Hidrogeles de elastina obtenidos por química click para el crecimiento dirigido de células del sistema nervioso

HIDROGELES DE ELASTINA OBTENIDOS POR QUÍMICA CLIK PARA EL CRECIMIENTO DIRIGIDO DE CÉLULAS DEL SISTEMA NERVIOSO TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Autor: Pedro Luis Pérez Alonso Tutoras: Mercedes Santos García Matilde Alonso Rodrigo Valladolid, Julio 2021 Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 3.- ÍNDICE 1. RESUMEN Y ABSTRACT 7 1.1 RESUMEN 7 1.2 ABSTRACT 8 2. INTRODUCCIÓN 9 2.1 EL SISTEMA NERVIOSO 9 2.2 EL CICLO CELULAR Y LA REGENERACIÓN TISULAR 12 2.3 POLÍMEROS TIPO ELASTINA 14 2.4 PRODUCCIÓN DE POLÍMEROS 16 2.5 HIDROGELES 19 3. OBJETIVOS 21 4. MATERIALES Y MÉTODOS 21 4.1 MATERIALES 21 4.1.1 REACTIVOS QUÍMICOS Y DISOLVENTES 21 4.1.2 MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN 22 4.1.3 CULTIVOS CELULARES 22 4.2 EQUIPAMIENTO INSTRUMENTAL UTILIZADO 23 4.3 TÉCNICAS UTILIZADAS 23 4.3.1 ELECTROFORESIS SDS-PAGE 23 4.3.2 ESPECTROFOMETRÍA 24 4.3.3 GRABACIONES DE IMÁGENES 25 4.3.4 FLUORESCENCIA 25 4.3.5 MALDI-TOF 26 4.3.6 ESPECTROSCOPIA INFRARROJA 26 4.3.7 ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 27 4.4 METODOLOGÍA 28 4.4.1 PRODUCCIÓN DE LOS POLÍMEROS 28 4.4.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS POLÍMEROS PRODUCIDOS 29 4.4.3 MODIFICACIÓN QUÍMICA 31 4.4.4 FORMACIÓN DE LOS HIDROGELES 37 4.4.5 MANTENIMIENTO DE LOS CULTIVOS CELULARES 37 Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 4.- 4.4.6 ENSAYO DE ADHESIÓN TEMPRANA 37 4.4.7 TINCIÓN DE LAS MUESTRAS 38 4.4.8 ESTUDIO DE LA LONGITUD AXONAL 38 4.4.9 ANÁLISIS DE LOS DATOS 38 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39 5.1 PRODUCCION Y PURIFICACIÓN DEL BIOPOLÍMERO 39 5.1.1 SCREENING 39 5.1.2 PRODUCCIÓN EN BIOREACTOR 40 5.1.3 LISIS CELULAR 41 5.1.4 PURIFICACIÓN 41 5.1.5 USO DEL POLÍMERO 43 5.2 CARACTERIZACIÓN 43 5.3 FORMACIÓN DE HIDROGELES 46 5.3.1 PREPARACIÓN DE LOS HIDROGELES 46 5.3.2 DOMINIO DE LOS HIDROGELES 47 5.4 ENSAYOS IN VITRO 47 5.4.1 ENSAYO DE ADHESIÓN PRELIMINAR 47 5.4.2 ENSAYO DE CRECIMIENTO AXONAL 49 5.4.3 PRÓXIMOS TRABAJOS 53 5.5 OTROS ESTUDIOS SIMILARES 54 6. CONCLUSIONES 55 7. AGRADECIMIENTOS 57 8. BILIOGRAFÍA 59 Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 5.- ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 Reactivos utilizados y su casa comercial. _________________ 21 Tabla 2 Disoluciones usadas para la producción de los polímeros. ____ 22 Tabla 3 Materiales utilizados para la experimentación in vitro. ______ 22 Tabla 4 Relación de técnicas y equipos utilizados._________________ 23 Tabla 5 Secuencia de aminoácidos abreviaba con el peso molecular de los polímeros usados. La secuencia de adhesión celular está en rojo, los dominios sensibles a proteasas de degradación rápida y lenta se encuentran en verde y azul, respectivamente. Tomado de [59]. 28 Tabla 6 Secuencia de los péptidos IK y QK comprados a BACHEM para la modificación química. _________________________________ 32 Tabla 7 Lista de los polímeros que se mezclan para crear los diferentes hidrogeles. __________________________________________ 37 Tabla 8 Media y desviación estándar de las medidas tomadas a los axones de las células C6. ______________________________ 51 Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 6.- Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 7.- 1. RESUMEN Y ABSTRACT 1.1 RESUMEN El sistema nervioso es el encargado de generar y transmitir las señales necesarias para coordinar todo el cuerpo. Las células que lo componen, neuronas y células gliales, poseen muy limitada su capacidad de regeneración en humanos adultos, por lo que cualquier daño que reciban será casi irreversible. La elastina es una proteína que forma parte de la matriz extracelular. Mediante técnicas de ingeniería genética se pueden diseñar polímeros proteicos que imiten a esta elastina e incluir en sus secuencias dominios específicos de adhesión y/o degradación. En este Trabajo Fin de Master se han producido polímeros recombinantes tipo elastina, ELRs (Elastin-like recombinamers), usando una cepa no patógena de E.coli. Asimismo, se han realizado modificaciones químicas en estos biopolímeros ELRs para introducir en ellos los grupos funcionales necesarios para llevar a cabo química click entre sus cadenas, de manera que se puedan formar hidrogeles por entrecruzamiento de dichos polímeros. Los hidrogeles preparados se han utilizado como soporte en el cultivo de células gliales C6 con objeto de estudiar el comportamiento celular en diferentes entornos peptídicos. Se ha estudiado su comportamiento en cuanto a su adhesión y proliferación con el tiempo. La medición de la longitud del axón mediante técnicas inmunohistoquímicas, que permite la identificación de dicho axón, nos permite proponer a este tipo de hidrogeles de elastina como potencialmente adecuados para promover y dirigir el crecimiento de estas células. Por tanto, estos hidrogeles se muestran como potenciales análogos de tejido con importante papel en regeneración de tejido neuronal dañado, con la posibilidad en el futuro de trasladarlo a las neuronas. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 8.- 1.2 ABSTRACT The nervous system is in encharged of generating and transmitting the necessary signals to coordinate the entire body. It is composed by two different types of cells, neurons and glial cells. They have a very limited capacity for regeneration in adult humans. Any damage they receive will be almost irreversible. Elastin is a protein that is part of the extracellular matrix. Using genetic engineering techniques, we can design protein polymers that mimic this elastin and add specific sequences such as adhesion or degradation domains. In this work we produced Elastin-like recombinamers (ELRs), using a non-pathogenic strain of E.coli. We made chemical modifications to these polymers to be able to do click chemistry between their chains. Crosslinking allows the formation of hydrogels. The prepared hydrogels were used as surface for the culture of glial cells C6, so we can study their behavior in different peptide environment. We studied their adherence and proliferation. Using immunostaining we can identify and measure their axon length. The results allow us to propose these hydrogels as potentially suitable for enhancing and leading the growth of this cells. Therefore, these hydrogels present potential tissue analogs with important role in the regeneration of damaged neural tissue, with the possibility in the future of transferring it to neurons. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 9.