Estudio conformacional de la norleucina

1 Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Estudio conformacional de la norleucina Autor: Néstor Badás Molpeceres Tutores: Susana Blanco y Juan Carlos López. 2 3 Índice 1. Abstract/Resumen ................................................................................................................ 5 2. Introducción.......................................................................................................................... 6 3. Objetivos y plan de trabajo.................................................................................................. 15 4. Fundamento teórico............................................................................................................ 16 4.1 Introducción .................................................................................................................. 16 4.2 Aproximación de Born-Oppenheimer ............................................................................ 18 4.3 Métodos de cálculo ....................................................................................................... 20 4.3.1 Método de Hartree-Fock ........................................................................................ 20 4.3.2 Métodos post Hartree Fock .................................................................................... 32 4.3.3 Métodos semiempíricos ......................................................................................... 35 4.3.4 Métodos DFT (Density Functional Theory) .............................................................. 36 5. Resultados .......................................................................................................................... 39 5.1 Procedimiento ............................................................................................................... 39 5.2 Tablas de resultados ...................................................................................................... 41 5.2.1 Tablas de energías, constantes y poblaciones ......................................................... 44 5.2.2 Distancias y ángulos entre planos ........................................................................... 50 5.3 Simulación del espectro de rotación .............................................................................. 56 6. Conclusiones ....................................................................................................................... 59 7. Bibliografía .......................................................................................................................... 60 4 5 1. Abstract/Resumen English: Non proteinogenic aminoacids have traditionally been disregarded in the synthesis of proteins in favor of the proteinogenic aminoacids. The recently found applications for these non proteinogenic aminoacids have renewed the interest on the study of such molecules and its properties. While on a biological matrix the aminoacids are typically ionized forming zwitterions, the study of the neutral aminoacids in isolation conditions is best achieved in gas phase. In order to carry out experiments to determine the structure of the isolated molecules it is useful to make a theoretical study to search for the most stable conformers and its abundances, prior to the experimental study. This work is a compilation of the results of a theoretical study using ab initio and DFT theoretical methods on the most stable conformers of norleucine, a chiral ramificated aminoacid with four atoms of carbon on its chain. A fundamental goal is to study the stability of the conformers and the factors that explain such stability. Español: Los aminoácidos no proteinogénicos tradicionalmente han estado eclipsados por los aminoácidos proteinogénicos en la síntesis de proteínas. Esto se debe a que la síntesis de proteínas ha estado hasta hace poco limitada al uso de aminoácidos canónicos. Las nuevas aplicaciones para estos aminoácidos no proteinogénicos han renovado el interés en el estudio de estas moléculas y sus propiedades. Pese a que en medio biológico los aminoácidos están normalmente ionizados en forma de zwitteriones el estudio de los aminoácidos neutros en condiciones de aislamiento se realiza en fase gas. Para llevar a cabo experimentos sobre la estructura de estas moléculas es útil hacer un estudio teórico previo de las estructuras y abundancias de los confórmeros más estables, antes de su estudio experimental. Este trabajo es una recopilación de resultados del estudio teórico usando métodos ab initio y DFT, sobre los confórmeros más estables de la norleucina, un aminoácido quiral con una cadena de cuatro átomos de carbono. Un objetivo fundamental es estudiar la estabilidad de los confórmeros y los factores que contribuyen a esa estabilidad. 6 2. Introducción La norleucina es un -aminoácido no proteinogénico (no forma parte de las proteínas) de seis carbonos de estructura análoga a la metionina pero sin azufre (Figura 1), que se ha encontrado de manera natural asociado a algunas cepas bacterianas. Se detectó por primera vez en un péptido antifúngico producido por la Bacillus subtilus [1]. La norleucina se puede obtener como subproducto de la síntesis de la leucina, cuando se usa piruvato o α-cetobutirato en lugar de α-cetoisovalerato [2] o como producto de la desaminización de la L-lysina. [3] Pese a que no forma parte del código genético de las proteínas, la norleucina tiene propiedades biológicas conocidas: se sabe que la L-norleucina previene el daño cerebral en la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce [4] que ocurre cuando la leucina se acumula en el cerebro y se convierte en ácido α-cetoisocaproico. Dado que la norleucina tiene una estructura muy similar a la leucina (Figura 1), ambas compiten por ocupar un lugar específico en el transportador de aminoácidos neutros grande (LAT1) que lleva aminoácidos