Métodos de análisis del plexo nervioso

FACULTAD DE CIENCIAS Grado en Óptica y Optometría MEMORIA TRABAJO FIN DE GRADO TITULADO MÉTODOS DE ANÁLISIS DEL PLEXO NERVIOSO Presentado por: Alba Caballero Santana Tutelado por: Pilar Cañadas Suárez Tipo de TFG: Revisión En Valladolid a 24 de Mayo, 2019 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 2 ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………………………………3 1.INTRODUCCIÓN .........................................................................................................4 1.1 Córnea………………………………………………………………………....…..4 1.2 Inervación corneal ……………………………………………………….……….5 1.3 Importancia de la inervación corneal …………………………………………..6 1.4 Evaluación del plexo nervioso…………………………………………..………6 1.5 Parámetros del plexo nervioso…………………………………………..……...7 1.6 Importancia de los métodos de análisis………………………………….…...10 2. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………...……………11 2.1 Material necesario…………………………………………………………...…..11 3. RESULTADOS…………………………………………………………………………….12 3.1 Artículo: Reconocimiento automático de las estructuras nerviosas corneales en imágenes de microscopía confocal…………………………..…….12 3.2 Artículo: Cuantificación y segmentación de los nervios corneales y parámetros morfológicos para la detección temprana de la neuropatía diabética……………………………………………………………………………....13 3.3 Artículo: Análisis automático de la neuropatía diabética periférica utilizando la morfología multiescala de fibras nerviosas corneales en imágenes de microscopía confocal………………………………………………...14 3.4 Artículo: Evaluación automática de la tortuosidad del nervio corneal en imágenes in vivo de microscopía confocal………………………………..………15 3.5 Artículo: Repetibilidad de imágenes de la córnea con microscopía confocal para cuantificar la morfología del nervio corneal………………………16 3.6 Artículo: Base estandarizada de densidad del plexo nervioso corneal humano para investigaciones clínicas con microscopia confocal laser in vivo..17 3.7 Artículo: Diagnóstico y cuantificación del plexo nervioso subbasal en voluntarios sanos y pacientes diabéticos con o sin retinopatía…………………18 3.8 Artículo: Análisis morfométrico automatizado, semiautomatizado y manual del plexo nervioso subbasal corneal en individuos con y sin diabetes.18 3.9 Artículo: Técnica rápida y eficiente para el rastreo automático de nervios cornales en microscopía confocal………………………………………………….19 3.10 Artículo: Un sistema de segmentación del nervio totalmente automatizado y análisis de parámetros morfométrico para el diagnóstico precoz de la neuropatía diabética a partir de imágenes corneales………...…..20 3.11 Artículo: Cuantificación de la tortuosidad del plexo nervioso subbasal de la córnea mediante una escala multidimensional………………………………...21 3.12 Artículo: Análisis del plexo nervioso subbasal de la córnea mediante el uso de un nuevo software…………………………………………………………..22 4. DISCUSIÓN...............................................................................................................23 5.CONCLUSIONES ......................................................................................................25 6.BIBLIOGRAFÍA .........................................................................................................26 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 3 RESUMEN Justificación y objetivos: El análisis del plexo nervioso corneal tiene gran importancia clínica debido a la afectación que sus parámetros tienen en diferentes patologías o procesos refractivos. Por lo tanto, el objetivo del estudio es el análisis de los diferentes métodos para analizar el plexo nervioso para determinar el proceso más eficaz tanto en el rastreo de nervios como en la rapidez del procesamiento. Material y métodos: Se realizó el análisis de 12 artículos relacionados con el rastreo de nervios del plexo nervioso, realizando una búsqueda sistemática en fuentes bibliográficas tanto en libros como bases de datos. La búsqueda se realizó en español y en inglés para la obtención de los artículos más actuales y relacionados con el trabajo. Resultados: Se analizó de forma individual cada artículo, realizando un resumen y determinado los métodos utilizado en cada artículo, así como los parámetros analizados. Conclusiones: Se comprobó la importancia del análisis del plexo nervios debido a su relación con la alteración de sus parámetros producidos por diferentes patologías y procesos refractivos. Siendo el método automático el más eficaz tanto en determinación de parámetros como en el tiempo de procesamiento, pudiendo incluirse como parámetro en la clínica diaria. Palabras clave: plexo nervioso subbasal corneal, microscopía confocal corneal y parámetros del plexo nervioso. ABSTRACT Purpose: Corneal nerve plexus analysis has great clinical value due to the affectation of its parameters in the different pathologies or refractive processes. The purpose of the study is the analysis of the different methods to analyze the corneal nerve plexus available to determine the most effective method in nerve tracking and in the speed of processing. Material and methods: 12 articles related to nerve tracking of the nerve plexus were reviewed, conducting a systematic search in bibliographic sources as books and databases. The search was conducted in Spanish and English to find the most current articles. Results: Each article was analyzed individually, doing a summary and determined the methods used, as well as the parameters analyzed. Conclusion: It was verified the importance of the analysis of the nervous plexus due to its relation with the alteration of its parameters produced by different pathologies and refractive processes. Being the automatic method the most effective, being able to be included as a parameter in the daily clinic. Keywords: subbasal nerve plexus, confocal microscopy and nerve plexus parameters. Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 4 1. INTRODUCCIÓN 1.1 CÓRNEA La córnea está formada por diferentes capas que contribuyen al mantenimiento de su transparencia, pero esta organización se modifica periféricamente en la región del limbo.1 Histológicamente, la córnea se puede dividir en cinco capas, desde la parte externa a la interna. - Epitelio: es una capa estratificada escamosa no queratinizada que constituye el 10 % del grosor total de la córnea, formada por 5 o 6 capas de células que aumenta a 8-10 en su zona periférica. Es una capa que se renueva continuamente a lo largo de la vida gracias a la población de células madre del limbo esclerocorneal. Su capa más superficial presenta microvellosidades.1,3,4 El epitelio está compuesto por tres estratos celulares: o Las células basales: son células cilíndricas con un núcleo redondeado u oval y paredes sinuosas que se adhieren firmemente entre ellas y con la membrana basal epitelial mediante hemidesmosomas y tonofibrillas. o Células aladas: forman 3 o 4 capas de células aladas, con un núcleo ovalado uniéndose mediante uniones tipo desmosoma y tipo GAP. o Células superficiales: son células escamosas planas superpuestas en las que desaparecen los núcleos y presenta prolongaciones digitales en la superficie para el mantenimiento de la película lagrimal. La adherencia a la membrana basal mediante los hemidesmosomas restringe el paso de líquido a través de esta capa. Las uniones de las diferentes células se consiguen mediante uniones estrechas, uniones adherentes y uniones GAP (permiten el paso de iones y pequeñas moléculas solubles en agua).4 - Membrana de Bowman: es una capa fibrilar sin componente celular que está íntimamente relacionada con las capas superficiales del estroma, lo que imposibilita su separación. El margen anterior limita con la membrana basal del epitelio mientras que el margen posterior esta formado por fibras de colágeno entremezcladas aleatoriamente con el estroma. Microscópicamente se puede observar que son fibrina de colágeno delgado y corto.1,2,3 - Estroma: construye un 90% del espesor total de la córnea, con un grosor aproximado de 500 micras. Es una capa formada por fibras colágenas, células del estroma y la matriz extracelular. Las fibras de colágeno se disponen en haces paralelos entre si formando una malla paralela a la superficie corneal (figura 1). La malla se forma por láminas entretejidas se cruzan entre sí en ángulo recto de forma regular formando lamelas en red, de forma que cada lamina recorre el largo de la córnea. La matriz extracelular está Figura 1. Disposición de las fibras de colágeno del estroma corneal. Extraído de Villa C, Santodomingo J. La córnea. Parte I. Estructura, función y anatomía microscópica. Gaceta óptica; 2010.Pag 454 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 5 compuesta por colágeno y proteoglicanos (glicoproteínas) que mantienen las uniones entre las fibras de colágeno. Las células del estroma son los queratocitos, tienen forma aplanada y con un gran número de prolongaciones que se entrelazan entre sí mediante uniones tipo GAP. El estroma se distribuye en el 80% del peso de seco de la córnea son fibras de colágeno, el 15 % es sustancia fundamental y las células son el 5%.1,2,3,4 - Membrana de Descemet: es una lámina basal con un grosor entre 2 y 20 micras segregada por el endotelio, cubre la porción posterior del estroma y anterior del endotelio. Está compuesta por fibras de colágeno con un entretejido sencillo. La línea de Schwalbe, es una acumulación de fibras de colágeno circulares que marca la terminación de la membrana de Descemet a nivel de ángulo iridiocorneal.1,2,3,4 - Endotelio: es una capa única de células escamosas de unas 5 micras de espesor con límites intercelulares sinuosos. Las células endoteliales tienen forma hexagonal con un área aproximada de 18 micras, son de origen mesodérmico y no tiene capacidad mitótica demostrada, por lo que existe una disminución gradual de su número con el paso del tiempo y las células vecinas rellenan el espacio modificando su tamaño (polimegatismo) y su forma (pleomorfismo). Las células endoteliales presentan algunas uniones entre ellas, siendo diferente que las epiteliales.1,3,4 (Figura 2) Mediante el epitelio, la cara anterior de la córnea esta en contacto con la película lagrimal, mientras que la cara posterior, el endotelio, está en contacto con el humor acuoso de la cámara anterior.2 1.2 INERVACION CORNEAL La córnea esta inervada con nervios sensitivos, estos derivan de los nervios ciliares, que son las ramas terminales de la división oftálmica del trigémino (5º par craneal). Desde el ganglio trigémino, viajan por el nervio nasociliar y sus ramas nerviosas ciliares hasta la ramificación de las fibras nerviosas que penetran en la córnea.5 Los nervios se distribuyen en la córnea por el estroma medio y anterior, llegando al centro de la córnea de forma radial. Los filamentos nerviosos no pierden su vaina de mielina hasta que han atravesado al menos 1 mm o más de la córnea, A medida que avanzan hacia la córnea, los nervios se dividen y atraviesan la membrana de Bowman, formando un plexo nervioso debajo del epitelio, quedando las terminaciones nerviosas libres distribuidas por las células epiteliales.4 (Figura 3) Estas terminaciones nerviosas crean amplias zonas de recepción para cada axón sensorial que se superponen unos Figura 2: Células endoteliales forma hexagonal. Extraído de Batawi H, Shalabi N,Joag M, Koru-Senguk T, Rodríguez J,Green P,Campingotto M, Karp C, Galor A. Sub-basal cornea nerve plexus análisis using a new software technology. En; Eye and Contac lens;2017 ;0;0; Pag:1-7 Figura 3: Plexo nervioso en un paciente normal. Extraído de Yang AY, Chow J y Liu J. Corneal Innervation and Sensation; The Eye and Beyond. En Yale Journal of Biology and Medicine. 