Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivos de hortalizas

EFECTO DE LA PRESENCIA DE METALES PESADOS (Zn y Cu) EN EL DESARROLLO Y CONTENIDO DE LÍPIDOS, AZÚCARES Y CLOROFILAS EN CULTIVO DE HORTALIZAS Trabajo Final de Grado Ingeniería de Sistemas Biológicos Autor: Andrés Mauricio Perdomo Vargas Tutora: Nuria Cañameras Fecha: 08 / junio / 2020 Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 2 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Resumen La contaminación del medioambiente con metales pesados es un tema que concierne a nivel mundial. Estos metales se pueden acumular en el suelo, fuentes de agua y ser asimilados por las plantas en su forma iónica. Los problemas derivados de contaminación por metales no sólo implican a la especie vegetal, también puede afectar a los humanos que hacen de los vegetales una fuente de alimento. Las actividades antropogénicas hacen que la concentración de metales aumente, por ejemplo, la fertilización del suelo y uso de pesticidas de forma no controlada. El objetivo principal de este trabajo es evaluar el efecto que tiene la adición de dos metales pesados, zinc y cobre (Zn y Cu), en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivos de hortalizas en invernadero fertilizados con lodos de depuradora. Se utilizaron tres dosis diferentes de metales, siendo las especies vegetales utilizadas la lechuga (Latuca sativa L. variedad Maravilla) y el rábano (Raphanus sativus tipo redondo rojo), ambas cultivadas en contenedor. Los cultivos fueron sometidos a riego diario. El suelo utilizado procedía de una parcela de Agrópolis (unidad científico técnica de la UPC). Las lechugas y los rábanos se cosecharon pasados 57 y 36 días, respectivamente. En las lechugas, el análisis estadístico de diferentes parámetros como crecimiento vegetal, contenido de clorofilas, lípidos y carbohidratos no resulta ser significativo. Tampoco se observaron síntomas aparentes de toxicidad. En cuanto a los rábanos, se encontraron diferencias significativas en el contenido de clorofila, siendo las plantas tratadas con dosis media las que tenían un contenido inferior al resto. El resto de parámetros de biomasa y contenido de lípidos y carbohidratos no mostraron diferencias significativas. 3 Resum La contaminació del medi ambient amb metalls pesants és un tema que afecta a nivell mundial. Aquests metalls es poden acumular al sòl, a les fonts d’aigua i a més poden ser assimilats per les plantes en la seva forma iònica. Els problemes derivats de la contaminació amb metalls no impliquen tan sols a l’espècie vegetal, sinó que també poden afectar als humans que aprofiten els vegetals com a font d’aliment. Les activitats antropogèniques fan que les concentracions de metalls augmentin, per exemple, amb la fertilització del sòl y l’ús de pesticides de forma no controlada. L’objectiu principal d’aquest treball és avaluar l’efecte que té l’adició de dos metalls pesants, zinc y coure (Zn y Cu), en el desenvolupament y contingut de lípids, sucres i clorofil·les en cultius d’hortalisses en hivernacle fertilitzats amb fangs de depuradora. Es van emprar tres dosis diferents de metalls, sent les espècies vegetals utilitzades l’enciam (Latuca sativa L. varietat Meravella) i el rave (Raphanus sativus tipus rodó vermell), les dues van ser cultivades en contenidor. Els cultius van ser sotmesos a reg diari. El sòl emprat provenia d’una parcel·la d’Agròpolis (unitat científic-tècnica de la UPC). La collita dels enciams i els raves va ser passats 57 i 36 dies, respectivament. En els enciams, l’anàlisi estadístic de diferents paràmetres com el creixement vegetal, contingut de clorofil·les, lípids i carbohidrats no va resultar ser significatiu. Tampoc es van observar símptomes aparents de toxicitat. Respecte als raves, es van trobar diferencies significatives en el contingut de clorofil·la. Les plantes tractades amb dosis mitja van resultar en contingut inferior de clorofil·la. La resta de paràmetres de biomassa y contingut de lípids i carbohidrats no van mostrar diferencies significatives. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 4 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Abstract Pollution of environment with heavy metals it is a global concern. These metals can accumulate in soil, water sources and can be assimilated by plants in their ionic form. The problems derived from metal contamination not only involve the plant species, they can also affect humans that use vegetables like source of food. Anthropogenic activities cause the concentration of metals to increase, for example, with fertilization of soil and the use of pesticides in an uncontrolled way. The aim of this study is to evaluate the effect of two heavy metals, zinc and copper (Zn and Cu), has on the development and content of lipids, sugars and chlorophylls in a greenhouse vegetable crops fertilized with sewage sludge from a wastewater treatment plant. Three different doses of metals were used, the plant species used were lettuce (Latuca sativa L. var. Maravilla) and radish (Raphanus sativus round red type), both grown in containers. The crops were submitted to daily irrigation with water. The soil used came from a plot in Agrópolis (UPC scientific-technical unit). Lettuces and radishes were harvested after 57 and 36 days, respectively. From lettuces, statistical analysis of different parameters such as plant growth, chlorophyll, lipid and carbohydrate content did not show significant differences. Either not apparent toxicity symptoms were observed. Regarding radishes, significant differences were found in the chlorophyll content, being the plants treated with medium dose those with a lower content than rest. Other parameters such as biomass, and lipid and carbohydrate content did not show significant differences. 