Estudio para la determinación de polygodial y estigmasterol en especies vegetales: Philodendron Bipinnatifidum y Polygonum Punctatum

FACULTAD DE CIENCIAS TRABAJO FIN DE GRADO Estudio para la determinaci´on de polygodial y estigmasterol en especies vegetales: Philodendron Bipinnatifidum yPolygonum Punctatum AUTORA: Ver´onica Mart´ın Hern´andez TUTORES: Dr. Luis Deb´an Miguel Universidad de Valladolid, Departamento de Anal´ıtica Dra. Gloria Arminda Resqu´ın Romero Universidad Nacional de Asunci´on, Paraguay, Departamento de Fitopatolog´ıa Agradecimientos Las muestras analizadas para este TFG fueron obtenidas en Paraguay, dentro del programa PACID de la Universidad de Valladolid. Primeramente, agradecer a mi tutor por haberme proporcionado los medios necesarios para la realizaci´on del trabajo, as´ı como sus consejos durante la duraci´on de este. De igual manera, agradecer a Francisco de la Rosa y a Rosario G´omez por proporcionarme la ayuda necesaria. Por ´ultimo, gracias a Rub´en y Javier por sus apreciaciones a lo largo del trabajo. ´ Indice general 1. Resumen/Abstract 5 2. Introducci´on 7 2.1. Descripci´on de los ejemplares vegetales estudiados . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2.1.1. Philodendron Bipinnatifidum .......................... 8 2.1.2. Polygonum Punctatum ............................. 9 2.2. Descripci´on de los analitos estudiados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.2.1. Estigmasterol .................................. 11 2.2.2. Polygodial.................................... 12 2.3. Antecedentes bibliogr´aficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3. Objetivos y Plan de Trabajo 15 4. Procedimiento Experimental 17 4.1. Material......................................... 17 4.2. Equipos ......................................... 17 4.3. Reactivos ........................................ 18 4.4. Obtenci´ondelamuestra ................................ 18 4.5. Toma y preparaci´on de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.5.1. Extracci´on en Soxhlet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.5.2. Extracci´on por maceraci´on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.5.3. Preparaci´on de las disoluciones patr´on de Polygodial y Stigmasterol . . . . 20 4.6. T´ecnicasdean´alisis................................... 21 5 6´ INDICE GENERAL 4.6.1. Espectroscopia molecular UV-Visible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 4.6.2. Cromatograf´ıa l´ıquida HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 4.6.3. Cromatograf´ıa de gases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 4.7. Experimentaci´on .................................... 22 4.7.1. Espectroscopia UV-Visible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.7.2. HPLC con detector UV-Vis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.7.3. Cromatograf´ıa de gases, detector FID . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 5. Resultados y discusi´on 31 5.1. Cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 5.2. Cromatograf´ıa de gases con detector de ionizaci´on de llama . . . . . . . . . . . . . 33 6. Conclusiones 41 Bibliografia 43 Anexos 44 ´ Indice de figuras 2.1. ´ Area geogr´afica de Philodendron Bipinnatifidum ................... 8 2.2. Philodendron Bipinnatifidum .............................. 9 2.3. ´ Area geogr´afica de Polygonum Punctatum ...................... 10 2.4. Polygonum Punctatum ................................. 10 2.5. Estigmasterol ...................................... 11 2.6. Polygodial........................................ 12 4.1. Coordenadas de la toma de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.2. Extracci´on mediante Sohxlet de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.3. Espectro de absorci´on del estigmasterol. Patr´on de 10 mg/l . . . . . . . . . . . . . 22 4.4. Patr´on de Estigmasterol de 10 ppm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 4.5. Cromatograma de extracto de P. Bipinnatifidum ampliado ............. 23 4.6. Patr´on estigmasterol 100 ppm, fase m´ovil 95 % acetonitrilo, 5 % metanol . . . . . 24 4.7. Extracto de P. Bipinnatifidum ............................. 25 4.8. Cromatograma patr´on polygodial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.9. Cromatograma extracto en hexano de P. punctatum ................. 27 4.10. Cromatograma extracto en metanol mediante Soxhlet de P. punctatum ...... 28 4.11. Cromatograma extracto en metanol mediante maceraci´on de P. punctatum . . . . 28 4.12. Cromatograma extracto en metanol observando la degradaci´on de P. punctatum . 29 4.13. Cromatograma extracto en diclorometano de P. punctatum ............. 29 5.1. Recta de calibrado mediante el m´etodo de patr´on externo para el Estigmasterol . 32 7 8´ INDICE DE FIGURAS 5.2. Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de patr´on externo para el estigmasterol ...................................... 32 5.3. Recta de calibrado mediante el m´etodo de adiciones patr´on para el Estigmasterol . 33 5.4. Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de adiciones patr´on para el Estigmasterol ...................................... 33 5.5. Recta de calibrado para el m´etodo de adiciones patr´on sobre el extracto en hexano 34 5.6. Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de adiciones patr´on en extracto enhexano ........................................ 34 5.7. Recta de calibrado para el m´etodo de adiciones patr´on sobre el extracto en metanol 35 5.8. Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de adiciones patr´on en extracto enhexano ........................................ 35 5.9. Recta de calibrado para el m´etodo de adiciones patr´on sobre el extracto en metanol 36 5.10. Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de adiciones patr´on en extracto en metanol mediante macerado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 5.11. Recta de calibrado para el m´etodo de adiciones patr´on sobre el extracto en diclorometano ........................................ 38 5.12. Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de adiciones patr´on en extracto en metanol mediante macerado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 ´ Indice de tablas 2.1. Resumen bibliogr´afico de distintos m´etodos de separaci´on y cuantificaci´on del estigmasterol ....................................... 13 4.1. Resumen de distintas fases m´oviles en columna C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.2. Resumen de distintas fases m´oviles en columna altamente polar . . . . . . . . . . 24 4.3. Fases m´oviles empleadas para la separaci´on del extracto en una columna apolar . 25 4.4. Resumen de las distintas rampas del CG-FID para el patr´on de polygodial . . . . 26 5.1. Tabla patr´on externo estigmasterol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 5.2. Tabla adiciones patr´on estigmasterol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 5.3. Tabla adiciones patr´on en hexano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 5.4. Tabla adiciones patr´on en metanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 5.5. Tabla adiciones patr´on en metanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 5.6. Tabla adiciones patr´on en diclorometano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 5.7. Comparativa extracci´on en Soxhlet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 5.8. Comparativa extracciones mediante maceraci´on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 1 8CAP´ ITULO 2. INTRODUCCI ´ ON 2.1. Descripci´on de los ejemplares vegetales estudiados Los controladores biol´ogicos que se han estudiado son las especies Philodendron bipinnatifidum yPolygonum Punctatum, ya que con estos ejemplares se ha trabajado en cultivos agroecol´ogicos. Ambos vegetales difieren mucho entre s´ı, tanto en sus caracter´ısticas f´ısicas observables como en su forma de reproducci´on, ya que, de hecho, ni tan siquiera pertenecen a la misma clase de la divisi´on angiosperma, puesto que el ejemplar Philodendron Bipinnatifidum pertenece a las monocotiled´oneas y el ejemplar Polygonum Punctatum pertenece a la clase II o dicotiled´oneas. 2.1.1. Philodendron Bipinnatifidum Esta especie vegetal se localiza en el continente sudamericano entre los meridianos 41 º y 58 º de longitud Oeste y los paralelos 20 º y 27 º de latitud Sur. Dicha zona abarca la provincia de misiones (Argentina), el sur de Brasil y todo Paraguay (exceptuando los departamentos de Alto Paraguay y Boquer´on), [3] como puede verse en la figura 2.1. Esta planta se conoce com´unmente con los nombres de g¨uemb´e,imb´e obanana-de-macao, siendo los dos ´ultimos siendo exclusivos de la zona brasile˜na. Figura 2.1: ´ Area geogr´afica de Philodendron Bipinnatifidum La especie Philodendron Bipinnatifidum pertenece a la familia de las Araceae. Es una planta perenne que contiene l´atex en su interior y puede medir hasta 1,5 metros de altura. El tallo arborescente puede medir hasta unos 18 cm de di´ametro. Las hojas presenta una forma ovalada, semejante a la forma de un coraz´on y est´an subdivididas en peque˜nos gajos o pinnatifidos. Son hojas flexibles pero con cierta resistencia, y miden de largo entre 10 a 100 cm y de ancho de 300-70 cm. Los pinnatifidos a su vez presentan un borde dentado [3]. Ejemplificando esta descripci´on,se puede observar la especie estudiada en la figura 2.2. Recientemente, ya han sido identificados diversos compuestos presentes en la planta tales como stigmasterol o β-sitosterol [4]. 2.1. DESCRIPCI ´ ON DE LOS EJEMPLARES VEGETALES ESTUDIADOS 9 Figura 2.2: Philodendron Bipinnatifidum Usos medicinales Los usos medicinales de la planta son conocidos desde hace casi un siglo. Ya se document´o en 1931 como los indios canig¨u´a empleaban las hojas como antis´eptico [3] y en Brasil, la planta en su totalidad se emplea para combatir ´ulceras, reumatismo y orquitis, as´ı como aplicado en la curaci´on de heridas [5]. Usos en la agricultura Las hojas de Philodendron Bipinnatifidum se emplean como insecticida tanto en la provincia de Misiones (Argentina) as´ı como en Paraguay. La forma de empleo m´as antigua documentada consiste en triturar la hoja y esparcir los fragmentos en el suelo y sirve para combatir piques (Tunga penetrans), pulgas (Siphonaptera), nig¨uas (Sarcpsilla penetrans) y algunos otros insectos [3]. Tambi´en se ha observado in situ su uso en el terreno, bien empleando extractos solamente de la planta o bien en combinaci´on con extractos de otras plantas. 