2018; 91. Pag 13- 21 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 6 a otros produciendo un alto nivel de sensibilidad a los estímulos externos con baja localización del estimulo4,5 Debido a esta inervación, la córnea se convierte en uno de los tejidos más sensibles del cuerpo. La concentración de las terminaciones de la córnea es entre 300 y 600 veces mayor que en la piel, y localizados en los dos tercios centrales. Debido a la concentración tan alta de receptores, cuando se produce la lesión en una sola célula epitelial provocaría una percepción dolorosa.4 La importancia de esta sensibilidad tiene como finalidad su protección. En la córnea existen 3 tipos de receptores nerviosos y esto permite a la córnea percibir estímulos térmicos, mecánicos y químicos. - Receptores nociceptores: son mecanorreceptores que responden a estimulo mecánicos, que transmiten el dolor agudo como respuesta a un contacto mecánico con la superficie de la córnea a través de nervios mielinizados tipo A𝛿 - Receptores polimodales: son nociceptores que responde a un dolor agudo y mantenido en respuesta a estímulos químicos como la acetilcolina, prostaglandinas, además de responder al aumento de la temperatura, mediante nervios mielinizados tipo C - Receptores de temperatura: son nociceptores que responde a la disminución de la temperatura, es decir, son receptores de frío, siendo nervios mielinizados tipo A𝛿 y C.5 Estas terminaciones, cuando sufren algún daño, se pueden regenerar, pero el problema radica en que cuando se regeneran, no tiene la misma sensibilidad específica que antes de la lesión.4 1.3 IMPORTANCIA DE LA INERVACION CORNEAL La función principal de la inervación de la córnea es protegerla ante las amenazas y los estímulos externos para que se produzca una respuesta de la película lagrimal y activar el reflejo de parpadeo y así evitar que las amenazas externas puedan entrar en el ojo. De este modo se mantiene una superficie ocular estable para permitir una buena visión y con el mantenimiento de una buena calidad lagrimal se evitar síntomas de ojo seco.5 Los nervios corneales también liberan sustancias tróficas como neuropéptidos, neurotróficas y factores de crecimiento que son muy importantes para una correcta proliferación del epitelio corneal, mantener la integridad del epitelio y permitir una correcta cicatrización de la córnea. La disminución o pérdida de la inervación sensorial de la córnea pueden producir patologías como la queratitis neurotrófica que conlleva una pérdida de visión.5 Por todo esto, es importante conocer y determinar el estado de los nervios corneales, ya que, en los diferentes procedimientos quirúrgicos, posibles traumatismos o enfermedades oculares, estos nervios pueden resultar dañados y, por lo tanto, la córnea perdería su sensibilidad y podría no advertimos de manera adecuada de complicaciones oculares.5 1.4 EVALUACIÓN DEL PLEXO NERVIOSO En algunos estudios realizados en pacientes con ortoqueratología se observa que en los primeros meses del tratamiento podremos encontrar una disminución de la sensibilidad corneal, que con su uso se estabiliza. Además, se Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 7 puede observar una disminución de la densidad de nervios, sin producir cambio en la sensibilidad de la córnea, pero también encontramos cambios en la tortuosidad de los nervios tanto en la córnea central como en la zona periférica, sin una recuperación rápida después de la retirada del tratamiento con ortoqueratología.6, 17 En ciertas enfermedades como la diabetes, se observa una disminución del número de fibras y un aumento de la tortuosidad con la disminución de la densidad de los nervios y las ramificaciones en función de la gravedad de la enfermedad. Por otro lado, tras una cirugía LASIK se produce una disminución del número de terminaciones nerviosas del plexo nervioso sin recuperar la cantidad de nervios que se tenía antes de la intervención. 8Igualmente, después de un trasplante de córnea se observa que las fibras son más cortas y con mayor tortuosidad y en pacientes con queratocono o con síndrome de Sjögren o síndrome de pseudoexfoliación presentan mayor tortuosidad incluso en pacientes con artritis reumatoide porque el número de fibras nerviosas está disminuido.20 Al evaluar la córnea central y periférica se observa que la densidad y la sensibilidad corneal es mayor en la zona central que en la periferia. Pero se encontró menor sensibilidad en la periferia superior y se cree que es debido a una adaptación neuronal a la presión continua a la que se ve sometida la córnea por el parpado superior.8 En la actualidad se usa la microscopia confocal para la exploración del plexo nervioso porque nos permite obtener imágenes in vivo y es una técnica no invasiva, permitiendo conocer que el nervio está formado por fibras nerviosas con cuentas tortuosas y delgadas, con una reflectividad homogénea diferente del fondo.9 Además como el plexo nervioso subbasal se dispone paralelo a la superficie de la córnea, entre la membrana de Bowman y el epitelio basal, nos permite obtener imágenes reproducibles y cuantificar diferentes parámetros.8 1.5 PARÁMETROS DEL PLEXO NERVIOSO El microscopio confocal in vivo permite obtener imágenes de forma rápida, reiterativa y no invasiva in vivo de las fibras nerviosas corneales. En estas imágenes podemos observar el plexo nervioso, su engrosamiento, la reducción de la densidad del nervio, un aumento de su tortuosidad del nervio y de sus ramificaciones. Para poder medir los diferentes parámetros del plexo nervioso, se necesitan conseguir imágenes correctamente enfocadas y con un buen contraste entre el nervio y el fondo de la imagen, además de ser imágenes con buena resolución, para poder obtener medidas fiables. En el plexo nervioso se pueden analizar diferentes parámetros a partir de las imágenes obtenidas con el microscopio confocal:10,11 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 8 - La densidad nerviosa: se define como el total de nervios visible en un área determinada, expresándose mm2. Pero otros estudios solo incluyen nervios mayores de 50μm o solo se analiza el total de nervios en un determinado corte y en función de cómo se realice el análisis, el número y la longitud de los nervios puede cambiar. La densidad se considera el parámetro del cual se puede obtener más información en el análisis cualitativo del plexo nervioso, siendo el parámetro más estandarizado. La densidad total estándar de los nervios de la córnea es de 19mm2, con una desviación estándar de 4-5 mm2.12,21,25 - La anchura: consiste en determinar la distancia desde una pared del nervio a otra pared del nervio, midiéndose en μm. - Orientación: se determina la orientación de las fibras nerviosas debido a que existen ciertas enfermedades en las que se puede encontrar cambio en la orientación. En ciertas enfermedades encontramos la ruptura de los nervios y variación en su orientación, lo que dificultara su análisis. El valor normal de la orientación de los nervios es 93.6º con una desviación de 28.5º. (Figura 4)10 - La longitud: se expresa en mm/mm2 o micras/mm2, mostrando la media de los valores obtenidos.10 - Número de células de Langerhan: las células Langerhan son células que presentan