Determinación de la capacidad antioxidante de infusiones

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Determinación de la capacidad antioxidante de infusiones Autora: Sofía López Ayúcar Tutora: Laura Toribio Recio Agradezco a mi tutora, la Dra. Laura Toribio Recio, la ayuda, dedicación y paciencia recibidas durante la realización de este trabajo. De igual forma, expreso mi agradecimiento a los profesores del Grupo de Investigación TESEA (I.U. CINQUIMA) del Departamento de Química Analítica por sus enseñanzas. Hago extensivo mi agradecimiento a mis compañeros de laboratorio y a Mario Martínez Cuéllar por el apoyo incondicional recibido. Dedico este trabajo a mi familia, por la confianza depositada en mí y el apoyo ilimitado recibido en todo momento, y a mis amigos, por alentarme a seguir adelante en todo momento. Trabajo Fin de Grado Índice Sofía López Ayúcar ÍNDICE 1. Resumen .......................................................................................................................................... 1 2. Abstract ............................................................................................................................................ 2 3. Introducción y antecedentes bibliográficos ................................................................................... 3 3.1. Propiedades de los distintos tipos de té ............................................................................... 3 3.2. Propiedades de la infusión de frutos del bosque ................................................................. 6 3.3. Antioxidantes ......................................................................................................................... 7 3.4. Capacidad antioxidante y su determinación ........................................................................ 9 3.4.1. Método DPPH .................................................................................................................. 10 3.4.2. Método ABTS ................................................................................................................... 12 3.5. Polifenoles ............................................................................................................................ 14 3.6. Determinación del contenido fenólico total ....................................................................... 15 3.7. Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) ...................................................................... 16 4. Objetivos y plan de trabajo ........................................................................................................... 19 5. Experimental .................................................................................................................................. 20 5.1. Equipos ................................................................................................................................. 20 5.2. Material y reactivos ............................................................................................................. 22 5.3. Muestras ............................................................................................................................... 23 5.4. Columna cromatográfica ..................................................................................................... 24 6. Resultados y discusión .................................................................................................................. 25 6.1. Capacidad antioxidante de infusiones ................................................................................ 25 6.1.1. Método DPPH .................................................................................................................. 25 6.1.2. Método ABTS ................................................................................................................... 29 6.2. Contenido fenólico total (TFC) de las infusiones ................................................................ 34 6.3. Determinación del contenido individualizado en polifenoles mediante cromatografía de fluidos supercríticos (SFC). ................................................................................................................ 37 7. Conclusiones .................................................................................................................................. 48 8. Bibliografía ..................................................................................................................................... 49 Abreviaturas .......................................................................................................................................... 52 Listado de figuras y tablas ..................................................................................................................... 54 Trabajo Fin de Grado Resumen Sofía López Ayúcar 1 1. Resumen En este estudio se ha determinado la capacidad antioxidante de varias infusiones utilizando dos métodos diferentes, el ensayo DPPH y el ensayo ABTS. Se observó que se obtenían valores mayores con el método ABTS que con el DPPH, pero con ambos se obtuvo el mismo orden en cuanto a la capacidad antioxidante de las infusiones estudiadas, siendo el té verde el que presentó mayor capacidad antioxidante, luego el té negro con canela, seguido por el té negro, el té rojo y, por último, la infusión fría de frutos del bosque. También se probaron distintos tiempos de infusión y distintas temperaturas obteniéndose los mejores resultados cuanto mayores eran ambos factores. Además se determinó el contenido fenólico total de las mismas utilizando el método Folin-Ciocalteau y se observó que existía una correlación entre el contenido fenólico y la capacidad antioxidante cuando se determinó mediante el método ABTS, pero no cuando se determinó con el método DPPH. Por último, se trató de determinar alguno de los polifenoles presentes en las infusiones utilizando cromatografía de fluidos supercríticos (SFC). Trabajo Fin de Grado Abstract Sofía López Ayúcar 2 2. Abstract In this work the antioxidant capacity of several infusions was determined using two different methods, the DPPH assay and the ABTS assay. The ABTS assay provided higher values for the antioxidant capacity than the DPPH one, but in both cases the antioxidant capacity decreased in the order green tea>black tea with cinnamon> black tea> red tea >cold infusion of red fruits. Different infusion times and different temperatures were also tested, obtaining the best results for the highest time and temperature. In addition, the total phenolic content was determined using the Folin-Ciocalteau method and the results showed a correlation between the total phenolic content and the antioxidant capacity measured by using the ABTS method, but not by using the DPPH one. Finally, the infusions were analysed using supercritical fluid chromatography in order to determine the individual polyphenols. Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 3 3. Introducción y antecedentes bibliográficos Las hierbas se han utilizado desde siempre tanto por sus propiedades culinarias como por su efectividad como medicamentos. Frecuentemente, se aconseja el consumo de medicinas basadas en infusiones de hierbas ya que presentan compuestos antioxidantes que previenen o retrasan la aparición de enfermedades crónicas relacionadas con la gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otros radicales libres en el cuerpo [1]. Las infusiones son una de las bebidas más consumidas en el mundo. Desde el año 2500 a.C se empezaron a utilizar las hojas del té como bebida medicinal en China, y a partir de entonces se tomó como costumbre la práctica de preparar bebidas con hierbas mediante la acción del calor para extraer sus principios activos. Esto se debió a sus múltiples propiedades, las cuales beneficiaban al organismo. A día de hoy las infusiones siguen siendo una de las bebidas de mayor relevancia a causa de sus propiedades relajantes, antioxidantes y reconstituyentes, además de su agradable sabor y reconfortante aroma. Las propiedades medicinales de las hierbas y otras plantas se han investigado y se ha demostrado que presentan beneficios para la salud por su capacidad antioxidante, por ser anticancerígenas, antimutagénicas, antihipertensivas y por presentar baja toxicidad [2]. Entre las variedades más consumidas de infusiones de hierbas se encuentran la manzanilla, el romero, la menta, la tila, la valeriana y el té. 3.1. Propiedades de los distintos tipos de té Como se ha mencionado anteriormente, los inicios del consumo del té datan del año 2500 a.C en China y su posterior llegada a Europa tuvo lugar en el siglo XVII. El té es una fuente de hidratación, ya que está formado por un 75-78% de agua. En el porcentaje restante se incluyen proteínas, aminoácidos, glúcidos, vitaminas, alcaloides, fenoles, pigmentos, lípidos, ácidos orgánicos, saponarias, esteroles y sustancias aromáticas. De estas sustancias depende el color, sabor, gusto y efecto medicinal del té [3]. La composición del té varía en función del tipo de té, la zona de cultivo, el procesado y la manipulación de las hojas. Además, la temperatura del agua a la que se infusiona, el tiempo de infusión y el factor de exprimir o no la bolsa en la que se encuentra afecta en una mayor o menor presencia de los componentes activos del té. Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 4 El té contiene polifenoles, potentes antioxidantes que ayudan a evitar la oxidación de las células. Contiene varios tipos de polifenoles, pero los más abundantes son los flavonoides. Los principales flavonoides del té pertenecen a las sustancias conocidas como catequinas, cuyo papel antioxidante previene enfermedades cardiovasculares, reduce el riesgo de cáncer y retrasa el envejecimiento. El té es un arbusto de hoja perenne cuyo nombre científico es Camellia. Este tiene dos variedades principales, la Camellia Sinensis y la Camellia Assamica. De la Camellia Sinensis se obtiene el té verde, mientras que la Camellia Assamica (de cultivo mayoritario) produce el té negro. Además de diferenciarse en la variedad de la que proceden, los distintos tipos de té se diferencian en el proceso de elaboración al que se somete cada uno, el cual le aporta unas peculiaridades en cuanto a sabor y composición. El té se elabora a partir de las hojas y brotes tiernos de la planta y, una vez recolectados, el proceso que sufren es diferente según el tipo de té que se quiere obtener. A continuación se presentan las principales diferencias entre las variedades de té [3]. - Té verde: es un té no fermentado. Justo después de su cosecha se secan las hojas de la planta, se enrollan y se cuecen al vapor, evitando así el proceso de oxidación. Entre sus características se puede mencionar que tiene gran poder antioxidante (debido en gran parte a catequinas y otros polifenoles). Es de color verde. Figura 1: té verde Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 11 Figura 7: reacción general entre el radical DPPH y los compuestos antioxidantes (AH) El DPPH se añade en exceso para evitar reacciones secundarias que interfieran en el color y el tiempo de reacción hasta que el valor de absorbancia es constante suele variar entre 5 y 180 minutos, en función del tipo de antioxidante. El resultado de la capacidad antioxidante se cuantifica a través de algún estándar como Trolox o vitamina C con unidades TEAC (micromoles o mg equivalentes de Trolox por 100 g) o como EC50. La EC50 es la concentración eficiente al 50%, es decir, la concentración de antioxidantes necesaria para obtener el 50% de la reactividad (disminución de la absorbancia del radical DPPH al 50%). El tiempo necesario para alcanzar ese EC50 se denomina TEC50 y permite clasificar los antioxidantes en rápidos (<5 min), intermedios (5-30 min) y lentos (>30 min). A partir de esto se determina la eficiencia antioxidante o antirradical (AE) como: AE=1/(EC50xTEC50). Entre las ventajas del método se puede mencionar que es simple, rápido y únicamente necesita un espectrofotómetro UV-Vis para determinar la capacidad antioxidante. Entre las desventajas se puede comentar que el DPPH solo puede disolverse en medios orgánicos; puede dar problemas cuando se analizan compuestos que absorben en la región del visible 500-520 nm, ya que los espectros se superponen a los del DPPH (ocurre particularmente con los carotenoides); el radical DPPH tiene poca similitud con los radicales peroxilo altamente reactivos y transitorios involucrados en la peroxidación de lípidos, por lo que muchos antioxidantes que reaccionan rápidamente con los radicales peroxilo pueden reaccionar lentamente o ser inertes al DPPH debido a la inaccesibilidad estérica; y, por último, el DPPH es a la vez radical y oxidante, por lo que la pérdida de color puede deberse a una reacción radical (SET), a una reducción (HAT) o a alguna reacción secundaria [7, 11]. Radical libre de 2,2-difenil-1-picrilhidracilo 2,2-difenil-1-picrilhidracina Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 12 3.4.2. Método ABTS El ensayo ABTS se basa en la capacidad de eliminación del radical ABTS.+ por parte de los antioxidantes. El radical ABTS presenta un color azul intenso con una banda de absorción en torno a 734 nm. La capacidad antioxidante se mide a través de la disminución de la absorbancia a esa longitud de onda. El esquema de reacción se muestra en la Figura 8. Es un método ampliamente utilizado para determinar la capacidad antioxidante en alimentos [20] y bebidas [17, 18]. Figura 8: reacción general entre el catión radical ABTS.