Empleo del colirio de suero autólogo en el tratamiento de la enfermedad del ojo seco

PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA SALUD TESIS DOCTORAL: EMPLEO DEL COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DEL OJO SECO Presentada por SANDRA LILIANA VALENCIA CASTILLO para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid Dirigida por: FRANCISCO MINAYA MARTINEZ FRANCISCO JAVIER GARCIA MIGUEL D. Francisco Minaya Martínez, Doctor en Medicina y Cirugía por la Universidad de Málaga y Facultativo Especialista en Oftalmología del Hospital General, Complejo Hospitalario de Segovia, como codirector de la tesis doctoral de Doña Sandra Liliana Valencia Castillo, alumna del Programa de Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud de la Universidad de Valladolid, informa favorablemente la solicitud de autorización para el depósito de la tesis doctoral de Doña Sandra Liliana Valencia Castillo, titulada “EMPLEO DEL COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DEL OJO SECO”, desarrollada de acuerdo con los requisitos exigibles en un trabajo de investigación en el ámbito médico. Asimismo certifica que la mencionada tesis responde a la adecuación del resultado de la investigación al proyecto presentado en su momento, al desarrollo del proceso de formación doctoral del doctorando y a la oportunidad y elaboración metodológica de los resultados de la investigación que figuran en la misma. Por todo ello, el abajo firmante encuentra dicha tesis doctoral APTA para ser presentada y defendida en sesión pública ante el Tribunal que a tal efecto se designe. Segovia, a 27 de Agosto de dos mil diecinueve. Fdo. Dr. Francisco Minaya Martínez D. Francisco Javier García Miguel, Doctor en Medicina y Cirugía por la Universidad Autónoma de Madrid, Diplomado Europeo de Anestesiología, Reanimación y Cuidados Críticos y Jefe de Servicio de Anestesiología y Reanimación del Complejo Asistencial de Segovia CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral titulada “EMPLEO DEL COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DEL OJO SECO” ha sido realizada bajo su dirección y supervisión por Dª. Sandra Liliana Valencia Castillo. La elaboración de la presente Tesis Doctoral cumple el desarrollo metodológico de un trabajo de Investigación en el ámbito médico. Presenta una revisión bibliográfica exhaustiva del tema en la introducción, plantea la hipótesis de trabajo a demostrar que se desarrolla perfectamente y analiza en el material y métodos y análisis estadístico, y finalmente las conclusiones o tesis es adecuadamente derivado del trabajo desarrollado previamente Una vez redactada, el presente trabajo ha sido examinado por el que suscribe, encontrándola APTA para ser presentada y defendida en sesión pública ante el Tribunal que a tal efecto se designe. Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Segovia a dieciséis de agosto de dos mil diecinueve. Segovia a 16 de Agosto de 2019 Fdo: Dr. Francisco Javier García Miguel A mis hijos: Daniel, Maria, Laura y Lucía. A mi esposo Javier, mis padres y hermanos. AGRADECIMIENTOS En primer lugar quiero agradecer a Dios por permitirme finalizar esta Tesis Doctoral. También quisiera mostrar mi más sincero agradecimiento, a todas las personas que han contribuido de uno u otro modo en la elaboración, desarrollo y finalización de esta Tesis Doctoral. A mi esposo Dr. Francisco Javier Garcia Miguel, por su infinita paciencia, apoyo y motivación continua e incondicional prestada en el desarrollo de este trabajo, sin la cual no hubiera sido posible la realización del mismo. A mi tutor de tesis, el profesor Javier García Frade por su cercanía y ayuda mostrados desde el inicio. Al Dr. Francisco Minaya Martínez por su apoyo desde el primer día que me escuchó hablar del estudio, y por sus sabios consejos y tiempo dedicado. A mis hijos Daniel, María Laura y Lucía, por las horas de compañía cedidas para la realización de cursos, sesiones científicas y finalización de esta Tesis Doctoral. A Almudena Carneros, por su dedicación, paciencia y por estar disponible a cualquier hora y por todos sus consejos. Al Dr. Dayro Gutiérrez, por la ayuda recibida en el estudio estadístico de esta Tesis Doctoral. A Raúl Gonzalo Gala por su ayuda y colaboración en la maquetación de esta Tesis Doctoral. Al Departamento de Anatomía Patológica, por la ayuda recibida en las tinciones de las muestras recogidas en este estudio y estar siempre disponibles a solucionar cualquier duda respecto a las mismas. A las Dras Esther Saez Martín y Gisela Benancio, por la ayuda prestada en la valoración de los pacientes y en la toma de las muestras mediante la citología de impresión conjuntival por transferencia y su disposición continua durante todo el desarrollo de este trabajo, sin la cual no hubiera sido posible la realización del mismo. Al Dr Miguel Angel Calle, por su motivación inicial, por facilitarme bibliografía y por indicarme el asesor más adecuado para el desarrollo de esta tesis doctoral. Al Servicio de Farmacia Hospitalaria, en especial a María Dolores Ruiz Ruíz, por facilitarme la recogida de datos y por resolverme cuantas dudas me han surgido a lo largo de la realización de la Tesis A la enfermera Pilar Carrera Esteras por su ayuda y disposición en la toma de muestras de sangre necesarias, para la realización del suero autólogo. A las enfermeras del Banco de Sangre, en especial Sofía, por haberme echado una mano siempre que lo he necesitado. A Francisco Javier Iglesias Muñoz, por su ayuda incondicional, su apoyo y por todos sus consejos. A todos los pacientes que decidieron participar en este estudio, lo cual me ha permitido elaborar, desarrollar y finalizar esta Tesis Doctoral. A todos mis compañeros del Servicio de Hematología y Hemoterapia del Complejo Asistencial de Segovia, tanto a los que participaron en mi formación, como con los que hoy en día comparto mi actividad. En último lugar y como apoyo más importante, durante tantas horas de trabajo a pesar de la distancia, a mis padres y hermanos. ¡Gracias por estar siempre ahí!. “Sólo aquellos que se arriesgan a ir muy lejos, pueden llegar a saber lo lejos que pueden ir.” T.S.Elliot Í N D I C E DE CONTENIDOS I. RESUMEN ..........................................................................................................XII I. SUMMARY.........................................................................................................XIV ÍNDICE DE TABLAS ..................................................................................................XV ÍNDICE DE FIGURAS ..............................................................................................XVII ÍNDICE DE ABREVIATURAS ...................................................................................XIX II. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1 2.1 FUNDAMENTOS DE LA MEDICINA REGENERATIVA ......................................................1 2.2 ESTRATEGIAS DE LA MEDICINA REGENERATIVA ..........................................................4 2.2.1 INDUCCIÓN QUÍMICA O BIOLÓGICA..........................................................................................4 2.2.2 TRASPLANTES CELULARES..........................................................................................................5 2.2.3 TRASPLANTE DE TEJIDOS Y ÓRGANOS ARTIFICIALES .................................................................6 2.3 MEDICINA REGENERATIVA EN OFTALMOLOGÍA ..........................................................8 2.3.1 DEFECTOS EPITELIALES PERSISTENTES (DEP) PRODUCIDOS POR DIVERSAS ETIOLOGÍAS..........8 2.3.2 MANEJO DE LA QUERATOPATÍA NEUROTRÓFICA......................................................................8 2.3.3 EROSIONES CORNEALES RECURRENTES.....................................................................................8 2.3.4 CIRUGÍAS DE RECONSTRUCCIÓN ...............................................................................................9 2.3.5 AGUJERO MACULAR RETINIANO................................................................................................9 2.3.6 COMPLICACIONES POSTOPERATORIAS DE LA CIRUGÍA FILTRANTE DEL GLAUCOMA...............9 2.3.7 POSTOPERATORIO DE PACIENTES CON PTERIGION...................................................................9 2.3.8 TRATAMIENTO DE LA QUERATOPATÍA ASOCIADA A LA ANIRIDIA.......................................9 2.3.9 MANEJO DEL OJO SECO ASOCIADO A ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUÉSPED (EICH) .....10 2.4 ENFERMEDAD DEL OJO SECO (DED) ..........................................................................10 2.4.1 COMPOSICIÓN Y FUNCIONES DE LA LÁGRIMA ........................................................................13 2.4.2 CLASIFICACIÓN DE LA DED.......................................................................................................15 2.4.3 DIAGNÓSTICO DE LA DED ........................................................................................................19 2.4.4 TRATAMIENTO DE LA DED .......................................................................................................25 2.5 SUERO AUTÓLOGO. PROPIEDADES EN EL TRATAMIENTO DE LA DED..........................26 2.5.1 DEFINICIÓN Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DEL SA ..........................................................26 2.6 EFECTOS CLÍNICOS DEL COLIRIO DE SA EN EL TRATAMIENTO DE LA DED ....................37 2.6.1 EFECTOS SOBRE EL EPITELIO....................................................................................................37 2.6.2 EFECTOS DEL SUERO AUTÓLOGO SOBRE LAS MUCINAS (MUC) ..............................................37 2.6.3 EFECTOS SOBRE LA METAPLASIA ESCAMOSA..........................................................................39 2.6.4 EFECTOS SOBRE LA ESTABILIDAD DE LA PELÍCULA LAGRIMAL ................................................40 2.6.5 EFECTOS SOBRE EL TEST DE SCHIRMER Y EL TEST DE BUT.......................................................40 2.6.6 EFECTOS BACTERICIDAS...........................................................................................................41 III. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO............................................................................. 43 IV. HIPÓTESIS DE TRABAJO ..................................................................................... 46 V. OBJETIVOS ......................................................................................................... 48 5.1 OBJETIVOS PRINCIPALES...........................................................................................48 5.2 OBJETIVOS SECUNDARIOS........................................................................................48 VI. MATERIAL Y MÉTODOS...................................................................................... 50 6.1 TIPO DE ESTUDIO .....................................................................................................50 6.2 POBLACIÓN DIANA...................................................................................................51 6.3 ESTIMACIÓN DEL TAMAÑO MUESTRAL.....................................................................52 6.4 VARIABLES DE ESTUDIO............................................................................................53 6.5 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS ................................................................................54 6.5.1 RECOGIDA DE LAS MUESTRAS DE CONJUNTIVA......................................................................54 6.6 EXTRACCIÓN DE LA SANGRE, OBTENCIÓN DEL SUERO Y PREPARACION DEL COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO ........................................................................................................57 6.7 DISPENSACIÓN Y POSOLOGÍA...................................................................................62 6.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.............................................................................................64 6.9 CONSIDERACIONES ÉTICAS Y CONFIDENCIALIDAD DE DATOS.....................................66 VII. RESULTADOS .................................................................................................... 68 7.1 RESULTADOS DEL ANÁLISIS DESCRIPTIVO .................................................................68 7.1.1 GÉNERO....................................................................................................................................68 7.1.2 EDAD ........................................................................................................................................69 7.1.3 CLASIFICACIÓN DE LA GRAVEDAD DE LA DED..........................................................................70 7.1.4 PATOLOGÍA ASOCIADA ............................................................................................................71 7.2 RESULTADOS DEL ANÁLSIS COMPARATIVO...............................................................72 7.2.1 COMPARACIÓN DE MEDIAS DE LAS VARIABLES CUANTITATIVAS............................................72 7.2.2 COMPARACIÓN DE PORCENTAJES DE LAS VARIABLES CUALITATIVAS.....................................79 7.3 RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE CORRELACIÓN...........................................................80 7.4 RESULTADOS DEL ANÁLISIS MULTIVARIANTE. REGRESIÓN LINEAL MÚLTIPLE (RLM) ...85 VIII. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 89 8.1 DISCUSIÓN DE LA POBLACION DEL ESTUDIO .............................................................89 8.2 DISCUSION DEL ESTUDIO COMPARATIVO..................................................................91 8.2.1 VARIACIÓN EN LA CITOLOGÍA DE IMPRESIÓN CONJUNTIVAL POR TRANSFERENCIA .......91 8.2.2 CAMBIOS EN LOS TESTS DIAGNÓSTICOS DE SCHIRMER Y BUT................................................92 8.3 DISCUSIÓN DEL ESTUDIO ANALÍTICO........................................................................93 8.3.1 DISCUSIÓN DEL ANÁLISIS DE CORRELACIÓN............................................................................93 8.3.2 DISCUSIÓN DEL ANÁLISIS MULTIVARIANTE .............................................................................93 8.4 DISCUSIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON COLIRIO DE SA........................93 8.5 DISCUSIÓN DE LA PREPARACIÓN DEL COLIRIO DE SA.................................................95 8.6 NUEVAS PERSPECTIVAS DE TRATAMIENTO DE LA DED.............................................105 8.6.1 COLIRIO DE SUERO HETERÓLOGO (SH)..................................................................................105 8.6.2 COLIRIO DE PRP......................................................................................................................105 8.6.3 COLIRIO DE PRGF ...................................................................................................................106 8.6.4 COLIRIO DE SCU .....................................................................................................................108 8.6.5 COLIRIO DE MEMBRANA AMNIÓTICA (MA)...........................................................................108 8.6.6 PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................................................................108 8.7 LIMITACIONES DEL ESTUDIO...................................................................................110 IX. CONCLUSIONES................................................................................................ 