Biopolímeros para la síntesis de nanopartículas en dosificación de fármacos

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Biopolímeros para la síntesis de nanopartículas en dosificación de fármacos Autor: Alejandro del Hierro González Tutor/es: Dr. F. Javier Arias Dra. Alessandra Girotti Agradecimientos A mi familia, porque sin ellos no podría haberlo conseguido. A Javier y Alessandra, por haberme mostrado la investigación en un fantástico campo científico. A Irene y Sara, por el compañerismo y el ambiente generado durante estos meses, vitales para la consecución de los propios objetivos. Índice 1Resumen/Abstract .................................................................................................................. 1 2Introducción........................................................................................................................... 2 2.1Biología molecular e ingeniería genética................................................................................... 2 2.2Tecnología del ADN recombinante .......................................................................................... 2 2.3Biomateriales ....................................................................................................................... 4 2.4Sistemas de dosificación de fármacos ...................................................................................... 5 2.4.1Elastina y polipéptidos tipo elastina................................................................................... 6 2.4.2Nanopartículas basadas en ELPs........................................................................................ 8 3Objetivos ............................................................................................................................. 10 4Materiales y métodos............................................................................................................ 11 4.1Materiales ......................................................................................................................... 11 4.1.1Reactivos químicos ....................................................................................................... 11 4.1.2Soluciones tamponadas ................................................................................................. 11 4.1.3Materiales para biología molecular.................................................................................. 12 4.1.3.1Cepas bacterianas ................................................................................................... 12 4.1.3.2Medios de cultivo ................................................................................................... 12 4.1.3.3Enzimas de restricción y ligasa .................................................................................. 13 4.1.3.4Vectores plasmídicos ............................................................................................... 14 4.1.3.5Genes sintéticos y plásmidos base ............................................................................. 15 4.1.3.6Kits de extracción y purificación de ADN..................................................................... 16 4.2Métodos............................................................................................................................ 16 4.2.1Reacción de ligación ...................................................................................................... 16 4.2.2Preparación de placas de cultivo bacteriano ..................................................................... 17 4.2.3Transformación en cepas bacterianas .............................................................................. 17 4.2.3.1Transformación en DH5α Competent Cells .................................................................. 17 4.2.3.2Transformación en BLR(DE3) Competent Cells ............................................................. 18 4.2.3.3Transformación en SHuffle® T7 Express Competent E. coli ............................................. 18 4.2.4Purificación de ADN plasmídico de E. coli.......................................................................... 18 4.2.5Digestión analítica de ADN con enzimas de restricción ....................................................... 20 4.2.6Electroforesis de ADN en geles de agarosa ....................................................................... 20 4.2.7Secuenciación de ADN ................................................................................................... 22 4.2.8Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida........................................................ 22 4.2.9Bioproducción de proteínas recombinantes ...................................................................... 24 4.2.10Extracción y purificación proteica .................................................................................. 26 4.2.10.1Sonicación celular e ITC.......................................................................................... 26 4.2.10.2Extracción orgánica y precipitación en acetonitrilo ..................................................... 27 4.2.11Caracterización de polipéptidos tipo elastina .................................................................. 27 4.2.11.1Espectrometría de masas MALDI-TOF....................................................................... 27 4.2.11.2Resonancia Magnética Nuclear de protón (1H-RMN)................................................... 28 4.2.11.3Análisis de aminoácidos por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) ........... 29 4.2.11.4Dispersión dinámica de la luz (DLS) .......................................................................... 29 4.2.11.5Calorimetría diferencial de barrido (DSC) .................................................................. 30 5Resultados y discusión ........................................................................................................... 31 5.1Síntesis del polímero (SI)2..................................................................................................... 31 5.1.1Ligación del inserto (SI)2 con el plásmido pET7 y amplificación del p7(SI)2.............................. 31 5.1.2Digestión analítica del p7(SI)2 ......................................................................................... 31 5.1.3Bioproducción del (SI)2 .................................................................................................. 32 5.1.4Purificación.................................................................................................................. 35 5.1.5Caracterización del biopolímero...................................................................................... 38 5.1.5.1Determinación de la masa molecular aparente por SDS-PAGE ....................................... 38 5.1.5.2Análisis de la composición por 1H-RMN ...................................................................... 39 5.1.5.3Determinación de la masa molecular por MALDI-TOF ................................................... 40 5.1.5.4Análisis de la formación de nanopartículas mediante DLS ............................................. 40 5.1.5.5Determinación de la temperatura de transición mediante DSC ...................................... 41 5.1.5.6Determinación de la composición aminoacídica mediante HPLC .................................... 42 5.2Síntesis del polímero 3CK24(SI)2 ............................................................................................. 42 5.2.1Bioproducción del 3CK24(SI)2 ........................................................................................... 42 5.2.2Purificación.................................................................................................................. 44 5.2.2.1Purificación por ITC ................................................................................................. 44 5.2.2.2Purificación por extracción con disolventes orgánicos y precipitación en acetonitrilo. ....... 47 5.2.3Caracterización del biopolímero...................................................................................... 48 5.2.3.1Determinación de la masa molecular aparente por SDS-PAGE ....................................... 48 5.2.3.2Análisis de la composición por 1H-RMN ...................................................................... 49 5.2.3.3Determinación de la masa molecular por MALDI-TOF ................................................... 50 5.2.3.4Determinación de la temperatura de transición mediante DSC ...................................... 50 5.2.3.5Determinación de la composición aminoacídica mediante HPLC .................................... 50 5.3Síntesis del 3K(EI)2............................................................................................................... 51 5.3.1Purificación por extracción con disolventes orgánicos y precipitación en acetonitrilo.............. 51 5.3.2Caracterización del biopolímero...................................................................................... 53 5.3.2.1Determinación de la masa molecular aparente por SDS-PAGE ....................................... 53 5.3.2.2Análisis de la composición por 1H-RMN ...................................................................... 55 5.3.2.3Determinación de la masa molecular por MALDI-TOF ................................................... 55 5.3.2.4Determinación de la temperatura de transición mediante DSC ...................................... 55 5.3.2.5Determinación de la composición aminoacídica mediante HPLC .................................... 56 6Conclusiones ........................................................................................................................ 57 7Bibliografía........................................................................................................................... 58 8Anexo .................................................................................................................................. 60 8.1Espectros de 1H-RMN .......................................................................................................... 60 8.2MALDI-TOF del (SI)2 ............................................................................................................. 61 8.3MALDI-TOF del 3CK24(SI)2 ..................................................................................................... 62 8.4MALDI-TOF del 3K(EI)2 ......................................................................................................... 63 8.5Termogramas obtenidos por DSC .......................................................................................... 64 8.6Abreviaturas ...................................................................................................................... 