al cerebro, por lo que cantidades controladas de norleucina en el cuerpo pueden limitar la concentración de leucina que llega al cerebro. Se ha observado que es una molécula con propiedades antifúngicas [5,6] , y se puede utilizar con otros medicamentos que se absorben por la piel para acelerar su Lisina Metionina Norleucina Figura 1 Moléculas de L-Lisina, L-Metionina, L-Norleucina y L-Leucina. Leucina 7 asimilación [7]. Además de ser necesaria para el correcto crecimiento de los huesos, juega un papel en el equilibrio de los niveles de nitrógeno en el cuerpo humano y tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. [8]. Su papel biológico no es lo único que la hace interesante. Otro de los campos de estudio es el de la síntesis de biopolímeros utilizando aminoácidos no proteinogénicos como monómeros. En los últimos años ha aumentado el número de estudios para la síntesis de aminoácidos no convencionales, tanto in vivo como in vitro, por sus aplicaciones a la síntesis de nuevas proteínas, tradicionalmente limitada al uso de aminoácidos proteinogénicos [9,10]. La utilización de aminoácidos no proteinogénicos es por tanto algo relativamente nuevo para la bioquímica, que permite ampliar el número de cadenas proteicas y las estructuras que se pueden construir, con respecto de utilizar solamente aminoácidos proteinogénicos [10]. La estructura y propiedades de las proteínas dependen, entre otras, de los aminoácidos que lo componen, es por ello que el uso de aminoácidos no convencionales podría conducir a la síntesis de nuevas proteínas, o al descubrimiento de nuevas rutas sintéticas artificiales para proteínas. Por tanto el estudio de las propiedades de los aminoácidos (AAs) es un campo de conocimiento no solo de interés puramente químico, sino también para diferentes áreas de la medicina y bioquímica con aplicaciones directas en estos campos. Una de estas propiedades a estudiar es la estructura, directamente relacionada con la reactividad de los aminoácidos. Por ello es interesante conocer las conformaciones que estos aminoácidos pueden adoptar. Los aminoácidos pueden presentarse en diferentes formas ya que actúan como anfóteros, no obstante la forma neutra canónica es la estructura que presentan cuando están aislados. Es por ello que el estudio de los aminoácidos en fase gas es una forma ideal para estudiar las propiedades intrínsecas de los aminoácidos. El estudio sobre las moléculas de interés biológico y sus propiedades como estructura y reactividad se realiza desde las macromoléculas más grandes, como proteínas, hasta los bloques estructurales más pequeños, como son los aminoácidos. Desde hace décadas el interés en el estudio de este campo ha aumentado considerablemente desde áreas diferentes de la Biología, Química y Física. Una de las metas principales es obtener información de las propiedades de las biomoléculas derivadas de su 8 estructura a nivel molecular. Por ello en los últimos años ha crecido el interés en el estudio de las biomoléculas en condiciones de aislamiento, como una buena forma de conocer las propiedades inherentes a dichas moléculas. Los ensayos en fase gas representan una oportunidad perfecta para realizar el estudio de estas propiedades inherentes en condiciones de aislamiento. [11-14]. Los aminoácidos pueden formar cadenas a través de su unión mediante el enlace peptídico. Las cadenas que resultan de esta interacción forman lo que llamamos estructura primaria. Este junto con la influencia de otras moléculas del medio, principalmente agua, ordena las cadenas de péptidos dando lugar a ordenaciones superiores en forma de estructura secundaria, terciaria y cuaternaria (Figura 2). Las aminoácidos en medio biológico suelen estar disolución acuosa como iones divalentes o zwitteriones, pero en fase gas se presentan como moléculas neutras, lo que permite estudiar dichas moléculas en condiciones de aislamiento, que aportará información sobre las propiedades inherentes de éstas debido a su estructura. [15] Los puentes de hidrógeno y otras interacciones no covalentes intramoleculares también juegan un papel importante en la formación de la estructura superior de las proteínas. Es por ello que resulta de interés conocer el papel de dichas interacciones en la estabilización de los confórmeros más estables de los aminoácidos. Este trabajo se centrará en las interacciones intramoleculares de un aminoácido, la norleucina. Figura 2 Órdenes de organización de las proteínas 9 Debido a la variabilidad conformacional que pueden presentar los aminoácidos antes de entrar en su estudio se debe explicar la nomenclatura [16] para la designación de los diferentes confórmeros en función del tipo de enlace de hidrógeno: Se utilizará a molécula objeto de estudio de este trabajo, la norleucina (Figura 3), para ilustrar las explicaciones: La clasificación utilizada se basa en la posición relativa de los grupos amino y carboxilo. Así se distinguen tres confórmeros: -De tipo I: En ellos existe un puente de hidrógeno entre los hidrógenos del grupo amino y el oxígeno con doble enlace del grupo carboxilo (NH···O) (Figura 4). -De tipo II: En los que el puente de hidrógeno se forma entre el hidrógeno del OH y el amoniaco del grupo amino (OH···NH) (Figura 5). -De tipo III: El puente de hidrógeno se forma entre los hidrógenos del grupo amino y el oxígeno del OH (NH···OH) (Figura 6). Figura 3 Molécula de L-Norleucina Figura 4 Ejemplo de interacción de tipo I Figura 5 Ejemplo de interacción de tipo II Figura 6 Ejemplo de interacción de tipo III 16 4. Fundamento teórico 4.1 Introducción La mecánica cuántica surge en el primer cuarto del siglo XX y se desarrolla posteriormente como un modelo matemático alternativo a la mecánica clásica, para entender el comportamiento de las partículas microscópicas. La aplicación de la mecánica cuántica permitió la resolución de problemas hasta entonces inexplicables por la física clásica como la emisión de