2.1.2. Polygonum Punctatum Esta planta se localiza en h´abitats h´umedos, tales como humedales o en la proximidad de los r´ıos. Su distribuci´on geogr´afica es amplia pues puede encontrarse en pr´acticamente la totalidad del continente americano y en diversos pa´ıses asi´aticos, como se muestra en la figura 2.3. Este vegetal alcanza una altura de 1,5 metros de alto, El tallo es simple de color verde rojizo, agudiz´andose los tonos rojos de este al secarse. Las hojas pueden medir hasta 16 cm de largo y con forma de punta de lanza. Las flores se agrupan en racimos de hasta 8 cm de largo y son peque˜nas y de color blanquecino [27]. Es una planta de baja altura (aproximadamente 50 cm de alta), con hojas alargadas de unos 2 cm de largo y con forma de lanza. El tallo presenta un color verde-rojizo, agudiz´andose el color rojo al secarse. Las flores son de color blanco brillante. Estos 10 CAP´ ITULO 2. INTRODUCCI ´ ON Figura 2.3: ´ Area geogr´afica de Polygonum Punctatum detalles pueden observarse en la figura 2.4. Esta planta presenta un sabor picante, lo cual hace que en guaran´ı esta hierba sea conocida como Ka´a’tai o en Argentina con el nombre de Vinagrillo. Figura 2.4: Polygonum Punctatum En la actualidad, el total de compuestos identificados en esta planta asciende a dos: polygodial [6] y β-sitosterol [7]. Usos medicinales Esta planta se emplea en el tratamiento de diversas enfermedades e infecciones. Su uso para el tratamiento de enfermedades de forma tradicional se encuentra ampliamente documentado, puesto que tanto las tribus preexistentes en Latinoam´erica como los criollos que llegaron con 2.2. DESCRIPCI ´ ON DE LOS ANALITOS ESTUDIADOS 11 la colonizaci´on empleaban infusiones de las partes a´ereas de las plantas para el tratamiento de hemorroides, como desinfectante aplic´andose sobre heridas abiertas o como antiinflamatorio [8], [9], [10]. Extractos mediante maceraci´on en diclorometano de la planta presentan actividad frente a diversos microorganismos, inhibiendo el crecimiento de estos: Bacillus subtilus,Staphylococus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans yEscherichia coli mientras que los extractos en metanol presenta actividad solo contra Bacilus subtilis. Dicha planta no solo presenta actividad antimicrobiana, sino que extractos metan´olicos del vegetal muestran actividad anti-HSV [11]. Extractos en diclorometano de esta planta tambi´en presentan actividad antf´ungica frente a C.sphaerospermum [6]. Usos en la agricultura Al igual que el ejemplar anterior, esta planta se emplea tambi´en como un biodefensor en diversos cultivos en Paraguay, enmarcados en el ´ambito de la agroecolog´ıa, aunque su uso todav´ıa es limitado. 2.2. Descripci´on de los analitos estudiados 2.2.1. Estigmasterol Este compuesto pertenece a la familia de los fitoesteroles y su nombre mediante la nomenclatura de la IUPAC es (3S, 10R, 13R)-17-((2R,5S,E)-5-etil-6metilhepten-3-il) -10,13-dimetil2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 -tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ol, pero nos referiremos a lo largo de este trabajo por su nombre m´as com´un, estigmasterol (figura 2.5). Su peso molecular es de 412,37 g/mol y en estado s´olido es un s´olido blanco. Figura 2.5: Estigmasterol Este compuesto org´anico, se encuentra presente en numerosas especies vegetales, ya que la familia de los fitoesteroles es com´un a todos los vegetales, lo ´unico que var´ıa entre cada planta es la cantidad de fitoesteroles de cada tipo. Recientemente se est´a investigando el efecto de este compuesto frente a diversos tipos de c´ancer, como el c´ancer g´astrico [12]. Tambi´en se ha estudiado la actividad inhibidora de hormonas tiroideas (T4) cuando se aplica sobre organismos vivos [13]. 12 CAP´ ITULO 2. INTRODUCCI ´ ON 2.2.2. Polygodial La nomenclatura IUPAC de esta mol´ecula es (1R, 8aS)-5,5,8a-trimetil-1,4,5,6,7,8,8a-octahidronaftaleno-1,2-dicarbaldehido y su f´ormula qu´ımica es C15H22O2aunque se denomina polygodial (figura 2.6). Su peso molecular es de 234,34 g/mol. En estado s´olido, presenta un color amarillo claro-beis. Figura 2.6: Polygodial Este sesquiterpeno dialdeh´ıdo se encuentra en una gran variedad de plantas, como es el caso de la familia Polygonaceae a la que pertenece la especie Polygonum Punctatum. Esta mol´ecula org´anica presenta actividad repelente frente a ´afidos (insectos de la familia Aphidoidea) [14], [15], no solo actuando como repelente, sino que tambi´en mata a las larvas de estos empleando disoluciones con concentraciones mayores o iguales a 40 ppm, convirtiendo a este compuesto en un insecticida m´as potente que el conocido DEET [16]. En diversos ensayos biol´ogicos, el polygodial se ha sido visto como un prometedor antif´ungico frente a hongos filamentosos como pueden ser Sacharomices Cerevisiae yCandida albicans y se ha comprobado que es m´as potente frente a estos que otros antibi´oticos, tales como actinomycin D, rifampicin y amphotericin B, siendo el MIC del polygodial de 1,56 µg/ml frente al hongo S. cerevisiae [19]. Adicionalmente, presenta actividad antihelm´ıntica frente a C. elegans con un EC50 = 13,1± 5,3µM. Diversos estudios han demostrado que es un inhibidor de la movilidad de las larvas de la especie Trichostrongylus soluriformis (un nem´atodo par´asito de las ovejas) presentando un IC50 = 0,07 mg/ml [18]. 