Papel del neuroprotector ApoD en el manejo microglial de agregados amiloides

Papel del neuroprotector ApoD en el manejo microglial de agregados amiloides Autora: Marta Poncela Herrero Coautor: Miguel Villa Valdés Tutores: Miriam Corraliza Gómez y Diego Sánchez Romero Trabajo Fin de Grado Medicina. Curso 2018-2019. Índice MARTA PONCELA HERRERO 2 ÍNDICE RESUMEN ....................................................................................................................... 3 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 4 2. MATERIALES Y MÉTODOS. ....................................................................................... 7 2.1. Revisión bibliográfica. ................................................................................................... 7 2.2. Cultivo celular y tratamientos. ...................................................................................... 7 2.3. Preparación de oligómeros de ß-amiloide. .................................................................... 8 2.4. Electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Coomassie. ................................... 8 2.5. Estudio de viabilidad celular. ........................................................................................ 9 2.6. Reacción en cadena de la Polimerasa cuantitativa a tiempo real (RT- qPCR). ................ 9 2.7. Inmunocitoquímica en células BV2. ............................................................................ 10 2.8. Inmunohistoquímica en tejido cerebral de ratón. ....................................................... 11 3. RESULTADOS ......................................................................................................... 12 3.1. Caracterización de los oligómeros de ß-amiloide. ....................................................... 12 3.2. Efecto de los oligómeros de ß-amiloide sobre las células BV2. .................................... 12 3.3. Análisis del papel de ApoD en la viabilidad de las células BV2 tratadas simultáneamente con ß-amiloide. ...................................................................................................................... 13 3.4. Estudio del efecto del ß-amiloide sobre la supervivencia de las células BV2 tratadas previamente con ApoD. ......................................................................................................... 14 3.5. Cuantificación de la expresión de IL1ß en microglía tratada con ß-amiloide y ApoD. ... 15 3.6. Inmunocitoquímica de células BV2 tratadas con ß-amiloide. ...................................... 16 3.7. Inmunohistoquímica para Iba1 en la microglía de ratón WT y ratón ApoD-KO. ........... 17 4. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 18 5. CONCLUSIÓN ......................................................................................................... 20 6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 21 7. PÓSTER ................................................................................................................. 23 8. ANEXO .................................................................................................................. 24 Resumen MARTA PONCELA HERRERO 3 RESUMEN La apolipoproteína D (ApoD) es una glicoproteína de la familia de las lipocalinas, cuya expresión se incrementa en las regiones del sistema nervioso central afectadas por la Enfermedad de Alzheimer. La función neuroprotectora de esta proteína frente al estrés oxidativo, que caracteriza al proceso de envejecimiento y a las patologías neurodegenerativas, ha sido ampliamente estudiada en neuronas y astrocitos. En este trabajo se analiza el papel de ApoD en las células BV2 (microglía de ratón) expuestas a los oligómeros de ß-amiloide, que son considerados los responsables del proceso neurodegenerativo que ocurre en la Enfermedad de Alzheimer. De acuerdo con los resultados obtenidos, ApoD parece ejercer una función protectora frente al daño generado por los oligómeros de Aß sobre las células microgliales, que podría estar relacionada con su actividad antiinflamatoria. Palabras clave Apolipoproteína D - ß-amiloide - Microglía - Células BV2 - Neurodegeneración - Enfermedad de Alzheimer Introducción MARTA PONCELA HERRERO 4 1. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Alzheimer es una patología neurodegenerativa de curso progresivo que constituye la primera causa de demencia en personas de edad avanzada. Se caracteriza por la pérdida gradual de la memoria episódica, acompañada de la afectación de otros dominios cognitivos (desorientación, deficiencia del lenguaje, agnosias, apraxias y disfunción ejecutiva). Un conjunto de síntomas que dificulta la realización de las actividades de la vida diaria y acaba generando una dependencia funcional progresiva del sujeto (1). A pesar de que la patogenia del Alzheimer sigue sin establecerse, se cree que todas las formas de la enfermedad comparten un mismo origen: la sobreproducción o ausencia de aclaramiento del péptido ß-amiloide (Aß). En condiciones normales, dicho péptido se obtiene del procesamiento de la proteína precursora de amiloide (APP) por las asecretasas. Sin embargo, de acuerdo con la hipótesis amiloidea, se cree que en la enfermedad de Alzheimer se produce un procesamiento anómalo de la APP por las ß y gsecretasas, que da lugar a péptidos de ß-amiloide1-40, 1-42. Estos péptidos, por un lado, atraviesan la membrana de las neuronas y forman oligómeros, mientras que, por otro, se agregan en fibrillas formando las placas de amiloide extracelulares características de la enfermedad (1,2). El depósito del Aß desencadena una respuesta inflamatoria con formación de radicales libres, estrés oxidativo y entrada masiva de calcio en la neurona, que conduce a la disfunción y muerte neuronal. Por tanto, el péptido Aß parece ser el responsable del proceso de neurodegeneración que tiene lugar en la enfermedad de Alzheimer (1,2). La apolipoproteína D (ApoD) humana es una glicoproteína de la familia de las lipocalinas que parece jugar un importante papel en el proceso neurodegenerativo. Su gen se localiza en la región p14.2 del cromosoma 3 y su estructura terciaria consiste en un barril ß constituido por 8 láminas ß-antiparalelas, que forman una cavidad o bolsillo que permite la unión de pequeños ligandos hidrofóbicos (3). ApoD se encuentra ampliamente distribuida en el organismo: glándulas adrenales, riñones, páncreas, bazo, pulmones, ovarios, testículos, cerebro, nervios periféricos y líquido cefalorraquídeo. En cambio, a diferencia de lo que ocurre en el resto de las Introducción MARTA PONCELA HERRERO 5 apolipoproteínas, su expresión en el hígado y el intestino es baja. El sistema nervioso destaca como uno de los principales tejidos de expresión de ApoD: en el sistema nervioso periférico se expresa en los fibroblastos del endoneuro y en las células de Schwann y en el sistema nervioso central en los astrocitos y oligodendrocitos (3). ApoD es una proteína multifunción: protege frente al estrés oxidativo reduciendo la perioxidación lipídica (4), participa en la diferenciación neuronal (5) e interviene en la regeneración de los nervios dañados (3). Todas estas funciones puede llevarlas a cabo gracias a su capacidad de unir diferentes ligandos hidrofóbicos (multi-ligando): ácido retinoico, retinol, esfingomielina, ácidos grasos, progesterona, anandamida, ácido araquidónico y ácido E3-metil-2-hexanoico (5). Diversos estudios (3,6) informan sobre un aumento de la expresión de ApoD en condiciones neuropatológicas, como en el proceso de envejecimiento, en las patologías neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Niemann-Pick) o en la lesión de los nervios periféricos. ApoD es el gen que más aumenta su expresión en el envejecimiento en varias especies (7), lo que parece representar un mecanismo protector frente al deterioro cerebral que tiene lugar durante dicho proceso (8). En la enfermedad de Alzheimer se ha detectado un incremento de los niveles de ApoD en el líquido cefalorraquídeo y en varias regiones cerebrales afectadas por la enfermedad: hipocampo (9), corteza prefrontal y corteza entorrinal (10). Este incremento de ApoD se produce en la línea celular HT22 de origen neuronal sometida al ß-amiloide (11), lo puede deberse a la función neuroprotectora que parece tener dicha proteína frente al estrés oxidativo. Además, se ha detectado