+ y los compuestos antioxidantes El radical puede ser formado por reacción enzimática (utilizando peroxidasas o mioglobina por ejemplo) o por reacción química (utilizando dióxido de manganeso (MnO2), persulfato potásico (K2S2O8) o radicales peroxil generados en la termólisis aeróbica del 2,2’-azobis(2amidinopropano (AAPH)). En general, las reacciones químicas para formar el radical requieren mucho más tiempo (por ejemplo con el persulfato de potasio se necesitan hasta 16 horas) o altas temperaturas y las reacciones enzimáticas son mucho más rápidas y emplean condiciones más suaves [7, 11]. En cuanto a las reacciones químicas, los oxidantes más empleados son MnO2, AAPH y K2S2O8 debido a que son los que presentan menos interferencias en la formación del radical. Entre estos tres, el persultato potásico necesita más tiempo de reacción (12-16 horas) que cuando se utiliza dióxido de manganeso (formación instantánea) pero las medidas de la absorbancia son más sencillas con el persulfato, ya que con el dióxido de manganeso la estabilidad del radical formado es baja. Con el APPH el radical formado presenta estabilidades diferentes en cada ocasión. Por ello, habitualmente se emplea persulfato potásico para la formación del radical. El radical estable se forma mezclando en agua una disolución de ABTS 7 mM con persulfato potásico, obteniéndose una concentración final de 2,45 mM. La mezcla se deja reaccionar en la oscuridad y a temperatura ambiente 12-16 horas y se obtiene el radical Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 13 (Figura 9). El radical será más estable cuanto mayor sea la relación ABTS/persulfato (valor entre 2 y 3), pero hay que tener en cuenta que su estabilidad es corta, durando aproximadamente dos días (lo que depende del oxidante y las condiciones de reacción y almacenamiento). Tras formarse el radical la disolución se diluye (en etanol o tampón fosfato) hasta que la absorbancia es de 0,7 (±0,02) a 734 nm y entonces se puede utilizar para determinar la capacidad antioxidante de las muestras, expresándola como TEAC (Capacidad Antioxidante Equivalente en Trolox) [21]. Figura 9: formación del radical ABTS.+ en presencia de persulfato potásico Entre las ventajas del método se puede mencionar que es un método simple utilizado con frecuencia, que el radical ABTS.+ se puede solubilizar en medios acuosos y orgánicos y reacciona rápidamente con los antioxidantes (normalmente la reacción se completa en 30 minutos). Además se puede utilizar en un amplio rango de pH. Entre las desventajas se puede comentar que el tiempo de reacción varía en función de los antioxidantes y, por lo tanto, utilizar un punto final fijo de corta duración (4-6 minutos) puede dar lugar a valores falsos de la capacidad antioxidante y que el intervalo de concentraciones que se puede utilizar es relativamente pequeño ya que una concentración muy baja de antioxidantes produciría una disminución de la absorbancia muy pequeña que no podría ser medida y, por el otro lado, una elevada concentración de antioxidantes necesitaría demasiado ABTS y esto daría concentraciones muy altas [7, 11]. Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 14 3.5. Polifenoles Los polifenoles se definen químicamente como sustancias que poseen un anillo aromático que presenta uno o más sustituyentes hidroxilo (-OH). La mayor parte de los polifenoles contienen más de un grupo hidroxilo y son sustancias bioactivas con capacidad antioxidante que se encuentran en altas concentraciones en alimentos, como frutas, vegetales, cereales y chocolate, y en bebidas, como el té o el vino [22]. Los polifenoles son metabolitos secundarios producidos por las plantas en situaciones de estrés con fines de autoprotección y ejercen funciones importantes en la salud de los seres humanos debido a que son fuertes antioxidantes que neutralizan radicales libres por donación de un átomo de hidrógeno o de un electrón. Se ha demostrado científicamente que presentan beneficios para la salud humana debido a que previenen el estrés oxidativo, lo que disminuye las enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y neurodegenerativas, el cáncer, la diabetes y el envejecimiento celular [23]. Los polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias que incluyen compuestos con estructuras muy diversas y frecuentemente se encuentran unidos a otras biomoléculas (azúcares en su mayoría). Se conocen más de 8000 estructuras fenólicas, de las cuales 4000 son flavonoides. Al ser un grupo tan diverso se puede dividir en varios subgrupos, siendo los ácidos fenólicos y los flavonoides los más abundantes en la naturaleza. Los ácidos fenólicos son compuestos orgánicos que presentan un ácido carboxílico unido a un anillo fenólico formando esqueletos C1-C6 (derivados del ácido benzoico) o C3-C6 (derivados del ácido cinámico). Los flavonoides son compuestos orgánicos que presentan un esqueleto general C6-C3-C6, cuyas unidades C6 son anillos de naturaleza fenólica. Los flavonoides se dividen a su vez en distintos subgrupos en función a sus características [24]. Debido a la amplia diversidad de polifenoles y a su gran presencia en plantas, su extracción, separación, identificación y análisis puede ser llevada a cabo por distintos procedimientos, no hay ningún método estándar para ello. Las muestras deben prepararse y conservarse adecuadamente y, habitualmente, se secan, congelan o liofilizan antes de la extracción para evitar la degradación de los polifenoles. Los procedimientos más utilizados para los productos de origen vegetal son la extracción líquido-líquido y sólido-líquido debido a su eficiencia, facilidad de empleo y amplia aplicabilidad. Para la extracción se utilizan disolventes orgánicos o mezclas de disolventes orgánicos y acuosos. Otro factor importante es el pH, que debe ser Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 15 ácido en la mayoría de los casos ya que los polifenoles son más estables. Cuando los polifenoles se encuentran unidos a azúcares se lleva a cabo una hidrólisis ácida o enzimática, o una saponificación para poder determinar los polifenoles libres. Hay métodos espectrofotométricos para estimar el contenido fenólico total, como el utilizado en este estudio, el cual es rápido y sencillo. Pero este no es específico para compuestos individuales, lo que hace necesario separar los polifenoles para poder identificarlos y cuantificarlos. Las técnicas más utilizadas para ello son la cromatografía de gases y la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), de las cuales se prefiere esta última debido a que en la primera se debe realizar una derivatización previa de los polifenoles para facilitar su volatilización. En HPLC se suele trabajar en fase inversa, empleando columnas C18 que varían entre 100 y 250 mm de longitud y entre 3 y 10 µm de tamaño de partícula. Además, se suelen utilizar gradientes para la elución y fases móviles formadas por mezclas de disolventes orgánicos (acetonitrilo o metanol) y disoluciones acuosas de ácidos (acético, fórmico, etc.). Como detectores se suelen utilizar ultravioleta/visible (UV/VIS), fotodiodo array (PDA) y fluorescencia, pero últimamente se usa también la espectrometría de masas para muestras complejas. Por último, hay que mencionar que los tiempos de análisis suelen variar entre 30 y 40 minutos [25]. Hay que destacar que la cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una opción estudiada en los últimos años para el análisis de polifenoles gracias a sus altas resoluciones y eficiencias, cortos tiempos de análisis y bajo consumo de disolventes. En SFC no hay una fase estacionaria de uso general como en HPLC, pero últimamente se están estudiando fases estacionarias polares aquirales para expandir su aplicabilidad [26]. 