antígenos, las cuales aumentan las reacciones cutáneas de hipersensibilidad. Son células que se encuentran en epitelios poli estratificados planos, además de encontrarse en tejidos linfáticos (como el timo), ganglios linfáticos y el bazo. En la córnea se encuentran en el epitelio. Estas células extendiendo los procesos detríticos formando una red celular denominada sistema retículo-epitelial (Figura 5). Las células de Langerhands pueden moverse a los tejidos subyacentes porque tiene una red de microfilamentos y un sistema de microtúbulos, además de tener la capacidad de realizar movimientos pseudopódicos y las prolongaciones de sus dendritas se pueden retraer y extender. Es importante cuantificar la presencia de estas células en el epitelio corneal debido a que el epitelio actúa como revestimiento externo del globo ocular ya que tapiza cavidades relacionadas con el exterior, protegiendo la superficie ocular de factores externos.11 Figura 5: Células de Langerhan en epitelio. Extraído de Sedano E, Victorio J, NieraC, Rojas C. Demostración Inmunohistologíca de las Células de Langerhans en la Córnea Humana. En Anales de la Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.1997. Vol.58, Nª3 Figura 4: Orientación y longitud de nervios sub-basales. Extraído de Nombela-Palomo M, Felipe-Marquez G, Hernandez-Verdejo JL, Nieto- Bona A. Short-term Effects of Overnight Orthokeratology on Corneal Subbasal Nerve Plexus Morphology and Corneal Senstivity. En Eye and Contact Lents.2016;0;0; Pag 1-7 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 9 El recuento de las células Langerhans se realiza de forma manual en cada imagen utilizando el método diseñado por Nieto-Bona et al10 para realiza el recuento de células del epitelio. Los valores normales dependen de la región de la córnea que se observe, encontrando un promedio de 214 células/mm2 en la periferia y 31 células/mm2 en la zona paracentral.10,25 (Figura 6) - El número de fibras nerviosas: se entiende como la suma de todos los troncos nerviosos que se puedan calcular manualmente en la imagen. En muchas imágenes se pueden encontrar uniones nerviosas cortas y perpendiculares denominadas anastomosis y ramas nerviosas que no se consideran fibras nerviosas completas y no se incluyen en los estudios.13 - La reflectividad del nervio: también se puede nombrar como el número de arrosariamiento, entendiéndose como el número de puntos hiperreflectivos. Estos puntos deben estar bien definidos, mostrándose a ambos lados de la fibra nerviosa, calculándose manualmente a en distancia de 100μm de una fibra. Los valores normales de reflectividad en una córnea normal son: 0.75 unidades de gris con una variación de 0.02-0.03.13,6,10 - La tortuosidad de la fibra: se define estudiando la frecuencia y la amplitud de los cambios de dirección que sufre la fibra nerviosa Se puede medir la tortuosidad cuantitativamente mediante el cálculo en múltiples escalas espaciales, permitiendo obtener información más precisa. La tortuosidad se suele medir en las líneas centrales de la fibra. Los valores normales de la tortuosidad son 1.55 con una desviación estándar de 0.89. (Figura 7)13,22. También existe otra escala de clasificación de la tortuosidad en función de la frecuencia y la amplitud del cambio de dirección, determinado 5 grados, donde el 0 indica que el nervio es recto sin tortuosidad y el 4 indica un nervio con la máxima torturosdiad.31 - Patrón de ramificación: es el mayor número de ramificaciones que podemos encontrar prolongados a partir de una fibra nerviosa.13 - El volumen de los nervios: permite observar de forma tridimensional las estructuras de la córnea, y por tanto de los nervios permitiendo discriminar y evaluar las características morfológicas. El inconveniente es que la cuantificación de los nervios es complicada porque el campo de visión es limitado y el tiempo de exploración de forma adecuada es la largo, por lo que es uno de los parámetros que menos práctico.21 El análisis del plexo nervioso se realiza de forma cuantitativa, pero se debe tener cuidado por la variación de la profundidad de campo. Debemos tener Figura 6: Células de Langerhans. Fuente: Pilar Cañadas Figura 7: Tortuosidad de los nervios. Extraído de Neira C, Montalvo C, Sedano E. Demostración histoquímica de las células de Langerhans en córnea humana. En: Alma Máter, 1994;8; pag:89-96 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 16 tortuosidad o a infraestimar cuando la tortuosidad es baja, para evitarlo se clasifican en función de un umbral determinado. Cuando se compararan los datos obtenidos de forma manual y automática, en la forma manual se clasificaron las imágenes según su tortuosidad en baja, media o alta por un experto mientras que la forma automática se computerizaba con el algoritmo propuesto. Se encontró que el método automático realizaba un mínimo de errores de clasificación. Para clasificar el grado de la tortuosidad, se diseñó un nuevo criterio que se basa en sumar la curva de giro de cada uno de los segmentos del nervio. El método automático realiza la clasificación con menor error, mejor separación entre clases, aunque puede haber ocasiones en las que la fibra nerviosa sea de longitud insuficiente para determinar de forma adecuada la tortuosidad, debido a que parte del nervio quede fuera de la imagen o porque la profundidad de campo del instrumento es estrecha o las propias características del paciente. También se analizó la sensibilidad siendo alta o baja en función de si el paciente tenía o no alguna patología y la repetibilidad de la prueba, concluyendo que es una medida que se tendría que mejorar. 