66 1 1Resumen De la necesidad de poder suministrar un medicamento evitando todo tipo de efectos secundarios en el paciente, así como potenciando la eficacia del mismo una vez este ingresa en el organismo, sin que sea necesario el uso de varias dosis de este, nacen los sistemas de dosificación controlada de fármacos. De entre todos los vehículos que se pueden utilizar para conseguir este fin, se han elegido los polipéptidos tipo elastina (ELPs), capaces de formar estructuras en forma de nanopartícula donde portar el fármaco a transportar por el cuerpo, sin generar rechazo ni productos tóxicos en su degradación. El siguiente trabajo tuvo como fin la síntesis de dos polímeros tipo elastina, el (SI)2 y el 3CK24(SI)2, así como su purificación, caracterización y evaluación a la hora de formar nanopartículas en disolución acuosa gracias a su naturaleza anfifílica. Como vector de producción se utilizó E. coli, debido a la sencillez de su manejo y la facilidad de introducir en su maquinaria proteica ADN recombinante plasmídico, que codificaba para nuestras proteínas en cuestión. Paralelamente, también se inició la puesta a punto de un nuevo protocolo de purificación con el polímero 3K(EI)2. Abstract The necessity to be able to administer a drug without side effects in the patient, and with an enhacing efficiency for penetrating in the organism, without using several doses of drug, led to the creation of controlled drug delivery systems. Among all the vehicles that can be used to achieve this goal, elastin-like polypeptides (ELPs) have been chosen because of its ability to form nanoparticle-shaped structures to carry the drug and transport it through the body, without generating rejection or toxic products during its degradation. The following work was aiming at the synthesis of two elastin-like polymers, (SI)2 and 3CK24(SI)2, as well as their purification, characterization and the evaluation of their nanoparticle-formation ability in aqueous solution thanks to their amphiphilic nature. E. coli was used as production vector, due to its handling simplicity and the ease of introducing recombinant plasmid DNA into its protein machinery, which coded for our proteins of interest. In parallel, a new purification protocol was tested with the 3K(EI)2 polymer, too. 2 2Introducción 2.1Biología molecular e ingeniería genética Se define la biología molecular como el campo de la ciencia que estudia a los seres vivos y los procesos que ocurren en su interior desde el punto de vista de sus macroestructuras: polisacáridos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Dos corrientes bien diferenciadas forman parte de esta disciplina: la estructuralista, que se encarga del estudio a nivel atómico de los componentes celulares, solapándose con la bioquímica estructural; y la informacionista, cuyo punto de mira es la transmisión de información biológica de generación en generación, compartiendo materia de estudio con la genética. El flujo de la información genética, por lo tanto, ocurre de manera que una molécula de ADN sufre el proceso de transcripción, por el cual la información que contiene es codificada en una molécula de ARN y que, mediante la traducción, será transformada en una serie de aminoácidos que conformarán una proteína final. En resumen, el ADN celular tiene como misión la expresión de proteínas a través de moléculas intermediarias, los ARN (Figura 1). Figura 1. Dirección del flujo de información genética1. El conjunto de técnicas que permiten la manipulación del ADN se conoce como ingeniería genética, permitiendo desde la transferencia de ADN de un organismo a otro, introduciéndolo en sus propias secuencias génicas y creando organismos modificados genéticamente, hasta la replicación de moléculas de ADN, obteniendo muchísimas copias a partir de una inicial. De esta manera, por extrapolación a lo anteriormente descrito, se es incluso capaz de sintetizar proteínas gracias a la modificación del ADN de un ser vivo, aprovechando su maquinaria celular. 2.2Tecnología del ADN recombinante El proceso comienza con la clonación del ADN (Figura 2), una herramienta de la ingeniería genética que se basa en la obtención de múltiples copias de una secuencia génica de interés, en 9 cantidad de moléculas de agua podrán interaccionar con esa secuencia y, por lo tanto, menor será la Tt del polímero de interés9. Así, cuando un ELP se construye con un bloque hidrófobo y otro hidrofílico (un polipéptido anfifílico), se producirá un autoensamblaje del mismo cuando se alcance la temperatura crítica de micelización (CMT), que viene definida por la Tt de cada bloque y la influencia de los mismos entre sí. La parte hidrofóbica quedará enterrada en el interior de la estructura mientras que la hidrofílica permanecerá en la superficie, en contacto con el agua, formando nanopartículas (Figura 10). La concentración a la que esto ocurre se denomina concentración crítica de micelización (CMC)5. Figura 10. Formación de nanopartículas y agregados al aumentar la temperatura del polipéptido lineal disuelto10. Esto les confiere un notorio valor como sistemas de dosificación de fármacos, puesto que medicamentos hidrofóbicos que se transportan mal por el torrente sanguíneo quedarían encapsulados en el núcleo hidrofóbico y, como la nanopartícula es soluble por sus segmentos hidrofílicos, se mejoraría extraordinariamente el alcance de su diana terapéutica y su transporte y accesibilidad. 10 3Objetivos Por lo anteriormente expuesto, resulta evidente el interés en la obtención de polipéptidos tipo elastina desde el punto de vista biomédico como nuevos sistemas con gran potencial en la dosificación de fármacos, gracias a su biocompatibilidad y a su degradación de manera no tóxica y sin efectos secundarios, debido a que imitan la secuencia de la elastina natural. En esta línea, este trabajo se focalizó en producir y purificar dos polímeros tipo elastina basados en serinas e isoleucinas, el (SI)2 y el 3CK24(SI)2. El (SI)2 poseería una carga superficial neutra debido a que dichos aminoácidos no poseen grupos cargados, mientras que el 3CK24(SI)2, debido a su bloque de lisinas, debería ser catiónico en condiciones fisiológicas. Una vez puesta a punto su purificación se caracterizarán y se evaluará la capacidad de cada uno para la formación de nanopartículas. A su vez, se pretende probar un método de purificación alternativo empleando un polímero muy utilizado en el grupo de investigación, el 3K(EI)2, con el objetivo de disminuir el tiempo que conlleva el método tradicional mediante ciclos de transición inversa (ITC). Por tanto, los objetivos marcados a corto plazo fueron los siguientes: 1. Mediante el uso de las técnicas y métodos de ingeniería genética, unir los insertos génicos que codifican para el (SI)2 y 3CK24(SI)2 a los vectores adecuados de clonación (para amplificar sus cantidades) y expresión (para producir las proteínas recombinantes), mediante el uso de técnicas y métodos de la ingeniería genética. Esto se realizará en distintas cepas de E. coli. 2. Confirmar, mediante técnicas de biología molecular, la correcta secuencia de los plásmidos sintetizados. 3. Producir ambos polímeros a media escala una vez que se haya comprobado, mediante técnicas como la electroforesis, que a pequeña escala las bacterias son capaces de generar la proteína de manera eficiente. 4. Purificar los polímeros basados en serinas e isoleucinas mediante ITC, además de poner a punto de un nuevo protocolo de purificación alternativo con un polímero altamente estudiado en el grupo de investigación. 5. Caracterizar a través de distintas técnicas sus propiedades fisicoquímicas y su capacidad para la formación de nanoestructuras. Para ello, se emplearán técnicas tales como: SDSPAGE, MALDI-TOF, 1H-RMN, DLS o análisis de aminoácidos por HPLC. 11 4Materiales y métodos 4.1Materiales 4.1.1Reactivos químicos A continuación, se expone un listado de los productos químicos utilizados ordenados alfabéticamente (Tabla 1): 4.1.2Soluciones tamponadas Un tampón (o buffer) es una disolución que se encarga de mantener el pH entorno a un valor preciso, siendo imprescindible que, en algunos tipos de técnicas o tratamientos, no se presenten fluctuaciones del mismo. Las disoluciones tampón utilizadas son las siguientes (Tabla 2): Tampón Composición Loading Buffer Electroforesis de ADN 5x Glicerol 30%, SDS 0,1%, azul de bromofenol 0,05%, Tris 50 mM pH8, EDTA 0,5 mM Loading Buffer Electroforesis de Proteínas 5x Tris-base 25mM pH 8.3, Glicina 192mM, SDS 0,1% (p/v), -mercaptoetanol 1% Buffer de sonicación 1x Tris-base 20mM pH 8, EDTA 1 mM, PMSF 1mM Buffer Tris-acetato-EDTA (TAE) 1x EDTA 1 mM, Tris-acetato 40mM pH 8 Buffer de lavado celular 20x NaCl 2,00 M, Tris-base 0,200 M pH 7,5 Running Buffer 5x Glicina 0,959 M, Tris-base 0,124 M, SDS 17,3 mM Buffer fosfato salino (PBS) 1x NaH2PO4 5 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 Tabla 2. Disoluciones tampón. Los términos ‘’5x’’ o similares indican que se encuentra cinco veces más concentrado que su solución final, aplicando la dilución pertinente. Reactivo Casa comercial Reactivo Casa comercial Acetonitrilo 99% (MeCN) Fisher Glicerol 99% Thermofisher Ácido acético >99% (HAcO) Thermofisher Glicina Sigma-Aldrich Ácido clorhídrico 37% (HCl) Thermofisher Glucosa Merck Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Formedium Hidróxido sódico (NaOH) Thermofisher Acrilamida (Bisacrilamida) 40% VWR Isopropanol >99% (iPr-OH) Thermofisher Agarosa Seakem Lonza Kanamicina Formedium Ampicilina Formedium Marcador de ADN NZY Ladder III NZYTech Azul de bromofenol Alfa Aeser Marcador Unstained Protein Molecular Weight Marker Thermo Scientific -Mercaptoetanol 99% GIBCO Marcador NZYBlue Protein Marker NZYTech Cloruro de cobre (CuCl2) Acro Metanol >99% (MeOH) Thermofisher Cloruro de sodio (NaCl) Formedium Persulfato amónico (PSA) >98% Thermofisher Dodecilsulfato sódico (SDS) Formedium SimplySafeTM EURx Etanol >99% (EtOH) Panreac Tetrametiletilendiamina (TEMED) 99% Thermofisher Fluoruro de fenilsulfonilmetano 99% (PMSF) Apollo Scientific Tris (hidroximetil) aminometano (Tris base) Sigma-Aldrich Tabla 1. Resumen de los reactivos químicos utilizados. 