Estudio de la expresión de la Apolipoproteína D en nervio periférico humano

Universidad de Valladolid | Mayo de 2023 TRABAJO DE FIN DE GRADO | GRADO EN MEDICINA ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE LA APOLIPOPROTEÍNA D EN NERVIO PERIFÉRICO HUMANO AUTOR Reyes González Delgado TUTORIZADO POR Diego Sánchez Romero Paloma Jiménez Arribas Universidad de Valladolid | Mayo de 2023 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 2 1.1. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................................... 2 1.1.1. Apolipoproteína D: generalidades ....................................................................................... 2 1.1.2. Estructura del SNP ............................................................................................................. 2 1.1.3. Distribución esperada de ApoD en el SNP ......................................................................... 4 1.1.4. Perspectivas y enfoque en la investigación sobre ApoD .................................................... 5 1.2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 7 3. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 7 3.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................. 7 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................................... 7 4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................ 7 4.1 Estrategia de búsqueda bibliográfica:.......................................................................................... 7 4.2 Selección de sujetos.................................................................................................................... 8 4.3 Metodología: Obtención de muestras .......................................................................................... 9 4.4 Metodología: Procesamiento de las muestras ............................................................................. 9 4.4.1 Fijación e inclusión en parafina........................................................................................... 9 4.4.2 Tallado ................................................................................................................................ 9 4.4.3 Desparafinación e hidratación del tejido ............................................................................. 9 4.4.4 Desenmascaramiento de los antígenos ............................................................................ 10 4.4.5 Tinción inmunohistoquímica ............................................................................................. 10 4.4.6 Tinción histológica ............................................................................................................ 11 4.4.7 Procesamiento de imágenes ............................................................................................ 11 5. RESULTADOS ................................................................................................................................... 11 5.1 Estudio histológico de nervios periféricos murinos y humanos ................................................. 11 5.2 Inmunofluorescencia: nervio ciático de ratón ............................................................................ 13 5.3 Expresión de ApoD en nervio sural humano ............................................................................. 14 5.4 Control de especificidad de anticuerpos secundarios ............................................................... 17 6. DISCUSIÓN ....................................................................................................................................... 18 7. CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 20 8. REFERENCIAS .................................................................................................................................. 