Producción y caracterización de polímeros recombinantes tipo elastina para terapias génicas dirigidas

1 Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Producción y caracterización de polímeros recombinantes tipo elastina para terapias génicas dirigidas Autora: Sandra Rodríguez Sufuentes Tutor/es: Dr. Francisco Javier Arias Vallejo Sara Escalera Anzola 2 3 AGRADECIMIENTOS Este trabajo es el fin de una etapa en la que he podido aprender tanto en muchos ámbitos. Tengo a mucha gente a la que agradecer, tanto a las personas que empezaron conmigo esta etapa y se han mantenido, como a las personas que he encontrado gracias a esta etapa. Sin todos vosotros no habría llegado hasta aquí. A mi tutora Sara, por guiarme y ayudarme en todo momento, y por ser más que una tutora, una amiga, con la que he podido tanto reír como llorar. Sin ti no habría sido posible nada de este trabajo, y nunca podré llegar a agradecerte todo lo que mereces. A mi tutor Javier por permitirme la oportunidad de aprender tanto y tener tantísima paciencia conmigo, con mis agobios y mis “en plan”. A toda la gente que forma y ha formado parte del laboratorio en lo que he estado ahí, y de la que he podido aprender mucho, en especial a Andrea que ha estado en esta última etapa y con la que he compartido risas y desgracias, y a Alessandra. A los técnicos del LTI, en especial a Javier, por ayudarme tanto con las técnicas que eran completamente nuevas para mí. A mis amigos y amigas, que habéis hecho toda esta etapa mucho más divertida, y que me habéis ayudado en todo lo que podíais y más. A Kevin, que es probablemente la persona que más me ha aguantado todo este tiempo, y que ha sido un pilar fundamental para mi durante estos años. A mis padres, abuelos y hermana, que me han soportado tantísimo todos estos años, y en especial este último, y que sin su apoyo y amor no habría llegado aquí. Gracias sobre todo por confiar más en mí que yo misma en muchos momentos. “ Soy de las que piensan que la Ciencia tiene una gran belleza. Un científico en su laboratorio no es solo un técnico: es también un niño colocado ante fenómenos naturales que le impresionan como un cuento de hadas ” Marie Curie 4 ÍNDICE 1. Resumen.......................................................................................................................................... 6 2. Introducción ........................................................................................................................................ 7 2.1 Biología molecular y Biomateriales Recombinantes: .................................................................. 7 2.2 Elastina: ......................................................................................................................................... 8 2.2.1. Polímeros tipo elastina (ELPs) .............................................................................................. 8 2.2.2 Polímeros recombinantes tipo elastina (ELRs) ..................................................................... 9 2.3 Poliplexos .................................................................................................................................... 10 2.4 Fragmentos de anticuerpos: scFv ............................................................................................... 10 2.5 EpCAM y su papel en el cáncer: ................................................................................................. 11 2.6. Terapia génica dirigida: una técnica molecular para el tratamiento de enfermedades ......... 12 3. Objetivos ........................................................................................................................................... 13 4. Materiales y métodos ....................................................................................................................... 14 4.1. Materiales .................................................................................................................................. 14 4.1.1 Reactivos químicos .............................................................................................................. 14 4.1.2 Materiales de Biología Molecular: ...................................................................................... 15 4.1.3 Enzimas ................................................................................................................................ 15 4.1.4 Kits para el tratamiento de DNA. Purificación y extracción de DNA ................................. 16 4.1.5 Disoluciones tamponadas ................................................................................................... 17 4.1.6 Disoluciones de teñido: ....................................................................................................... 18 4.2 Métodos ...................................................................................................................................... 18 4.2.1 Electroforesis en gel ............................................................................................................ 18 4.2.2 Purificación de DNA plasmídico .......................................................................................... 22 4.2.3 Digestión de DNA mediante enzimas de restricción .......................................................... 22 4.2.4 Identificación y análisis de los fragmentos de DNA ........................................................... 23 4.2.5 Determinación y análisis de la concentración y pureza de las muestras de DNA ............. 23 4.2.6 Crecimiento colonias bacterianas en placas de LB-Agar. ................................................... 24 4.2.7 Preparación de muestras de electroforesis para SDS-PAGE. Preparación de muestras para la selección de colonias ................................................................................................................ 25 4.2.8 Bioproducción de polímeros recombinantes ...................................................................... 27 4.2.9 Lavado y ruptura de las células ........................................................................................... 29 4.2.10 Purificación de polímeros recombinantes ........................................................................ 31 4.2.11 Caracterización físico-química del polímero recombinante ............................................ 32 5. Resultados y discusión ...................................................................................................................... 38 5.1 Bioproducción de scFv(EpCAM)-VOK-H6. Proceso y optimización ............................................ 38 5 5.2 Purificación de scFv(EpCAM)-VOK-H6 ........................................................................................ 41 5.3 Purificación de DNA plasmídico ................................................................................................. 43 5.4 Caracterización de scFv(EpCAM)-VOK-H6 .................................................................................. 44 5.4.1 Caracterización físico-química............................................................................................. 45 5.4.2 Caracterización funcional de scFv(EpCAM)-VOK-H6 ........................................................... 48 5.5 Caracterización del poliplexo ..................................................................................................... 51 5.5.1 Caracterización físico-química del poliplexo ...................................................................... 51 5.5.2 Caracterización funcional del poliplexo .............................................................................. 56 6. Conclusiones ..................................................................................................................................... 57 7. Perspectivas de futuro ...................................................................................................................... 57 8. Bibliografía ........................................................................................................................................ 58 9. Abreviaturas...................................................................................................................................... 60 10. Anexos ............................................................................................................................................. 62 Anexo 1 ............................................................................................................................................. 62 Anexo 2 ............................................................................................................................................. 64 Anexo 3 ............................................................................................................................................. 65 Anexo 4 ............................................................................................................................................. 65 6 1. Resumen La elastina es una proteína de gran importancia e interés cuyas propiedades elásticas y resistentes son de gran utilidad para el desarrollo de nuevos biomateriales, como los polímeros recombinantes tipo elastina (ELR). Estos biopolímeros cuentan con una serie de características, como su elevada biocompatibilidad, que les hace ideales para aplicaciones biomédicas, como el transporte de terapias génicas dirigidas. En este trabajo se ha producido y purificado el ELR scFv(EpCAM)-VOK-H6, cuya secuencia de aminoácidos le permite formar poliplexos mediante la complejación de moléculas de DNA plasmídico terapéutico. Tanto al ELR como al poliplexo se les ha realizado una caracterización físico-química y funcional con diferentes técnicas: electroforesis en gel de poliacrilamida (SDSPAGE), espectroscopia de masas (MALDI-TOF), inmunoensayo Western-Blot, ELISA, dispersión dinámica de luz (DLS), microscopía de fuerza atómica (AFM) y espectroscopia de RMN ordenada por difusión (2D DOSY NMR). Abstract Elastin is a protein of great importance and interest whose elastic and resistance properties can be exploited in the development of new biomaterials, such as elastin-like recombinamers (ELR). These biopolymers have several characteristics, such as their high biocompatibility, which makes them ideal for biomedical applications, for example their use as carriers for targeted gene therapies. In this work we have produced and purified the ELR scFv(EpCAM)-VOK-H6, whose amino acid sequence enables it to form polyplexes through the complexation of therapeutic plasmid DNA molecules. Physicochemical and functional characterization was performed to both the ELR and the polyplex using different techniques: polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), mass spectroscopy (MALDI-TOF), Western-Blot immunoassay, ELISA, dynamic light scattering (DLS), atomic force microscopy (AFM) and diffusion-ordered NMR spectroscopy (2D DOSY NMR). 