ApoD en los depósitos de Aß de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (12). En un estudio realizado en ratones (13) se evidenció que ApoD ejerce una función reguladora de la patología amiloidea en la enfermedad de Alzheimer. En ratones con pérdida de función para ApoD (Knock-out) se detectó un aumento del número de placas de amiloide en la región hipocampal y cortical, mientras que en ratones con sobreexpresión de ApoD en neuronas se reducía dicho número, así como los niveles de ß-amiloide1-40,1-42 42. Introducción MARTA PONCELA HERRERO 6 Se desconoce si ApoD se expresa en la microglía y si puede ejercer algún papel en relación con ésta. Las células microgliales son consideradas los macrófagos del Sistema Nervioso Central, donde juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis en condiciones fisiológicas. La microglía modula la sinapsis neuronal y participa en la neurogénesis postnatal a nivel del hipocampo (esencial para el aprendizaje y la memoria) (14). A pesar de que la función de la microglía en la enfermedad de Alzheimer todavía no ha sido esclarecida, se ha relacionado con el depósito y aclaramiento del ß-amiloide. Se cree que los oligómeros de Aß desencadenan una respuesta inflamatoria con participación de la microglía activada, que libera una gran cantidad de mediadores inflamatorios que podrían contribuir al proceso neurodegenerativo que tiene lugar en la enfermedad (15,16). El papel del neuroprotector de ApoD en el estrés oxidativo ha sido ampliamente estudiado en neuronas y astrocitos. En cambio, los estudios realizados en microglía han sido escasos. Es por ello que en este trabajo queremos estudiar cómo se comporta la microglía ante el estrés oxidativo generado por el ß-amiloide, y cómo el tratamiento con ApoD puede modificar dicho comportamiento. El objetivo principal de este proyecto es determinar si ApoD ejerce un papel neuroprotector en las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer. Materiales y métodos MARTA PONCELA HERRERO 7 2. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1. Revisión bibliográfica. La búsqueda bibliográfica se fundamentó en los conceptos claves de este trabajo: apolipoproteína D (ApoD), ß-amiloide (Aß), patología neurodegenerativa y enfermedad de Alzheimer (Tabla 1). Dicha revisión fue llevada a cabo en la base de datos online PubMed. TÉRMINOS FILTROS ARTÍCULOS Apolipoprotein D Ninguno 609 10 últimos años 141 10 últimos años + review 3 “Apolipoprotein D” AND “neurodegenerative” 10 últimos años 18 “Apoliporotein D” AND “Alzheimer” 10 últimos años 11 “Apolipoprotein D” AND “amyloid” 10 últimos años 8 Tabla 1. Clasificación de las palabras claves buscadas, los filtros empleados y el nº de artículos obtenidos. 2.2. Cultivo celular y tratamientos. La línea celular BV2 (microglía de ratón; Blasi 1990 (17)) se cultiva en el medio RPMI1640 suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS), 1% de L-Glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Las células se mantienen incubadas a 37ºC y 5% de CO2. Los pases de cultivo se realizan cuando se alcanza la confluencia celular y, para ello, se emplea el GHCKS (NaCl (6,37 g/L), KCl (0.30 g/L), Na3Citrato2H2O (3 g/L), glucosa (2 g/L) y HEPES (4,77 g/L). pH = 7.5), que al causar una disminución del calcio permite que se levanten las células y puedan ser transferidas al nuevo medio. La siembra celular se realiza con la ayuda de la cámara de Neubauer, que nos permite contar el número de células presente en nuestra suspensión celular y calcular el volumen de ésta necesario para sembrar la densidad celular deseada en el experimento. Una vez estimado dicho volumen, podemos sembrar las células con su medio correspondiente en cada pocillo. Por último, cabe destacar que a lo largo de los experimentos las células BV2 han sido tratadas con ApoD humana (10, 50 y 100 nM; 3 horas y 24 horas) y oligómeros de ßamiloide (0.1, 0.5, 1, 2, 5 y 10 µM; 3 horas y 24 horas). Materiales y métodos MARTA PONCELA HERRERO 8 2.3. Preparación de oligómeros de ß-amiloide. En primer lugar, tras 30 minutos a temperatura ambiente disolvemos 1 mg de Aß1-42 en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP). A continuación, la