- 2. INTRODUCCIÓN 2.1 EL SISTEMA NERVIOSO El sistema nervioso sigue siendo un gran misterio para la humanidad. Con el paso de los años, se han ido descubriendo cosas que no se sabían antes e incluso, algunos han hecho cambiar completamente la percepción que se tenía del sistema nervioso. El sistema nervioso se clasifica en dos grupos: el Sistema Nervioso Central (SNC) y el Sistema Nervioso Periférico (SNP). Tanto el central como el periférico comparten ciertas similitudes, pero también tienen grandes diferencias, lo que les permite desempeñar y desarrollar diferentes funciones. Las células más conocidas del sistema nervioso son las neuronas, pero la glía que es bastante menos conocida, tiene bastante importancia en el sistema [1]. Hasta el siglo XIX, lo poco que se sabía del sistema nervioso se debía a que no existían técnicas adecuadas para poder visualizar estas células. No fue hasta finales del siglo XIX, que gracias a la tinción de Golgi (inventada por Camilo Golgi), por primera vez se pudo teñir las neuronas con dicromato de osmio y nitrato de plata. El problema de esta tinción era que sólo se teñía menos del 1% de las neuronas, pero las que se teñían, se teñían completamente [2]. Gracias a esta tinción surgieron dos teorías, una mucho más conocida que la otra: la teoría reticular y la teoría neuronal. La primera fue establecida por Golgi en la que decía que las conexiones de las neuronas eran al azar, no existía polaridad celular y tampoco había un espacio sináptico. La otra teoría, la neuronal, refutaba la anterior y fue creada por Santiago Ramón y Cajal. Esta teoría afirmaba que existía una separación entre las células, que mediante conexiones especializadas (sinapsis) las células podían comunicarse entre ellas, y las partes que participaban en la conducción nerviosa eran el cuerpo celular (soma) y la prolongación (axón). También afirmaba que existía una polaridad, por ello la comunicación era unidireccional. Además, existía una alta organización entre las células, por lo que las conexiones no podían ser por azar. Camilo Golgi y Santiago Ramón y Cajal recibieron el Nobel de medicina en 1906, por las aportaciones de la tinción de Golgi y los dibujos y teoría neuronal de Ramón y Cajal [3]. Basándose en los estudios de Ramón y Cajal, Heinrich Wilhelm Gottfried Waldeyer nombró a esa célula nerviosa, que era la unidad estructural básica del sistema nervioso (ver figura 1), como neurona, que es como la conocemos hoy en día [4]. La escuela de Ramón y Cajal ha sido muy importante en el campo de la neurología, ya que produjo muchos descubrimientos, como el protagonizado por su discípulo Pío del Río Hortega que identificó la microglía y los oligoendrocitos [5]. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 16.- Figura 6 Estructura del polímero en relación a la temperatura de transición. 2.4 PRODUCCIÓN DE POLÍMEROS La información de la secuencia polipeptídica se almacena en el material genético. Cuando una célula quiere expresar una proteína tendrá que acceder al gen que codifique la proteína en cuestión. El DNA es la forma más estable de almacenar la información. El DNA está compuesto por cadenas de nucleótidos que la maquinaria molecular usará para crear una cadena complementaria de RNA. Por lo general el RNA es más inestable, por lo que se usa como intermediario. La maquinaria celular leerá la secuencia de RNA y sintetizará esa proteína. El código genético determina las combinaciones de 3 nucleótidos que codifica para cada aminoácido. Por tanto, podemos crear una cadena de DNA para producir una proteína. Usando ingeniería genética podemos obtener una secuencia de nucleótidos que nosotros diseñemos a la carta, con el objeto de obtener las características que requiramos para nuestro polímero. Esto es posible gracias a la tecnología del DNA recombinante. Una vez estudiadas las características, dominios y secuencias de corte que queremos que tenga nuestro polímero, se diseña un inserto de DNA, que es lo que permitirá que se pueda sintetizar el polímero deseado [33]. Para bioproducir los polímeros a gran escala, en este Trabajo fin de Grado usaremos una cepa de Escherichia coli no patógena [34]. E.coli es un bacilo gran negativo, forma parte de la familia de las enterobacterias que se encuentra presente en el tracto gastrointestinal de los humanos. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 17.- Figura 7 Estructura simplificada de un plásmido que se usa para la expresión de un gen que codifica para una proteína de interés. Existen numerosas cepas, algunas patógenas y otras no. Es una bacteria bastante fácil de crecer, ya que no requiere condiciones muy estrictas y fácilmente asequibles [35, 36]. Las bacterias poseen plásmidos, que son unas estructuras de DNA extracromosómico que pueden replicarse independientemente. Por tanto, si añadimos nuestro inserto que codifica para nuestro polímero, conseguiremos que las bacterias lo produzcan. Es necesario realizar un estudio exhaustivo del vector que usaremos (el plásmido que utilizaremos) como del inserto. Los vectores de expresión (ver figura 7) llevan diferentes secuencias que permiten modificar la transcripción de los genes que se encuentran a continuación, ya sea aumentando o inhibiendo la expresión de manera constitutiva o dependientes de un sustrato. Es un proceso complejo en el que cualquier error puede ocasionar que no se produzca la expresión de nuestro inserto o se requieran ciertas condiciones para que nuestro gen se exprese. Hay que comprobar qué enzimas de restricción (reconocen secuencias específicas y producen un corte en la cadena) se van a usar para añadir nuestro inserto, así como verificar que esté en el marco de lectura correcto para producir nuestra proteína. Una vez realizada la transformación bacteriana y una vez comprobado que está nuestro inserto, se ponen a crecer las bacterias para que se dividan y poder congelar varios stocks de nuestras bacterias transformadas [34]. Esto se debe a que las polimerasas (enzimas que transcriben o replican ácidos nucleicos) no son perfectas, y pueden cometer algunos errores, algunas tienen capacidad correctora de errores y otras no [37]. Estos errores son mutaciones que, al acumularse durante sucesivas replicaciones, pueden desembocar en la no producción de nuestra proteína o que expresen otra diferente. Por tanto, tener un stock que no ha sufrido apenas replicaciones es útil para evitar tener que realizar todo el proceso una vez que no podamos usar un stock [38]. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 18.- Para realizar la producción hay que obtener un inóculo de una colonia aislada (indicativo que todas las bacterias han surgido de una misma). Esta colonia la elegiremos mediante un screening previo, que es una pequeña producción que haremos en las mismas condiciones que luego usaremos en el biorreactor. Mediante electroforesis en gel de acrilamida podremos observar las bandas correspondientes a las proteínas. En el gel, las proteínas se desplazan según su tamaño: cuanto más pequeño es éste avanzarán más rápido. Una vez elegida la colonia que más exprese nuestra proteína, el siguiente paso consiste en hacer el inóculo. Las fases del crecimiento bacteriano incluyen inicialmente una fase lag o latencia en la que se produce la adaptación al medio, por lo que apenas crecen; posteriormente se produce una fase exponencial donde las bacterias se reproducen. La siguiente fase es la estacionaria donde no hay grandes cambios en la población, seguida de la fase de muerte donde empiezan a acabarse los nutrientes y las células mueren. Como queremos producir y evitar gastar tiempo y dinero, tenemos