3.6. Determinación del contenido fenólico total Uno de los métodos más utilizados para la determinación del contenido fenólico total es el ensayo Folin-Ciocalteau. Es un método colorimétrico basado en reacciones de transferencia de electrones entre los compuestos fenólicos y el reactivo de Folin-Ciocalteau (FCR), y el contenido fenólico se expresa respecto a algún patrón concreto (habitualmente ácido gálico). Este ensayo presenta un problema, no es específico para la determinación del contenido fenólico total, ya que hay otros compuestos no fenólicos (como los azucares reductores o la vitamina C) que pueden formar parte de las muestras y pueden reducir el FCR, dando lugar a resultados incorrectos. Para solucionar este problema lo que se hace es ajustar el pH a ∼ 10 Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 16 (básico), ya que los compuestos fenólicos solo reaccionan con FCR en estas condiciones, debido a que se produce el anión fenolato que reduce el FCR. El ensayo FC se propuso para mejorar el diseño inicial de Folin y Denis destinado al análisis de proteínas, determinando su concentración total a través del contenido en tirosina (la cual contiene un grupo fenol). Años después, Singleton y Rossi modificaron este ensayo para aplicarlo al análisis de fenoles totales en vino y desde entonces se utiliza en muchas aplicaciones. La naturaleza química exacta del reactivo Folin-Ciocalteau no se ha determinado, pero se cree que está compuesto por heteropolifosfowolframatos-molibdatos, lo que da lugar a una disolución de color amarillo intenso. La reacción que ocurre tiene lugar entre el reactivo y los polifenoles, de modo que se forma un compuesto de color azul relacionado con la concentración de polifenoles. Esta reacción también es desconocida debido a su complejidad, lo único que se sabe con certeza es que sucede mediante secuencias reversibles de reacciones de reducción. Entre el wolframio y el molibdeno se cree que este último es más fácil de reducir y, por lo tanto, la reacción de transferencia de electrones tiene lugar entre los polifenoles (reductor) y los molibdatos (VI) (oxidante) [6, 27]. A pesar de que la naturaleza química del FCR es desconocida, este método es simple y reproducible, lo que hace que sea utilizado habitualmente en el análisis de diferentes tipos de matrices, incluyendo las infusiones [1, 15, 16, 17]. 3.7. Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica intermedia ente la cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases. En SFC, la fase móvil es un fluido supercrítico, es decir, un fluido con temperatura y presión por encima de los valores críticos (punto crítico). Entre las características de los fluidos supercríticos se puede destacar lo siguiente [28]: - Su densidad, viscosidad y otras propiedades son intermedias entre las de un gas y un líquido, siendo la densidad más cercana a las del líquido y la viscosidad a la del gas. Esto se puede observar en la Tabla 1. - En algunos casos, en los que los fluidos son gases en condiciones ambientales, se pueden recuperar con facilidad los analitos disueltos en ellos. - Muchos de ellos son baratos, inocuos y no tóxicos. Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 17 Tabla 1: comparación de las propiedades de fluidos supercríticos, gases y líquidos En comparación con la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), en SFC el mayor coeficiente de difusión y la menor viscosidad de la fase móvil permite utilizar flujos mayores, la transferencia de materia es más rápida (menores tiempos de retención) y la caída de presión a lo largo de la columna es menor. Esto hace que en SFC las separaciones sean más rápidas y eficaces [29, 30]. En comparación con la cromatografía de gases (GC), en SFC se pueden analizar compuestos no volátiles (o difíciles de volatilizar) y permite separar compuestos mucho más polares [31]. Hay muchos compuestos que se han empleado en SFC como fases móviles a lo largo del tiempo, como N2O, NH3 o butano. Sin embargo, actualmente el CO2 es el más utilizado como fase móvil. Esto es debido a que presenta una temperatura crítica de 31ºC y una presión crítica de 72,9 atm (valores fácilmente alcanzables) y a que es un disolvente excelente para moléculas no polares, fácilmente disponible, barato, transparente en el ultravioleta, inoloro y no tóxico (GRAS, Generally Recognized As Safe). Esto se puede observar en la Tabla 2 [28]. PROPIEDAD GAS (1 atm, 25ºC) FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO (1 atm, 25ºC) DENSIDAD (g/cm3) (0,6-2) x 10-3 0,2-0,5 0,6-2 COEFICIENTE DE DIFUSIÓN (cm2/s) (1-4) x 10-1 10-3-10-4 (0,2-2) x 10-5 VISCOSIDAD (1-3) x 10-4 (1-3) x 10-4 (0,2-3) x 10-2 Trabajo Fin de Grado Introducción y antecedentes bibliográficos Sofía López Ayúcar 18 Tabla 2: propiedades de algunos fluidos supercríticos El CO2 es un disolvente apolar, por lo que muchas veces se mezcla con algún disolvente orgánico miscible con él, denominado “modificador”, de este modo se pueden separar compuestos polares. Los modificadores más comunes son alcoholes como metanol o etanol. En algunas ocasiones el uso de los modificadores orgánicos no es suficiente para conseguir que eluyan los analitos con buenas formas de pico, por lo que se suele introducir en la fase móvil un componente denominado “aditivo”, el cual se incluye en concentraciones muy bajas. Estos aditivos que mejoran la forma y simetría de los picos cromatográficos pueden ser ácidos (como el ácido trifluoroacético (TFA)), bases (como la trietilamina (TEA)) o sales, aunque en menor frecuencia (formiato amónico normalmente). Hay que mencionar que las columnas utilizadas habitualmente en SFC son empaquetadas y las fases estacionarias suelen ser polares [32]. Son muy pocos los trabajos en los que se utiliza SFC para la separación de polifenoles, y en menor medida en muestras reales [33, 34]. FLUIDO TEMPERATURA CRÍTICA (Tc), ºC PRESIÓN CRÍTICA (Pc), atm DENSIDAD EN EL PUNTO CRÍTICO, g/mL CO2 31,3 72,9 0,47 N2O 36,5 71,7 0,45 NH3 132,5 112,5 0,24 n-Butano 152,0 37,5 0,23 Trabajo Fin de Grado Objetivos y plan de trabajo Sofía López Ayúcar 19 4. Objetivos y plan de trabajo El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar la capacidad antioxidante de diferentes tipos de infusiones (té verde, té negro, té rojo, té negro con canela e infusión fría de frutos del bosque), para ello se han empleado dos métodos distintos (DPPH y ABTS), y también se ha determinado el contenido fenólico total utilizando el método Folin-Ciocalteau. Finalmente se ha utilizado la cromatografía de fluidos supercríticos con el fin de identificar y cuantificar individualmente los compuestos fenólicos presentes en dichas infusiones. El plan de trabajo seguido para llevar a cabo el estudio ha sido el siguiente: - Revisión de antecedentes bibliográficos relacionados con el tema a tratar para obtener los conocimientos requeridos. - Aprendizaje de la utilización del espectrofotómetro de absorción molecular UV-Vis. - Determinación de la capacidad antioxidante de las muestras mediante dos ensayos distintos: DPPH y ABTS. - Comparación de resultados obtenidos mediante ambos métodos. - Determinación del contenido fenólico total de las muestras mediante el método FolinCiocalteau. - Observación de la posible correlación entre el contenido fenólico total obtenido para cada muestra, y su capacidad antioxidante. - Aprendizaje de la utilización del equipo de cromatografía de fluidos supercríticos. - Separación, identificación y cuantificación de los polifenoles presentes en las muestras mediante SFC. Trabajo Fin de Grado Experimental Sofía López Ayúcar 20 5. Experimental 5.1. Equipos Se ha utilizado el espectrofotómetro V-650 de Jasco Corporation (Tokio, Japón) mostrado en la Figura 10. Figura 10: espectrofotómetro V-650 El equipo mide el espectro de absorción molecular de una muestra en un rango de longitud de onda de 190 a 900 nm. Las fuentes de luz utilizadas son una lámpara de deuterio (D2) (187 a 350 nm) para la región UV, y una lámpara halógena (WI) (330 a 900 nm) para la región VIS/NIR. Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 27 Figura 14: variación de la capacidad antioxidante con el tiempo de infusión para DPPH Como se puede observar (Figura 14), al aumentar el tiempo de infusión aumentó la capacidad antioxidante de la infusión, de modo que en todas las variedades se observó un aumento claro cuando se pasó de infusionar 2 minutos a infusionar 5. Sólo en el caso del té verde y té negro hay un incremento alto al pasar de infusionar de 5 a 10 minutos, mientras que en el resto de infusiones permanece prácticamente constante. Además, al comparar con los resultados obtenidos por otros autores [16], se observa que ocurre lo mismo, al aumentar el tiempo de infusión aumenta la capacidad antioxidante ya que se extraen más componentes. Se observa además, que a los 10 minutos de infusión, el té que presentó mayor capacidad antioxidante fue el verde, con una capacidad antioxidante de 105,02 mg trolox/g muestra seca, seguido por el negro con canela, el negro, el rojo y, por último, la infusión fría de frutos del bosque sería la que menos capacidad antioxidante presentó (7,76 mg trolox/g muestra seca). A continuación se ensayaron diferentes temperaturas (65, 85 y 100 ºC) para ver si al aumentar la temperatura del agua en que se hacía la infusión, aumentaba también la capacidad antioxidante o si, por el contrario, aunque era lógico esperar una mayor extracción de compuestos, estos podían sufrir degradaciones dando como resultado final una disminución de la capacidad antioxidante. Esto se hizo seleccionando los mejores tiempos de infusión obtenidos anteriormente; de modo que se infusionó 5 minutos para el té negro y rojo (ya que no se apreciaban grandes aumentos en la AC de 5 a 10 minutos) y 10 minutos para el té verde 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 Té negro Té rojo Infusión fría de frutos del bosque Té verde Té negro con canela C (mg Trolox/g muestra) Comparación tiempos de infusión 2 minutos 5 minutos 10 minutos Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 28 y té negro-canela (había un aumento claro al pasar de 5 a 10 minutos). Cabe destacar que este ensayo no se realizó para la infusión de frutos del bosque ya que es una infusión fría. A continuación se muestran los resultados obtenidos para la AC a diferentes temperaturas (Figura 15). Figura 15 variación de la capacidad antioxidante con la temperatura del agua de infusión para DPPH Como se puede observar, al aumentar la temperatura de infusión aumentó la capacidad antioxidante de la infusión, de modo que en todas las variedades había un incremento apreciable al pasar de infusionar a 65ºC o 85ºC a utilizar agua hirviendo. Además, el té que presentó mayor capacidad antioxidante fue el verde, luego el negro con canela, seguido del negro y, por último, el té rojo. En la revisión bibliográfica también se encontró un trabajo en el que se comparaba la capacidad antioxidante de infusiones de plantas medicinales preparadas con agua fría (20ºC) y con agua caliente (98ºC), observándose que se obtenían mejores resultados infusionando con agua caliente [18]. Para comprobar si las aparentes diferencias encontradas entre las distintas variedades de infusiones eran significativas se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) en función del tipo de infusión. Esto se realizó a partir de los datos obtenidos para la temperatura de ebullición y el tiempo óptimo de infusión mencionado anteriormente (5 minutos para té negro 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 Té negro Té rojo Té verde Té negro con canela C (mg Trolox/g muestra) Comparación temperaturas del agua de infusión Tª ebullición 85ºC 65ºC Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 29 y rojo y 10 minutos para té verde y negro-canela), ya que de esta forma se obtenía la mayor capacidad antioxidante. Al observar los resultados se comprobó que se obtuvo un valor para la significación a posteriori de aproximadamente 0,00 (p a posteriori), valor menor a 0,05 (𝛂, significación a priori para un nivel de confianza del 95%), por lo que la hipótesis nula (la hipótesis nula es que el factor no tiene efecto) se rechaza con fuerza, es decir, se pudo concluir que los valores medios obtenidos eran significativamente diferentes para cada tipo de infusión. En la Figura 16 se puede observar esta diferencia, donde se representa la capacidad antioxidante en función del tipo de infusión mediante un gráfico de caja y bigotes (Box-plot). Figura 16: gráfico de caja y bigotes obtenido para la AC por el método DPPH Como se puede observar, el té verde es el que presenta mayor capacidad antioxidante, sobre todo respecto a la infusión fría de frutos del bosque y al té rojo. También se puede apreciar que los valores medios obtenidos para el té negro y para el té negro con canela son muy similares, presentando el té negro con canela valores mayores; lo que puede ser debido al aporte extra de la canela. 6.1.2. Método ABTS Para el método ABTS había que preparar el radical, ya que no estaba formado como ocurría en el caso del DPPH. Para ello se preparó una disolución con 2,45 ml de K2S2O8 24,5 mM, enrasando a 25,0 mL con ABTS 7 mM. La mezcla se dejó incubar en la oscuridad a temperatura ambiente entre 12 y 16 horas, de modo que se obtenía el radical ABTS.