2.3. Antecedentes bibliogr´aficos En lo referente al estigmasterol, la bibliograf´ıa, relativa a su identificaci´on y cuantificaci´on es extensa. Las columnas empleadas para ello son apolares (C18) o de una polaridad intermedia (C8), y las fases m´oviles empleadas son muy variopintas como se ve resummido en la tabla 2.1. 2.3. ANTECEDENTES BIBLIOGR ´ AFICOS 13 Columna Fase m´ovil Referencia bibliogr´afica C8 Metanol 86 %, agua 14 % [20] 88 % metanol, 12 % agua [21] metanol 95 % agua 5 % [22] C 18 70 % acetonitrilo 30 % metanol [23] amonio acetato en agua [24] 90 % metanol, 10 % acetonitrilo [25] 50 % acetonitrilo, 50 % agua [26] Tabla 2.1: Resumen bibliogr´afico de distintos m´etodos de separaci´on y cuantificaci´on del estigmasterol Los antecedentes bibliogr´aficos del polygodial presentan un n´umero menor, y, se centran en la observaci´on mediante t´ecnicas m´as novedosas, como el CG-MS. De forma general, se suele emplear una rampa desde 70 º C hasta 200 º C de 10 º C/min, empleando como gas portador He [19], [17] y la identificaci´on del compuesto se realiza por comparaci´on con bibliograf´ıa existente. Cap´ıtulo 3 Objetivos y Plan de Trabajo El objetivo del presente trabajo consiste en la determinaci´on de los compuestos de polygodial y estigmasterol en plantas, concretamente en los ejemplares P. Punctatum yP. Bipinnatifidum cuyos compuestos presentan actividad farmacol´ogica y pesticida, comentada en el cap´ıtulo anterior. Ambos compuestos org´anicos fueron extra´ıdos a trav´es de dos t´ecnicas: el m´etodo Soxhlet y mediante maceraci´on del vegetal en disolventes org´anicos. La identificaci´on de dichas mol´eculas y, posterior cuantifiaci´on de las mismas se realiz´o poniendo a punto dos m´etodos distintos para cada uno de ellos; el estigmasterol se identificar´a y cuantificar´a pormediante HPLC-UV/Vis y el polygodial mediante CG-FID. Para la consecuci´on de los objetivos se analizaran los patrones en diversas condiciones en cada uno de los equipos disponibles, as´ı como los extractos en varias condiciones para obtener la mejor separaci´on de las mol´eculas org´anicas a analizar. 15 Cap´ıtulo 4 Procedimiento Experimental 4.1. Material  Botes de pl´astico (45 y 100 ml)  Equipo de extracci´on Sohxlet  Filtro de papel gravim´etrico  Filtro de jeringa 25mm 0,45µm  Filtro de jeringa 25mm 0,22µm  Matraces Erlenmeyer (100 ml)  Matraces volum´etricos (5 ml, 10 ml, 25 ml, 100 ml)  Pipetas (1ml, 2 ml, 5 ml, 10ml y 25ml)  Vasos de precipitados (50 ml, 100 ml y 250 ml)  Viales de 10 ml  Viales para cromatograf´ıa de gases 4.2. Equipos Los equipos empleados en la elaboraci´on de este trabajo de investigaci´on se localizan en el departamento de anal´ıtica de la Universidad de Valladolid y son los siguientes:  Balanza Anal´ıtica de precisi´on 0,00001g  Columna del gases BP-20  Columna del HPLC C18 5.0 de longitud 150 x 4,6 mm.  Columna del HPLC de CN 5.0 longitud 250 x 4,6 mm 17 24 CAP´ ITULO 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Columna con fase estacionaria polar Por otra parte, se llev´o a cabo un estudio en empleando una columna altamente polar, cuya fase estacionaria est´a compuesta por grupos ciano monofuncionales anclados a la fase estacionaria. Puesto que la informaci´on de la que se dispon´ıa es, escasa, se fueron eligieron diversas fases m´oviles de polaridades diferentes, partiendo de la fase m´ovil que se hab´ıa empleado con la columna anterior para comparar la retenci´on entre ambas columnas y, optimizar la fase m´ovil. Las distintas fases m´oviles se encuentran resumidas en la tabla 4.2 La fase m´ovil ´optima para el an´alisis del analito Fase m´ovil Tiempo de retenci´on (min) Acetontrilo Metanol Agua 30 % 70 % 0 % 3,65 70 % 30 % 0 % 3,17 30 % 30 % 40 % 3,07 50 % 50 % 0 % 3,39 50 % 0 % 50 5,37 80 % 20 % 0 % 3,17 90 % 0 % 10 % 3,13 95 % 5 % 0 % 3,22 Tabla 4.2: Resumen de distintas fases m´oviles en columna altamente polar consiste en una composici´on 95 % de acetonitrilo y 5 % de metanol, reflejado en la figura 4.6 ya que se obtiene un pico en un tiempo de retenci´on de 4,316 min. Figura 4.6: Patr´on estigmasterol 100 ppm, fase m´ovil 95 % acetonitrilo, 5 % metanol Posteriormente se analiza el extracto para lo cual se procede a la optimizaci´on de la fase m´ovil empleada en la fase m´ovil, resumidas las distintas fases m´oviles en la tabla 4.3. La fase m´ovil que presenta mejor resolucio´on es la fase m´ovil formada por un 95 % de acetonitrilo, 5 % metanol, representada en la figura 4.7. 