21 Resumen: La Apolipoproteína D (ApoD) es una lipocalina perteneciente a una familia de proteínas ligadoras de pequeñas moléculas hidrofóbicas. Interviene en la regeneración Walleriana, tanto en la activación de la fagocitosis de residuos de mielina como en la posterior degradación de esta. Su expresión en el SNP ha sido estudiada en modelo animal, pero no se conocen estudios precedentes sobre su expresión en humano. Los resultados observados en este trabajo concuerdan con lo esperado según la bibliografía acerca de su expresión en SNP de modelo animal, aunque existen diferencias (la distribución de ApoD tanto en las envueltas de tejido conjuntivo como en el compartimento intracelular, y la cantidad de células de Schwann) que requieren de un mayor y más profundo estudio. Este trabajo es un primer estudio cualitativo de la expresión de ApoD en nervio periférico humano control que puede preceder a posteriores estudios sobre enfermedad neurodegenerativa humana. Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 2 1. INTRODUCCIÓN 1.1. MARCO TEÓRICO 1.1.1. Apolipoproteína D: generalidades La Apolipoproteína D (ApoD) es una proteína extracelular glicosilada perteneciente a la familia de las lipocalinas. Esta familia proteica se caracteriza por su labor transportadora y ligadora de pequeñas moléculas hidrofóbicas, incluidas algunas moléculas lipídicas de importante función biológica. La especificidad en la unión a distintos ligandos y el mecanismo molecular de las Lipocalinas condicionarán su tejido de expresión. La apolipoproteína D humana se aisló por primera vez a partir de plasma unida a proteínas de alta densidad (HDL). Ella y sus homólogos de insectos, Lazarillo (Laz) y Neural Lazarillo (NLaz), comparten diversas funciones ancestrales aunque con diferencias significativas por ejemplo en la unión a esteroles (ApoD humana no se une fuertemente a colesterol, a diferencia de NLaz y Laz que sí ligan ergosterol)[1]. Es su papel en la homeostasis lipídica el que capacita a ApoD para su fundamental acción: el mantenimiento de membranas biológicas. El papel de ApoD está siendo ampliamente estudiado en diversos tejidos ya que se ha demostrado que es moduladora del estado reducción-oxidación de estructuras lipídicas interviniendo en procesos muy diversos[2]. La pérdida de función de ApoD en ratón aumenta los niveles de peroxidación de lípidos cerebrales y la sensibilidad al estrés oxidativo, con la consiguiente afectación en su locomoción y aprendizaje. La sobreexpresión de ApoD humana en el cerebro del ratón produce efectos opuestos[3]. El gen ApoD se expresa en muchos tejidos, con altos niveles de expresión en bazo, testículos y cerebro[4]. También se acumula en los puntos de regeneración de los nervios periféricos y en parénquima cerebral y líquido cefalorraquídeo de pacientes con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, esquizofrenia o esclerosis múltiple. La expresión de ApoD aumenta durante el envejecimiento cerebral de mamíferos, atribuyéndosele un papel neuroprotector en el envejecimiento y en situaciones de estrés metabólico. 1.1.2. Estructura del SNP Las células nerviosas periféricas tienen sus núcleos en ganglios y médula espinal. Sus axones se extienden agrupados y rodeados por células de Schwann y cubiertas conjuntivas, formando así el nervio periférico. La vaina de mielina, de constitución espiral, destaca por su intensa electrodensidad. Por dentro de la vaina está el axón y Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 3 por fuera se colocan el núcleo y el resto del citoplasma de la célula de Schwann. Forman al estrecharse los nodos de Ranvier que pueden ser visibles a gran aumento. Las células de Schwann están rodeadas por un tejido conjuntivo conocido como endoneuro, que une las fibras nerviosas de los fascículos. Dentro del fascículo y en asociación con el tejido conjuntivo hay fibroblastos, macrófagos y mastocitos ocasionales[5]. Figura 1. Histología del nervio periférico humano. A. Corte longitudinal teñido con Hematoxilina/Eosina (H-E), donde se observa una característica imagen ondulante debido a la capacidad contráctil de las células perineurales. Vemos los núcleos de las células de Schwann dispuestos en lo que sería el recorrido de la mielina, una capa de abundantes núcleos correspondiente con el perineuro (*), y el epineuro (flecha) entre los fascículos. B. Corte transversal con tinción tricrómica. C. Corte transversal teñido con H-E. Los axones aparecen como una estructura eosinofílica circular, rodeada de un espacio “vacío” antes ocupado por la mielina. Por fuera del axón, en ocasiones se ve el núcleo de una célula de Schwann. En los cortes transversales se pueden observar capilares bien definidos. Modificado de [5]. Alrededor de cada fascículo se encuentra el perineuro, tejido conjuntivo especializado formado