12 4.1.3Materiales para biología molecular 4.1.3.1Cepas bacterianas Tanto para la clonación como para la expresión de los genes de interés, se utilizaron diferentes cepas de E. coli: • DH5 Competent Cells (Nzytech): bacterias usadas como sistema de subclonaje del plásmido pET7(SI)2 y el pET10NKKK(EI)2 obtenidos mediante ligación previa. Su eficacia de transformación, o nivel de competencia, es de ≥ 106 cfu/μg, donde cfu significa unidad formadora de colonias y hace referencia al rendimiento de las células en cuanto al proceso de transformación se refiere. A mayor eficacia de transformación, más bacterias internalizan el plásmido con la resistencia a antibiótico y, por lo tanto, más colonias crecen en el medio de cultivo con dicho antibiótico. • BLR(DE3) Competent Cells (Novagen): sistema de expresión para la producción de la proteína recombinante (SI)2 del plásmido anteriormente amplificado. Su nivel de competencia es de > 2 x 10⁶ cfu/μg. Se trata de células competentes preparadas para la introducción de ADN exógeno mediante choque térmico. • SHuffle® T7 Express Competent E. Coli (NEB): sistema de expresión utilizado para obtener el polipéptido tipo elastina 3CK24(SI)2 a partir del vector pET10NCCCK24(SI)2. Su nivel de competencia es de 107 cfu/µg. 4.1.3.2Medios de cultivo Tanto para el crecimiento bacteriano como la expresión de proteínas, las bacterias necesitan unos medios de cultivo específicos, en función del objetivo buscado, que difieren notablemente en su composición, diferenciándose: • Lysogeny Broth (caldo de lisogenia, LB) (Formedium): medio de cultivo en el que se favorece el crecimiento de las bacterias en lugar de la expresión proteica. Se compone de 10 g/L triptona, 10 g/L NaCl y 5 g/L extracto de levadura (25 g/L). • LB 2X (Formedium): similar al anterior, pero doblemente enriquecido en nutrientes para mejorar el cultivo: 20 g/L triptona, 20 g/L NaCl y 15 g/L extracto de levadura (55 g/L) • Modified Terrific Broth (mTB o TB modificado): utilizado para la producción de proteína debido a su contenido en lactosa, lo cual promueve la autoinducción, además de para la generación previa de biomasa. Se compone de 12 g/L triptona, 24 g/L extracto de levadura, 4 mL glicerol/L medio, 3,3 g/L (NH4)2 SO4, 6,8 g/L KH2PO4, 7,1 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L glucosa, 2,0 g/L lactosa, 0,15 g/L MgSO4 (55,85 g/L). • LB Autoinductor (Formedium): medio que, además del crecimiento, también promueve la inducción de la expresión proteica. Su composición es similar al LB normal, salvo que posee distintas sales fosfato, además de lactosa, presente también en el TB, que induce la expresión. Se compone de 10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 3,3 g/L (NH4)2 SO4, 6,8 g/L KH2PO4, 7,1 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L glucosa, 2,0 g/L lactosa, 0,15 g/L MgSO4 (34,85 g/L). 13 • LB-Agar (Formedium): medio en estado sólido con el cual se recubren las placas Petri para el cultivo bacteriano. Normalmente requiere ser suplementado con un antibiótico, en concentración 1 L/mL de medio. Se prepara con 25 g/L LB y 15 g/L agar. Para asegurar que no se produce ningún tipo de contaminación en su preparación, todos los medios se esterilizan en botellas de vidrio con autoclave a 121ºC durante 21 min. • Medio de caldo superóptimo con represión por catabolito (S.O.C. Medium) (Fisher): utilizado para obtener transformaciones de máximo rendimiento. Se compone de 2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosa. 4.1.3.3Enzimas de restricción y ligasa Las enzimas de restricción son nucleasas de tipo endonucleasa, es decir, cortan el ADN de doble cadena cuando identifican un patrón interno concreto de bases nitrogenadas, o lo que se conoce como secuencia de restricción. El objetivo de su utilización fue extraer el inserto del vector de clonación (realizado anteriormente por el grupo de investigación) y comprobar que se había producido correctamente la ligación entre el vector de expresión y dicho inserto, que se expondrán más adelante. A continuación, se exponen las enzimas de restricción utilizadas junto con la secuencia diana que reconocen (Tabla 3): Enzima de restricción Secuencia diana EcoRI XbaI NdeI Tabla 3. Enzimas de restricción utilizadas y sus correspondientes secuencias de restricción. Todas se emplearon siguiendo los protocolos y los buffers de la casa comercial (Thermofisher). En este caso era el tampón empleado fue el denominado GreenBuffer 5x, de la misma casa comercial. Como se aprecia en los cortes, todas estas enzimas generan extremos cohesivos. De encontrarse una única secuencia de restricción en un vector de clonación, se produciría su linealización y, en presencia de un inserto génico digerido con una enzima que genere extremos cohesivos complementarios, la unión de los mismos. Dicho proceso, conocido como reacción de ligación, requiere de la presencia de otra enzima, la T4 ADN Ligasa. La T4 ADN Ligasa (Thermofisher), que debe su nombre al bacteriófago T4, de donde fue obtenida inicialmente, es una enzima que se encarga de la unión de fragmentos lineales de ADN cuyos extremos sean compatibles, catalizando la formación del enlace fosfodiéster. La casa comercial también proporciona su correspondiente tampón, el T4 Buffer DNA Ligase 10x. 14 4.1.3.4Vectores plasmídicos Los vectores se clasifican en función de su uso. Pueden ser: de clonación, para generar muchas copias de un gen, o de expresión, si interesa producir la proteína que codifica. En este caso, el trabajo se basó en el uso de vectores de expresión, siendo estos el pET7, el pET10NCCC y el pET10NKKK. • pET7 (p7): vector de expresión de 5546 pb con secuencias que codifican resistencia al antibiótico Ampicilina y que fue obtenido a partir de la modificación del vector comercial pET-25b(+) (Novagen) por la Dra. Alessandra Girotti (Figura 11)11. Figura 11. Representación del vector pET7. • pET10NCCC (p10N3C): vector de expresión derivado del pET10 de 4520 pb con resistencia a Kanamicina, que añade tres cisteínas al extremo N-terminal de la secuencia del inserto añadida en la ligación (Figura 12). Figura 12. Esquema del pET10NCCC. 15 • pET10NKKK (p10N3K): vector de expresión derivado del pET10 de 4520 pb con resistencia a Kanamicina, que añade tres lisinas al extremo N-terminal de la secuencia del inserto añadida en la ligación (Figura 13). Figura 13. Esquema del pET10NKKK. 4.1.3.5Genes sintéticos y plásmidos base El trabajo realizado se inició a partir de los fragmentos génicos (SI)2, 3K(EI)2 y el plásmido de expresión p10N3CK24(SI)2, ya desarrollados por el Grupo de Biodispositivos Avanzados para Nanomedicina de la Universidad de Valladolid (UVa). • (SI)2: es un inserto génico que codifica para uno de nuestros polímeros tipo elastina de interés. Posee un tamaño de 3300 pb y conforma un tetrabloque (Figura 14) formado a partir del dibloque S50I60, es decir, 50 repeticiones de la secuencia que codifica para el pentapéptido (VPGSG), con serina como aminoácido huésped, y por tanto de naturaleza hidrofílica; y 60 repeticiones de la secuencia codificante del bloque peptídico (VGIPG), de naturaleza hidrofóbica al poseer isoleucina como aminoácido huésped. Este tetrabloque fue introducido en el vector de expresión pET7, formando el p7(SI)2, para posteriormente realizar un subclonaje y la producción de la proteína recombinante. Figura 14. Esquema del (SI)2, indicando los pentapéptidos formados por cada bloque. En naranja, hidrofóbicos y en azul, hidrofílicos12. • p10N3CK24(SI)2: vector de expresión diseñado para añadir tres cisteínas al N-terminal de la proteína expresada. Lleva incorporado el inserto de interés, K24(SI)2, que es similar al anterior salvo que incluye 24 repeticiones de la secuencia que conforma el pentapéptido (VPGKG), con lisinas, en su N-terminal y a continuación de las cisteínas. Tiene un tamaño de 3660 pb (Figura 15). 16 Figura 15. Esquema del 3CK24(SI)2, indicando la cola de cisteínas introducidas por el vector de expresión12. • 3K(EI)2: inserto de 3309 pb que codifica para un polímero compuesto por tres lisinas seguidas de un tetrabloque compuesto por un dibloque de [(VPGVG)2 (VPGEG) (VPGVG)2]10, cuyo aminoácido huésped es el glutámico, y de (VPIPG)60 análogo al anterior. El hecho de que haya cuatro pentapéptidos (VPGVG) flanqueando al del glutámico tiene como misión la reducción del carácter hidrofílico de ese bloque, facilitando, la purificación del mismo al disminuir su temperatura de transición. Este inserto fue ligado al vector de expresión p10N3K (Figura 16). Figura 16. Esquema del 3K(EI)2, indicando la cola de lisinas introducida por el vector de expresión. 4.1.3.6Kits de extracción y purificación de ADN Para identificar qué colonias de subclonaje han introducido el plásmido buscado, es necesario extraerlo del interior de las bacterias y purificarlo. Para ello, se utilizó el NucleoSpin® Plasmid/Plasmid (NoLid) Mini kit for plasmid DNA purification (Macherey-Nagel) para la obtención de pequeñas cantidades de ADN a partir de cultivos bacterianos de poco volumen (5-10 mL). 4.2Métodos 4.2.1Reacción de ligación La reacción de ligación consiste en la introducción de ADN exógeno, denominado inserto, a un vector. Ambos componentes deben tener extremos complementarios y, por lo tanto, requiere que reciban la digestión enzimática por parte de enzimas de restricción que generen dichos extremos compatibles (Figura 3 y Figura 17). Figura 17. Reacción de ligación, donde se ve que el inserto (en verde) es compatible con los extremos generados2. 17 Para ello, se utiliza la T4 ADN Ligasa, que actúa junto a su T4 Buffer DNA Ligase 10x suministrado por la misma casa comercial. El procedimiento consiste en mezclar los componentes de la reacción junto con el buffer y la enzima y dejar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora o a 4ºC durante tres días. El ADN recombinante (rADN) resultante de la ligación debe ser conservado a -20ºC. 4.2.2Preparación de placas de cultivo bacteriano La preparación de placas de Petri para el cultivo de colonias requiere realizar la mezcla LB-Agar anteriormente mencionada (apartado 4.1.3.2), disolviéndola y esterilizándola a 121ºC durante 21 min. Después, se vierte en campana estéril sobre las placas de Petri una cantidad aproximada a 30 mL y se dejan solidificar. En el caso de que se requiera la suplementación con un antibiótico adecuado, este debe ser diluido en el medio de forma que su concentración final sea 1 L Antibiótico/mL de LB-Agar. 4.2.3Transformación en cepas bacterianas Para seguir con el proceso de clonaje, necesitamos introducir el rADN en la célula anfitriona, la cual se va a encargar de generar múltiples copias del plásmido introducido y que lleva nuestro gen de interés. Este proceso de incorporación de ADN exógeno por parte de la bacteria se denomina transformación. Aunque se han utilizado diferentes cepas bacterianas, todas previamente almacenadas a -80ºC, el proceso de transformación posee un punto común en todas ellas, el método de introducción de ADN, ya que las células utilizadas han recibido numerosos tratamientos fisicoquímicos para inducirlas el estado de competencia. Este estado, que es natural en muchos tipos de bacterias, se alcanza cuando, al estar el medio que las rodeas en unas condiciones determinadas, son capaces de abrir poros en su membrana y captar ADN externo. En la práctica, se consigue dejándolas incubar en hielo un tiempo determinado (depende de la cepa) y posteriormente realizar un choque térmico a 42ºC durante unos pocos segundos de manera exacta, tal y como indica el protocolo de la casa comercial. Durante ese choque térmico es cuando captan el rADN. 4.2.3.1Transformación en DH5α Competent Cells Células utilizadas para clonaje de rADN. Se saca una alícuota de bacterias y se coloca en hielo para que descongele lentamente. En un tubo de 14 mL, se pipetean 50 L de las células, sobre los cuales se añaden 5 L del rADN que se quiere incorporar y se deja incubando en hielo durante 30 min. Pasado ese tiempo se realiza un choque térmico de 30 s a 42ºC y se colocan de nuevo en el hielo durante 2 min para que vuelvan a cerrar sus poros. En ese momento se añaden 450 L S.O.C. Medium y se incuban durante 1 h a 37ºC y 250 rpm en un incubador con agitación. El tubo deber permitir la renovación del flujo de aire de su interior. De la transformación obtenida se siembran 60 L y 120 L en dos placas de Petri, preparadas y atemperadas anteriormente, que contengan el antibiótico adecuado, y se dejan crecer durante 16 h a 37ºC en una estufa. 