Repercusiones de la hipoxia intermitente en intestino delgado. Estudio en un modelo experimental animal

GRADO EN NUTRICIÓN HUMANA Y DIETÉTICA TRABAJO FIN DE GRADO Repercusiones de la hipoxia intermitente en intestino delgado. Estudio en un modelo experimental animal. Presentado por Esther Valverde Pérez para optar al Grado en Nutrición Humana y Dietética TUTORAS: Dra. Ana Obeso Cáceres1 y Dra. Elvira González Obeso2 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología 2Servicio Anatomía Patológica Hospital Clínico Universitario de Valladolid FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE VALLADOLID. CURSO 2018/2019 1 Agradecimientos. A mis padres y a mi hermana, por los esfuerzos que han hecho para que yo haya podido llegar hasta aquí y por el apoyo brindado. A mi pareja y amigos, por animarme a seguir adelante. Al grupo de investigación “Fisiología y Fisiopatología de la sensibilidad al oxígeno” por ayudarme con este estudio y, en especial, a Marta Ayllón, Víctor Mínguez y Carla Calleja, por hacer más amenas esas mañanas/tardes de laboratorio. A todos los profesores del Grado, por aportarme los conocimientos necesarios para realizar este trabajo de investigación y formarme para ser una buena profesional. Y por supuesto a mis dos tutoras, las doctoras Ana Obeso y Elvira González, por guiarme en este estudio y enseñarme lo bonito que es el mundo de la investigación. 2 RESUMEN INTRODUCCIÓN: La apnea obstructiva del sueño es probablemente el trastorno del sueño más grave. Ocasiona detención de la respiración y reanudación de ésta de forma repentina durante el sueño. Por tanto, los sujetos que la padecen sufren episodios de hipoxia intermitente combinados con episodios de normoxia. Estas situaciones provocan ciertas modificaciones en la estructura de diferentes órganos y presencia de inflamación. Estos cambios pueden afectar al intestino delgado, órgano sustancial del organismo que posee un complejo sistema inmunitario. OBJETIVO: Observar las posibles repercusiones de la hipoxia intermitente como modelo de la apnea obstructiva del sueño en intestino delgado en un modelo murino experimental. MÉTODOS: Se trata de un estudio experimental en el que se han realizado técnicas histológicas, análisis morfométrico y detección de marcadores de inflamación como CD68, TNF-α, IL-1 e IL-6 mediante inmunofluorescencia en vellosidades de la sección yeyunal. RESULTADOS: El estudio muestra cambios en la morfología, especialmente en cuanto a anchura media y pico de las vellosidades intestinales y composición celular de estas. Sin embargo, no presenta diferencias con respecto a los marcadores inflamatorios analizados (CD68, IL-1 e IL-6). CONCLUSIÓN: La hipoxia intermitente produce alteraciones en la estructura del intestino delgado, pero no modifica los marcadores inflamatorios analizados. Palabras clave: apnea obstructiva del sueño, síndrome de apnea/hipopnea del sueño, intestino delgado, yeyuno, inflamación, CD68, IL-1, IL-6 3 ÍNDICE DE CONTENIDOS RESUMEN ..................................................................................................................................... 2 ÍNDICE DE TABLAS ..................................................................................................................... 4 ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................... 4 ABREVIATURAS .......................................................................................................................... 5 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 6 1.1. Apnea obstructiva del sueño (AOS) y Síndrome de apnea hipopnea del sueño (SAHS) ...................................................................................................................................... 6 1.2. Hipoxia intermitente ....................................................................................................... 7 1.3. Intestino delgado ........................................................................................................... 8 1.3.1. Anatomía e histología ............................................................................................ 9 1.3.2. Sistema inmune de la mucosa intestinal ............................................................. 11 1.3.3. Inflamación en el intestino ................................................................................... 13 2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 14 3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 15 4. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................... 16 4.1. Diseño ......................................................................................................................... 16 4.2. Muestra ........................................................................................................................ 16 4.3. Metodología ................................................................................................................. 17 4.3.1. Inclusión de las muestras de yeyuno de rata control y experimental en parafina…. ........................................................................................................................... 17 4.3.2. Tinción con hematoxilina-eosina de muestras de yeyuno de rata control y experimental ........................................................................................................................ 