por una porción epitelial y por una porción fibrosa externa de tejido conjuntivo denso. Constituye la barrera hematoneural y su epitelio es un derivado de la leptomeminge en continuidad con el neuroepitelio de la aracnoides. Las células del Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 4 epitelio perineural se disponen en varias capas de forma alineada y ordenada formando una lámina pseudoepitelial. La célula perineural especializada tiene una lámina basal en ambas superficies, contiene vesículas de pinocitosis y mitocondrias y en el citoplasma abundantes filamentos finos (miofilamentos) y densidades citoplasmáticas. Estos dos últimos son componentes característicos de la célula muscular lisa que explican su capacidad miocontráctil. El epineuro es el tejido más externo del nervio que mantiene a los fascículos unidos e impide la sobre-distensión y el desgarro de las fibras nerviosas. Está formado por tejido conjuntivo denso y contiene fibras colágenas, algún fibroblasto, algún adipocito y fibras elásticas gruesas. Por él viajan los vasos sanguíneos que irrigan al nervio formando redes que atraviesan el perineuro hasta llegar al endoneuro. Alrededor de ellos aparecen con frecuencia mastocitos. El epineuro está en conexión con la duramadre del SNC y se torna más delgado a medida que avanza distalmente. Los fibroblastos se pueden identificar gracias a sus núcleos alargados (aunque no tan planos como los de las células de Schwann, y más pequeños). El endoneuro y el epineuro contienen fibroblastos típicos que contienen vesículas de pinocitosis, mitocondrias y abundante cantidad de cisternas de retículo endoplásmico rugoso (lo que indica que produce colágeno). 1.1.3. Distribución esperada de ApoD en el SNP Uno de los principales tejidos de expresión de ApoD es el sistema nervioso. En el sistema nervioso central, ApoD se expresa principalmente en oligodendrocitos y astrocitos [6]. En cuanto al sistema nervioso periférico, técnicas de fluorescencia han confirmado la localización de ApoD en células de Schwann, donde la Apolipoproteína D se localiza en vesículas de secreción y en la vaina exterior de las células, con un patrón de expresión dinámico que sugiere la posibilidad de cambio entre un estado inactivo y la activación ante determinadas situaciones funcionales[2]. En cultivos celulares realizados 7 días después de la lesión de nervio ciático de rata, se identificó mediante hibridación in situ la expresión de ApoD mayoritaria y casi exclusiva en fibroblastos del endoneuro[7], siendo la expresión mucho menos intensa en nervio ciático intacto tanto en epineuro como en perineuro. Se ha objetivado también la presencia de ApoD en adipocitos y pericitos[2]. Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 5 Estos datos acerca de la expresión de ApoD en el sistema nervioso periférico han sido estudiados en modelo animal, pero no se conocen estudios sobre su expresión en humano. 1.1.4. Perspectivas y enfoque en la investigación sobre ApoD - Consecuencias del proceso lesivo en el SNP Ante un proceso lesivo, independientemente de su origen (traumático, degenerativo, inflamatorio, vascular, metabólico…), acontece en el nervio periférico una “degeneración-regeneración Walleriana (WDR)”, proceso en el que la porción del nervio distal a la lesión se desintegra[8]. A continuación, las células de Schwann se colocan formando largos cordones celulares rodeados de lámina basal que servirán de guia para el crecimiento de un axón en regeneración. Estas estructuras se denominan bandas de Büngner, y pueden considerarse una banda endoneural primitiva[9]. El cabo proximal empieza a regenerarse a lo largo de las bandas de Büngner para tratar de alcanzar su órgano diana, siendo crucial para la reconstrucción la preservación de continuidad de las envolturas de tejido conjuntivo. Durante este proceso de degeneración Walleriana se produce una fagocitosis por parte de macrófagos y células de Schwann[10] hacia los detritus celulares y restos de mielina, y una estimulación de la producción de factores de crecimiento que contribuyan a crear un microambiente propicio para la posterior regeneración axonal y la remielinización. En este proceso participan tanto macrófagos residentes como infiltrantes. En nervio ciático seccionado se ha observado que la acumulación de macrófagos es predominante en el epineuro