5 Sumario Agradecimientos _____________________________________________________ 11 1. Introducción _____________________________________________________ 13 1.1. Metales pesados_____________________________________________________ 13 1.2. Fangos de depuradora ________________________________________________ 17 1.3. Contexto del trabajo__________________________________________________ 19 2. Objetivos ________________________________________________________ 21 2.1. Objetivo general _____________________________________________________ 21 2.2. Objetivos específicos _________________________________________________ 21 3. Materiales y métodos ______________________________________________ 23 3.1. Material vegetal _____________________________________________________ 23 3.2. Tipo de contenedor __________________________________________________ 23 3.3. Suelo y fertilización __________________________________________________ 24 3.4. Metales pesados_____________________________________________________ 26 3.5. Riego ______________________________________________________________ 26 3.6. Tratamientos del experimento __________________________________________ 27 3.7. Diseño del experimento _______________________________________________ 27 3.7.1. Dosificación de metales pesados __________________________________________ 27 3.7.2. Montaje y distribución __________________________________________________ 28 3.7.3. Duración y condiciones de cultivo __________________________________________ 30 3.8. Determinación de biomasa ____________________________________________ 32 3.9. Crecimiento vegetal __________________________________________________ 34 3.10. Determinación de lípidos y carbohidratos _________________________________ 35 3.11. Determinación de clorofilas ____________________________________________ 37 3.12. Tratamiento estadístico _______________________________________________ 40 4. Resultados _______________________________________________________ 42 Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 6 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech 4.1. Biomasa ___________________________________________________________ 42 4.1.1. Biomasa de lechuga _____________________________________________________ 42 4.1.2. Biomasa de rábano _____________________________________________________ 43 4.2. Crecimiento vegetal __________________________________________________ 46 4.2.1. Longitud y número de hojas en lechuga. ____________________________________ 46 4.2.2. Longitud y número de hojas en rábano _____________________________________ 49 4.3. Contenido de lípidos y carbohidratos ____________________________________ 52 4.4. Composición de clorofilas _____________________________________________ 54 4.4.1. Estimación de la composición de clorofilas en lechuga según dosis aplicada_________ 54 4.4.2. Estimación de la composición de clorofilas en lechuga según posición de la hoja _____ 55 4.4.3. Estimación de la composición de clorofilas en rábano según dosis aplicada _________ 57 4.4.4. Estimación de la composición de clorofilas en rábano según posición de la hoja _____ 59 5. Discusión ________________________________________________________ 62 Conclusiones _________________________________________________________ 66 Referencias __________________________________________________________ 67 7 Índice de tablas Tabla 1-1. Valores genéricos de referencia (NGR) de metales pesados en suelos para protección de ecosistemas en zonas agropecuarias y forestales ___________________________________________ 17 Tabla 1-2. Valor límite de concentración de metales pesados en los lodos destinados a su utilización agraria ____________________________________________________________________________ 18 Tabla 3-1. Características principales del suelo empleado en el experimento (s.m.s.: sobre materia seca) __________________________________________________________________________________ 24 Tabla 3-2. Características principales del fango empleado en el experimento (s.m.f.: sobre materia fresca; s.m.s.: sobre materia seca) ____________________________________________________________ 25 Tabla 3-3. Concentración de metales pesados añadidos a cada contenedor dependiendo de la dosis __ 27 Tabla 3-4. Sorteo aleatorio del número de contenedor por dosis y especie vegetal _________________ 29 Tabla 3-5. Duración de cultivo experimental de cada especie vegetal ___________________________ 30 Tabla 3-6. Duración y condiciones de riego ________________________________________________ 31 Tabla 3-7. Ecuaciones simultaneas para cuantificar clorofilas en tejido vegetal a partir de absorbancias y en cubeta de 1 cm ___________________________________________________________________ 39 Tabla 4-1. Resultados de la determinación de biomasa en lechuga según dosis aplicada de metales pesados. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia de 5% ____________________ 43 Tabla 4-2. Resultados de la determinación de biomasa de hojas y bulbo en rábano según dosis aplicada de metales pesados. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia de 5% __________ 45 Tabla 4-3. Resultados de la determinación de hoja más larga y número de hojas totales en cultivo de lechuga según dosis aplicada de metales pesados. Valores promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% __________________________________________________________________ 48 Tabla 4-4. Resultados de la determinación de hoja más larga y número de hojas totales en cultivo de rábano según dosis aplicada de metales pesados. Valores promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% __________________________________________________________________ 51 Tabla 4-5. Resultados de la determinación de lípidos y carbohidratos en hojas de lechuga según dosis aplicada de metales pesados. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% ___ 52 Tabla 4-6. Resultados de la determinación de lípidos y carbohidratos en bulbo de rábano según dosis aplicada de metales pesados. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% ___ 53 Tabla 4-7. Resultados de la determinación de clorofilas a , b y totales en lechuga según la dosis de metales pesados añadida. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% _____ 55 Tabla 4-8. Resultados de la determinación de clorofilas a en lechuga según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% __ 56 Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 8 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Tabla 4-9. Resultados de la determinación de clorofilas b en lechuga según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% __ 56 Tabla 4-10. Resultados de la determinación de clorofilas totales en lechuga según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% _______________________________________________________________________________ 57 Tabla 4-11. Resultados de la determinación de clorofilas a , b y totales en rábano según la dosis de metales pesados añadida. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% _____ 58 Tabla 4-12. Resultados de la determinación de clorofilas a en rábano según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% __ 60 Tabla 4-13. Resultados de la determinación de clorofilas b en rábano según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% __ 60 Tabla 4-14. Resultados de la determinación de clorofila total en rábano según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% _______________________________________________________________________________ 60 9 Índice de figuras Figura 3-1. Contenedor para el cultivo en invernadero _______________________________________ 23 Figura 3-2. Presentación de metales pesados objeto de estudio en este experimento _______________ 26 Figura 3-3. Cultivo con riego por goteo en el invernadero de Agrópolis __________________________ 26 Figura 3-4. (Izquierda) Planta de lechuga y (derecha) semillas de rábano con gotero al inicio del experimento________________________________________________________________________ 29 Figura 3-5. Cultivo experimental en invernadero la primera semana ____________________________ 29 Figura 3-6. Esquema gráfico de la distribución aleatoria por especie vegetal y dosis de metales pesados añadidos. A la derecha de cada casilla se indica la especie vegetal L y R, lechuga y rábano respectivamente. (D0: dosis control; D2: dosis media; D4: dosis alta) ___________________________ 32 Figura 3-7. (A) Muestras de rábano correctamente etiquetadas, (B) hojas de rábano identificadas para desecar en estufa a 80 ºC, y (C) hojas de rábano después de estar en estufa durante 2 días __________ 33 Figura 3-8. (Izquierda) Semillas de rábano sembradas el primer día de experimento, (Centro) brotes de rábano al cabo de 2 semanas de la siembra, y (Derecha) planta de rábano en el momento de la cosecha __________________________________________________________________________________ 34 Figura 3-9. Tubos de vidrio enumerados para ser pesados en balanza analítica ___________________ 36 Figura 3-10. (A) Peso de filtro de nylon en balanza analítica con resolución de 0,01 mg y exactitud ± 0,005 mg, y (B) ampliación de imagen ________________________________________________________ 36 Figura 3-11. Medidor OPTI-SCIENCES CCM-200 plus utilizado para medir valor relativo de clorofila ____ 38 Figura 4-1. Resultados de (A) peso fresco, (B) peso seco y (C) humedad de la parte aérea de lechuga según dosis aplicada de metales pesados _________________________________________________ 42 Figura 4-2. Resultados de (A) peso fresco, (B) peso seco y (C) humedad de la parte aérea de rábano según dosis aplicada de metales pesados ______________________________________________________ 44 Figura 4-3. Resultados de (A) peso fresco, (B) peso seco y (C) humedad de la parte subterránea de rábano según dosis aplicada de metales pesados _________________________________________________ 45 Figura 4-4. Plantas de lechuga que presentan hojas secas ____________________________________ 46 Figura 4-5. Representación de la evolución de (A) longitud de hoja más larga y (B) número total de hojas en lechuga según dosis aplicada de metales pesados ________________________________________ 47 Figura 4-6. Resultados de (A) longitud de hojas más larga (cm) y (B) número total de hojas en lechuga según dosis aplicada de metales pesados _________________________________________________ 48 Figura 4-7. Representación de la evolución de (A) longitud de hoja más larga y (B) número total de hojas en rábano según dosis aplicada de metales pesados ________________________________________ 50 Figura 4-8. Resultados de (A) longitud de hojas más larga (cm) y (B) número total de hojas en rábano según dosis aplicada de metales pesados _________________________________________________ 51 Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 16 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech conoce como traslocación de metales (Rai et al., 2019). Eissa y Negim (2018) obtuvieron que las concentraciones de Zn, Cu, Pb, Ni y Cd se disponían en mayor proporción en las raíces que en las hojas de lechugas y espinacas que crecían en suelos contaminados con metales pesados por el uso de aguas residuales. Efectos adversos en las especies vegetales Las plantas pueden presentar efectos desfavorables tanto por deficiencia de micronutrientes como por exceso. La deficiencia de iones Zn en la planta puede provocar crecimiento retardado y clorosis (Sturikova et al., 2018). Concentraciones tóxicas de metales pueden derivar en la producción de especies oxigeno reactivas (EOR) como superóxidos (O2·-) y radicales hidroxil (·OH) (Berni et al., 2019). Cuando las concentraciones de EOR pasan de su umbral, la célula entra en un estado de estrés oxidativo e incrementa la oxidación de ADN, proteínas, lípidos y carbohidratos. Para combatir el exceso de EOR, las células vegetales generan enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa, glutatión reductasa y peroxidasa entre otras (Alves et al., 2016). Algunos síntomas de toxicidad en plantas por exceso de iones metálicos son reducción en la fotosíntesis, inhibición de elongación de raíz, crecimiento de tallo retardado, clorosis en las hojas y necrosis de tejidos (Krämer y Clemens, 2006). Por ejemplo, la toxicidad de Cu puede afectar al contenido en clorofila de la planta (Pätsikkä et al., 2002; Zengin y Munzuroglu, 2005). El grupo de Kumar (Kumar et al., 2008) encontraron que el peso fresco y seco de las plantas disminuía cuando se aplicaba una concentración elevada de Cu (100 µM). Otros autores indican que las concentraciones de Zn en el medio cultivo (750 mg/Kg) pueden reducir en un 20% el contenido hídrico en el cultivo de espinaca (Naz et al., 2015). La deficiencia de Fe en planta es un efecto común de toxicidad por Cu y Zn (Reichman, 2002). El efecto tóxico combinado de Cu y Zn también puede provocar menor asimilación de Mn en la parte aérea de las plantas y además mostrar clorosis en las hojas más nuevas (Ebbs y Kochian, 1997). 