112 X. BIBLIOGRAFIA................................................................................................... 114 XI. DIVULGACIÓN CIENTÍFICA RELACIONADA CON EL ESTUDIO .............................. 122 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN OJO SECO TABLAS XVI caliciformes antes del tratamiento y resto de variables obtenidas en la citología de impresión conjuntival por transferencia después del tratamiento Tabla XVII. Modelo de regresión lineal múltiple obtenido con las variables de la citología de impresión conjuntival por transferencia después del tratamiento con colirio de suero autólogo 87 Tabla XVIII. Variaciones en las distintas fases de elaboración, dispensación y almacenaje del colirio de suero autólogo 101 Tabla XIX. Diferencias en cuanto a metodología de elaboración y dispensación del colirio de suero autólogo en diferentes publicaciones 101 Tabla XX. Ensayos clínicos investigando el empleo del colirio de suero autólogo en el tratamiento de la enfermedad del ojo seco 102 Tabla XXI. Concentraciones de los principales factores de crecimiento y proteínas de adhesión en voluntarios sanos entre suero autólogo, plasma rico en plaquetas y plasma rico en factores de crecimiento 107 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN OJO SECO FIGURAS XVII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de los mecanismos de restauración tisular 2 Figura 2. Capas de la lágrima 13 Figura 3. Anatomía del aparato lagrimal 14 Figura 4. Clasificación de la enfermedad del ojo seco 16 Figura 5. Pruebas de diagnóstico de la enfermedad del ojo seco 20 Figuras 6-11. Pasos para la realización de la citología de impresión conjuntival por transferencia 56-57 Figuras 12-34. Diferentes momentos del proceso de realización del colirio de suero autólogo en el Complejo Asistencial de Segovia 58-62 Figura 35. Distribución de los pacientes según el género 68 Figura 36. Histograma de la distribución de la edad de los pacientes 69 Figura 37. Clasificación clínica de la enfermedad del ojo seco de los pacientes del estudio 70 Figura 38. Patología asociada a la enfermedad del ojo seco de los pacientes del estudio 71 Figura 39. Variación del número de células caliciformes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 73 Figura 40. Variación de la media de células calicifrmes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 73 Figura 41. Variación del tamaño de las células caliciformes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 74 Figura 42. Comparación del tamaño de las células caiciformes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 74 Figura 43. Variación del tamaño del núcleo de las células caliciformes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 75 Figura 44. Comparación del tamaño del núcleo de las células caliciformes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 75 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN OJO SECO FIGURAS XVIII Figura 45. Cambios histológicos en la citología de impresión conjuntival por transferencia en algunos pacientes antes y después del tratamiento con colirio de suero autólogo 76-77 Figura 46. Variación en la media del número de células caliciformes tras el tratamiento con suero autólogo según el número basal de células caliciformes obtenidad por citología de impresión conjuntival por transferencia 78 Figura 47. Correlación entre la variable principal (número de células caliciformes) y el resto de covariables 82-83 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN OJO SECO ABREVIATURAS XIX ÍNDICE DE ABREVIATURAS • AR: Artritis Reumatoide • BMP: Proteínas Morfogenéticas del Hueso • BSS: Suero Salino Balanceado • BUT: Tiempo de Ruptura de la Película Lagrimal • DED: Enfermedad del Ojo Seco (Dry Eye Disease) • DEP: Defectos Epiteliales Persistentes • DEWS: Dry Eye WorkShop • DHA: Ácido Docosahexaenoico • EGF: Factor de Crecimiento Epitelial • EICH: Enfermedad Injerto Contra Huésped • FC: Factores de Crecimiento • FDA: Food and Drug Administration • FGF: Factor de Crecimiento de Fibroblastos • FGFR1: Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos 1 • FR: Factor Reumatoide • GESOC: Grupo Español de Superficie Ocular y Córnea • IC: Intervalo de Confianza • IG: Inmunoglobulinas • IGF-1: Factor de Crecimiento Insulina Tipo 1 • IL: Interleuquina • MA: Membrana Amniótica • MR: Medicina Regenerativa • NGF: Factor de Crecimiento Neuronal COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN OJO SECO ABREVIATURAS XX • OSDI: Ocular Surface Disease Index • PAS: Ácido Peryódico de Schif • PDGF: Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas • PRGF: Plasma Rico en Factores de Crecimiento • PRP: Plasma Rico en Plaquetas • RLM: Regresión Lineal Múltiple • RPM: Revoluciones Por Minuto • SA: Suero Autólogo • SCU: Suero de Cordón Umbilical • SH: Suero Heterólogo • SS: Síndrome de Sjögren • TGF-β: Factor de Crecimiento Transformante Beta • α-SMA: Actina α del Músculo Liso II. INTRODUCCIÓN COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 1 II. INTRODUCCIÓN La Medicina Regenerativa (MR) es una rama de la Medicina que tiene como objetivo generar estrategias terapéuticas destinadas a restaurar la función de los órganos y/o tejidos. Supone una nueva forma de terapia para pacientes con enfermedades agudas o crónicas en la función tisular. 1,2 La trascendencia de esta nueva forma de terapia ha sobrepasado los límites del debate científico y ha generado un importante debate ético y mediático, que ha llevado a las autoridades gubernamentales a legislar su contenido y ámbito de aplicación. Actualmente, estas normas se recogen en el Real Decreto-ley 9/2014, de 4 de julio, por el que se establecen las normas de calidad y seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos. (BOE» núm. 163, de 05/07/2014). 2.1 FUNDAMENTOS DE LA MEDICINA REGENERATIVA La MR está basada en la simulación de los mecanismos biológicos necesarios para la regeneración tisular. Estos mecanismos son intrínsecos a los tejidos y su conocimiento es básico para el desarrollo de este tipo de terapias, precisando del esfuerzo conjunto de profesionales pertenecientes a varias disciplinas como Medicina, Biología, Química, Ingeniería, etc. Ante una agresión o pérdida tisular, el organismo va a responder con un proceso de restauración del tejido afectado. Esta restauración puede dar como resultado un tejido original, proceso conocido como reparación o, por el contrario, la restauración puede originar un tejido similar al original, denominándose en este caso regeneración (figura 1). Las técnicas de MR van encaminadas a procurar la regeneración tisular guiada. La capacidad de regeneración es intrínseca al propio tejido y sus mecanismos son similares en casi todos ellos, precisando unos sistemas de anclaje, que sirven de guía a las células, y de unas señales reguladoras del metabolismo que forman parte del denominado microambiente tisular y que controlan los procesos de COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 2 proliferación, diferenciación y migración celular así como la formación de matriz extracelular. Tratamiento regenerativo AGRESIÓN O PÉRDIDA DE SUSTANCIA  RESTAURACIÓN DEL TEJIDO AFECTADO Te jido con distinta Tejido similar al Arquitectura y función original REPARACIÓN REGENERACIÓN Figura 1. Esquema de los mecanismos de restauración tisular. Fisiológicamente existen tres mecanismos de regeneración tisular:  Hiperplasia compensadora, mediante el aumento de la mitosis celular, para mantener o restaurar la masa tisular.  Activación de las células madre, mediante la producción, maduración y diferenciación de las células progenitoras; como es el caso de los epitelios, los endotelios, el tejido conectivo y las células hematopoyéticas.  Producción de células madre por desdiferenciación de células adultas, mecanismo por el cual las células adultas pierden sus características fenotípicas y se transforman en células madre, recuperando parte del potencial biológico que tenían previamente. Estos mecanismos de desdiferenciación celular están íntimamente relacionados con los mecanismos que promueven la oncogénesis, jugando el factor p53 un importante papel en ambos procesos y siendo este carácter oncogénico el principal factor limitante para la utilización clínica de estas células 3 . Los fibroblastos juegan un papel primordial en los procesos de reparación tisular. Los fibroblastos son las células más comunes y menos especializadas del tejido conectivo. Su gran capacidad para diferenciarse a COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 3 otros fenotipos celulares más especializados ha sido ampliamente utilizada en MR. 3,4 Los fibroblastos son los responsables de la formación de la matriz extracelular, una estructura imprescindible para mantener la integridad del tejido conectivo y que proporciona un soporte, en forma de entramado, que resulta fundamental en la reparación de las heridas. Estas células sintetizan todos los elementos que integran la matriz extracelular, como colágeno (sobre todo las fibras de colágeno tipo I), proteoglicanos y glucosaminoglicanos de la sustancia amorfa, proteínas fibrosas como la fibronectina y laminina, y fibras elásticas como la elastina. Los fibroblastos tienen una gran importancia durante la cicatrización y reparación de las heridas al migrar hacia la zona lesionada y proliferar, aumentando la producción de matriz extracelular para reparar el defecto tisular. Se trata de células morfológicamente muy heterogéneas según su localización y actividad. Podemos distinguir varios tipos o estados de diferenciación, que son regulados por señales específicas del microambiente que les rodea:  Fibrocitos. Son fibroblastos relativamente quiescentes pero, en condiciones normales, son los responsables de la formación y mantenimiento de la matriz extracelular. Son células con poca capacidad para dividirse y sin actividad contráctil.  Fibroblastos. Son células más activas con una mayor producción de matriz extracelular. Presentan un importante citoesqueleto de microtúbulos y microfilamentos de actina que les permite la movilidad celular.  Miofibroblastos. Los miofibroblastos son una subpoblación de fibroblastos que presentan características intermedias entre los fibroblastos y las células de músculo liso. Por un lado, son células formadoras de matriz extracelular y por otro presentan carcterísticas contráctiles y expresan la actina α del musculo liso (α-SMA). 5,6 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 4 2.2 ESTRATEGIAS DE LA MEDICINA REGENERATIVA Basándonos en estos principios fisiológicos, la MR utiliza tres tipos de estrategias para la reparación o regeneración de los tejidos: 2.2.1 INDUCCIÓN QUÍMICA O BIOLÓGICA Representa el área de la MR que más impacto ha tenido en la actualidad. 7 Muchos agentes tópicos han sido utilizados en Medicina, por su eficacia en acelerar la reparación tisular de las heridas. 8 Moléculas como la angiotensina, ácido retinoico, aminoácidos como la L-arginina, factores solubles como citoquinas o interleuquinas (IL), derivados de purinas sintéticas, preparados sintéticos de matriz extracelular (Alloderm  , Integra  ) y Factores de Crecimiento (FC) han sido utilizados para estimular la función y producción de células endógenas. 9,10 De todos ellos, los FC son los más importantes. A. FACTORES DE CRECIMIENTO (FC) Los FC, son un conjunto de sustancias mayoritariamente de naturaleza proteica, cuya función es regular una gran variedad de procesos celulares como la proliferación y el metabolismo celular, la quimiotaxis, migración y diferenciación dirigida, y la producción de matriz extracelular. Estos FC juegan un importante papel en la reparación tras agresiones tisulares, de ahí su importancia en MR así como en Oncología experimental, siendo muy útil el estudio de estas moléculas reguladoras en el diagnóstico, seguimiento y tratamiento de algunas neoplasias. 10 Los FC están presentes en casi todos los tejidos y son producidos por la mayoría de las células, pero sobre todo por fibroblastos, células endoteliales y leucocitos (monocitos y macrófagos), almacenándose en la médula ósea y en las plaquetas. Se suelen sintetizar en forma de moléculas precursoras, o profactores, que posteriormente son procesados por enzimas proteolíticas para completar la síntesis de la molécula madura que interacciona con receptores específicos de la membrana celular. Su efecto es multifuncional, dependiendo de la célula diana sobre la que actúan, de su estado fisiológico, de su relación con otras células y con la matriz extracelular y de la presencia de COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 11 se consideró importante retener el término "enfermedad" en la definición. - Superficie ocular La superficie ocular se define como la que comprende las estructuras del ojo y los anexos, incluída la córnea, la conjuntiva, los párpados, las pestañas, la película lagrimal, las glándulas lagrimales principal y accesorias y las glándulas de Meibomio. Por lo tanto, las lágrimas, tanto en términos de los componentes individuales en el sitio de producción, como en forma de película en la superficie ocular, se incluyen dentro del término "superficie ocular". - Homeostasis de la película lagrimal La película lagrimal tiene un papel vital en la lubricación y protección de la superficie ocular, así como en el mantenimiento de una superficie lisa y refractiva para un rendimiento visual óptimo. Fisiológicamente, la homeostasis describe el estado de equilibrio en el cuerpo con respecto a sus diversas funciones y a la composición química de los fluidos y tejidos. Cuando se aplica a la DED, el concepto de homeostasis de la película lagrimal alterada reconoce la posibilidad de los muchos cambios diferentes que pueden ocurrir en la película lagrimal y la superficie ocular, en respuesta a una o más de las causas subyacentes de la DED. La interrupción de la homeostasis se considera la característica unificadora que describe el proceso fundamental en el desarrollo de la DED. - Síntomas La definición de DED de 1995 identificó las molestias como la principal respuesta sintomática asociada con el ojo seco, y la definición de 2007 amplió el concepto de síntomas para incluir trastornos visuales. Si bien la terminología varía según el idioma y entre las diferentes culturas. Los síntomas oculares siguen siendo un componente fundamental de la DED. El informe original de TFOS DEWS mantuvo la “incomodidad” como un término dentro de la definición, pero amplió el concepto de síntomas para incluir la alteración visual, en reconocimiento de la falta de definición transitoria informada por los individuos afectados que correspondía con la calidad de la superficie lagrimal. TFOS DEWS II reconoce que tanto la incomodidad como los síntomas de alteración visual siguen siendo fundamentales para la DED, pero para evitar restricciones y maximizar la relevancia en todo el mundo, ha elegido la frase "... COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 12 acompañado de síntomas oculares" para la definición actual, para abarcar un rango más amplio de posibles síntomas asociados con la DED. - Papel etiológico El término "rol etiológico" enfatiza el concepto de una vía involucrada, sin sugerir que las características específicas se consideren resultados de medición o elementos de diagnóstico requeridos. 