que conseguir una proporción del volumen total del reactor que se encuentre en fase exponencial. Como se trabaja con microorganismos, la esterilidad es muy importante ya que cualquier contaminación puede hacer que nuestra bacteria no crezca, por eso se esteriliza el medio del biorreactor en un autoclave antes de añadir nuestro inóculo. El fermentador permite controlar las condiciones necesarias para una producción óptima como la temperatura, CO2, pH, presión, así como mantener estas condiciones a lo largo del proceso. Mediante la medida de la absorbancia de las muestras de producción podremos observar en qué fase se encuentra nuestro cultivo. Una mayor absorbancia implica un mayor crecimiento celular, que no siempre es indicativo de una buena producción, ya que las condiciones óptimas de crecimiento no tienen por qué ser iguales a las óptimas de producción. Después de extraer el contenido del biorreactor, se realizarán lavados con tampón de lavado de bacterias y centrifugaciones sucesivas para eliminar todo el medio que pudiera haber. Mediante un disruptor que, por presión diferencial, romperá las membranas bacterianas, se liberará nuestro polímero. Se añaden inhibidores de proteasas porque éstas pueden degradar nuestro polímero. La última fase de la producción es la purificación, en la que se aprovecha la agregación reversible de los polímeros con la temperatura. Dependiendo del polímero, se realizarán centrifugaciones sucesivas en frío o en caliente para ir eliminando proteínas que no son de interés. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 19.- También se puede modular el pH para favorecer que precipite la proteína. Una vez eliminada todas las impurezas se realizarán diálisis para eliminar todas las sales que puedan quedar. Por último, se filtrará y liofilizará, obteniéndose nuestro polímero puro y estéril. Es un proceso largo y costoso. Por cada 15 litros de medio que se usa se obtienen unos 2-3 gramos de polímero, dependiendo del que se produzca [39, 40]. 2.5 HIDROGELES Los hidrogeles son redes que se forman a partir de polímeros naturales o sintéticos. Normalmente se mezclan dos polímeros diferentes para obtener un hidrogel con unas características determinadas que no pueden obtenerse a partir de un solo polímero [41]. Por lo general son materiales con una gran capacidad de absorción de agua y pueden llegar a absorber incluso de 500 a 600 veces su peso en agua, dependiendo del hidrogel. Debido a esta capacidad de absorción de agua, presentan unas propiedades bastante similares a los tejidos biológicos. Los hidrogeles son materiales que tienen un futuro bastante prometedor en la regeneración tisular y de aplicación, por ejemplo, en heridas o en quemaduras [42]. Al permitir que el área con el hidrogel esté hidratada, el exceso de agua exudado se absorbe y, al cubrir el tejido sin adherirlo, permite una mayor y mejor regeneración. Además, muchos hidrogeles son transparentes lo que permite que se pueda ir monitorizando el proceso de regeneración, otros son traslúcidos [43, 44]. Para mejorar la bioactividad de los hidrogeles, los polímeros se pueden diseñar de manera que sean capaces de liberar fármacos de manera controlada, o que favorezcan la adhesión de células específicas o de proteínas. También pueden diseñarse para que sean sensibles a proteasas específicas de manera que pueda degradarse a lo largo del tiempo, permitiendo que las células se adhieran y vayan creciendo sobre el hidrogel, mientras éste se va degradando, permitiendo una regeneración del tejido similar a la inicial y sin necesidad de eliminarlo puesto que se va absorbiendo progresivamente [45]. Para obtener nuestros hidrogeles realizaremos una modificación química a los dos polímeros que usaremos para crear cada tipo de hidrogel. Esta modificación es necesaria para poder utilizar la química click como reacción de entrecruzamiento de las cadenas de los polímeros tipo elastina. El término “química click” fue introducido en 2001 por K. Barry Sharpless para referirse a aquellas reacciones con un rendimiento muy alto, que requieran condiciones suaves, que puedan realizarse en disolventes no tóxicos o que se puedan eliminar fácilmente sin la producción de subproductos. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 20.- La reacción elegida en este trabajo es la cicloadición 1,3-dipolar de Hüisgen entre azidas y alquinos, que cumple con las características de la química click. En general, esta reacción requiere Cu+ como catalizador, pero la elección de alquinos activados tales como los derivados de ciclooctino evita la utilización de catalizador en la reacción. Las modificaciones químicas se realizarán sobre los grupos aminos de las cadenas laterales del polímero, perteneciente a los aminoácidos lisina. Realizaremos reacciones de modificación mediante reacción de sustitución nucleófila con los correspondientes derivados de N-hidroxisuccinimidil ester que permiten introducir los grupos azido y ciclooctino necesarios para obtener nuestro hidrogel [46]. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 21.- REACTIVO CASA COMERCIAL (3-amino propil)-trimetoxisilano Sigma-Aldrich Acetona Sigma-Aldrich Ácido clorhídrico Sigma-Aldrich Acrilamida Iberlabo Ampicilina Panreac Carbonato de (1R,8S,9S) biciclo [6.1.0]non- 4in-9-ilmetil succinimidilo Galchimia Carbonato de 2-Azidoethil (2,5- dioxopirrolidin-1-il) Synaffix Diciclohexilcarbodiimida(DCC) Sigma-Aldrich Diclorometano(DCM) Sigma-Aldrich Dietil éter Scharlau Dimetilformamida (DMF) Acros Organics Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma-Aldrich REACTIVO CASA COMERCIAL Dodecil sulfato sódico(SDS) Apollo Scientic Etanol Panreac Glicerol Fisher-Scientic Glucosa Acros Hidróxido sódico Panreac Metanol Scharlau Persulfato de diamino Sigma Aldrich Sulfato de cobre Fluka TEMED Sigma-Aldrich THF Scharlau Trietilamina Sigma Aldrich Tris(hidroximetil)aminometano(TRIS) Sigma Aldrich Tabla 1 Reactivos utilizados y su casa comercial. 3. OBJETIVOS El tejido nervioso tiene una regeneración limitada respecto a otros tipos de tejidos. El uso de hidrogeles con secuencias específicas que favorezcan el crecimiento de las células neuronales y de una manera dirigida podrían ayudar en la regeneración de este tejido, para poder usarlo en clínica y regenerar los tejidos nerviosos dañados y así tratar las enfermedades causadas por el daño a estas células. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 MATERIALES 4.1.1 REACTIVOS QUÍMICOS Y DISOLVENTES Los reactivos y disolventes listados en la siguiente tabla (ver tabla 1) son los que se han utilizado, indicando también su casa comercial. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 22.- TAMPÓN BUFFER SAL OTROS Tampón de lavado Tris pH 8 20 mM NaCl 0.2 M - Tampón de sonicación Tris pH 8 20 mM - EDTA 1 mM MATERIAL CASA COMERCIAL Millicel EZ slice 8-well Thermo Scientic Células gliales de rata C6 ATCC Medio F-12k ATCC Suero Fetal Bovino Lonza Suero de caballo Gibco Paraformaldehído Sigma Aldrich Tritón X-100 Sigma Aldrich BSA Sigma Aldrich PBS Anticuerpo primario Antibeta III tubulin Abcam Anticuerpo secundario Goat Anti-rabbit IgG H&L (AlexaFluor® 488) Abcam Rhodamine-Phalloidin Invitrogen Medio de montaje con DAPI Abcam Tabla 2 Disoluciones usadas para la producción de los polímeros. Tabla 3 Materiales utilizados para la experimentación in vitro. 