la doble cadena de DNA de las células objetivo, basándose en uniones de tipo Watson y Crick entre los nucleótidos del gRNA del complejo CRISPR/Cas9 y la secuencia complementaria a esta, diana genómica sobre la que tendrá lugar la actividad nucleasa de la Cas.(7) La especificidad de este método se consigue con la creación de gRNAs de unos 20 pares de bases, que se unirán a su diana genómica, actuando como marcadores para realizar el corte en la doble cadena de DNA.(3,4) La existencia de una secuencia PAM (Protospacer Adjacent Motif) en el DNA diana resulta esencial, aunque no forme parte per se de la maquinaria de edición genética. Estos son secuencias cortas de 2-6 pares de bases que son reconocidos por una Cas en particular, encontrándose justo a continuación de la secuencia complementaria del gRNA.(3–5) Figura 1: Evolución del sistema de edición genética CRISPR/Cas9 (6) 6 Figura 2 Esquema del complejo CRISP/Cas9 (8) 1.2.2. Mecanismo HITI (Homology-independent targeted integration) Una vez se produzca el corte en la doble cadena de DNA, la maquinaria celular se pondrá en marcha para llevar a cabo su reparación. Tradicionalmente se habían descrito dos mecanismos básicos para la reparación del DNA celular dañado. Por un lado la reparación directa por homología (HDR), en la cual tras el corte se produce recombinación homóloga con un fragmento de DNA donante. El problema con este mecanismo es que se trata de un proceso exclusivo de células en división.(9) Por otro lado se encuentra la reparación por unión de extremos no homólogos (NHEJ). Este mecaniso lleva a cabo la reparación de la doble cadena conllevando en la mayoría de los casos la inserción o delección de pares de bases, lo que provoca la alteración del gen y de su producto. Es un mecanismo por tanto que no permite la introducción de un gen.(10) Ante esta disyuntiva, surge un tercer mecanismo: la integración independiente de homología (HITI). Mediante el cual, si hay un fragmento de DNA libre con extremos romos se integrará en la diana interrumpiendo el gen y permitiendo la expresión del nuevo inserto.(9,10) 7 1.3. Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) El CAR consiste en un receptor transmembrana donde sus subunidades tienen procedencias diferentes, de ahí su nombre. El objetivo de este trabajo consiste en explicar cómo se integra el gen que lo codifica en el genoma linfocitario, para que este lo exprese y pueda llevar a cabo su función antitumoral. 1.3.1. Estructura del CAR El CAR consta de a) un dominio extracelular, cuya función es la de unión al ligando y dotará de especificidad al linfocito T; b) un dominio transmembrana y espaciador, que modula la capacidad de unión del linfocito a las células tumorales; y c) un dominio intracelular o de señalización, que será el responsable de iniciar la cascada de activación del linfocito T. Los resultados que cabría esperar son: la eliminación de las células tumorales por las CAR-T, así como una persistencia de estas en el organismo, lo que conferiría una vigilancia inmune continuada.(11) Estos componentes que forman el CAR, no son producidos de forma artificial, sino que son secuencias polipeptídicas que se encuentran en la naturaleza. Así, por ejemplo, el dominio extracelular proviene de cadenas ligeras o pesadas de anticuerpos; el dominio transmembrana procede de CD8; y el dominio intracelular que es el que conforma este mismo dominio en el TCR.(12) En la figura 3 se puede observar la estructura de distintos tipos de receptores. Tanto el TCR nativo como el transgénico (es decir, de especificidad conocida y producido de forma artificial por ingeniería genética) requieren del procesamiento del antígeno y su posterior presentación a través del complejo mayor de histocompatibilidad, lo que generará señales co-estimuladoras que terminarán en la activación del linfocito. (12) Los CAR, en cambio, carecen de cadenas beta y alfa, que se sustituyen por un dominio extracelular constituido únicamente por fragmentos de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos, otorgándoles la capacidad de reconocer de manera directa el antígeno, sin necesidad de mediación del complejo mayor de histocompatibilidad para la activación del linfocito.(11,12) 8 1.4. Estado actual de las terapias con células CAR-T Aunque la inmunoterapia con células CAR-T supone algo novedoso y que sigue en vías de desarrollo y perfeccionamiento, ya se han aplicado en algunos pacientes con linfoma y Leucemia Linfoide Aguda con resultados prometedores. Este modelo de terapia parece ser muy adecuado y ofrecer muy buenos resultados en patologías malignas mediadas por linfocitos B (el CAR muestra especificidad por CD19, un antígeno CD que actúa de correceptor en las células B)(11). Figura 3 Comparación de los receptores TCR endógenos vs TCR modificados por ingeniería genética vs CAR (Fesnak A.D., et al. (2016)) 9 Figura 1 Representación gráfica de los resultados de varios ensayos clínicos sobre el tratamiento con células CAR- T en tumores hematológicos (A) y tumores sólidos (B). CR: respuesta completa; PR: respuesta parcial; SD: enfermedad estable; PD: enfermedad progresiva; NR: sin respuesta; NE: no evaluable.