33 La DED, también llamada, Queratoconjuntivitis Seca, 34 es una afección muy frecuente, y su etiología puede deberse a: 1. Producción insuficiente de lágrima 2. Producción de lágrimas de baja calidad. No siempre existe una causa reconocible de la DED. Su prevalencia aumenta con la edad, y es más frecuente en mujeres menopáusicas, en relación a los cambios hormonales. Otros factores de riesgo son el uso de lentes de contacto, algunas cirugías oculares (fundamentalmente el LASIK), empleo de pantallas de visualización y algunos fármacos como antidepresivos, ansiolíticos, antihistamínicos, diuréticos, etc. 33 En algunas ocasiones, se puede identificar alguna patología sistémica que produce la DED, como es el Síndrome de Sjögren (SS) (asocia además sequedad en boca y otras mucosas), la artritis reumatoide (AR) u otras enfermedades autoinmunes. Los signos y síntomas de la DED suelen afectar a ambos ojos, y los más frecuentes son los siguientes: 1. Irritación 2. Ardor 3. Sensación de sequedad 4. Sensación de cuerpo extraño 5. Ojo lloroso, con aumento del lagrimeo. Esto se produce como consecuencia de la hiperproducción refleja de lágrima cuando, por mala calidad, la existente no protege la superficie ocular. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 13 6. En algunos casos, puede dificultar la visión (visión borrosa, visión doble), mejorando tras el parpadeo repetido. Este síntoma, así como las molestias tipo arenilla, son frecuentes tras la lectura prolongada o uso del ordenador. La mayoría de los síntomas de la DED aumentan a lo largo del día, siendo más intensos por la tarde-noche. 2.4.1 COMPOSICIÓN Y FUNCIONES DE LA LÁGRIMA La lágrima se produce de manera continua en las glándulas lagrimales situadas encima del globo ocular. Su misión principal es: lubricar el ojo, mantener limpia la córnea y arrastrar cualquier cuerpo extraño hacia el saco y el conducto nasolagrimal, para ser luego expulsado al exterior por las fosas nasales. La lágrima está compuesta por tres capas: 1. Capa Lipídica: secretada principalmente por las glándulas de Meibomio, que se encarga de evitar la evaporación de la misma. 2. Capa Acuosa: Representa el 99,78% de la lágrima. Se secreta por la glándula lagrimal principal y accesorias. 3. Capa Mucosa: Es la capa que está en contacto con el epitelio corneal. En esta capa se forma un gel rico en hidratos de carbono, producido por las células caliciformes o de Goblet, que posteriormente se disuelve progresivamente en la parte acuosa (figuras 2 y 3). Figura 2. Capas de la lágrima.. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 14 Figura 3. Anatomía del aparato lagrimal. La lágrima es una película fluida que recubre toda la superficie ocular (córnea y conjuntiva). Tiene como funciones: • Evitar la desecación corneal. • Mantener el poder de refracción del ojo. Puesto que la película lagrimal precorneal representa la superficie del conjunto óptico de mayor potencia refractiva del ojo. Una disrupción de la película lagrimal afectará a la Agudeza Visual. • Favorecer los mecanismos de defensa inmunológica contra las infecciones oculares. • Potenciar la penetración del oxígeno en la córnea (nutrición de la misma). La lágrima tiene gran importancia en el mantenimiento de las interacciones dinámicas que existen entre las diferentes estructuras que integran la superficie ocular. 35 Además de su función óptica y lubricante, tiene gran importancia a nivel metabólico y antimicrobiano, al actuar como vehículo de moléculas que van a regular la estabilidad y viabilidad de los epitelios de la superficie ocular. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 15 También aporta enzimas reguladoras y nutrientes como glucosa, oxígeno, agua y electrolitos necesarios para el metabolismo del epitelio corneal. Por otro lado, la lágrima contiene altas concentraciones de proteínas estructurales como albúmina, lactoferrina o lisozima que mantienen las propiedades físicas de la película lagrimal, así como numerosas proteínas activas o funcionales, como los FC, vitaminas, inmunoglobulinas (IG) y neuropéptidos, que regulan los procesos de proliferación, migración y diferenciación de las células del epitelio corneal y conjuntival. Estas proteínas se sintetizan en la glándula lagrimal principal y en las glándulas accesorias de Krause y Wolfring, siendo posteriormente vertidas a la lágrima. 36 Además, la lágrima tiene propiedades antimicrobianas derivadas no sólo de su efecto barrera por barrido mecánico, por el cual elimina detritus, cuerpos extraños y microorganismos, sino que en la lágrima hay también IG, factores del complemento, linfocitos, macrófagos y enzimas como la lactoferrina, arilsulfatasa, peroxidasa y lisozima con efecto bacteriostático y bactericida. 36 En la DED, muchas de estas sustancias están disminuidas, y esto contribuye a aumentar el daño sobre las células conjuntivales del ojo. 37 2.4.2 CLASIFICACIÓN DE LA DED La DED se ha clasificado según la estructura de la película lagrimal afectada en: deficiencia acuosa, mucosa o lipídica. 38 Posteriormente, 34 se realizó una clasificación más patogénica (Figura 4), clasificándola en: 1. Ojo seco acuodeficiente (disminución de la producción o fallo en el transporte de la lágrima). 2. Ojo seco evaporativo (alteración del parpadeo, de la apertura palpebral, de la superficie ocular, otros trastornos); y, 3. Alteraciones combinadas. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 16 Figura 4. Clasificación de la Enfermedad del Ojo Seco (DED). Tomada de Craig JP et al. 33 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 17 Para clasificar la DED también se recomienda la Clasificación de Madrid, propuesta por Murube et al. 39 que aborda la DED en tres ejes: según la etiología, la histopatología y la gravedad. A. CLASIFICACIÓN DE LA DED SEGÚN SU ETIOLOGÍA Las múltiples causas capaces de desarrollar una DED se pueden reunir en 10 grupos, en los que unos suelen afectar a glándulas exocrinas (ojos, nariz, boca, vagina, piel), mientras que otros, suelen afectar sólo a las glándulas de ambos ojos, de un solo ojo, o incluso a una sola variedad glandular de un ojo (tabla I). B. CLASIFICACIÓN HISTOPATOLÓGICA O «ALMEN» DE LA DED Desde un punto de vista histopatológico, la DED se clasifica en acuodeficiente y no acuodeficiente. En la mayoría de los casos el déficit lacrimal se acompaña de déficit de otras glándulas exocrinas. Todo ello se resume en la clasificación «ALMEN», acrónimo donde la A representa la acuodeficiencia; la L, la lipodeficiencia; la M, la mucodeficiencia; la E, la epiteliopatía; y la N, las exocrinopatías no oculares (Tabla II). TABLA I. Clasificación etiológica de la DED. 39 (pan-exocrinos) 1, 2, 3, 4, 5 (dacrio-exocrinos) 6, 7, 8, 9, 10 1. Etarios 2. Hormonales 3. Farmacológicos 4. Inmunopáticos 5. Hiponutricionales 6. Disgenéticos 7. Inflamatorios 8. Traumáticos 9. Neurodeprivativos 10. Tantálicos COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 18 TABLA II. Clasificación histopatológica de la DED o ALMEN. 39 Acuodeficiente Lipodeficiente Mucodeficiente Epiteliopático No ocular, exocrinodeficiente C. CLASIFICACIÓN CLÍNICA DE LA DED Desde un punto de vista clínico, y para establecer un pronóstico y tratamiento, la gravedad de la sequedad ocular definida por Murube et al. 39 fue modificada posteriormente según las recomendaciones de un subgrupo de expertos en la DED 40 y finalmente revisada por el Subcomité de definición y clasificación de TFOS DEWS II (Tabla III). 33 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 19 TABLA III. Esquema para la clasificación clínica de la DED. 33,39,40 Nivel de gravedad de la DED 1 2 3 4* Incomodidad, gravedad y frecuencia Leve y/o episódico; ocurre bajo estrés ambiental. Episódico o crónico moderado, con o sin estrés Frecuente o constante grave sin estrés Severo y/o discapacitante y constante Síntomas visuales Ninguno o fatiga episódica leve Episódico molesto y/o limitante Molesto, crónico y/o constante, limitante Constante y/o posiblemente discapacitante Inyección conjuntival Ninguno a leve Ninguno a leve +/- +/++ Tinción conjuntival Ninguno a leve Variable Moderado a marcado Marcado Tinción corneal (severidad/ubicación) Ninguno a leve Variable Central marcado Erosiones punteadas severas Signos corneales/ lagrimales Ninguno a leve Desechos leves ↓ menisco Queratitis filamentosa, agregación de moco, ↑ desechos en las lágrimas Queratitis filamentosa, agregación de moco, ↑ desechos en las lágrimas, ulceración Párpado/Glándulas de Meibomio MGD variablemente presente MGD variablemente presente Frecuente Triquiasis, queratinización, simbléfaron TBUT (seg) Variable <10 <5 Inmediato Puntuación de Schirmer (mm/5 min) Variable <10 <5 <2 *Debe presentar signos y síntomas. TBUT: tiempo de ruptura lagrimal con fluoresceína. MGD: disfunción de la glándula de Meibomio. Reimpreso con permiso de Behrens A et al. 40 2.4.3 DIAGNÓSTICO DE LA DED La DED es una enfermedad multifactorial, crónica y a veces asintomática lo que la convierte en una patología difícil de estandarizar. Su diagnóstico está orientado a identificar las pruebas que permiten cumplir la definición de la enfermedad y los subtipos para orientar y monitorizar el tratamiento. Además, deben servir para realizar el diagnóstico diferencial y las comorbilidades (figura 5). 33 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 20 Figura 5. Pruebas de diagnóstico de la DED. Tomada de Craig JP et al. 33 La secuencia de pruebas para el diagnóstico de ojo seco son: 1. Historia clínica y exploración de la superficie ocular: Con la historia clínica enfocada a la patología de la superficie ocular, teniendo en cuenta los factores de riesgo y clasificación se puede realizar la aproximación diagnóstica en la gran mayoría de los pacientes. 2. Cuestionarios: Los cuestionarios son de gran utilidad como ayuda diagnóstica y nos pueden servir para cuantificar la gravedad de la patología y la respuesta al tratamiento. Los más empleados son: 1. El OSDI (Ocular Surface Disease Index): nos da información sobre la gravedad de la patología y la afectación de la visión. 2. Cuestionario SANDE: consiste en dos preguntas sobre la frecuencia y gravedad de los síntomas. Este cuestionario sirve para el diagnóstico de la enfermedad y también funciona como herramienta de monitorización del tratamiento. 3. Pruebas no invasivas para el diagnóstico de la DED: COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 27 tratamiento de diferentes patologías del epitelio ocular, tales como: DED, queratitis neurotrófica, defectos epiteliales persistentes y erosión corneal recurrente entre otras. Se trata de un producto de uso individual, por lo que se considera una fórmula magistral, y en nuestro país su norma de elaboración está regulada por el Real Decreto 175/2001, de 23 de febrero, por el que se aprueban las normas de correcta elaboración y control de calidad de fórmulas magistrales y preparados oficinales. La ley 29/2006 de 26 de Julio, los reconoce legalmente como medicamentos. Cada vez se conocen más detalles sobre los mecanismos de acción del colirio de SA en el epitelio ocular, si bien éstos aún no están totalmente claros. Se sabe, que contiene sustancias con efecto trófico que van a actuar sobre la dinámica epitelial regulando la proliferación, migración y diferenciación de las células epiteliales de la superficie ocular. 51,52 Incluso, en estudios in vitro con células del epitelio conjuntival, se ha demostrado un efecto dosis dependiente del colirio de SA sobre la expresión de mucinas. 53 De estos componentes del SA, los que se consideran de mayor importancia son el EGF, el TGF-β, la vitamina A, el PDGE, la fibronectina, la albúmina, la α2 macroglobulina, el FGF y neuropéptidos como la sustancia P, el IGF-1 y el NGF. Además, el colirio de SA contiene IG, lisozima y FC que le aportan un efecto bactericida y bacteriostático. 54 En la tabla V se muestra una relación comparada de las concentraciones de los principales factores epiteliotróficos encontrados en la lágrima basal y en el SA. 31 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 28 TABLA V. Relación comparada de las concentraciones de los principales factores epiteliotróficos encontrados en la lágrima basal y el SA. 31 Lágrima SA EGF (ng/mL) 0,3-3,0 0,5 TGF-β (ng/mL) 2-10 6-33 Vitamina A (mg/mL) 0,02 46 Lisozima (mg/mL) 1,4 6 En la tabla VI se muestran algunas de las acciones más importantes de estas sustancias a nivel de la superficie ocular. 55 TABLA VI. Principales acciones de las sustancias presentes en el SA a nivel de la superficie ocular. 55 Sustancias Acciones a nivel de la superficie ocular EGF - Favorece la proliferación, migración y diferenciación de células epiteliales y fibroblastos. - Aumenta la síntesis de fibronectina. - Efecto antiapoptótico. - Aumenta la producción de mucina 1. TGF-β - Efecto regulador sobre otros FC. - Inhibe la proliferación celular. - Favorece la migración de fibroblastos y su diferenciación a miofibroblatos. Efecto quimiotáctico de PMN, macrófagos, etc. - Favorece la formación de matriz extracelular (importante efecto fibrogénico) y neovascularización. - Inhibe la metaloproteinasa. - Efecto antiinflamatorio Vitamina A - Propiedades antibacterianas y antioxidantes. - Mantenimiento y reparación de las células epiteliales corneales y conjuntivales. - Prevención de la metaplasia escamosa. PDGF - Regulación de las interacciones entre células epiteliales y estroma durante los procesos de cicatrización. - Regulador de la expresión y acción de otros FC. - Favorece la migración y diferenciación de fibroblastos así como el depósito de matriz. extracelular. Efecto angiogénico y quimiotáctico. Fibronectina - Favorece la migración celular en los procesos de reparación corneal. Albúmina - Efectos antiapoptóticos. - Protege la degradación de citoquinas y FC. α-macroglobulina - Efecto anticolagenasa. FGF - Favorece la proliferación de la mayoría de las células implicadas en la reparación tisular. - Efecto quimiotáctico sobre fibroblastos. - Favorece la síntesis y contracción de la matriz extracelular. - Favorece la migración de los queratocitos. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 29 IGF-1 - Regula la acción de otros FC. - Estimula la proliferación y migración del epitelio corneal. - Aumenta la expresión de integrinas. - Efecto antiapoptótico. - Efecto quimiotáctico para fibroblastos. Sustancia P - Favorece la migración y proliferación del epitelio corneal y queratocitos. NGF - Favorece la proliferación y diferenciación de células epiteliales. - Favorece el crecimiento de los fibroblastos y la regeneración y crecimiento neuronal. Induce neovascularización corneal. Inmunoglobulinas - Efecto antimicrobiano. Lisozima - Efecto antimicrobiano. Complemento - Efecto antimicrobiano. EGF: Factor de crecimiento epitelial. TGFβ : Factor de crecimiento transformante β . FC: Factor de crecimiento. PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas. FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos. IGF-1: Factor de crecimiento tipo insulina. NGF: Factor de crecimiento neuronal. 2.5.1.1 EGF El EGF fue el primer factor de crecimiento identificado, siendo descubierto en 1960. El EGF estimula una amplia variedad de tipos celulares. Acelera los procesos de reparación y cicatrización de las heridas, favoreciendo, por un lado, la proliferación y migración de células epiteliales y fibroblastos y, por otro, aumentando la síntesis de proteínas como la fibronectina y activando la expresión de sus receptores. 56,57 Tiene también un efecto quimiotáctico sobre los fibroblastos atrayéndolos hacia la zona dañada y estimulando la formación de colágeno y matriz extracelular. El EGF es secretado en las zonas lesionadas por células inflamatorias como macrófagos y tiene efectos antiapoptóticos. 