radiación de un cuerpo negro en frecuencias superiores al visible o la estabilidad de los átomos o el efecto fotoeléctrico. [30] Aplicando los principios mecanocuánticos se pueden predecir las propiedades de una partícula, o un conjunto de partículas, generalmente resolviendo la ecuación de Schrödinger mediante aproximaciones. La ecuación de Schrödinger dependiente del tiempo para una partícula en un espacio monodimensional es: [4.1] Tiene una solución exacta para sistemas que solo presentan un electrón, pero en el resto de sistemas es necesario utilizar aproximaciones para obtener un resultado. En cualquier caso para las metodologías utilizadas en este trabajo no es necesario tener en cuenta la influencia del tiempo en el sistema, ya que los valores de energía que se buscan son estacionarios, por lo que para trabajar se puede utilizar la ecuación de Schrödinger independiente del tiempo [30]: [4.2] 17 El operador aplicado a la función de onda se llama operador Hamiltoniano, y se define como: [4.3] Que se puede reescribir como: [4.4] Para un sistema que se encuentra en un espacio tridimensional y está compuesto de varios átomos, y la función de onda y el Hamiltoniano dependerán de las coordenadas de los nucleos y los electrones . Reescribiendo la ecuación de Schrödinger para una molécula poliatómica: [4.5] El operador Hamiltoniano se describe como la suma de todos los operadores que contribuyen a la energía en el sistema, que son: la energía cinética de los núcleos Tnn( ) , la energía cinética de los electrones Tee( , el potencial de repulsión entre los electrones Vee( , el potencial de repulsión de los nucleos Vnn( y el potencial de atracción entre electrones y núcleos Vne( . El Hamiltoniano por tanto quedará como: [4.6] 18 Que para un sistema de N electrones y M nucleos se define como:            4.2 Aproximación de Born-Oppenheimer La existencia del término de atracción entre núcleos y electrones requiere que a la hora de resolver la ecuación de Schrödinger se tenga en cuenta simultáneamente la posición de electrones y núcleos, lo que lo hace irresoluble. No obstante, puesto que los núcleos son considerablemente más pesados que los electrones, se los puede considerar como partículas estáticas con respecto de los electrones. En esto consiste la aproximación Born-Oppenheimer[31]. Si aproximamos para el sistema que los núcleos están parados, se puede considerar que los movimientos de los electrones son independientes del movimiento de los núcleos, lo que permite despreciar la contribución cinética de los núcleos , considerar que el término de repulsión de los núcleos es constante , y finalmente que el término de atracción entre electrones y núcleos , depende exclusivamente de la posición de los electrones. Por tanto al realizar la aproximación Born-Oppenheimer el Hamiltoniano se aproxima a: [4.8] Aplicando este operador sobre la función de onda se obtiene la ecuación de Schrödinger electrónica: [4.9] [4.7] 19 La resolución de esta expresión, considerablemente más fácil que la ecuación de Schrödinger completa, para cada posición de los núcleos permite obtener la energía electrónica asociada al sistema en función de la posición de los núcleos. La representación de dicha energía en relación con la posición de los núcleos permite obtener una gráfica que se conoce como Superficie de Energía Potencial, SEP que es en realidad una hipersuperficie si el sistema tiene más de dos núcleos. La SEP es la representación de la energía electrónica frente a las diferentes coordenadas interatómicas del sistema (Figura 15). Es de interés para el estudio teórico de las moléculas, ya que los mínimos globales se corresponden con las conformaciones más estables del sistema, y puntos de silla de primer orden (que son mínimos en todas las direcciones, menos en una que son máximos) con configuraciones intermedias o estados de transición[32]. Además esta hipersuperficie representa la función de energía potencial asociada a las vibraciones moleculares. Figura 15 Ejemplo de SEP 20 4.3 Métodos de cálculo Se puede realizar una primera división de los métodos de cálculo en función de las aproximaciones realizadas para resolver la ecuación de Schrödinger, que de otra manera sería irresoluble debido a la presencia del término de repulsión electrónelectrón. -Si se realiza el cálculo sin sustituir ningún parámetro por valores experimentales los métodos se denominan ab initio. A su vez dentro de este grupo hay variantes según las aproximaciones utilizadas para resolver la ecuación de Schrödinger. -Si se sustituye algún parámetro de la ecuación por valores obtenidos experimentalmente se habla de métodos semiempíricos, que son útiles para obtener resultados para sistemas grandes en tiempos menores de lo que permitiría un método ab initio. -Alternativamente existen métodos de cálculo no mecanocuánticos, como los de Mecánica Molecular, que aproximan el sistema atómico como un sistema de bolas y muelles y está basado en la mecánica clásica. Estos métodos tienen utilidad para macromoléculas y sistemas complejos 4.3.1 Método de Hartree-Fock [33,34] Es también conocido como método del campo autoconsistente. Como se ha descrito antes, la energía de cada electrón depende de las posiciones del resto de electrones en cada instante. Se puede realizar un promedio del campo eléctrico generado por los otros electrones y aproximar la repulsión interelectrónica como la repulsión de cada electrón con dicho campo promedio. Se parte de la ecuación de Schrödinger electrónica, el Hamiltoniano electrónico es: [4.10] 21 En esta expresión los sumatorios en i y j se extienden a los N electrones del sistema y  se extiende al número de núcleos M. El término de es el hamiltoniano monoelectrónico que se corresponde con la energía que tendría un electrón si éste fuera el único que estuviera en la molécula. El término incluye su energía cinética y la contribución de la atracción entre los núcleos de la molécula y ese electrón.    