solución obtenida se distribuye en tres eppendorfs no siliconados que se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas, permitiendo así la formación de monómeros. Posteriormente, se centrifugan los 3 viales a 800g durante 15 minutos y la película que forma el péptido se resuspende en DMSO, obteniéndose una concentración de 5 mM. Se sonican las muestras de Aß 5 mM durante 10 minutos y se distribuyen en 27 alicuotas que se conservan a -20ºC. Finalmente, 24 horas antes del empleo del péptido Aß, añadimos a cada alicuota DMEM 4,5g/L (sin L-glutamina ni rojo fenol) para favorecer la formación de oligómeros de Aß1-42 a una concentración de 80µM. Por último, sonicamos las muestras durante 10 minutos y las incubamos 24 horas a 4ºC (18). 2.4. Electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con Coomassie. La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de docecilsulfato sódico (SDSPAGE) nos permite separar las proteínas de acuerdo con su peso molecular. El SDS desnaturaliza las proteínas y les aporta una serie de cargas negativas proporcionales a su tamaño. De esta forma, se neutraliza la carga de la proteína y se forma un complejo con carga negativa que migra hacia el ánodo. Como todas las proteínas tienen la misma carga/unidad de masa su movilidad por el gel depende únicamente de su peso molecular. Este tipo de electroforesis nos permite estimar el peso molecular de las proteínas a estudio al compararlas con otras de peso molecular conocido. Una vez realizada la electroforesis, se puede llevar a cabo una tinción con Coomassie. El Coomassie Brillant Blue (CBB) R-250 es un colorante derivado del trifenilmetano que se emplea en la tinción de las proteínas. Dado que todo el gel queda impregnado del colorante, debemos desteñirlo con una solución de ácido acético para que solo queden marcadas las proteínas. En nuestro caso, la electroforesis se realizó en gel de poliacrilamida al 15% y a voltaje constante (80V). Materiales y métodos MARTA PONCELA HERRERO 9 2.5. Estudio de viabilidad celular. El Bromuro 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) nos permite estudiar la viabilidad celular mediante la cuantificación de la actividad de las deshidrogenasas mitocondriales. La reacción que se produce entre el MTT y dichas enzimas mitocondriales da lugar a la rotura del anillo de tetrazolio y la formación de cristales de formazán insolubles de color púrpura. Por tanto, existe una relación entre el color púrpura (obtenido por reducción del MTT) y la viabilidad celular (19). Para la realización del MTT sembramos nuestras células en 50 µl de medio RPMI1640 completo a una densidad de 47.000 células/cm2. Una vez realizada la bajada de suero (FBS 1%) y todos los tratamientos necesarios, se retira el medio y se añade el MTT (62,5 µg/ml). A continuación, se incuban las células durante 3 horas a 37ºC para que la reacción con las deshidrogenasas mitocondriales tenga lugar. Tras este periodo de tiempo, se añade en cada pocillo la solución de isopropanol con Triton X-100 (10%) para solubilizar los cristales de formazán que se hayan formado. Finalmente, se mide la solución obtenida en el espectofotómetro (SoftMaxPro) a una absorbancia λ=570 nm, a la cual se le resta la absorbancia del fondo (λ=690 nm). 2.6. Reacción en cadena de la Polimerasa cuantitativa a tiempo real (RT- qPCR). La PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa que nos permite cuantificar la cantidad de DNA amplificado a medida que la PCR va avanzando. Dicha cuantificación se realiza gracias al empleo de unos compuestos fluorescentes, que al unirse al DNA de doble cadena emiten una señal de fluorescencia proporcional a la cantidad de DNA amplificado. La extracción del RNA de las células BV2 se realiza con 0,5 ml de Qiazol, y su concentración y pureza se miden con el espectofotómetro Nanodrop. A continuación, 500 ng de RNA son transcritos a cDNA mediante una reacción de transcripción inversa (RT) en la que se emplean: RT buffer 5X, oligodT primers 50µM, random hexamers 100µM, mix de enzima retrotranscriptasa y dH2O. El cDNA que se obtiene constituye el sustrato de la PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR). Para ejecutar la