3.5 ARTÍCULO 5: REPETITIBILIDAD DE IMÁGENES DE LA CÓRNEA DE MICROSCOPIA CONFOCAL PARA CUANTIFICAR LA MORFOLOGÍA DEL NERVIO CORNEAL (2013)29 En el estudio analizan los parámetros de la densidad (NFD), la longitud (NFL)del nervio, el TC y la densidad de cada rama del nervio (NBD) con el fin de poder diagnosticar enfermedades de forma precoz, teniendo en cuenta un criterio aceptado internacionalmente. En el estudio se seleccionaron 380 imágenes al azar de participantes sanos obteniendo 2 imágenes de cada participante. Las imágenes fueron analizadas por dos expertos, de forma que un experto tenía cocimientos de análisis del nervio del plexo y el otro no. Se seleccionó la imagen en función del contraste, profundidad, enfoque de la imagen, y se seleccionaron de forma manual mediante el software CCMetrics. Cada parámetro se identifica por colores: la densidad del nervio se marca en color rojo, la densidad de cada rama en las diferentes uniones de cada segmento se identifica en verde, las ramificaciones se identifican en color azul y la longitud es la suma de los nervios destacados en rojo y azul. (Figura 9) También se calculael coeficiente intraclase (ICC) para deteminar la repetitibilidad entre los metodos analizados y los diferentes expertos. En el análisis por ambos expertos, se observaron diferencias unicamente en el parámetro de NBD. Teniendo en cuenta que el objetivo del estudio era determinar la repetibilidad de los parámetros con imágenes IVCCM, se concluye que de los Figura 9: imagen original e imagen analizada por el software CCMetrics. Extraída de Petropoulos I, Manzoor T.Morgan, Fadavi H, Asghar O, Alam U, Ponirakis G, Dabbah M, Chen X, Grahan J, Tavaki M, Malik R.Repeatibility Corneal Microscopy to Quantifi Corneal Nerve Morphology. En: Cornea; 2013; 32;5; Pag: 83-89 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 17 parámetros analizados, la longitud y la densidad del nervio, son los parámetros con mayor repetitibilidad y con valores más fiables, pero la longitud unicamente se detectaba correctamente en pacientes con patología. El NBD y el TC fueron los parámetros menos reproducibles y supusieron mayor dificultad, observando que la tortuosidad se analizaba mejor cuando seguia un patron simple con forma de ábol o de X con múltiples ramas. 3.6 ARTÍCULO 6: BASE ESTANDARIZADA DE DENSIDAD DEL PLEXO NERVIOSO CORNEAL HUMANO PARA INVESTIGACIONES CLÍNICAS CON MICROSCOPÍA CONFOCAL LÁSER IN VIVO. (2013)25 Este estudio se centra en el análisis de la densidad del plexo nervioso, determinando cual es el mejor criterio de selección y análisis de las imágenes y buscando la relación de densidad en función de la edad, sexo y el ojo analizado. En el estudio, participaron 106 personas sanas agrupadas en 4 grupos según la edad. Para la obtención de las imágenes, se utilizó la microscopía confocal ajustando la profundidad axial de forma manual para conseguir un área más amplia de la córnea central y el volumen de forma automática en un único campo de visión. Esto conlleva un tiempo de procesamiento lento en un área grande. Se determinó un criterio de selección de la imagen, siendo de gran importancia la calidad de la imagen. En análisis lo realizaron por 2 observadores diferentes a los que tomaron la imagen. El rastreo de los nervios se realizó de forma manual y automática, en la forma manual se utilizó el software ImagenJ sobre imágenes sin tratar (no se ajustó el brillo ni el contraste), determinado como nervio cuando como mínimo el 75% del nervio era visible, sino se excluía y la longitud del nervio se determinó en milímetros con el software NeuronJ. El análisis automático utilizó imágenes tratadas previamente (normalizado el contraste y la luminosidad) aplicando un logaritmo de rastreo basado en punto de inicio del nervio y un filtrado para reducir los falsos positivos con un tiempo de procesamiento de 2.5 minutos, además se determinó la longitud del nervio con el software NeuronJ en las coordenadas de vértice y se usó una interpolación bilineal para obtener los valores según los puntos de inicio. Al comparar los resultados entre ambos observadores, se encontró una diferencia de 0.085mm/mm2 de densidad, además se encontró una densidad diferente con el método manual y automático de 0.071mm/mm2. Estas diferencias se deben a la longitud del nervio, el contraste. La densidad total era diferente en el método manual, siendo aproximadamente de 18.8mm/mm2 (ojo derecho) y de19.2mm/mm2 (ojo izquierdo) y el método automático de 18.6 mm/mm2 (ojo derecho) y 19.2mm/mm2 (ojo izquierdo). En este estudio se determinó que la longitud del ojo humano es de 19mm/mm2, sin encontrar diferencias en función del sexo, pero si en función de la edad, puesto que se observó que a medida que avanzaba la edad, la densidad nerviosa era menor. También se encontraron cambios después de intervenciones oculares o en ciertas patologías afectando tanto al ojo intervenido o enfermo como al sano. En las imágenes se analizaron áreas pequeñas, pero si se quiere utilizar este parámetro para la clínica se necesita un método que analiza áreas mayores en poco tiempo. Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 18 3.7 ARTÍCULO 7: DIAGNÓSTICO Y CUANTIFICACIÓN DEL PLEXO NERVIOSO SUBASAL EN VOLUNTARIOS SANOS Y PACIENTES DIABÉTICOS CON O SIN RETINOPATÍA (2013)27 El estudio se basa en determinar la relación entre retinopatía diabética y los cambios morfológicos del plexo nervioso subbasal. En el estudio participaron 18 pacientes diabéticos tipo II clasificándose según la presencia de retinopatía o no y 20 pacientes sanos. A todos los participantes se le realizó una estesiometría corneal para medir la sensibilidad corneal y se tomaron las imágenes de microscopia confocal con un escaneo automático a nivel de las células basales en la membrana de Browman y el estroma anterior. El análisis de la imagen se realiza de forma automática con un software determinando la longitud, diámetro, densidad, continuidad y conectividad de los nervios. La conectividad se determina simulando que los nervios son caminos con nodos de cambios del ritmo. Las imágenes se analizaron morfológicamente y topográficamente segmentado las fibras en el eje medial. La sensibilidad corneal era menor en pacientes con diabetes (43mm) que en pacientes sanos (59mm), además en pacientes con retinopatía se encontraron estructuras deterioradas y alteraciones de los nervios cuando padecían diabetes que cuando estaban sanos. En pacientes diabéticos se encontró menor densidad de ramas y fibras y una disminución progresiva en pacientes con retinopatía diabética. También se observó que en paciente diabéticos los nervios eran más tortuosos y con menor reflectividad, pero no se encontraron diferencias significativas entre paciente sin retinopatía y con la enfermedad. Como conclusión, se encontró una alteración significativa en pacientes diabéticos del plexo nervioso independiente de la existencia de retinopatía diabética, pero si se ha demostrado que existe una relación entre la evolución de la diabetes y la presencia de retinopatía diabética, que se ha observado independientemente del control del nivel glucémico pudiendo desarrollar o no retinopatía. 