58,59 Este factor está presente tanto en la secreción lagrimal basal como en la refleja, siendo su concentración menor en la lágrima refleja. 50 La concentración de EGF en la lágrima basal varía enre 1.9 y 9.7 ng/mL, mientras que en la secreción lagrimal refleja oscila entre 0.7 y 8.1 ng/mL. 49-51 La concentración de EGF en lágrima es superior a los 0.5 ng/mL encontrados en suero, 49 aunque disminuye significativamente en casos de sequedad ocular. 51 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 30 2.5.1.2 TGFβ El TGF-β pertenece a una superfamilia de FC que incluye también a las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), activinas e inhibinas. El TGF-β es secretado por una gran variedad de células como plaquetas, células endoteliales, linfocitos y macrófagos. Al igual que otros FC, se sintetiza a partir de un precursor inactivo, precisando enzimas proteolíticas para su posterior activación. El TGF-β tiene un efecto pleiotrópico, actuando de forma diferente, y a veces opuesta, dependiendo del tipo de células sobre las que actúe y del entorno que las rodea. En general se considera un factor inhibidor y regulador de la función de otros FC. Suele inhibir la proliferación de células epiteliales. A pesar de su efecto supresor sobre la proliferación celular, su efecto global sobre la cicatrización tisular es positivo. Dado que su concentración en suero es casi tres veces mayor que la encontrada en la lágrima, 60,61 conviene diluir el colirio de SA para su aplicación oftalmológica con el fin de reducir su concentración, aunque con ello reduzcamos también la concentración de otros factores. Pacientes con enfermedades inmunes o tratamiento inmunosupresores presentan una menor concentración de TGF-β en suero. 62,63 2.5.1.3 Vitamina A La vitamina A o retinol es una vitamina liposoluble esencial para el organismo que, al ser incapaz de sintetizarla, ha de obtenerla de forma exógena a través de alimentos o suplementos nutricionales. Está presente en los alimentos de origen animal en forma de vitamina A preformada, mientras que los alimentos de origen vegetal contienen precursores de la vitamina A como los carotenos, de los que el más importante es el betacaroteno, que posteriormente se transforman en vitamina A en el hígado o en el intestino. 50 A nivel ocular, los efectos de la Vitamina A son muy importantes. De hecho, el nombre de retinol deriva de que esta vitamina genera y aporta los pigmentos necesarios para el buen funcionamiento de la retina. La vitamina A es necesaria para el proceso fisiológico de la visión. Su déficit origina COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 31 inicialmente una disminución de la agudeza visual en condiciones de baja iluminación que puede llevar a la ceguera total si el proceso continúa. Su poder antioxidante ejerce un efecto positivo en la prevención y tratamiento de enfermedades degenerativas como la miopía y cataratas cuando son inducidas por déficit de vitamina A. 50 En la superficie ocular los efectos de la vitamina A se producen a distintos niveles. Por un lado, ejerce un notable efecto en la prevención y control de las infecciones bacterianas, parasitarias y virales, y, por otro, es esencial para el mantenimiento de la integridad y reparación de los epitelios y mucosas de la superficie ocular. La vitamina A parece prevenir los procesos de metaplasia escamosa de los epitelios. 50 Su déficit origina la xeroftalmia, un cuadro en el que de forma progresiva aparece sequedad ocular, metaplasia de los epitelios corneal y conjuntival, queratinización (manchas de Bitot), pérdida de la transparencia corneal, queratomalacia y ceguera. La vitamina A es uno de los principales factores epiteliotróficos presentes en el SA, siendo su concentración casi 100 veces superior a la encontrada en la lágrima. 51 2.5.1.4 PDGF El PDGF fue uno de los primeros FC en ser caracterizado, siendo el primero en demostrar efecto quimiotáctico sobre monocitos y macrófagos. Se considera un factor de gran importancia en la regulación del crecimiento y división celular de una amplia variedad de células al facilitar el paso a la fase G1 del ciclo celular. 64 El PDGF potencia y acelera de forma dosis dependiente la reparación tisular in vivo e in vitro. 65 Estudios in vitro han demostrado que este factor actúa sobre la migración y diferenciación de los fibroblastos acelerando el depósito de matriz extracelular y aumentando la producción, resistencia y contracción del colágeno tanto en los tejidos dañados como en los procesos de remodelación en tejidos sanos. 66-70 Estos efectos son más lentos pero más duraderos que los producidos por el TGF-β. EL PDGF es un potente factor quimiotáctico para monocitos, macrófagos y fibroblastos, células consideradas esenciales en los mecanismos de COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 32 reparación tisular. 67-69 La actividad de los fibroblastos en cuanto a migración y formación de matriz extracelular varía según el estadío de la reepitalización, siendo ésta máxima hacia el día 14, cuando el epitelio presenta ya todas sus capas, iniciándose entonces un cambio en el perfil de factores secretados con modificaciones en la actividad de los mismos. 71 2.5.1.5 Fibronectina La fibronectina es una glicoproteína dimérica presente en la matriz extracelular. También interviene en la transducción de señales mediando en procesos como la división, la diferenciación y el crecimiento celular. La fibronectina juega por tanto un importante papel en la adhesión de las células en la matriz extracelular y a la membrana basal. 72 En la superficie ocular, la fibronectina es uno de los factores más importantes en la fase de migración celular durante la reparación del epitelio corneal tras lesiones. 72-76 Su concentración en suero sanguíneo es casi 10 veces superior a la encontrada en la lágrima, aunque en pacientes con enfermedades inmunes o tratamientos inmunosupresores esta concentración suele estar más disminuida. 55,77 2.5.1.6 Albúmina La albúmina es la principal proteína de la sangre, representando casi un 55% del total de las proteínas plasmáticas. Se sintetiza en el hígado y es fundamental para el mantenimiento de la presión oncótica entre el compartimento intra y extravasuclar. La albúmina tiene un importante papel en el control del pH sanguíneo y también como vehículo de hormonas, ácidos grasos libres y fármacos. A nivel ocular, la albúmina ha demostrado tener efectos beneficiosos sobre la cicatrización, disminuyendo la degradación de citoquinas y FC en las zonas de lesión tisular, 77,78 presentando también actividad antiapoptótica. 79 La albúmina disponible para uso comercial como producto farmacéutico ha sido utilizada como alternativa al colirio de SA. 79 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 33 2.5.1.7 α 2 macroglobulina La α2 macroglobulina pertenece a la familia de las globulinas, unas proteínas solubles que representan un importante componente de la sangre y que también incluyen a proteínas como el fibrinógeno y las gammaglobulinas. La α2 macroglobulina pertenece al grupo de las globulinas α-2, al que también pertenecen la eritropoyetina y otras proteínas transportadoras como la haptoglobina y la ceruloplasmina. Su principal función es neutralizar las enzimas proteolíticas. A nivel de la superficie ocular presenta actividad anticolagenasa, útil en quemaduras oculares y úlceras marginales como las encontradas en la enfermedad de Mooren. 80-82 2.5.1.8 FGF La existencia de un factor de crecimiento para fibroblastos se conoce desde 1939 gracias a los trabajos de Trowell et al. 83 aunque hasta 1984 no se identificó la molécula del FGF ácido y meses después la molécula del FGF básico. 84 Actualmente se conocen al menos 23 péptidos diferentes dentro de esta familia, de los que el FGF ácido o FGF-1 y el FGF básico o FGF-2 son los más importantes y mejor caracterizados. Las distintas formas de FGF están implicadas en múltiples funciones fisiológicas. Promueven la proliferación celular, el aumento del índice de la actividad mitótica y la sínesis del ADN, además regulan los procesos de crecimiento, diferenciación y mantenimiento de la viabilidad y el metabolismo de muchas células además de los fibroblastos. A nivel ocular, el FGF-2 favorece la migración de los queratocitos, mientras que el FGF-1 tiene menos efectos sobre estas células del estroma corneal. 83-85 2.5.1.9 IGF-1 El IGF-1 es un polipéptido de 70 aminoácidos y 7,7 kDa de peso molecular que pertenece a una familia de péptidos solubles. 83 Su secreción y acción tisular dependen de la hormona del crecimiento, por lo que sus acciones COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 34 disminuyen con la edad. A nivel de la superficie ocular, el IGF-1 estimula la migración y proliferación del epitelio corneal en un mecanismo sinérgico con la Sustancia P. 85 2.5.1.10 Sustancia P La sustancia P es un péptido neuroactivo de cadena corta formada por 11 aminoácidos y con un peso molecular de 1,5 kDa. Su concentración en suero medida por radioinmunoanálisis, es de 157±42,1 ng/mL, mientras que la concentración en lágrima determinada mediante ELISA es de 0,071±0,035 ng/mL, 85,86 estando estos valores elevados en pacientes con queratoconjuntivitis vernal y alérgica. A nivel de la superficie ocular, la sustancia P estimula la migración del epitelio corneal en un mecanismo sinérgico con el IGF-1. 51 2.5.1.11 NGF El NGF fue el primer factor neurotrófico descrito. Es una proteína de 14 kDa de peso molecular, que junto con otros factores de la familia de las neurotrofinas, son de vital importancia en el crecimiento, mantenimiento y supervivencia de diferentes grupos neuronales, tanto durante el desarrollo embriológico como en la vida adulta. 85 El NGF ha sido utilizado en el tratamiento de úlceras corneales secundarias a queratopatía neurotrófica al inducir la regeneración de los nervios estromales tras agresiones. 86,87 Por otro lado, el NGF induce la producción de sustancia P y del péptido relacionado con el gen de la calcitonina que favorecen la proliferación del epitelio corneal. Los efectos biológicos del NGF a nivel de la superficie ocular son mediados por receptores específicos localizados en el epitelio corneal y conjuntival. 88,89 2.5.1.12 IG Las IG son un amplio grupo de proteínas solubles y de superficie celular que representan un 20% del total de proteínas del plasma y están implicadas en procesos de reconocimiento y unión celular. Entre los miembros de esta familia se incluyen anticuerpos, receptores para antígenos de superficie en COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 35 linfocitos T y B, co-receptores (CD4, CD8 y CD19), moléculas presentadoras de antígenos como las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad, moléculas de adhesión, FC como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos y algunos precursores de receptores de FC como el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR-1). 90,91 El tipo de IG va a estar determinada por los diferentes tipos de cadenas pesadas (mu, gamma, alfa, delta y epsilon) o ligeras (kappa o lambda) presentes en su estructura, teniendo cada una de ellas funciones biológicas distintas. Existen 5 tipos de inmunoglobulinas:  IgG. Es la IG más abundante en el plasma, representando el 80% del total de las IG. Se produce en respuesta a infecciones (bacterias, hongos o virus) y sus principales funciones son la fijación del complemento y la unión a receptores en células fagocíticas.  IgM. Constituye un 6% del total de IG. Es el primer tipo de IG sintetizada en respuesta a infecciones.  IgA. Es la IG predominante en las secreciones seromucosas del organismo como lágrima, leche y saliva. Aunque no fija el complemento ni tiene capacidad opsonina, la IgA tiene una gran importancia al actuar como defensa inicial contra patógenos invasores, impidiendo que estos microorganismos atraviesen las mucosas y lleguen al plasma.  IgE. Se encuentra en pequeñas concentraciones en el plasma de personas normales. Es la responsable de los procesos alérgicos mediados por hipersensibilidad tipo I. La IgE está implicada en la respuesta inmune contra parásitos y protozoos.  IgD. Es una IG unida a la membrana de linfocitos B, que actúa como marcador de diferenciación. Su presencia, junto con IgM, confiere inmunocompetencia a estos linfocitos. La IgD no se encuentra en forma soluble en el plasma y representa menos del 1% de las IG plasmáticas. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO INTRODUCCIÓN 36 2.5.1.13 Lisozima La lisozima es una enzima abundante en secreciones corporales como saliva, lágrima y moco, pero también en otros órganos y en el plasma. Su concentración en lágrima es similar en hombres y mujeres, disminuyendo con la edad, y representando entre el 20 y 40% del contenido proteico de la lágrima. Puede actuar como opsonina, facilitando la fagocitosis de patógenos por otras células como macrófagos o actuar directamente, en un proceso mediado por el ácido glutámico y el ácido aspártico, hidrolizando enlaces glucosídicos de la pared celular de las bacterias, sobre todo Gram+. Estos efectos de la lisozima sobre las bacterias reducen su potencial patógeno. 2.5.1.14 Complemento El sistema del complemento es uno de los componentes fundamentales de la respuesta inmunitaria ante agentes infecciosos que “complementa” el efecto de los anticuerpos en su acción destructora de microorganismos. 92 El complemento es especialmente importante frente a gérmenes Gram-, siendo las bacterias Gram+ más resistentes a su acción. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO JUSTIFICACIÓN 43 III. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO La DED es una entidad de la superficie ocular, producida por un grupo heterogéneo de enfermedades que producen un déficit funcional de la lágrima. Su prevalencia en la población es alta (5-30%) 33 y existe un alto nivel de demanda tanto en consultas de Atención Primaria como en consultas de Oftalmología derivadas de esta patología. Las recomendaciones para el tratamiento de la DED, según el Subcomité de definición y clasificación de TFOS DEWS II de la DED, se basan en un enfoque multifactorial teniendo en cuenta las características de la enfermedad. 33,115 En la mayoría de los casos el tratamiento etiológico no es posible, por ello el tratamiento convencional suele ser sintomático, siendo la terapia sustitutiva con lágrimas artificiales y lubricantes el tratamiento más frecuente. Esta terapia presenta ciertas limitaciones debido a la complejidad de la lágrima natural. En los últimos años, la utilización del colirio de SA, obtenido de la separación de los componentes líquidos y celulares de la propia sangre del paciente, ha sido un tratamiento instaurado, sobre todo en pacientes con DED severa o que no responden adecuadamente a la terapia convencional. A pesar de todos los efectos clínicos del colirio de SA descritos anteriormente, el efecto por el cual el colirio de SA es efectivo en el tratamiento de la DED, no queda perfectamente aclarado en la literatura. El mecanismo de acción del colirio de SA, aunque no es bien conocido, se basa tanto en su acción lubricante como en su mayor concentración en vitaminas A y E, FC (como EFG, TGF-, FGF, HGF), fibronectina y nutrientes que promueven el trofismo celular del epitelio del ojo, interviniendo en su regeneración. La mayor parte de los estudios demuestran una mejoría de la sintomatología (reducción del picor, sensación de cuerpo extraño, sequedad ocular, etc). No obstante, no está claro entre los distintos estudios los mecanismos por los que se produce esta mejoría clínica. Hay autores que sugieren el incremento de la humedad del ojo como la única mejoría, 55 y otros autores describen la regeneración epitelial tras el tratamiento. 