4.1.2 MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN Para la producción se utilizaron los siguientes medios para el crecimiento de las bacterias y para el lavado de células las disoluciones (ver tabla 2). ✓ LB: medio de cultivo rico nutricionalmente para el crecimiento de bacterias. Se prepara a una concentración de 25g/L en agua destilada. Requiere esterilización en autoclave. Casa comercial Conda ✓ LB agar: para la preparación de placas necesarias para sembrar. Preparado con 25 g/L de medio LB y 15 g/L de agar. ✓ TB: medio usado para mejorar la expresión de los plásmidos de E.coli. Preparado a una concentración de 55.8 g/L y se le añade 8 mL/L de glicerol. 4.1.3 CULTIVOS CELULARES Se utilizaron los siguientes materiales para la realización de los estudios in vitro (ver tabla 3). Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 23.- TÉCNICA INSTRUMENTAL EQUIPO CASA COMERCIAL Calorimetría diferencial de barrido (DSC) DCS 8822e Mettler Toledo Centrifugación Centrífuga ST 16R Thermo-Scientific Centrifugación Centrífuga Avanti Beckman Espectrometría de masas MALDI TOF Espectrómetro de masas Bruker Autoflex (Laboratorio de Técnicas Instrumentales UVA) Bruker Espectrometría infrarroja (FTIR) Infrarrojo Tensor27 Bruker Espectrofotometría Nanodrop 2000c Thermo-Scientific Resonancia Magnética Nuclear (RMN) RMN 400 (L.T.I. UVA) Agilent Technologies Fluorescencia Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E epifluorescnce Nikon Corporation Fluorescencia Microscopio confocal Leica TCS SP8 LIGHTNING Leica Microsystems Grabación de imágenes Cytosmart Lux2 Cytosmart Tabla 4 Relación de técnicas y equipos utilizados. 4.2 EQUIPAMIENTO INSTRUMENTAL UTILIZADO En la siguiente tabla (ver tabla 4) se recogen las diversas técnicas utilizadas con su correspondiente equipo utilizado. 4.3 TÉCNICAS UTILIZADAS 4.3.1 ELECTROFORESIS SDS-PAGE La electroforesis en gel de acrilamida en condiciones desnaturalizantes permite la separación proteica de acuerdo a su movilidad electroforética. Al desnaturalizar la proteína, esta pierde su conformación Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 24.- tridimensional y mediante la aplicación de una corriente eléctrica se hace migrar por el gel de acrilamida. La migración depende de la longitud de la cadena polipeptídica y su peso, cuanto más pequeña sea la proteína más migrará en el gel. Dependiendo del porcentaje de acrilamida/bis-acrilamida que se use, el tamaño del poro que se forme será mayor o menor. A mayor porcentaje de bis-acrilamida, el tamaño del poro es mucho mayor, por lo que las proteínas con mayor peso molecular se separarán mucho más. Si se usa un menor porcentaje de acrilamida, se producirá una mayor separación en las bandas correspondientes a las proteínas de pesos moleculares más bajos. Para proteínas entre el rango de 90-100 kDa se hace un gel al 10% y entre 60-100 al 12% de acrilamida. Se añade a las muestras tampón de carga que contiene azul de bromofenol y glicerol. Esto permite que las muestras no floten en el pocillo y difundan al resto y podemos controlar cuánto tiempo queda de la electroforesis, ya que el frente de banda del azul de bromofenol es el primero en llegar al final del gel. Para determinar el peso molecular de cada banda, en uno de los pocillos se añade un marcador, que contiene diversas bandas de peso conocido, permitiendo así relacionar el peso de nuestra proteína con la banda del marcador según lo que ha corrido en el gel [49]. Realizando una tinción negativa con CuCl2 podremos ver las bandas de nuestra proteína, ya que se forman complejos entre el CuCl2 y el SDS. Observando las bandas no sólo podemos inferir el peso aproximado de la proteína, sino que también podemos observar cuánta proteína hay según el grosor de la banda. 4.3.2 ESPECTROFOMETRÍA La espectrofotometría es una técnica que permite medir cuánta luz absorbe una muestra y, usando la ley de Lambert-Beer, podemos conocer la concentración del analito en la muestra, ya que dicha absorbancia es directamente proporcional a su concentración. La finalidad de esta técnica en este trabajo no es conocer la concentración de un determinado analito. Midiendo la absorbancia a 600 nm, que es el estándar para medir absorbancia en las diluciones microbiológicas, podremos llevar el control de la fase en que se encuentra nuestro cultivo bacteriano. Si el valor de la absorbancia disminuye significa que las bacterias se están muriendo, si sigue aumentando significa que siguen creciendo [50]. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 25.- Utilizando esta técnica a modo de control, podemos decidir cuándo acabar la fermentación en el biorreactor. El espectrofotómetro es un instrumento que proyecta un haz de luz monocromática. Parte de la intensidad del haz de luz es absorbida por la muestra y el espectrofotómetro es capaz de medir esa luz absorbida. 4.3.3 GRABACIONES DE IMÁGENES El CytoSmart Lux2 es un microscopio invertido que permite ir tomando fotos de un cultivo celular en intervalos de tiempo programados. Este aparato lleva incorporado una luz en la parte superior para iluminar la muestra debido a que se encontrará en el interior del incubador a oscuras. Al colocar la muestra sobre el Cytosmart, se asegura que la muestra no se mueva y siempre se grabe la misma zona. Mediante la toma de fotos durante el tiempo de estudio permite ver cómo interaccionan las células con el soporte y entre ellas, así como ver cómo proliferan a lo largo del experimento. Con estas fotos se monta un video timelapse, que muestra a cámara rápida cómo ha sido la evolución [51]. 4.3.4 FLUORESCENCIA La fluorescencia es la capacidad que tienen algunas sustancias de absorber energía de una longitud de onda determinada y emitir a otra longitud de onda mayor. La medida de la fluorescencia de fluorocromos presentes en anticuerpos, la inmunofluorescencia, permite detectar la presencia de los antígenos en las células y tejidos, su localización y cuantificar según la intensidad del fluorocromo. Los anticuerpos son cadenas peptídicas que son capaces de formar una unión muy fuerte específicamente con el antígeno que detecta. Por tanto, si se realizan tinciones con anticuerpos marcados con fluorocromos podremos localizar las estructuras que reconocen esos anticuerpos. Mediante microscopios invertidos de epifluorescencia o un microscopio confocal podemos tomar imágenes de las muestras celulares teñidas previamente con moléculas fluorescentes [52]. Estos instrumentos permiten excitar las muestras a la longitud de onda que requiera el fluoróforo, y a través de un conjunto de filtros que posee, elegir las longitudes de onda a las que quiere detectar la emisión. Mediante los softwares que incluyen, se puede elegir las condiciones a las que se quiere realizar la foto, e incluso programar secuencias en el caso que se quiera observar varios anticuerpos fluorescentes. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 32.- PÉPTIDO SECUENCIA IK H-Cys[(3-succinimido-propionyl)-B-Ala-DBCO]-Gln-Ala-Ala-Ser- Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH trifluoroacetate salt QK H-Cys[(3-succinimido-propionyl)-B-Ala-DBCO]-Lys-Leu-Thr-Trp- Gln-Glu-Leu-Tyr-Gln-Leu-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ile-OH trifluoroacetate salt Figura 13 Esquema general de la reacción para modificar un ELR con ciclooctino. Tabla 6 Secuencia de los péptidos IK y QK comprados a BACHEM para la modificación química. redisolviéndolo en agua MQ fría (4ºC) y, posteriormente, dializándolo con agua destilada (2 x 25 L) y MQ (1 x 25L). Se midió y ajustó el pH a 7. Se filtró y liofilizó para obtener un recombinámero blanco modificado con ciclooctino. El esquema de la reacción se muestra en la figura 13. 4.4.3.3 MODIFICACIÓN QUÍMICA DE RGD-AZIDA CON LOS PÉPTIDOS QK E IK Al polímero RGD con azida se le realizaron 2 modificaciones diferentes para añadir dos péptidos diferentes QK e IK (BACHEM), cuya secuencia se muestra en la Tabla 6, para obtener así RGD-QK-Azida y RGDIK-Azida. Los péptidos IK y QK poseen un dibenzociclooctino (DBCO) en el amino terminal que se unirá por reacción click al grupo azido del RGD-ELR modificado dando lugar a dos polímeros diferentemente modificados: RGDIK-Azida y RGD-QK-Azida (ver figura 14). La estequiometría que usamos es Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 33.- Figura 14 Esquema de la reacción para añadir los péptidos QK (arriba) e IK (abajo) al RGD-N3 obtenido anteriormente. 0.5:1 (péptido:ELR). Para elegir esta ratio nos basamos en el artículo escrito por Flora et al. [60] 4.4.3.4 OBTENCIÓN RGD-QK-AZIDA Una disolución de H- Cys [(3- succinimidopropionyl)- β- Ala- DBCO]- Lys-Leu-Thr-Trp-Gln-Glu-Leu-Tyr-Gln-Leu-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ile-OH trifluoroacetate salt (0.01336 mmol, 1,2 eq) en DMF (0.5 mL) se añade a otra disolución de RGD-N3 en 15 DMF (0.01114 mmol, 15 mL). La mezcla se agitó durante 8 horas. Después se añadió dietiléter a la mezcla para producir un precipitado blanco. Se centrifugó (12500G, 10 min), retiró el sobrenadante y el sólido se lavó con acetona (3 x 35 mL) centrifugando (12500G, 10 min). Se secó en atmósfera reducida, redisolviendo en agua MQ fría (4ºC), dializado con agua destilada (2 x 25 L) y MQ (1 x 25L). Se midió el pH y se ajustó a 7, se filtró y liofilizó para obtener en recombinámero blanco ELR-RGD-N3-QK 4.4.3.5 OBTENCIÓN RGD-IK-AZIDA Una disolución de H-Cys[(3-succinimido-propionyl)-β-Ala-DBCO]-Gln- Ala-Ala-Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH trifluoroacetate salt (0.02451 mmol, 2,2 eq) en DMF (0.5 mL) se añadió a otra disolución de RGD-N3 en DMF (0.01114 mmol, 20 mL). La mezcla resultante se agitó durante 8 horas. Se añadió dietil éter a la mezcla para obtener un precipitado blanco. Se centrifugó (12500G, 10 min), se retiró el sobrenadante y el sólido se lavó con acetona (3 x 35 mL) centrifugando (12500G, 10 min). Se secó con presión reducida, redisolviendo en agua MQ fría (4ºC), dializando en agua destilada (2 x 25 L) y MQ (1 x 25L). Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 34.- Se midió y ajustó el pH a 7. Se filtró y liofilizó para obtener el recombinámero blanco RGD-N3-IK 4.4.3.6 CARACTERIZACIÓN DE LOS POLÍMEROS MODIFICADOS La caracterización de los polímeros modificados se realiza mediante espectroscopía infrarroja FTIR-ATR (figura 15), 1H-NMR (figura 16), DSC (figura 17) y MALDI-TOF (figura 18). Figura 15 Espectro FTIR-ATR de RGD-N3-QK (arriba) y RGD-N3-IK (abajo). Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 35.- Figura 16 Espectro de 1H-NMR de RGD-N3-QK (arriba) y RGD-N3-IK (abajo). Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 36.- 64263 32242 0 100 200 300 400 Intens. [a.u.] 30000 40000 50000 60000 70000 80000 m/z Figura 18 MALDI-TOF del polímero RGD-N3-QK (arriba) y RGD-N3-IK (abajo). Figura 17 DSC del polímero RGD-N3-QK Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 37.- 4.4.4 FORMACIÓN DE LOS HIDROGELES La formación de los hidrogeles se realiza disolviendo por separado cada polímero en PBS estéril (x1, pH 7.2), a una concentración de 50 mg/mL cada uno, e incubándolos a 4ºC toda la noche. Posteriormente, se mezclan los polímeros a una ratio de 1:1 en volumen; la mezcla se incubó durante 2 minutos a 4ºC y se añadió 20 µL a los pocillos de un portaobjetos (Millicel EZ slice 8-well, Thermo Scientic), dando lugar a los siguientes geles VV, UR, GR, GQ, GI (ver tabla 7). Los geles se dejaron incubando toda la noche a 4ºC. 4.4.5 MANTENIMIENTO DE LOS CULTIVOS CELULARES Las células utilizadas son células gliales de rata (C6; ATCC® CCL- 107™), cultivadas en medio F-12K (ATCC, Catalog No. 30-2004) suplementado con 2.5% de suero fetal bovino (FBS, Lonza) y 15 % de suero de caballo (ref 16050-130, Gibco). Las células se incubaron a 37°C con un 5% de CO2 en una atmósfera húmeda. Se cambió el medio 3 veces a la semana y se hicieron pases de células de 2 a 3 para los experimentos siguientes, siguiendo las recomendaciones de la ATCC. En todos los experimentos realizados se usaron 5x104 células por muestra. 4.4.6 ENSAYO DE ADHESIÓN TEMPRANA Añadimos a los hidrogeles un pequeño volumen de medio y los metimos en el incubador a 37°C para que se atemperara. Primero realizamos una prueba con un gel GI para decidir el tiempo de experimentación, HIDROGEL POLÍMERO 1 POLÍMERO 2 VV VKV - ciclo VKV - N3 UR DRIR - ciclo RGD - N3 GR GTAR - ciclo RGD - N3 GQ GTAR - ciclo RGD - QK - N3 GI GTAR - ciclo RGD - IK - N3 Tabla 7 Lista de los polímeros que se mezclan para crear los diferentes hidrogeles. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 38.- realizando un time-lapse con el CytoSMART Lux2 que permite decidir que el tiempo de experimentación sería 24, 48 y 72 horas en función de la morfología. Por tanto, añadimos en cada pocillo 5x104 células y dejamos incubar 24, 48 y 72 horas. 4.4.7 TINCIÓN DE LAS MUESTRAS Una vez pasado el tiempo de incubación (24, 48 o 72 horas según el grupo al que perteneciese la muestra), se fijó con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente (r.t.) durante toda la noche. Para realizar las tinciones, realizamos lavados con PBS 1X y permeabilizamos con 0,1% Triton™ X-100 (Sigma Aldrich). Incubamos 1 hora con BSA y volvemos a lavar con PBS y tritón. Añadimos el anticuerpo primario Anti-beta III tubulin (ab18207, Abcam) e incubamos toda la noche a 4ºC. Lavamos con PBS y tritón, incubamos con el anticuerpo secundario Goat Anti-RAbbit IgG H&L AlexaFluor®488(ab150077, Abcam) 2 horas a temperatura ambiente. Volvemos a lavar con PBS y tritón e incubamos 30 minutos con Rhodamine-Phalloidin (R415, Invitrogen) y lavamos con PBS solo. Usamos un medio de montaje que contiene DAPI (ab104139, Abcam). 4.4.8 ESTUDIO DE LA LONGITUD AXONAL El experimento se realizó por triplicado, tomando fotos de la fluorescencia de áreas aleatorias con un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence acoplado a una cámara DS-2MBWc. Se utiliza el sofware NIS-Elements AR (Nikon Corporation). Asimismo, se tomaron fotos con el microscopio confocal Leica TCS SP8 LIGHTNING (Leica Microsystems). En la inmunofluorescencia podremos observar en azul los núcleos (DAPI), en verde los microtúbulos (Alexa Fluor® 488) y en rojo los filamentos de actina (TRITC). La longitud de la neurita se midió usando ImageJ. 