18 4.2.3.2Transformación en BLR (DE3) Competent Cells Una vez se consigue la clonación del plásmido deseado, este se transfiere a una cepa que favorezca la expresión de la proteína recombinante. El protocolo a seguir es parecido al anterior, salvo que se utilizan 20 L de bacterias, 1 L de rADN, 80 L S.O.C. Medium y la incubación en hielo dura 5 min. De la transformación resultante se siembran 20 L, junto con una cama de 50 L de S.O.C. Medium para favorecer su extensión por la placa, y 40 L en dos placas diferentes que se incuban durante 16 h a 37ºC. 4.2.3.3Transformación en SHuffle® T7 Express Competent E. coli Cepa de expresión con un protocolo de transformación análogo al de DH5 (apartado 4.2.3.1), salvo que la cantidad de S.O.C. Medium utilizada es de 950 L. De la transformación, se siembran dos placas con antibiótico, una con 75 L y otra dividida en dos mitades: una con 20 L y la otra con una dilución 1:10 de S.O.C. Medium de otros 20 L. 4.2.4Purificación de ADN plasmídico de E. coli. Para comprobar que el vector y el inserto se han unido correctamente, es necesario extraer y purificar el material genético de la bacteria para su posterior uso en la síntesis del ELP. Para ello se siguió el protocolo de purificación anteriormente mencionado (apartado 4.1.3.6). Hay dos protocolos a seguir con el NucleoSpin® Plasmid/Plasmid (NoLid) Mini kit for plasmid DNA purification: uno para vectores de expresión, denominados “low-copy”, y otro para vectores de clonación, también conocidos como “high-copy” (Figura 18). La diferencia entre ambos radica en la cantidad de biomasa producida, siendo mayor la de los vectores high-copy que los low-copy, necesitando mayor cantidad de volumen de cultivo en el segundo caso para alcanzar la cantidad óptima de biomasa, siendo de 5 mL de LB + 5 L del antibiótico correspondiente para el high-copy (puesto que el plásmido está diseñado para obtener un alto número de copias) y de 10 mL de LB + 10 L del antibiótico para el low-copy (diseñado para plásmidos de expresión, cuya replicación es menor). Al emplearse diferentes volúmenes de cultivo también se modifican las cantidades de reactivo posteriormente utilizadas. En este caso, como se trabajaron vectores de expresión, se siguió el protocolo low-copy. Figura 18. Resumen del protocolo de extracción y purificación de ADN plasmídico13. El cultivo se centrifuga para separar el medio de cultivo del pellet bacteriano, descartando el sobrenadante. A continuación, se añade el tampón de resuspensión, que posee RNasa para eliminar las posibles moléculas de ARN que puedan contaminar el ADN plasmídico. Se centrifuga, 25 glucosa 20% hasta el 1% y 100 L de los preinóculos, dejándolo crecer hasta que alcanza un valor de OD600 de 0,7-0,9, momento en el que el crecimiento de la bacteria es exponencial y está listo para ser almacenado. En un criovial se añaden 800 L de dicho cultivo y 200 L de glicerol estéril (autoclavado) al 80%, se agita por inversión hasta alcanzar la homogeneidad y se guarda a -80ºC. Al día siguiente, a las 8:00 h, se coge 1 mL en dos tubos de 1,5 mL de uno de los Erlenmeyer y uno de ellos se centrifuga, pues servirá como blanco para el otro. Se realiza lo mismo con el control preparado y las muestras del inóculo cogidas del día anterior. Los blancos y las muestras se diluyen 1:10 (o lo necesario para que entre en el rango lineal de la Ley de Lambert-Beer) en las cubetas del espectrofotómetro y se mide su OD600. La cantidad de biomasa da una idea de la producción obtenida. A las 8:30 h, se mide de nuevo la absorbancia del mismo Erlenmeyer. Si el valor obtenido es mayor al anterior, se deja al cultivo crecer media hora más y se repite el procedimiento; por el contrario, si es igual o menor, se asume que las bacterias ya han abandonado la fase exponencial (Figura 22) y se detiene la producción. Figura 22. Curva de crecimiento bacteriano. Es de vital importancia no dejar que entren en la fase de apoptosis, lo cual implicaría la pérdida de la proteína deseada16. Las muestras cogidas se preparan como se detalla en el apartado 4.2.8 y se observa por SDS-PAGE el rendimiento de la producción, teniendo en cuenta que, en función del valor de OD600 se resuspende en un volumen de agua ultrapura Milli-Q (Milli-Q) diferente (Tabla 6), para normalizar la cantidad de proteína que se cargará en la electroforesis: OD600 Resuspender en: 0,1-0,5 20 mL agua Milli-Q 0,5-2 50 mL agua Milli-Q >2 100 mL agua Milli-Q >5 200 mL agua Milli-Q Tabla 6. Correspondencia de agua de resuspensión y absorbancia. El contenido de los Erlenmeyer se centrifuga durante 15 min a 5000 x g y 4ºC, desechando el sobrenadante (junto con lejía) y repitiendo el proceso hasta recoger todo el pellet celular con la proteína de interés. Una vez obtenido, se procede al lavado de las células con el buffer de Lavado 1x, resuspendiendo el pellet en una pequeña cantidad del mismo mediante agitación vigorosa hasta la resuspensión total. El pellet resuspendido se centrifuga durante 15 min a 5000 x g y 4ºC. 26 Este último paso se repite hasta que el sobrenadante salga incoloro, conservando el pellet con el polímero deseado. 4.2.10Extracción y purificación proteica Con el objetivo de sacar la proteína del interior de la bacteria y comenzar a purificarla, se siguieron dos métodos de lisis celular en función del protocolo de purificación empleado: sonicación seguido de ciclos de transición inversa (ITC) o extracción con disolvente orgánico con posterior precipitación del polímero en acetonitrilo. 4.2.10.1Sonicación celular e ITC El pellet celular, que posee la proteína en su interior, se resuspende en buffer de sonicación 1x según la siguiente relación (Ecuación 5): V(mL)= 5 ∙ OD600,última muestra ∙ Vcultivo(L) Ecuación 5 Además, se añade PMSF 1 M hasta una concentración final de 0,001M, el cual es un inhibidor de proteasas que evita la degradación proteica. Finalmente, se realiza la sonicación, que consiste en romper la pared celular bacteriana y la membrana plasmática mediante el uso de ultrasonidos a 4ºC, empleando una energía máxima de 25000 J. El equipo Hielscher UP400St con termostato Lauda Alpha RA 12 fue cedido por Dra. F. Ronda del grupo de investigación PROCEREAL de la UVa. Una vez rotas las células, el resto celular o debris se separa realizando una centrifugación a 4ºC y 10000 x g durante 1 h 30 min. La naturaleza a esta temperatura de los polímeros tipo elastina es la de permanecer en la disolución y no en el precipitado, tal y como se explicó en el apartado 2.4.1. Tras comprobar por SDS-PAGE que el polímero reside en el sobrenadante, se comienza la purificación mediante ITC. Debido a que los polímeros tipo elastina poseen la propiedad de disolverse en frío y precipitar en caliente gracias a su temperatura de transición, al sobrenadante que surge de los ultrasonidos se le somete a un ciclo caliente para provocar su precipitación. Esto suele ir acompañado de un salado de la fase acuosa con NaCl ya que los iones de dicha sal secuestran las moléculas de agua al crear su propia esfera de hidratación facilitando la precipitación del polímero. Después de provocar la precipitación en caliente y su separación del sobrenadante por centrifugación, el pellet obtenido se resuspende en agua Milli-Q durante toda la noche a 4ºC para volver a disolver el polímero de interés. La disolución obtenida se centrifuga, esta vez conservando el sobrenadante donde se encuentra la proteína. En cada centrífuga ha de analizarse tanto el precipitado como el sobrenadante por SDS-PAGE, para comprobar si se ha perdido parte del polímero en alguna fase no deseada y conocer la pureza del mismo. Si se encuentra contaminado con otras proteínas, será necesario aplicar otro ciclo de ITC; de lo contrario, se podrá conservar el último sobrenadante frío, portador del ELP de interés. Este método es útil puesto que sólo los polipéptidos tipo elastina poseen este comportamiento reversible con la 27 temperatura, permitiendo así la purificación selectiva de estos polímeros frente al resto de proteínas endógenas bacterianas. Finalmente, tras conseguir un sobrenadante frío puro, el polímero se somete a diálisis donde se eliminan las sales añadidas hasta que su concentración sea despreciable (del orden de 10-8 M) y, una vez finalizada, se congela la muestra dializada a -20ºC durante unas horas. Para concluir, se elimina el agua del disolvente empleando bajas presiones por liofilización. El liofilizador LyoQuest55 Plus fue cedido por el Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) de la UVa. Finalizada la liofilización, el polímero totalmente seco está listo para ser caracterizado. 4.2.10.2Extracción orgánica y precipitación en acetonitrilo Una alternativa a la sonicación mucho más rápida que el ITC clásico, puesto que este requiere normalmente tres o más ciclos para la purificación completa del polímero, es la extracción con disolventes orgánicos y la posterior precipitación de la proteína en acetonitrilo17. Al resuspender el pellet celular en 4 mL de disolvente orgánico/g de pellet se consigue la ruptura de las bacterias, separándose por centrifugación el debris del sobrenadante orgánico, que posee disuelto el polímero. Posteriormente, se añade acetonitrilo puro hasta una concentración final del 70% (v/v), pudiendo observarse cómo el polímero precipita debido al cambio de polaridad producido por ambos disolventes orgánicos. Por centrifugación se eliminan los disolventes orgánicos y se dejan evaporar los restos de la mezcla orgánica en campana. Después se resuspende el pellet (la proteína de interés) a 4ºC durante toda la noche en buffer de sonicación debido a que no posee una concentración salina alta (como el PBS 1x) que complicaría la diálisis posterior. Se separa el sobrenadante del precipitado por centrifugación, sometiendo al sobrenadante frío a un único ciclo de ITC con el fin de eliminar las impurezas de bajo peso molecular que queden. Para ello, se añade al polímero disuelto una disolución saturada de (NH4)2SO4 hasta una concentración final del 20% (v/v) junto al calentamiento correspondiente, provocando su precipitación. A continuación, se centrifuga para separar el sobrenadante y el pellet, resuspendiendo este último en buffer de sonicación a 4ºC al contener la proteína de interés. Tras disolver el ELP, se realiza una última centrifugación para separar el sobrenadante frío del precipitado y, tras analizar dicho sobrenadante por SDS-PAGE y comprobar la pureza del polímero, se dializa y liofiliza de acuerdo a lo descrito en el apartado 4.2.10.1. 