RT-qPCR en el termociclador se utiliza el SYBR Green Mix takara (1x) y los primers reverse y forward (200 nM) para cada gen a estudio (IL1ß y L18) mostrados en el Anexo 1. Resultados MARTA PONCELA HERRERO 16 3.6. Inmunocitoquímica de células BV2 tratadas con ß-amiloide. Con el objetivo de determinar si las células BV2 fagocitan el ß-amiloide, se preparó una imnunocitoquímica en la que se compararon tres situaciones: células control, células en tratamiento con oligómeros de Aß y células expuestas a Aß y ApoD. Para ello, se empleó un marcaje con anticuerpos del ß-amiloide. Figura 7. Inmunocitoquímica de células BV2 tratadas con ß-amiloide. Se visualizaron las muestras en el microscopio de fluorescencia con el objetivo 20x y se obtuvieron fotos en DIC (imágenes superiores), en DAPI (marcaje nuclear) y en proteína verde fluorescente-GFP (imagen inferior). No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre las células tratadas solo con ß-amiloide y las tratadas con ß-amiloide y ApoD (P-valor =0,923; T-student). DMSO (+) ß-AMILOIDE (-) APOD (-) DMSO (-) ß-AMILOIDE (+) APOD (-) DMSO (-) ß-AMILOIDE (+) APOD (+) 20µm 20µm20µm Resultados MARTA PONCELA HERRERO 17 Por un lado, demostramos que las células no sometidas a ß-amiloide no muestran señal de fluorescencia (Figura 7) y que la microglía es capaz de fagocitar el Aß. Por otro lado, el análisis cuantitativo establece que no existen diferencias estadísticamente significativas en cuanto al marcaje del ß-amiloide entre las células tratadas solo con los oligómeros y las células tratadas con Aß y ApoD. 3.7. Inmunohistoquímica para Iba1 en la microglía de ratón WT y ratón ApoD-KO. Iba1 (ionizing calcium-binding adaptor molecule 1) es una proteína específica de macrófagos/microglía, cuya expresión aumenta cuando estas células se activan. Para comparar la activación de la microglía en presencia y ausencia de ApoD, hemos llevado a cabo una inmunohistoquímica con marcaje de Iba1 en cortes de cortex cerebral de ratones Wild Type (WT) y ApoD Knock-out envejecidos, dado que se considera que durante el envejecimiento se produce una activación de las células microgliales No se encontraron diferencias estadísticamente significativas respecto al número de células con marcaje de Iba1 entre los ratones WT y los ApoD-KO (Figura 8). Figura 8. Inmunohistoquímica para Iba1 en cortes cerebrales de ratón. Se observaron las muestras en el microscopio de fluorescencia con el objetivo 20x y se obtuvieron imágenes en DIC y en proteína verde fluorescente-GFP (imagen) de ratones WT (n=6) y ApoD-Ko (n=6). No se detectaron diferencias estadísticamente signiticativas entre ambos grupos de ratones (P-valor =0,511; T-student). WT 20μm ApoD-KO 20μm Cuantificación microglia WT ApoD-KO 0 5 10 15 20 25 Genotipo Células Iba1(+) Discusión MARTA PONCELA HERRERO 18 4. DISCUSIÓN Este trabajo tiene como objetivo esclarecer qué papel ejerce ApoD sobre la microglía expuesta a oligómeros de ß-amiloide. Para ello, a lo largo de estos meses nos hemos planteado una serie de preguntas a las que vamos a intentar dar respuesta a continuación. Con el objetivo de analizar el efecto del estrés oxidativo en la microglía, en nuestro laboratorio se llevaron a cabo varios experimentos en los que se exponía a las células BV2 a diferentes factores estresantes, como el paraquat (21) o el LPS (lipopolisacárido bacteriano). El efecto deletéreo de estas sustancias sobre la viabilidad de las células BV2 nos hizo preguntarnos: ¿Qué ocurre si exponemos a la microglía a oligómeros de ßamiloide? Estudios previos evidencian que los oligómeros de Aß inducen una respuesta inflamatoria que desencadena la activación de la microglía, alterando su función de fagocitosis y aclaramiento del Aß fibrilar (15,16). Además, dichos oligómeros parecen disminuir la viabilidad de la microglía, a diferencia de lo que ocurre con la forma fibrilar (15). Nuestros resultados (Figura 3) corroboran que la viabilidad de estas células disminuye en presencia de oligómeros de Aß con dependencia de la dosis (a mayor dosis de Aß menor viabilidad). Una vez demostrado el efecto perjudicial del ß-amiloide sobre la microglía nos planteamos: ¿Es capaz ApoD de proteger a la microglía del daño causado por los oligómeros de Aß? El papel neuroprotector de ApoD ha sido estudiado exhaustivamente a lo largo de los últimos años. Se ha demostrado que su presencia en neuronas ejerce una función protectora frente al estrés oxidativo (13,22). Sin embargo, los estudios sobre su función en la microglía han sido escasos. Por ello, una vez que en nuestro laboratorio se demostró que estas células no expresaban ApoD, pero que eran capaces de fagocitarla (21), decidimos estudiar el posible papel neuroprotector de dicha proteína en relación con la microglía. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, el tratamiento de la microglía con ApoD simultáneo al tratamiento con Aß no parece proteger a las células del daño causado por los oligómeros (Figura 4). Sin embargo, si la microglía expuesta a Aß es tratada previamente con ApoD se atenúa la disminución de la viabilidad celular causada por el ß-amiloide (Figura 5). Este resultado, parece indicar que ApoD es capaz de prevenir el daño que causa el estrés oxidativo en la microglía, pero que una vez que el daño está establecido su papel protector se desvanece. Además, en el laboratorio se detectó que el efecto neuroprotector del Discusión MARTA PONCELA HERRERO 19 tratamiento con ApoD durante 3 horas es mayor que el del tratamiento durante 24 horas. Estudios posteriores por inmunocitoquímica revelaron que esa diferencia se debía a que con el tiempo ApoD se degrada. Por tanto, al igual que ocurre en neuronas, ApoD parece proteger a la microglía del estrés oxidativo de los oligómeros de Aß cuando se administra de forma preventiva. Pero ¿cuál es el mecanismo por el que ApoD ejerce su función neuroprotectora? En este trabajo, se ha detectado que ApoD disminuye la expresión de una citocina proinflamatoria (IL1ß) y que dicha disminución se acentúa cuando las células son expuestas a ß-amiloide Figura 6. Estos hallazgos parecen indicar que ApoD tiene un efecto antiinflamatorio, que es mayor en presencia de un estrés oxidativo y que podría ser el mecanismo por el que ejerce su papel neuroprotector. Resultaría interesante ampliar este estudio y analizar la expresión microglial de citocinas antiinflamatorias (IL10, TGFß, etc) en presencia de ApoD. Conocido el posible efecto antiinflamatorio de ApoD nos preguntamos: ¿Puede esta proteína alterar la función fagocítica de la microglía? En un estudio realizado en nuestro laboratorio por inmunocitoquímica, no se detectaron diferencias en la fagocitosis del Aß por la microglía entre las células tratadas y las no tratadas con ApoD (Figura 7). Este hallazgo parece indicar que esta proteína no altera la función de fagocitosis de estas células. Sin embargo, este experimento se realizó con tratamiento de ApoD durante 24 horas y dado que se ha demostrado que esta proteína se degrada con el tiempo, sería adecuado repetirlo con un tratamiento a tiempos más cortos. Además, de acuerdo con la literatura científica (15) los oligómeros de Aß sí influyen en la función fagocítica de las células microgliales y, por tanto, han podido actuar como un factor confusor en este estudio. Por último, nos pareció interesante analizar qué papel juega ApoD en la activación de la microglía. Se cree que durante el envejecimiento se produce una inflamación crónica en el cerebro (inflammaging), en la que podría participar la microglía activada. Los resultados obtenidos demostraron que ApoD no influye en la activación microglial, al no detectarse diferencias entre los ratones Wild-Type y los ratones ApoD-KO envejecidos (Figura 8). Conclusión MARTA PONCELA HERRERO 20 5. CONCLUSIÓN ApoD ejerce un papel neuroprotector sobre la microglía expuesta a los oligómeros de ßamiloide, que son considerados los responsables del proceso de neurodegeneración que tiene lugar en la Enfermedad de Alzheimer. Este efecto neuroprotector podría estar relacionado con la función antiinflamatoria que juega ApoD y no tanto con la alteración de la fagocitosis o la activación microglial, sobre las que esta proteína parece tener poca influencia. Son necesarios más estudios para esclarecer la función de ApoD en relación con la microglía y el estrés oxidativo, y de esta forma, conocer la importancia que adquiere dicha proteína en la Enfermedad de Alzheimer. Bibliografía MARTA PONCELA HERRERO 21 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Domarus A von, Farreras Valentí P, Rozman C. Medicina interna. Barcelona: Doyma; 2012. 