7 2. Introducción 2.1 Biología molecular y Biomateriales Recombinantes: La Biología Molecular es un dominio de la Biología que estudia la función, estructura y composición de los componentes moleculares principales de la célula: proteínas, ácidos nucleicos, glúcidos y lípidos. Su dogma principal, representado en la ilustración 1, está basado en la forma en la que se transmite el flujo de la información genética: El DNA (ácido desoxirribonucleico) es el encargado de guardar y transmitir la información, que luego se transcribe a RNA (ácido ribonucleico), para acabar traduciéndose a proteínas. Ilustración 1-Representación del dogma de la Biología Molecular Los biomateriales se definen como aquellos materiales (naturales o sintéticos) cuyo fin es la fabricación de dispositivos que puedan reemplazar una parte o función del cuerpo de forma fiable y segura. Para que estos biomateriales sean fiables y seguros, deben cumplir unos requisitos: que sean químicamente inertes y estables, que no sean tóxicos, ni puedan causar rechazo inmunológico, que tenga propiedades mecánicas adecuadas para la función que van a desempeñar, y que sea relativamente económico y fácil de fabricar para así poder producirlo a gran escala [1]. Dentro de estos biomateriales, se encuentran los polímeros [2], los cuales toman una gran importancia dentro de la investigación en las terapias génicas dirigidas como vehículos. Un polímero es cualquier sustancia natural o sintética, compuesta por la repetición de unidades más simples conocidas como monómeros. Un ejemplo de polímero natural que forma parte de nuestro organismo son el DNA, constituido por nucleótidos, o las proteínas, constituidas por aminoácidos [3]. Entre las proteínas pertenecientes a nuestro organismo, encontramos la elastina, la cual proporciona elasticidad a los tejidos de los vertebrados [4]. 8 2.2 Elastina: La elastina (del griego elast(o) que significa “golpeado”, “dúctil” e in(a) “sustancia”[5]) es una proteína perteneciente al grupo de las holoproteínas, dado que está compuesta por aminoácidos enteramente. Se trata de un biopolímero insoluble muy duradero, compuesto por un 90% de aminoácidos apolares, lo que le dota de una elevada hidrofobicidad. Se han descrito varias secuencias de aminoácidos para describir la estructura primaria. La secuencia más frecuente en esta proteína es Valina-Prolina-Glicina- Valina-Glicina, VPGVG. Un aminoácido natural que no está presente en esta secuencia pero que tiene una gran importancia es la lisina. La función de la elastina es proporcionar elasticidad y resistencia a muchos tejidos de los vertebrados tales como la piel, los pulmones y los vasos sanguíneos. Sus redes de fibras elásticas se forman gracias al autoensamblaje entre las lisinas de su precursor monomérico, la tropoelastina, en la matriz extracelular durante la elastogénesis en su fase principal, a través de la acción de la enzima lisil oxidasa. Estas fibras son muy duraderas, gracias a las características intrínsecas de este precursor monomérico, y posibilita los ciclos de relajación y estiramiento repetidos en un medio hidratado [6][4][7]. Las fibras de elastina tienen dos posibles plegamientos, uno desenrollado, desplegado, y otro completamente enrollado, plegado, pudiendo pasar de una a otra mediante una transición. Esta propiedad es la que hace adecuados a los péptidos similares a la elastina (ELP) para poder usarlos como biomateriales [6]. 2.2.1. Polímeros tipo elastina (ELPs) Los polímeros tipo elastina (elastin-like-polymers, ELPs) son un tipo de biopolímeros artificiales pertenecientes a los biopolímeros termosensibles. Como su propio nombre indica, son polímeros derivados de la elastina. Por lo tanto, algunas de sus características son debidas a esta proteína, como por ejemplo su elasticidad, biocompatibilidad o su resistencia [8][9]. Su secuencia está basada en la de la elastina natural, que consiste comúnmente en repeticiones del péptido VPGVG: los ELPs se han biosintetizado generalmente como (VPGXG)n, siendo X cualquier aminoácido natural o artificial menos la prolina [10]. Los polímeros con esta secuencia son funcionales, presentan un comportamiento inteligente. Esto significa que van a tener transiciones de fase reversibles, entre la forma plegada, enrollada, y la forma desplegada, dependientes de algunos factores tales como la temperatura o el pH. Estas transiciones también van a estar subordinados al peso molecular y a los aminoácidos que compongan el polímero y a la concentración que haya en solución. Volviendo a la dependencia con la temperatura, los ELPs 9 presentan una Transición Inversa con la Temperatura (ITT, del inglés Inverse Temperature Transition) de tal forma que a una temperatura inferior a su Temperatura de Transición Tt, las cadenas poliméricas de los ELPs van a estar desordenadas, desplegadas, mientras que, si se supera esta Tt, estas cadenas se plegaran hidrofóbicamente, ensamblándose para dar estructuras más grandes. Es importante remarcar la conservación de la transición inversa con la temperatura al fusionar el polímero tipo elastina a otra proteína, lo cual lo va a hacer muy interesante en aplicaciones biomédicas, como el suministro de fármacos mediante la construcción de biomateriales de escala nanométrica, ya que puede “programarse” la temperatura de transición de cada polímero según su aplicación [8][9][11]. Otras características que le dotan de interés para aplicaciones biomédicas junto con las temperaturas de transición, son: el hecho de que se puede construir un ELP con un peso molecular determinado según lo que se necesite, puesto que este será un parámetro a tener en cuenta si su aplicación es la de transporte de fármacos, al influir en la vida de este. También su gran biocompatibilidad es muy interesante: el sistema inmune no va a generar ningún rechazo hacia los ELPs, puesto que los confunde con la elastina natural y no es capaz de distinguirlo de esta. Además, los productos que generan estos polímeros tipo elastina son aminoácidos simples y naturales fácilmente biodegradables [10]. 2.2.2 Polímeros recombinantes tipo elastina (ELRs) Un método de sintetizar ELPs simple y eficaz es el uso de bacterias productoras para llevar a cabo una síntesis recombinante de estos. El resultado de esta estrategia son los ELRs (Elastin-Like Recombinamers). La síntesis recombinante tiene la ventaja de permitir sintetizar estructuras complejas, o polímeros grandes con total control de la secuencia, puesto que con la síntesis química esto suponía un problema, ya que se obtenían mezclas estadísticas de polímeros con distinto peso molecular, es decir, de alta polidispersidad. Al igual que los ELPs, están basados principalmente en la repetición del pentapéptido VPGXG, donde X es cualquier aminoácido exceptuando a la prolina. Al estar inspirados en la secuencia de la elastina, mantienen sus propiedades elásticas y su capacidad de autoensamblaje, y su respuesta a cambios térmicos, es decir, su transición de fase reversible con la temperatura. Por otro lado, al ser recombinantes, se pueden alterar estas secuencias fácilmente añadiendo grupos funcionales y modificando algunas propiedades mediante métodos de DNA recombinante, como el comportamiento térmico, que va a permitir ajustar esa temperatura de transición Tt (explicada en el punto 2.2.1) de forma más precisa. Estos biopolímeros, gracias a estas características tienen un futuro muy prometedor como materiales para aplicaciones biomédicas, como por ejemplo administración de fármacos en terapia génica dirigida [12][13]. 16 - Tipo II: reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual del extremo 5’ a 3’, que del 3’ a 5’ de la cadena complementaria), cortando siempre en el mismo sitio dentro de esta. - Tipo IIS: similares a las de tipo II, pero no reconocen secuencias palindrómicas. Además, cortan fuera de las secuencias de reconocimiento. - Tipo IV: solo cortan en cadenas de DNA modificado. Las enzimas pueden realizar cortes en la doble hebra que generan extremos cohesivos, o extremos romos. En los primeros, dejan de dos a cuatro nucleótidos desapareados por extremo, y en el segundo, no deja bases desapareados, se corta en el centro del palíndromo. Generan fragmentos de DNA conocidos como fragmentos de restricción. Las enzimas que se usaron en este trabajo se utilizaron enzimas de tipo II: Tabla 1-Función, tampón usado y secuencias diana de las enzimas EcoRI y HindIII Enzima de restricción Secuencia diana Buffer o tampón Uso en este trabajo EcoRI 5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’ Green buffer Fast Digest 10x Digestiones analíticas: Identificación de fragmentos de DNA: Linealización de plásmido HindIII 5’A A G C T T 3’ 3’ T T C G A A 3’ Green buffer Fast Digest 10x Digestiones analíticas: Identificación de fragmentos de DNA: Se usó junto con EcoRI para cortar el inserto mKate 4.1.4 Kits para el tratamiento de DNA. Purificación y extracción de DNA Para poder llevar a cabo la extracción de DNA plasmídico de las bacterias a través de métodos de Biología Molecular, y así poder trabajar con fragmentos de DNA conocidos, se ha utilizado el siguiente Kit: Ilustración 3--Ejemplo de extremo romo (izquierda) y extremo cohesivo (derecha) 17 - Nucleospin® Plasmid/Plasmid (NoLid) (Macherey-Nagel): gracias a este kit se puede purificar de pequeñas muestras de cultivo bacteriano (5-10mL), el DNA plasmídico. El fundamento teórico se explica en el apartado 4.2.2.1. 