4.7. EXPERIMENTACI ´ ON 25 Fase m´ovil Tiempo de retenci´on (min) Acetontrilo Metanol 70 % 30 % 3,23 80 % 20 % 3,37 90 % 10 % 3,45 95 % 5 % 3,51 Tabla 4.3: Fases m´oviles empleadas para la separaci´on del extracto en una columna apolar Figura 4.7: Extracto de P. Bipinnatifidum Los solapamientos que se producen nos indican que posiblemente esta columna no es la m´as adecuada para su determinaci´on. Por tanto, tomadas en cuenta todas las consideraciones, el m´etodo ideal para la separaci´on del estigmasterol es mediante el empleo de una columna C18 fase apolar. 4.7.3. Cromatograf´ıa de gases, detector FID Para la el an´alisis del polygodial mediante esta t´ecnica se ha empleado como referencia diversos trabajos en los que la identificaci´on se realiza mediante CG-MS. La identificaci´on y cuantificaci´on del compuesto se ha realizado mediante cromatografia de gases y un detector de ionizaci´on a la llama. La columna empleada para la separaci´on es un BP20 con fase estacionaria de polietilenglicol. Primeramente se llevaron a cabo mediciones del patr´on puro para observar el pico y la intensidad de este, empleando diferentes rampas que se encuentran resumidas en la tabla 4.4. Posteriormente se optimiz´o la separaci´on de los diversos componentes del extracto siguiendo las rampas que se hab´ıan empleado para el estudio del patr´on. Las condiciones ´optimas de separaci´on de los diversos compuestos del extracto consiste en: portal de inyecci´on 250 º C y temperatura programada en el horno con dos rampas; una primera rampa de 80 º C a 190 º C de 20 º C/min seguidas de otra rampa m´as leve (5 º C/min) hasta alcanzar la temperatura 26 CAP´ ITULO 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Temperatura de inyecci´on ( º C) Rampas 250 80 º C a 250 º C 10 º C/min 250 80 º C a 250 º C 20 º C/min 250 80 º C a 280 º C 20 º C/min 250 80 º C a 280 º C 30 º C/min 250 80 º C a 250 º C 50 º /min 250 80 º C a 280 º C 50 º C/min 250 80 º C a 190 º C 20 º C/min y 190 º C a 250 º C 5 º C/min Tabla 4.4: Resumen de las distintas rampas del CG-FID para el patr´on de polygodial de 250 º C. La temperatura de la llama de hidr´ogeno se encuentra a 300 º C. Estas condiciones se mantendr´an durante todos los an´alisis para comparar los extractos en los diferentes tiempos de retenci´on. Los l´ımites de detecci´on y cuantificaci´on para este m´etodo toman unos valores de alrededor de 0,58 mg/l y 1,7 mg/l respectivamente. La identificaci´on del compuesto se ha realizado por comparaci´on en las mismas condiciones del tiempo de retenci´on del patr´on puro y de los compuestos del extracto, apareciendo en un tiempo de retenci´on comprendido entre 16,6 a 16,7 minutos, como se puede observar en la figura 4.8. Habi´endose optimizado las condiciones del equipo para la cuantificaci´on del compuesto de Figura 4.8: Cromatograma patr´on polygodial inter´es, en este caso polygodial, se llev´o a cabo la identificaci´on y cuantificaci´on de dicho analito de inter´es en los diversos extractos que se han realizado empleando los m´etodo de extracci´on mediante Sohxlet y mediante maceraci´on. Para determinar la cantidad de compuesto presente en la muestra se realiz´o el m´etodo de adiciones patr´on, puesto que, la matriz es compleja y puede ocluir al analito impidiendo la volatilizaci´on total de este en la muestra. 4.7. EXPERIMENTACI ´ ON 27 Extractos en hexano Se analiz´o un extracto de 100 ml extra´ıdo mediante Soxhlet. Se identific´o el compuesto en el extracto obtenido, teniendo el compuesto un tiempo de retenci´on similar al patr´on empleado, como puede observarse en la figura 4.9, observ´andose la existencia de un pico cromatogr´afico en el minuto 16,716, al igual que en el patr´on. Figura 4.9: Cromatograma extracto en hexano de P. punctatum El analito aparece en un tiempo de retenci´on semejante al del patr´on de 16,7 minutos. Extractos en metanol En lo relativo a este disolvente se han empleado dos t´ecnicas de extracci´on: mediante Sohxlet y mediante macerado. Observando el cromatograma del extracto mediante Sohxlet, figura 4.10 se observa un pico en un tiempo de retenci´on de 16,705 minutos, semejante al tiempo de retenci´on del patr´on. 28 CAP´ ITULO 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Figura 4.10: Cromatograma extracto en metanol mediante Soxhlet de P. punctatum En el cromatograma del extracto mediante maceraci´on (figura 4.11) se observa el pico correspondiente al polygodial en el tiempo de retenci´on del patr´on (16,725 minutos). Figura 4.11: Cromatograma extracto en metanol mediante maceraci´on de P. punctatum Con el fin de observar la evoluci´on del compuesto con el tiempo, una fracci´on del extracto se almacen´o durante dos meses a temperatura de laboratorio y en presencia de luz, dando lugar al cromatograma de la figura 4.12. En ´el, se observa una gran cantidad de compuestos a menores tiempos de retenci´on que en los cromatogramas anteriores, mientras que no se encuentra el pico correspondiente al analito, lo que indica que el compuesto se degrada con el tiempo. 