17 Valores límite de metales en suelos En Cataluña se establecen unos niveles genéricos de referencia (NGR) en la Ley 5/2017 (Generalitat, 2017) en cuanto a metales en los suelos por aplicación de residuos. Estos niveles se establecen para la protección de los ecosistemas y la salud animal (Tabla 1-1). Tabla 1-1. Valores genéricos de referencia (NGR) de metales pesados en suelos para protección de ecosistemas en zonas agropecuarias y forestales Elemento Valor NGR (mg/Kg suelo seco) As 6 Co 25 Cu 90 Es 50 Hg 2 Mo 3,5 Ni 45 Zn 170 1.2. Fangos de depuradora El uso de fangos de depuradora como fertilizante orgánico es una práctica que no sólo se utiliza para eliminar residuos sino también para aprovechar recursos. Es un material que contiene gran cantidad de materia orgánica, así como nitrógeno, fósforo y potasio entre otros que son nutrientes que las plantas necesitan y asimilan para un crecimiento adecuado. Además estos fangos también suelen incrementar el intercambio catiónico de minerales en el suelo, así como crear mayor cantidad de agregados. En contraste a las ventajas que tiene el uso de fangos de depuradora, se tiene que tener en cuenta que este fertilizante puede ser una fuente de contaminantes para el suelo y las aguas freáticas. La mayoría de fangos contienen metales pesados, por eso su uso como abonos está limitado en función de su concentración para que no impliquen problemas para las especies vegetales y animales. La proporción efectiva de fango de depuradora que se añade a los cultivos para un mayor crecimiento vegetal Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 18 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech varía dependiendo de las condiciones del suelo y del tipo de cultivo (Rrong et al., 2016), pero siempre teniendo en cuenta su limitación por concentración. El fango que se utiliza en la agricultura tiene que pasar por un proceso de estabilización para reducir el contenido en materia orgánica, modificar el pH y eliminar la presencia de microorganismos patógenos. En general, los fangos utilizados como fertilizantes aumentan el contenido de materia orgánica en el suelo, disminuyen su pH y aumentan la cantidad de varios micronutrientes como Cu, Zn, Ni, y Cr (Rorat et al., 2016). Valores límite de metales en fangos Los valores seguros de metales pesados que no presentan riesgo para los humanos son diferentes dependiendo si se analiza el fertilizante, el suelo o los alimentos. Para la fertilización con compuestos orgánicos como fango de depuradora, se fijan valores para Cd, Cu, Ni, Pb, Zn Hg y Cr dependiendo del pH del suelo en el que se aplican (Tabla 1-2). A nivel nacional, estos valores máximos están detallados en el Real Decreto 1310/1990 (Gobierno de España, 1990). Tabla 1-2. Valor límite de concentración de metales pesados en los lodos destinados a su utilización agraria Elemento Valores límite (mg/Kg s.m.s) Suelo con pH < 7 Suelo con pH > 7 Cd 20 40 Cu 1000 1750 Ni 300 400 Pb 750 1200 Zn 2500 4000 Hg 16 25 Cr 1000 1500 s.m.s.: sobre materia seca 19 1.3. Contexto del trabajo Este trabajo forma parte de un proyecto RETOS, financiado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. El título del proyecto es Dinámica de la acumulación de antibióticos, metales y genes de resistencia bacteriana en cultivos agrícolas por fertilización orgánica. Implicaciones en la producción vegetal. Tiene como código de referencia: AGL2017-89518-R. Quienes lideran el proyecto son el Dr. Víctor Matamoros Mercadal y el Dr. Josep María Bayona Termens del Instituto de Diagnóstico Ambiental y Estudios del Agua (IDAEA) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Este trabajo experimental se realiza en el invernadero de Agrópolis de la UPC, en los laboratorios de la ESAB y en los laboratorios del IDAEA-CSIC. Previamente a este TFG, Sofía Jaray realizó, también vinculado al proyecto RETOS, su TFG. En dicho trabajo se valoró para cultivo de lechuga la dosis de fango de depuradora utilizada en este TFG. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 20 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Objetivos 21 2. Objetivos 2.1. Objetivo general El objetivo general de este trabajo final de grado es evaluar el efecto que tiene la adición de dos metales pesados, zinc y cobre, en el desarrollo vegetal y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en dos cultivos de hortalizas (lechuga y rábano) en invernadero fertilizados con lodo de depuradora. 2.2. Objetivos específicos A continuación, se definen los objetivos necesarios para poder alcanzar la finalidad del objetivo general: - Determinar la biomasa final fresca y seca. - Cuantificar el contenido de clorofilas a, b y totales. - Identificar el crecimiento vegetal asociado a longitud y número de hojas. - Valorar el contenido de lípidos y carbohidratos. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 22 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Materiales y Métodos 23 3. Materiales y métodos 3.1. Material vegetal Lechuga Las lechugas que se usaron en este trabajo son de la especie Lactuca sativa L. variedad Maravilla. Se adquirió el plantel en la empresa Planters Lladó de Gavà. Rábano Se adquirieron semillas de la especie Raphanus sativus tipo redondo rojo, de la empresa Semillas Fitó. Se mantuvieron a baja temperatura (4ºC) hasta el día de su siembra para mantener su viabilidad. 3.2. Tipo de contenedor Para este experimento se utilizaron contenedores de cristal opaco de capacidad 2,5 L (diámetro= 15 cm, altura= 20 cm) con forma de embudo en su parte inferior para facilitar el drenaje (Fig. 3-1). Se usaron un total de 30 contenedores (5 repeticiones por tratamiento). Los tratamientos establecidos se explican en el apartado 3.6. Figura 3-1. Contenedor para el cultivo en invernadero Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 24 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech 3.3. Suelo y fertilización El suelo utilizado fue una mezcla de suelo y arena fertilizado con fango de depuradora. El suelo procedía de una parcela de cultivo ubicada en Agrópolis (longitud 2º03_E, latitud 41º17_N) ubicada en Viladecans. La capa escogida fue la perteneciente al horizonte superior del suelo. Antes de ser fertilizado con el fango, el suelo material fue tamizado a 5 mm. El fango deshidratado, apto para uso agrícola, procedía de la estación de depuración de aguas residuales de Gavà-Viladecans. Las principales características físico-químicas de este suelo y del fango están detalladas en la tablas 3-1 y 3-2. El análisis fue realizado por la empresa Eurofins Agroambiental, S.A. Se trata de un suelo de textura franca y elevado contenido en fósforo (> 21 x 10-6 P) y potasio (> 300 x 10-6 K). Tabla 