4.4.9 ANÁLISIS DE LOS DATOS El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA, utilizando como prueba post-hoc la comparación de Tukey. Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado (n ≥ 3). Los resultados se muestran como media ± desviación estándar, aceptando las diferencias significativas si el pvalue < 0.05 (*). Para el análisis estadístico se usó Minitab v19.1 y para la representación gráfica Origin Pro. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 39.- 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 PRODUCCION Y PURIFICACIÓN DEL BIOPOLÍMERO 5.1.1 SCREENING La producción de los polímeros GTAR-ELR, DRIR-ELR, RGD-ELR y VKV-ELR, que ya habían sido descritos anteriormente [48, 58] y cuyas secuencias se encuentran en la Tabla 5, fue realizada mediante fermentación en un biorreactor de 15 L. Se realizó la producción de todos los polímeros usados, pero sólo se explicará la producción de RGD-ELR. Aunque se realizaron todas las bioproducciones, se va a explicar detenidamente la correspondiente a la obtención de RGD-ELR, biopolímero que modificaremos químicamente en etapas posteriores hasta la obtención de sus correspondientes hidrogeles. En primer lugar, realizamos un screeening en el que seleccionaremos varias colonias aisladas y las pondremos a incubar en las mismas condiciones. Mediante una electroforesis en gel de acrilamida podremos ver las diferentes bandas que corresponden a diversas proteínas. Cuanto más abajo se encuentren en el gel, más pequeñas son. Utilizando en uno de los carriles un marcador, que contiene diferentes bandas cuyo peso molecular se conoce, podremos relacionar el tamaño de las proteínas que contienen nuestras muestras. Lo importante aquí es que elegimos aquella colonia que produzca una banda de nuestro polímero mucho más grande (indica mayor cantidad) teniendo en cuenta que no sobreexprese ninguna otra proteína que pueda dificultarnos la posterior purificación. El gel obtenido en el screening se observa en la Figura 19. La colonia que elegimos fue la 8, ya que presenta una banda más intensa y gruesa de nuestro polímero en relación al resto de colonias. Además, no expresa otras proteínas como ocurre con las colonias 1 y 3, lo que puede complicar la purificación. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 40.- Figura 19 Screening de RGD-ELR. Las calles numeradas corresponden a colonias aisladas diferentes. M es el marcador de peso molecular. 5.1.2 PRODUCCIÓN EN BIORREACTOR Una vez elegida la colonia (número 8), se usará como inóculo para realizar la fermentación en el biorreactor, bajo condiciones óptimas para el crecimiento bacteriano (pH 7, 37ºC). A las 20 horas de incubación tomamos muestras cada 30 minutos para determinar su absorbancia. Para ello se alicuotó el mismo volumen de muestra (tomado del fermentador) en eppendorfs, que se centrifugaron. En uno de los eppendorf nos quedamos con el sobrenadante (blanco), y con el otro resuspendemos el precipitado en agua, para así poder medir la absorbancia de manera más precisa, ya que el propio medio también puede absorber y hay que restar su absorbancia. Una vez que decidimos sacar la producción del reactor, repartimos el volumen en botes de centrifuga. Mediante centrifugaciones, las bacterias precipitarán y el medio será el sobrenadante, que eliminaremos. Para eliminar posibles impurezas que pudiera haber, se usará un tampón de lavado en el que diluiremos el pellet obtenido. Se volverá a centrifugar y retirar el sobrenadante otras dos veces. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 41.- 5.1.3 LISIS CELULAR La producción del polímero de interés es intracelular, por lo que hay que romper las membranas para así liberar todas las proteínas intracelulares. Para ello en el último lavado se utiliza un tampón de sonicación, al que añadimos inhibidores de proteasas para evitar la degradación de nuestro polímero. Mediante un disruptor podremos romper las membranas por presión diferencial. 5.1.4 PURIFICACIÓN El protocolo de purificación polimérica depende de las características del polímero a purificar. Todas las purificaciones comparten una serie de pasos, que son los ciclos de centrifugaciones por encima y por debajo de la temperatura de transición (ITC). Por encima de esa temperatura Tt, el polímero precipitará, y por debajo el polímero será soluble. El uso de diferentes sales permite disminuir la temperatura de transición de los polímeros, de manera que se favorece su precipitación a temperaturas más bajas. En aquellos polímeros que poseen aminoácidos portadores de grupos ácidos o básicos, la modificación del pH de manera adecuada permite que el polímero precipite a temperaturas más bajas para la forma más apolar que hace que la polaridad media del polímero disminuya. A través del protocolo creado para cada polímero se podrán ir eliminando las proteínas que no son la de interés. Para ir controlando este proceso se realizará una electroforesis SDS-PAGE (ver figura 20). El polímero RGD pesa unos 60kDa, y corresponde a la banda más ancha que se ve. Las calles 1 y 2 corresponden al precipitado y sobrenadante respectivamente obtenidos tras la lisis celular que se centrifugó en frío. Con ese sobrenadante se realizó una centrifugación a 40 ºC, con lo que se obtuvo un sobrenadante (calle 3) y un precipitado (calle 4) donde se encuentra nuestro polímero. Con el precipitado se centrifugó en frío y obtuvimos su precipitado (calle 5) y su sobrenadante (calle 6). En esta última calle se observa que hay alguna banda adicional a la de interés, por lo que se repitió el ciclo de centrifugación en caliente y en frío varias veces para eliminar las proteínas adicionales. Las calles 7 y 8 son el precipitado y sobrenadante del segundo ciclo de centrifugaciones. Lo que pudimos observar en la purificación del polímero RGD era que en todos los pasos siempre se perdía polímero en la fracción que no debería haber, por ello tuvimos que repetir los pasos para recuperar lo máximo que pudiéramos. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 48.- Figura 25 Fotos tomadas con el CytoSmart Lux2 a tiempos 0h, 24 h, 48 h y 72 h. A las 48 horas de incubación se ha producido la adhesión total de las células, como muestra su morfología alargada, y comienza su proliferación ya que se triplica la población. Así mismo, a este tiempo, se observa que las células empiezan a interaccionar entre ellas porque se observa que se van estirando hacia otras células cercanas y van adquiriendo una morfología fusiforme, característica de las células C6. A las 72 horas de incubación las células continúan con el mismo comportamiento, pero debido a la proliferación, se encuentran recubriendo casi toda la superficie del hidrogel (ver Figura 25). Se ha comparado el comportamiento que mostraron las células gliales con las que mostraron células endoteliales en un estudio similar [59]. Se observa que las células epiteliales a las 6 horas ya se habían adherido mientras que nuestras células gliales necesitaban 48 horas. Una célula que no está adherida presenta una morfología redonda. Cuando se adhiere a una superficie, la morfología empieza a cambiar hasta adoptar su forma característica, en el caso de las células gliales adoptaban forma de huso. Las células gliales presentaban una adhesión mucho menor al principio, un simple pipeteo para cambiar el medio hacía que perdiéramos bastantes células adheridas a la superficie. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 49.- Los resultados obtenidos en este ensayo nos permitieron determinar los tiempos de incubación de los experimentos posteriores, que llevaríamos a cabo a 24, 48 y 72 horas, debido a los cambios sustanciales observados previamente. La reducida adhesión temprana puede deberse al tipo celular (células gliales C6), ya que en su cultivo y expansión en flask de cultivo celular presentaron el mismo comportamiento llegando a tardar 24 h en adherirse y empezar a proliferar. 5.4.2 ENSAYO DE CRECIMIENTO AXONAL Una vez comprobado el tiempo necesario para la adhesión de las células gliales a la superficie del hidrogel, adaptamos los tiempos de los experimentos para que las células pudiesen estar adheridas a la superficie del hidrogel, condición exigida para poder medir la longitud axonal. El ensayo se realiza con los 5 hidrogeles diferentes preparados por metodología click VV, UR, GR, GQ, GI, y se analizarán a 3 tiempos de incubación: 24, 48 y 72 horas. 5.4.2.1 TINCIÓN INMUNOFLUORESCENTE Como queremos medir la longitud axónica necesitamos localizar con precisión varias estructuras celulares para poder realizar la medición. Tenemos que identificar el núcleo, que sería el lugar desde el que parte el axón, y la terminación del axón. La distancia entre estos dos puntos es la longitud del axón. Para determinar por dónde existe axón recurrimos a 2 componentes del citoesqueleto que se encuentran en el axón: los microtúbulos y los filamentos de actina. Realizando una tinción con anticuerpos específicos para cada molécula, que están ligados a fluoróforos, a través de un microscopio de epifluorescencia o confocal podemos localizar cada estructura. Para teñir los microtúbulos, elegimos usar un anticuerpo específico para la β-3 tubulina, que es específica de las células neuronales y es un indicador positivo de la normal actividad neuronal, presentando roles específicos en neurogénesis, guía y mantenimiento del axón, que emite en la región del verde. Para los filamentos de actina, elegimos un anticuerpo selectivo de la f-actina que emite en la región del rojo. Para teñir los núcleos, usamos un medio de montaje que contenía DAPI, que emite en la región del azul. Mediante la toma de imágenes a través de estos microscopios, usando programas informáticos se puede medir la longitud axónica (ver Figura 26). Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 50.- Figura 26 Fotos representativas de las células en cada tipo de hidrogel (VV, UR, GR, GQ, GI) a los diferentes tiempos (1,2 y 3 días). En azul están los núcleos, en verde la β-III tubulina, en rojo los filamentos de actina. En naranja donde localizan el verde y el rojo. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 51.- Tabla 8 Media y desviación estándar de las medidas tomadas a los axones de las células C6. Los resultados que obtuvimos se encuentran registrados en la Tabla 8 (ver figura 27). Los axones el primer día son muy cortos porque las células no se adhieren bien el primer día, no superando los 20 µm. En el segundo día en el gel VV los axones son similares, pero en el resto de hidrogeles se observa un crecimiento significativo superando los 35 µm en todos los geles. El gel GI, que tiene las secuencias de adhesión neuronal tiene una longitud de axón superior a los 50 µm, diferenciándose de los otros geles. En el tercer día, la longitud de los axones aumenta en todos los geles, encontrándose 4 diferentes grupos. En el hidrogel VV ha sido donde menos crecimiento hubo a lo largo del experimento, y donde menor longitud tienen los axones. El UR presenta también un crecimiento a lo largo de los dos días, pero no llega a superar a los del grupo formado por GR y GQ. El grupo GI es el que presenta tanto mayor longitud como mayor crecimiento a lo largo del experimento. Esto se debe a que las secuencias de adhesión neuronal TIEMPO (DÍAS) GEL MEDIA DESV. ESTANDAR 1 VV 15,131 13,486 1 UR 15,76 15,09 1 GR 22,17 20,27 1 GQ 11,44 11,43 1 GI 14,19 13,78 2 VV 14,84 5,86 2 UR 37,88 4,79 2 GR 38,84 11,39 2 GQ 38,2 12,49 2 GI 53,02 12,5 3 VV 26,94 10,16 3 UR 48,81 10,82 3 GR 72,38 11,61 3 GQ 69,62 10,54 3 GI 102,12 20,68 Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 52.- favorecen que los axones puedan extenderse por la superficie mucho más fácil. Que era lo que esperábamos. La longitud de los axones medidos en otro estudio con las células C6 se corresponden a los obtenidos en este experimento [61]. Cuanto mayor sea la longitud del axón, más estiradas están las células, indicando que hay una mayor actividad neuronal, proliferación celular y existe un funcionamiento celular normal. Dando lugar a una población densa y alineada de células con morfología más organizada en vez de la aparición de células multipolares que poseen un solo axón y muchas dendritas. En un futuro experimento se repetirá la tinción de β-III tubulina para estudiar y cuantificar la expresión de la β-III tubulina que indica funciones específicas en la neurogénesis, la guía de los axones y el mantenimiento. Los buenos resultados obtenidos permiten organizar un nuevo experimento en el que se sujetan las células a unos beads y se introducen en Figura 27 Longitud de los axones por tipo de hidrogel según el tiempo. En el eje de las X se encuentra el tiempo en días, y en el eje de la Y la longitud del axón en micrómetros. Para simplificar no se muestra que no hay diferencias significativas entre los geles. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 53.- los hidrogeles. Las células irían degradando el gel e irían estirando sus axones dirigiéndolos hacia otras células cercanas. Lo que prevemos es que los hidrogeles con secuencias de adhesión neuronales favorezcan el crecimiento de los axones, por tanto, la distancia entre los axones será mucho menor comparados con la del resto de hidrogeles. 5.4.2.2 PROBLEMAS EN LA EJECUCIÓN Durante la toma de fotos con los microscopios hubo varios contratiempos. El primero de ellos es que la topografía del hidrogel no era uniforme, por lo que cada vez que movías el campo de visión del microscopio tenías que volver a enfocarlo, esto se debe a que el gel no forma una capa totalmente lisa en la superficie y a que le microscopio confocal va provisto de un pinole que permite diferenciar “z” muy pequeños evitando la señal de “z” por encima y por debajo. El siguiente problema y el más importante de todos es que los propios geles son autofluorescentes, que en algunos casos enmascaraban las tinciones ya que el gen emite luz a las frecuencias de observación de los fluorocromos usados, principalmente el azul y el verde, haciendo que el color rojo, que se encuentra a longitudes de onda más largas, fuera era el que mejor se veía. Por estos motivos usamos los filamentos de actina (rojo) para medir la longitud axónica ya que el verde era más difícil de diferenciar. 