3111 p. 2. Lane CA, Hardy J, Schott JM. Alzheimer’s disease. European Journal of Neurology. enero de 2018;25(1):59-70. 3. Rassart E, Bedirian A, Do Carmo S, Guinard O, Sirois J, Terrisse L, et al. Apolipoprotein D. Biochim Biophys Acta. 18 de octubre de 2000;1482(1-2):185-98. 4. Bhatia S, Knoch B, Wong J, Kim WS, Else PL, Oakley AJ, et al. Selective reduction of hydroperoxyeicosatetraenoic acids to their hydroxy derivatives by apolipoprotein D: implications for lipid antioxidant activity and Alzheimer’s disease. Biochemical Journal. 15 de marzo de 2012;442(3):713-21. 5. 5Ruiz M, Sanchez D, Correnti C, Strong RK, Ganfornina MD. 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Journal of Visualized Experiments [Internet]. 14 de julio de 2010 [citado 29 de mayo de 2019];(41). Disponible en: http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1884 19. Pascua-Maestro R, Corraliza-Gomez M, Diez-Hermano S, Perez-Segurado C, Ganfornina MD, Sanchez D. The MTT-formazan assay: Complementary technical approaches and in vivo validation in Drosophila larvae. Acta Histochemica. abril de 2018;120(3):179-86. 20. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. diciembre de 2001;25(4):402-8. 21. Bendito-Guilarte B, Corraliza-Gomez M, Poncela M, Villa-Valdés M, Arribas-Rodríguez E, Ganfornina MD, et al. Role of apolipoprotein D in microglial response to oxidative stress and amyloid beta tiggeres damage. En: 18th National Meeting of the Spanish Society os Neuroscience. Santiago de Compostela; 2019. 22. Navarro A, del Valle E, Juárez A, Martinez E, Ordóñez C, Astudillo A, et al. Apolipoprotein D synthesis progressively increases in frontal cortex during human lifespan. AGE. marzo de 2010;32(1):85-96. Póster MARTA PONCELA HERRERO 23 7. PÓSTER PAPEL DEL NEUROPROTECTOR APOD EN EL MANEJO MICROGLIAL DE AGREGADOS AMILOIDES L AZ AB Autores:Marta Poncela Herrero, Miguel Villa Valdés Tutores:Miriam Corraliza Gómez, Diego Sánchez Romero INTRODUCCIÓN La apolipoproteína D (ApoD)es una glicoproteína perteneciente ala familia de las lipocalinas,cuya expresión aumenta en el líquido cefalorraquídeo yen las regiones del sistema nervioso central afectadas por la Enfermedad de Alzheimer.El efecto neuroprotector de esta proteína ha sido estudiado en neuronas yastrocitos,en los que ha demostrado disminuir el estrés oxidativo causado por los oligómeros de ß-amiloide (Aß). Se cree que las células microgliales participan en la fagocitosis yaclaramiento del péptido Aß,pero los estudios que relacionan estas células con ApoD son escasos. El desconocimiento del papel que juega ApoD sobre la microglía en presencia de Aß,nos ha llevado ala realización de este trabajo con el objetivo de descifrar qué función puede ejercer en la Enfermedad de Alzheimer. 1 CONCLUSIONES •Los oligómeros de Aß disminuyen la viabilidad de las células BV2. •ApoD puede proteger de forma preventiva a las células microgliales del efecto de Aß. •ApoD ejerce un papel antiinflamatorio frente al ß-amiloide. •Se necesitan más estudios para esclarecer el efecto de ApoD sobre la microglía y su importancia en la Enfermedad de Alzheimer. 4 FINANCIACIÓN MATERIALES Y MÉTODOS 2 CÉLULAS BV2 (Microglía de ratón) CULTIVO Y SIEMBRA CELULAR RPMI1640 5% FBS 1% L-glutamina 1% P/S Cámara de Neubauer OLIGOMERIZACIÓN HFIP Aß 1mg Monómeros DMSO Aß 5 mM DMEM 4,5 g/L Oligómeros Aß 80 µM 24 horas 4oC INMUNOHISTOQUÍMICA Ac 1º Ac 2º Rabbit !Iba1 0,5µg/mL Goat!Rabbit Alexa 488nm 1,5µg/mL ApoD-KO ApoD-WT RT-qPCR Qiazol 0,5 ml RNA cDNA Transcriptasa inversa RT-qPCR Espectrofotómetro Termo cicla dor 100 10 -0.25 10 -0.5 10 -0.75 10 -1 10-1.25 10-1.5 10-1.75 10-2 10-2.25 10-2.5 10-2.75 10-3 Cycl e 510 15 20 25 30 35 40 45 Norm. Fluoro. 