La ecuación de Schrödinger electrónica se resuelve para obtener el conjunto de funciones de onda con sus correspondientes energías. El método es iterativo y funciona de la siguiente manera[32,33]: -Se eligen unas funciones de base iniciales, y se realiza una combinación lineal de dichas funciones que dará lugar a la función de onda total, esta función resultante debe ser antisimétrica y se puede reescribir como un determinante, formando el determinante de Slater, que es lo que se usará como función de onda de prueba en la ecuación de Schrödinger. -Se definen unos operadores mecanocuánticos (Operadores de Fock), que aparecen al aplicar el Hamiltoniano a la función de prueba función de prueba. Estos operadores se usan para calcular la energía del sistema. -Mediante el método de variaciones se minimiza la energía del sistema con respecto de la función de prueba. Se obtienen las ecuaciones de Fock, que se deben resolver para obtener una nueva función de onda, que tendrá otra energía asociada. -Con esta segunda función de onda se construyen otro nuevos operadores de Fock y se resuelve, obteniendo una nueva función de onda, con otra energía asociada. Se repite esta iteración hasta que se cumple la condición de convergencia: que la diferencia de valores entre el resultado obtenido, y el resultado obtenido del paso inferior sea menor que un valor límite para la convergencia. Entonces se deja de iterar y se asume el valor obtenido como resultado. (Se obtiene una energía y una función de onda). [4.11] 22 4.3.1.1 Construcción de los Determinantes de Slater [31,32] El primer paso por tanto consiste en la construcción del determinante de Slater, expresión que actuará como función de onda inicial sobre la que operar. Este determinante se genera inicialmente como un producto de las funciones de onda monoelectrónicas de todos los electrones. Si un electrón 1 tiene una función de onda 1 y unas coordenadas espaciales x1. Un sistema con n electrones formará la función de onda como producto de estas funciones de onda individuales de manera que la función de onda total será:  1,  2,  3,…,  n  1 x1  2 x2  3 x3 ….  n xn [4.12] Que además tiene que cumplir la condición antisimetría, es decir:   1,  2,  3,…,  n  1,  3,  2,…,  n [4.13] Para satisfacer esta condición siempre, no vale simplemente con aplicar el producto directo de las funciones de onda de los electrones, es necesario realizar una combinación tal que para un sistema de N electrones el determinante de Slater es: [4.14] Donde se usa el término Como constante de normalización. 23 En el determinante cada fila representa cada uno de los electrones del sistema, y cada columna representa el espín-orbital para su electrón correspondiente. Intercambiar dos electrones se corresponde con intercambiar dos filas con el determinante cambiando de signo. Si hubiera dos filas iguales (dos electrones con el mismo spinorbital) el determinante se anula, esto permite cumplir el principio de exclusión de Pauli y asegura la condición de antisimetría. El determinante de Slater se puede escribir de manera abreviada como:     [4.15] Lo primero por tanto es contruir el determinante de Slater a partir de un conjunto ortonormal de spin-orbitales (normalizados y ortogonales entre sí). Los spin-orbitales pueden estar sujetos a restricciones de simetría:   [4.16] [4.17] 4.3.1.2 Definición de operadores En un sistema de N electrones en el que se tiene un determinante de Slater de la forma abreviada [4.15] se introduce en la ecuación de Schrödinger, se opera y se reorganizan los términos se obtiene una expresión para la energía total del sistema tal que: [4.18] 24 Siendo la integral correspondiente al elemento ii de la matriz del operador Hamiltoniano monoelectrónico para el electrón 1:   [4.19] es la integral de Coulomb que incluye el potencial electrostático del electrón 1 localizado en el spin-orbital  al verse afectado por el campo eléctrico creado por el electrón 2 localizado en el spin-orbital  . es la integral de intercambio y aparece como consecuencia de la antisimetría introducida en la función de onda de prueba a través del determinante de Slater.     [4.20]     [4.21] Estas integrales pueden considerarse como los elementos ij de las matrices de dos operadores. El operador de Coulomb y el operador de intercambio .     [4.22]     [4.23] Las integrales de Coulomb y de intercambio se pueden expresar como:     [4.24] Finalmente se define el operador de Fock , que incluye la energía cinética del electrón y de la atracción hacia los núcleos a través del operador Hamiltoniano monoelectrónico y además de la repulsión media con el campo creado por los demás electrones a través de los operadores de Coulomb y de intercambio. [4.25] 25 En el Operador de Fock están integrados los spin-orbitales del Determinante de Slater a través de las definiciones de los operadores de Coulomb y de intercambio. 4.3.1.3 Minimización de la energía: Método Variacional Parte del teorema de Eckart [35] según el cual el valor esperado de la energía obtenido para una función de onda aproximada siempre es mayor que el valor real de la energía. Se busca el conjunto de parámetros que den un valor mínimo de la energía esperada (el valor mas aproximado al verdadero) que serán los que den lugar a la función de onda que mejor defina el sistema.  Siendo la Energía la definida en la expresión [4.18], resulta: Se opera con los operadores expuestos previamente y se reordena la expresión, resultando en las ecuaciones de Fock:   Siendo = 1,2,3,…,N No existe un único conjunto de spin-orbitales que sean solución a las ecuaciones de Fock y minimicen la energía . Uno de estos conjuntos da lugar a una matriz para los elementos que resulta ser un matriz diagonal, los spin-orbitales de dicho conjunto se denominan spin-orbitales canónicos, en función de los cuales las ecuaciones de Fock se convierten en: [4.27] [4.28] [4.26] 32 funciones difusas s y p a los átomos pesados, y funciones difusas s a los átomos de hidrógeno. La parte entre paréntesis significa que a la base se le añaden dos funciones de polarización d a los átomos pesados y una función de polarización p a los átomos de hidrógeno. 