4.1.5 Disoluciones tamponadas En la siguiente lista, se describen las disoluciones usadas: - SDS-PAGE Tampón de carga 5x: 10% (p/v) SDS, 25% (v/v)-mercaptoetanol, 2% (v/v) azul de bromofenol (BPB), 50% (v/v) glicerol, 0.3 M Tris-base; pH 6,8. - Tampón de desarrollo de gel proteínas 5x: Tris-base 0.12 M, glicerol 0.96, SDS 0.02M; pH 8.3. La disolución de SDS es preparada por separado, y añadida tras el ajuste de pH. - Tampón TAE 50x: 40mm Tris-base, 19mM ácido acético, 1mM EDTA; pH 8. - Tampón de lavado celular: Tris-Base 20mM, NaCl 140 mM; pH 8. - Tampón de lisis o de sonicado: Tris-Base 20mM, PMSF 1mM; pH 8. - Tampón de equilibrado cromatográfico: guanidina-HCl 3M, imidazol 10 mM, DTT 1mM en PBS; pH 7. - Tampón de lavado cromatográfico en gradiente 1: guanidina-HCl 3M, imidazol 25 mM, DTT 10 mM en PBS; pH 7.4. - Tampón de lavado cromatográfico en gradiente 2: imidazol 25 mM, en PBS; pH 7.4. - Tampón cromatográfico de elución: imidazol 250 mM, en PBS; pH 7.4. - Tampón fosfato salino, PBS: NaCl 173mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4, KH2PO4 1.8mM, pH 7.9. - MES tampón 10x: 20 mM 2-(N-morpholine)- ethanesulfonic acid, NaCl 0.1 M; pH 5. - Tampón de transferencia para Western Blot: 20% (v/v) Tampón de desarrollo 5x, 15% (v/v) metanol en agua destilada. - PBS-T: 0.1% (v/v) Tween-20 en PBS 1x. - Tampón NaHCO3/Na2CO3 ELISA: 0,23% (m/v) Na2CO3, 0,353% (m/v) NaHCO3. Se ajusta el pH a 9.5 con HCl 3%. - TBS 10%: 2.4% (m/v) Tris-HCl, 0.56% (m/v) Tris-Base, 8.8% NaCl; pH 7.6. - TBST: 0.05% Tween-20 en TBS 1x. 18 4.1.6 Disoluciones de teñido: 4.1.7.1 Geles de poliacrilamida: - Azul brillante de Coomassie: Está compuesta por un 0.1% (v/v) de Azul de Coomasie, un 10% (v/v) de ácido acético, un 40% (v/v) de metanol y un 50% (v/v) de agua. Para llevar a cabo el desteñido de los geles, se una disolución compuesta por un 40% (v/v) de metanol, un 10% (v/v) de ácido acético, y un 50% (v/v) de agua. 4.1.7.2 Geles de agarosa: - Disolución de teñido para gel de agarosa: Para estos geles se usa una disolución al 0.005% de colorante SYBR Safe en tampón TAE 1x. 4.2 Métodos 4.2.1 Electroforesis en gel La electroforesis (electro, referido a electricidad, y foresis, del griego phoros que significa trasladar) es una técnica de separación de moléculas basada en la diferente migración de estas bajo la acción de un campo eléctrico. Consiste en la aplicación pues, de una corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen un gel. El gel es una sustancia semisólida formada por polímeros que constituyen una malla con un gran contenido de agua o solución tampón. Al aplicar la corriente, las macromoléculas adquieren una velocidad constante, puesto que se equilibra la fuerza impulsora del campo eléctrico, con la resistencia que encuentra la macromolécula al desplazarse, es decir, con la fuerza de fricción. La separación de las moléculas depende pues, de dos factores principalmente: la carga y la masa. Estas dos variables van a actuar conjuntamente. En electroforesis se trabaja con tos tipos de gel: - Gel de agarosa - Gel de poliacrilamida A continuación, se explicarán ambos geles, así como para que se usa cada uno. 19 4.2.1.1 Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE discontinuo) SDS-PAGE significa SDS-PolyAcrilamide Gel Electrophoresis, es decir, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS). El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza la proteína y la dota de una carga neta negativa. Su finalidad es el análisis de proteínas. Este tipo de geles suelen usar un sistema tampón Tris discontinuo. Estos geles son el resultado de la polimerización química de una de mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Según la concentración y la proporción de ambas, se consiguen distintas porosidades, aunque menores que las de los geles de agarosa. Los otros componentes que forman estos geles son el tampón Tris, el SDS, el PSA (persulfato de amonio) que se encarga de formar en disolución radicales libres, que interactuarán con los grupos reactivos de la acrilamida y la bisacrilamida, y el TEMED(Tetrametil-etilen-diamina), un catalizador, que inicia la reacción de polimerización una vez se añade. Al final, se va a formar una malla, compuesta por una serie de cadenas muy larga de poliacrilamida, que se ha entrelazado con la bisacrilamida. La poliacrilamida se organiza de forma lineal, mientras que la otra forma brazos que unen las cadenas de la otra. Los geles de poliacrilamida discontinuos constan de dos partes: el gel de compactación (o stacking gel) y gel de resolución (o resolving gel). - El gel de compactación se prepara con una menor concentración de acrilamida para que tenga poros grandes para que los péptidos más grandes puedan migrar fácilmente. Esto permite que las proteínas en una muestra cargada se concentren en una banda apretada durante los primeros minutos de la electroforesis antes de ingresar a la porción de resolución de un gel. - El gel de resolución, usa una concentración de acrilamida mayor, por lo que el tamaño de poro más pequeño del gel de resolución comienza a tener un efecto de tamizado, lo que resulta en la separación de péptidos por tamaño una vez las macromoléculas llegan a este gel. Los geles de poliacrilamida pueden hacerse a diferentes porcentajes, como se ve en la tabla 13 (anexo 2). En el presente trabajo se ha utilizado usado siempre un gel de resolución del 10%. Este porcentaje de elige según el peso molecular de la proteína. Para poder realizar una semicuantificación de la proteína de interés, se necesita que haya un marcador de referencia compuesto por fragmentos protéicos con un peso molecular y cantidades conocidas. En este caso he usado el marcador NZY-Bluesafe®, que sigue el patrón que se ve a continuación (ilustración 4): 20 Ilustración 4-Bandas con sus pesos correspondientes del marcador de referencia NZY-Bluesafe® El gel se forma dentro de un soporte, añadiendo primero el gel de resolución, y una vez este está gelificado, el gel de compactación. Antes de que gelifique, se añade un peine adecuado para formar los pocillos en los que se depositará la muestra. Este soporte se mete en una cubeta con tampón de desarrollo 1x. La electroforesis se realiza a amperaje constante (25mA/gel) hasta que los colorantes de referencia que llevan tanto el marcador como las muestras, alcancen el final del gel, lo cual lleva una hora aproximadamente. Por último, se lleva a cabo la tinción del gel con Azul de Coomassie. Una vez está teñida, es decir, no se distingue el color del gel del color del tinte, se destiñe con una disolución de desteñido especificada en el apartado 4.1.7. Para poder ver el gel y observar así las bandas, se utiliza un transiluminador de luz blanca Gel DocTM EZ Image, que permite también hacer fotografías de estos, y ver el porcentaje de banda y su peso molecular, para la caracterización. Para poder estudiar este último, hay que tener en cuenta la existencia de un retraso electroforético, debido a la lentitud de avance del ELR en el gel a causa de su elevada hidrofobicidad, que provocará que la banda aparezca a tamaños superiores a los reales. 4.2.1.2 Electroforesis de DNA en geles de agarosa. En el caso del DNA, plásmidos, fragmentos génicos o fragmentos resultantes de una digestión con enzimas de restricción, el gel que se usa es de agarosa La agarosa es un polímero lineal de un peso medio de 12000Da compuesto de residuos alternantes de D ‐galactosa y 3,6 ‐anhidro ‐ L ‐galactosa unidos por enlaces glucosídicos α (13) y β (14). Las cadenas del polímero de agarosa forman fibras helicoidales, que al solidificar forma una malla con 21 «poros» cuyo tamaño puede ser controlado mediante la concentración y tipo de agarosa. Podemos jugar mucho con estos geles, utilizando diferentes concentraciones iniciales de agarosa, o diferentes tipos de agarosa. Se emplean para separar moléculas de diferentes rangos con un peso molecular desde 20 pb hasta más de 20 Kpb. Estos geles se forman fundiendo la agarosa en tampón TAE 1x por en una temperatura entre 50º-60ºC. Este tampón tiene un pH de 8, valor en el cual los grupos fosfatos de DNA están cargados negativamente, y dado que este pH se mantiene durante todo el desarrollo de la electroforesis, la carga de todos los fragmentos de DNA será la misma. Es decir, la separación de las moléculas de DNA va a ser debida únicamente al tamaño de estas. Los fragmentos de mayor tamaño se encontrarán más cerca de los pocillos, y los más pequeños, más lejos. Para la formación del gel se usa un formador, y una vez vertido sobre este, antes de que gelifique, se pone un peine para poder formar los pocillos en los que depositar la muestra. Para la electroforesis, estos geles se colocan en cubetas de electroforesis, sumergidos en el tampón TAE 1x, y se une a una fuente de alimentación con un cátodo y un ánodo. El DNA correrá desde el polo negativo al positivo, ya que, al tener la carga neta negativa, será repelido por el negativo, y atraído por el positivo. Estos geles se someterán a un voltaje fijo de 90V, durante 90 minutos. La muestra de DNA se prepara añadiendo una sustancia que sirva para aumentar la densidad. Se suele añadir un colorante, una sustancia que permita seguir la migración, y un tampón. En este caso, se usó el Green Buffer 10x. Al igual que con las proteínas, se necesita un marcador de referencia: el NZY Ladder III, que contiene 14 fragmentos de DNA de tamaños y cantidades conocidas (ilustración 5) Ilustración 5-Bandas con sus pares de bases correspondientes del marcador de referencia NZYLadder III 22 4.2.2 Purificación de DNA plasmídico Para poder llevar a cabo la formación del poliplexo, es necesario tener el plásmido que se desee complejar con el ELR puro, es decir, tener la certeza de que el DNA usado es un único fragmento de secuencia conocida. Para este caso, interesa una purificación de DNA plasmídico procedente de cepas bacterianas (E. coli): Se busca la extracción y purificación del DNA plasmídico presente en el citoplasma de la bacteria. Para esto, se ha usado el Kit Nucleospin Plasmid QuickPureTM Macherey-NagelTM. 4.2.2.1 Purificación con Protocolo NucleoSpin® Plasmid/Plasmid NoLid Este tipo de purificación se basa en la lisis alcalina del cultivo bacteriano, siguiendo el esquema de la ilustración 6. El paso previo a la purificación es el cultivo bacteriano en medio líquido en un volumen de 5mL, que se explica en el apartado 4.2.6. En este caso se seleccionan 4 colonias, en vez de las 8 para los screening de proteínas. El plásmido de interés es el pCMVmKate2, cuya resistencia es a la Kanamicina. Se realiza la purificación por el método de la lisis alcalina siguiendo el protocolo comercial NucleoSpin® Plasmid/Plasmid NoLid (ilustración 6). Para medir la concentración del DNA plasmídico purificado, se usa NanoDrop OneC (Thermo Scientific). Esto se explica en el apartado 4.2.5. 