3.8 ARTÍCULO 8: ANÁLISIS MORFOMÉTRICO AUTOMATIZADO, SEMIAUTOMATIZADO Y MANUAL DEL PLEXO NERVIOSO SUBASAL CORNEAL EN INDIVIDUOS CON Y SIN DIABETES (2014)18 En este estudio se comparan los resultados obtenidos mediante un método automático y dos métodos manuales y semiautomáticos. Se analizan 50 imágenes extraídas de forma aleatoria de una base de 314 participantes, 17 pacientes sanos y 33 pacientes con diabetes. Para la obtención de imágenes se empleó la microscopia confocal generando imágenes en 2 dimensiones de la zona central de la córnea. Solo se analizan 8 mediante el método manual, automático o semiautomático. El método manual se basa en el software CCMetrics, que rastrea todos los nervios visibles, analizando la densidad, longitud y tortuosidad del nervio, siendo la longitud del nervio el parámetro que se iba a comparar. El método semiautomático utiliza el software NeuronJ, el cual realizaba el trazado de nervios mediante la determinación del punto de inicio del nervio y el algoritmo rastreaba el camino optimo del nervio para determinar la longitud del nervio y después de dividía por el área de la imagen analizada para Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 19 obtener la longitud del nervio en unidades de mm/mm2. Mientras que el análisis automático, realizado con el software ACCMetrics, trazó los nervios de forma rápida en diferentes imágenes de 400x 400μm. En cada uno de los métodos, se determinó el tiempo de duración del proceso y la variabilidad del análisis de la longitud del nervio. Se evaluó la repetibilidad de la prueba, el coeficiente de relación y la varianza para mostrar las diferencias de estos valores en los diferentes métodos. Se encontraron valores similares en el parámetro de longitud del nervio con los tres métodos, con el método automático la longitud del nervio era de 17.4 mm/mm2, con el método semiautomático era de 16.0 mm/mm2 y con el método automático, la longitud era de 16.3 mm/mm2. Los tres métodos están íntimamente relacionados, pero existe mayor relación ente el manual y el semiautomático. El tiempo del proceso fue mucho menor con el método automático (aproximadamente 13 segundos) que con el semiautomático (64 segundos) y el manual (96 segundos). También se observó, que independiente del método que se utilizase, la cantidad de nervios era menor en pacientes con la enfermedad que en paciente sanos. Se anotaron más nervios con sistema manual que con el método automático debido a que el explorador humano es capaz de detectar un mayor número de nervios. También influye que en el reconocimiento automático se tuvo que aumentar el umbral para evitar los falsos positivos, por lo que le método automático tiende a subestimar los resultados. Se demostró una elevada repetibilidad entre el método semiautomático y el automático, y que el método automático presenta un tiempo de procesamiento menor. Pero también se encontraron desventajas como no detectar nervios delgados, que estén fuera de foco de la imagen o confundir nervios con otras estructuras como dendritas. Estos inconvenientes se pueden resolver realizando después del método automático una evaluación manual, pero esto disminuye su repetibilidad. Por lo que el método automático era adecuado para analizar los nervios del plexo aportando velocidad, consistencia y objetividad. 3.9 ARTÍCULO 9: TECNICA RÁPIDA Y EFICIENTE PARA EL RASTREO AUTOMÁTICO DE NERVIOS CORNEALES EN MICROSCOPIA CONFOCAL (2016)14 En este artículo se estudian los métodos automáticos para analizar los nervios corneales de forma rápida y efectiva, mediante la obtención de imágenes de microscopia confocal. Obteniendo resultados incluso en imágenes grandes, para las que los métodos anteriores requerían un tiempo elevado de ejecución debido a la marcación del nervio punto a punto. El método desarrolla un enfoque automático para rastrear los nervios mediante un trazado preciso, determinado parámetros clínicamente útiles. Para evaluar la efectividad del algoritmo propuesto se comparó tortuosidad y densidad del nervio obtenidos mediante el análisis automático y manual. Se analizaron 246 imágenes del plexo nervioso de sujetos sanos por evaluadores de forma manual. Realizaron un rastreo de las líneas centrales en cada uno de los nervios visibles, mediante el sistema de rastreo NeuronJ. Para Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 20 evaluar la tortuosidad del nervio, se emplearon 30 imágenes de pacientes sanos y con patologías como queratocono, síndrome de pseudoexfoliacion y diabetes. Para tener imágenes adecuadas se usaron filtros como el filtro Top-Hat (es un procedimiento morfológico basado en una serie de ecuaciones para resaltar los detalles claros sobre un fondo oscuro). para corregir la iluminación irregular, y el filtro Log-Gabor para mejorar el contraste de los nervios con el fondo. Para reconocer los nervios se emplea un umbral que considera la línea central de cada región umbral como un segmento del nervio y para determinar que ese segmento sea un nervio se utilizó un enfoque de máquinas de vectores de soporte (SVM), que analizan en función de dos características: morfológicas y basada en la intensidad. Las características morfológicas se relacionan con la forma y el tamaño del segmento del nervio, siendo la longitud y el área del nervio. Mientras que las características basadas en la intensidad se calculan usando filtros sobre las imágenes obtenidas con el microscopio confocal. Cuando se encuentran nervios desconectados de la base se conectan mediante brechas para determinar adecuadamente la tortuosidad, siendo necesario conocer la distancia, el ángulo y la intensidad desde un nervio a otro. Se determinó la sensibilidad y la cantidad de falsos descubrimientos (FDR), permitiendo comparar el enfoque propuesto con el algoritmo de Scarpa et al.16 y el rastreo manual. Se encontró una sensibilidad menor y unos valores de FDR significativos respecto al rastreo manual, pero en nuestro enfoque, la sensibilidad y los FDR son mayores que con el algoritmo de Scarpa et al. Además, el enfoque propuesto necesitó menor tiempo de análisis que el algoritmo de Scarpa et al. (0.61 segundos frente a 145,56 segundos). También se determinó la densidad del nervio mediante el método propuesto y el método manual, obteniendo diferencias no significativas (el coeficiente de correlación entre ambos fue de 0.93). Respecto a la tortuosidad, cuando se comparó, se clasificaron correctamente el 92.3% de las imágenes analizadas. Podemos decir que el análisis automático obtiene resultados similares a los resultados obtenidos con el análisis manual o semiautomático, debido a que es capaz de rastrear de forma correcta el 90% de los nervios corneales presentes en una imagen de microscopia confocal, Pero su ventaja principal es su capacidad de rastrear y analizar los nervios con la misma eficacia que un método manual, pero en menor tiempo. 