( Figura obtenida de Hartmann, J. et al. (2017).EMBO molecular medicine, e201607485)(12) La FDA ha aprobado dos medicamentos donde las CAR-T son el principio activo: KymriahTM y YescartaTM. Ambos salieron al mercado en el año 2017, habiendo ofrecido muy buenos resultados en los ensayos clínicos, principalmente en tumores hematológicos. Los inconvenientes principales serían el coste (entre 375.000-475.000 $ por tratamiento) y la posibilidad de aparición de ciertos efectos adversos de gravedad considerable, que se describen a continuación:(13) ● Tormenta de citocinas (Cytokine Release Syndrom (CRS)): aparición de fiebre, mialgias, hipotensión, hipoxia y posibilidad de fallo multiorgánico y muerte en las tres primeras semanas postinfusión. Se debe a la liberación descontrolada de citocinas, que a su vez provocan una activación exagerada del sistema inmunitario generando un cuadro de inflamación generalizada grave. El manejo de estos pacientes es muy delicado y el tratamiento debe ser agresivo, mediante inmunosupresores (corticoides o fármacos biológicos como Tocilizumab, que es un anticuerpo monoclonal humanizado que reconoce e inactiva la IL-6. 16 Figura 7: generación del plásmido que contiene el gRNA en 5´ y la secuencia autocatalítica T2A. Figura 8: comprobación mediante PCR de la correcta inserción de las secuencias T2A y del gRNA. Figura 9: integración del CAR (sin promotor) en el plásmido obtenido en el proceso anterior Figura 10: comprobación de la correcta inserción mediante PCR del CAR sobre el plásmido generado en el primer paso. 17 4.2. Comprobación de la edición por citometría de flujo Tras 48 horas de incubación en las condiciones adecuadas se procedió a la cuantificación del porcentaje de edición mediante citometría de flujo. Para ello se recogieron 50.000 células Jurkat y se marcaron con anticuerpos fluorescentes contra la proteína del TCR (PE (ThermoFisher)) y la del CAR (APC) (fluorocromos para cada anticuerpo). Los resultados obtenidos se analizaron con el software ―Kaluza‖, y se muestran en la figura 13. Figura 11: inserción de la secuencia PolyA y el gRNA en 3´, obteniéndose el plásmido definitivo. Figura 12: comprobación de la correcta inserción de las secuencias en el plásmido definitivo 18 Figura 13 Resultados obtenidos en la citometría de flujo. A) muestra control: células Jurkat sin modificar, la gran mayoría presentan el TCR y carecen de CAR; B) no me acuerdo de cuales eran estas (células Jurkat en las que se ha insertado el gen CAR pero no se ha realizado el knock-out sobre TCR; C) células Jurkat del experimento, en las que se ha buscado realizar el knock-out sobre el TRAC y que se insertase el gen del CAR. Según estos resultados se observa una eficacia del experiemento del 15.28 % del total, proporción que representan las células que no expresan el TCR pero sí el CAR (ver figura 13: gráfica C, cuadrante E4). Esto es, en el 15 % de las células se ha conseguido anular la expresión de TCR y, además, la expresión en superficie del CAR. 5. DISCUSIÓN El sistema de edición genética CRISPR/Cas9 ha supuesto un avance inconmensurable en el ámbito de la biomedicina, permitiendo silenciar genes e insertar otros de interés con una precisión nunca antes vista. Además la implementación del método con el denominado HITI ha conseguido aumentar su eficacia e incluso hace posible plantearse la idea de la modificación genética in vivo en un futuro(9). Aun a pesar de las carencias que todavía es posible encontrar en las técnicas de edición genética, es necesario tener en cuenta que se trata de un campo muy novedoso y que se encuentra en pleno desarrollo, avanzando a pasos agigantados y con unas perspectivas muy positivas en cuanto a las potenciales aplicaciones que pueden tener en el mundo de las enfermedades de origen genético, principalmente en el cáncer.(15) 19 6. CONCLUSIONES Aunque la aplicación de terapias con células CAR-T es actualmente todavía escasa, suponiendo fármacos de tercera o cuarta línea para procesos malignos refractarios al resto de tratamientos más ―convencionales‖, los ensayos clínicos existentes muestran una buena tasa de respuesta en determinados tipos de tumores, con unos efectos adversos potencialmente peligrosos pero poco frecuentes.(16) La terapia con células CAR-T se está desarrollando a pasos agigantados debido a los múltiples usos que se le puede dar en función del antígeno que sea capaz de reconocer el receptor quimérico generado. Otras líneas de investigación trabajan en minimizar los efectos secundarios, aumentar la viabilidad de las células una vez transfundidas o incluso generar una terapia con CAR-T alogénica, creando células de uso universal, es decir aplicables a cualquier paciente, lo que reduciría muy significativamente los costes de producción y, por tanto, del tratamiento. 7. BIBLIOGRAFÍA 1. Yang Y. 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