4.7. EXPERIMENTACI ´ ON 29 Figura 4.12: Cromatograma extracto en metanol observando la degradaci´on de P. punctatum Extractos en diclorometano Las extracci´on en el caso de este disolvente se ha realizado solamente mediante maceraci´on, identific´andose el compuesto en un tiempo de retenci´on (16,705 minutos) an´alogo al patr´on. Figura 4.13: Cromatograma extracto en diclorometano de P. punctatum Cap´ıtulo 5 Resultados y discusi´on 5.1. Cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´on Puesto a punto el m´etodo para el an´alisis del analito mediante el empleo de la columna apolar, se llevo a cabo la cuantificaci´on del compuesto, empleando dos m´etodos distintos para ello: el m´etodo el patr´on externo y el m´etodo de adiciones patr´on. El extracto a analizar es el obtenido mediante maceraci´on, puesto que, como se observ´o anteriormente, el extracto extra´ıdo mediante Sohxlet no presentaba ning´un pico en el ´area de an´alisis del patr´on. M´etodo de patr´on externo para el Estigmasterol Para la ejecuci´on de este m´etodo, en el extracto macerado se procedi´o a realizar la medidas de patr´on de concentraciones comprendidas entre 4 mg/l y 40 mg/l (tabla 5.1). Los resultados presentan una tendencia lineal ajust´andose a la recta de ecuaci´on ´ Area = 10,178C−0,7901 y cuyo coeficiente de regresi´on R2= 0,9996, presentada en la gr´afica 5.1. La ecuaci´on de la recta Concentraci´on (mg/l) ´ Area (mAU/s−1) 4,0 42,2707 8,0 80,5014 16,0 155,2484 20,0 206,9016 40,0 406,7560 Tabla 5.1: Tabla patr´on externo estigmasterol obtenida presenta la expresi´on El gr´afico de residuales de la recta de regresi´on (figura 5.2) no presenta tendencia, por lo que se puede concluir que los datos se ajustan a una recta. Sustituyendo por el valor del ´area obtenido al analizar el extracto (figura 4.5), se obtiene el valor de 7,89 mg/l, siendo el valor total en la muestra de extracto de 0,15 mg por cada gramo extra´ıdo. 31 32 CAP´ ITULO 5. RESULTADOS Y DISCUSI ´ ON Figura 5.1: Recta de calibrado mediante el m´etodo de patr´on externo para el Estigmasterol Figura 5.2: Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de patr´on externo para el estigmasterol M´etodo de adiciones patr´on para el Estigmasterol Posteriormente se realiza el m´etodo de adiciones patr´on a fin de evitar el posible efecto matriz. Este ser´ıa el m´etodo indicado en matrices complejas, como ocurre en el caso del extracto de una planta, puesto que la cantidad de compuestos org´anico es elevada, adem´as de que pueden presentar polaridades semejantes, dificultando as´ı la identificaci´on de un pico cromatogr´afico que pueda asignarse con certeza al compuesto que buscamos. En lo tocante al an´alisis mediante el m´etodo de adiciones patr´on, fueron preparadas distintas disoluciones patr´on comprendidas entre 5 y 50 ppm, como puede observarse en la tabla 5.2, donde se ven las ´areas correspondientes. Las medidas se realizaron por triplicado. Concentraci´on (mg/l) ´ Area (mAU/s−1) 0 39,3572 5 83,5385 10 162,9310 15 231,8086 20 274,1570 25 325,1280 50 652,6528 Tabla 5.2: Tabla adiciones patr´on estigmasterol 5.2. CROMATOGRAF´ IA DE GASES CON DETECTOR DE IONIZACI ´ ON DE LLAMA 33 Figura 5.3: Recta de calibrado mediante el m´etodo de adiciones patr´on para el Estigmasterol Figura 5.4: Gr´afica de los residuales de la regresi´on del m´etodo de adiciones patr´on para el Estigmasterol Los resultados se ajustan a una recta de ecuaci´on ´ Area = 33,572C+ 12,276 con coeficiente de regresi´on R2= 0,9959, reflejada en la gr´afica 5.3, el gr´afico de los residuales (figura 5.4) no exhibe una tendencia clara, por lo que los resultados se ajustan a una recta. Interpolando en dicha recta se obtiene que el valor de la concentraci´on en el extracto es igual a 5,47 mg/l, obteni´endose 0,10 mg por cada gramo de material vegetal seco. Comparando ambos m´etodos de cuantificaci´on, se observa que los valores entre ambos difieren, por lo que se constata que existe efecto matriz. Por lo tanto, el m´etodo m´as conveniente de an´alisis de compuesto de inter´es en la muestra ser´ıa el m´etodo de adiciones patr´on. 5.2. Cromatograf´ıa de gases con detector de ionizaci´on de llama Puesta a punto la t´ecnica de medida con las condiciones comentadas con anterioridad, se procedi´o a la cuantificaci´on del polygodial extra´ıdo mediante diferentes t´ecnicas. En los ensayos previos que se hicieron se observ´o proporcionalidad directa entre las ´areas, pero la cuantificaci´on se realiz´o exclusivamente mediante el m´etodo de adiciones patr´on. Cap´ıtulo 6 Conclusiones En el desarrollo de este trabajo se ha puesto a punto dos m´etodos para determinar en material vegetal, previa extracci´on en disolventes org´anicos, compuestos que presentan inter´es farmacol´ogico e inter´es pesticida y repelente. Estigmasterol El estigmasterol se analiz´o y determin´o mediante HPLC con detector UV/Vis empleando una fase m´ovil de 70 % acetonitrilo y 30 % metanol, dando un pico cromatogr´afico definido y posteriormente se cuantific´o en extracto