5.4.3 PRÓXIMOS TRABAJOS Con los datos obtenidos con estos experimentos, podemos ver que los diferentes geles permiten que las células gliales crezcan diferentes. Por tanto, se podrían diseñar estructuras con estos hidrogeles que permita el crecimiento direccionado de las células. Así se favorecería la regeneración en caso de daño y muerte celular. Lo ideal sería que esto se pudiera trasladar a las neuronas, que son otro tipo de células neuronales, que tienen un crecimiento y una regeneración mucho menor. Si se consiguiera, se podrían utilizar para tratar enfermedades causadas por el daño o destrucción neuronal. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 54.- 5.5 OTROS ESTUDIOS SIMILARES Los polímeros producidos en biorreactores, a los que se les hace una modificación química para la formación de hidrogeles, mediante la misma reacción que la utilizada en este trabajo presentan una gran amplitud de usos. Uno de ellos es la regeneración de tejido cardiaco tras un infarto de miocardio. Cuando ocurre un infarto, las células del tejido cardiaco afectado por la falta de oxígeno se mueren. El cuerpo intenta regenerar las células perdidas, pero se forma un tejido cicatricial fibrótico. Este tejido no tiene las funciones que poseen las células cardiacas y no se puede recuperar, por lo tanto, la zona regenerada habrá perdido su función original, y la persona afectada podrá volver a sufrir otro infarto. Este estudio usó polímeros producidos en el mismo laboratorio y de la misma manera que los usados en este trabajo para la formación de unos hidrogeles que se inyectan en el área afectada. Este gel evita que crezca el tejido fibroso y favorece la angiogénesis (formación de vasos sanguíneos) y el acercamiento de células sanas que irán creciendo sobre el gel. El gel tiene secuencias de degradación, por lo que mientras las células van creciendo, se va degradando el gel, reparando el tejido sin la aparición del tejido fibroso. Por el momento, el estudio se ha realizado en ovejas, pero parece bastante prometedor para su aplicación en clínica, que es lo que buscamos con este trabajo, pero para las células neuronales [62]. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 55.- 6. CONCLUSIONES ✓ Se han producido los polímeros tipo elastina VKV, DRIR, GTAR y RGD que han sido modificados para la creación de hidrogeles vía química click a través de los grupos azida y ciclo. ✓ A pesar de la adhesión tardía, las células gliales se adhieren al hidrogel y empiezan a proliferar una vez adheridas, permitiendo el recubrimiento de la superficie en poco tiempo. ✓ Los diferentes dominios bioactivos que poseen los hidrogeles permiten que el crecimiento de los axones sea diferente, observándose un mayor crecimiento en el hidrogel que posee secuencias de adhesión específicas de células neuronales (GI). También se observa un buen comportamiento en aquellos hidrogeles que poseen dominios de adhesión celulares generales. ✓ Los resultados demuestran que los hidrogeles de elastina con el péptido derivado de laminina IK impulsan el crecimiento de células neuronales y la extensión de neuritas, pudiéndose usar dichos scaffolds en medicina regenerativa para el tratamiento de diferentes enfermedades del sistema nervioso. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 56.- Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 57.- 7. AGRADECIMIENTOS En este apartado quisiera agradecer la colaboración, dedicación, y ayuda que he recibido de tantas personas dentro y fuera del laboratorio. En primer lugar, a Rocío y Leticia, por enseñarme todo lo que saben de la producción de polímeros, sin ellas este trabajo no se habría podido realizar. Quería agradecer a mis compañeras del Máster Ariadna y Lucía por toda la ayuda que me han ofrecido en el laboratorio. A Diana por confiar en mí y permitirme ayudarla con sus experimentos. También a mis amigas Mónica, Clara, Elena, Anaïs por hacer más ameno este año tan complicado. Quiero agradecer especialmente a Fernando que sin su ayuda todo este trabajo no hubiera sido posible. Por su puesto, a mi tutora Merche, por su tutela, ayuda y orientación en la elaboración de este TFM y por encontrar un sitio en su ajetreada agenda para dar un último repaso antes de la entrega. A todos aquellos, que durante este proceso me han animado a seguir y conseguir el objetivo y que no están reseñados, por expreso deseo de ellos. Mi agradecimiento. Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 64.- 55. Anguebes, F., Pat, L., Ali, B., Guerrero, A., Córdova, A. V., Abatal, M., & Garduza, J. P. (2016). Application of multivariable analysis and FTIRATR spectroscopy to the prediction of properties in campeche honey. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2016. https://doi.org/10.1155/2016/5427526 56. Keeler, J. (2011). Understanding NMR spectroscopy. John Wiley & Sons. 57. Background and Theory Page of Nuclear Magnetic Resonance Facility. Mark Wainwright Analytical Centre. University of Southern Wales Sydney., 2011. 58. Girotti, A., Reguera, J., Rodríguez-Cabello, J. C., Arias, F. J., Alonso, M., & Testera, A. M. (2004). Design and bioproduction of a recombinant multi(bio)functional elastin-like protein polymer containing cell adhesion sequences for tissue engineering purposes. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 15(4), 479–484. https://doi.org/10.1023/B:JMSM.0000021124.58688.7a 59. González-Pérez, F., Ibáñez-Fonseca, A., Alonso, M., & Rodríguez- Cabello, J. C. (2021). Combining tunable proteolytic sequences and a VEGF-mimetic peptide for the spatiotemporal control of angiogenesis within Elastin-Like Recombinamer scaffolds. Acta Biomaterialia. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2021.06.005 60. Flora, T., de Torre, I. G., Alonso, M., & Rodríguez-Cabello, J. C. (2019). Tethering QK peptide to enhance angiogenesis in elastin-like recombinamer (ELR) hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 30(2). https://doi.org/10.1007/s10856-019-6232-z 61. Jain, R., & Roy, S. (2020). Controlling Neuronal Cell Growth through Composite Laminin Supramolecular Hydrogels. ACS Biomaterials Science and Engineering, 6(5), 2832–2846. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.9b01998 62. Contessotto, P., Orbanić, D., da Costa, M., Jin, C., Owens, P., Chantepie, S., Chinello, C., Newell, J., Magni, F., Papy-Garcia, D., Karlsson, N. G., Kilcoyne, M., Dockery, P., Rodríguez-Cabello, J. C., & Pandit, A. (2021). Elastin-like recombinamers-based hydrogel modulates post-ischemic remodeling in a non-transmural myocardial infarction in sheep. Science Translational Medicine, 13(581). https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaz5380 Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 65.- Máster TÉCNICAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD QUÍMICOS Página 66.-