17 4.3.3. Inmunofluorescencia sobre muestras de yeyuno de rata control y experimental18 4.3.4. Visualización de las muestras de yeyuno de rata control y experimental al microscopio ......................................................................................................................... 18 4.3.5. Análisis estadístico .............................................................................................. 18 5. RESULTADOS .................................................................................................................... 19 5.1. Histología ..................................................................................................................... 19 5.2. Estudio morfométrico................................................................................................... 21 5.2.1. Altura vellosidades intestinales ........................................................................... 21 5.2.2. Anchura media vellosidades intestinales ............................................................ 23 5.2.3. Anchura pico vellosidades intestinales ................................................................ 26 5.3. Inmunofluorescencia ................................................................................................... 28 6. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 30 7. LIMITACIONES ................................................................................................................... 31 8. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 32 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 33 ANEXOS ..................................................................................................................................... 35 ANEXO I. PROCESADO DE LOS TEJIDOS .......................................................................... 36 ANEXO II. PROTOCOLO TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA ............................................. 37 ANEXO III. PROTOCOLO TINCIÓN INMUNOFLUORESCENCIA ........................................ 38 4 ÍNDICE DE TABLAS TABLA 1. Valores medios de la altura de la vellosidad del yeyuno, desviación estándar y error de la media del grupo control (A) y del grupo experimental (B) .................................................. 21 TABLA 2. Valores medios de la anchura media de la vellosidad del yeyuno, desviación estándar y error de la media del grupo control (A) y del grupo experimental (B) ....................... 24 TABLA 3. Valores medios de la anchura del pico de la vellosidad del yeyuno, desviación estándar y error de la media del grupo control (A) y del grupo experimental (B) ....................... 26 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1. Niveles de respuesta a la hipoxia ............................................................................... 8 FIGURA 2. Estructura y capas del ID ........................................................................................... 9 FIGURA 3. Vista general de un corte longitudinal de ID de rata teñido con H/E ......................... 9 FIGURA 4. Representación de los elementos que integran el tejido linfoide en la mucosa intestinal ...................................................................................................................................... 12 FIGURA 5.Vías de interacción de la AOS .................................................................................. 13 FIGURA 6. a) Patrón de concentración de oxígeno (O2) en el aire respirado por ratas sometidas a hipoxia intermitente leve y grave. b) Mínimos y máximos de recuperación en los ciclos de saturación de oxígeno arterial (SpO2) causados por la respiración de los patrones de hipoxia intermitente leve y grave ............................................................................................................. 16 FIGURA 7. Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental con objetivo 10x en la que se detallan las diferentes medidas realizadas en el análisis morfométrico: altura (1), anchura media (2), anchura pico (3). ..................................... 19 FIGURA 8. A) Tinción con H/E de una sección longitudinal de un segmento de yeyuno de rata control (A) objetivo 10x y (B) Tinción con H/E de una sección longitudinal de un segmento de yeyuno de rata control objetivo (40x). Barra de calibración a 100 µm ........................................ 19 FIGURA 9. A) Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental (A) objetivo 10x B) Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental objetivo (40x). Barra de calibración a 100 µm ............................. 20 FIGURA 10. Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental ................................................................................................................................ 20 FIGURA 11. Diagrama box-plot que compara el grupo control (A) frente al grupo experimental (B) ................................................................................................................................................ 22 FIGURA 12. Diagramas de dispersión del grupo control (A) y del grupo experimental (B) ....... 