4.2.3 Digestión de DNA mediante enzimas de restricción La digestión es el proceso por el cuál una enzima de restricción con actividad endonucleasa, reconoce unas secuencias determinadas del DNA conocidas como secuencias diana, cortando esta secuencia de forma específica. Estas secuencias diana son secuencias cortas a menudo, y palindrómicas. Las enzimas de restricción usadas se explican en el apartado 4.1.3. Ilustración 6-Esquema del procedimiento de purificación de plásmidos procedentes de cepas bacterianas. Las etapas son: 1- Lisis alcalina y neutralización; 2- Clarificación del lisado; 3- Extracción en fase sólida; 4-Eliminación de interferentes apolares; 5- Eliminación de interferentes polares; 6-Elución del DNA plasmídico purificado. 1 2 3 4 5 6 7 23 Las digestiones se pueden realizar con dos fines: analíticos y preparativos. En el primer caso, se trata de una identificación del tamaño de los fragmentos de DNA, para poder identificar si este fragmento es el deseado. Este es el que nos interesa en este trabajo, puesto que la digestión se ha llevado a cabo con el fin de ver si el plásmido tratado es el deseado y si está bien. El segundo caso, se lleva a cabo para recuperar y purificar el DNA contenido en la banda elegida. En la ilustración 29, (anexo 3) podemos ver el mapa de restricción del plásmido de interés, y se pueden observar los puntos en este por donde cortan las dos enzimas usadas en este trabajo: EcoRI y HindIII. Las secuencias diana por las que cortan son explicadas en el apartado 4.1.3, en la tabla 1. Con estas enzimas, se han llevado a cabo dos digestiones diferentes, una con EcoRI sola, y otra con EcoRI + HindIII. Es decir, a cada colonia diferente, se ha realizado dos digestiones, de la siguiente forma: - En el caso de la digestión con EcoRI: En el eppendorf se añade 1 L del plásmido pCMVmKate, 0.5 L de la enzima EcoRI, 0.5 L de Green buffer y 3 L de agua mQ. En este caso, como se ve en el mapa de restricción, usando únicamente esta enzima, conseguimos la linealización del plásmido, con un tamaño total de 4684 pb. - En el caso de la digestión con EcoRI + HindIII: En el eppendorf se añade 1 L del plásmido pCMVmKate, 0.5 L de la enzima EcoRI, 0.5 L de la enzima HindIII, 0.5 L de Green Buffer y 2.5 L de agua mQ. Usando ambos enzimas, se obtienen dos fragmentos, el correspondiente al inserto mKate2, (gen que codifica la proteína mKate2, una proteína fluorescente roja), con un tamaño de 700 pb, y el resto del plásmido, con un tamaño de 3984 pb. 4.2.4 Identificación y análisis de los fragmentos de DNA Para poder identificar los fragmentos de DNA explicados en el apartado 4.2.3, se realiza una electroforesis en gel de agarosa, que como ya se ha explicado en el apartado 4.2.1, nos permite separar los fragmentos únicamente por su diferente peso molecular. El marcador de tamaño NZY Ladder III nos va a permitir hacer una identificación de los fragmentos, gracias a su contenido en bandas de DNA de tamaño perfectamente conocido, cumpliendo un papel de patrón comparativo (ilustración 7, apartado 4.1.2.1) 4.2.5 Determinación y análisis de la concentración y pureza de las muestras de DNA Una vez se ha purificado el plásmido, y hecho las digestiones e identificaciones para comprobar si estaba bien, el siguiente paso es el de determinar la concentración y la pureza de las muestras de 24 plásmidos. Para esto, se realiza un análisis de la absorbancia con el equipo NanoDrop OneC (ThermoScientific), un espectrofotómetro de microgota, que permite realizar ensayos de determinar la pureza de muestras génicas con volúmenes del orden de 2 L. La absorbancia se puede relacionar con la concentración según la ley de Lambert-Beer (ecuación 1): 𝐴 = 𝜀 ∗ 𝑐 ∗ 𝑙 Ecuación 1-Ley de Lambert-Beer Este espectrofotómetro mide en la región del UV-Visible completo, y usa dos lámparas para emitir la radiación: la lámpara de Deuterio para la radiación ultravioleta, y la de Wolframio para la del visible. Para poder seleccionar la longitud de onda deseada, consta de un monocromador, que consta de una rendija de entrada, un sistema dispersante (red de difracción) y una rendija de salida. Este espectrofotómetro es capaz de evaluar las relaciones de absorbancia a dos longitudes de onda diferentes: se va a obtener dos índices de pureza, uno con relación A260/A280 (absorbancia a 260nm en relación a la corregida a 280nm), y otro con relación A260/A230 (absorbancia a 260nm en relación a la corregida a 230nm). Según los valores obtenidos, se puede evaluar la pureza según la tabla 14 (anexo 4). Para llevar a cabo las medidas, primero se depositan 2L de un blanco (en este caso agua mQ) con el fin de disminuir el ruido de fondo, disminuyendo también los límites de cuantificación (LOQ) para poder detectar concentraciones pequeñas con fiabilidad. Después se procede a medir la pureza de las muestras de DNA, con 2 L también, analizando primero las muestras más diluidas (las de segunda elución obtenidas en la purificación del plásmido), y después las más concentradas (las de primera elución). 4.2.6 Crecimiento colonias bacterianas en placas de LB-Agar. Para poder llevar a cabo la bioproducción del polímero scFv(EpCAM)-VOK-H6, previamente se realiza el crecimiento de las colonias bacterianas transformadas con el plásmido que codifica al polímero en un medio sólido, y así poder hacer un primer screening (apartado 4.2.3) y seleccionar la colonia más productora. Con esta se llevará a cabo un segundo screening y con la colonia más productora de este, se iniciará la preparación de la bioproducción. Para esto, se utiliza un gel de LB-Agar en placas Petri. El LB es de por sí solo un medio rico en nutrientes en el que las colonias van a poder crecer. Hay que tener en cuenta el tipo de gen de resistencia a antibiótico que tiene el plásmido que codifica la proteína de interés, con el cuál se transformó la bacteria previamente, ya que estas adquieren esa 25 resistencia. En el caso para el polímero de estudio scFv(EpCAM)-VOK-H6, la resistencia es a la ampicilina, por lo que las placas de LB-Agar seleccionadas van a llevar este antibiótico. Se sembró por agotamiento con la ayuda del mango de Kolle, a partir de un glicerol stock proveniente de una siembra realizada anteriormente con células competentes BLR transformadas con el plásmido p7-scFv(EpCAM)-VOK-H6. Estas placas se dejan durante la noche (es decir, entre 16-18 horas) a 37ºC en una estufa boca abajo para evitar condensaciones y tapadas con papel de aluminio, para que puedan crecer las colonias. Ilustración 7-Ejemplo de una placa de LB-Agar donde se ha llevado a cabo una siembra por agotamiento 4.2.7 Preparación de muestras de electroforesis para SDS-PAGE. Preparación de muestras para la selección de colonias Como se ha explicado en el punto 4.2.2, para poder empezar la bioproducción, hay que llevar a cabo el crecimiento de las colonias bacterianas transformadas. Una vez este paso está hecho, hay que hacer un estudio de estas colonias mediante una SDS-PAGE, para poder seleccionar la más productora de estas, es decir, hay que hacer un primer screening de las colonias. Todos los procesos en los que se trabaja con cultivos bacterianos se llevaron a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. El screening empieza con la selección en la placa de diferentes colonias. Las colonias que se seleccionan tienen que cumplir una serie de requisitos: estar aisladas de otras colonias, no ser de diferentes formas y tamaños entre sí, y no tener satélites (estos son colonias de otras bacterias que crecen alrededor de las colonias que interesan, aprovechándose de la reducción de la presencia de antibiótico en su entorno). 32 4.2.11 Caracterización físico-química del polímero recombinante 4.2.11.1 SDS-PAGE Todo el fundamento de esta técnica esta explicado en el apartado 4.2.1.1. La muestra para el análisis de SDS-PAGE se prepara en una concentración 1mg/mL de agua ultrapura, y se deja disolviendo toda la noche a 4ºC. Se toman 20L de este, y se añaden 5L de tampón de carga. Después se lleva a cabo la electroforesis durante una hora a amperaje constante de 25mA/gel. Esta técnica permite conocer el peso aparente del polímero, con la ayuda de un marcador que actúa como patrón (ilustración 6 del apartado 4.2.1.1). También sirve para poder evaluar el porcentaje de pureza del polímero, con respecto a las impurezas debidas a las degradaciones de este o a la presencia de otras proteínas ajenas. 4.2.11.2 Espectrometría de masas (MALDI-TOF) La espectroscopia de masas es una técnica que nos permite identificar un compuesto conociendo su masa molecular. Con esta técnica, se obtiene un ión molecular, que es el ión de mayor peso molecular, y a su izquierda productos del fraccionamiento de la muestra: Los compuestos van a romper de distinta forma, y estudiando los diferentes fragmentos, puede realizarse la identificación del compuesto. Las etapas de la espectroscopia de masas son: - Ionización (activación): para detectar compuestos por espectroscopia, tiene que estar ionizado, ya que las especies neutras no las detecta. La ionización la llevan a cabo las fuentes de iones. - Extracción (Aceleración): los analitos (iones) tienen que ser extraídos de la fuente de iones para llevarlo al siguiente apartado. Se realiza con aceleración para extraerlos, que se consigue aplicando una diferencia de potencial. - Análisis: se lleva a cabo en el analizador. Se lleva a cabo una diferenciación entre iones formados por la diferente relación masa/carga (m/z) que tengan y así poder separarlos. - Detección: cuando llegan los iones, se genera una corriente iónica, que se transforma en corriente eléctrica, y se obtiene un pico. Entre las diferentes fuentes de iones y analizadores, el MALDI-TOF está compuesto por una fuente de iones MALDI (Desorción/Ionización por Láser Asistida por una Matriz) y un analizador de tiempo de vuelo (TOF). La fuente de iones MALDI permite trabajar en fase condensada (solido o liquido), lo que le hace ideal para