4.3.2 Métodos post Hartree Fock 4.3.2.1 Método de Møller–Plesset [39] Los métodos post Hartree Fock son aquellos que van un paso mas allá y tienen en cuenta la energía de correlación electrónica, en vez de considerar que el conjunto de electrones genera un campo eléctrico global. En concreto para este trabajo se ha utilizado el método de perturbaciones de Møller–Plesset. Se parte de la base de que el sistema a estudiar es similar a otro sistema cuya solución es conocida. El Hamiltoniano del sistema a estudiar se considera una combinación del Hamiltoniano cuyo sistema es de solución conocida, Ho, más un término de perturbación, que es la diferencia de energía entre los dos sistemas. Por tanto la ecuación de Schrödinger para el sistema a estudiar será: [4.40] Y la ecuación de Schrödinger para el sistema sin perturbar es: [4.41] Definiendo un parámetro  , que puede valer desde cero (el sistema a estudiar y el sistema conocido son iguales) hasta la unidad (la perturbación es máxima). Se puede escribir el Hamiltoniano del sistema a estudiar como una suma del Hamiltoniano del 33 sistema que ya tiene solución (0) (que corresponde con la solución obtenida por HF), mas un término de perturbación ’, parametrizado por :  [4.42] Para cualquier valor de  se pueden obtener los valores de energías y funciones de onda asociadas, mediante desarrollos en serie de Taylor, con expresiones del tipo:    [4.43]    [4.44] Si eventualmente se trabaja con diferente valores de  hasta que se llegue a  = 1 , entonces las expresiones de arriba quedarán como una suma de los términos de orden cero, de orden uno, orden dos, …, así hasta orden n. Los valores E(0) y  son las soluciones ya conocidas, que son las de orden cero; los valores E(1) y  son la corrección a la solución de primer orden; los valores E(2) y son la corrección de la solución de segundo orden, así hasta los valores E(n) y nque serán la corrección de la solución de orden n. Si se sustituye dicho desarrollo en series de Taylor en la Ecuación de Schrödinger para el sistema de estudio se obtiene:            [4.45] Para que la anterior expresión se cumpla es necesario que los términos a ambos lados de la igualdad sean iguales para cada potencia de : -Para 0    [4.46] -Para 1   [4.47] 34 -Para 2 [4.48] -De forma general para n La potencia de  representa las solución ya conocida si es de orden cero, la corrección de primer orden es la de , la de segundo orden es la de 2, … Operando en la ecuación de primer orden se obtiene la corrección de energía de primer orden y la función de onda de primer orden, de manera análoga operando en la ecuación de orden n se puede obtener la energía de correlación y la función de onda de orden n. Se sustituyen estos valores obtenidos en las expresiones de la energía total y la función de onda total. A diferencia del método de Hartree-Fock el método de Møller–Plesset incluye la energía de correlación aproximada entre pares de electrones. Para este método el Hamiltoniano de orden cero (o) se obtiene como una combinación de operadores de Fock monoeléctronicos extendido al total de electrones del sistema. Las funciones de onda de orden cero son los determinantes de Slater obtenidos con el método de Hartree Fock. Con estas dos se puede obtener una energía de orden cero, que corresponde a la suma de las energías de los orbitales que conforman el determinante de Slater del método de Hartree Fock. El Hamiltoniano de perturbación ’ incluye la correlación entre los electrones y se define como la diferencia entre la energía de repulsión verdadera de los electrones y el potencial promedio que se calcula por Hartree Fock. [4.50] [4.49] 35 No hay diferencia entre la energía obtenida por Hartree-Fock y el método de perturbaciones de Møller–Plesset aplicando solo la corrección de primer orden, ambas coinciden. Por lo que la energía de correlación electrónica verdadera se introduce a partir de la corrección de segundo orden. Se pueden calcular correcciones de orden mayor que dos (MP3, MP4, etc) pero son más costosos y generalmente la diferencia de resultados no es la suficiente para justificar un cálculo mayor que de orden dos. Es por ello que el método MP2 (de orden dos) es el más utilizado. 4.3.3 Métodos semiempíricos [40] Con respecto del método de Hartree Fock, pretenden simplificar los cálculos mediante lo omisión o la parametrización de algunas integrales utilizando en su lugar constantes obtenidas experimentalmente, como energías de ionización atómicas o momentos dipolares. Esto se traduce en menor tiempo de cálculo, por lo que los métodos semiempíricos son de especial interés en su aplicación para moléculas grandes. Los diferentes métodos semiempíricos se diferencian en las aproximaciones y parametrizaciones realizadas para resolver el cálculo. Los mas simples como el método de Hückel permite estudiar moléculas planas con sistemas de electrones  conjugados, y el método de Hückel extendido permite también incluir los orbitales . Existen otros métodos, y la mayoría se basan en la aproximación NDDO (Neglect of Diatomic Differential Overlap). Dentro de esta categoría se encuentran los métodos AM1 (Austin Model 1) y PM3 (Parametriced Model 3), que han sido usados en este trabajo. 