3.10 ARTÍCULO 10: UN SISTEMA DE SEGMENTACIÓN DEL NERVIO TOTALMENTE AUTOMÁTICO Y ANÁLISIS DE PARÁMETROS MORFOMÉTRICOS PARA EL DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LA NEUROPATÍA DIABÉTICA A PARTIR DE IMÁGENES CORNEALES (2016)30 En este estudio se crea un método de análisis del plexo nervioso para poder detectar la neuropatía diabética de forma precoz. El proceso de segmentación del nervio se basa en un primer procesamiento para mejorar la visibilidad de los nervios, después eliminar las estructuras que no sean nervios y finamente se detectan los bordes de cada nervio. Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 21 Se analizaron 919 imágenes, en las que 445 pertenecían a sujetos control, 350 pertenecían a sujeto diabéticos sin neuropatía y 124 eran imágenes de pacientes con neuropatía. La determinación de los bordes se realiza con el filtro Gauss mediante un algoritmo con umbral determinado y las ramificaciones se unen al nervio colocando un punto en cada segmento final, si están próximos se traza una línea recta que conecta la ramificación con el nervio principal. (Figura 10) Los parámetros que se analizan fueron: la longitud que se calcula sumando la distancia entre los pixeles consecutivos del mismo segmento, la densidad se calcula dividendo los pixeles que corresponden a un nervio entre el área, el coeficiente de tortuosidad calculada a partir de longitud del nervio y el grosor del nervio que es la distancia entre los extremos en horizontal de los nervios. Para comprobar el rendimiento del método se analizó el índice de similitud estructural que comprara la calidad de la imagen, el índice de Rand que calcula el número de pares de pixeles, la variacion de la información que mide la distancia entre segmentos realizado de forma manual y automática y el error global siendo un refinamiento de la imagen, de modo que estos 4 parámetros comparan la imagen real con la segmentada. Los resultados concluyen en la efectividad del método de rastreo para la conexión de nervios de forma automática a tiempo real con un tiempo de análisis de 7 segundos. 3.11 ARTICULO 11: CUANTIFICACIÓN DE LA TORTUOSIDAD DEL PLEXO NERVIOSO SUBSAL DE LA CÓRNEA MEDIANTE UNA ESCALA MULTIDIMENSIONAL (2016)24 En este estudio se analiza la tortuosidad del plexo nervioso debido su íntima relación con la evaluación de ciertas patologías. Para su media existían diferentes métodos, pero tenían limitaciones: usar una sola escala, no diferenciar entre frecuencias altas y bajas, solo se basan en un coeficiente (como la curvatura), no determinan el nivel de confianza. Por ello, en este estudio se utiliza un análisis multi-escala con un algoritmo de aprendizaje automático, mostrando los resultados en un plano de tortuosidad (TP) de 2 dimensiones. Se incluyeron en el estudio 140 imágenes adquiridas con el microscopio confocal, tanto de pacientes sanos como con enfermedades (ojo seco, y queratitis por herpes simple). Las imágenes se analizaron por 3 expertos y se rastrearon con el software NeuronJ. El objetivo es calcular la tortuosidad con multi-escalas, asignar las medidas en 4 niveles de tortuosidad en un plano y mostrar el nivel de confianza. El análisis con multi-escala se basa en la medida de la curvatura máxima, los puntos de reflexión y los índices de tortuosidad de informes anteriores calculadas para 6 frecuencias espaciales partiendo de la medida de la curva y puntos de reflexión, con un algoritmo diseñado para medir su densidad, a partir de la fibra original y se suaviza su forma eliminando las altas frecuencias. Figura 10: Conexión de segmentos del nervio. Extraído de Al-Fahdawi S, Qahwayi R, Al-Waisy A, Ipson S, Malik R, Brahma A y Xin C. a fully automatic nerves segmentation and morphometric parameters quantification system for early diagnosis of. En Computer methods and programs in biomedicine; 2016;135; pag: 151–166 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 22 Para determinar el nivel de tortuosidad se emplea una estrategia de envoltura que se basa en un regresor ordinal logístico multinomial analizando la probabilidad de una imagen con una tortuosidad mayor y menor para crear 4 niveles de tortuosidad. El plano de tortuosidad de consigue con las 2 medidas mejores de tortuosidad y presenta los 4 niveles mostrando los límites de tortuosidad determinados por los expertos. Con este plano se clasifica la tortuosidad en 4 niveles, siendo una clasificación visual y se mostró el nivel de confianza a partir de la probabilidad de pertenecer a alguno de los 4 niveles. Como se realiza automáticamente se consigue un nivel de rendimiento mejor, pero tiene limitaciones como el uso de fibras rastreadas manualmente. Al compararlo con un método automático, analizan cada imagen como un todo y se pierde la contribución individual de cada fibra. Por otro lado, el volumen de análisis es bajo, 2-3 fibras por análisis. 