+ azul verdoso oscuro. Una vez formado el radical se medía su absorbancia, determinándose su longitud de onda de máxima absorción la cuál fue de 734 nm, y se diluyó hasta obtener una absorbancia de Capacidad antioxidante (mg Trolox/g muestra seca) Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 30 0,7±0,02 a esa longitud de onda. Este radical diluido ya se podía utilizar para determinar la capacidad antioxidante de las muestras. La formación de este radical se realizó de este modo porque es la forma de producir el radical más estable en agua, no obstante, se debía repetir la preparación del radical cada dos días debido a su alta inestabilidad. Del mismo modo que para el DPPH, para determinar la capacidad antioxidante mediante el método ABTS se debe conocer previamente el tiempo de reacción entre el radical y los antioxidantes. Para ello se realizó una cinética con las infusiones, de modo que se tomaron 0,3 mL de cada infusión, se enrasó a 5,0 mL con la disolución del radical ABTS y se midió la disminución de la absorbancia a lo largo del tiempo a 734 nm. En la Figura 17 se puede observar que a partir de los 30 minutos (1800 segundos) la variación de la absorbancia con el tiempo era muy pequeña, inferior al 5%. El caso que se presenta es el del té negro, pero para el resto de infusiones ocurría lo mismo, por lo que se fijó el tiempo de incubación de la mezcla en media hora. Figura 17: cinética del té negro con ABTS a 734 nm Se preparó una línea de calibrado utilizando Trolox en un rango de concentraciones de 10 a 90 ppm. Para ello se pipeteó 0,3 mL de cada disolución patrón de Trolox, enrasando a 5,0 mL con la disolución del radical ABTS. Se dejó reaccionar la mezcla en la oscuridad y a temperatura ambiente (25ºC) durante media hora y se midió la disminución de la absorbancia a 734 nm. Con las muestras se siguió el mismo procedimiento. A partir de los resultados obtenidos para las infusiones y de la línea de calibrado se determinó la concentración (mg/L) equivalente en Trolox por interpolación, y se expresó la capacidad antioxidante de cada muestra como mg Tiempo (segundos) Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 31 Trolox/g muestra seca. Hay que mencionar que las muestras se analizaron por triplicado y los resultados presentados son las medias de las tres réplicas. En primer lugar, se llevó a cabo la determinación de la capacidad antioxidante de todas las variedades para 2, 5 y 10 minutos de infusión a la temperatura de ebullición del agua, con el fin de determinar cual era el tiempo óptimo de infusión para probar más tarde diferentes temperaturas. En la Figura 18 se muestran los resultados obtenidos para cada tipo de infusión y para los diferentes tiempos ensayados expresados en mg Trolox/g muestra seca. Figura 18: variación de la capacidad antioxidante con el tiempo de infusión para el método ABTS Como puede observarse al igual que en el método DPPH, al aumentar el tiempo de infusión aumentó la capacidad antioxidante. Cuando se pasó de infusionar 2 minutos a infusionar 5, especialmente para el té verde y el té negro con canela, se observó un incremento pronunciado, mientras que al pasar de 5 a 10 minutos en general el aumento fue menor, excepto para la infusión de té rojo. Hay que comentar que en el caso del té rojo al infusionar 10 min se apreció un mayor aumento cuando se utilizó ABTS que cuando se utilizó DPPH; mientras que por el contrario, para el té verde y té negro con canela sólo se observó un ligero aumento utilizando ABTS. Cabe destacar que aunque los dos métodos (DPPH y ABTS) se utilizan indistintamente para determinar la capacidad antioxidante, la contribución de cada compuesto con capacidad antioxidante es diferente en cada uno y esto puede justificar las diferencias observadas. 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 400.00 Té negro Té rojo Infusión fría de frutos del bosque Té verde Té negro con canela C (mg Trolox/g muestra) Comparación tiempos de infusión 2 minutos 5 minutos 10 minutos Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 32 Se observa además que, para todos los tiempos de infusión, el té que presentó mayor capacidad antioxidante fue el verde, seguido del negro con canela, el negro, el rojo y, por último, la infusión fría de frutos del bosque. Esto coincide con lo obtenido para un tiempo de infusión de 10 minutos con el método DPPH. A continuación se experimentó con distintas temperaturas (65, 85 y 100 ºC) utilizando un tiempo de infusión de 10 minutos. En la Figura 19 se muestran los resultados obtenidos. Figura 19: variación de la capacidad antioxidante con la temperatura del agua de infusión para ABTS Como se puede observar, al aumentar la temperatura de infusión aumenta la capacidad antioxidante de la muestra, de modo que en todas las variedades se ve un aumento cuando se pasa de infusionar a 65ºC a infusionar a 85ºC, y lo mismo ocurre al pasar de 85ºC a la temperatura de ebullición, siendo más marcado este último aumento. Además, se puede observar que el té que presentó mayor capacidad antioxidante para todas las temperaturas fue el verde, pero en función de la temperatura utilizada el siguiente sería el negro con canela (para Tª eb.) o el negro (para 85 y 65ºC) y, por último, en todos los casos el que presentó la menor capacidad antioxidante fue el té rojo. Del mismo modo que para el método DPPH, para comprobar si las aparentes diferencias encontradas entre las distintas variedades de infusiones eran significativas se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) en función del tipo de infusión. Esto se realizó a partir de los 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 400.00 Té negro Té rojo Té verde Té negro con canela C (mg Trolox/g muestra) Comparación temperaturas del agua de infusión Tª ebullición 85ºC 65ºC Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 33 datos obtenidos para la temperatura de ebullición y el tiempo de infusión óptimo mencionado anteriormente (10 minutos), ya que de esta forma se obtenía la mayor capacidad antioxidante. Al observar los resultados se comprobó que se obtuvo un valor para la significación a posteriori de aproximadamente 0,00, valor menor a 0,05, por lo que la hipótesis nula se rechaza con fuerza, es decir, se pudo concluir que los valores medios obtenidos eran significativamente diferentes para cada tipo de infusión. En la Figura 20 se puede observar esta diferencia, donde se representa la capacidad antioxidante en función del tipo de infusión mediante un gráfico de caja y bigotes (Box-plot). Figura 20: gráfico de caja y bigotes obtenido para la AC por el método ABTS Como se puede observar, el té verde es el que presenta mayor capacidad antioxidante, sobre todo respecto a la infusión fría