80,116 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO JUSTIFICACIÓN 44 Con este estado del conocimiento, se planteó este estudio para investigar cómo se modifica la CIC por transferencia con el tratamiento con colirio de SA en pacientes con DED, describir cómo se modifica el grado de metaplasia escamosa, así como conocer la modificación de los tests de flujo y estabilidad lagrimal (test de Schirmer y BUT respectivamente) con el tratamiento con colirio de SA en pacientes afectos de DED. IV. HIPÓTESIS DE TRABAJO COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO HIPÓTESIS 46 IV. HIPÓTESIS DE TRABAJO El empleo del colirio de suero autólogo en pacientes diagnosticados de enfermedad del ojo seco modifica las características citológicas de las células caliciformes, así como su capacidad mucínica. estudiada mediante citología de impresión conjuntival por transferencia. Por este motivo mejoran también los síntomas clínicos, los tests de flujo y estabilidad lagrimal (tests de Schirmer y BUT respectivamente), así como el grado de metaplasia escamosa conjuntival de los pacientes. V. OBJETIVOS COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO OBJETIVOS 48 V. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVOS PRINCIPALES • Conocer cómo se modifica la citología de impresión conjuntival por transferencia con el tratamiento con colirio de SA en pacientes con DED. • Estudiar la variación en la densidad de CC conjuntivales durante el tratamiento con SA. • Analizar la modificación de los tests de Schirmer y BUT tras el tratamiento con colirio de SA. • Evaluar la modificación del grado de metaplasia escamosa conjuntival de los pacientes con DED tratados con colirio de SA. 5.2 OBJETIVOS SECUNDARIOS • Conocer las características de los pacientes con DED del Complejo Asistencial de Segovia. • Ver la efectividad del uso del colirio de SA en pacientes con DED. • Conocer las posibles reacciones o efectos adversos del colirio de SA empleado en el tratamiento de pacientes con DED. VI. MATERIAL Y MÉTODOS COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 50 VI. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1 TIPO DE ESTUDIO Estudio prospectivo, descriptivo y analítico cuasi-experimental de los pacientes que acudieron a la consulta de Oftalmología, diagnosticados de DED de cualquier etiología, y en los que se indicó tratamiento con colirio de SA. La Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS) clasificó nuestro estudio titulado “Empleo del SA en el tratamiento de pacientes con diagnóstico de DED”, como un: Estudio post-autorización de seguimiento prospectivo (EPA-SP) en Marzo de 2015. (Anexo I) El estudio constó de tres fases: 1. Estudio descriptivo de los pacientes diagnosticados de DED en el Complejo Asistencial de Segovia, desde Enero del 2017 hasta Diciembre 2017, en los que se indicó tratamiento con colirio de SA. Se definió la edad de los pacientes, género, clasificación de la gravedad de la DED y patología asociada a la DED, si la había. 2. Estudio comparativo: A continuación se recogió información pre y postratamiento con el colirio de SA mediante la CIC transferencia. Cuando se estableció la indicación del colirio de SA como tratamiento de la DED del paciente, por parte del Oftalmólogo responsable, y previa obtención del consentimiento informado, se realizó a cada paciente una primera CIC por transferencia, para determinar el número de CC conjuntivales previo al tratamiento con colirio de SA (Citología Impresión 1). Posteriormente el investigador principal informó e instruyó al paciente sobre el tratamiento. El paciente se administró una gota de colirio de SA 4 veces al día en ambos ojos durante un mes. Al finalizar el tratamiento con colirio de SA, se realizó nuevamente otra CIC por transferencia (Citología Impresión 2). Las CIC siempre las realizó el investigador principal en la región temporal superior del ojo derecho del paciente. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 51 En las CIC por transferencia se compararon las siguientes variables obtenidas antes y después del tratamiento de la DED con SA:  Número de CC,  Tamaño de CC,  Densidad de CC,  Tamaño del Núcleo de las CC,  Tamaño del citoplasma de las CC,  Densidad de CC, A cada paciente también se le realizó un test de Schirmer y un test de BUT antes y después del tratamiento con SA. Los resultados de ambos tests también se compararon. 3. Estudio de correlación y análisis multivariante, de la variable dependiente número de CC con el resto de las variables del estudio para intentar controlar las posibles variables de confusión. 6.2 POBLACIÓN DIANA Durante 1 año se estudiaron 24 pacientes mayores de 18 años con diagnóstico clínico de DED que acudieron a la consulta de Oftalmología de nuestro hospital, con indicación de inicio de tratamiento con colirio de SA y que accedieron a participar en el estudio (muestreo no probabilístico por conveniencia). El diagnóstico clínico de la DED se confirmó considerando la sintomatología y las pruebas de Schirmer, BUT y CIC por transferencia. Se incluyeron en el estudio todos los pacientes que de manera consecutiva aceptaron participar en el estudio y cumplieron con los criterios de inclusión (adultos diagnosticados de DED). A todos ellos se les explicó en detalle cada uno de los procedimientos y los riesgos potenciales y se les pidió que firmaran el consentimiento informado (Anexo II). Una vez dada la indicación de uso del colirio de SA, por parte del Oftalmólogo, el paciente fue informado de forma oral y escrita sobre el correcto uso y manejo de estos preparados. Se hizo especial COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 52 énfasis en lo referente a las medidas de conservación e higiene a la hora de aplicar las instilaciones así como en la manipulación de estos productos por otras personas (se trata de fluidos parenterales y, por tanto, pueden transmitir enfermedades infecciosas). Se excluyeron del estudio los pacientes en tratamiento con: esteroide tópico ocular, medicamentos análogos de las prostaglandinas o inmunosupresores tópicos. También se excluyeron los pacientes que en ese momento estuvieran en tratamiento sistémico con corticosteroides o antiinflamatorios no esteroideos. También fueron excluídos del estudio pacientes con antecedentes de infección activa de Hepatitis B, C, VIH y sífilis. Se realizó estudio de despistaje serológico para VIH, VHB, VHC y sífilis previos al tratamiento con colirio de SA. También se excluyeron del estudio los pacientes que presentaban suero lipémico y/o suero hemolizado después de la centrifugación de la muestra sanguínea. Cada paciente fue sometido a la toma de una primera CIC por transferencia antes de iniciar el tratamiento con colirio de SA (Citología Impresión 1), Posteriormente se sometió a los pacientes a tratamiento con colirio de SA al 20% una gota 4 veces al día en ambos ojos durante un mes. A los pacientes se les suministró el medicamento en frascos goteros etiquetados. Los pacientes se administraron el tratamiento con colirio de SA en su domicilio tal y como habían sido instruidos por el Oftalmólogo e Investigador Principal, con el objetivo de minimizar la posibilidad de error en la administración del tratamiento. Tras completar el mes de tratamiento, se realizó una segunda CIC por transferencia (Citología Impresión 2). Finalmente, se realizó una comparación de las variables en el prey pos-tratamiento. 6.3 ESTIMACIÓN DEL TAMAÑO MUESTRAL Para el cálculo del tamaño muestral se realizó un muestreo probabilístico tomando el número de CC conjuntivales como la variable más representativa en los datos del estudio. 117 Aceptando un riesgo α de 0,05 y un riesgo 1-β de 0,8 en un contraste bilateral, se precisan 24 sujetos para detectar una COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 59 Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 60 Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 61 Figura 26. Figura 27. Figura 28. Figura 29. Figura 30. Figura 31. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 62 Figura 32 Figura 33. Figura 34. Figuras 12-34. Diferentes momentos del proceso de realización del colirio de SA en el Complejo Asistencial de Segovia. 6.7 DISPENSACIÓN Y POSOLOGÍA El colirio de SA, adecuadamente identificado, se entregó al paciente. Se le insistió de nuevo en la importancia del uso correcto y manejo de estos preparados, sobre todo en lo referente a las medidas de conservación e higiene a la aplicación de las instilaciones, así como a la manipulación de estos preparados por otras personas. Se insistió en la importancia de que el colirio en uso estuviese en nevera a 4ºC y el resto, almacenado en el congelador a – COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 63 20ºC hasta que fueran utilizados. Le indicamos que se aplicara 1 gota en cada ojo cada 6 horas (4 veces al día) durante 1 mes consecutivo. Cada frasco tenía una semana de duración. Además, se instruyó y aconsejó al paciente para que desechara los frascos una vez ya utilizados, en un contenedor de material biológico (Anexo VI). En la tabla VII, se resume el protocolo de preparación, dispensación y almacenamiento del colirio de SA que se siguió: TABLA VII. Protoloco de elaboración, dispensación y posología del colirio de SA en el Complejo Asistencial de Segovia. Hematología Farmacia Consentimiento informado Excluídos: Pacientes con antecedentes o serología positiva para VIH, VHC, VHB y Sífilis. Suero lipémico y/o hemolizado Venopunción: 30-40 mL de sangre sin anticoagulante Coagulación: +/-30 minutos a 22ºC Centrifugación: 3000 rpm/10 minutos/22ºC Dilución: 20% con 40 mL de suero fisiológico 0.9% +/-50 mL, repartidos en 8-12 envases (5 mL) Conservación: envase en uso en la nevera a 4ºC durante 7 días máximo, resto almacenados en el congelador a – 20ºC, máximo 3 meses Posología: 1 gota/6 horas Desechar envase tras 7 días. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 64 6.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Con los datos obtenidos de las distintas variables y para el procesamiento de los mismos se realizó una base de datos utilizando el programa Microsoft Excel 2013 para Windows, recogiéndose las variables cuantitativas con su valor y asignando a las variables cualitativas un valor numérico que nos permitiera su posterior análisis estadístico. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el paquete estadístico SPSS v15.0. Se emplearon las siguientes herramientas estadísticas: 1. En la Fase descriptiva de las variables cuantitativas se utilizaron los principales parámetros de centralización, dispersión y posición (media, desviación estándar y rango). Para las variables cualitativas se utilizó el análisis de frecuencia, porcentajes y los límites de confianza del porcentaje. 2. En la Fase comparativa se compararon las variables del estudio antes y después del tratamiento con colirio de SA. Las herramientas estadísticas empleadas en esta fase comparativa fueron: a. La comparación de variables cualitativas se realizó mediante tablas de contingencia y el cálculo de la prueba de Chi Cuadrado. Se empeó el Test exacto de Fisher si en la tabla de contingencia alguna frecuencia observada era inferior a 5. b. El análisis comparativo de las variables cuantitativas, dado el tamaño muestral y tratarse de muestras apareadas, se realizó mediante la Prueba de la Suma de Rangos de Wilconxon (estadística no paramétrica). 3. Finalmente, en la Fase de correlación y análisis multivariante se realizó: a. Una primera fase de correlación que nos permitió explorar las correlaciones que había entre dos variables cuantitativas entre sí. Para ello empleamos los Coeficientes de Correlación de COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 65 Pearson (r) para estadística paramétrica y Spearman (rho) para no paramétrica. El coeficiente de correlación de Spearman (Rho) intenta identificar el grado de correlación entre 2 variables cuantitativas: • Puede ser POSITIVO si a medida que aumenta una variable, la otra también lo hace. • Puede ser NEGATIVO si a medida que aumenta una variable, la otra disminuye. • Su resultado puede oscilar entre -1 y +1, cuanto más se acerque el resultado a 0, indica que el grado de correlación es nulo o inexistente, y mientras más se acerque el resultado a los extremos (-1 o +1), indica que el grado de correlación es más fuerte. • Existen diferentes puntos de corte para interpretar el resultado. Entre los más frecuentes se encuentran: Escala 1 Escala 2 Rho Perfecta = 1 Rho Excelente = 0.90 – 0.99 Rho Buena = 0.80 – 0.89 Rho Regular = 0.50 – 0.79 Rho Mala < 0.50 Rho Escasa o nula = 0 – 0,25 Rho Débil = 0,26 - 0,50 Rho entre moderada y fuerte = 0,51 - 0,75 Rho entre fuerte y perfecta 5 = 0,76 - 1,00 Por último, el grado de correlación entre 2 variables cuantitativas, se acompaña siempre de un valor de P, que representa su significación estadística. b. Una segunda fase de ANÁLISIS MULTIVARIANTE. En ella realizamos un análisis con muchas variables al mismo tiempo (no solo 2). En función del tipo de la variable principal del estudio, número de CC, (variable cuantitativa discreta), la COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO MATERIAL Y MÉTODOS 66 mejor elección de tipo de análisis será una Regresión Lineal Múltiple, en donde compararemos las modificaciones del número de CC, antes y después del tratamiento con colirio de SA, ajustado por todas las demás covariables del modelo. Uno de los parámetros estadísticos que nos arrojará la Regresión Lineal Múltiples es el R-squared (R 2 ), que efectivamente es la proporción de variabilidad de la variable dependiente, explicada por la variabilidad en la variable independiente. Para todo el análisis estadístico se consideró que existían diferencias estadísticamente significativas cuando había un nivel de significación de 95% (p<0,05). 6.9 CONSIDERACIONES ÉTICAS Y CONFIDENCIALIDAD DE DATOS El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigaciones Científicas del Complejo Asistencial de Segovia en Marzo de 2015 (Acta 07/2015). El consentimiento informado (Anexo II) se solicitó por escrito respetando los términos de la Declaración de Helsinki. Todos los datos incluidos en la base de datos fueron anonimizados, no pudiendo en ningún caso identificar directa o indirectamente un sujeto individualmente. La base de datos permanece bajo claves de seguridad y sólo accesible a los investigadores. Además, el estudio cumple con la normativa internacional de protección de datos y la legislación española vigente (Ley Orgánica 3/2018, de 5 de diciembre, de Protección de Datos Personales y garantía de los derechos digitales LOPDGDD). VII. RESULTADOS COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 68 VII. RESULTADOS 7.1 RESULTADOS DEL ANÁLISIS DESCRIPTIVO 7.1.1 GÉNERO En la figura 35 aparece la distribución de los pacientes según su género. De los 24 pacientes incluidos en el estudio, 23 eran mujeres y 1 era varón. Tabla VIII. Distribución de pacientes según género. Frecuencia Porcentaje Sexo Hombres 1 4,2 Mujeres 23 95,8 Total 24 100 Figura 35. Distribución de los pacientes según el género. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 75 Figura 44. Comparación del tamaño del núcleo de células caliciformes antes y después del tratamiento con suero autólogo. P<0,01 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 76 La figura 45 muestra los cambios histológicos en la CIC por trasferencia en algunos de los pacientes del estudio antes y después del tratamiento con colirio de SA. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 77 Figura 45. Cambios histológicos en la Citología de Impresión Conjuntival por trasferencia en algunos pacientes del estudio antes y después del tratamiento con colirio de SA. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 78 Al dividir la población en 4 cuartiles de acuerdo con el número basal de CC obtenidos en la CIC por transferencia antes del tratamiento con colirio de SA, se observó que el incremento de la media de CC fue significativamente mayor en aquellos pacientes con un menor número basal de CC (aumento de 18,1 ± 15 células en los pacientes del cuartil 1 vs. 1,8 ± 4,5 en los del cuartil 4; p = 0.017) (Figura 46). CC: células caliciformes conjuntivales Figura 46. Variación en la media del número de células caliciformes tras el tratamiento con suero autólogo según el número basal de células caliciformes obtenidos por citología de impresión conjuntival por trasferencia. A continuación se presentan las tablas de contingencia de las variables cuantitativas Test de Schirmer y Test de BUT antes y después del tratamiento con colirio de SA. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 79 Tabla XIII. Comparación de los Tests de Schirmer y de BUT, antes y después del tratamiento con suero autólogo. VARIABLE PRETRATAMIENTO Media (SD) A POSTTRATAMIENTO Media (SD) DIFERENCIA P B Test Schirmer (milímetros) 5,29 (2,49) 6,62 (2,42) 1,33 <0,001 Test BUT (segundos) 10,87 (2,07) 12,45 (2,06) 1,58 <0,01 A Desviación Estándar. B P calculada según la prueba de la Suma de Rangos de Wilcoxon. BUT: Test de Tiempo de Ruptura Lagrimal. 7.2.2 COMPARACIÓN DE PORCENTAJES DE LAS VARIABLES CUALITATIVAS Con respecto al grado de metaplasia obtenido en la CIC por transferencia antes y despues del tratamiento con colirio de SA, el 16,7% de los pacientes presentaba una metaplasia de grado 4 (n=4); el 25% una metaplasia de grado 3 (n=6); el 41,7% una metaplasia de grado 2 (n=10) y el 16,7% una metaplasia de grado 1 (n=4) respectivamente antes del tratamiento. Después del tratamiento, en 7 pacientes (29.2%) el grado de metaplasia bajó en un nivel. Los 4 pacientes con metaplasia de grado 4 pasaron al grado 3 (p<0,001). Tres de los 6 pacientes con metaplasia de grado 3 pasaron al grado 2. En total, 7 de los 10 pacientes con metaplasia de grado 3 ó 4 mejoraron su grado de metaplasia en un nivel (Tabla XIV). COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 80 Tabla XIV. Comparación del grado de metaplasia escamosa antes y después del tratamiento con suero autólogo. VARIABLE PRETRATAMIENTO n (%) POSTTRATAMIENTO n (%) DIFERENCIA P A VALUE Metaplasia Grado IV 4 (16,7) 0 (0) -4 <0,001 Grado III 6 (25) 7 (29,15) +1 >0,05 Grado II 10 (41,7) 10 (41,7) 0 >0,01 Grado I 4 (16,7) 7 (29,15) +3 >0.05 Los valores se expresan en número de casos y porcentaje. A Valor de P calculada mediante el Test Exacto de Fisher. 7.3 RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE CORRELACIÓN En la tabla XV se muestran las correlaciones entre todas las variables cuantitativas del estudio comparativo, antes y después del tratamiento con colirio de SA. En la figura 47 se muestra el diagrama de puntos entre la correlación de la variable principal (número de CC) y las demás covariables del estudio respectivamente. 81 Correlaciones 1 -,030 -,045 -,166 ,185 ,260 ,176 ,174 ,005 ,126 -,148 -,170 ,888 ,836 ,439 ,387 ,219 ,411 ,416 ,982 ,557 ,490 ,428 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 -,030 1 ,883** ,351 -,338 -,429* ,557** ,506* -,570** -,597** ,514* ,487* ,888 ,000 ,093 ,106 ,037 ,005 ,012 ,004 ,002 ,010 ,016 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 -,045 ,883** 1 ,245 -,481* -,555** ,719** ,639** -,819** -,813** ,689** ,659** ,836 ,000 ,249 ,017 ,005 ,000 ,001 ,000 ,000 ,000 ,000 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 -,166 ,351 ,245 1 -,038 -,111 ,011 ,006 -,017 -,073 ,450* ,464* ,439 ,093 ,249 ,861 ,606 ,960 ,978 ,935 ,735 ,027 ,022 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 ,185 -,338 -,481* -,038 1 ,920** -,025 ,048 ,742** ,736** -,331 -,356 ,387 ,106 ,017 ,861 ,000 ,907 ,823 ,000 ,000 ,115 ,088 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 ,260 -,429* -,555** -,111 ,920** 1 -,058 ,035 ,706** ,813** -,387 -,412* ,219 ,037 ,005 ,606 ,000 ,789 ,869 ,000 ,000 ,062 ,046 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 ,176 ,557** ,719** ,011 -,025 -,058 1 ,968** -,676** -,594** ,469* ,398 ,411 ,005 ,000 ,960 ,907 ,789 ,000 ,000 ,002 ,021 ,054 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 ,174 ,506* ,639** ,006 ,048 ,035 ,968** 1 -,592** -,531** ,357 ,285 ,416 ,012 ,001 ,978 ,823 ,869 ,000 ,002 ,008 ,087 ,177 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 ,005 -,570** -,819** -,017 ,742** ,706** -,676** -,592** 1 ,935** -,584** -,554** ,982 ,004 ,000 ,935 ,000 ,000 ,000 ,002 ,000 ,003 ,005 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 ,126 -,597** -,813** -,073 ,736** ,813** -,594** -,531** ,935** 1 -,564** -,546** ,557 ,002 ,000 ,735 ,000 ,000 ,002 ,008 ,000 ,004 ,006 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 -,148 ,514* ,689** ,450* -,331 -,387 ,469* ,357 -,584** -,564** 1 ,995** ,490 ,010 ,000 ,027 ,115 ,062 ,021 ,087 ,003 ,004 ,000 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 -,170 ,487* ,659** ,464* -,356 -,412* ,398 ,285 -,554** -,546** ,995** 1 ,428 ,016 ,000 ,022 ,088 ,046 ,054 ,177 ,005 ,006 ,000 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N Correlación de Pearson Sig. (bilateral) N TAMAÑOCC2 DENSIDAD2 DENSIDAD1 CITOPLASMA1 TAMAÑONUCLEO1 TAMAÑONUCLEO2 TAMAÑOCITO1 TAMAÑOCITO2 RELACIONNC1 RELACIONNC2 NUMEROCC1 NUMEROCC2 TAMAÑOCC2 DENSIDAD2 DENSIDAD1 CITOPLA SMA1 TAMAÑON UCLEO1 TAMAÑON UCLEO2 TAMAÑO CITO1 TAMAÑO CITO2 RELACIO NNC1 RELACIO NNC2 NUMEROCC1 NUMEROCC2 La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral). **. La correlación es significante al nivel 0,05 (bilateral). *. Tabla XV. Correlaciones de las variables cuantitativas de las células caliciformes antes y después del tratamiento con SA. 82 Figura 47. Correlación entre la variable principal (Número de CC) y demás covariables. A B C D E F G H I Correlación entre el número y el tamaño de las Células Calicifirmes: A. Pretratamiento, B. Postratamiento, C. General. Correlación entre el número y la densidad de las Células Caliciformes: D. Pretratamiento, E. Postratamiento, F. General. Correlación entre el número de Celulas Caliciformes y el tamaño del núcleo de las células caliciformes: G. Pretraamiento, H. Postratamiento, I. General.Valores de P calculados mediante Coeficiente de Correlación de Spearman (Rho). Rho= 0.893 P<0.0001 Rho= -0.175 P>0.05 Rho= 0.297 P<0.05 Rho= 0.637 P<0.01 Rho= 0.387 P>0.0 5 Rho= 0.524 P<0.0001 Rho= -0.490 P>0.05 Rho= -0.425 P<0.01 Rho= -0.389 P>0.05 83 Figura 47. Continuación. Correlación entre la variable principal (Número de CC) y demás covariables J K L M N O Correlación entre el número de las Células Calicifirmes y el tamaño del Citoplasma: J. Pretratamiento, K. Postratamiento, L. General. Correlación entre el número de las Células Caliciformes y la relación Nucleo/Citoplasma: M. Pretratamiento, N. Postratamiento, O. General. Valores de P calculados mediante Coeficiente de Correlación de Spearman (Rho). Rho= 0.346 P>0.05 Rho= 0.141 P>0.05 Rho= 0.251 P>0.05 Rho= -0.538 P<0.01 Rho= -0.538 P<0.01 Rho= -0.513 P<0.0001 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO RESULTADOS 84 De los 15 diagramas de puntos obtenidos previamente podríamos concluir (tabla XVI): • El grado de asociación entre el número y el tamaño de las CC en la fase pretratamiento es significativo (Rho=0.893; p<0.0001), pero dicha asociación se pierde por completo en la fase postratamiento (Rho=- 0.175; p>0.05). En un escenario general (analizando los datos pre y postratamiento), la asociación entre el número y el tamaño de las CC es débil pero significativo (Rho=0.297, p<0.05). • El grado de asociación entre el número y la densidad de las CC en la fase pretratamiento es significativo (Rho=0.637; p<0.01), pero dicha asociación se pierde por completo en la fase postratamiento (Rho=- 0.387; p>0.05). En un escenario general (analizando los datos pre y postratamiento), la asociación entre el número y la densidad de las CC es débil pero significativa (Rho=0.524, p<0.0001). • El grado de asociación entre el número de CC y el tamaño del núcleo de las CC en la fase pretratamiento es no significativo (Rho=-0.389; p>0.05), no significativa en la fase postratamiento (Rho=-0.490; p>0.05). En un escenario general (analizando los datos pre y postratamiento), la asociación entre el número y el tamaño del núcleo de las CC es débil pero significativa (Rho=-0.425, p<0.01). • El grado de asociación entre el número y el tamaño del citoplasma de las CC en la fase pretratamiento es no significativo (Rho=0.346; p>0.05), no significativo en la fase postratamiento (Rho=-0.141; p>0.05). En un escenario general (analizando los datos pre y postratamiento), la asociación entre el número y el tamaño del citoplasma de las CC es no significativa (Rho=0.251, p>0.05). • El grado de asociación entre el número y la relación N/C de las CC en la fase pretratamiento es moderado y significativo (Rho=-0.538; p<0.0001), dicha asociación es moderada y significativa en la fase postratamiento (Rho=-0.538; p<0.01). En un escenario general (analizando los datos pre y postratamiento), la asociación entre el COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 91 8.2 DISCUSION DEL ESTUDIO COMPARATIVO 8.2.1 VARIACIÓN EN LA CITOLOGÍA DE IMPRESIÓN CONJUNTIVAL POR TRANSFERENCIA En nuestro estudio, la valoración histológica de la eficacia del tratamiento con colirio de SA se realizó midiendo el número, tamaño, densidad, tamaño del nucleo, tamaño del citoplasma y relación núcleo citoplasma (N/C) de las CC conjuntivales pre y post tratamiento con SA, mediante la técnica de CIC por transferencia. La CIC es una técnica mínimamente invasiva que permite obtener una “biopsia” de la superficie ocular y determinar el grado de metaplasia escamosa de la superficie conjuntival. 46 Como ya se comentó, esta técnica ha sido empleada en el estudio de diversas enfermedades de la superficie ocular. Fue utilizada por primera vez por Egbert et al. 44 en 1977 siendo modificada posteriormente por otros autores de acuerdo con sus necesidades. Actualmente, no existe una técnica estandarizada de realización. La técnica empleada en nuestro estudio, es una modificación descrita por Minaya F. 45 y que podemos denominar CIC por transferencia. Esta técnica no está descrita anteriormente en la literatura. El motivo por el cual escogimos esta técnica es porque, en nuestra opinión, es la de mayor rentabilidad en cuanto a la obtención de una buena cantidad de tejido para estudio. En las técnicas de CIC sin transferencia o convencionales se procesa y se tiñe la tira de recogida de muestra con el porta, no se pierde tejido, pero se ve mucho peor al microscopio. En nuestro estudio encontramos, una mejoría significativa en el número, tamaño, densidad, tamaño del núcleo y relación N/C de las CC después del tratamiento con colirio de SA. Las 3 variables que tuvieron una mejoría más significativa fueron: el tamaño, el tamaño del núcleo y el número de las CC. Esta mejoría fue más evidente en los pacientes con DED grave, mientras que en pacientes con DED leve y moderada, estos cambios en las CC fueron menores o no se produjeron. Con respecto al grado de metaplasia post tratamiento con colirio de SA, en nuestro estudio ésta se redujo en 1 grado, en los pacientes con DED COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 92 grave, mientras que en pacientes con DED leve y moderada no se modificó. No hemos podido encontrar en la literatura estudios donde se demuestre mediante la CIC, el aumento en la densidad de las CC en pacientes con diagnóstico de DED previamente tratados con SA. Luna Martinez et al. 141 demostraron una disminución del grado de metaplasia escamosa y un aumento del número de CC estadísticamente significativos, mediante la toma de biopsia de conjuntiva bulbar, con el tratamiento con SA al 20% y con una dosificación de una gota, 4 veces al día, frente al tratamiento con carboximetilcelulosa ajustado a una misma dosificación. Nuestros resultados sólo se pueden comparar en parte con los realizados por otros autores. 56,141-143 Los resultados obtenidos en los pacientes con DED grave fue similar en todos los estudios incluido el nuestro. Pero sólo en nuestro estudio se trataron con colirio de SA casos de DED leve, a diferencia del resto. 8.2.2 CAMBIOS EN LOS TESTS DIAGNÓSTICOS DE SCHIRMER Y BUT En nuestro estudio se emplearon el test de Schirmer, el test de BUT, y la CIC por transferencia, para evaluar el efecto del SA en la superficie ocular de los pacientes. Al igual que en otros estudios, 139,143-146 el test de Schirmer y el test de But mejoraron significativamente en nuestro estudio, tras el tratamiento con el SA durante 1 mes. Tsubota et al. 50 y Kojima et al. 106 encontraron mejoría en el test de BUT de pacientes tratados con SA al compararlos con el uso de lágrimas artificiales. Liu et al. 137 encontraron mejoría en el test de BUT y las tinciones con fluoresceína y el rosa de bengala. Noble et al. 94 en su estudio aleatorizado y prospectivo sólo encontraron mejoría en la sintomatología y en la CIC, no así en el test de Schirmer y el test de BUT. Yoon et al. 136 compararon el uso del colirio de SA con el uso de colirio de sangre de cordón umbilical (SCU) y describieron que ambos colirios mostraron mejoría en los síntomas, el test de BUT, la tinción corneal y la CIC. La mejoria con el colirio de SA sólo se encontró en los pacientes sin SS. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 93 8.3 DISCUSIÓN DEL ESTUDIO ANALÍTICO 8.3.1 DISCUSIÓN DEL ANÁLISIS DE CORRELACIÓN En el análisis de correlación encontramos una asociación estadísticamente significativa entre el número de CC y el tamaño, densidad, tamaño del núcleo, tamaño del citoplasma y relación N/C tras la administración del tratamiento con colirio del SA. Estos datos no los podemos contrastar con la literatura, ya que no hemos podido encontrar estudios donde se demuestren estos datos de forma independiente mediante CIC por trasferencia. Aunque en algunos estudios, 94,140,147,148 se observa una clara mejoría de la metaplasia escamosa de la CIC de estos pacientes, pudiéndose inferir de forma indirecta el aumento en el número y características histológicas de las CC ( ya que es un parámetro de valoración de la metaplasia). 8.3.2 DISCUSIÓN DEL ANÁLISIS MULTIVARIANTE En el análisis multivariante encontramos un incremento significativo en el tamaño promedio de las CC, la densidad y el tamaño del citoplasma de las mismas, tras la administración del tratamiento con colirio del SA, independientemente de la edad del paciente. No hemos podido encontrar en la literatura estudios donde se demuestre mediante CIC, el aumento en la densidad de las CC en pacientes con diagnóstico de DED previamente tratados con SA. En nuestra opinión, esto es debido al efecto trófico de los FC que posee el colirio de SA, favoreciendo la proliferación, migración y diferenciación de las células epiteliales. También se debe a la acción directa de la vitamina A sobre las CC, produciendo un aumento del número y tamaño de las mismas. 8.4 DISCUSIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON COLIRIO DE SA La Medicina Basada en la Evidencia es hoy en día el criterio seguido por muchos especialistas en materia de salud, cuando no existen ensayos clínicos, para mostrar la utilidad de un tratamiento. En el caso del empleo del colirio de COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 94 SA en el tratamiento de la DED existen ensayos clínicos demostrando la eficacia del mismo. 