3-1. Características principales del suelo empleado en el experimento (s.m.s.: sobre materia seca) Textura Franca (40% Arena, 16,2% Limo grueso, 19% Limo y 24,8% Arcilla) pH 8,48 Conductividad eléctrica (CE) 0,240 dS/m Humedad 1,33% Materia orgánica 1,27% s.m.s. N total 0,089 % s.m.s. P 33 mg/Kg s.m.s. Carbonato cálcico equivalente 28 % s.m.s. Ca 7014 mg/Kg s.m.s. Mg 362 mg/Kg s.m.s. Na 91 mg/Kg s.m.s. K 344 mg/Kg s.m.s. 25 Tabla 3-2. Características principales del fango empleado en el experimento (s.m.f.: sobre materia fresca; s.m.s.: sobre materia seca) Materia seca 105ºC 20,9 % s.m.f. pH 8,4 Conductividad eléctrica (CE) 2,56 dS/m Materia orgánica 51,5 % s.m.s. N Kjeldahl 2,77 % s.m.s. N amoniacal 1,34 % s.m.s. P 1,55 % s.m.s. K 0,207 % s.m.s. Ca 7,0 % s.m.s. Mg 0,480 % s.m.s. Fe 1,49 % s.m.s. Cd 0,51 mg/Kg s.m.s. Cu 240 mg/Kg s.m.s. Ni 53 mg/Kg s.m.s. Pb 29 mg/Kg s.m.s. Zn 699 mg/Kg s.m.s. Hg 0,60 mg/Kg s.m.s. Cr 57 mg/Kg s.m.s. C/N 9,3 La dosis de fango de depuradora incorporada fue la misma para todos los tratamientos y equivalía a un contenido en N de 100 U.F. (unidades fertilizantes). Esta dosis fue elegida de acuerdo a los resultados experimentales que obtuvo Jaray (2019) en un TFG anterior realizado dentro del mismo proyecto de investigación donde utilizó 70,32 g fango húmedo/planta en cada contenedor de 2,5 L de capacidad. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 32 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Figura 3-6. Esquema gráfico de la distribución aleatoria por especie vegetal y dosis de metales pesados añadidos. A la derecha de cada casilla se indica la especie vegetal L y R, lechuga y rábano respectivamente. (D0: dosis control; D2: dosis media; D4: dosis alta) 3.8. Determinación de biomasa Para estimar la biomasa de las plantas se determinó el peso fresco, peso seco y humedad (Eq. 3-1) de diferentes partes de la planta. En el caso de la lechuga, se trabajó con 1/4 del total de las hojas (parte aérea), y en el caso del rábano, se trabajó con todas las hojas (parte aérea) y 1/4 del bulbo de la planta (parte subterránea). (3-1) 33 Los investigadores del IDAEA-CSIC necesitaban tener la mayor cantidad de material vegetal, parte aérea de lechugas y parte subterránea de rábanos, para realizar sus analíticas para determinar los metales pesados de la biomasa. El peso fresco de cada muestra se toma en el momento de la cosecha utilizando una balanza Sartorius de 0,001 g de resolución y ± 0,0005 g de exactitud. Una vez son identificadas correctamente las muestras, se llevan al laboratorio de Producción Vegetal de ESAB para ponerlas en bandeja de aluminio y en estufa a 80 ºC hasta obtener peso constante (Fig. 3-7). El peso seco se determinó con una balanza Scaltec de 0,0001 g de resolución y ± 0,00005 g de exactitud. Figura 3-7. (A) Muestras de rábano correctamente etiquetadas, (B) hojas de rábano identificadas para desecar en estufa a 80 ºC, y (C) hojas de rábano después de estar en estufa durante 2 días A B C Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 34 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech 3.9. Crecimiento vegetal Para ver la evolución del crecimiento de las plantas se observaron los siguientes parámetros: (a) número de hojas y (b) medida de hoja más larga. Se obtuvieron datos durante 9 semanas y 4 semanas, lechuga y rábano respectivamente. La recopilación de datos es inferior en el caso del rábano porque decidimos esperar hasta que la planta germinara para descartar los brotes “innecesarios” y dejar sólo uno. Además, el ciclo de cultivo del rábano es inferior que el ciclo de cultivo de la lechuga. Así, los datos de rábano son a partir de 15 días desde la siembra de semillas y finalizan en la cuarta semana desde el inicio de toma de datos (Fig. 3-8). 04/03/19 18/03/19 08/04/19 Figura 3-8. (Izquierda) Semillas de rábano sembradas el primer día de experimento, (Centro) brotes de rábano al cabo de 2 semanas de la siembra, y (Derecha) planta de rábano en el momento de la cosecha a) Número de hojas Se cuentan las hojas desarrolladas tanto de lechuga como rábano. Para lechuga, el método más efectivo para contar es en forma de espiral empezando desde el centro de la planta y en dirección hacia el exterior de ésta. En lechuga, a partir de la semana 3, las hojas que presentan un tamaño inferior a 4 cm de longitud son descartadas como dato ese día. También las hojas que se sequen al inicio del experimento no se tienen en cuenta como dato. Los cotiledones se descartan en ambas especies para esta medida. 35 b) Longitud de hoja más larga Se miden las hojas exteriores de cada planta para determinar cual tiene mayor longitud. Para ello, se utiliza una cinta métrica flexible para medir desde la base del tallo hasta la punta de la hoja. Hace falta hacer 2-3 medidas en cada planta para determinar la hoja más larga cada día. 3.10. Determinación de lípidos y carbohidratos El análisis de carbohidratos y lípidos que se detalla a continuación, se lleva a cabo en las instalaciones del IDAEA-CSIC después de haber cultivado lechugas y rábanos. Las muestras de lechuga y rábano con las que se trabajó en este apartado se mantuvieron en congelación desde el día que fueron cosechadas y llevadas al laboratorio del IDAEA-CSIC. Para lechuga, se trabaja con la parte aérea de la planta (hojas) y para rábano, en este caso, con la parte subterránea de la planta (bulbo). Hay ligeras variaciones en el método que se detalla a continuación y que fue descrito por Margenat (2018) en su tesis doctoral. a) Preparación y extracción de lípidos y carbohidratos En primer lugar, se ponen 3 g (peso fresco) de material vegetal troceado en un tubo Falcon™ para desecarlo a 105 ºC en estufa durante 24 h; después se añaden 15 mL de etanol/hexano (1:1, v/v); después la muestra se somete a vibraciones sonoras durante 15 min y se centrifuga a 2500 rpm durante 15 min; entonces se utiliza un filtro de 0,22 μm de nylon para filtrar el sobrenadante a otro tubo de vidrio (Fig. 3-9) previamente pesado; y se seca el solvente con nitrógeno gas para finalmente pesar el filtro y el tubo. El contenido del filtro y el tubo se denominan carbohidratos y lípidos, respectivamente (Fig. 3-10). En el caso del rábano, se empieza con 1 g (peso fresco) y 5 mL de etanol/hexano (1:1, v/v), y a partir de aquí se sigue el mismo proceso anterior descrito. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 36 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Figura 3-9. Tubos de vidrio enumerados para ser pesados en balanza analítica Figura 3-10. (A) Peso de filtro de nylon en balanza analítica con resolución de 0,01 mg y exactitud ± 0,005 mg, y (B) ampliación de imagen A B 37 b) Cuantificación de lípidos y carbohidratos A continuación, se detallan las ecuaciones (3-2 y 3-3) necesarias para determinar el contenido de lípidos y carbohidratos en diferentes muestras de material vegetal: (3-2) (3-3) c) Adaptación del método empleado Como ya se mencionó al principio de este apartado, los investigadores del IDAEACSIC también estaban realizando experimentación con los cultivos objeto de este trabajo. Aunque sus resultados no influyen en la ejecución del mismo. En este método, se utilizaron tubos Falcon™ en lugar de tubos de vidrio para desecar la muestra fresca y someterla a vibraciones sonoras. También se utilizó una cantidad inferior de muestra en el caso de rábano (1 g peso fresco) debido a que investigadores del IDAEA-CSIC necesitan disponer del máximo material posible para analizar metales pesados en planta. 3.11. Determinación de clorofilas Para estimar las clorofilas a, b y totales de las plantas se utilizó el medidor OPTISCIENCES CCM-200 plus (Fig. 3-11). Este aparato mide la transmitancia en 2 longitudes de onda (653 nm y 931 nm) y calcula el CCI (chlorophyll content index) (Eq. 3-4) como valor relativo de clorofila. La exactitud que presenta es de ± 5% del valor relativo. Se hacen medidas por triplicado de 3 zonas diferenciadas de la hoja: exterior, media, e interior. Se obtienen 9 mediciones por planta en un total de 15 lechugas. En el caso del rábano, al tener las hojas más pequeñas, se hacen 3 mediciones en dos zonas: exterior e interior. Se obtienen 6 mediciones por planta en un total de 15 rábanos. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 38 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Figura 3-11. Medidor OPTI-SCIENCES CCM-200 plus utilizado para medir valor relativo de clorofila El valor absoluto de clorofila en cada planta se consigue mediante las líneas de tendencia que obtenemos de relacionar el CCI con la cantidad de clorofilas extraídas (mg/cm2) de una muestra. En el caso de la lechuga, utilizamos las líneas de tendencia (Eq. 3-5, 3-6 y 3-7) obtenidas por Nadal (2015) y con unidades (mg/cm2) donde (x) representa el valor de CCI. (3-4) Clorofilas a → (3-5) Clorofilas b → (3-6) Clorofilas totales → (3-7) 39 En el caso de rábanos, las líneas de tendencia, que relacionan los valores CCI con la cantidad extraída de clorofilas en una muestra, las obtenemos en un análisis posterior a este cultivo experimental. Se trabaja conjuntamente con otro estudiante de ESAB que está realizando experimentación con rábanos cultivados en parcela. A continuación, se detalla el proceso de extracción y cuantificación de clorofilas en muestras de hoja de rábano. Extracción de clorofilas Para la extracción de clorofilas en muestras de rábano, se seleccionan las hojas óptimas (coloración verde, sin partes secas, sin signos de ataque de plagas) de individuos adultos. Se mide el CCI de 30 plantas y se marca con un rotulador la superficie donde se hace la medición. Una vez recortadas estas muestras (30 en total), se identifican y llevan al laboratorio de la ESAB para realizar la extracción de clorofilas con 5 mL de N,N’-dimetilformamida (DMF) en tubos de vidrio y área foliar aproximada de 1,77 cm2. Estos tubos se mantienen en condiciones de oscuridad y refrigerados a 4 ºC durante 48 h (Inskeep & Bloom, 1985). Cuantificación de clorofilas extraídas Una vez extraídas las clorofilas, se procede a medir la absorbancia de cada muestra a 647 nm y 664,5 nm con un espectrofotómetro. Las clorofilas (a, b y totales) se pueden calcular con los coeficientes de Inskeep & Bloom (1985) (Tabla 3-7). Tabla 3-7. Ecuaciones simultaneas para cuantificar clorofilas en tejido vegetal a partir de absorbancias y en cubeta de 1 cm Solvente Ecuaciones para concentración de clorofila (mg/L) DMF Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 40 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech 3.12. Tratamiento estadístico Se realizó un tratamiento estadístico de los resultados estimados de biomasa de cada especie según correspondiera (parte aérea o subterránea) y contenido de lípidos y carbohidratos. También se analizaron los resultados de clorofilas, y longitud de hoja más larga, número de hojas y diámetro medio. Se utilizó el programa Minitab ® 18 para hacer un análisis de la varianza (ANOVA). Se utilizó el método de Tukey para analizar los promedios cuando había igualdad de varianzas, y por el contrario se utilizó el método de Games-Howell para analizar los promedios cuando no había igualdad de las varianzas. Se estableció un nivel de significancia del 5% para observar si había diferencias significativas en los resultados obtenidos dependiendo de la dosis utilizada. Todas las figuras del apartado de resultados representan el valor promedio ± intervalo de confianza del 95%. 41 Resultados Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 48 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Las plantas de lechuga con dosis D2 presentaron un una longitud de hoja de 14,4 cm. Los resultados obtenidos de longitud de hoja, en general, son superiores a 13 g en todos las dosis de metales sin diferencias significativas (p=0,099) (Fig. 4-6). Respecto al número total de hojas, las plantas con dosis D0 y D4 presentaron valores similares de 26 hojas, y de 24,6 hojas en plantas tratadas con dosis D2. Las diferencias no son significativas para ninguno de los dos parámetros (Tabla 4-3). Figura 4-6. Resultados de (A) longitud de hojas más larga (cm) y (B) número total de hojas en lechuga según dosis aplicada de metales pesados Tabla 4-3. Resultados de la determinación de hoja más larga y número de hojas totales en cultivo de lechuga según dosis aplicada de metales pesados. Valores promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Longitud de hoja más larga (cm) Número total de hojas D0 13,80 ± 0,27 a 26,00 ± 2,55 a D2 14,40 ± 0,42 a 24,60 ± 2,88 a D4 13,90 ± 1,19 a 26,00 ± 1,87 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. D4D2D0 16 15 14 13 12 11 10 Dosis Longitud de hoja (cm) D4D2D0 30 25 20 15 10 Dosis Numero de hojas A B 49 4.2.2. Longitud y número de hojas en rábano En cuanto a longitud de la hoja más larga, podemos observar que las plantas con dosis D0 tienen un valor promedio superior a las plantas de dosis D2 durante las 3 primeras semanas (Fig. 4-7-A). En la última semana de cultivo, se aprecia que las plantas de dosis media (D2) y alta (D4) tienen longitudes de hoja más largas que plantas con dosis nula (D0) aunque no presenta una diferencia significativa. Los rábanos tratados con dosis D0, presentan un mayor número de hojas durante todo el periodo (semana 0 – semana 3) respecto a plantas tratadas con dosis D0 y D4 (Fig. 4-7-B). Así mismo, se aprecia que plantas con dosis D2 y D4 tienen valores similares desde la semana 1 hasta la semana 3 que marca el fin del cultivo y día de cosecha. Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 50 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech El tratamiento estadístico de resultados de este apartado (Tabla 4-4), tan sólo se hizo de los datos recogidos de la última semana (semana 3). Figura 4-7. Representación de la evolución de (A) longitud de hoja más larga y (B) número total de hojas en rábano según dosis aplicada de metales pesados 8 10 12 14 16 18 Semana0 Semana1 Semana2 Semana3 Longitud de hoja (cm) D0 D2 D4 0 2 4 6 8 Semana0 Semana1 Semana2 Semana3 Número de hojas D0 D2 D4 A B 51 A continuación, observamos que los rábanos tratados con diferentes dosis (D0, D2 y D4) no resultan en un aumento o deficiencia del crecimiento. (Fig. 4-8). Los rábanos tratados con dosis D0, tienen un valor promedio de 16 cm de longitud de hoja. Este valor es inferior a los 16,7 cm que tienen plantas con dosis D2 y D4, pero no resulta en una diferencia significativa. Respecto al número de hojas, los rábanos tienen un promedio superior a 6 hojas en todos los tratamientos. No se encuentran diferencias significativas (Tabla 4-4). Figura 4-8. Resultados de (A) longitud de hojas más larga (cm) y (B) número total de hojas en rábano según dosis aplicada de metales pesados Tabla 4-4. Resultados de la determinación de hoja más larga y número de hojas totales en cultivo de rábano según dosis aplicada de metales pesados. Valores promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Longitud de hoja más larga (cm) Número total de hojas D0 15,90 ± 1,03 a 7,00 ± 1,00 a D2 16,70 ± 0,98 a 6,60 ± 0,55 a D4 16,70 ± 1,3 a 6,60 ± 0,55 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. D4D2D0 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 Dosis Longitud de hoja (cm) D4D2D0 8 7 6 5 4 Dosis Numero de hojas A B Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 52 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech 4.3. Contenido de lípidos y carbohidratos Lechuga Las plantas tratadas con dosis D4 tienen un valor promedio de lípidos de 0,3356 %. Aunque las plantas con dosis D0 y D2 tienen un valor inferior a 0,3 %, esta no resulta ser una diferencia significativa (p>0,05). En cuanto a carbohidratos, observamos que los resultados de plantas ofrecen un valor aproximado de 0,05 % (Fig. 4-9). No obtenemos diferencias significativas (p>0,05) en contenido de lípidos y carbohidratos en muestras de lechuga (Tabla 4-5). Figura 4-9. Contenido de (A) lípidos (%) y (B) carbohidratos (%) en lechuga según dosis aplicada de metales pesados Tabla 4-5. Resultados de la determinación de lípidos y carbohidratos en hojas de lechuga según dosis aplicada de metales pesados. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Lípidos (%) Carbohidratos (%) D0 0,2725 ± 0,0329 a 0,05467 ± 0,02110 a D2 0,2642 ± 0,0445 a 0,05006 ± 0,01878 a D4 0,3356 ± 0,1385 a 0,04906 ± 0,01203 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. D4D2D0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Dosis Lipidos (%) D4D2D0 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 Dosis Carbohidratos (%) A B 53 Rábano Las plantas de rábano tratadas con dosis D0 y D4 tienen un contenido de lípidos inferior al 0,10 % (Fig. 4-10-A). Y aunque las plantas con dosis D2 tienen un valor superior, esta diferencia no resulta ser significativa (p>0,05). Respecto a carbohidratos, se observa que el promedio general de las muestras se sitúa alrededor de 0,06 % (Fig. 4-10-B). En la tabla 4-6 se detalla la comparación de promedios de lípidos y carbohidratos. No se encuentran diferencias significativas en este apartado. Figura 4-10. Contenido de (A) lípidos (%) y (B) carbohidratos (%) en rábano según dosis aplicada de metales pesados Tabla 4-6. Resultados de la determinación de lípidos y carbohidratos en bulbo de rábano según dosis aplicada de metales pesados. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Lípidos (%) Carbohidratos (%) D0 0,0745 ± 0,0148 a 0,0575 ± 0,0124 a D2 0,1069 ± 0,0758 a 0,0573 ± 0,0183 a D4 0,0701 ± 0,0049 a 0,0682 ± 0,0208 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. D4D2D0 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Dosis Lipidos (%) D4D2D0 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Dosis Carbohidratos (%) A B Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 54 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech 4.4. Composición de clorofilas 4.4.1. Estimación de la composición de clorofilas en lechuga según dosis aplicada En todos los casos, la cuantificación de clorofilas a, b y totales resulta en valores similares en plantas con diferentes dosis (D0, D2 y D4) alrededor de 0,015 mg/cm2 para clorofilas a (Fig. 4-11). Para clorofilas b, el promedio de todas las muestras se sitúa con valores superiores a 0,004 mg/cm2. El análisis estadístico de este apartado no revela diferencias significativas respecto al contenido de clorofilas en lechugas, valor p>0,05 en todos los casos (Tabla 4-7). Figura 4-11. Resultados de (A) clorofilas a (mg/cm2), (B) clorofilas b (mg/cm2) y (C) clorofilas totales (mg/cm2) en lechuga según dosis aplicada de metales pesados D4D2D0 0,017 0,014 0,011 0,008 0,005 0,002 Dosis Clorofila a (mg/cm2) D4D2D0 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 Dosis Clorofila b (mg/cm2) D4D2D0 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 Dosis Clorofila total (mg/cm2) A B C 55 Tabla 4-7. Resultados de la determinación de clorofilas a, b y totales en lechuga según la dosis de metales pesados añadida. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Clorofilas a (mg/cm2) Clorofilas b (mg/cm2) Clorofilas totales (mg/cm2) D0 0,01467 ± 0,004864 a 0,00431 ± 0,001405 a 0,01898 ± 0,006269 a D2 0,01537 ± 0,004779 a 0,00451 ± 0,001381 a 0,01988 ± 0,006159 a D4 0,01544 ± 0,004503 a 0,00453 ± 0,001301 a 0,01997 ± 0,005804 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. 4.4.2. Estimación de la composición de clorofilas en lechuga según posición de la hoja A continuación, se observa que el contenido global de clorofilas, dependiendo del nivel en que se encuentra la hoja (exterior, medio e interior), disminuye a medida que la hoja está más al interior. Esta diferencia es casi el doble cuando se comparan nivel exterior e interior (Fig. 4-12). Según análisis estadístico, estas diferencias son significativas en todas las clorofilas a, b y totales (P<0,05 en todos los casos). Figura 4-12. Resultados de (A) clorofilas a (mg/cm2), (B) clorofilas b (mg/cm2) y (C) clorofilas totales (mg/cm2) en lechuga según dosis aplicada y posición exterior InteriorMedioExterior 0,0200 0,0175 0,0150 0,0125 0,0100 0,0075 0,0050 Posicion de hoja Clorofila a (mg/cm2) InteriorMedioExterior 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 Posicion de hoja Clorofila b (mg/cm2) InteriorMedioExterior 0,026 0,024 0,022 0,020 0,018 0,016 0,014 0,012 0,010 Posicion de hoja Clorofila total (mg/cm2) A B C Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 56 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Las tablas 4-8, 4-9 y 4-10, muestran el contenido de clorofilas a, b y totales según nivel de la hoja y dosis de metales pesados. No se observan diferencias en contenido de clorofilas en diferentes niveles de hoja y dosis de metales. Tabla 4-8. Resultados de la determinación de clorofilas a en lechuga según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Clorofilas a (mg/cm2) Exterior Medio Interior D0 0,01851 ± 0,00238 a 0,01635 ± 0,00303 a 0,00914 ± 0,00282 a D2 0,01947 ± 0,00189 a 0,01703 ± 0,00179 a 0,00960 ± 0,00287 a D4 0,01888 ± 0,00267 a 0,01681 ± 0,00217 a 0,01062 ± 0,00351 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. Tabla 4-9. Resultados de la determinación de clorofilas b en lechuga según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Clorofilas b (mg/cm2) Exterior Medio Interior D0 0,00542 ± 0,00069 a 0,00480 ± 0,00087 a 0,00272 ± 0,00082 a D2 0,00570 ± 0,00055 a 0,00499 ± 0,00052 a 0,00285 ± 0,00083 a D4 0,00553 ± 0,00077 a 0,00493 ± 0,00063 a 0,00314 ± 0,00010 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes. 57 Tabla 4-10. Resultados de la determinación de clorofilas totales en lechuga según la dosis de metales pesados añadida y posición en la hoja. Valor promedio ± desviación estándar, y nivel de significancia del 5% Dosis Clorofilas totales (mg/cm2) Exterior Medio Interior D0 0,02394 ± 0,00306 a 0,02115 ± 0,00390 a 0,01186 ± 0,00364 a D2 0,02518 ± 0,00244 a 0,02202 ± 0,00230 a 0,01244 ± 0,00370 a D4 0,02440 ± 0,00344 a 0,02174 ± 0,00279 a 0,01376 ± 0,00452 a Los promedios con la misma letra no son significativamente diferentes 4.4.3. Estimación de la composición de clorofilas en rábano según dosis aplicada A continuación, se detallan las ecuaciones (4-1, 4-2, y 4-3) de las líneas de tendencia obtenidas de relacionar el valor relativo de clorofila (CCI) (también (x) en las ecuaciones) y la cantidad de clorofila extraída del tejido vegetal (mg/cm2). Clorofilas a → (4-1) Clorofilas b → (4-2) Clorofilas totales → (4-3) Se aprecia que los resultados en contenido de clorofilas son inferiores en plantas con dosis media (D2) respecto a las otras plantas de dosis control y dosis alta, D0 y D4 respectivamente (Fig. 4-13). Plantas con dosis D0 y D4, tienen valores muy similares en la composición de las clorofilas a, b y totales con valores de 0,025; 0,007 y 0,031 mg/cm2, respectivamente. Las plantas tratadas con dosis D2, resultan en valores de 0,020; 0,005 y 0,026 mg/cm2 para clorofilas a, b y total, respectivamente. Estas diferencias resultan ser inferiores significativamente (p=0,001 en todos los contenidos de clorofilas) (Tabla 4-11). Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 64 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech promedios de peso seco de plantas tratadas con dosis D2, están al límite de la significancia de ser inferiores a plantas con dosis D4 y D0 (p=0,051). En cuanto al contenido de clorofila, la dosis D2 parece tener un efecto negativo en los rábanos ya que obtuvimos valores inferiores respecto a plantas con dosis D4 y D0. Reichman (2002) expone que plantas en contacto con altas dosis de Cu pueden provocar una reducción de contenido en clorofila en plantas pero no así en biomasa. Esta deficiencia de contenido en clorofila, también puede resultar de la competencia que tienen los iones de Cu y Fe en la raíz de la planta y que resulta en la menor absorción de Fe (Pätsikkä et al., 2002). En la investigación realizada por Ebbs & Kochian (1997) obtienen que las concentraciones de Fe y Mn en planta son inferiores cuando la planta está expuesta a concentraciones de 6,5 y 0,32 mg/L de Zn y Cu, respectivamente. 65 Conclusiones Efecto de la presencia de metales pesados (Zn y Cu) en el desarrollo y contenido de lípidos, azúcares y clorofilas en cultivo de hortalizas 66 Escuela Superior de Agricultura de Barcelona UPC – BarcelonaTech Conclusiones Las principales conclusiones de este trabajo son:  El cultivo de lechugas no refleja un efecto tóxico de los metales pesados añadidos en diferentes dosis. La biomasa, el contenido de clorofilas y lípidos y carbohidratos no se vieron afectados por la adición de metales.  En cuanto a los rábanos, no se vio afectada significativamente la biomasa aérea (hojas) y subterránea (bulbo) de las plantas con ninguna de las dosis de metales añadidas.  El contenido de clorofilas de los rábanos se vio reducido en plantas tratadas con dosis media (D2) de metales pesados. Las plantas tratadas con dosis D0 y D4 presentan valores similares de clorofilas a, b y totales.  En general, el cultivo de hortalizas no presentó síntomas externos de toxicidad como clorosis o mayor senescencia de hojas. 67 Referencias Alvarado, A. (2020). Efecto de la incorporación de diferentes abonos orgánicos en el desarrollo y contenido en lípidos, azúcares y clorofilas en cultivos de hortalizas (Trabajo final de grado). Universitat Politècnica de Catalunya. http://hdl.handle.net/2117/178013 Alves, L., Reis, A., Gratão, P. (2016). 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