realizar espectroscopia de proteínas. Con otras fuentes de iones no era posible ya que no generaban iones en fase gaseosa de proteínas. Se trata de una fuente blanda, es decir, 33 transmite poca energía a la muestra, por lo que genera poca fragmentación. Como su propio nombre indica, es de desorción: genera directamente iones en estado gaseoso sin tener que volatilizar la muestra. Por la parte del detector de tiempo de vuelo, también es idóneo para el análisis de biopolímeros, puesto que tiene un rango de relación masa/carga muy amplia, de hasta 200-300KDa. La prueba se realiza con el equipo Bruker Autoflex Speed (MALDI TOF), perteneciente al Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid. La matriz en la que se preparó la muestra es 2.5-DHAP. 4.2.11.3 ELISA El ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) es una técnica englobada dentro de los enzimoinmunoensayos (EIA). Se basa en el uso de un enzima para detectar la unión de un anticuerpo a un antígeno, con el fin de obtener un producto coloreado. El ELISA se puede realizar de forma directa, indirecta, o tipo Sandwich. Para este experimento, se utiliza el ELISA indirecto, fijando el antígeno EpCAM a la placa, con el fin de poder ver si el polímero con el scFv es funcional, uniéndose o no a este antígeno. Procedimiento: 1. Primero se debe llevar a cabo el Coating, el recubrimiento de la placa Medisorp, de Thermo Fisher, con el que se hace el ELISA. Esto se hace con 200l de una disolución de EpCAM/Trop1, His, Human 1ng/L en tampón NaHCO3/Na2CO3. Para el blanco se usa BSA 1ng/L(Álbumina de suero bovino) en tampón NaHCO3/Na2CO3 . Como control positivo, una disolución de 1ng/L de scFv(EpCAM)-VOK-H6. Esto se deja fijando toda la noche a 4ºC. 2. Al día siguiente, se realizan 3 lavados con 250L de TBS 1x. 3. Se lleva a cabo el bloqueo durante 90 minutos a 37ºC con BSA 5% en TBS, 250L. 4. Se lava de nuevo 3 veces con 250L de TBS 1x. 5. Se añaden 200L de las disoluciones preparadas en diferentes concentraciones, en BSA 0.5% del polímero de interés, y el control negativo, en los pocillos recubiertos con EpCAM. En los que no, TBS 1x. Se incuba 1 hora a 37ºC. 6. Se lava nuevamente 3 veces con 250L de TBS 1x. 7. A continuación, se añade la Biotin-Protein L(GenScript) en concentración 1:50000(v/v) en BSA 0.5%, se deja 1 hora a 37ºC, y después se llevan a cabo 3 lavados con TBS 1x. Después 34 se añade la streptavidina-HRP(GenScript) en concentración 1:100000(v/v) en BSA 0.5%, con el fin de formar el complejo Biotina-streptavidina. Ambos en cantidades de 200L. 8. Se incuba 1 hora a 37ºC, y se lava 3 veces con TBS 1x. 9. Por último, se añade el sustrato, O-Phenylenediamine Dihydrochloride Stable Peroxide, OPD 1x, un sustrato cromogénico, capaz de visualizar la actividad de la enzima peroxidasa del rábano, HRP. Se echan 100L por pocillo. La absorbancia se mide en el equipo SpectraMax® M Series Multi-Mode Microplate Readers (Molecular Devices) a 450nm en el IOBA (Instituto de Oftalmobiología Aplicada de la Universidad de Valladolid). 4.2.11.4 Western Blot El Western Blot es una técnica usada en biología molecular. Para este trabajo, su finalidad es un estudio inmunológico: la detección de impurezas del polímero. Está basado en tres elementos: - Separación de las proteínas por tamaño. - Transferencia a un soporte sólido. - Reconocimiento específico de la proteína objetivo para poder visualizarla. Para el primer paso, se lleva a cabo un SDS-PAGE (apartado 4.2.1.1), utilizando el marcador coloreado de Western Blot PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific) representado en la ilustración 9. Ilustración 9-Marcador de western Blot con los pesos correspondientes a las bandas Una vez ha acabada la electroforesis, llega el paso de la transferencia al soporte sólido: Una membrana PVDF (fluoruro de polivinilideno) (Transfer Membranes; Inmobilon®). En este paso se utiliza un campo eléctrico con el fin de transferir las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana. Para este paso, primero se debe activar la membrana dejándola un minuto en metanol, y después lavándola con el tampón de transferencia. Es muy importante manejar la membrana en todo momento con pinzas. 35 Se monta el módulo de transferencia de la siguiente forma: dos esponjas y un papel de filtro mojados en tampón de transferencia, el gel proveniente del SDS-PAGE, la membrana de PVDF, otro papel de filtro, y 3 esponjas. Se pone en vertical, y se llena de tampón de transferencia. Después se lleva a la cubeta con agua destilada previamente enfriada y hielos (para refrigerar) y se deja 1:30h a 300mA. Una vez acabada la electrotransferencia, se retira la membrana del módulo de transferencia. Por último, se lleva a cabo la detección. Antes de empezar con este paso, se lleva a cabo un bloqueo de la membrana con leche en polvo al 5% en TBST, con agitación orbital de 20rpm, a temperatura ambiente, con el fin de evitar las uniones inespecíficas a la membrana. Como se realizan dos marcajes con dos proteínas diferentes, la membrana se recorta en dos partes una vez ocurrida la electrotransferencia. Es muy importante que la parte de la membrana en la que están las proteínas (la que estaba tocando el gel) este boca arriba. Una vez pasada la hora, se lava la membrana 3 veces con TBST, en periodos de 5 minutos. Después, se añade a una membrana 6x-HisTag Monoclonal Antibody (His.H8), HRP, diluido 1:2000 en TBST con 2% de leche en polvo, que se une específicamente a la cola de histidinas del polímero, y a la otra Biotin- Protein L 1:1000 en TBST con 2% de leche en polvo, que se une a las cadenas ligeras variables del anticuerpo. Esto se deja durante la noche (16-18 horas) a 4ºC con agitación orbital. Al día siguiente, según la proteína usada, se sigue un procedimiento: - 6x-HisTag Monoclonal Antibody (His.H8) - HRP: Se lava con PBST 3 veces, en periodos de 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se revela, añadiendo la solución de DAB 1x. El DAB permite visualizar la actividad de la enzima peroxidasa del rábano (HRP). Esto se incuba 10 minutos en agitación orbital a oscuras. - Biotin-Protein L: se lava con TBST 3 veces. En este caso, como no hay HRP, como en el caso anterior, se añade la streptavidina-HRP en concentración 1:10000 en TBST 0,5% de leche, para formar el complejo streptavidina-biotina, el cual es la interacción biológica no covalente más fuerte que existe. Esto se deja 1 hora incubando con agitación orbital. Después, se siguen los mismos pasos que en el caso anterior. 4.2.11.5 Espectrometría DLS (Dynamic Light Scattering) El DLS (Dynamic Light Scattering) es una técnica que permite analizar el tamaño de partícula mediante la medida del movimiento browniano, el movimiento aleatorio entre las partículas en disolución debido a la interacción con las partículas del solvente. El movimiento browniano depende de la viscosidad del medio, y del tamaño de las partículas, de tal forma que las partículas de mayor tamaño 36 se moverán más lento al interaccionar con las partículas del solvente, y las de menor tamaño, más rápido [25]. La velocidad del movimiento browniano viene dada por el coeficiente de difusión (D). Sabiendo este valor, se puede saber el tamaño de la partícula, puesto que están inversamente relacionados, según la ecuación Stokes-Einstein: 𝐷 = 𝑘𝑇 3𝜋ηd(H) Ecuación 3-Ecuación Stokes-Einstein. Donde k es la constante de Bolztmann, T es la temperatura absoluta, η es la viscosidad del medio, y d(H) es el diámetro hidrodinámico de la partícula [25]. El DLS ha sido usado para medir el tamaño y carga del poliplexo, una nanopartícula formada por la complejación del plásmido purificado (apartado 4.2.2) con el polímero. Para formar este, se han mezclado scFv(EpCAM-VOK-H6) con VOK-H6 en las ratios 2/3, 1/3 y 0/3, con el plásmido en una ratio de 50:1 N/P (N: lisinas presentes en el VOK; P: fosfatos presentes en el plásmido). Esta ratio ha sido optimizada previamente por el grupo Smart Devices for NanoMedicine de la Universidad de Valladolid [26]. Para ello, se han mezclado los componentes en las proporciones que se desean a 4ºC, se agitan con vortex a 25ºC durante 1 minuto, y se incuban a esta temperatura 30 minutos. Las medidas de tamaño y potencial de los poliplexos se llevan a cabo en el Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid, en el equipo Zetasizer Nano Series (Malvern). 4.2.11.6 Espectroscopia de RMN ordenada por difusión, 2D DOSY NMR. Este tipo de espectroscopia busca separar las señales obtenidas por RMN de diferentes especies, según su coeficiente de difusión. Se trata pues, de un experimento donde se realiza una medición de difusión molecular precisa, de forma no invasiva, y útil para biofluidos. Debido justamente a que su objetivo es el de separar las especies presentes espectroscópicamente, se le conoce como “cromatografía de RMN” [27] [28]. En estos espectros, en el eje x se muestra el desplazamiento químico, mientras que en el eje y está el coeficiente de difusión [28]. Este análisis va a permitir comprobar la formación del poliplexo, gracias a la complejación del plásmido pCMVmKate2 con el ELR scFv(EpCAM)-VOK-H6. 37 El experimento se realiza en el espectrómetro de RMN de 500 Hz de Agilent Technologies, perteneciente al LTI (Laboratorio de Técnicas Instrumentales), por técnicos pertenecientes a este laboratorio. 