obtenido por maceraci´on del material vegetal, encontr´andose una cantidad por encima del l´ımite de detecci´on del m´etodo. Las cantidades determinadas de esta planta, constituyen el 0,01 % del peso total de la planta. Polygodial El polygodial se analiz´o mediante cromatograf´ıa de gases, resultando en un pico bien definido, en un tiempo de retenci´on del orden de 16,7 minutos para posteriormente identificar el compuesto en el extracto y por ´ultimo cuantificar. Analizando los diversos extractos de plantas se han determinado cantidades del orden de miligramos por gramo de muestra, encontr´andose la cantidad extra´ıda en un intervalo de porcentajes entre el 0,03 % y el 0,09 % del peso total de la planta seca. La mayor cantidad se obtiene mediante extracci´on en Soxhlet. Ambos m´etodos han proporcionado resultados exitosos en lo referente a la cuantificaci´on de los compuestos, aun siendo las cantidades extra´ıdas un peque˜no porcentaje en comparaci´on con la cantidad de muestra empleada en la extracci´on, por lo que se recomiendo emplear m´etodos de mayor sensibilidad para mejorar la precisi´on como CG-MS, aunque ambos m´etodos ofrecen resultados aceptables frente al alto coste econ´omico que implica la utilizaci´on del equipo CG-MS. 41 Bibliograf´ıa [1] Roger Dajoz, Tratado de ecolog´ıa, segunda edici´on. Ed. Mundi-Prensa [2] Dantzig, G.B. yP. Wolfe,((The world of organic agriculture)),FIL y FOAMORGANICS INTERNATIONAL. (2014) [3] Jorge V. Crisci y Omar A. Gancedo ((Sistem´atica y Etnobot´anica del G¨uemb´e)), (1971) Secci´on Bot´anica, XI, pags. 285-302. [4] Scapinello, Jaqueline and Aguiar, Gean Pablo S. and Dal Magro, Camila and Capelezzo, Ana P. and Niero, Rivaldo and Dal Magro, Jacir and de Oliveira, D´ ebora and Oliveira, J. Vladimir ((Extraction of bioactive compounds from Philodendron bipinnatifidum Schott ex Endl and encapsulation in PHBV by SEDS technique)), Industrial Crops and Products 125 (2018), 65-71. [5] Bolson, Mˆ onica and Hefler, Sonia Regina and Dall’Oglio Chaves, Elisiane Inˆ es and Gasparotto Junior, Arquimedes and Cardozo Junior, Euclides Lara ((Ethno-medicinal study of plants used for treatment of human ailments, with residents of the surrounding region of forest fragments of Paran´a, Brazil)),Journal of Ethnopharmacology, 161 (2015), 1-10. [6] Alves, Tˆ ania Maria De Almeida and Ribeiro, Fabiane Lacerda and Kloos, Helmut and Zani, Carlos Leomar ((Polygodial, the Fungitoxic Component from the Brazilian Medicinal Plant Polygonum punctatum)), Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 96 (2001), no. 6, 831-833. [7] Mart´ınez, Miguel and Ben´ıtez, Bonifacia and Alvarez, Sandra and Prieto, Rebeca and Valdo, Gil and Da, Jos´e and Bravo, Jos´e A and Vila, Jos´e L ((Determination of an Active Principle of Polygonum Punctatum Elliot)), Bolivian Journal of Chemistry, 34 (2017), no. 1, 14-17. [8] Leit˜ao, Fernanda and Guimar˜aes, Suzana and Stern, Viviane and Machline, Ines and Martins, Karine ((Original article Medicinal plants traded in the open-air markets in the State of Rio de Janeiro , Brazil : an overview on their botanical diversity and toxicological potential)) Revista Brasileira de Farmacognosia 24 (2014), no. 2, 225-247. [9] Scarpa, Gustavo F ((Medicinal plants used by the Criollos of Northwestern Argentine Chaco)),91 (2004), no. September 2003, 115-135. [10] Pignal, Marc and Romaniuc, Sergio and Grael, Cristiane F F and Fagg, Christopher W and Brand, Maria G L((Useful Brazilian plants listed in the field books of the French naturalist Auguste de Saint-Hilaire ( 1779 – 1853 ))),143 (2012), 488-500. [11] Tareq, Mahmud and Khan, Hassan and Ather, Arjumand and Thompson, Kenneth D and Gambari, Roberto ((Extracts and molecules from medicinal plants against herpes simplex viruses)) 67 (2005), 107-119. [12] Li, Kang and Yuan, Dawei and Yan, Rong and Meng, Lei and Zhang, Yong and Zhu, Kun ((Stigmasterol exhibits potent antitumor effects in human gastric cancer cells mediated via inhibition of cell migration, cell cycle arrest, mitochondrial mediated apoptosis and inhibition of JAK/STAT signalling pathway)) Journal of B.U.O.N. 23 (2018), no. 5, 1420-1425. [13] Panda, S. and Jafri, M. and Kar, A. and Meheta, B. K. ((Thyroid inhibitory, antiperoxidative and hypoglycemic effects of stigmasterol isolated from Butea monosperma)) Fitoterapia 80 (2009), no. 2, 123-126. [14] Asakawa, Yoshinori and Dawson, G.W. and Griffiths, D.C. and Lallemand, J.-Y. and Ley, S.V., Mori ((Activity of drimane antifeedants against aphids, and comparative biological effects and chemical reactivity of (-)- and (+)- polygodial)) (1988), no. 10, 1845-1855. 43 44 BIBLIOGRAF´ IA [15] Pickett, J A and Wadhams, L J and Woodcock, C M ((Developing sustainable pest control from chemical ecology)), Agriculture, Ecosystems and Environment 64 (1997), no. 2, 149-156. [16] Asakawa, Yoshinori and Ludwiczuk, Agnieszka and Nagashima, Fumihiro ((Phytochemistry Phytochemical and biological studies of bryophytes)), Phytochemistry 91 (2013), 52-80. [17] Derita, M. G. and Leiva, M. L. and Zacchino, S. A. ((Influence of plant part, season of collection and content of the main active constituent, on the antifungal properties of Polygonum acuminatum Kunth)), Journal of Ethnopharmacology. 