4.2.11Caracterización de polipéptidos tipo elastina Una vez se ha extraído el polímero puro, se procede a su caracterización mediante distintas técnicas que nos permitan confirmar la correcta obtención del mismo: 4.2.11.1Espectrometría de masas MALDI-TOF La espectrometría de masas es una de las técnicas analíticas más completas actualmente, pues es capaz de analizar muestras complejas, es sensible, específica (detecta analitos en concreto) y universal (sirve para cualquier tipo de muestra), además de poder realizar análisis tanto 28 cuantitativos como cualitativos y proporcionar información estructural de las moléculas analizadas, así como información sobre sus características fisicoquímicas, energías de enlace, etc. El esquema general de cualquier espectrómetro de masas consta de un dispositivo que permite la introducción de la muestra a presiones inferiores a 10-6 mbar, para posteriormente vaporizarla (si no es gaseosa) y e ionizarla en la fuente de iones, fragmentándola. Estos iones pasan al analizador, donde su trayectoria se verá desviada por campos eléctricos o magnéticos, sufriendo una desviación mayor o menor en función de su masa para una misma fuerza aplicada. El registro de los iones en el detector genera el espectro de masas, que posee forma de un gráfico de barras donde se representa la intensidad relativa de cada ion frente a su relación masa/carga (m/z). Como generalmente z = +1, el valor de m/z nos da la masa molecular. Hay dos tipos de fuentes de iones: duras, que generan una mayor fragmentación al aplicar mayor energía y por lo tanto se registran un mayor número de señales; y blandas, que aplican menos energía y por lo tanto dan un menor número de señales, aunque se pueden observar algunas como la correspondiente al ion fragmento inicial (m/z = 1), pico que con las fuentes duras podría perderse. El espectrómetro de masas ideal para moléculas de gran peso molecular es aquél que utiliza el método de ionización con fuente blanda conocido como Desorción/Ionización por Láser Asistida por Matriz (MALDI), acoplado a un analizador de tiempo de vuelo (TOF) debido al gran rango de masas moleculares que es capaz de procesar (200-300 kDa). Para realizar la medida se mezcla una disolución acuosa/alcohólica de la muestra con un exceso de sustancia matriz que absorbe la radiación, siendo esta disolución evaporada en la sonda metálica de introducción de la muestra. A continuación, la muestra se expone ante un haz de láser pulsante que la sublima y la ioniza, permitiendo la aparición de señales de carga múltiple debido al tipo de fuente empleada. En el TOF los iones son acelerados hasta alcanzar la misma energía cinética y después son liberados en un tubo donde no hay ningún tipo de campo. La velocidad con la que llegan los iones al detector será inversamente proporcional a su masa, llegando antes, por lo tanto, los más ligeros18. Para el análisis de polímeros, se pesa 1 mg de los mismos y el espectro lo realiza un técnico del LTI con un equipo Bruker Autoflex. 4.2.11.2Resonancia Magnética Nuclear de protón (1H-RMN) La resonancia magnética nuclear es una técnica espectroscópica capaz de dar, entre otras, información estructural de la molécula estudiada. Se basa en la interacción de algunos núcleos atómicos con radiaciones del orden de la radiofrecuencia. Cuando un protón es alcanzado con la energía adecuada, sus estados nucleares, que inicialmente eran degenerados, se desdoblan en dos niveles de energía, habiendo un ligero exceso en el de más bajo valor energético, de acuerdo a la ley de distribución de Boltzmann (Ecuación 6): Nj Ni = e−∆E/kT Ecuación 6 donde Nj/Ni representa la relación entre los niveles, k es la constante de Boltzmann, T la temperatura del medio y E la diferencia energética entre los mismos. Los núcleos sufrirán 29 transiciones entre ambos niveles de energía, bien excitándose o bien relajándose, produciendo un fenómeno que se conoce como resonancia. Este proceso permite la identificación estructural de la molécula, pues no todos sus núcleos de poseen las mismas frecuencias de resonancia, viéndose estas alteradas por el entorno atómico. De esta manera se pueden identificar los distintos protones que poseen los polímeros para completar su correcta caracterización19. Para analizar los polímeros, se prepara una disolución de cada uno de 16-20 mg/mL en un volumen mínimo de 600 L de DMSO deuterado. Posteriormente, se obtiene el espectro de 1HRMN empleando un equipo RMN 400 Agilent Technologies del LTI. 4.2.11.3Análisis de aminoácidos por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) es una técnica analítica de separación altamente empleada por su elevada sensibilidad, capacidad de automatización y cuantificación exacta, entre otras características. La fase móvil es un líquido que atraviesa una fase estacionaria que, generalmente, está inmovilizada en una columna cromatográfica. En función de la misma y de cómo ocurra la separación, las cromatografías se clasifican en varios tipos: de reparto, de adsorción, iónica, de exclusión por tamaños, de afinidad y quiral. Los componentes que presenten fuertes interacciones con la fase estacionaria avanzarán más lentamente junto con el flujo de la fase móvil, mientras que los que posean uniones débiles con la misma lo harán más deprisa. Esto provoca la separación de los compuestos de una mezcla en bandas o zonas a lo largo de la columna, permitiendo su posterior recuperación en fracciones separadas20. El análisis de los aminoácidos de los polímeros fue realizado por el personal del LTI con un equipo HPLC Agilent Technologies 1200 series. Para ello, se les entregaron 5 mg de los polímeros pertinentes. 4.2.11.4Dispersión dinámica de la luz (DLS) La dispersión dinámica de la luz (DLS) es una técnica espectroscópica efectiva para medir el tamaño de las partículas que hay presentes en una disolución, yendo desde pocos nanómetros hasta 5 m aproximadamente. Consiste en realizar mediciones del ensanchamiento Doppler de la luz dispersada Rayleigh debido al movimiento de difusión traslacional de las partículas (movimiento browniano) cuando la disolución es iluminada con un haz láser monocromático. El movimiento térmico causa fluctuaciones temporales en la intensidad de la dispersión y ensancha la línea Rayleigh. La dependencia de dichas fluctuaciones con el tiempo se utiliza para obtener información sobre el tamaño de las partículas presentes en el medio (Figura 23). 30 Figura 23. Esquema del equipo necesario para el DLS. La gráfica representa la variación de la intensidad de dispersión respecto al tiempo, necesaria para el cálculo del tamaño de las partículas21,22. Por lo tanto, el diámetro hidrodinámico (DH) de las nanopartículas formadas por el polímero debido a su autoensamblaje, alcanzada su temperatura de transición, se puede determinar mediante el uso de esta técnica, empleando la ecuación de Stokes-Einstein (Ecuación 7), a través del coeficiente de difusión traslacional (D): DH=kT 3πηD Ecuación 7 donde k es la constante de Boltzmann, T la temperatura del medio y  su viscosidad. A través del índice de polidispersidad (PDI), que señala el grado de variación del tamaño de las nanopartículas presentes en una muestra, podemos conocer la homogeneidad de la misma19. El DLS también permite la medición del potencial zeta (ZP) de las nanopartículas, es decir, su carga neta superficial en el plano que separa el fluido en movimiento del medio del que se encuentra adherido a la nanopartícula. El equipo utilizado fue un Zetasizer Nano ZSP (Malvern) del Centro CARTIF del Parque Tecnológico de Boecillo. 4.2.11.5Calorimetría diferencial de barrido (DSC) Los métodos térmicos pertenecen al conjunto de técnicas en las que se mide una propiedad física de una sustancia y/o de sus productos de reacción frente a la temperatura, mientras se somete a un programa de temperatura controlado. El más usado por su rapidez, sencillez y disponibilidad es la calorimetría diferencial de barrido (DSC), donde se mide la diferencia de calor entre la muestra y una sustancia de referencia frente a la temperatura, obteniéndose resultados de gran precisión y reproducibilidad. Como permite medir las variaciones de energía, es el método pertinente para el cálculo de la temperatura de transición de los polipéptidos tipo elastina. El equipo utilizado, cedido por el grupo PROCEREAL de la UVa, fue el DSC 3 STAR® System (Mettler Toledo)23. 31 5Resultados y discusión 5.1Síntesis del polímero (SI)2 5.1.1Ligación del inserto (SI)2 con el plásmido pET7 y amplificación del p7(SI)2 El primer paso para la obtención del polímero es la construcción del plásmido recombinante que se utilizará para la bioproducción del mismo. Con este fin, primero ha de unirse el vector de expresión pET7 (linealizado previamente por el grupo con una enzima de digestión), de 5546 pb, junto con el inserto (SI)2, de 3300pb (también sintetizado y linealizado en el Grupo de Biodispositivos Avanzados para Nanomedicina de la UVa) mediante una reacción de ligación (Figura 24). Para ello, se sigue el protocolo establecido por la casa comercial, en el cual se utilizan las cantidades adecuadas de los fragmentos génicos junto con la T4 ADN Ligasa y su tampón correspondiente, también aportado por la misma casa comercial. Figura 24. Esquema de la reacción de ligación para la obtención del p7(SI)2. La mezcla de la reacción permaneció a temperatura ambiente durante 1 h y, posteriormente, se realizó la transformación en células competentes DH5, con la intención de obtener transformantes del plásmido ligado y una mayor cantidad de este (como se indica en el apartado 4.2.3.1). De las colonias crecidas, se seleccionan y pican las de mejor morfología para cultivarlas en medio líquido que permita la posterior purificación del plásmido obtenido mediante el NucleoSpin® Plasmid/Plasmid (NoLid) Mini kit for plasmid DNA purification, siguiendo el protocolo específico para plásmidos “low-copy” ya que se trata de un vector de expresión (apartado 4.2.4). 