en los primeros días post lesión, y que alcanza su pico en el día 14 post lesión, momento en el que se concentran en endoneuro[11]. Implicación de la Apolipoproteína D Es un hecho demostrado que ApoD interviene en la regeneración Walleriana. El cómo y cuándo está en estudio. Garcia-Mateo y cols. han estudiado el papel de esta lipocalina en la fase temprana de la WDR (7 días después de lesión) confirmando que interviene tanto en la activación de la fagocitosis de residuos de mielina como en la posterior degradación de esta intracelularmente. - El proceso de activación de la fagocitosis mediado por ApoD resulta más eficiente: citoquinas como TNFA y MCP1 presentan un pico de expresión post lesión en presencia de ApoD en contraste con la expresión sostenida en ausencia de la lipocalina. Una óptima regulación de expresión de señalizadores de activación fagocitaria como la galectina-3 es dependiente de ApoD. Es decir, en ausencia de ApoD la fagocitosis de la mielina requiere de una mayor y menos Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 6 específica actividad pro-inflamatoria, lo que conlleva un retraso de la misma. Esta acción fagocítica es llevada a cabo tanto por macrófagos infiltrantes como residentes, y por las propias células de Schwann tras expresar ciertas modificaciones fenotípicas. - Una vez fagocitados los residuos de mielina, en ratones ApoD-KO, su degradación ha demostrado un inicio retardado y un proceso más lento con mayor acumulación tanto de macrófagos como de grandes fragmentos mielínicos en su interior[12]. Además, Apo D cumple un papel homeostático ante las alteraciones producidas por una lesión nerviosa que, independientemente del origen lesional, acarreará un estrés oxidativo con la consiguiente producción de hidroperóxidos y lipoperóxidos. Tanto en el sistema nervioso central como en el periférico, Apo D controla el acúmulo de estos residuos procedentes de la degradación de ácidos grasos. Prueba de ello, se ha comprobado que los ratones ApoD KO presentan signos de neurodegeneración a los 3 meses de vida, presentando daño oxidativo y defectos en la homeostasis proteica en cortex e hipocampo. - Re-mielinización Tras la necesaria eliminación de mielina, comienza el proceso de re-mielinización. Las células de Schwann son susceptibles de sufrir cambios fenotípicos[13] que primero las capacitan para la fagocitosis específica de mielina y posteriormente para la remielinización. Uno de los pasos fundamentales para posibilitar una óptima función de la mielina es la compactación de sus capas. Es conocido que la proteína MBP interviene en la compactación intracelular, pero el proceso de compactación extracelular sigue siendo motivo de estudio. Para que se produzca es necesaria la eliminación del glicocálix, que por su carácter hidrofílico mantiene las membranas separadas e impide la interacción proteína-proteína. Implicación de la Apolipoproteína D Las sialidasas son las enzimas encargadas de la eliminación del glicocálix. Se encuentran tanto en lisosomas (NEU1) como en la membrana (NEU3), y su localización está relacionada con la expresión de ApoD. Se adjudica a ApoD la función de mantenimiento de la membrana lisosomal que les mantiene impermeables y con un pH óptimo, requisitos imprescindibles para la función de las sialidasas y el tráfico lisosoma- Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 7 membrana. En ausencia de ApoD, el glicocálix es menos hidrofóbico y más rico en ácido siálico. Al contrario que la eliminación de residuos mielínicos, que se produce en fases tempranas tras la lesión, el proceso de compactación acarrea consecuencias más tardías, en la fase de maduración de la mielina. Se ha demostrado que la ausencia de ApoD conlleva una compactación deficiente de la cara extracelular de la vaina de mielina, evidenciado al medir el diámetro del axón. Esto produce unas consecuencias funcionales, ya que se reduce significativamente la velocidad de conducción nerviosa, comprometiendo el aprendizaje de tareas motoras. Bioquímicamente también hay alteraciones: las proteínas Plp y P0 que se encargan de mantener la compactación de las hojas extracelulares una vez producida, disminuyen su expresión[14]. 