23 FIGURA 13. Diagrama box-plot que compara el grupo control (A) frente al grupo experimental (B) ................................................................................................................................................ 25 FIGURA 14. Diagramas de dispersión del grupo control (A) y del grupo experimental (B) ....... 25 FIGURA 15. Diagrama box-plot que compara el grupo control (A) frente al grupo experimental (B) ................................................................................................................................................ 27 FIGURA 16. Diagramas de dispersión del grupo control (A) y del grupo experimental (B) ....... 28 FIGURA 17. Sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental objetivo 10x. A) DAPI y Alexa 594 con CD68 B) DIC con CD68 .......................................................................... 29 FIGURA 18. Sección circular de un segmento de yeyuno de rata control objetivo 40x. A) DAPI y FITC con IL-1 B) DIC con IL-1. Barra de calibración 10 μm ....................................................... 29 FIGURA 19. Sección circular de un segmento de yeyuno de rata control objetivo 40x. A) DAPI y FITC con IL-6 B) DIC con IL-6. Barra de calibración 10 μm ....................................................... 29 5 ABREVIATURAS AOS: apnea obstructiva del sueño AS: apnea del sueño H/E: tinción hematoxilina-eosina HI: hipoxia intermitente HIC: hipoxia intermitente crónica IAH: índice apnea-hipopnea del sueño ID: intestino delgado GALT: gut-associated lymphoid tissue, tejido linfoide asociado con el intestino HIF-1: factor inducible por hipoxia 1 ME: media NGS: suero normal de cabra PBS: buffer de fosfato salino PSG: polisomnografía SD: desviación estándar SEM: error de la media TFG: trabajo fin de grado SAHS: síndrome de apnea hipopnea del sueño SAOS: síndrome de apnea obstructiva del sueño 6 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Apnea obstructiva del sueño (AOS) y Síndrome de apnea hipopnea del sueño (SAHS) La apnea del sueño (AS) es un trastorno común en el cuál la respiración se interrumpe o se hace muy superficial durante el sueño. Estas interrupciones pueden durar desde pocos segundos a minutos y pueden aparecer más de 30 veces por hora. El tipo más común es la apnea obstructiva del sueño (AOS). El síndrome de apnea/hipopnea obstructiva del sueño (SAOS), es una entidad caracterizada por episodios repetidos de obstrucción de la vía aérea superior (VAS) durante el sueño (apneas del sueño); esta situación provoca caídas de la saturación arterial de oxígeno y despertares repetidos, dando lugar a un sueño no reparador condicionando, de forma secundaria, un cuadro de hipersomnia diurna así como trastornos cardiorrespiratorios, metabólicos y neuropsiquiátricos (1). Todas estas alteraciones son las que conforman el SAOS. En el año 2005 el documento Nacional de Consenso sobre el síndrome de apnea hipopnea del sueño (SAHS) recomienda usar el concepto de "SAHS", frente a SAOS, debido a que el primero: incluye una referencia específica a las hipopneas (de importancia creciente); evita el término "obstructiva", lo que permite incluir también las mixtas y las centrales y, finalmente, porque estas siglas definen tanto la traducción española como la anglosajona (2). Su primera descripción se remonta a la literatura del SXIX, concretamente en la primera novela de Charles Dickens, publicada en 1835 “The Posthumous Papers of the Pickwick club” (3) aunque como trastorno se documentó por primera vez en la década de 1960. Desde entonces, sus impactos en la salud han recibido una creciente atención por parte del público y la comunidad de la salud. La fragmentación del sueño, la hipoxia intermitente, la hipercapnia y los esfuerzos respiratorios ineficaces representan la mayoría de los trastornos fisiológicos en la AOS (4). De acuerdo con la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) el SAOS es el desorden respiratorio del sueño más común, afectando entre el 6 y el 20% de los hombres, entre el 6 y el 9% de las mujeres de mediana edad y a más del 20% de las personas mayores de la población general (5). La sospecha clínica es fundamental en el diagnóstico del SAHS. La alta prevalencia, morbilidad y mortalidad de este síndrome ha provocado un incremento de los métodos que se han desarrollado tanto para el diagnóstico como para su tratamiento. 7 Uno de los métodos diagnósticos más característicos es la polisomnografía (PSG). La PSG convencional incluye registro de electroencefalograma, electroftalmograma, electromiograma, electrocardiograma y frecuencia cardiaca, flujo aéreo, esfuerzo respiratorio y saturación de O2 en sangre durante toda la noche. Todo esto permite detectar y cuantificar los eventos respiratorios principales, apneas e hipoapneas. La apnea se define como el cese completo del flujo de aire a través de las vías aéreas durante más de 10 segundos e hipoapnea como la disminución de dicho flujo entre el 30% y 90%, durante más de 10 segundos, asociado a desaturación de O2 en sangre ≥ 3 % y a microdespertares (6). La gravedad de la AOS se define por el índice de apnea hipopnea (IAH), calculándose a través de la suma de apneas e hipoapneas entre el número de horas de sueño. El IAH de 5-15 eventos/h, 15-30 eventos/h y >30 eventos/h son indicativos de AOS leve, moderada y grave, respectivamente. Se considera que un IAH de 0 a 4 eventos/h es normal (7). La sola existencia de un IAH anormal no es sinónimo de SAHS, sino que debe coexistir con síntomas (sobrepeso u obesidad, ronquidos progresivos cada vez más intensos, cansancio, excesiva somnolencia durante el día…). La gravedad clínica del SAHS debe considerar varios aspectos (6). 