124 (2009), no. 3, 337-383. [18] Lorimer, Stephen D and Perry, Nigel B and Foster, Lysa M and Burgess, Elaine J and Douch, Philip G C and Hamilton, Mary C and Donaghy, Morgan J and Mcgregor, Rachael A ((A Nematode Larval Motility Inhibition Assay for Screening Plant Extracts and Natural Products)), 1 (1996), 2842-2845. [19] Derita, Marcos G. and Gattuso, Susana J. and Zacchino, Susana A. ((Occurrence of polygodial in species of Polygonum genus belonging to Persicaria section)), Biochemical Systematics and Ecology 36 (2008), no. 1, 55-58. [20] Lagarda, M. J. and Garc´ıa-Llatas, G. and Farr´e, R. ((Analysis of phytosterols in foods)), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41 (2006), no. 5, 1486-1496. [21] Grace, Mary H. and Esposito, Debora and Timmers, Michael A. and Xiong, Jia and Yousef, Gad and Komarnytsky, Slavko and Lila, Mary Ann ((Chemical composition, antioxidant and anti-inflammatory properties of pistachio hull extracts)), Food Chemistry 210 (2016), 85-95. [22] Nair, V. D.P. and Kanfer, I. and Hoogmartens, J. ((Determination of stigmasterol, β-sitosterol and stigmastanol in oral dosage forms using high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection)), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41 (2006), no. 3, 731-737. [23] S´anchez-Machado, D. I. and L´opez-Hern´andez, J. and Paseiro-Losada, P. and L´opez-Cervantes, J. ((An HPLC method for the quantification of sterols in edible seaweeds)), Biomedical Chromatography 18 (2004), no. 3, 183-190. [24] Dias, Irundika H.K. and Wilson, Steven R. and Roberg-Larsen, Hanne ((Chromatography of oxysterols)), Biochimie 153 (2018), 3-12. [25] Sriraman, Sandhiya and Ramanujam, Ganesh Munuswamy and Ramasamy, Mohan Kumar and Dubey, Govind Prasad ((Identification of beta-sitosterol and stigmasterol in Bambusa bambos (L.) Voss leaf extract using HPLC and its estrogenic effect in vitro)), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 115 (2015), 55-61. [26] Talreja, Tamanna and Kumar, Mangesh and Goswami, Asha and Gahlot, Ghanshyam and Jinger, Surendra Kumar and Sharma, Tribhuwan ((Qualitative and quantitative estimation of phytosterols in Achyranthes aspera and Cissus quadrangularis by HPLC )), The Pharma Innovation Journal 6(2017), no. 1, 76-79. [27] http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/polygonaceae/polygonum-punctatum/fichas/ficha.htm ANEXOS 1 Anexo I: HPLC detector UV-Vis Figura 1: Cromatograma patr´on 10 ppm. Columna CN. Fase m´ovil, 70 % acetonitrilo, 30 % metanol. 3 4 Figura 2: Cromatograma patr´on 10 ppm. Columna CN. Fase m´ovil 30 % acetonitrilo, 30 % metanol, 40 % agua. 5 Figura 3: Cromatograma patr´on 10 ppm. Columna CN. Fase m´ovil 50 % acetonitrilo, 50 % metanol. 12 Figura 10: Cromatograma patr´on 16 ppm columna C18 13 Figura 11: Cromatograma patr´on 20 ppm columna C18 14 Figura 12: Cromatograma patr´on 40 ppm columna C18 15 Figura 13: Cromatograma adiciones patr´on 10 ppm columna C18 Figura 14: Cromatograma adiciones patr´on 20 ppm columna C18 16 Figura 15: Cromatograma adiciones patr´on 25 ppm columna C18 Figura 16: Cromatograma adiciones patr´on 100 ppm columna C18 Anexo II: CG-FID Figura 17: Cromatograma patr´on polygodial. En el an´alisis se emplean dos rampas: la primera de 20 º C/min desde 80 º C hasta 190 º C y la segunda de 5 º C/min desde 190 º C hasta 250 º C. Figura 18: Cromatograma patr´on polygodial en hexano. La rampa utilizada consitse en una rampa de 20 º C/min partiendo de 80 º C y llegando hasta 250 º C. 17 18 Figura 19: Cromatograma patr´on polygodial en hexano. La rampa utilizada consiste en una ´unica rampa de 50 º C/min partiendo de 150 º hasta llegar a 280 º C. Figura 20: Extracto en hexano mediante Soxhlet de Polygonum Punctatum. La rampa utilizada consiste en una ´unica rampa de 20 º C/min partiendo de 80 º C y llegando hasta 250 º C. 19 Figura 21: Extracto en metanol mediante Soxhlet de Polygonum Punctatum La rampa utilizada consiste en una ´unica rampa de 20 º C/min partiendo de 80 º C y llegando hasta 250 º C. 20 Figura 22: Cromatograma de extracto en hexano. Adici´on 1, total concentraci´on de patr´on de 10 ppm 21 Figura 23: Cromatograma de extracto en hexano. Adici´on 2, total concentraci´on de patr´on de 20 ppm 28 Figura 30: cromatograma de extracto en metanol. Adici´on 3, total de concentraci´on de patr´on de 30 ppm 29 Figura 31: Cromatograma de extracto en metanol. Adici´on 4, total de concentraci´on de patr´on de 40 ppm 30 Figura 32: Cromatograma de extracto diclorometano. Adici´on 1, total de concentraci´on de patr´on de 10 ppm 31 Figura 33: Cromatograma de extracto diclorometano. Adici´on 2, total de concentraci´on de patr´on de 20 ppm 32 Figura 34: Cromatograma de extracto diclorometano. Adici´on 3, total de concentraci´on de patr´on de 30 ppm 33 Figura 35: cromatograma de extracto diclorometano. Adici´on 4, total de concentraci´on de patr´on de 40 ppm