4.2.11.7 Microscopia de fuerza atómica (AFM) La microscopia de fuerza atómica es un tipo de microscopia de sonda de barrido, en la que una punta va barriendo la superficie de la muestra, midiendo las fuerzas de interacción entre estas. Está basado en una punta (tip) en un a microplaca (cantiléver en voladizo) flexible, un fotodetector, un piezoeléctrico que permite que la punta se pueda mover en el eje x, y z, y un láser, cuya radiación incide sobre la superficie del cantiléver. Al hacerse el barrido, se produce una deflexión de la micropalanca, se desviará la incidencia del láser de una forma u otra, esto se detectará en el fotodiodo, y un software cuantifica estas desviaciones, convirtiéndolas en cambios de altura, de las que se obtienen las imágenes. El AFM tiene varios modos de operación [29]: - Contacto continuo entre punta y muestra  Modo contacto (Contact mode)  Medida de fuerzas (Force volumen) - Contacto intermitente entre punta y muestra  Contacto intermitente (Tapping mode)  Contraste de fase (Phase contrast mode) - No contacto entre punta y muestra (Non-contact mode) En este trabajo, el modo de operación usado es Tapping mode. En este modo, se mide la topografía tocando intermitentemente la superficie. El cantiléver oscila a una amplitud y fase constante durante el barrido [30]. Según la interacción de la punta con la superficie, va a haber un desfase, a partir de la cual se obtiene la imagen de fase. La imagen Height Retrace por otro lado, es la imagen generada a partir de la señal que llega al fotodiodo. El último tipo de imagen obtenido con AFM es la imagen de amplitud, imagen sin sentido físico, ya que da una cuantificación del error que se tiene en el registro de la señal. Con esta técnica se han podido obtener imágenes de los poliplexos formados con las ratios de scFv(EpCAM)-VOK-H6 2/3 y 0/3 (es decir, únicamente con VOK-H6). Se usaron dos estrategias distintas de análisis: 38 - 30L sobre una placa de mica equilibrada, con secado directo - 50L sobre una placa de mica equilibrada, con incubación de 45mins y un lavado con agua mQ posterior. El experimento se llevó a cabo con el equipo MFP-3D Infinity Bio, de Oxford Instruments, con la punta AC-160, en el LTI (Laboratorio de Técnicas Instrumentales, Universidad de Valladolid) por el técnico del mencionado laboratorio. Las medidas se realizaron en seco y en modo repulsivo. 5. Resultados y discusión 5.1 Bioproducción de scFv(EpCAM)-VOK-H6. Proceso y optimización El proceso empieza con la construcción del plásmido pET7-scFv(EpCAM)-VOK-H6, que contiene el gen que codifica el polímero denominado scFv(EpCAM)-VOK-H6, previamente sintetizado en el seno del grupo Smart Devices for NanoMedicine de la Universidad de Valladolid. Una vez obtenido el plásmido, se procede a la transformación de una célula competente (BLR), aunque en este trabajo se parte de un glicerol stock de la célula ya transformada. La célula, al tener este plásmido, va a producir la proteína que codifica el gen, el scFv(EpCAM)-VOK-H6. A continuación, vemos su secuencia de aminoácidos: MESLLPVDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVELKRATPSHNSHQVPSAGGPTANSGTSGSEVQLVQSGPG LVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINS LRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPG KGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGK GVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKG VPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVP GKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPG KGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVPGKGVGGGVGHHHHHHGGGGGV En la secuencia se pueden distinguir 3 bloques: en morado, la parte del fragmento de anticuerpo de única cadena o scFv (apartado 2.4), encargado del direccionamiento de la molécula frente a la proteína de membrana EpCAM; en rojo, el bloque denominado VOK y constituido por el pentapéptido repetido: ((VPGKG)72), que complejará a un plásmido formando el correspondiente poliplexo (apartado 2.3); y en verde, la cola de 6 histidinas, que permitirá realizar la purificación del polímero mediante una cromatografía en columna de afinidad con iones metálicos inmovilizados IMAC (apartado 4.2.10). El peso teórico de la proteína quimérica es de 61kDa. 39 La evaluación de la expresión se realiza en una SDS-PAGE (apartado 4.2.11.1) de un primer screening de las diferentes colonias aisladas a partir del glicerol stock en la placa Petri, con el fin de ver cuáles son las más productoras (apartado 4.2.7), que son las que más proteína de interés han producido en un tiempo dado. En la ilustración 10, se muestra la imagen de un primer screening, y de un segundo screening proveniente de las células hijas de la colonia 4 del anterior cultivo. En la ilustración 10 (izda), a parte de las colonias 1-8, se usa un control negativo de otro polímero procedente de una BLR, para poder diferenciar así la proteína deseada, de las propias de la célula. De las colonias seleccionadas para el segundo screening, se selecciona la colonia 8 como la más productora. A partir de esta, comienza el proceso de bioproducción (apartado 4.2.8) que se repetirá tres veces. Se realizan dos producciones iniciales a 37ºC con la diferencia de que, en la segunda, se realiza la producción en erlenmeyers con deflactores. Mientras que, en la tercera producción, la inoculación se realizó a primera hora, dejando la producción 6 horas a 37ºC con agitación, y posteriormente, traspasándolo a 4ºC con agitación durante el fin de semana, en erlenmeyers con deflactores. La turbidez alcanzada en las diferentes producciones realizadas se puede ver en la tabla 3. Estas absorbancias sirven para llevar un seguimiento de la cantidad de células que se obtiene: Tabla 3-Valores de la absorbancia obtenidos en las tres producciones llevadas a cabo. La primera y segunda, llevada a cabo como en el apartado 4.2.8, la tercera, diferente: se deja a 4ºC durante el fin de semana Absorbancia 600nm 1º producción 2º Producción 3º Producción Control 3.6 3.41 -- Inóculo 2.3 2.16 -- Muestra 8:00am 4.04 4.06 -- Muestra 8:30am 3.7 3.07 4.67 Ilustración 10-SDS-PAGE del primer (izquierda) y segundo (derecha) screening del biopolímero recombinante scFv(EpCAM)-VOK-H6. Se señala en rojo, la banda correspondiente al polímero scFv(EpCAM)-VOK-H6. 40 La disminución en las absorbancias de las 8:30 es consecuencia de parar la producción justo al final del ciclo de vida de la bacteria. En las dos producciones llevadas a 37ºC por la noche tienen una absorbancia similar. En la que se realiza a 4ºC durante el fin de semana, se puede observar una absorbancia superior por lo que ha habido un mayor crecimiento celular. Para comprobar el éxito de la producción se realiza una electroforesis SDS-PAGE (apartado 4.2.11.1) (ilustración 11). Ilustración 11-Producciones del scFv(EpCAM)-VOK-H6. Izquierda: primera producción en flask sin deflactores a 37ºC durante la noche. Centro: segunda producción en flask con deflactores a 37ºC durante la noche. Derecha: Tercera producción a 4ºC durante el fin de semana en flask con deflactores. Señalado en rojo, el polímero scFv(EpCAM)-VOK-H6. En la ilustración 11 (izquierda y centro), se puede ver bien la diferencia en la intensidad de banda procedente de las muestras tomadas a las 8 y 8:30am, con respecto a la del inóculo: en las primeras hay mucha más producción que en la del inóculo. Esto es consecuencia de la autoinducción de la proteína. En el caso del inóculo, en el medio de cultivo, se añade glucosa, y tal como se explica en el apartado 4.2.8, es un inhibidor del promotor de la lactosa, y en presencia de esta, no va a empezar a producir. Sin embargo, en los medios de cultivo para la producción, no se añade glucosa, y las bacterias podrán producir el polímero. Se puede ver que con deflactores (ilustración 11 centro), se obtiene una producción del polímero mayor (la banda es mucho más intensa) a la que se hace sin deflactores (ilustración 11 izqda), debido a la mayor aireación obtenida con estos a pesar de que los crecimientos celulares fueron similares. Por otro lado, en la tercera producción llevada a cabo a 4ºC durante el fin de semana, a pesar de haberse obtenido un mayor número de células (tabla 3), la producción es inferior que las realizadas a 37ºC durante la noche, en especial a la de la segunda producción, la cual se considera como la mejor producción y por tanto las condiciones óptimas de expresión. 41 5.2 Purificación de scFv(EpCAM)-VOK-H6 Tras el cosechado celular y su posterior lavado, las bacterias fueron lisadas por sonicación (apartado 4.2.9), y centrifugadas. Se analizaron tanto el sobrenadante resultante como sus restos celulares en el pellet. Como puede observarse en la ilustración 12, la banda correspondiente al polímero se encuentra en el pellet, donde se ha acumulado en forma de cuerpos de inclusión. Para solubilizar estos cuerpos de inclusión, se añaden sales de guanidina 3M, que desnaturalizan las proteínas, al romper todas las interacciones no covalentes (apartado 2.2.1). Tras el tratamiento durante 16-18 horas a 4ºC, se clarifica por centrifugación y se analizan por SDS-PAGE ambas fracciones. En la ilustración 12 se observa cómo la banda del polímero se encuentra en el sobrenadante tras este paso. Ilustración 12-Analisis por SDS-PAGE del lisado por sonicación de las bacterias y extracción de los cuerpos de inclusión con sales de guanidina 3M. A la izquierda, primera producción: en las calles 1 y 2 se ve el pellet y el sobrenadante de sonicado en ese orden; en la 3 y en la 4, el pellet y el sobrenadante de sales de guanidina 3M. En el centro, segunda producción: en las calles 1 y 2 se ve el sobrenadante y el pellet de sonicado; en la 3 y en la 4, el sobrenadante y el pellet con sales de guanidina 3M. A la derecha, tercera producción: en las calles 1 y 2 se ve el sobrenadante y el pellet de sonicado; en la 3 y en la 4, el sobrenadante y el pellet de sales de guanidina 3M. Señalado en rojo, la banda correspondiente al polímero scFv(EpCAM)-VOK- H6 Una vez confirmada la presencia del polímero en el sobrenadante, se lleva a cabo su purificación mediante cromatografía en columna de afinidad IMAC, tal y como se explica en el apartado 4.2.10: se realiza en un gradiente negativo de sales de guanidina (desde 3M a 0M), que permite al scFv plegarse correctamente hasta su forma funcional (proceso conocido como refolding proteico). Una vez eliminado cualquier resto de sales de guanidina, se realiza la elución del biopolímero con una concentración de imidazol de 250mM. La primera purificación se realizó según se relata en el apartado 4.2.10, cargando el polímero disuelto en la columna que contiene la resina mediante una bomba peristáltica durante la noche. Sin embargo, en el caso de las segunda y tercera producciones se cargó la muestra en método Batch: sobre 2mL de resina, se añadió la muestra y tampón de equilibrado a partes iguales, y se incubó con la resina con agitación orbital suave toda la noche. Posteriormente la resina se empaquetó en la columna, recogiendo el sobrenadante denominado no retenido (Flow-Through) y lavando la columna con 48 En el caso donde la detección se llevó a cabo con Protein L (Ilustración 19 Izquierda), se visualiza básicamente una banda intensa, correspondiente a scFv(EpCAM)-VOK-H6, puesto que es el único que contiene el lugar de reconocimiento para esta molécula en el bloque del scFv. En este caso se observan otras bandas inferiores, débiles y poco definidas por lo que pueden deberse a interacciones inespecíficas por parte de los componentes del Western Blot (Protein L o Streptavidin), puesto que estas bandas no aparecen ni en el SDS-PAGE (Ilustración 16), ni en el espectro de masas (Ilustración 18). En el análisis con 6x-HisTag mAb (Iilustración 19.dcha) se puede observar un mayor número de bandas intensas y nítidas. La banda mayoritaria sigue apareciendo a la altura de la molécula intacta de scFv(EpCAM)-VOK-H6, pero dado que este mAb se une especificamente a la cola de histidinas del extremo carboxilo, le permite poder detectar también las posibles degradaciones del bloque scFv que conservan ese extremo. Gracias a este experimento, puede confirmarse que todas las impurezas visualizadas en el SDS-PAGE (Ilustración 17) se corresponden con degradaciones del polímero de interés por su extremo amino terminal (es decir, la parte correspondiente al scFv), que sin embargo no son detectadas por la protein L al no tener las cadenas  ligeras que reconoce esta molécula. Entre ellas se incluye la banda de VOK-H6 que aparece en el MALDI (Ilustración 18) y el pico minoritario de 47.45kDa claramente visible en la segunda preparación y que ahora tiene una movilidad similar a la banda de 55kDa del marcador por efecto del retraso electroforético indicado anteriormente. 