5.1.2Digestión analítica del p7(SI)2 Una vez se aíslan los correspondientes plásmidos se analiza la concentración y pureza de cada uno de ellos mediante el espectrofotómetro Nanodrop y se procede a comprobar que la inserción del inserto ha tenido lugar con éxito mediante una digestión analítica de DNA (apartado 4.2.5) y la posterior identificación de los fragmentos resultantes tras ser visualizados por una electroforesis en gel de agarosa (apartado 4.2.6). Para ello se realizan dos ensayos (Figura 25): en primer lugar, se procede a la digestión del DNA con NdeI, enzima que cortaría al plásmido solo una vez y nos proporcionaría un plásmido linealizado cuyo tamaño sería de 8846 pb. Por otro lado, se realiza una codigestión con las enzimas EcoRI y XbaI, puesto que una de ellas permitiría linealizar el plásmido, y la otra separaría 32 al inserto junto con 69 pb extra. Por lo tanto, se esperaría ver un fragmento de 5547 pb correspondiente al p7 menos las bases anteriormente mencionadas, y otro de 3369 pb, del inserto (SI)2 con dichas bases. Figura 25. El gel A muestra el mapeo de restricción con NdeI, mientras que el B la codigestión mencionada. El marcador utilizado es el NZYLadder III, identificado como “MK”. Los números hacen referencia a las colonias seleccionadas y “p7” indica el plásmido de partida digerido con las respectivas enzimas a modo de control. Se puede apreciar que, en el gel A, aparece un fragmento entre 10000 y 7500 pb que podría adjudicarse al producto de la ligación en las colonias 3 y 4, en comparación con el control p7, que es el plásmido linealizado y sin inserto. Por su lado, el gel B nos muestra varios fragmentos: uno asimilable al tamaño del p7 menos 69 pb (5547 pb) y otro al inserto más esas 69 pb (3369 pb). Por lo tanto, se confirma que la ligación ha ocurrido con éxito en la colonia 3 y la colonia 4, mientras que en el resto ha ocurrido un autoensamblaje del plásmido original a causa de la compatibilidad de los extremos generados. A continuación, se exponen las concentraciones obtenidas de cada plásmido y su nivel de pureza (Tabla 7): Muestra Conc. (ng/L) A260/A230 A260/A280 Col 3, 1º el. 202,4 2,03 1,88 Col 3, 2º el. 40,7 1,95 1,93 Col 4, 1º el. 190,9 2,01 1,88 Col 4, 2º el. 48,0 2,13 1,94 Tabla 7. Concentración y nivel de pureza de cada elución. Comparando con el baremo de la Tabla 4, todos ellos alcanzan una pureza óptima y aceptable. Estos resultados concuerdan con la secuencia teorizada de los plásmidos de interés (apartado 4.2.7), la cual se confirmó posteriormente con una secuenciación de nucleótidos. Así, una vez obtenidos los plásmidos deseados se comenzó con la síntesis del polímero. 5.1.3Bioproducción del (SI)2 Una vez se obtiene el plásmido p7(SI)2 con un grado de pureza óptimo, se procede a su transformación en la cepa competente de expresión bacteriana BLR(DE3) (apartado 4.2.3.2) para 33 comenzar a preparar la producción del polímero. Se pican un total de ocho colonias de las transformantes, sembrándolas en medio de expresión TB. A continuación, se decide cuál de ellas es la más productora realizando una electroforesis de proteínas tal y como se indica en el apartado 4.2.8, realizando el primer screening. Para ello se analizan las bandas correspondientes a las proteínas producidas por las bacterias de cada colonia, buscando que aparezca la correspondiente al peso molecular del polímero interés y evaluando su anchura e intensidad, parámetros indicativos de la cantidad de proteína que ha sido producida. Elegida la colonia más productora del primer screening (Figura 26), es decir, la que presenta la banda de ELP más ancha e intensa, se siembra en una nueva placa dicha colonia por agotamiento y se analiza el segundo screening. De este segundo screening se seleccionó de nuevo la colonia más productora, y fue con esta con la que se realizó el inóculo de la producción. A través de la traducción de la hebra codificante del p7(SI)2 se dedujo la secuencia de aminoácidos del polímero, lo que nos permitió obtener que el peso molecular teórico del (SI)2 es de 90,5 kDa. Una vez fue conocida su masa molecular y, por lo tanto, la banda a estudiar, se empleó un gel para la electroforesis del 10% de acrilamida para proceder a su análisis. Figura 26. Primer screening del (SI)2. El marcador utilizado es el NZYBlue Protein Marker. En la Figura 26 se aprecian bandas más intensas y de mayor grosor que las proteínas endógenas de la bacteria, con una movilidad electroforética alrededor de 90 kDa, correspondiente al polímero de interés. Las colonias 3 y 4 se eligen como las más productoras, en base a sus anchuras e intensidades, y se siembran en dos nuevas placas de Petri. Puesto que la que mejor creció fue la colonia 4 finalmente fue esta la seleccionada para realizar el segundo screening (Figura 27). 34 Figura 27. Segundo screening del (SI)2. En el segundo screening, las colonias 4 y 5 fueron elegidas como más productoras (mucho más que las del primer screening, tal y como se deduce de sus intensidades), y con ellas se preparó la producción según lo explicado en el apartado 4.2.9. Así, para la producción se prepararon 5 L de medio de cultivo en 10 Erlenmeyer de 2 L, llenándolos hasta 1/4 de su capacidad (500 mL) para favorecer la aireación. El medio de cultivo elegido se compuso de 1/3 de medio LB y 2/3 de medio TB, y se emplearon tanto Erlenmeyers de vidrio, con y sin deflectores (que favorecen aún más el aporte de oxígeno) y de plástico con deflectores. La primera medida de la OD600 de la producción fue realizada tras 16 h de crecimiento, y la siguiente tras 16 h y 30 min, momento en el cual se detectó que la OD600 no variaba (Tabla 8) y por lo tanto el crecimiento bacteriano había llegado a fase estacionaria. Muestra OD600 (1:10) OD600 Control inóculo 0,525 5,250 Inóculo 0,455 4,550 Medida 8:30 h 0,367 3,670 Medida 9:00 h 0,365 3,650 Tabla 8. Absorbancias de la producción del (SI)2. La electroforesis realizada de los Erlenmeyer a las 16 h y 30 min en función del material (vidrio o plástico) y las características de los Erlenmeyer (con o sin deflectores), así como del control del inóculo y el inóculo es la siguiente (Figura 28): 41 Disolvente Temperatura Diámetro (nm) PDI ZP (mV) PBS 1x 4ºC 41,10 1,000 - 37ºC 58,62 0,125 - Agua Milli-Q 4ºC 29,38 0,669 - 37ºC 202,00 0,190 - NaCl 10 mM 4ºC - - -1,74 37ºC - - -2,39 Tabla 12. Resultados de la formación de nanopartículas del (SI)2. Como se aprecia en los datos de la Tabla 12, el diámetro de las agregaciones formadas fue mayor a 4ºC en PBS respecto del agua Milli-Q, lo cual se debe a la solvatación del polímero en PBS por la presencia de sales. De la misma manera, el polímero sufrió una contracción a 37ºC en PBS. respecto del agua Milli-Q, posiblemente porque la concentración salina reduce la Tt del mismo y, por lo tanto, facilita la formación de la nanopartícula. Valores de PDI < 0,2 se consideran óptimos para concluir que la población medida es homogénea, por lo que en PBS y en agua Milli-Q a 4ºC se puede decir que existe una gran variación en el tamaño de los agregados que forma el polímero en la disolución. Esto concuerda con el hecho de que el polímero a 4ºC se encuentra disuelto en el medio y totalmente extendido, obteniéndose valores de 29,28 – 41,10 nm, pero con un PDI de 1,00. Sin embargo, en condiciones fisiológicas se obtiene una población homogénea de nanopartículas de 58,62 nm, lo cual cuadra con que el ELP a temperaturas superiores a su Tt se encuentra en su forma insoluble y prácticamente organizado. Es decir, el polímero en condiciones fisiológicas se halla transicionado. Los resultados en agua Milli-Q, sin embargo, muestran la formación de agregados más grandes, en comparación con el PBS, por encima de la Tt. Probablemente, esto se deba a la ausencia de sales del medio. El valor del ZP indica cierta carga superficial negativa de las nanopartículas formadas, pudiéndose considerar prácticamente neutras. Esto se podría deber al carboxilo terminal que presentan las moléculas de polímero y, en gran medida, al glutámico de la secuencia de control de expresión de los ELPs: MESLLP. Estos resultados son muy prometedores ya que el bloque de serinas, por no ser excesivamente hidrofílico, podría haber dificultado la formación de estas nanopartículas. 5.1.5.5Determinación de la temperatura de transición mediante DSC Mediante la DSC se determinó de Tt del polímero en PBS, imitando así las condiciones fisiológicas. Las muestras se prepararon a una concentración de 50 mg/mL, y se analizaron con un protocolo de temperatura que incluía una isoterma de 5ºC durante 10 min previa a una rampa de temperatura que iba de 5ºC a 70ºC a una velocidad de 5ºC/min (Anexo, apartado 8.5). De esta manera se obtuvo una Tt de 14,84ºC para el (SI)2. Esta característica hace a este ELP idóneo para la encapsulación de fármacos ya que asegura que el polímero se encontrará transicionado en condiciones fisiológicas. 42 5.1.5.6Determinación de la composición aminoacídica mediante HPLC Para confirmar la correcta composición del polímero, se llevó a cabo el análisis de sus aminoácidos mediante HPLC (Tabla 13). Aminoácido Valor teórico Valor experimental M 1 0,75 E 1 0,50 S 101 115,31 L 2 1,49 V 220 207,48 P 221 223,90 G 440 445,43 I 120 115,43 Total 1106 1110,30 Tabla 13. Análisis de aminoácidos del (SI)2. Tal y como se observa en los valores experimentales para cada aminoácido, expuestos en la Tabla 13, no hay diferencias significativas entre los valores teóricos y los encontrados experimentalmente, luego se corrobora que la composición del polímero es la esperada. 5.2Síntesis del polímero 3CK24(SI)2 5.2.1Bioproducción del 3CK24(SI)2 Partiendo del vector de expresión p10NCCC ligado al inserto K24(SI)2 se realizó la transformación del mismo en la cepa de expresión de E. coli “SHuffle® T7 Express Competent E. coli” (apartado 4.2.3.3) para preparar la producción del polímero. Se realizó el primer y segundo screening (Figura 34) con el objetivo de determinar las colonias más productoras, picándose un total de ocho colonias en cada uno y sembrándolas en medio TB. Debido al nuevo bloque de lisinas y la adición de 3 cisteínas en el extremo N-terminal, el peso molecular teórico del polímero, obtenido de manera análoga al (SI)2, es de 101,4 kDa, recurriéndose a geles del 10% de acrilamida para realizar las SDS-PAGE. Figura 34. La electroforesis A muestra el primer screening, mientras que el gel B el segundo screening, donde los números hacen referencias a las colonias picadas de cada uno. El marcador (MK) utilizado es el NZYBlue Protein Marker ‘’V’’ indica calle vacía, es decir, sin muestra. Se indican los pesos moleculares de las bandas correspondientes al polímero de interés y las del marker que lo flanquean. 