0 10 -0.25 10 -0.5 10 -0.75 10 -1 10 -1.25 10 -1.5 10 -1.75 10 -2 10 -2.25 10 -2.5 10 -2.75 10 -3 10 Thres hold L18 IL1b 5 10 15 20 25 30 35 40 45 RT-qPCR Melting Aß Control ApoD Aß + ApoD AßSiembra ApoD 24 horas 24 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS Siembra Aß 48 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS DMSOSiembra ApoD 24 horas 24 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS Siembra DMSO 48 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS INMUNOCITOQUÍMICA Aß Control ApoD Aß + ApoD 24h Mouse !Aß 0,2µg/µL Goat!Mouse Alexa 488nm 1,5µg/mL Ac 1º Ac 2º AßSiembra ApoD 24 horas 24 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS Siembra Aß 48 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS DMSOSiembra ApoD 24 horas 24 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS Siembra DMSO 48 horas 24 horas 5% FBS 1% FBS Aß MTTSiembra ApoD 24 horas 24 horas 24 horas 3 horas 5% FBS 1% FBS Aß MTTSiembra ApoD 24 horas 24 horas 24 horas 3 horas 5% FBS 0,2% FBS Aß MTT Siembra ApoD 24 horas 24 horas 3 horas 5% FBS 1% FBS 1 2 3 MTT 62,5 µg/mL Isopropanol Triton X-100 (10%) ESTUDIO DE VIABILIDAD Simultáneo (1% FBS) Previo (1% FBS) Previo (0,2% FBS) deg. 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 dF/dT 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Deg. dF/dt.L18IL1ß 3RESULTADOS ESTUDIO DE VIABILIDAD EN CÉLULAS BV2 TRATADAS CON APOD Y Aß 0 20 40 60 80 100 120 00,1 110 Viabilidad [Aβ] (µM) Curva dosis Aß-viabilidad *** *** *** *** 0 20 40 60 80 100 120 140 160 00.1 0.5 1 Viabilidad [Aβ] (μM) Tratamiento previo con ApoD (0,2% FBS) ApoD 0nM ApoD 50nM ApoD 100nM * * * Disminución de la viabilidad de las células BV2 con Aß 0 20 40 60 80 100 120 00.1 0,5 1 Viabilidad [Aβ] (μM) Tratamiento previo con ApoD ApoD 0nM ApoD 50nM ApoD 100nM *** *** *** *** Sí hay efecto de ApoD si el tratamiento es previo El efecto de ApoD disminuye en bajo suero 0 20 40 60 80 100 120 140 160 00.1 0.5 1 Viabilidad [Aβ] (μM) Tratamiento previo con ApoD (1% FBS) ApoD 0nM ApoD 50nM ApoD 100nM ** * * 0 20 40 60 80 100 120 0 1 Viabilidad [Aß] (µM) Tratamiento simultáneo ApoD y Aß ApoD 0 ApoD 10 ApoD 50 ApoD 100 ** Mezcla de oligómeros y monómeros No hay efecto de ApoD si el tratamiento es simultáneo ApoD tiene mayor efecto a 1% FBS nM EXPRESIÓN DE mRNA DE IL1ß 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Fold Regulation * * ** DMSO Aß (1µM) ApoD (50 nM) ++ + ++ + - - - - - - *** CONTEO DE CÉLULAS MICROGLIALES EN CÓRTEX CEREBRAL DE RATÓN ApoD-WT 20μm ApoD-KO 20μm Cuantificación microglia WT ApoD-KO 0 5 10 15 20 25 Genotipo Células Iba1(+) ESTUDIO DE INTERNALIZACIÓN DE Aß EN CÉLULAS BV2 DMSO (+) ß-AMILOIDE (-) APOD (-) DMSO (-) ß-AMILOIDE (+) APOD (-) DMSO (-) ß-AMILOIDE (+) APOD (+) 20µm 20µ M 20µ M 20µm 20µm No se observan diferencias en la cantidad de Aß fagocitado en células tratadas con y sin ApoD No se observan diferencias en el número de células microgliales activadas en la corteza cerebral de ratones ApoD-KO ApoD es capaz de contrarrestar el efecto proinflamatorio de Aß SIMULTÁNEO vs. PREVIO 1% FBS vs. 0,2% FBS NomarskiAßDAPI Aβo (24h) Oligómeros Aß Monómeros Aß 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 0.5 0.75 11.5 22.5 Proteína T.I. (μg) KDa Anexo MARTA PONCELA HERRERO 24 8. ANEXO ANEXO 1. RT-qPCR: primers para IL1ß y L18. PRIMER SECUENCIA Mouse Rpl18-Forward 5’-TTCCGTCTTTCCGGACCT-3’ Mouse Rpl18-Reverse 5’-TCGGCTCATGAACAACCTCT-3’ Mouse IL1ß-Forward 5’-TGTAATGAAAGACGGCACACCCAC-3’ Mouse IL1ß-Reverse 5’-GGCTTGTGCTCTGCTTGTGAGG-3’ Anexo 1. Primers para IL1ß y L18. ANEXO 2: RT-qPCR: amplificación mediante qPCR a tiempo real. Anexo 2. Amplificación del gen de interés (IL1ß) y el gen housekeeping (L18) mediante qPCR a tiempo real. Threshold: línea horizontal roja. ANEXO 3. RT-qPCR: método 2-DDCt Tratamientos Media Cts IL1ß Media Cts L18 D Ct DD Ct 2- DD Ct ApoD 0; Aß 0 30.03 24.90 5.13 0 1 ApoD 50; Aß 0 29.76 24.21 5.54 0,41 0,75 ApoD 0; Aß 1 28.40 23.72 4.68 -0.45 1,36 ApoD 50; Aß 1 30.14 23.84 6.30 1.17 0,44 Anexo 3. Cuantificación relativa de la expresión génica de IL1ß respecto L18. Cycle 100 10 -0.25 10 -0.5 10 -0.75 10 -1 10 -1.25 10 -1.5 10 -1.75 10 -2 10 -2.25 10 -2.5 10 -2.75 10 -3 Cycle 510 15 20 25 30 35 40 45 Norm. Fluoro. 0 10 -0.25 10 -0.5 10 -0.75 10 -1 10 -1.25 10 -1.5 10 -1.75 10 -2 10 -2.25 10 -2.5 10 -2.75 10 -3 10 Thres hold L18 IL1b 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ct Fluorescencia