1.2. JUSTIFICACIÓN: Este trabajo se planteó con el objetivo de reproducir el estudio de expresión de la Apolipoproteína D realizado en ratones en tejido periférico nervioso humano sano, buscando comparar su expresión. Se propone el estudio de la expresión de ApoD en nervio periférico humano en estado basal (sin enfermedad ni lesión nerviosa) como paso previo al estudio de su expresión en la enfermedad neurodegenerativa humana. 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Estudiar la expresión de ApoD en muestras de tejido nervioso periférico humano sano. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Caracterizar los tipos celulares que expresan ApoD en el nervio periférico humano sano. - Interpretar los resultados de expresión de ApoD en humano en función de la información existente en el ratón como modelo animal experimental. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Estrategia de búsqueda bibliográfica: Para una primera búsqueda bibliográfica se establecieron tres campos principales sobre los que obtener información: la Apolipoproteína D (sus características, estructura Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 14 Figura 3. Inmunofluorescencia en nervio ciático de ratón con anticuerpos anti- S100 y anti-ApoD. A. En un corte longitudinal se visualizan los axones marcados en verde por S100 y una zona de tejido adiposo con escasa celularidad a la izquierda de la imagen. B. En la zona más periférica del tejido nervioso se sitúa el perineuro que agrupa cada fascículo. C. El marcaje de ApoD se dispone en zonas adyacentes a los núcleos de células de Schwann (flecha). D. La co-localización de S100 y ApoD en las células de Schwann se aprecia en color amarillo. Se pueden distinguir los nodos de Ranvier de los axones (*). Se aprecia marcaje de ApoD en el perineuro (punta de flecha) y en el tejido adiposo (flechas blancas). E. ApoD se concentra en las células de Schwann en zonas cercanas al núcleo (flechas). Barras de calibrado: 40 μm. 4.3 Expresión de ApoD en nervio sural humano Se realizó según el procedimiento indicado en la sección “materiales y métodos” una tinción de inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos MH-S100, RbH-ApoD, y Hoechst como colorante de núcleos (FIGURA 4). En los cortes transversales de nervio sural humano se distinguen las cubiertas conjuntivas del nervio, que presentan intensa fluorescencia verde correspondiente a ApoD (panel A). Se observan también algunos fibroblastos del perineuro encargados de la síntesis de colágeno que presentan marcaje para ApoD (panel B). Los axones se ven como espacios vacíos sin fluorescencia rodeados de la vaina de mielina y en algunas zonas de vesículas llenas de ApoD (panel C). ApoD es una proteína extracelular que se sintetiza en células de Schwann y fibroblastos en el sistema nervioso periférico. En cambio, la proteína S100 se localiza en el citoplasma y/o el núcleo. En los cortes transversales se aprecia mejor la distribución de ApoD en el compartimento intracelular Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 15 de la célula de Schwann. En estas imágenes, ApoD y S100 se expresan con un patrón mutuamente excluyente en el interior del citoplasma de las células de Schwann. En un corte longitudinal a gran aumento (panel D) podemos apreciar esta distribución intracelular de ApoD y su colocalización con S100: en esta célula de Schwann se observa cómo ApoD se localiza en pequeñas vesículas citoplasmáticas. Figura 4. Inmunofluorescencia de nervio sural humano con anticuerpos anti-S100 y anti-ApoD. A. Corte transversal. El marcaje de ApoD se observa en la vaina perineural que separa los dos fascículos (puntas de flechas). Abundantes vasos discurren paralelos a los axones (*). También alrededor de ellos se encuentran células con fluorescencia intensa para ApoD. B. En el perineuro se observan fibroblastos con marcaje para ApoD (flechas). C. A mayor aumento se distingue marcaje de S100 rodeando los espacios vacíos correspondientes al axón (flechas). ApoD y S100 se colocalizan en algunas células de Schwann, pero de forma mutuamente excluyente dentro de la célula (círculo) en estas secciones transversales del axón. D. Corte longitudinal. Co-localización de S100 y ApoD en la célula central. Se distinguen vesículas intracelulares (flechas) con ApoD que co-localizan con el marcaje citoplasmático de S100 en la célula de Schwann. E. Corte longitudinal. ApoD se localiza en zonas adyacentes al núcleo de las células de Schwann (flechas). Barras de calibrado: A: 100 µm; B, C: 50 µm; D:10 µm; E: 20 µm. Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 16 Las células de Schwann de nervio sural humano aparecen con su típica morfología de núcleo alargado y citoplasma extenso rodeando al axón. ApoD, al igual que en el nervio ciático de ratón, se concentra en zonas adyacentes a los núcleos. La diferencia en el número de células de Schwann con respecto a las muestras de ratón es notable. Los cortes de las muestras humanas son de 2,5 micras mientras la muestra de ratón tiene un grosor de 4 micras. Estudios que evalúan cómo distintos factores favorecen la regeneración axonal tras sección en modelos animales utilizan la celularidad y la abundancia de células de Schwann como indicadores de mayor regeneración[16]. Para confirmar el patrón de expresión de ApoD y su colocalización con el marcador S100, repetimos el procedimiento utilizando distintos anticuerpos: RbH-S100 y el monoclonal MH-ApoD (FIGURA 5). Figura 5. Inmunofluorescencia de nervio sural humano con anticuerpos anti-S100 y anti-ApoD. A. Corte transversal. Se distinguen los distintos fascículos agrupados por la cubierta perineural (punta de flecha) que presenta abundante marcaje para ApoD. Se observan también vasos (*). B. Corte transversal. Se distinguen células del epitelio perineural (punta de flecha). C y D. Cortes longitudinales. Los fascículos de axones aparecen rodeados de tejido conjuntivo laxo. Las flechas blancas señalan puntos de colocalización de ApoD y S100 en algunas células de Schwann. Los fibroblastos del perineuro presentan fluorescencia correspondiente a ApoD. El símbolo  en A y B señala artefactos técnicos de marcaje. Barras de calibrado en A, B: 25 μm; C, D: 50 μm. Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 17 El patrón de marcaje con estos nuevos anticuerpos es similar al descrito anteriormente. Un subconjunto de células de Schwann expresa ApoD, como se observa por la colocalización establecida por la fluorescencia amarilla (paneles A-D). Así mismo, tanto el epineuro como el endoneuro contienen fibroblastos formadores de tejido conjuntivo que expresan ApoD. El núcleo de dos células del epitelio perineural (panel B) presentan intensa fluorescencia de ApoD en su interior. En cortes transversales (paneles A y B) se pueden distinguir los fascículos agrupados y envueltos en perineuro, y todos ellos rodeados por una capa más gruesa correspondiente con el epineuro. Existe además una mayor concentración de marcaje de ApoD en las zonas adyacentes a los vasos sanguíneos (panel A). Los paneles C y D de la figura 4 muestran cortes longitudinales de nervio sural en los que no se han marcado los núcleos con Hoechst. Se puede distinguir claramente la colocalización de ApoD en células de Schwann. En la periferia del fascículo hay una zona no fluorescente que se corresponde con el tejido conectivo denso que rodea el haz nervioso. En el panel D, se distingue entre los fascículos el perineuro con células que expresan ApoD. 4.4 Control de especificidad de anticuerpos secundarios Con el objetivo de evaluar la especificidad de unión de los anticuerpos secundarios empleados en este trabajo, se llevó a cabo un control negativo con doble incubación de anticuerpos secundarios en una muestra de nervio sural (FIGURA 6). Se eligió una zona de tejido nervioso con abundante celularidad para el control del anticuerpo GRb-IgG- Alexa 488 (panel A) y una zona de tejido adiposo, que también presenta marcaje para ApoD para el anticuerpo GM-IgG-Alexa-594 (paneles B y C), comprobando que no existe fluorescencia en ausencia de los anticuerpos primarios Rbα-S100 y Mα-ApoD. Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 18 5. DISCUSIÓN En este trabajo he estudiado el patrón de expresión de ApoD en nervio periférico humano en comparación con su expresión en un modelo animal (ratón), y en comparación con lo descrito en la literatura. Existen algunos resultados que merecen discusión: 1) Se ha observado que, en contraposición con las muestras de modelo animal, donde ApoD abunda en el endoneuro, el marcaje de ApoD en humanos predomina en perineuro y epineuro. No es esta la única diferencia: la intensidad de marcaje en el perineuro es notoriamente mayor que en muestras de ratón. La diferencia en grosor de estas envueltas conjuntivas no es suficiente para