de frutos del bosque. Hay que señalar que con el método ABTS las infusiones de frutos del bosque y té rojo se diferencian más que con el método DPPH. Una vez determinada la capacidad antioxidante por ambos métodos se evaluó el coeficiente de correlación de Pearson para estudiar la asociación entre las dos variables aleatorias (DPPH y ABTS). Este coeficiente varía entre -1 y +1 en función del tipo de asociación, siendo estos dos valores los que indican una perfecta relación lineal entre las dos variables. Se obtuvo un valor de r=0,9837 con un p-valor=0,0025. El p-valor es menor que 0,05, por lo que la correlación es significativamente diferente de cero con un nivel de confianza del 95%. Por lo tanto, DPPH y ABTS presentan una correlación significativa entre los valores obtenidos por ambos métodos, como era lógico esperar. Capacidad antioxidante (mg Trolox/g muestra seca) Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 34 6.2. Contenido fenólico total (TFC) de las infusiones Para determinar el contenido fenólico total de las distintas infusiones se utilizó el método Folin-Ciocalteau. En este caso, los ensayos se realizaron utilizando agua a temperatura de ebullición y 10 minutos de infusión, puesto que eran las condiciones en las que se obtenía mayor capacidad antioxidante. Se utilizó como patrón de referencia ácido gálico, el cual al reaccionar con el reactivo, presenta un máximo de absorbancia a 760,4 nm. La línea de calibrado se preparó en un intervalo de concentraciones de 25 a 300 ppm. Para realizar la línea de calibrado se mezclaron 0,3 mL de cada patrón de ácido galico con 0,3 mL de reactivo Folin-Ciocalteau y la mezcla se dejó reaccionar 5 minutos. Pasados estos 5 minutos, se enrasó a 5,0 mL con una disolución de carbonato sódico al 5%, se dejó reaccionar la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente (25ºC) durante hora y media y se midió la absorbancia a 760,4 nm. Con las muestras se siguió el mismo procedimiento. A partir de los resultados obtenidos para las infusiones e interpolando en la línea de calibrado se determinó la concentración (mg/L) equivalente en ácido gálico y finalmente se expresó el contenido fenólico total de cada muestra como mg ácido gálico/g muestra seca. Hay que mencionar que las muestras se analizaron por triplicado y los resultados presentados son las medias de las tres réplicas. En la Figura 21 se presentan los resultados obtenidos. Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 35 Figura 21: variación del contenido fenólico total por el método Folin-Ciocalteau Como se puede observar, el té verde es el que posee un mayor contenido fenólico total (78,70 mg ácido gálico/g muestra), lo que coincide con los valores obtenidos para la capacidad antioxidante en los que el té verde también es el presenta los valores más altos. Del mismo modo, la infusión fría de frutos del bosque es la que presenta menor contenido fenólico total (13,06 mg ácido gálico/g muestra seca) y también menor capacidad antioxidante. Esto puede ser razonable si se considera que la capacidad antioxidante y el contenido fenólico total están directamente relacionados, algo que consideran algunos autores. Sin embargo, otros piensan que no existe esa relación, ya que los compuestos fenólicos pueden tener diferentes respuestas en función a su estructura y los extractos vegetales pueden presentar gran cantidad de compuestos antioxidantes además de polifenoles, por lo que no se puede predecir la capacidad antioxidante a partir de su contenido fenólico [20]. Esto explicaría los resultados obtenidos para el té negro con canela, el rojo y el negro, ya que, después del té verde, el té con mayor contenido fenólico total sería el negro, luego el rojo y después el negro con canela, a diferencia de lo que ocurrió con la capacidad antioxidante en la que el orden era té negro con canela, seguido del negro y el rojo. Al igual que para la capacidad antioxidante, para comprobar si las aparentes diferencias encontradas entre las distintas variedades de infusiones para el contenido fenólico total eran significativas se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) en función del tipo de infusión. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Té negro Té rojo Infusión fría de frutos del bosque Té verde Té negro con canela C (mg ácido gálico/g muestra) TFC mediante Folin-Ciocalteau Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 36 Al observar los resultados se comprobó que se obtuvo un valor para la significación a posteriori de aproximadamente 0’00, valor inferior a 0’05, por lo que la hipótesis nula se rechaza con fuerza, es decir, se pudo concluir que los valores medios obtenidos eran significativamente diferentes para cada tipo de infusión. En la Figura 22 se puede observar esta diferencia, donde se representa el contenido fenólico total en función del tipo de infusión mediante un gráfico de caja y bigotes (Box-plot). Figura 22: gráfico de caja y bigotes obtenido para el contenido fenólico total por el método FC Como se puede observar, el té verde es el que presenta mayor contenido fenólico total, sobre todo respecto a la infusión fría de frutos del bosque. Por otro lado se observa que el té negro, el té negro con canela y el té rojo presentan una mayor similitud en lo referente a su contenido fenólico total. Una vez determinado el contenido fenólico total se evaluó el coeficiente de correlación de Pearson para estudiar la asociación entre cada uno de los métodos para la determinación de la capacidad antioxidante (DPPH y ABTS) y el método Folin-Ciocalteau. Se obtuvo un valor de r=0,8575 con un p-valor=0,0632 para DPPH y FC y un valor de r=0,9229 con un p-valor=0,0254 para ABTS y FC. Por lo tanto, los valores de la capacidad antioxidante obtenidos mediante el método DPPH y el contenido fenólico total determinado mediante el método Folin-Ciocalteau no presentan correlación significativa, mientras que sí que la presentan, para un nivel de confianza del 95%, cuando la capacidad antioxidante se determina mediante el método ABTS. Contenido fenólico total (mg ácido gálico/g muestra seca) Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 43 Té verde En el caso del té verde se identificó únicamente catequina en una concentración alta en comparación con la encontrada en el resto de infusiones como se verá a continuación. Hay que mencionar que el compuesto que aparece a un tiempo de retención de 6 minutos no se pudo identificar, pero aparece en todos los tés y no en la infusión fría de frutos del bosque, y el pico que aparece a un tiempo de retención de 21-22 minutos se pensó en un primer momento que podía ser la quercetina pero esta teoría se descartó al observar el espectro de absorción molecular. Tabla 6: concentración de los polifenoles encontrados en el té verde expresados en mg polifenol/g muestra seca (n = 3) Figura 25: cromatograma del té verde. 