43 Atendiendo a la anchura e intensidad de la banda de la proteína de interés, en el primer screening (Figura 34, gel A) se eligió la colonia 4 como la más productora, la cual se siembra por agotamiento. Analizando las colonias hijas en el segundo screening (Figura 34, gel B), se eligió la colonia 8 como la más productora de acuerdo a los criterios anteriores, siendo la candidata para preparar el inóculo de la producción del 3CK24(SI)2. De esta manera, se prepararon 4,6 L de medio de cultivo en 8 Erlenmeyer de 2 L. La primera medida de la OD600 se realizó a las 16 h de crecimiento, y la segunda a las 16 h y 30 min, momento en el que se determinó que se había alcanzado la fase estacionaria del crecimiento bacteriano (Tabla 14). Con el objetivo de evaluar las condiciones óptimas de generación de biomasa y producción y estudiar la relación de Vcultivo:Vrecipiente que permita la perfecta aireación para este fin, se midieron las OD600 de los Erlenmeyer utilizados (Tabla 15) atendiendo a las propiedades físicas de los mismos y la composición y cantidad de los medios de cultivo, contando con una pareja de Erlenmeyer de cada tipo, que son los siguientes: 500 mL de TB sin deflectores, 400 mL de TB con deflectores, 400 mL de TB sin deflectores, 500 mL de LB de autoinducción con deflectores y 500 mL con 1/3 de LB 2X y 2/3 de TB (LB + TB) con deflectores. Muestra OD600 (1:10) OD600 Control inóculo 0,674 6,740 Inóculo 0,200 2,000 Medida 8:05 h 0,466 4,660 Medida 8:35 h 0,435 4,350 Tabla 14. Medidas de las densidades ópticas realizadas indicativas de la entrada del crecimiento bacteriano en fase estacionaria. Muestra OD600,1 (1:10) OD600,2 (1:10) OD600, media (1:10) OD600, final TB 400 mL SD 0,435 0,395 0,4150 4,150 TB 400 mL CD 0,375 0,376 0,3755 3,755 TB 500 mL SD 0,288 0,350 0,3190 3,190 LB Indc. 500 mL CD 0,215 0,220 0,2175 2,175 LB + TB 500 mL CD 0,425 0,312 0,3685 3,685 Tabla 15. Absorbancias medidas de cada pareja de Erlenmeyer. ‘’SD’’ significa sin deflectores y ‘’CD’’ con deflectores. Uno de los Erlenmeyer de 400 mL de TB SD fue utilizado para determinar la detención de la producción. Según los valores de OD600 expuestos en la Tabla 15 se observa que las condiciones en las que el crecimiento bacteriano ha sido mayor fueron en el par de Erlenmeyer con 400 mL de TB sin deflectores, seguido de los dos Erlenmeyer con 400 mL de TB con deflectores y, finalmente, los que contenían la mezcla de 500 mL de medios LB + TB con deflectores. De acuerdo a esto, se deduce que la presencia de deflectores favorece la aireación, así como la relación 1:5 Vcultivo:Vrecipiente. Esto es lógico ya que el medio TB es un medio muy rico y la relación 1:5 implica mayor cantidad de aire en el Erlenmeyer, lo cual favorece el crecimiento bacteriano. Por el contrario, los Erlenmeyer con 500 mL de LB de autoinducción son los que presentaron menor cantidad de biomasa. 44 En paralelo, se analizó la expresión proteica de cada tipo de Erlenmeyer mediante SDS-PAGE (Figura 35). Figura 35. Análisis por SDS-PAGE de la bioproducción del 3CK24(SI)2. Se indica la hora en la que fueron tomadas las muestras de 400 mL de TB sin deflectores, puesto que fueron utilizadas para determinar que el crecimiento bacteriano se encontraba en fase estacionaria. Se contempla en la electroforesis que los Erlenmeyer con 500 mL de LB autoinductor con deflectores fueron los que menos han expresado la proteína de interés a pesar de su cualidad autoinductora, mientras que los que contenían 500 mL de TB sin deflectores (OD600 = 3,190) y 500 mL de LB + TB con deflectores han sido los que más la han producido (OD600 = 3,685). Esto se debe a que el TB empleado fue un TB de autoinducción, lo que permite una mayor generación de biomasa gracias a que evita la absorción de lactosa hasta que la glucosa se agota, momento en el cual se induce la producción que, por haber mayor crecimiento, debería de dar lugar a mayor cantidad de proteína. Además, la mezcla LB + TB anteriormente ha dado altos rendimientos en la producción de otros polímeros del grupo, por lo cual los resultados observados en la electroforesis son los esperados. Para concluir, el control del inóculo es el que poseía la OD600 más elevada. Esto es debido a que, en los Erlenmeyer, se añadió 1 mL de inóculo en 500 mL de medio, quedando en una proporción 1:500, mientras que, en el control, al añadirse 1 mL de inóculo en 5 mL de medio su proporción es de 1:5. En base a lo anterior, es de esperar que si se aumentara la cantidad de inóculo en los Erlenmeyer también hubiese una mayor producción de biomasa. 5.2.2Purificación 5.2.2.1Purificación por ITC Los polímeros tipo elastina que poseen cisteína en su estructura tienen la capacidad de formar puentes disulfuro tanto inter como intracatenarios consigo mismos y con otras proteínas presentes en el citoplasma bacteriano. Dicha unión es muy fuerte, motivo por el cual su 45 solubilidad se ve reducida y, por lo tanto, la purificación por ITC se ve dificultada por la tendencia de esta familia de ELP a permanecer en los precipitados en lugar de los sobrenadantes, según los resultados previos obtenidos por el grupo. Para solventar este impedimento se diseñó un protocolo de purificación por ITC (Figura 36) que incluyese un paso previo de reducción de los puentes disulfuro del polímero empleando -mercaptoetanol hasta una concentración final 0,1 M. Asimismo, sería interesante que las lisinas del 3CK24(SI)2 se encontrasen protonadas en vista a futuras aplicaciones en dosificación de fármacos. En base a esta consideración, se trabaja en pH inferiores al pKa de las lisinas cuando se encuentran en el polímero, es decir, a pH < 10. Figura 36. Esquema de purificación por ITC seguido para el 3CK24(SI)2 Teniendo en cuenta lo anterior, la purificación por ITC comenzó con la lisis bacteriana de la mitad del pellet de la producción mediante una sonicación empleando 84,78 mL del buffer de lisis celular (tomando como OD600 final la media de los valores de la Tabla 15 otorgados por los Erlenmeyer, resultando un valor de OD600 = 3,391). Tras realizar la centrifugación pertinente para separar los restos celulares del citosol bacteriano, se vio por electroforesis que no todo el polímero residía en el sobrenadante, sino que una cantidad importante del mismo permanecía en el precipitado (“↓ultra”) (Figura 37). Este hecho obligó a realizar una segunda sonicación que no consiguió 46 extraer la totalidad de la fracción que permanecía en dicho precipitado, por lo que se decidió seguir purificando la parte del ELP que sí se consiguió separar. Midiendo el pH de cada sobrenadante generado en cada paso del ITC, se comprobó que este poseía un valor en torno a 8, por lo que no era necesario un ajuste del mismo para conseguir la protonación de las lisinas anteriormente mencionada. En vista que era necesaria una concentración de NaCl 1,5 M para provocar la precipitación del (SI)2, se probó a añadir durante el primer ciclo de ITC una concentración de NaCl 2 M para reducir la temperatura de transición del polímero, pues es de esperar que, al poseer un bloque hidrofílico compuesto por lisinas, dicha temperatura fuese mayor a la Tt del (SI)2. Esta concentración de NaCl consiguió la precipitación total del polímero durante el primer ciclo de ITC, pero, en el segundo ciclo, fue necesario aumentar la cantidad de NaCl gradualmente hasta 3 M. De acuerdo a lo previsto, la purificación iba a ser entorpecida por la tendencia del polímero a quedarse en el pellet (“↓ultra”, “↓red”y “↓F”) (Figura 37). Para obtenerlo completamente puro solo fueron necesarios 2 ciclos. Figura 37. Representación del esquema de purificación desde la sonicación hasta el SbF3, donde “↓” indica precipitado y “Sb” sobrenadante. El marcador utilizado en el gel de la derecha es el Unstained Protein Molecular Weight Marker. Como se aprecia en la electroforesis, una gran cantidad de polímero se queda en los precipitados señalados sin conseguir su completa extracción. Para intentar separarlo en su totalidad del precipitado F3, el cual proporcionaría el sobrenadante más puro, se trató al mismo con - mercaptoetanol hasta una concentración final de 0,1 M, procurando reducir los posibles puentes disulfuro que pudieran haberse formado con otras proteínas insolubles presentes en la bacteria (Figura 38). Asimismo, la resuspensión de dicho precipitado tuvo lugar a 4ºC en un tampón acético/acetato con el fin de ajustar el pH a un valor de 4,75. El objetivo de este tratamiento es asegurar la protonación de las lisinas del polímero, aumentando el carácter hidrofílico del bloque y, por lo tanto, provocando un aumento de la temperatura de transición del polímero. A causa del aumento de la Tt, se facilita la disolución en frío del ELP. 47 Figura 38. Electroforesis posterior a la resuspensión del precipitado F3 con el agente reductor  -mercaptoetanol en medio ácido, siendo el 2ºSbF3 el generado con dicho tratamiento. Como se aprecia en la electroforesis de la Figura 38 se ve que el polímero de interés residente en el segundo SbF3 salió más puro, exento de cualquier proteína endógena de la bacteria, que el generado en primera instancia sin este agente reductor en medio ácido, pese a que no consiguió extraer la totalidad del polipéptido. Queda pendiente, por lo tanto, la optimización de la purificación por ITC para conseguir la extracción total del polímero de los precipitados donde reside. Una vez fueron obtenidos los sobrenadantes fríos con el polímero disuelto y puro, se sometieron a diálisis con el fin de eliminar la concentración de NaCl hasta un valor despreciable. Con este fin, fue necesario someter los sobrenadantes a 3 ciclos de diálisis con 25 L de agua destilada y un último de agua Milli-Q. El producto de la diálisis fue dividido en dos para un estudiar el comportamiento del polímero a diferentes pH. Así a una mitad se le ajustó el pH hasta un valor de 4 y la otra fue llevada a pH 8. En este último caso se hipotetizó que las lisinas se encontrarían protonadas en su mayor parte al encontrarse dicha fracción por debajo del pKa de las mismas. El estudio y caracterización de esta posible protonación y desprotonación se realizó mediante distintas técnicas (apartado 5.2.3). La masa del 3CK24(SI)2 que se obtuvo por ITC, después de congelado y liofilizado, fue de 257,94 mg. Puesto que dicha cantidad es la asociada a la mitad del pellet de la producción, el rendimiento obtenido para un cultivo de 4,6 L, por extrapolación, fue de 112,15 mg/L de medio, siendo 1,28 veces superior al rendimiento conseguido con el (SI)2. 5.2.2.2Purificación por extracción con disolventes orgánicos y precipitación en acetonitrilo. Teniendo en cuenta los inconvenientes presentados por la purificación por ITC y la incompleta separación del polímero de los restos celulares tras la lisis bacteriana, se probó la purificación alternativa que incluye la extracción con disolventes orgánicos y la precipitación de la proteína en 48 acetonitrilo (apartado 4.2.10.2) con la otra mitad del pellet de la producción y la fracción que no pudo ser separada de los restos celulares tras la sonicación. Sin embargo, no tuvo éxito, ya que todos los SDS-PAGE realizados con las fases generadas en dicho método no presentaban ningún tipo de banda. Además, los sobrenadantes finales obtenidos se congelaron y liofilizaron asociando el problema a una gran dilución de las proteínas presentes que impidiera su apreciación por SDSPAGE. Una vez liofilizado, el sólido que apareció se trató de manera pertinente para analizarlo por electroforesis (1 mg/mL) junto con el pellet tratado con los disolventes orgánicos, no sólo no apareciendo ningún tipo de banda de ninguna proteína, sino que el pellet aún poseía el polímero de interés. Atendiendo a los resultados se concluyó que el disolvente orgánico no fue capaz de extraer el polipéptido de manera efectiva, que permanecería en los restos celulares, lo cual dificultaría el desarrollo de las electroforesis provocando que finalmente no se visualizara nada. En conclusión, habría que estudiar de manera detallada los parámetros de dicho método con el fin de conseguir lograr purificación empleando este protocolo, pero, por ahora, el método viable para extraer el ELP puro es el ITC. 5.2.3Caracterización del biopolímero En el caso del 3CK24(SI)2 purificado por ITC sólo fue posible la caracterización de la fracción que fue ajustada a pH 8, puesto que la que poseía un pH 4 no se pudo disolver ni en agua, ni en DMSO, invalidando su estudio por RMN y MALDI-TOF. Su insolubilidad en PBS impidió también el análisis de su Tt por DSC. Este comportamiento tan contrario a la naturaleza reversible de los ELPs lleva a pensar que el polímero pudo haberse degradado durante el ajuste de su pH ya que en el proceso el pH alcanzó valores de 2, punto crítico ya que en estas condiciones los ELPs se degradan rápidamente. Por este motivo, lo resultados expuestos en este apartado de Caracterización del biopolímero corresponden a la fracción purificada por ITC y ajustada a un pH 8. 