1.2. Hipoxia intermitente Definimos hipoxia intermitente (HI) como desaturaciones recurrentes de oxígeno en la sangre. Generalmente, suele caracterizarse por ciclos cortos de hipoxia y reoxigenación pero, los patrones de HI distan mucho entre los pacientes con AS. Por esta razón, a la hora de realizar comparaciones entre sujetos o situaciones experimentales, la HI debe definirse por: duración de cada ciclo, intensidad de la hipoxemia en cada ciclo, duración de la HI por día y el número total de días/años en los cuáles la HI se encuentra presente. Atendiendo a la duración de los episodios de HI, podemos diferenciar hipoxia intermitente aguda o hipoxia intermitente crónica (HIC). La HIC es característica en patologías como la AOS, donde se producen episodios de hipoxia durante el sueño generados por obstrucciones en la vía aérea de manera intermitente mientras que el resto del día el sujeto no sufre apneas ni hipoxia, pues respira en un ambiente normóxico. En el trabajo se emplea el término HI en lugar de HIC, con el fin de simplificar. 8 Se han estudiado los diferentes efectos que puede producir la HI, distinguiendo entre efectos protectores y perjudiciales. El favorecimiento hacia uno u otro se explica por diferentes circunstancias, como una buena o mala adaptación de todo el organismo, tiempo de exposición a la hipoxia, % de O2 al que se somete, etc. (8). La respuesta a la hipoxia puede esquematizarse en tres niveles (FIGURA 1): de detección o sensor de oxígeno, de regulación (mediante el control de la expresión de una amplia serie de genes) y efector múltiple (incluye múltiples cambios funcionales como la estimulación de biomoléculas). El sistema regulador está modulado directamente por el sensor, el elemento organizador principal es un factor de transcripción específico, el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) (9). En el presente trabajo se ha simulado la HI como modelo de AS, con el fin de observar las posibles repercusiones de ésta en intestino delgado (ID). 1.3. Intestino delgado El ID es la porción tubular del aparato digestivo que proximalmente está separado del estómago por el esfínter pilórico y distalmente del intestino grueso por la válvula íleocecal. Mide unos 6 metros de longitud y sus funciones principales son la digestión y absorción de alimentos. Estas funciones son asistidas por las secreciones de las glándulas del estómago y las glándulas anejas a este tubo digestivo: las glándulas salivares, páncreas exocrino y el hígado con la secreción biliar, controlado por el sistema nervioso entérico y autónomo (10). FIGURA 1. Niveles de respuesta a la hipoxia 15 3. OBJETIVOS El objetivo principal de la asignatura TFG en el Grado de Nutrición Humana y Dietética es desarrollar las competencias generales, incluidas en la Orden CIN/730/2009, de 18 de marzo, las competencias específicas y transversales. Además, aplicado a mi trabajo, aprender la capacidad de trabajo en equipo y organización en el laboratorio, realizar un trabajo de investigación acorde a las normas establecidas e incorporar los conocimientos adquiridos durante los estudios de Grado con autonomía y bajo supervisión de las tutoras. Concretando más en este estudio, el objetivo principal de “Repercusiones de la hipoxia intermitente en intestino delgado. Estudio en un modelo experimental animal” es dilucidar las posibles repercusiones de la exposición a la HI características de la AOS en ID en un modelo experimental de rata. Como objetivos específicos: 1. Analizar si la exposición a HI produce cambios en la estructura histológica del ID (yeyuno) comparado con animales controles. 2. Identificar la presencia de marcadores específicos reactivos a la inflamación en ID (yeyuno) como posible consecuencia de la HI comparado con animales controles. 16 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. Diseño El diseño del presente estudio, experimental de experiencias controladas, se basa en una primera parte de búsqueda bibliográfica y una segunda experimental. La búsqueda bibliográfica se ha realizado en bases de datos (PubMed, SciELO, Elsevier, Dialnet…), libros de texto, revisiones sistemáticas como Cochrane… en todas ellas, se ha buscado los conceptos mencionados anteriormente, (HI, ID, SAHS, AOS…) y artículos que, posiblemente, los relacionase entre sí. Posteriormente, se realizó la parte experimental, empleando un modelo animal murino sometido a HI. 4.2. Muestra El estudio, previamente aprobado por el Comité Ético de Investigación de la Universidad de Valladolid, se realizó con ratas de raza Wistar, de 3 meses de edad mantenidos hasta la edad de 4 meses de edad en las instalaciones, aptas para animales, situadas en la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid. Se mantuvieron en un régimen general, es decir, en jaulas estándar a 20-24ºC. Las ratas (n=15) se dividieron en dos grupos, de forma aleatoria: • Grupo control (n=8): fue sometido a condiciones de oxígeno normales (21 % O2). • Grupo experimental (n=7): fue sometido a situación de HI. A continuación, en la FIGURA 6 (21) se presentan gráficamente las condiciones de HI a las que ha sido sometido el grupo experimental durante 4 semanas. En este caso, los sujetos han sido sometidos a hipoxia grave (severe hypoxia) que se refleja en ambas gráficas. FIGURA 6. a) Patrón de concentración de oxígeno (O2) en el aire respirado por ratas sometidas a hipoxia intermitente leve y grave. b) Mínimos y máximos de recuperación en los ciclos de saturación de oxígeno arterial (SpO2) causados por la respiración de los patrones de hipoxia intermitente leve y grave 17 Tras la finalización del tiempo de exposición las ratas fueron eutanasiadas. Posteriormente se realizó la cirugía para extracción de la sección yeyunal. 