1. Catequina. Condiciones cromatográficas: columna DAICEL DCPak PBT, 35ºC, 150 bares, 2 mL/min, gradiente Tabla 3 POLIFENOLES CONCENTRACIÓN (mg polifenol/g muestra seca) % RSD Catequina 80,3 3.6 Intensidad (µV) Tiempo de retención (min) 1 Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 44 Té negro con canela En el té negro con canela se identificaron cinámico y catequina, siendo este último el de mayor concentración aunque en menor medida que en el caso del té verde. Tabla 7: concentración de los polifenoles encontrados en el té negro con canela expresados en mg polifenol/g muestra seca (n=3) Figura 26: cromatograma del té negro con canela. 1. Cinámico 2. Catequina. Condiciones cromatográficas: columna DAICEL DCPak PBT, 35ºC, 150 bares, 2 mL/min, gradiente Tabla 3 POLIFENOLES CONCENTRACIÓN (mg polifenol/g muestra seca) % RSD Cinámico 6,4 2.1 Catequina 30,9 3.5 Tiempo de retención (min) Intensidad (µV) 1 2 Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 45 Té negro En el té negro se identificaron ferúlico, cumárico, cafeico, gálico y catequina. La catequina sigue siendo el polifenol mayoritario al igual que en los casos anteriores y su concentración es menor que en el té verde y el negro con canela. También se puede observar el pico del mismo compuesto desconocido a los 6 minutos de retención. Tabla 8: concentración de los polifenoles encontrados en el té negro expresados en mg polifenol/g muestra seca (n=3) Figura 27: cromatograma del té negro. 1. Ferúlico 2. Cumárico 3. Cafeico 4. Gálico 5. Catequina. Condiciones cromatográficas: columna DAICEL DCPak PBT, 35ºC, 150 bares, 2 mL/min, gradiente Tabla 3 POLIFENOLES CONCENTRACIÓN (mg polifenol/g muestra seca) % RSD Ferúlico < LOD Cumárico 0,54 4.3 Cafeico 0,8 3.8 Gálico 8,5 2.3 Catequina 10,3 3.1 Tiempo de retención (min) Intensidad (µV) 1 2 3 4 5 Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 46 Té rojo En el té rojo se identificaron cinámico, ferúlico, sinápico, gálico, naringenina y catequina. En este caso, la concentración de la catequina es menor que en el té verde, el negro con canela y el negro. Del mismo modo, se puede observar el pico del compuesto desconocido a los 6 minutos de retención, el cual es aún más intenso. Tabla 9: concentración de los polifenoles encontrados en el té rojo expresados en mg polifenol/g muestra seca (n=3) Figura 28: cromatograma del té rojo. 1. Cinámico 2. Ferúlico 3. Sinápico 4. Gálico 5. Naringenina 6. Catequina. Condiciones cromatográficas: columna DAICEL DCPak PBT, 35ºC, 150 bares, 2 mL/min, gradiente Tabla 3 POLIFENOLES CONCENTRACIÓN (mg polifenol/g muestra seca) % RSD Cinámico < LOD -- Ferúlico 0,4 4,1 Sinápico 0,2 3,6 Gálico 3,8 2,5 Naringenina 0,3 4,2 Catequina 2,0 4,3 Tiempo de retención (min) Intensidad (µV) 1 2 3 4 5 6 Trabajo Fin de Grado Resultados y discusión Sofía López Ayúcar 47 Infusión fría de frutos del bosque En la infusión fría de frutos del bosque se identificaron cinámico, gálico y catequina. Al igual que en los otros casos, la catequina sigue siendo la de mayor concentración, pero en menor medida que en los tés. En este caso no se observa el pico a 6 minutos de retención, por lo que puede ser debido a compuestos de la planta del té. Tabla 10: concentración de los polifenoles encontrados en la infusión fría de frutos del bosque expresados en mg polifenol/g muestra seca (n=3) Figura 29: cromatograma de la infusión fría de frutos del bosque. 1. Cinámico 2. Gálico 3. Catequina. Condiciones cromatográficas: columna DAICEL DCPak PBT, 35ºC, 150 bares, 2 mL/min, gradiente Tabla 3 POLIFENOLES CONCENTRACIÓN (mg polifenol/g muestra seca) % RSD Cinámico 1,1 3,7 Gálico <LOD --- Catequina 1,5 3,9 Tiempo de retención (min) Intensidad (µV) 1 2 3 Trabajo Fin de Grado Conclusiones Sofía López Ayúcar 48 7. Conclusiones • Se ha determinado la capacidad antioxidante de distintas variedades de infusiones por el método DPPH y por el método ABTS, obteniéndose mayores valores de la misma por el último método y presentando siempre el té verde la mayor capacidad antioxidante y la menor la infusión de frutos del bosque. Además, se observó que había cierta correlación entre los resultados obtenidos por ambos métodos. • Se ha determinado el contenido fenólico total de las infusiones mediante el método Folin-Ciocalteau, observándose que al igual que en el caso de la capacidad antioxidante, el que presentó mayor contenido fenólico total fue el té verde y el menor la infusión de frutos del bosque. Además, se apreció una correlación entre el contenido fenólico total y la capacidad antioxidante obtenida por el método ABTS, pero no ocurría lo mismo con los resultados del DPPH. • Los mejores resultados tanto en términos de capacidad antioxidante como en contenido fenólico total, se obtuvieron realizando las infusiones con agua calentada hasta ebullición y dejando infusionar durante 10 minutos. • Los resultados obtenidos tanto para la capacidad antioxidante como para el contenido fenólico total mostraron diferencias significativas para los distintos tipos de infusiones. Hay que señalar que en lo referente a la capacidad antioxidante, los valores obtenidos para la infusión de frutos del bosque fueron más similares a los obtenidos para el té rojo, pero siempre mayores para éste último. Lo mismo puede decirse para el té negro y para el té negro con canela, en este caso los mayores valores observados para el té negro con canela pueden ser debidos precisamente al aporte de la canela. Con respecto al contenido fenólico total se observó una mayor similitud entre los valores obtenidos para el té negro, té negro con canela y té rojo. • Se llevó a cabo la determinación individual de 9 polifenoles mediante cromatografía de fluidos supercríticos (SFC). Los resultados mostraron que el polifenol más abundante en todos los casos fue la catequina y que el perfil cromatográfico obtenido era diferente para cada tipo de infusión. Trabajo Fin de Grado Bibliografía Sofía López Ayúcar 49 8. Bibliografía [1] S. Gonçalves, D. Gomes, P. Costa y A. 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Trabajo Fin de Grado Abreviaturas Sofía López Ayúcar 52 Abreviaturas ABTS Ácido 2,2’azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) AC Capacidad antioxidante CUPRAC Cupric ion reducing antioxidant capacity DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidracilo EtOH Etanol FC Folin-Ciocalteau FCR Reactivo de Folin-Ciocalteau FRAP Ferric reducing antioxidant power GAE Equivalente en ácido gálico GC Cromatografía de gases HAT Transferencia de átomos de hidrógeno HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución LOD Límite de detección LOQ Límite de cuantificación MeOH Metanol ORAC Oxygen radical absorbance capacity PDA Detector de fotodiodos alineados ROS Especies reactivas de oxígeno SET Transferencia de un único electrón SFC Cromatografía de fluidos supercríticos SOD Superóxido dismutasa TEAC Capacidad antioxidante equivalente en Trolox