149 No obstante , el empleo del colirio de SA en la DED aún no está generalizado, iniciándose su empleo cuando el tratamiento convencional con lágrima artificial no ha sido suficiente. En el año 2004 y 2005 se empezó a hablar de la utilidad del colirio de SA en pacientes con úlceras neurotróficas y con queratitis sicca, cuando los tratamientos previamente empleados no conseguían ninguna mejoría. 94-104 Actualmente, el colirio de SA se emplea para el tratamiento de diversas patologías en Oftalmología, sin que exista un protocolo de su indicacion, quedando ésta únicamente a criterio del Oftalmólogo. Algunos estudios, 56,94,139-148,150-153 han encontrado mejores resultados con la utilización del colirio de SA en patologías como queratitis sicca, defectos epiteliales persistentes o úlceras corneales, ya que en estos casos, existe una ausencia de factores epiteliotróficos y la utilización del colirio de SA presenta clara mejoría. Tananuvat et al. 139 compararon el uso del colirio de SA frente al uso de lágrimas artificiales en la DED, y aun sin encontrar diferencias estadísticamente significativas, afirmaron que el grupo tratado con SA presentó una clara tendencia a la mejoría de la sintomatología, incluyendo cambios en la CIC. Noble et al. 94 sin embargo, utilizando el SA en 11 pacientes encontraron una mejoría significativa sólo en la CIC, no así en los otros test diagnósticos. Tsubota et al. 50 señalaron que el SA al presentar características bioquímicas y biomecánicas similares a la lágrima, ser hipoalergénico y aportar factores tróficos a la superficie ocular, es el tratamiento de elección en la DED grave secundaria al SS. En esta patología, al encontrarse, tanto la producción basal como refleja de lágrima muy disminuidas, es necesario aportar exógenamente los factores tróficos contenidos en el SA para mantener la integridad de la superficie ocular. Pflugfelder et al. 154 observaron que el balance de citoquinas en las lágrimas de los pacientes con SS, frente a la composición de su SA, estaba alterado a favor de un aumento de citoquinas proinflamatorias y un descenso de FC conforme a la gravedad de la DED. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 95 Harloff et al. 62 encontraron que la capacidad de migración celular del SA de pacientes con AR y tratamiento inmunosupresor estaba disminuida en pacientes con DED grave frente a individuos sanos. Stenwall et al. 155 propusieron también que el suero de pacientes con enfermedades autoinmunes podía contener citoquinas proinflamatorias y que el uso de un suero heterólogo (SH) adaptado, seleccionado por su contenido en citoquinas antinflamatorias, podría mejorar el efecto antinflamatorio del SA. En nuestra opinión, no existe ningún artículo que defina la dosis y la concentración más adecuada del SA a utilizar en el tratamiento de la DED. Poon et al. 80 demostraron que el SA en concentraciones del 50% y 100% fueron más eficaces en la resolución de la sintomatología. Cho et al. 156 y Gus et al. 157 compararon el uso de SA al 50% frente al uso de SA al 20%, sin encontrar superioridad de eficacia de uno frente al otro respectivamente. Sin embargo, encontraron que cuanto mayor era la concentración a la que se empleaba el SA, mayor era el riesgo de que aparecieran depósitos de inmunocomplejos. También por esta razón, Geerling et al. 55 contraindicaron el SA a altas concentraciones (>50%), en pacientes con trasplante corneal, por presentar mayor riesgo de rechazo. Sin embargo, los mismos Poon et al. 80 y Geerling et al. 55 consideraron que la respuesta al SA en el tratamiento de las úlceras corneales era dosis dependiente, aconsejando por lo tanto extracciones de sangre con mayor frecuencia, para obtener así un SA más denso y de concentración al 50%, que permitía un mejor cierre de la úlcera corneal. En nuestro estudio, empleamos colirio de SA al 20%, porque en la bibliografía revisada es la concentración que la mayoría de los autores recomiendan como eficaz clínicamente y bien tolerada por los pacientes, permitiéndonos así reducir la posible aparición de efectos adversos y consiguiendo por lo tanto una mayor adherencia de los pacientes al tratamiento. 31,50,106,136,141,143,147 8.5 DISCUSIÓN DE LA PREPARACIÓN DEL COLIRIO DE SA En la preparación del colirio de SA en nuestro hospital intervienen los Servicios de Hematología (Banco de Sangre) y Farmacia. Existe una gran COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 96 variabilidad en el proceso de preparación, almacenaje y dispensación del colirio de SA. El colirio de SA, al tratarse de un producto para uso individual, se considera una fórmula magistral, actualmente reconocida como medicamento y en nuestro país, sus normas de elaboración están reguladas por el Real Decreto 175/2001 de 23 de febrero. 158 La distribución de productos farmacéuticos está regulada por leyes gubernamentales en la mayoría de los países. En EEUU, la Food and Drug Administration (FDA) controla la comercialización de los productos farmacéuticos. En la Unión Europea, cada país miembro es soberano a la hora de autorizar la comercialización de fármacos. En países como Alemania, el protocolo estándar de preparación sigue las directrices de la Guía del Bundesärztekammer (Colegio de Médicos) y del Instituto Paul Ehrlich para donación y uso de productos hemáticos. 55,145 En Inglaterra y Gales el protocolo estandarizado de preparación del colirio de SA sigue los principios recomendados por el Servicio Nacional de la Sangre y la Agencia de Control de Medicamentos de Gran Bretaña y de acuerdo con la guía para predepósito de autodonación de sangre del British Committe for Standard in Haematology. 159 En todos estos protocolos, al igual que en nuestro estudio, se aplicaron los mismos criterios para la preparación del colirio de SA que para la extracción de sangre destinada a donación, es decir, a los pacientes se les realizó previamente un despistaje de enfermedades infecciosas (VIH, VHB, VHC y sífilis), de tal forma que si la serología era positiva, se excluía al paciente directamente para el tratamiento con SA. En Inglaterra y Gales, 159 se excluyeron también, a pacientes con anemia o enfermedades cardiovasculares. La cantidad de sangre extraída y el tiempo transcurrido desde la extracción hasta la centrifugación, también varía según los artículos publicados, desde 30 minutos hasta 48 horas. En nuestro estudio, se extrajeron 30 mL de sangre que se repartieron en tres tubos. Posteriormente se enviaron los tubos al Banco de Sangre, donde se centrifugaron y se enviaron al Servicio de Farmacia. El tiempo transcurrido entre la extracción de la muestra de sangre y la centrifugación de la misma, en nuestro estudio, fue de 30 minutos. Este dato es similar a los obtenidos en los estudios realizados por Noble et al. 94 y Liu et al. 160 Ambos estudios mantuvieron un tiempo de coagulación de 30 minutos, COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 97 aunque observaron que un tiempo de coagulación de al menos dos horas previas a la centrifugación estaba relacionado con un mayor efecto del SA sobre la migración y diferenciación de las células epiteliales, por lo que recomiendan dejar los tubos en una rejilla en posición vertical a 22ºC durante dos horas para que la sangre coagule previo a la centrifugación. También encontraron en su estudio una mayor concentración de todos los factores relacionados en la migración y diferenciación celular. Otra de las variaciones no estandarizadas en la preparación del SA es la diversidad en la potencia y tiempo de centrifugación. De ellos depende la cantidad de SA obtenido, la pureza del mismo, y la concentración de los factores relacionados en la migración y diferenciación celular. Tsubota et al. 50 y García et al. 143 centrifugaron las muestras durante 10 minutos a 5.000 rpm. Geerling et al. 55 centrifugaron a 3.000 rpm durante 15 minutos y consideraron que, con estas revoluciones y tiempo de centrifugación, se producía una cantidad importante de suero sin hemólisis. Igualmente, si se empleara menos fuerza de centrifugación, además de que se consiguiría menos cantidad de suero, en éste podrían quedar restos de membrana de plaquetas que podrían producir apoptosis celular e irritación durante su administración. Geerling et al. 55 compararon los resultados de su SA con respecto a los obtenidos por Tsubota et al. 50 encontrando que cuando centrifugaban a 3000 rpm durante 30 minutos el SA presentaba una mayor concentración de EGF pero una menor concentración de TGF-β. Malavazzi et al. 161 centrifugaron el suero a 1.500 rpm durante una hora. Dada esta variabilidad, algunos autores como Poon et al. 80 consideran que la fuerza de centrifugación no sólo depende del número de rpm, sino que también depende del diámetro del rotor y éste varía según el tipo de centrifugadora. Por lo que a la hora de centrifugar la sangre para la realización del SA, prefieren hablar de fuerza «g», que englobaría tanto el número de rpm como el diámetro del rotor de la centrífuga. Esto les parece una medida más homogénea y aplicable, independientemente del modelo de la centrifugadora. Siguiendo esta consideración, Liu et al. 160 observaron en su estudio, que aumentando la fuerza de centrifugación de 500 a 3.000 g, aumentaba COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 98 considerablemente la concentración de EGF y Vitamina A en el SA, teniendo esto un efecto menos llamativo sobre el TGF-β. En nuestro estudio, las muestras fueron centrifugadas durante 10 minutos, a 3.000 rpm o (3100 g), dato que no coincidió con ninguno de los autores revisados previamente en la bibliografía. Esto es así porque el procesamiento de las muestras de suero sanguíneo destinadas a la preparación de colirio de SA se ajustó al protocolo de manejo de muestras de nuestro Banco de Sangre, procesadas con la centrifugadora Ortoalresa serie Digtor 21. También existen discrepancias entre los autores en la preparación del colirio de SA, si debe realizarse con suero fresco o suero congelado. En nuestro caso, de cada tubo de 10 mL de sangre, obtuvimos aproximadamente 5 mL de suero, que posteriormente se envío al Servicio de Farmacia, donde se preparó el colirio de SA con suero fresco sin congelar. Nosotros, al igual que Lagnado et al. 162 y Noble et al. 94 preparamos todos los envases de colirio de SA con suero fresco, dándoselos luego al paciente, e indicándole que los envases que vayan a ser utilizados deben mantenerse en la nevera a 4ºC y el resto, almacenarlos en el congelador a –20ºC o –30ºC. Sin embargo, Tsubota et al. 50 refieren que los componentes del SA son estables durante un mes a temperaturas de +4ºC y durante tres meses a –20ºC. En esta linea, Sitaramamma et al. 163 analizaron el efecto en la disminución de la concentración proteica (especialmente de la IgA y la lizosima), de las muestras de lágrimas, cuando éstas eran almacenadas durante 4 meses a temperaturas de -20ºC y -70ºC. De ello infieren que el colirio de SA congelado no pierde sus propiedades. Una vez en el Servicio de Farmacia, la preparación del colirio de SA, se realizó en condiciones asépticas y en una campana de flujo laminar, destinada a este fin. En nuestro estudio este paso coincidió con lo realizado por otros autores. 37,55,56,94,143,156,160,164 Al igual que otros autores, 56,94,157,161-163 no utilizamos filtro millipore en la preparación del SA. También existe controversia, en la utilización de estos filtros. Fox et al. 48 sí recomiendan el uso de filtros para separar del SA restos de fibrina que parecen reducir los efectos del mismo (la preparación del colirio de SA en su estudio se realizó con plasma congelado COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 99 previamente). También refieren que añade un efecto esterilizante al no dejar pasar microorganismos como bacterias. 31,48 López-García et al. 31 recomiendan la utilización de filtros millipore como el Durapore ® o el Millipore Express™. En su estudio, observaron que estos filtros presentan un poro con un tamaño de 0,22 μm y tienen una baja afinidad por las proteínas, siendo ambos útiles para los volúmenes que se manejan en el colirio de SA. Sin embargo destacan que el filtro Durapore ® se satura y obstruye más fácilmente, y el filtro Millipore Express™ presenta una membrana de poliéster sulfota, que la hace especialmente útil para el filtrado de estos productos biológicos. Con respecto a la dilución del suero para la preparación del colirio de SA también existe controversia. Nosotros, al igual que la mayoría de los autores 55,56,94,162,163 de la bibliografía revisada, utilizamos suero fisiológico para hacer la dilución del suero y obtener colirio de SA. En nuestro protocolo añadimos 40 mL de suero fisiológico a 10 mL de suero sanguíneo, para conseguir una concentración final de SA al 20%. Este dato difiere de otros estudios, que para obtener una concentración final del colirio de SA al 20%, añadieron 8 mL de suero fisiológico. 157,161 Autores como Liu et al. 160 emplearon Suero Salino Balanceado (BSS) para la dilución, pues encontraron mayor proliferación de células epiteliales en los cultivos cuando el colirio de SA se realizó con BSS. La concentración de SA en nuestro estudio fue del 20%, y coincidió con la concentración utilizada por la mayoria de los autores revisados en la bibliografía. 149,155,157,159,160,161,165-168 Tsubota et al. 50 no encontraron diferencias significativas entre preparados de colirio de SA al 10% y al 20%, en la migración de células epiteliales en cultivos in vitro. En su estudio, Mukerji et al. 164 además de no encontrar diferencias significativas en las diferentes concentraciones del colirio de SA, observaron que la concentración al 20% parece suficiente y evita las molestias derivadas de la mayor viscosidad del SA a mayor concentración. Además resaltan la disminución considerablemente del número de extracciones de sangre y la mayor adherencia de los pacientes al tratamiento. Sin embargo, Poon et al. 80 Noble et al. 94 Cho et al. 156 Gus et al. 157 Hussain et al. 165 y Hwang et al. 166 utilizaron colirio de SA a concentraciones de 50% y 100%, y encontraron, que a estas concentraciones hay una mayor COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 100 respuesta en los efectos sobre la superficie ocular. Hay que destacar, que los pacientes que participaron en estos estudios fueron pacientes con DED grave, y SS grave, que habían agotado todas las demás formas de tratamiento convencionales. Revisando la bibliografía, encontramos una gran variabilidad en la metodología de preparación, almacenaje y dispensación del colirio de SA. Asimismo, la mayoría de los autores coinciden en la necesidad de unificar criterios mediante estudios randomizados y multicéntricos para optimizar los resultados obtenidos con este tratamiento. 94,169-172 En la tabla XVIII se muestran las variaciones encontradas en la literatura referentes a las distintas fases de la preparación y aplicación del colirio de SA, mientras que en la tabla XIX se muestran de forma resumida las diferencias en la elaboración y dispensación del colirio de SA en diferentes publicaciones. 