4.3. Metodología 4.3.1. Inclusión de las muestras de yeyuno de rata control y experimental en parafina Las muestras de yeyuno, pertenecientes al grupo control y experimental, tras ser extraídas se fijaron por inmersión en paraformaldehído (PF) al 4% en un buffer de fosfato (PB) 0.1M. Consecutivamente, de cada segmento de yeyuno se obtuvieron dos casettes que contenían, respectivamente, una sección circular (CIRC) y una longitudinal (LONG). Los casettes se identificaron de la siguiente manera, correspondiendo cada número a un sujeto (animal) diferente: • Controles: C9 (CIRC Y LONG), C10 (CIRC Y LONG), C11 (CIRC Y LONG) etc. • Experimentales: HI1 (CIRC Y LONG), HI2 (CIRC Y LONG), HI3 (CIRC Y LONG) etc. En cada casette a esta identificación anterior se añadió la fecha de inclusión. A continuación, se procesaron las muestras contenidas en cada casette mediante un procesador de tejidos (Procesador de Tejidos STP-120) localizado en el IBGM (Instituto de Biología y Genética Molecular) siguiendo el protocolo adjunto en el ANEXO I. Una vez finalizado el procesado de las muestras, estas se incluyeron en parafina (formando bloques) por medio del centro de inclusión EC 350. Los casettes fueron conservados en una caja a temperatura ambiente hasta que fueron cortados. 4.3.2. Tinción con hematoxilina-eosina de muestras de yeyuno de rata control y experimental De cada uno de los bloques de parafina se realizaron cortes histológicos de 6 µm de espesor mediante un microtomo de rotación manual HistoCore BIOCUT. Se obtuvieron 103 portaobjetos de muestras control y 100 de muestras experimentales, colocándose, aproximadamente, 3 cortes por portaobjetos. Posteriormente, 99 portaobjetos de muestra control y 96 de muestra experimental fueron teñidos con hematoxilina y eosina (H/E), atendiendo al protocolo adjunto en el ANEXO II. 18 4.3.3. Inmunofluorescencia sobre muestras de yeyuno de rata control y experimental La técnica de inmunofluorescencia se realizó sobre 4 portaobjetos que contenían muestra control y sobre 4 portaobjetos que contenían muestra experimental. Se emplearon 4 tipos de anticuerpos frente a receptores de TNF-α, CD68 e interleucinas IL-1 e IL-6. Se realizó el mismo número de técnicas para cada uno de los anticuerpos, una muestra control y otra experimental. El protocolo que se ha seguido para realizar esta técnica se adjunta en el ANEXO III. 4.3.4. Visualización de las muestras de yeyuno de rata control y experimental al microscopio Tanto las muestras teñidas con H/E como las sometidas a inmunofluorescencia, fueron observadas con el microscopio Carl Zeiss Axioskop 2 mot plus equipado con luz de fluorescencia y filtros adecuados para cada fluoróporo. Se realizó un estudio histológico, incluyendo el recuento por campo de eosinófilos y linfocitos. Además, fueron fotografiadas con la cámara digital Cool SNAP Photometric, Roper Scientific acoplada al microscopio. Estas imágenes fueron analizadas mediante un programa de análisis de imagen Metamorph 6.3 software. 4.3.5. Análisis estadístico Se realizó un estudio morfométrico de las vellosidades del yeyuno pertenecientes a ambos grupos de los parámetros de altura, anchura media y anchura del pico, los cuales se detallan en la FIGURA 7. Los datos obtenidos se sometieron a un análisis estadístico. Se ha realizado un estudio descriptivo en el que se incluye el cálculo de la media (ME), desviación estándar (DS) y error de la media (SEM) además de diferentes diagramas asumiendo normalidad. Para todo ello se empleó el programa GraphPad Prism 6.3. También se realizó estadística inferencial mediante la formulación de hipótesis a través del programa Statgraphics 18, utilizando un valor de p<0,05 como umbral para significancia. 19 FIGURA 7. Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental con objetivo 10x en la que se detallan las diferentes medidas realizadas en el análisis morfométrico: altura (1), anchura media (2), anchura pico (3). 