3.12 ARTICULO 12: ANÁLISIS DEL PLEXO NERVIOSO SUBBASAL DE LA CÓRNEA MEDIANTE EL USO DE UN NUEVO SOFTWARE (2017)28 En este estudio se desarrolla un método de análisis semiautomático y se analizan la reproductibilidad de los resultados del software y la fiabilidad del método, para ello se analizaron parámetros como la densidad, el número de fibras, su longitud, ramificaciones y la tortuosidad. Se obtuvieron 350 imágenes mediante microscopía confocal en tres exploraciones y se seleccionaron aquellas que tenían buen contraste y estaban bien enfocadas. El software rastrea de forma automática los nervios, después se revisa con el método manual, determinando aquellas fibras que el método automático no haya podido detectar, siendo más o menos parecidos en función de la calidad de imagen y el ambos procesos, manual y automático, se realizaron en un tiempo de 3.5 minutos por imagen. Para evaluar el software se analizaron dos imágenes, una por el software y la otra manualmente de una misma persona. También se evaluó su repetibilidad mediante el uso de 2 observadores, encontrándose una repetibilidad del método del 80%. Para la evaluación de los parámetros, se relacionaron unos con otros, excepto la densidad que solo se relacionó con el número de ramificaciones. Se observó que, en los participantes de mayor edad, todos los parámetros estaban disminuidos, en especial la longitud y la densidad del nervio, pero no se encontraron cambios en función del sexo o la raza. También se observó una disminución de la longitud, la densidad y alteración de la densidad en participantes con diabetes mellitus tipo II, siendo mayor la afectación cuanto más avanzada estaba la enfermedad. Por lo tanto, en este estudio se ha desarrollado software capaz de trazar y analizar los nervios del plexo nervioso con una buena repetibilidad en el análisis de la longitud del nervio y un proceso rápido. Ademas, se desarrolla un sistema semiautomático para determinar la morfología del nervio al comparar con resultado ya existentes, siendo repetibles en el tiempo. Pero el estudio tiene ciertas limitaciones como el tamaño de la muestra para poder corroborar los resultados, se recomienda repetir el estudio con una nuestra de mayor tamaño. Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 23 4. DISCUSIÓN Los diferentes artículos relacionados con el estudio del plexo nervioso analizan diferentes parámetros como la densidad, la longitud y la tortuosidad de los nervios observados.14,16,17,20 ,25,24,28,29,30 La tortuosidad es uno de los parámetros más analizados debido a su afectación en distintas patologías14,16,17,18,20,24,,28,29,30. Pero también en otros estudios1720,27,28,29,30 se analizan otros parámetros como el diámetro medio, el número de bifurcaciones, la sensibilidad corneal y la continuidad, siendo parámetros de menor relación clínica pero que aportan información relevante para el estudio del plexo nervioso. Por otro lado, en algunos estudios24, 28 se analiza el nivel de confianza y la repetibilidad del rastreo de nervios y la determinación de los parámetros, realizado tanto por un método automático como por un método manual. La importancia clínica de analizar estos parámetros se pone de manifiesto ya que se han visto cambios en algunas patologías como la neuropatía diabética14,15,17,18,20,27,28,30, síndrome de ojo seco, queratitis por herpes simples24, queratocono o el síndrome de pseudoexfoliación14,20. En estas patologías se puede observar una disminución de la densidad de nerviosa, disminución del número de ramificaciones y un aumento de la tortuosidad dependiendo del estado de evolución de la enfermedad. También encontramos cambios tras diversos procedimientos refractivos como el LASIK20 en los que se observa una disminución no solo de la densidad nerviosa sino también de la longitud de los nervios con cambios en la tortuosidad. Los diferentes artículos estudiados se caracterizan por aplicar a las imágenes obtenidas con microscopía confocal diferentes filtros como el filtro Gabor,16,14 el filtro Top Hat,14 o establecer un umbral determinado17 para normalizar el contraste y la luminosidad de la imagen. Con estos filtros se elimina el ruido que puede confundir los nervios con las diferentes estructuras que hay en la imagen. La mayoría de los estudios15,16,17,20,24,25,27 se basan en comparar el método manual con el método automático en el rastreo de los nervios, y así determinar sus parámetros con más facilidad y rapidez. Con el método manual, el automático y semiautomático se rastrean los nervios mediante algoritmos. En el método manual se usan el algoritmo CCMetrics18,29 o el ImagenJ25 y en el método automático el algoritmo ACCMetrics18 que identificaban los nervios a partir de la selección de un punto de inicio y secuencias de terminación y para la unificación de segmentos pertenecientes al mismo nervio se basaban en sus características. En algunos estudios se realiza el rastreo mediante un modelo de multiescala15,24 de forma automática clasificando la tortuosidad en 4 niveles determinando la curvatura máxima, los puntos de reflexión y los indicies de tortuosidad para 6 frecuencias espaciales, permitiendo mostrar los resultados en un plano de tortuosidad. En algunos artículos se realiza un análisis semiautomático mediante un algoritmo de segmentación14,18,28 (JAVA o NeuronJ) en los que se realiza primero un análisis automático y después un análisis manual para determinar los nervios no detectados por el método automático, siendo poco útil debido al alto tiempo de procesamiento. De forma general, el análisis automático tiene mayor utilidad clínica, puesto que, como muestran varios estudios,15,16,17,20,24,25,27 el tiempo de procesamiento, tanto para el rastreo de los nervios como el análisis de los Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 24 parámetros determinados es menor que con el método manual, o semiautomático.14,18,28 Por otro lado, el método automático tiene una menor proporción de detección de nervios erróneos, mayor sensibilidad y repetibilidad14,15,16,17,25,28,29 Pero también algún estudio16,18,24 muestra que el método automático puede subestimar el número de nervios respecto al manual. Aun encontrando estas limitaciones, se obtienen resultados similares en varios parámetros como la densidad y la longitud.14,16,17,18,20,25,28,30 Caballero A. “Métodos de análisis del plexo nervioso” 25 5. CONCLUSIONES Después revisar los diferentes artículos relacionados con el análisis del plexo nervioso, se puede comprobar la importancia de analizar el plexo nervioso debido a su íntima relación con la evolución y seguimiento de diferentes patologías o procesos de cirugía. Se ha llegado a la conclusión de que el método de análisis más apropiado es el método automático debido a su rapidez, sencillez y eficacia mediante la obtención de imágenes por microscopía confocal. Por lo tanto, el análisis del plexo nervioso podría ser de gran utilidad en la clínica diaria para la detección de enfermedades, el seguimiento de las mismas y su tratamiento.