36 4.3.4 Métodos DFT (Density Functional Theory) [32] Se traslada la complejidad de operar con funciones de onda a un objeto determinable experimentalmente, la densidad electrónica. El primer teorema de Hohenberg y Kohn [41] dice que en el estado fundamental la energía depende de la densidad electrónica, y se puede calcular por tanto como un funcional (una función de funciones) de la densidad electrónica: [4.51] Siendo E(  la energía total del sistema, T( ) la contribución de la energía cinética, Een( ) la energía de atracción entre electrones y nucleos; y Eee( ) la energía de repulsión entre electrones. Como se ha mencionado un funcional es una función de funciones, en este caso todas las contribuciones energéticas dependen de la densidad electrónica, que a su vez se puede escribir como una función aproximándolo a la definición de Kohn-Sahm [42] de la densidad electrónica:   Se puede aproximar la energía cinética del sistema a:   Se puede reescribir la expresión de la energía: Donde J( ) es la energía de interacción de Coulomb entre electrones y Exc( ) es el término de correlación-intercambio. [4.52] [4.53] [4.54] 37 Si se igualan las expresiones de la energía [4.51] y [4.54]: [4.55] Se puede despejar el término de correlación: [4.56] Esta expresión se puede separar en dos partes: 1) ( T( ) - Taprox( ) ) es la energía de correlación cinética, y 2) ( Eee( ) - J( ) ) aporta la energía de intercambio y el potencial de correlación. El siguiente paso es como en Hartree Fock, se busca un conjunto de orbitales que minimicen la energía, imponiendo la condición de ortogonalidadad:     Entonces se obtienen una serie de ecuaciones, llamadas ecuaciones de Kohn-Sham: Se define el potencial Vef como:    Vef es el potencial efectivo que engloba el potencial de repulsión entre los electrones, atracción entre electrones y núcleos; y el potencial de correlación e intercambio, Vx: Y Exc se compone a su vez de dos términos: uno de intercambio Ex( ) y otro de correlación Ec( ): [4.57] [4.58] [4.59] [4.60] [4.61] 38 Se han desarrollado diferentes funcionales para los términos de correlación y de intercambio, y cualquiera de estos se puede combinar entre sí, dando muchas posibilidades para definir un método. Los funcionales se han desarrollado basándose en distintas aproximaciones para obtener una fórmula final para Exc: -Aproximación de la densidad local (LDA): Se considera la densidad electrónica como un gas uniforme de electrones en el entorno molecular dicha densidad electrónica depende únicamente de (r). La energía de intercambio viene dada por:  -Aproximación de gradiente generalizado (GGA): Se incorpora en las expresiones de energía de intercambio y energía de correlación el módulo del gradiente de la densidad electrónica ( | | ). Existe una variante de la aproximación GGA en el que el módulo del gradiente de la densidad está elevado al cuadrado. -Funcionales híbridos: Los funcionales híbridos son aquellos en los que la función de la energía de intercambio incorpora la energía de intercambio del método Hartree-Fock. Se combinan con funcionales de correlación de otro tipo para dar lugar a métodos capaces de predecir bien las propiedades moleculares, con un coste computacional reducido. En este trabajo se ha utilizado el funcional híbrido B3LYP, se llama así porque incluye el funcional de correlación Becke’s 3, que usa tres parámetros para introducir la energía de correlación e intercambio y el funcional LYP (por sus autores Lee Yang y Parr). Su ventaja principal frente a otros funcionales híbridos es que utiliza un menor número de parametrizaciones[42]. Todos los cálculos por B3LYP en este trabajo incluyen la corrección empírica de Grimme gd3, ya que el método no describe bien las fuerzas de dispersión necesarias para describir las interacciones no covalentes como el enlace de hidrógeno [44]. [4.63] [4.62] 39 5. Resultados 5.1 Procedimiento Con el programa Spartan se construyó una molécula de norleucina genérica, con el grupo carboxilo en configuración cis (para los tipos I y III), y otra con el grupo ácido en disposición trans (para el tipo II). A partir de estas moléculas iniciales se realizó una búsqueda conformacional con los métodos mecánica molecular, AM1 y PM3. Se limitaron los resultados a 100 confórmeros de salida por cada conformación de entrada. Es decir, que se obtuvieron 100 conformaciones para cada método y cálculo y tipo de confórmero (Figura 16). Un total de 600 conformaciones. Seguidamente se realiza un primer cálculo de optimización de geometría para los confórmeros hallados a nivel B3LYP/6-31G, de forma que muchas estructuras acabaron resultando ser la misma, eliminando así un gran número de confórmeros predichos inicialmente. Para cada confórmero resultante, se tabula su energía en Hartrees, sus constantes rotacionales en MHz y las tres componentes del momento dipolar en Figura 16 Esquema del procedimiento 40 Debyes. Y la energía relativa con respecto del confórmero más estable, expresado en cm-1. A continuación se juntaron todos los confórmeros obtenidos por todos los métodos, se ordenaron por energía creciente, y se eliminaron los repetidos. Se consideraron dos confórmeros iguales cuando sus energías, constantes rotacionales y componentes del momento dipolar eran practicamente iguales (Su diferencia era menor del 5%). De los 600 confórmeros iniciales quedaron 240, de los cuales se seleccionaron aquellos cuya energía relativa no superó los 500 cm-1, asumiendo que estos serían los más abundantes debido a ser los de menor energía. Un total de 34 confórmeros cumplieron la condición de tener una energía relativa menor de 500 cm-1, sobre estos se realizó un segundo cálculo de optimización de geometría, esta vez con una base 6-311++G (2d,p) en dos fases: En la primera tanda de cálculo los 34 confórmeros serían sometidos a un cálculo de optimización de geometría por B3LYP, utilizando la base de cálculo 6311++G (2d,p), a continuación se repetiría el cálculo con la misma base pero por MP2. Finalmente se decidió acotar el estudio a los 10 confórmeros de menor energía obtenidos por cada metodología, es decir, los 10 confórmeros de menor energía calculados por B3LYP y los 10 confórmeros de menor energía obtenidos por MP2. Estos diez confórmeros de menor energía resultaron todos de tipo I y tipo II. Así que además se realizó una selección de los 5 confórmeros de tipo III de menor energía del anterior nivel de cálculo, para tener al menos cinco confórmeros de cada tipo. Posteriormente se realizó un cálculo de frecuencias de vibración, con una base 6311++G (2d,p) para verificar que todas las frecuencias fueran positivas (lo son), lo que significa que los confórmeros obtenidos son mínimos absolutos en la superficie de energía potencial. Adicionalmente se anotó la energía libre de Gibbs (E Gibbs) y se calcularon las abundancias (a 298K y 1bar). A continuación se analizarán dichos confórmeros, intentando explicar su estabilidad, asumiendo que las diferencias energéticas entre confórmeros se deben mayoritariamente a dos factores: los puentes de hidrógenos y las colocaciones de la cadena carbonada. 