5. RESULTADOS 5.1. Histología A continuación, se presentan los resultados del estudio histológico de las muestras pertenecientes a los grupos control y experimental. Las vellosidades intestinales de los animales experimentales presentan una mayor longitud y diámetro transversal en el tercio distal que las pertenecientes al grupo experimental. Este aumento se encuentra a expensas de una lámina propia expandida, por incremento en el número de linfocitos y células plasmáticas (FIGURAS 8 y 9). FIGURA 8. A) Tinción con H/E de una sección longitudinal de un segmento de yeyuno de rata control (A) objetivo 10x y (B) Tinción con H/E de una sección longitudinal de un segmento de yeyuno de rata control objetivo (40x). Barra de calibración a 100 µm A B 20 El recuento de eosinófilos tuvo como resultado por campo de gran aumento un máximo de 10 eosinófilos/campo en el grupo experimental contra 2 eosinófilos/campo en el grupo control. Por tanto, existe un aumento en el número de eosinófilos en el grupo experimental frente al grupo control. También se encuentran incrementados los linfocitos a nivel intraepitelial en el grupo experimental con respecto al grupo control: 3 linfocitos intraepiteliales/10 enterocitos en el grupo experimental versus 1 linfocito/50 enterocitos en el grupo control, existiendo zonas de las vellosidades sin linfocitos intraepiteliales en las vellosidades de animales control. Asimismo, se observa un incremento en el número de células caliciformes con presencia de amontonamiento de estas en las vellosidades y criptas intestinales de los animales experimentales en referencia a los animales controles. La capa submucosa, la muscular propia y la serosa no presentan alteraciones histológicas relevantes ni diferencias morfológicas significativas entre los animales controles y experimentales. Durante la exploración histológica se observó un engrosamiento de los vasos sanguíneos pertenecientes al grupo experimental, como se contempla en la FIGURA 10. FIGURA 10. Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental A B FIGURA 9. A) Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental (A) objetivo 10x B) Tinción con H/E de una sección circular de un segmento de yeyuno de rata experimental objetivo (40x). Barra de calibración a 100 µm 21 5.2. Estudio morfométrico De forma previa a la presentación de los resultados del estudio morfométrico es preciso resaltar que, de los 16 sujetos de experimentación, finalmente solamente se pudieron medir 13 debido a problemas en el procesamiento. 5.2.1. Altura vellosidades intestinales Se midió la altura desde la base de la vellosidad hasta el pico. Se obtuvieron 67 medidas de muestra control y 98 medidas de muestra experimental, las cuales se agruparon en base a los diferentes sujetos de estudio. A continuación, se presenta un resumen en forma de tabla (TABLA 1) en el que se aportan datos sobre el número de medidas, ME, SD y SEM. GRUPO CONTROL (A) SUJETO NÚMERO DE MEDIDAS ME DS SEM 9 8 466.6 55.90 19.76 11 5 489.8 66.65 29.81 12 3 396.7 29.41 16.98 13 19 344.9 65.03 14.92 14 3 535.4 13.52 7.80 15 7 467.9 66.75 25.23 16 22 395.2 39.37 8.39 TOTAL 67 442.4 48.09 17.56 GRUPO EXPERIMENTAL (B) SUJETO NÚMERO DE MEDIDAS ME DS SEM 2 35 233.9 151.9 25.68 3 3 617.2 9.645 5.569 4 4 397.8 228.0 114.0 5 8 395.1 135.9 48.05 6 14 460.7 125.5 33.54 7 34 543.8 66.49 11.40 TOTAL 98 441.4 119.57 39.7 TABLA 1. Valores medios de la altura de la vellosidad del yeyuno, desviación estándar y error de la media del grupo control (A) y del grupo experimental (B) 22 En la TABLA 1 se observa que las medias de ambos grupos (A y B) son similares, sin embargo, la desviación estándar del grupo B es muy superior a la del grupo A. Dados estos hechos, se enunció la hipótesis siguiente: la media de altura del grupo A es igual a la media de altura del grupo B (H0) frente a que la media de altura del grupo A es diferente a la media de altura del grupo B (H1). H0: µA=µB H1: µA≠µB En relación a la hipótesis formulada, el p-valor obtenido es de 0.802843 lo que nos lleva a concluir que no se rechaza la hipótesis nula (H0) con un 95% de nivel de confianza. Al obtener los resultados de esta hipótesis junto con los de la TABLA 1 se planteó la posibilidad de que la dispersión de los datos en cada uno de los grupos fuese diferente. Por tanto, se procedió a la inclusión del diagrama box-plot (FIGURA 11) y diagramas de dispersión (FIGURA 12). Además, se calculó el coeficiente de variación (CV). FIGURA 11. Diagrama box-plot que compara el grupo control (A) frente al grupo experimental (B) Las cajas del diagrama, que aparecen en la FIGURA 11, representan el 50% de los datos de cada uno de los grupos. Teniendo en cuenta esto y que la caja del grupo A es más estrecha que la del grupo B, los datos del primer grupo están más concentrados que los del segundo. Además, la distancia entre el mínimo y el máximo (recorrido) del grupo A es menor a la del grupo B, lo que indica una mayor dispersión de los datos de este último grupo. 23 Como segunda medida de dispersión de datos se realizaron dos diagramas de dispersión de datos, uno para cada grupo, como se muestra en la FIGURA 12. En ella, se observa gráficamente una mayor dispersión de datos en el grupo B. La tercera medida de dispersión fue el cálculo del CV. El CV representa el porcentaje que supone la desviación típica con respecto a la media, por lo que permite comparar la dispersión de distintas variables. Habitualmente, el valor del CV se compara con 0,5: si el coeficiente es inferior a dicho valor, se considera que la media es una medida representativa de la variable y los valores no están muy dispersos; si es superior, se considera no representativa y los valores están muy dispersos. Se obtuvo un CV de 0.19 para el grupo A y un CV de 0.45 para el grupo B. Aunque ambos valores son inferiores a 0.5, los valores del grupo B están más dispersos que los del grupo A. 5.2.2. Anchura media vellosidades intestinales Se midió la altura anchura media de