explicar esta tan llamativa diferencia de intensidad de fluorescencia para ApoD. La presencia de ApoD en estas regiones del nervio es atribuible a los fibroblastos que forman el perineuro y a los fibroblastos y adipocitos del epineuro, que son tipos celulares para los que se ha descrito la expresión de ApoD [2]. Se sabe que los fibroblastos de nervio periférico ejercen un papel en la diferenciación de las células de Schwann que ocurre durante el proceso de regeneración del nervio [17] y están en estudio las diferencias en el efecto promotor del crecimiento neuronal que pueden existir entre fibroblastos de nervios motores y sensitivos. Un estudio que realizó un ensayo de co-cultivo de fibroblastos y neuronas mostró que los fibroblastos sensoriales promueven el crecimiento de neuronas sensoriales a mayor escala que los motores [18]. Planteo para estudios futuros que la diferencia en el tipo de nervio periférico estudiado (el nervio sural humano es exclusivamente sensitivo, mientras que el nervio ciático de ratón es mixto) pueda explicar parte de los hallazgos acerca de la distinta expresión de la Apolipoproteína D en perineuro humano y de ratón. 2) Se observa también que existe una mayor intensidad de tinción en las zonas adyacentes a los vasos sanguíneos. En un estudio en el que se estudió mediante inmunocitoquimica la expresión de ApoD en el cerebro humano se observó una mayor inmunorreactividad en el citosol de las células perivasculares y los lisosomas de los pericitos en las paredes de los vasos sanguíneos. En este estudio se sugirió un potencial papel de las células gliales y ApoD en el transporte de esteroles y pequeñas moléculas hidrofóbicas hacia o desde los vasos sanguíneos en la corteza [19]. La expresión de ApoD en pericitos se ha confirmado en el cerebro de ratón [20]. Así mismo, se ha comprobado que en el SNC los astrocitos no dañados secretan vesículas extracelulares que contienen compuestos neuroprotectores, entre ellos el factor de crecimiento de fibroblastos-2, el factor de crecimiento del endotelio vascular, y ApoD [21]. Estas Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 19 vesículas extracelulares se forman intracelularmente en un proceso en el que participa el compartimento endo-lisosomal, en el que también se ha encontrado ApoD [22]. Por lo tanto, y por analogía con el proceso regenerativo en el SNC, resulta razonable la elevada expresión de Apolipoproteína D humana evidenciada en fibroblastos y células perivasculares del nervio periférico como parte de estas vesículas de secreción. 3) Una de las formas de identificar a la célula de Schwann como productora de ApoD en nuestros experimentos de inmunofluorescencia es que en estas existe co-localización de las proteínas S100 y ApoD, por lo que en los cortes longitudinales se observa una fluorescencia de color amarillo debida a la superposición de la fluorescencia de los dos anticuerpos secundarios. Tanto en las muestras de nervio periférico de ratón elegidas para este estudio, como en las referenciadas por la mayor parte de la literatura, se emplean cortes longitudinales de nervio periférico. Entre las muestras humanas cedidas por el HCUV para la realización de este trabajo disponemos de varias secciones (todas pertenecientes al mismo paciente) en las que se realizaron cortes transversales. Es en estas muestras transversales de humano donde mejor se observa el patrón excluyente de S100 y ApoD en el interior de la célula de Schwann. Esto puede deberse a la distinta distribución de estas proteínas dentro de la célula: S-100 es una proteína de bajo peso molecular fijadora de calcio que se expresa en células derivadas de la cresta neural (células de Schwann, melanocitos y células gliales), donde ocupa el citoplasma y/o el núcleo celular ([23]). Mientras tanto, ApoD no se encuentra libre en el citoplasma, sino que es una molécula extracelular que aparece en el interior de la célula de Schwann incluida en lisosomas y vesículas de secreción. El papel de la proteína S100 en el nervio periférico humano está en estudio. Se sabe que esta familia de proteínas diméricas ligadoras de calcio participan en procesos de diferenciación, crecimiento celular, división celular, transcripción y señalización a través de proteínas de membrana[24], y formando complejos con otras proteínas de unión a calcio podrían tener un papel