55 En la tabla XX se muestran los diferentes ensayos clínicos del uso del colirio de SA en el manejo de la DED. 149 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 107 hospitalaria y con la capacidad potencial de reducir costes en cuanto al número de consultas y procedimientos quirúrgicos requeridos por el paciente. Sin embargo, no existe una estandarización al establecer la concentración y pauta idónea del colirio de PRGF, no sólo en función de la patología ocular a tratar, sino también teniendo en consideración aquellos factores individuales que pudieran afectar a la composición del mismo, como la edad, estado de salud general del paciente, etc. El colirio de PRGF parecen ser una opción terapeútica segura y efectiva en pacientes con estadios II-III de queratopatia neurotrófica por: virus herpes simple, distrofias corneales, cirugías corneales, parálisis del V par craneal, infección por virus de herpes zoster, quemaduras oculares por cáusticos, 180 ya que se ha observado que estimula la proliferación y migración de queratocitos y fibroblastos conjuntivales y reduce e inhibe la diferenciación a miofibroblastos inducida por TGFβ1.173-175,177 Freire et al. 178 realizaron un estudio in vitro, comparando la concentración de los diferentes FC en los diferentes SA utilizados a nivel ocular, y encontraron, que el PRGF, presentaba niveles significativamente mayores de EGF (tabla XXI). Tabla XXI. Concentraciones de los principales FC y proteínas de adhesión en voluntarios sanos entre SA, PRP y PRGF. Preparados hemáticos EGF (pg/mL) PDGF (ng/mL) FGF (pg/mL) Fibronectina (µg/mL) Suero autólogo 417,9 + 82,6 17,3 + 3,7 58,5 + 54,6 31112 + 6758 PRP 279,8 + 78,1 18,2 + 6,4 57,0 + 44,4 30547 + 5104 PRGF 489,1 + 95,4* 15,5 + 4,6 58,2 + 41,2 31832 + 3563 *Estadísticamente significativo (p<0,05) entre plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) y plasma rico en plaquetas (PRP) así como entre PRGF y suero autólogo. EGF: factor de crecimiento epidérmico; FGF: factor de crecimiento de fibroblastos; PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetas. Adaptado de: Anitua et al. 179 COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 108 López-Plandolit Antolín S. 181 en su trabajo de tesis doctoral, estudió la seguridad y tolerancia de la utilización del PRGF a tres concentraciones distintas: 20%, 50%, 100%, en pacientes con DEP sin observar ningún caso de infección, ni incremento en la neovascularización, ni fibrosis corneal secundario a su utilización. Concluye que la aplicación del PRGF a esas tres concentraciones es seguro y tolerable. 8.6.4 COLIRIO DE SCU Es el colirio obtenido del suero de la sangre del cordón umbilical. Se extrae sangre después del parto (entre 60-80 mL) de la vena umbilical, y se maneja igual que el SA, con una dilución al 20%. Hasta el momento se ha usado con éxito en el tratamiento de: DED grave, EICH ocular y erosión corneal recurrente. 170 8.6.5 COLIRIO DE MEMBRANA AMNIÓTICA (MA) Es el colirio obtenido del suero de la membrana amniotica de donantes con embarazo controlado y cesárea electiva. Previa verificación de cribado serológico negativo de: HIV, HBsAg, HBc Anticuerpos, VHB por DNA, VHCAnticuerpos, VHC por RNA, Sífilis y anticuerpos HTLV 1 y 2, se recoge la placenta y se preserva en cuarentena a 4ºC hasta su procesamiento. El procesamiento consiste en la separación de la MA del corion y la correspondiente descontaminación con antibióticos (penicilina, estreptomicina y anfotericina B). Posteriormente el tejido se somete a un proceso de triturado y centrifugación para obtener el extracto. El proceso concluye con la liofilización y posterior reconstitución para obtener un colirio al 20%. Este producto, contiene factores de crecimiento como: EGF, bFGF, HGF y Endostatina. 8.6.6 PERSPECTIVAS FUTURAS Las perspectivas futuras de los productos derivados de la sangre incluyen la introducción de gotas oculares personalizadas, analizadas para determinar el contenido adecuado de los FC y las citoquinas según cada paciente y enfermedad de la superficie ocular. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 109 Sin embargo, es posible que con la extensión del empleo colirios derivados de los productos plasmáticos enriquecidos a concentraciones del 100%, puedan aumentar los efectos adversos y la intolerancia, y con ello surja la necesidad de establecer protocolos para, bien proceder a la dilución de los mismos, o a la inactivación del complemento e IG, mediante calentamiento, como recientemente publica el grupo de Anitua et al. 179 en el uso del PRGF. Para el futuro, queda la posibilidad de desarrollar un PRGF recombinante, enriquecido, mediante la adición al mismo, de ciertos FC, matrices biológicas o incluso células madre. Además, sería interesante asociarlo a determinados vehículos y/o presentaciones que permitiesen aumentar su permanencia en la superficie ocular. Finalmente, sería necesario realizar más ensayos clínicos, que comparen la efectividad y eficiencia de los distintos colirios existentes, especialmente el colirio de PRGF, con respecto al colirio de SA, por tratarse éste del producto hemoderivado más consolidado en Oftalmología. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DISCUSIÓN 110 8.7 LIMITACIONES DEL ESTUDIO La primera limitación de nuestro trabajo, hace referencia al tamaño muestral. Aunque el tamaño de la muestra se calculó mediante un muestreo probabilístico, teniendo en cuenta la variable más representativa (número de CC conjuntivales), el número final de los pacientes de nuestro estudio fue bajo (n=24). Esto ha impedido que en el análisis estadístico de los resultados hayamos podido estratificar nuestra variable dependiente, por diferentes estratos de otras variables independientes, puesto que al estratificar el número de pacientes en cada grupo, era demasiado bajo. Aún así, la recogida de estos 24 pacientes ha supuesto 1 año de seguimiento, puesto que la indicación del colirio de SA para el tratamiento de la DED, al menos en nuestro hospital sigue siendo baja, por no ser la primera opción terapéutica que se plantea en estos pacientes. La segunda limitación de nuestro estudio, fue que el 95,8% de nuestros pacientes eran mujeres, y sólo hubo un paciente varón. Es cierto que la DED es una patología más prevalente en mujeres que en hombres 2:1, pero no tan elevada, como la distribución de los pacientes de nuestro estudio. Esta distribución tampoco nos ha permitido, estudiar si existen o no diferencias en la respuesta al tratamiento de la DED con colirio de SA, relacionado con el género de los pacientes. La tercera limitación es la ausencia de un brazo control con placebo o un comparador activo. Sin embargo los cambios en la CIC por transferencia son observables y parecen consistentes con los encontrados por otros autores. 73,98,164,165 Para finalizar podemos concluir que el empleo del colirio SA en el tratamiento de la DED, es eficaz, mejorando la clínica de los pacientes, puesto que mejora la reepitelización y la densidad de las CC. No obstante, sería recomendable realizar más estudios con poblaciones más amplias e idéntica metodología de estudio en pacientes con DED, para confirmar nuestros resultados. IX. CONCLUSIONES COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO CONCLUSIONES 112 IX. CONCLUSIONES Las conclusiones de nuestro estudio son: 1. El tratamiento con colirio de SA para la DED, modificó la CIC por transferencia, aumentando el número de CC, el tamaño de las mismas a expensas del aumento de tamaño de su núcleo y aumento en la relación nucleo-citoplasma. Todos los cambios producidos en la citología de impresión conjuntival por transferencia fueron más significativos en los pacientes con DED grave. 2. Los pacientes con diagnóstico de DED, tratados con SA durante 1 mes, presentaron un aumento en la densidad de las CC conjuntivales. 3. El tratamiento con colirio de SA en pacientes con DED modificó el test de Schirmer y el test de BUT como consecuencia del aumento de la capacidad mucínica de la conjuntiva, al haber un aumento significativo del número y tamaño de las células caliciformes conjuntivales. 4. El grado de metaplasia escamosa conjuntival mejoró en todos los pacientes del estudio con DED tratados con colirio de SA. 5. Más del 90% de la población de nuestro estudio fueron mujeres. El 75% de los pacientes de nuestra población, tenía edades comprendidas entre la 4ª y 7ª década de la vida, siendo la edad de 50 años la más frecuente. El 75% de los pacientes presentaban una DED leve y moderada; el 25% restante presentaba una DED grave. En el 25% de los pacientes de nuestra población, la DED se asoció a AR. 6. Todos los pacientes presentaron una mejoría clínica con el tratamiento administrado de colirio de SA (1 gota de colirio de SA cuatro veces al día durante 1 mes). 7. En nuestro estudio, no encontramos ninguna reacción ni efecto adverso en el tratamiento con colirio de SA en pacientes con DED. Todos los pacientes presentaron buena tolerancia y buena adherencia al tratamiento. X. BIBLIOGRAFÍA COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO BIBLIOGRAFÍA 114 X. BIBLIOGRAFIA 1. Lin X, Huang J, Shi Y, Liu W. Tissue engineering and regenerative medicine in applied research: a year in review of 2014.Tissue Eng Part B Rev. 2015;21(2):177-86. 2. Vrana NE, Hasirci V, McGuinness GB, Ndreu-Halili A. Cell/tissue microenvironment engineering and monitoring in tissue engineering, regenerative medicine, and in vitro tissue models. Biomed Res Int. 2014;2014:951626. 3. 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Atentamente, Susana Martín Guijarro Departamento de Congresos SEHH-SETH C/ Aravaca nº 12, 1º B 28040 Madrid Tel.: + 34 91 319 19 98 - 628 92 34 14 Correo electrónico: [email protected] COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DIVULGACIÓN CIENTÍFICA 123 SUERO AUTÓLOGO AL 20% EN EL SÍNDROME DEL OJO SECO Valencia Castillo SL ; García Frade J A ; Sáez Martín E; Torres Tienza A; Díaz Valdés J; Olivier Cornacchia C; García Mateo A; Marcellini Antonio S; Zato Hernández E; Queizán Hernández J.A Servicio de Hematología y Hemoterapia del Complejo Hospitalario de Segovia A Jefe de Servicio Hematología y Hemoterapia. Hospital Rio Hortega Valladolid . Introducción: El colirio de suero autólogo (SA) , es un producto obtenido de la separación de los diferentes componentes sanguíneos del propio paciente. Posee muchos factores de crecimiento que ayudan a regenerar ciertas patologías oculares como el Síndrome del Ojo Seco.(SOS). El SOS es una enfermedad multifactorial muy frecuente caracterizada por una cantidad y calidad deficiente de lágrima. Los tratamientos convencionales con lágrimas artificiales carecen de muchos de los componentes activos de las lágrimas naturales. Existen diversos estudios con SA al 20% valorando la mejoría clínica de estos pacientes, pero son muy pocos los que valoran de forma cuantitativa el grado de mejoría y los cambios metaplásicos a nivel de la conjuntiva ocular. El objetivo de este estudio fue analizar los cambios histológicos de la conjuntiva, mediante la citología conjuntival por transferencia y la modificación de los test de Schirmer y de BUT tras el tratamiento con colirio de SA al 20% en pacientes con SOS. Material: El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Complejo Asistencial de Segovia en Septiembre del 2015. Se realizó un estudio descriptivo, prospectivo y analítico cuasi-experimental en pacientes adultos con diagnóstico de SOS a los que se les inició un tratamiento con colirio de SA al 20%. Se excluyeron pacientes con serología positiva para infección por el virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), sífilis, presencia de sueros hemolizados, y/o lipémicos. La muestra de sangre total fue centrifugada en el Servicio de Banco de Sangre a 3000 rpm durante 10 minutos y el suero obtenido fue enviado al Servicio de Farmacia para su preparación a la concentración del 20% (Figura 1). Cada paciente fue sometido a una primera citología de impresión conjuntival antes del tratamiento con colirio de SA al 20% (Figura 2). El paciente se administró una gota de colirio de SA al 20%, 4 veces al día en ambos ojos durante un mes. Al finalizar el tratamiento se realizó una segunda citología de impresión . Las citologías de impresión siempre las realizó el investigador principal en la región temporal superior del ojo derecho. Se determinó el número, tamaño, densidad, tamaño del núcleo, relación núcleo/citoplasma (N/C) y grado de metaplasia escamosa de las células caliciformes (CC) conjuntivales . El flujo y la estabilidad lagrimal se midieron por medio de los test de Schirmer y BUT . Resultados: Se incluyeron 24 pacientes, 23 eran mujeres (95,8%). La edad media fue 53,8 ± 12,6 años. El 41,7% presentaba SOS moderado y el 25% SOS severo. El 21% de los pacientes (n=5) presentaba artritis reumatoide (AR). En la citología de impresión aumentó significativamente el número de CC, su tamaño, relación N/C, densidad de las CC y mejoró el grado de metaplasia (Tabla I). Los test de Schirmer y BUT mejoraron de manera significativa tras el tratamiento. En el estudio multivariante, el incremento de células caliciformes conjuntivales se asoció de manera inversa con el resultado del test de Schirmer y de manera directa con la densidad de CC conjuntivales antes del tratamiento con SA al 20%. Conclusiones: El colirio de SA al 20% modificó la citología de impresión en pacientes con SOS, aumentando significativamente el número, tamaño, densidad y relación N/C de la CC, mejorando el grado de metaplasia escamosa No aparecieron reacciones adversas. VARIABLE PRETRATAMIENTO Media (DE) A POSTRATAMIENTO Media (DE) DIFERENCIA VALOR P B Número de CC C 202,3 (107,5) 210,1 (100,9) -6,2 <0,01 Tamaño de CC (µm) 24,5 (3,3) 30,8 (3,7) -6,3 <0,001 Densidad de CC 2,39 (0,91) 2,59 (0,72) -0,2 <0,05 Tamaño núcleo CC (µm) 6,91 (1,69) 7,71 (2,33) -0,8 <0,01 Tamaño citoplasma CC (µm) 26,29 (4,52) 26,62 (4,40) -0,33 >0.05 Relación N/C CC D 0,27 (0,08) 0,29 (0,1) -0,02 <0,01 Tabla I . Comparación de las principales variables de interés, obtenidas en la citología de impresión, antes y después del tratamiento. A Desviación Estándar. B Valor de P calculado mediante la Prueba de los Rangos con Signo de Wilcoxon. C. Células Calificormes. D Relación Núcleo / Citoplasma Células Caliciformes Figura 3: Comparación del número, tamaño y tamaño del núcleo de las células caliciformes, respectivamente, antes y después del tratamiento con Suero Autólogo. . Figura 1: Esquema de elaboración, dispensación y posología del colirio de Suero Autólogo en el Complejo Hospitalario de Segovia. Figura 2 : Recogida de muestras de conjuntiva mediante citología de impresión y preparación del colirio de Suero Autólogo al 20%. [email protected] COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DIVULGACIÓN CIENTÍFICA 129 95 CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE OFTALMOLOGÍA. COLIRIO DE SUERO AUTÓLOGO EN EL OJO SECO DIVULGACIÓN CIENTÍFICA 130 11.2 PUBLICACIONES A REVISTAS CIENTÍFICAS Blood Transfusion Art. n° 009-20 [email protected] <[email protected]> Mar 14/04/2020 12:37 Para: Valencia Castillo, Sandra Liliana <[email protected]> CC: [email protected] <[email protected]> Impact Factor (2018): 3.352 Dear Ms. Sandra Liliana Valencia Castillo, I am pleased to inform you that your manuscript 009-20 entitled AUTOLOGOUS SERUM EYE DROPS IMPROVE TEAR PRODUCTION, BOTH LACRIMAL FLOW AND STABILITY TESTS AND CONJUNCTIVA IMPRESSION CYTOLOGY WITH TRANSFER IN DRY EYE DISEASE. has been accepted on 14/04/2020 for publication in Blood Transfusion. Your manuscript will now be edited by our scientific editor and you will then be sent the galley proofs for your approval. Your work will be first pre-published on our web site and afterwards published in the printed issue of the Journal. Thank you for your collaboration. Yours sincerely, Luca Giovanni Mascaretti Editor in Chief Blood Transfusion