5.4.2 Caracterización funcional de scFv(EpCAM)-VOK-H6 5.4.2.1 Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay, ELISA La técnica inmunológica ELISA nos permite comprobar la funcionalidad biológica del polímero, como se ha explicado en el apartado 4.2.11.3, al detectar la molécula EpCAM frente a la que debería unirse el scFv de nuestro biopolímero en caso de que el replegamiento cromatográfico hubiera tenido éxito. En primer lugar, se realizó un ELISA con el polímero obtenido en el primer lote para definir las concentraciones idóneas. Se hizo con las siguientes condiciones de partida: para el bloqueo, BSA 2%. Las disoluciones madre del polímero scFv(EpCAM)-VOK-H6 y su control negativo, en este caso VOK-H6 (fragmento del polímero catiónico), era de 50 ng/ml. La Biotin-Protein L se usó a 1:20000, y la streptavidina-HRP a, 1:50000. Con estas condiciones (Condiciones A), se obtuvo la siguiente gráfica (Ilustración 20) variando las concentraciones de los biopolímeros y realizando la normalización de los datos en un parámetro Z (Anexo 1): 49 Ilustración 20-Gráfica del primer ELISA realizado con el polímero obtenido en la primera producción, en condiciones A, con un control negativo de VOK-H6, un polímero catiónico. Como se observa, la señal del polímero específico alcanza la saturación a concentraciones muy bajas y en un lapso de revelado demasiado rápido, por lo que se decide repetir el experimento reduciendo las concentraciones de Biotin-Protein L y streptavidina-HRP, a 1:50000 y 1:100000 respectivamente (Condiciones B). También se observa que el control negativo (VOK-H6) genera una señal excesiva, esto se debe a interacciones inespecíficas, ya que ambos polímeros son estructuralmente parecidos. Por tanto, se prueba en el siguiente ELISA la etapa de bloqueo con BSA 5%. Ilustración 21-Gráfica de un segundo ELISA del polímero procedente de la primera producción, en las condiciones B En el ELISA con nuevas condiciones (Ilustración 21), la señal específica no alcanza el máximo de absorbancia como antes y el control negativo reduce claramente su señal por lo que se asumen estas condiciones en los siguientes ELISAs. Con el polímero obtenido de la segunda producción, se realiza el ELISA con las condiciones B, pero usando un control negativo estructuralmente diferente: un polímero tipo elastina aniónico sin bloque adicional. En la ilustración 22, se puede visualizar la gráfica correspondiente a este ELISA. 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 0 0,5 1 Abs450nm Z ScFV(EpCAM)- VOK-H6 VOK-H6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 0,5 1 Abs450nm Z ScFV(EpCAM)- VOK-H6 VOK-H6 50 Ilustración 22-Gráfica del ELISA del polímero procedente de la segunda producción, con las condiciones B, y un control negativo de un polímero aniónico La señal específica se ve que llega a su valor máximo a concentraciones bajas. Esto no es preocupante con respecto al anterior experimento, puesto que se trata del polímero obtenido de otra producción. En el caso del control negativo, la señal es prácticamente nula: no hay ningún tipo de interacción inespecífica. Con esto se puede confirmar que la señal obtenida al usar como control negativo VOK-H6, eran efectivamente por interacciones inespecíficas al ser estructuralmente parecido al polímero scFv(EpCAM)-VOK-H6. Con el fin de comprobar comparar los polímeros de las tres producciones, se lleva a cabo un último ELISA, en las condiciones B (Ilustración 23) y con los valores de las concentraciones normalizadas según el grado de pureza calculado (Tabla 6). El control negativo analizado volvió a ser el polímero catiónico de los dos primeros ELISA. Ilustración 23-Gráfica del ELISA comparativo de los polímeros obtenidos en las tres producciones. Todos los valores se normalizaron con los porcentajes de pureza del polímero de cada producción. Como puede observarse, las señales observadas con las tres preparaciones de los biopolímeros son claramente similares y las diferencias mínimas pueden deberse al error intrínseco de la técnica que podrían minimizarse repitiendo el ensayo varias veces. La señal observada con el bloque polimérico -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 0,5 1 Abs450nm Z ScFV(EpCAM)- VOK-H6 Polímero aniónico 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 0,5 1 Abs 450nm Z ScFV(EpCAM)- VOK-H6 1º producción ScFV(EpCAM)- VOK-H6 2º producción ScFV(EpCAM)- VOK-H6 3º producción VOK-H6 51 se mantuvo a niveles bajos debido a una interacción básicamente inespecífica. Con todo ello podemos afirmar que la efectividad del fragmento de anticuerpo en los biopolímeros aislados respecto al reconocimiento del antígeno específico (EpCAM) son semejantes y que el procedimiento de purificación puede ser mejorado en el aspecto de la degradación proteolítica, pero muestra una alta consistencia respecto a la actividad biológica. 5.5 Caracterización del poliplexo Una vez finalizada la caracterización de los polímeros se procede a la formación del correspondiente poliplexo, y a su caracterización físico-química, y funcional. El poliplexo se forma mediante la complejación del plásmido pCMVmKate2, de peso molecular 2845219.5 g/mol y 4684pb de longitud, con el polímero producido y caracterizado scFv(EpCAM)-VOK-H6, y el polímero VOK-H6. Para ello, se utiliza el polímero obtenido en la tercera producción (ilustración 16 derecha), ajustando las proporciones con biopolímero VOK-H6 sintetizado previamente en el grupo de investigación para obtener unas relaciones de scFv(EpCAM)-VOK-H6/VOK-H6 de 2/3, 1/3 y 0/3(apartado 4.2.11.5). Este último se forma exclusivamente con VOK-H6, con el fin de hacer una comparación de poliplexos con scFv y otros sin él. Las tres relaciones de biopolímero se mezclan con el plásmido aislado manteniendo una relación de grupos amino/grupo fosfato de 50:1, según la proporción previamente optimizada por el grupo Smart Devices for NanoMedicine [31] . 5.5.1 Caracterización físico-química del poliplexo 5.5.1.1 Dynamic Light Scattering, DLS En esta técnica se analiza el diámetro hidrodinámico (d.H), carga superficial (Potencial Z) y la estabilidad del poliplexo formado con las tres condiciones descritas anteriormente. También se realiza una medida del tamaño del plásmido para poder comparar el antes y el después de haber sido complejado. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 7 mientras que en las ilustraciones 24 y 25 se exponen las representaciones gráficas de las distribuciones de tamaños y cargas obtenidos mediante esta técnica. 52 Tabla 7 - Valores obtenidos del poliplexo con DLS de tamaño y potencial Z para las tres condiciones y tamaño del plásmido pCMVmKate sin complejar. * Valor extraido de la bibliografía [32]. Tamaño (nm) Potencial Z (mV) A (2/3 scFv-VOK-H6/VOK-H6) 235.9 +16.79 B (1/3 scFv-VOK-H6/VOK-H6) 234.6 +21.45 C (0/3 scFv-VOK-H6/VOK-H6) 271.0 +36.56 Plásmido pCMVmKate2 1576.5 <-50* Como puede observarse, entre los poliplexos formados con scFv(EpCAM)-VOK-H6 no hay diferencia apreciable de tamaño mientras que el formado únicamente con VOK-H6 presenta un diámetro hidrodinámico superior. Por otro lado, los poliplexos con scFv(EpCAM)-VOK-H6 tienen una distribución de tamaños inferior al otro, por eso en la curva de la ilustración 24, se ven curvas más finas que en el caso del VOK-H6, con una distribución de tamaños muy amplia según su curva gaussiana. También se observa como el plásmido sin complejar tiene un tamaño muy superior (1.5 m) a todos los poliplexos y la carga negativa es claramente muy elevada. Con este dato se puede entender el nivel de condensación alcanzado gracias a la complejación. Ilustración 24-Gráfica de los tamaños del poliplexo para las tres condiciones usadas y del plásmido pCMVmKate2 Por otro lado, el potencial Z, que da una idea de la carga superficial de la partícula, debe tener un valor suficientemente positivo para poder interaccionar con las membranas de la célula y así poder entrar en esta. También, debe tener un valor lo más alejado de 0, así serán más estables los poliplexos: se repelen entre sí, y tienen menos tendencia a asociarse. En estos valores se aprecia más diferencia entre las dos ratios con scFv(EpCAM)-VOK-H6, donde se puede observar que la carga positiva expuesta es inversamente proporcional a la cantidad de scFv presente en su superficie. El poliplexo formado -10 0 10 20 30 40 50 0 500 1000 1500 2000 intensidad tamaño (d.nm) Tamaño de la partícula Plásmido poliplexo 2/3 scFv(EpCAM)-VOK-H6 poliplexo 1/3 scFv(EpCAM)-VOK-H6 poliplexo 0/3 scFv(EpCAM)-VOK-H6 53 exclusivamente con VOK-H6 será el más estable de los 3 con una carga de +36.5mV en su superficie. Cuando aumenta la cantidad de scFv se enmascara la carga positiva del VOK-H6, pero al mismo tiempo se reduce el efecto de repulsión y se estrecha la curva del tamaño obteniendo partículas más compactas. Ilustración 25-Gráfica del potencial Z de los poliplexos obtenidas en las tres condiciones En conclusión, se puede afirmar que la ratio 1/3 es el que mejor resultado da, puesto que en ambos casos el tamaño es parecido, pero el potencial Z es ligeramente superior que en el 2/3, lo que quiere decir que los poliplexos serán más estables y potencialmente más eficaces. 