41 5.2 Tablas de resultados Los confórmeros obtenidos, su energía electrónica, constantes rotacionales y momentos dipolares se presentan a continuación en las primeras tablas, ordenados por energía creciente y separados por metodología utilizada (B3LYP ó MP2) y tipo de confórmero en tipo I, tipo II, y tipo III. Para las tablas de MP2 se añaden además energías de Gibbs, abundancias y constantes de acoplamiento del cuadrupolo nuclear del átomo de nitrógeno. En un segundo lugar se exponen las tablas de distancias entre átomos que forman los puentes de hidrógeno, y los ángulos entre planos como una forma de medir el plegamiento de la cadena lateral. Las tablas se presentan solamente para los confórmeros predichos por MP2 y están separadas por tipos I, II y III. Al final de cada tabla hay un breve comentario en las razones que expliquen el orden de estabilidad. Finalmente se expone una simulación del espectro de rotación de la norleucina en fase gas utilizando los resultados predichos. Los confórmeros están nombrados en las tablas atendiendo al tipo de enlace de hidrógeno (tal y como se describe en la introducción de este trabajo) y teniendo en cuenta las posiciones relativas de los átomos correspondientes en tres proyecciones de Newman como se explicará ahora, el ángulo aproximado que forme el resto correspondiente respecto de la cadena carbonada determinará su nombre (ver Figura 17): -Si el ángulo es de 60º la posición es sinclinal y se abrevia con una G mayúscula (de Gauche), si los 60º son positivos (en sentido antihorario) se denomina +sinclinal y se escribe G+ ; si el ángulo es de -60º (sentido horario) se llama -sinclinal y se escribe como G-. -Si el ángulo son 120º se denomina +anticlinal, A+ ; y si es -120º -anticlinal, A-. -Si el ángulo que forman es cero grados, se denomina sinperiplana S, y si el ángulo es 180º la posición es antiperiplana T. 48 5.2.1.5 Confórmeros de tipo II (MP2) Parámetro II-G--T-T II-T-G--T II-G--T-T II-T-G--GII-G--T-GE/Hartee -440,66396 -440,66371 -440,66362 -440,66313 -440,66301 E/ cm-1 0 54,63 74,29 182,58 209,53 A 2437,52 2657,18 2551,64 2516,43 2720,08 B 838,23 933,34 816,53 1023,09 853,57 C 779,64 783,56 742,9 861,72 776,5 a -1,52 -0,39 1,63 -1,52 -2,65 b 5 -4,84 4,96 4,61 4,45 c 0,1 -0,79 0,35 0,03 -0,52 E Gibbs/ cm-1 248,45 480,43 208,28 733,26 464,41 Población 0,301 0,098 0,366 0,029 0,106 aa 1,71 0,29 -1,81 -1,70 1,40 bb 0,76 1,24 1,81 2,19 2,07 cc -2,47 -1,53 -0,01 -0,50 -3,47 ab -0,15 1,85 -1,48 1,53 0,39 ac 0,38 2,62 -2,63 -2,85 -1,33 bc 3,18 -1,66 -1,56 0,82 1,99  49 5.2.1.6 Confórmeros de tipo III (MP2) Parámetro IIIa-T-G--T IIIa-T-T-T III’-G--G--T III’-G--G--GIIIa-G+-T-G+ E/Hartee -440,66278 -440,66258 -440,6606 -440,66016 -440,65933 E/ cm-1 258,5 303,12 738,2 834,57 1016,15 A 2363,07 2518,07 2018,4 1916,22 2841,42 B 973,7 813,27 1101,06 1354,92 731,67 C 832,36 708,3 973,37 1049,73 704,73 a -0,73 0,07 0,03 -0,44 -2,32 b -0,05 -0,13 -0,6 -0,19 0,09 c 1,17 1,48 1,26 -1,36 1,4 E Gibbs/ cm-1 556,37 486,58 1129,64 1347,35 1138,42 Población 0,068 0,095 0,004 0,001 0,004 aa 2,24 1,70 1,67 1,86 -3,44 bb -3,52 -2,72 -4,52 -3,65 1,44 cc 1,28 1,02 2,85 1,79 2,00 ab 2,19 2,43 0,94 -0,78 -2,47 ac 0,60 0,50 -0,15 0,07 1,16 bc -1,60 -2,30 0,87 -2,59 1,16  50 5.2.2 Distancias y ángulos entre planos 5.2.2.1 Tipo I Imagen Tipo E/ cm-1 Distancias/Å y ángulos I’-G--T-T 10,07 r(Ha···O=C) = 2,58 r(Hb···O=C) = 2,92 = 61,75º = -179,37º = -179,66º I’-G+-G+-T 53,82 r(Ha···O=C) = 2,63 r(Hb···O=C) = 2,92 = -179.21º = 58,90º = 173,61º Ia-G+-T-T 75,48 r(Ha···O=C) = 2,56 r(Hb···O=C) = 3,01 = -170,73º = -176,82º = -179,29º I’-G+-G+-G+ 80,06 r(Ha···O=C) = 2,63 r(Hb···O=C) = 2,94 = -177,07º = 56,37º = 56,75º Ia-T-G--T 148,58 r(Ha···O=C) = 2,62 r(Hb···O=C) = 3,13 = -56,69º = -62,17º = -175,67º 51 El confórmero más estable (I’-G--T-T) presenta una interacción de tipo I’, es decir, con dos puentes de hidrógeno, que estabilizan más la estructura que un sólo puente de hidrógeno. Además de presentar una cadena completamente extendida con ángulos diedros de prácticamente ciento ochenta grados ( = -179,37º y = - 179,66º ) que minimiza el impedimento estérico. El segundo confórmero (I’-G+-G+-T) tiene una cadena algo más impedida, lo que se aprecia en el ángulo diedro que es de 59º ; y el es prácticamente 180 grados. Esto en principio haría que su estabilidad fuera menor que la del tercer confórmero (Ia-G+-T-T), que presenta una cadena lateral más estirada, con ambos ángulos de diedros de casi 180º. No obstante, el segundo confórmero presenta un puente de hidrógeno de tipo bifurcado con dos interacciones frente al tipo Ia, de una sola interacción que presenta el tercer confórmero (Ia-G+-T-T). Lo que en conjunto explica que el segundo confórmero tenga menos energía. Comparando el tercero (Ia-G+-T-T) y el cuarto (I’-G+-G+-G+) se aprecia que sucede justo lo contrario, el tercer confórmero presenta una interacción de tipo Ia menos estable que la I’ del cuarto confórmero, por lo que se explica su mayor energía en los impedimientos estéricos de la cadena carbonada para el cuarto confórmero. Si el tercer confórmero presenta una cadena estirada, el cuarto confórmero presenta una cadena lateral bastante plegada, cuyos ángulos diedros y son respectivamente 