las vellosidades. Se obtuvieron 76 medidas de muestra control y 99 medidas de muestra experimental, las cuales se agruparon en base a los diferentes sujetos de estudio. A continuación, se presenta un resumen en forma de tabla (TABLA 2) en el que se aportan datos sobre el número de medidas, ME, SD y SEM. FIGURA 12. Diagramas de dispersión del grupo control (A) y del grupo experimental (B) 24 GRUPO CONTROL (A) SUJETO NÚMERO DE MEDIDAS ME DS SEM 9 8 70.15 7.716 2.728 11 6 73.09 19.92 8.132 12 8 66.25 8.613 3.045 13 14 85.23 13.59 3.632 14 2 84.09 20.20 14.29 15 23 58.55 8.358 1.743 16 15 77.18 12.64 3.264 TOTAL 76 73.51 13.01 5.262 GRUPO EXPERIMENTAL (B) SUJETO NÚMERO DE MEDIDAS ME DS SEM 2 36 69.99 50.69 8.449 3 3 95.85 6.830 3.943 4 4 96.24 83.04 41.52 5 8 102.3 20.67 7.309 6 14 104.6 31.05 8.299 7 34 118.6 35.35 6.063 TOTAL 99 97.93 37.938 12.60 TABLA 2. Valores medios de la anchura media de la vellosidad del yeyuno, desviación estándar y error de la media del grupo control (A) y del grupo experimental (B) Como se puede comprobar en la TABLA 2, tanto las medias de ambos grupos como sus desviaciones estándar son diferentes, siendo superiores ambos parámetros en el grupo B. Se procedió de la misma manera que el apartado anterior, formulándose la siguiente hipótesis: la media de la anchura media del grupo A es igual a la media de la anchura media del grupo B (H0) frente a que la media de anchura media del grupo A es diferente a la media de anchura media del grupo B (H1). H0: µA=µB H1: µA≠µB 31 7. LIMITACIONES Antes de proceder al planteamiento de las conclusiones, es importante mencionar las limitaciones del presente estudio, con el fin de mejorar la compresión de los resultados y su corrección en futuras investigaciones. La principal barrera de este estudio ha sido la extensión de la muestra. El número de sujetos ha sido limitado, por lo que en futuras investigaciones se debería contar con una muestra más amplia, para obtener más resultados y, por tanto, conclusiones más potentes que puedan ser generalizadas. Respecto al número de mediciones, se ha contado con un número menor de medidas en el grupo control, a consecuencia del estado de estas muestras tras su procesamiento. Los cortes histológicos de este grupo se repitieron tres veces dando en todos los casos el mismo resultado, un estado no óptimo de la calidad histológica. Hubiese sido deseable una mayor calidad de las muestras con el fin de haber obtenido un número mayor de mediciones. Por otra parte, no se ha podido observar si existen diferencias entre ambos grupos respecto al receptor de TNF-α a consecuencia de un mal estado del anticuerpo. Tampoco se han realizado técnicas de inmunofluorescencia para otros anticuerpos que puede que interfieran en la inflamación intestinal, debido a una limitación económica del estudio. En futuros estudios se aconseja realizar técnicas de inmunofluorescencia para el receptor de TNF-α y técnicas de marcaje cuantitativo como el Western blot, para conocer valores específicos de esas posibles diferencias. 32 8. CONCLUSIONES En referencia a la asignatura TFG, se han adquirido durante el desarrollo de esta una mayor cantidad de conocimientos, pudiendo asentar las bases del desarrollo de un trabajo de investigación y la puesta en práctica de las diferentes técnicas utilizadas para ello. Con respecto a las conclusiones del estudio y con todo lo expuesto anteriormente, se puede concluir que: 1. La exposición a la HI produce cambios en la composición celular intestinal, presentándose un aumento de células caliciformes, plasmáticas, linfocitos y eosinófilos en comparación con el grupo control. 2. La capa submucosa, la muscular propia y la serosa no presentan alteraciones histológicas relevantes ni diferencias morfológicas significativas entre los animales controles y experimentales. 3. Existe un aumento del engrosamiento de los vasos sanguíneos del grupo experimental con respecto al grupo control. 4. Se produce una variación en la estructura de las vellosidades intestinales en ratas expuestas a HI, siguiendo un patrón menos homogéneo en comparación con el grupo control, especialmente en cuanto a los parámetros de anchura media y pico. 5. No hay aumento de los marcadores pro-inflamatorios empleados en el estudio: receptores de CD68 e interleucinas IL-1 e IL-6 en el ID de rata expuesta a HI. 33 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Hospital Universitario de Valme. El síndrome de apneas obstructivas del sueño. Capítulo 18. Asoc Neumol y Cirugía Torácica del Sur. 2004;219–231. 2. Grupo Español del Sueño (GES). Definición y concepto, fisiopatología, clínica y exploración del SAHS. Arch Bronconeumol. 2005;41:12–29. 3. Guilleminault C, Parejo-Gallardo KJ. Historia del síndrome de apnea-hipopnea obstructiva del sueño (SAHOS). Rev la Fac Med. 2017;65:11–16. 4. Unnikrishnan D, Jun J, Polotsky V. Inflammation in sleep apnea: An update. Rev Endocr Metab Disord. 2015;16(1):25–34. 5. Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica. Primer estudio comparativo del síndrome de apnea de sueño asociado a dos subtipos de hipertensión de alto riesgo cardiovascular. Web SEPAR. 2019. 6. Henry Olivi R. Apnea del sueño: cuadro clínico y estudio diagnóstico. Rev Médica Clínica Las Condes. 2015;24(3):359–373. 7. Butt M, Dwivedi G, Khair O, Gregory Y.H. Lip. Obstructive sleep apnea and cardiovascular disease. Int J Cardiol. 