5.2.3.1Determinación de la masa molecular aparente por SDS-PAGE El SDS-PAGE de la Figura 39 muestra al 3CK24(SI)2 puro y libre del resto de proteínas de la bacteria. Con dicha electroforesis se puede calcular el peso molecular aparente del polímero (Tabla 16 y Figura 39) realizando un ajuste lineal entre el Rf del marcador y el logaritmo en base 10 de las masas moleculares que este mismo ofrece, obteniendo una recta de calibrado. Mm (kDa) Rf Log Mm 116,0 1,00 2,06 66,2 0,76 1,82 45,0 0,69 1,65 35,0 0,54 1,54 25,0 0,34 1,40 18,4 0,18 1,26 14,4 0,12 1,16 Tabla 16. Relación de log Mm y Rf del marcador. 49 Figura 39. Representación de los datos de la Tabla 16. Despejando de la ecuación obtenida Rf = 1,0071(Log Mm) - 1,0506, se obtiene que la masa molecular aparente del 3CK24(SI)2 es de 101,5 kDa (Tabla 17). Rf Log Mm Mm (kDa) 3CK24(SI)2 0,97 2,01 101,5 Tabla 17. Peso molecular aparente del 3CK24(SI)2. Comparando la masa molecular aparente obtenida de 101,5 kDa con el peso molecular teórico de 101,4 kDa, se concluye que el 3CK24(SI)2 no posee un gran retraso electroforético, al contrario de lo encontrado con el (SI)2, debido a su mayor carácter hidrofílico al portar el bloque de las lisinas adicional. 5.2.3.2Análisis de la composición por 1H-RMN Observando el espectro de 1H-RMN obtenido del 3CK24(SI)2 (Anexo, apartado 8.1) a una concentración de 16 mg/mL en DMSO deuterado, se realiza la comparación (Tabla 18) de los protones previstos de manera teórica con los que se obtuvieron experimentalmente: Tipo de 1H Teóricos Experimentales CH3 (~0,5-1 ppm) 2187 2187,00 CH2 y otros CH (~1-2 ppm) 1483 1424,80 CH (~3,5-4,5 ppm) 2325 2263,86 OH (~5 ppm) 100 89,25 NH (peptídico) (~7-9 ppm) 979 858,03 Tabla 18. Clasificación de los protones del polímero 3CK24(SI)2. Según los valores expuestos en la Tabla 18, normalizando la señal de los grupos metilo, el valor más preciso respecto al teórico corresponde a las señales asociadas a los grupos alcohol del polímero. Nuevamente se presenta este grupo de señales particulares de los polipéptidos que portan el tetrabloque (SI)2, siendo dichas señales exclusivas de las serinas de dicho bloque. Por otro lado, la disminución de los protones detectada en el grupo amida del enlace peptídico se debe al ya mencionado equilibrio existente, dependiente del pH, entre la forma protonada del y = 1,0071x -1,0506 R² = 0,9844 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 Rf(adm.) Log Mm Mmaparente 3CK24(SI)2 50 mismo y su forma neutra, provocando una variación respecto del número de protones predicho teóricamente. Este cálculo también se realizó suponiendo en el que las amidas no se encontraban protonadas al poseer la muestra un pH fisiológico. De la misma manera, no se consideró la interacción global de los pentapéptidos ni la estructura terciaria del polímero, pudiendo deberse las variaciones experimentales encontradas respecto de los valores teóricos a la influencia de la estructura terciaria del polipéptido en los desplazamientos químicos de los protones que componen su estructura. Aun así, los valores teóricos son lo suficientemente próximos a los experimentales como para concluir que no hay diferencia significativa entre ellos y que la estructura del polímero era la anticipada. 5.2.3.3Determinación de la masa molecular por MALDI-TOF Los espectros de la muestra (Anexo, apartado 8.3) disuelta en DMSO a una concentración de polímero de 2 mg/mL mostraron las cuatro primeras ionizaciones. La masa molecular experimental media del polímero, asociada a la primera ionización, es de 101814. Comparando con el valor teórico de 101400 Da, la diferencia respecto del valor empírico es de 414 Da. Esto indica que el peso molecular teórico, aparente y experimental son prácticamente semejantes y que por tanto la masa molecular del 3CK24(SI)2 obtenida empíricamente era la prevista. 5.2.3.4Determinación de la temperatura de transición mediante DSC Utilizando las mismas condiciones que las descritas para el (SI)2, se obtuvieron dos puntos de transición o Tt (Anexo, apartado 8.5). El primer punto, de menor temperatura, corresponde a una Tt de 14,67ºC, análoga a la que presenta el (SI)2, por lo que se dedujo que se debía a la transición del tetrabloque (SI)2 del polímero; por otro lado, el segundo punto de transición corresponde a una Tt de 42,48ºC, por lo que pertenecería a la transición del bloque de las lisinas que, debido a su carácter hidrofílico, necesita una mayor temperatura para desprenderse de las moléculas de agua en estructura de clatrato. 5.2.3.5Determinación de la composición aminoacídica mediante HPLC El número de aminoácidos visualizados en el análisis del polímero fueron los siguientes (Tabla 19): Aminoácido Valor teórico Valor experimental M 1 1,07 E 1 3,17 S 101 107,01 L 2 2,76 V 244 220,80 P 245 244,88 G 488 483,88 I 120 120,57 K 24 16,94 C 3 15,25 Total 1229 1216,30 Tabla 19. Análisis aminoacídico del 3CK24(SI)2 57 6Conclusiones • Se consiguió la síntesis de los polímeros (SI)2 y del 3CK24(SI)2, partiendo de sus correspondientes genes contenidos en un plásmido de expresión. El rendimiento obtenido en el segundo polipéptido supera al primero, en contraste con los resultados anteriores obtenidos por el grupo de investigación. El uso de una cepa bacteriana distinta a la empleada anteriormente o los cambios en las condiciones de producción podrían ser la razón de este aumento en el rendimiento. • Se ha optimizado el protocolo de purificación por ITC del (SI)2, permitiendo que salga prácticamente puro en el primer ciclo del mismo, lo cual permite reducir el coste de reactivos y el tiempo de su obtención. Sin embargo, queda por mejorar el del 3CK24(SI)2, pudiendo seguirse la vía que emplea -mercaptoetanol como agente reductor para su extracción de los precipitados fríos. • El nuevo protocolo de purificación alternativo parece viable para polímeros que no tienen una gran complejidad estructural como el 3K(EI)2, siendo necesarias modificaciones para poder ser empleado en otros que sí la poseen, como el 3CK24(SI)2. • Las técnicas empleadas para la caracterización de los polímeros (SDS-PAGE, 1H-RMN, MALDI-TOF, DSC, DLS, análisis de aminoácidos) indican que estos poseen las composiciones y características esperadas de cada uno de ellos. • Se ha comprobado la capacidad de formación de nanopartículas del (SI)2 lo que permite utilizarlo para la encapsulación de fármacos en estudios posteriores. 58 7Bibliografía 1Bruce Alberts et al. (2014) Molecular Biology of the Cell. 6th edn. 2Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein and Stephen T. 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G., Dibner, M. D. and Battey, J. F. (1986) “Agarose Gel Electrophoresis,” in Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier. doi: 10.1016/B978-0-444-01082-7.50022-9. 15Bitesize Bio (2008) Agarose Gels Do Not Polymerise! 16Orbit Biotech Bacterial Growth Curve. 17Sweet, C. et al. (2021) “Development of a Fast Organic Extraction–Precipitation Method for Improved Purification of Elastin-Like Polypeptides That Is Independent of Sequence and Molecular Weight,” Biomacromolecules, 22(5). doi: 10.1021/acs.biomac.1c00096. 18Skoog, D. A., Holler, Fj. and Crouch, S. R. (2008a) Principios de análisis instrumental. 6th edn págs 559-560. 19Skoog, D. A., Holler, Fj. and Crouch, S. R. (2008a) Principios de análisis instrumental. 6th edn Capítulo 19. 59 20Skoog, D. A., Holler, Fj. and Crouch, S. R. (2008a) Principios de análisis instrumental. 6th edn págs 762, 816. 21Choudhary, R. C. et al. (2019) “Characterization Methods for Chitosan-Based Nanomaterials,” in. doi: 10.1007/978-3-030-12496-0_5. 22Skoog, D. A., Holler, Fj. and Crouch, S. R. (2008a) Principios de análisis instrumental. 6th edn págs 955-957. 23Skoog, D. A., Holler, Fj. and Crouch, S. R. (2008b) Principios de análisis instrumental. 6th edn págs 900-901. 60 8Anexo 8.1Espectros de 1H-RMN a) b) 61 c) Figura A.1. Espectros de protón de a) (SI)2 b) 3CK24(SI)2 c) 3K(EI)2. 8.2MALDI-TOF del (SI)2 62 8.3MALDI-TOF del 3CK24(SI)2 63 8.4MALDI-TOF del 3K(EI)2 64 8.5Termogramas obtenidos por DSC a) 65 b) c) Figura A.2. Termogramas del a) (SI)2 b) 3CK24(SI)2 c) 3K(EI)2. 66 8.6Abreviaturas Abreviatura Nombre completo Abreviatura Nombre completo 1H-RMN Resonancia magnética nuclear de protón LBIndc. LB de autoinducción A/Abs Absorbancia LTI Laboratorio de técnicas instrumentales Adm. Adimensional M Metionina C Cisteína MALDI-TOF Desorción/Ionización por Láser Asistida por Matriz con detector de tiempo de vuelo CD Con deflectores MK Marcador o marker Cfu Unidad formadora de colonias Mm/Pm Masa/peso molecular CMC Concentración crítica de micelar Milli-Q Agua ultrapura Milli-Q CMT Temperatura crítica micelar mTB/TB Modified Terrific Broth Col Colonia OD600 Densidad óptica a 600 nm Conc. Concentración P Prolina  Caliente (referencia a la fase) p/v Peso/volumen ddNTP Didesoxinucleótido trifosfato p10N3C pET10NCCC DLS Dispersión dinámica de la luz p10N3K pET10NKKK DSC Calorimetría diferencial de barrido p7 pET7 E Ácido glutámico Pb Pares de bases E. coli Escherichia coli PDI índice de Polidispersidad El. Elución Pr./↓ /Pt. Precipitado ELP Polipéptido tipo elastina rADN ADN recombinante F Frío (referencia a la fase) Rpm Revoluciones por minuto G Glicina S Serina HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia S.O.C. Medium Medio de caldo superóptimo con represión por catabolito I Isoleucina Sb. Sobrenadante I:M Isopropanol/metanol 1:1 SD Sin deflectores IBGM Instituto de biología y genética molecular SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico Inoc. Inóculo SPME Microextracción en fase sólida Iso Isopropanol Tt Temperatura de transición ITC Ciclos de transición inversa Ultra. Ultrasonidos K Lisina UVa Universidad de Valladolid L Leucina V Valina LB Lysogeny Broth v/v Volumen/volumen LB+TB Mezcla de 1/3 de medio LB y 2/3 de medio TB ZP Potencial zeta