5.5.1.2 Espectroscopia de RMN ordenada por difusión, 2D DOSY NMR. No se llegaron a obtener resultados concluyentes de este experimento, debido a la baja concentración de la muestra en las disoluciones, que dificultaba mucho la obtención del DOSY, al no poderse discernir bien las señales. Por falta de tiempo, no se pudo repetir el experimento a tiempo, con unas muestras con una concentración más adecuada. 5.5.1.3 Atomic Force Microscoscopy, AFM En las siguientes ilustraciones, se pueden observar las diferentes imágenes obtenidas mediante las dos estrategias descritas en el apartado 4.2.11.6. Como se ha explicado en este apartado, se obtienen 3 tipos de imagen: la imagen de amplitud, la imagen de fases, que da una idea del cambio de fase en la superficie cuando se produce un desfase en -100000 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 -10 0 10 20 30 40 50 Conteo total Potencial Z(mV) poliplexo 2/3 ScFV(EpCAM)- VOK-H6 poliplexo 1/3 ScFV(EpCAM)- VOK-H6 poliplexo 0/3 ScFV(EpCAM)- VOK-H6 54 la oscilación del cantilever consecuencia de la interacción de la punta con la superficie, y la imagen de Height Retrace, que es la imagen obtenida a partir de la señal que llega al fotodiodo. La escala de rojos que se ve en esta imagen, que difiere de la escala de grises observadas en las otras dos, es una modificación de la imagen para que sea mas visual. De esta imagen se obtiene la reconstrucción 3D, donde puede verse de forma mas exacta la altura. Esta altura no es la que tiene el poliplexo en realidad, puesto que en las proteínas se produce una adsorción con la mica, y eso se traduce en un descenso de la altura. Ilustración 26-Imágenes obtenidas con AFM del poliplexo formado con 2/3 de scFv, utilizando las dos estrategias de análisis: secado directo, e incubación durante 45 min y lavado con agua mQ En las imágenes obtenidas mediante secado directo del poliplexo formado por 2/3 de scFv(EpCAM)-VOK-H6, se observa la agregación de dos poliplexos. En las obtenidas después de haber lavado con agua mQ, se pueden visualizar poliplexos aislados. Los tamaños, alrededor de 150nm, son inferiores a los obtenidos por Poliplexo 2/3 ScFV Secado directo Incubación 45min y lavado con agua mQ Imagen de amplitud Imagen de fases Height retrace Imagen de amplitud Imagen de fases Height retrace Imagen de amplitud Imagen de fases Height retrace Imagen de amplitud Imagen de fases Height retrace Reconstrucción 3D Height retrace 55 DLS, pero es debido al proceso de secado al que se ha sometido la muestra con el fin de que los poliplexos se queden adheridas a la superficie de la mica [33]. Además, son dos técnicas distintas, ya que en el DLS lo que se mide es el diámetro hidrodinámico, y en este se observa una imagen 3D del poliplexo. Ilustración 27-Imágenes obtenidas con AFM del poliplexo formado con 0/3 de scFv, utilizando las dos estrategias de análisis: secado directo, e incubación durante 45 min y lavado con agua mQ. En este caso, los poliplexos tienen un tamaño inferior al obtenido con DLS, que como se ha explicado antes, no es preocupante, puesto que son dos técnicas diferentes, y en el DLS el experimento se realiza en disolución, mientras que aquí se realiza un secado, que provoca que los poliplexos se compacten. Poliplexo 0/3 ScFV (solo con VOK-H6) Secado directo Imagen de amplitud Imagen de fases Height retrace Imagen de fases Height retrace Reconstrucción 3D Height retrace Imagen de amplitud Imagen de fases Height retrace Height retrace Imagen de amplitud Imagen de fases Reconstrucción 3D Height retrace Incubación 45min y lavado con agua mQ Reconstrucción 3D Height retrace Imagen de amplitud 56 5.5.2 Caracterización funcional del poliplexo 5.5.2.1 Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay, ELISA Con este ELISA se pretende comprobar la funcionalidad de los poliplexos en las tres condiciones, con 2/3, 1/3 y 0/3 de scFv(EpCAM)-VOK-H6. Las condiciones que se utilizan son las descritas en el apartado 5.4.2.1, condiciones B. Se normalizaron los datos de concentración con el parámetro Z: Ilustración 28-ELISA llevado a cabo con los poliplexos formados con 2/3, 1/3 y 0/3 de polímero con scFv, Este último cumple la función de control negativo, puesto que no tiene ningún tipo de especificidad por EpCAM al estar formado únicamente con VOK-H6 Se puede observar que la mayor señal se obtiene con el poliplexo formado con 1/3 de scFv(EpCAM)- VOK-H6. Se intuye que la razón es debido a su menor concentración de scFv con respecto al poliplexo con 2/3 de scFv(EpCAM)-VOK-H6, puesto que, en estas condiciones, sufre un efecto estérico menor, lo que le dota de una mayor eficiencia de unión a EpCAM. Habría que llevar a cabo otro estudio con poliplexos formados con menor concentración de scFv(EpCAM)-VOK-H6, con el propósito de obtener la mejor relación scFv(EpCAM)-VOK-H6/VOK-H6. El poliplexo formado con 0/3 de scFv(EpCAM)-VOK-H6, da una señal mucho más baja debido posiblemente a interacciones inespecíficas. Esto era un resultado esperado, dado que este poliplexo no contiene moléculas de scFv que le permitan unirse específicamente a la molécula de EpCAM. Cabe destacar que el punto obtenido en Z=0.5 (a una concentración de 0.77ng/L), es ya significativo, puesto que se puede empezar a observar una diferencia entre las señales marcada. Con este experimento queda confirmada la funcionalidad del poliplexo, puesto que se une de forma específica a EpCAM, por lo que puede ser una estrategia exitosa en las terapias génicas dirigidas. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Abs450nm Z Poliplexo con 2/3 ScFV Poliplexo con 1/3 ScFV Poliplexo con 0/3 scFV 57 6. Conclusiones 1-Se ha llevado a cabo la producción del polímero quimérico scFv(EpCAM)-VOK-H6 usando dos condiciones: una primera producción en un cultivo de 5.6L, en condiciones de temperaturas de 37ºC durante la noche, y una segunda producción en un cultivo de 1.6L, pero incubando primero durante 6 horas a 37ºC, y luego llevándolo a 4ºC durante un fin de semana. En ambos casos se ha llevado un control exhaustivo de los parámetros que lo regían. El rendimiento obtenido ha sido mucho mejor en las condiciones de 4ºC durante un fin de semana: a pesar de que en estas condiciones la producción de las bacterias era inferior, el crecimiento bacteriano era superior. 2-La purificación de este ELR se ha realizado mediante una cromatografía de afinidad. La carga de la muestra se he llevado a cabo en columna, y en método Batch. Las diferencias de rendimiento en ambos casos no son muy significativas, por lo que ambos métodos son igual de válidos. 3- Se ha realizado una caracterización físico-química y funcional del polímero en la que se ha podido comprobar la existencia de degradaciones en el bloque correspondiente al fragmento proteico scFv. Sin embargo, estas impurezas no solo no impiden la formación del poliplexo, si no que se tienen en cuenta para disminuir la cantidad de scFv y los impedimentos estéricos que pueda causar. También se ha confirmado la funcionalidad del polímero mediante un ELISA. 4- Se ha comprobado que el polímero scFv(EpCAM)-VOK-H6 es eficaz a la hora de complejar el plásmido pCMVmKate2, formando un poliplexo, que se ha caracterizado física y funcionalmente. Mediante la técnica DLS se obtuvo un diámetro hidrodinámico en torno los 230 nm, mientras que con AFM, se obtuvo un tamaño de 150 nm. Esto es debido al secado previo al que se somete la muestra en el caso del AFM. Dado que el tamaño del plásmido es de 1576.5 nm, se puede confirmar la gran capacidad de complejamiento que posee el ELR. 5-Se ha confirmado mediante un ELISA la funcionalidad de del poliplexo, y que a mayor cantidad de scFv, menor eficiencia debido a impedimentos estéricos. Por lo tanto, se puede afirmar que el ELR producido podría tener futuro en aplicaciones biomédicas, ya que es capaz de formar un poliplexo funcional mediante la complejación de un plásmido con funciones terapéuticas. 7. Perspectivas de futuro Dada la degradación observada a lo largo del proceso de purificación del ELR scFv(EpCAM)-VOK-H6, habría que llevar a cabo una optimización de este proceso, con el fin de reducir aún más el efecto de las proteasas, o probar con otras cepas bacterianas que carezcan de estas. 64 ELISA poliplexos Tabla 12- Datos ilustración 28 del ELISA llevado a cabo con los poliplexos. Estos se disolvieron con las concentraciones descritas en la primera celda. Las medidas se realizaron por duplicado. En este caso, como se pretende saber cuál de los tres tiene mayor eficiencia, no se tiene en cuenta el porcentaje de scFv para obtener la gráfica. Aun así, se llevó a cabo una normalización de los datos. C(ng/L) z Abs 2/3 Desviación estándar Abs 1/3 Desviación estándar Abs 0/3 Desviación estándar 0.008 0.000 0.009 0.004 0.016 0.007 0.004 0.010 0.015 0.005 0.009 0.000 0.007 0.000 0.004 0.010 0.077 0.045 0.010 0.001 0.025 0.004 0.006 0.009 0.153 0.095 0.024 0.001 0.044 0.004 0.022 0.029 0.766 0.497 0.083 0.027 0.239 0.000 0.026 0.031 1.533 1.000 0.192 0.025 0.497 0.030 0.041 0.052 Anexo 2 Tabla 13-Cantidades para el SDS-PAGE. Resolving Gel Stacking Gel 7.5% 10% 12% 15% 4% mQ 4.10mL 3.62 mL 3.25mL 2.69mL 1.585 mL Tris pH 8,8 1,5M 1.88mL 1.88 mL 1.88mL 1.88mL Tris pH 6,8 0,5M 0.625mL Acrilamida 1.40mL 1.875 mL 2.25mL 2.81mL 250 L SDS 10% 75L 75L 75L 75L 18.75L PSA 10% 37.5L 37.5L 37.5L 37.5L 18.75 L TEMED 3.75L 3.75L 3.75L 3.75L 2.35L 65 Anexo 3 Ilustración 29-Mapa de restricción del plásmido pCMVmKate, con los puntos de corte de las enzimas EcoRI y HindIII indicados Anexo 4 Tabla 14-Grados de pureza según los valores de absorbancia en muestras de DNA obtenidos con el NanoDrop OneC Relación Valor (Uds. Absorbancia) Pureza A260/A280 ≥1.8-2.1 DNA de pureza óptima ≥1.6-1.7 DNA de pureza aceptable <1.6 Presencia de compuestos aromáticos >2.1 DNA contaminado con RNA A260/A230 >2-2.2 DNA de pureza óptima >1.8 DNA de pureza aceptable <1.8 DNA contaminado con sales, fenoles, hidratos de carbono <1.5 DNA altamente contaminado con sales, fenoles, hidratos de carbono