en la fusión, la organización y el tráfico de membranas[25]. Otra forma de distinguir a las células de Schwann es por su núcleo aplanado, que se distingue al marcarlo con el colorante Hoechst. En el nervio ciático humano impresiona la elevada densidad de núcleos de células de Schwann comparada con las muestras de ciático de ratón. Las imágenes obtenidas con el mismo aumento presentan mayor celularidad, y el grosor de las secciones es mayor en ratón. Existen estudios en los que para evaluar cómo distintos factores favorecen la regeneración axonal tras la sección de nervio en modelos animales utilizan la celularidad y la abundancia de células de Schwann como indicadores de mayor regeneración[16]. Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 20 Este hallazgo puede deberse a una distinta proporción de fibras mielinicas y amielínicas entre nervio ciático y sural, y entre nervio periférico humano y de ratón. Además, pese a tener la célula de Schwann una morfología nuclear característica, puede que no todos los núcleos que se visualizan en el endoneuro correspondan con este tipo celular. Recordamos que los fibroblastos tienen también un núcleo de forma alargada. Otros tipos celulares que podemos encontrar en el endoneuro son macrófagos residentes ocasionales. Otros factores como el tipo de fibras nerviosas o la edad de los controles no han sido valorados, por lo que no podemos afirmar que estas diferencias sean debidas a la especie. Variables como la edad y el sexo son controladas en el caso de las muestras obtenidas a partir de un modelo animal, pero no en el de las muestras de pacientes humanos. Sabemos con certeza que los ratones estudiados son controles, pero en cuanto a las muestras humanas utilizadas, nos encontramos en una situación distinta. Pese a no presentar las muestras cambios propios de enfermedad neurodegenerativa (confirmado por el Servicio de Anatomía Patológica del HCUV), sabemos que los pacientes fueron estudiados por clínica sugerente de patología del sistema nervioso periférico. Por lo tanto, posibles variantes podrían deberse tanto a las características individuales de los controles como a una posible patología subyacente. 6. CONCLUSIONES El objetivo inicial de este estudio era realizar una caracterización de la expresión de la Apolipoproteína D en biopsia de nervio sural de pacientes diagnosticados de enfermedad neurodegenerativa en comparación con sujetos sanos. Se pretendía evaluar cómo afecta el proceso de neurodegeneración a la expresión de ApoD en el sistema nervioso periférico, y por tanto a la capacidad de regeneración después de una lesión aguda o crónica de este. En mi Trabajo de Fin de Grado he estudiado mediante técnicas histoquímicas e inmmunohistoquimicas la expresión de ApoD en el grupo de sujetos control, pretendiendo así orientar futuros trabajos realizados en sujetos enfermos. Los resultados observados en nervios humanos considerados sanos concuerdan con lo esperado según la bibliografía que estudia la expresión de esta lipoocalina en el sistema nervioso periférico de ratón como modelo animal. Aun así, existen diferencias entre ambas especies, como la celularidad y la distribución de ApoD tanto en las envueltas de tejido conjuntivo como en el compartimento intracelular, que requieren de un mayor y más profundo estudio. Así mismo, es necesario ampliar el estudio de expresión de ApoD en nervio periférico humano enfermo Trabajo de Fin de Grado | Grado en Medicina 21 para comprobar su papel en las patologías neurodegenerativas, acerca de las cuales se conoce que cursan con una elevada expresión de ApoD. 7. REFERENCIAS 1. Ruiz M, Sanchez D, Correnti C, Strong RK, Ganfornina MD. Lipid-binding properties of human ApoD and Lazarillo-related lipocalins: functional implications for cell differentiation. FEBS J 2013;280:3928-43. 2. Sanchez D, Ganfornina MD. The Lipocalin Apolipoprotein D Functional Portrait: A Systematic Review. Front Physiol 2021;12:738991. 3. Ganfornina MD, Do Carmo S, Lora JM, Torres-Schumann S, Vogel M, Allhorn M, et al. Apolipoprotein D is involved in the mechanisms regulating protection from oxidative stress. Aging Cell 2008;7:506-15. 4. Rassart E, Bedirian A, Do Carmo S, Guinard O, Sirois J, Terrisse L, et al. Apolipoprotein D. Biochim Biophys Acta 2000;1482:185-98. 5. 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