2010;1(1):7–16. 8. Almendros I, Wang Y, Gozal D. The polymorphic and contradictory aspects of intermittent hypoxia. Am J Physiol Cell Mol Physiol. 2014;307(2):129–140. 9. Carmelo C, Angeles C. Respuesta a la hipoxia. Un mecanismo sistémico basado en el control de la expresión génica. Medicina Buenos Aires. 2006;2:155–164. 10. Drenckhahn D, Waschke J, Negrete JH. Compendio de Anatomía. Editorial Médica Panamericana; 2010. 11. Ross MH, Pawlina W. Histología : texto y atlas color con biología celular y molecular. Editorial Médica Panamericana; 2012. 12. Megías Pacheco M, Molist García P, Pombal Diego MÁ. Atlas de histología vegetal y animal. 2017. 13. Welsch U. Sobotta Histología. 3a Edicion. Editorial Médica Panamericana; 2013. 14. Ross MH, Pawlina W, Barnash TA. Atlas de Histología Descriptiva. Editorial Médica Panamericana; 2012. 15. Fainboim L. Introducción a la Inmunología Humana. 6a Edición. Buenos Aires; Madrid: Editorial Médica Panamericana; 2013. 16. Ramiro-Puig E, Pérez-Cano FJ, Castellote C, Franch A, Castell M. El intestino: pieza clave del sistema inmunitario. Revista Española de Enfermedades Digestivas. Editorial Garsi; 2008; 29–34. 17. Lim D, Kim W, Lee C, Bae H, Kim J. 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Gut microbiota in obstructive sleep apnea–hypopnea syndrome: disease-related dysbiosis and metabolic comorbidities 2019;133(7):905–917. 23. Wei Q, Bian Y, Yu F, Zhang Q, Zhang G, Li Y. Chronic intermittent hypoxia induces cardiac inflammation and dysfunction in a rat obstructive sleep apnea model. J Biomed Res. 2016;30(6):490–495. 24. Michiels C, Tellier C, Feron O. Cycling hypoxia: A key feature of the tumor microenvironment. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer. 2016;1866(1):76–86. 25. Silva L, Cunha D, Lopes J, Ramalheira J, Freire M, Novío S, et al. Comorbilidades y gravedad de la apnea del sueño. Estudio en una cohorte de pacientes portugueses. Rev Neurol. 2016;62(10):433–438. 35 ANEXOS 36 ANEXO I. PROCESADO DE LOS TEJIDOS PROCESADOR DE TEJIDOS STP-120 Programa número (0-10): 4 VASO REACTIVO TIEMPO DE INMERSIÓN HORAS: MINUTOS REVOLUCIONES POR MINUTO 1 Formol 01:00 60 2 Formol 01:00 60 3 Etanol 70º 01:30 70 4 Etanol 80º 01:30 70 5 Etanol 96º 01:30 70 6 Etanol 100º 01:00 70 7 Etanol 100º 01:00 70 8 Etanol 100º 01:00 70 9 Xileno 01:30 70 10 Xileno 01:30 60 11 Parafina 02:00 60 12 Parafina 02:00 60 37 ANEXO II. PROTOCOLO TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA VASO REACTIVO TIEMPO FUNCIÓN 1 Xilol 6´ DESPARAFINAR 2 Xilol 6´ 3 Xilol 6´ 4 Etanol 100º 5´ HIDRATAR 5 Etanol 100º 5´ 6 Etanol 96º 5´ 7 Etanol 96º 5´ 8 Etanol 70º 5´ 9 Etanol 70º 5´ 10 H2O corriente 10´´ LAVADO 11 Hematoxilina Harris 7´ TINCIÓN NUCLEAR 12 H2O corriente 10´´ LAVADO 13 Alcohol ácido 5´´ ACENTUAR EL CONTRASTE DEL COLORANTE 14 H2O corriente 10´´ LAVADO 15 Eosina 3´ TINCIÓN CITOPLASMÁTICA 16 H2O corriente 10´´ LAVADO 17 Etanol 70º 2´ DESHIDRATAR 18 Etanol 96º 2´ 19 Etanol 96º 2´ 20 Etanol 100º 2´ 21 Xilol 1´ ACLARAR 22 Xilol 1´ 23 Montaje con Eukitt Montar cada uno de los portaobjetos, para su posterior observación al microscopio ´= minutos ´´=segundos 38 ANEXO III. PROTOCOLO TINCIÓN INMUNOFLUORESCENCIA 1. Desparafinar e hidratar las muestras tal y como se muestra a continuación: - Xileno. Tres pases durante 10 minutos cada uno. - Alcohol 100%. Dos pases durante 5 minutos cada uno. - Alcohol 96%. Dos pases durante 5 minutos cada uno. - Alcohol 70%. Dos pases durante 5 minutos cada uno. 2. Lavar en Buffer de Fosfato Salino (PBS) 10mM durante 5 minutos. 3. Secar bien los restos de PBS alrededor de las muestras mediante aspiración. Trazar una circunferencia alrededor de cada una las muestras colocadas en el portaobjetos con ayuda de un lápiz graso. 4. Permeabilizar las muestras con solución A que contiene PBS 10mM, Tritón x100 al 0.01% y suero normal de cabra (NGS) al 0.02%, prestando atención para que la solución no rebose de la marca de lápiz graso y que cubra todas las muestras. Dejar reposar con la solución durante 15 minutos. 5. Secar bien los restos de la solución A mediante aspiración, intentando no tocar las muestras. 6. Añadir el anticuerpo primario, en este estudio en concreto anticuerpos anti-receptores de TNF-α, interleucinas IL-1 e IL-6 (mouse anti-) y CD68 (rabbit anti-), todos ellos a una dilución 1:500 en solución A. Posteriormente, las muestras se introducen en una caja opaca en ambiente húmedo que incluye papel de filtro y esterilla, para que las muestras histológicas no se sequen. Las muestras se dejan incubando en la caja toda la noche a 4ºC. 7. Al día siguiente, secar bien los restos de la solución A junto con el anticuerpo. 8. Lavar con PBS durante 5 minutos dos veces. 9. Secar bien los restos de PBS alrededor de las muestras mediante aspiración. 10. Añadir el anticuerpo secundario, goat-antimouse FITC para TNF-α, IL-1 e IL6 y goat-antirabbit Alexa 594 para CD68. Todos ellos diluidos a 1:500 en solución B que contiene PBS, NGS al 0.02% y el marcador nuclear DAPI diluido a 1:1000. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente y en oscuridad. 11. Lavar con PBS durante 5 minutos dos veces. 12. Lavar con agua destilada. 13. Montar el portaobjetos con Vectashield. 14. Las muestras estarían listas para su observación al microscopio.