56,37 y 56,75 grados. Finalmente el quinto confórmero (Ia-T-G--T) presenta una mayor energía debido al enlace de tipo Ia y al p moderado de su cadena con unos ángulos diedros = - 56,69º y = -62º 52 5.2.2.2 Tipo II Imagen Tipo E/ cm-1 Distancias/Å y ángulos II-G--T-T 0,00 r(OH···N) = 1,89 = 60,51º = 179,71º = 179,42º II-T-G--T 54,63 r(OH···N) = 1,93 = -56,72º = -59,88º = -174,42º II-G--T-T 74,29 r(OH···N) = 1,88 = 63,01º = -176,85º = -179,80º II-T-G--G182,58 r(OH···N) = 1,93 = -58,39º = -57,90º = -55,92º II-G--T-G209,53 r(OH···N) = 1,89 = 60,63º = -177,15º = -64,65º 53 El primer confórmero (II-G--T-T) presenta una distancia entre los átomos que forman el puente de hidrógeno de 1,89 Ångström y una cadena lateral totalmente estirada. Comparando del segundo (II-T-G--T) y tercero (II-G--T-T): pese a que el segundo tiene un enlace de H mas largo que el tercero (1,93 y 1,88 Å respectivamente), y una cadena lateral mas plegada ( = -59,88º = -174,42º), el II-T-G--T es de menor energía debido a que tiene una interacción débil entre un hidrógeno del carbono  y el oxígeno con doble enlace, tal y como se muestra en la Figura 21. Esta idea se respalda en que la distancia entre ambos (2,57Å) átomos es menor que la suma de los radios de Van der Waals del hidrógeno (1,20 Å) y oxígeno (1,52 Å) La estabilidad del tercer (II-G--T-T) y cuarto (II-T-G--G-) confórmeros se explica de forma inmediata: el tercero tiene una distancia entre los átomos que forman el puente de hidrógeno menor que el cuarto confórmero (1,88 frente a 1,93Å), además de que su cadena lateral está mas estirada ( = -176,85º y = -179,80º para el IIG--T-T frente a = -57,90º y = -55,92º para el II-T-G--G-), lo que también implica menor impedimiento estérico. La estabilidad relativa entre el cuarto (II-T-G--G-) y quinto (II-G--T-G-) confórmero no se explica de manera trivial, por un lado tenemos que la distancia entre los átomos que forman el puente de hidrógeno es menor para el quinto confórmero (1,89Å frente a 1,93 Å), que además tiene una cadena lateral mas estirada como se aprecia al comparar los ángulos diedros de ambos ( = -177,15º y = -64,65º frente a = -57,90º y = -55,92º). Sin embargo la distancia entre uno de los hidrógenos del carbono  y el oxígeno con doble enlace (2,60 Å) es algo menor que en la suma de los radios de Van der Waals del hidrógeno y oxígeno, por lo que se puede esperar una interacción débil entre ambos que estabilice la molécula (Figura 22) Figura 21 Interacción entre el oxígeno carbonílico y el hidrógeno del carbono  Figura 22 Interacción entre el oxígeno carbonílico y el hidrógeno del carbono  d = 2,57 Å d = 2,60 Å 54 5.2.2.3 Tipo III Imagen Tipo E/ cm-1 Distancias/Å y ángulos IIIa-T-G--T 258,50 r(Ha···O=C) = 2,57 r(Hb···O=C) = 3,19 = -51,15º = -59,63º = -174,99º IIIa-T-T-T 303,12 r(Ha···O=C) = 2,60 r(Hb···O=C) = 3,23 = -54,70º = -176,90º = -179,70º III’-G--G--T 738,20 r(Ha···O=C) = 2,73 r(Hb···O=C) = 2,54 = 79,00º = -59,65º = -175,03º III’-G--G--G834,57 r(Ha···O=C) = 2,69 r(Hb···O=C) = 2,57 = 80,68º = -63,17º = -66,18º IIIa-G+-T-G+ 1016,15 r(Ha···O=C) = 2,42 r(Hb···O=C) = 3,67 = -173,33º = 173,27º = 63,08º 55 El confórmero más estable (el IIIa-T-G--T) , lo es como en el resto de los casos debido a que tiene la menor distancia entre los átomos que forman el puente de hidrógeno, que por tanto dan lugar a la interacción mas estabilizante. El segundo confórmero (IIIa-T-T-T) es de mayor energía que el primero debido a la mayor distancia entre los átomos que forman el puente e hidrógeno, pese a tener una cadena lateral muy estirada ( = -176,90º y = -179,70º). El tercer confórmero (III’-G--G--T), siguiendo la tendencia, tiene un enlace de hidrógeno mas largo, además de una cadena lateral mas plegada, y por tanto con mayor impedimento estérico que el segundo confórmero (IIIa-T-T-T). Comparando el tercer (III’-G--G--T) y el cuarto (III’-G--G--G-) confórmero se observa que pese a tener distancias de puentes de hidrógeno parecidas (y ambas de tipo III’), el cuarto confórmero tiene una cadena lateral considerablemente mas plegada que el tercero (El tercero III’-G--G--T tiene = -59,65º y = -175,03º y confórmero III’-G--G--Gtiene = -63,17º y = -66,18º) lo que provocará mayor impedimento estérico, y disminuirá la estabilidad global de la molécula. La última comparativa se realiza entre el cuarto (III’-G--G--G-) y quinto confórmero (IIIaG+-T-G+). El quinto confórmero presenta una cadena lateral mas estirada ( = 173,27º y = 63,08º) que el cuarto ( = -63,17º = -66,18º), pero su diferencia de estabilidad se explica por el tipo de puente de hidrógeno: El cuarto confórmero presenta un enlace de hidrógeno de tipo III’ , mientras que el quinto de tipo IIIa. En el caso del cuarto confórmero el puente de hidrógeno está formado por tres átomos, los dos hidrógenos de la amina con el oxígeno del OH ; frente a un solo puente en el caso de la molécula de tipo IIIa. 56 5.3 Simulación del espectro de rotación Se presenta a continuación un espectro de rotación simulado de la norleucina incluyendo todos aquellos confórmeros cuya abundancia relativa al confórmero mas abundante es superior de 0,1. (Figura 23). Para ello se utilizó el programa SPCAT de Pickett [45] y a partir de las constantes rotacionales, momentos dipolares y constantes de acoplamiento del cuadrupolo nuclear del átomo de nitrógeno se generaron los ficheros .cat que posteriormente fueron usados en el programa de simulación ASCP [46]. Adicionalmente se muestra un espectro simulado solamente del confórmero mas abundante (I’-G--T-T) con una ampliación de la transición 11,1 <-- 00,0 En la que se aprecia la estructura hiperfina debido al acoplamiento de cuadrupolo nuclear del átomo de N14 (Figura 24). 57 Figura 23 Espectro simulado de la norleucina, incluyendo los confórmeros de abundancia superior a 0,1. Figura 24 Espectro simulado del confórmero mas abundante de la norleucina. En la ampliación se observa la estructura hiperfina.