Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles

Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Treball final de grau Enginyeria de Sistemes Biològics Autora Tutor acadèmic Segona tutora Inés Fernández Moyano Xavier Sorribas Royo Aïda Magdalena Fullana Castelldefels, 2021 Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 2 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Resum Els nematodes fitoparàsits del gènere Meloidogyne (root-knot nematodes – RKN) són paràsits obligats de plantes, en les que produeixen agalles en les arrels, provocant simptomatologia no específica en la part aèria de la planta que va des d’un creixement retardat o irregular fins el marciment, manca o deficiència de nutrients essencials, disminució en el rendiment del cultiu i fins i tot la mort de la planta hoste. Meloidogyne està àmpliament distribuït arreu del món i causa elevades pèrdues de producció en un ampli rang de cultius, inclosos els cultius hortícoles. La creixent demanda, per part de la població, dels productes generats al sector hortícola, alerta de la necessitat d’augmentar el rendiment d’aquests cultius en un entorn on cal prioritzar les tècniques respectuoses amb el medi ambient i amb la salut dels usuaris i consumidors. Així doncs, la gestió del nematode mitjançant tècniques basades en l’ús d’organismes antagonistes que actuïn directament sobre el patogen o que actuïn indirectament induint mecanismes de defensa de la planta pot ésser una bona alternativa als fumigants o nematicides d’origen químic. En el present estudi, es va avaluar la capacitat de tres formulats comercials a base de microorganismes antagonistes de nematodes, concretament a base dels fongs Purpureocillium lilacinum soca 251 (PL) i Trichoderma asperellum soca T34 (T34), i del bacteri Bacillus firmus soca I- 1582 (BF) , d'induir resistència enfront Meloidogyne incognita en tomàquet, pebrot, meló i síndria, quatre dels principals cultius hortícoles que es conreen al nostre país. Els assajos es van fer en condicions controlades. Les llavors es van desinfectar superficialment i es van sembrar en safates que contenien vermiculita estèril i es van mantenir en cambra climàtica a 25 oC de temperatura i 16:8 h de fotoperíode (llum:foscor). Les plantes es van trasplantar en contenidors de 200 cm3 de capacitat que contenien sorra esterilitzada com a substrat quan tenien la segona fulla veritable estesa, i al cap d’una setmana es van aplicar 20 mL de suspensió de 109 UFC de BF, 7,5·105 UFC de PL i 2·106 UFC de T34 a la sorra i es van mantenir en cambra climàtica a les mateixes condicions. Al cap d’una setmana, el sòl es va infestar amb 200 juvenils de M. incògnita per planta. Els assajos van mantenir-se el temps suficient per a que el nematode completés una generació. Al final de l’assaig es va determinar l’efecte dels diferents microorganismes sobre la infectivitat, reproducció i fertilitat del nematode en cada cultiu, comparant les diferents variables entre plantes tractades i no tractades amb els microorganismes. Els resultats van mostrar que la capacitat dels microorganismes d’induir resistència envers M. incognita era dependent del tipus de cultiu. L’aplicació de BF va reduir la infecció, reproducció i fertilitat de M. incognita en un 81%, 87% i 32%, respectivament, en el cultiu de tomàquet, així com la fertilitat en meló en un 32%. El cultiu de síndria va mostrar una baixa tolerància a BF provocant la mort del 80% de les plantes. L’aplicació de T34 va reduir en un 38% el nombre de masses formades per M. incognita en el cultiu de meló. L’aplicació de PL no va tenir cap efecte sobre la capacitat infectiva, reproductora, ni sobre la fertilitat de les femelles en cap cultiu. Paraules clau: Purpureocillium lilacinum, Trichoderma asperellum, Bacillus firmus, nematode agallador, pebrot, tomàquet, meló i síndria. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 4 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Resumen Los nematodos fitoparásitos del género Meloidogyne (root-knot nematodos - RKN) son parásitos obligados de plantas, en las que producen agallas en las raíces, provocando sintomatología no específica en la parte aérea de la planta que va desde un crecimiento retardado o irregular hasta el marchitamiento, falta o deficiencia de nutrientes esenciales, disminución en el rendimiento del cultivo e incluso la muerte de la planta huésped. Meloidogyne está ampliamente distribuido en todo el mundo y causa elevadas pérdidas de producción en un amplio rango de cultivos, incluidos los cultivos hortícolas. La creciente demanda, por parte de la población, de los productos generados en el sector hortícola, alerta de la necesidad de aumentar el rendimiento de estos cultivos en un entorno donde hay que priorizar las técnicas respetuosas con el medio ambiente y con la salud de los usuarios y consumidores. Así pues, la gestión del nematodo mediante técnicas basadas en el uso de organismos antagonistas que actúen directamente sobre el patógeno o que actúen indirectamente induciendo mecanismos de defensa de la planta puede ser una buena alternativa a los fumigantes o nematicidas de origen químico. En el presente estudio, se valora la capacidad de tres formulados comerciales a base de microorganismos antagonistas de nematodos, concretamente a base de los hongos Purpureocillium lilacinum cepa 251 y Trichoderma asperellum cepa T34, y la bacteria Bacillus firmus cepa I-1582, de inducir resistencia frente Meloidogyne incognita en tomate, pimiento, melón y sandía, cuatro de los principales cultivos hortícolas que se cultivan en nuestro país. Los ensayos se hicieron en condiciones controladas. Las semillas se desinfectaron superficialmente y se sembraron en bandejas que contenían vermiculita estéril y se mantuvieron en cámara climática a 25 ᵒC de temperatura y 16:8 h de fotoperiodo (luz: oscuridad). Las plantas se trasplantaron en contenedores de 200 cm3 de capacidad que contenían arena esterilizada como sustrato cuando tenían la segunda hoja verdadera extendida y al cabo de una semana se aplicaron 20 mL de suspensión de 109 UFC de BF, 7, 5 · 105 UFC de PL y 2 · 106 UFC de T34 en la arena y se mantuvieron en cámara climática en las mismas condiciones. Al cabo de una semana, el suelo se infestó con 200 juveniles de M. incognita por planta. Los ensayos se mantuvieron el tiempo suficiente para que el nematodo completara una generación. Al final del ensayo se determinó el efecto de los diferentes microorganismos sobre la infectividad, reproducción y fertilidad del nematodo en cada cultivo, comparando las diferentes variables entre plantas tratadas y no tratadas con los microorganismos. Los resultados mostraron que la capacidad de los microorganismos de inducir resistencia hacia M. incognita era dependiente del tipo de cultivo. La aplicación de BF redujo la infección, reproducción y fertilidad de M. incognita en un 81%, 87% y 32%, respectivamente, en el cultivo de tomate, así como la fertilidad en melón en un 32%. El cultivo de sandía mostró una baja tolerancia a BF provocando la muerte del 80% de las plantas. La aplicación de T34 redujo en un 38% el número de masas formadas por M. incognita en el cultivo de melón. La aplicación de PL no tuvo ningún efecto sobre la capacidad infectiva, reproductora, ni sobre la fertilidad de las hembras en ningún cultivo. Palabras clave: Purpureocillium lilacinum, Trichoderma asperellum, Bacillus firmus, nematodo agallador, pimiento, tomate, melón y sandía. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 6 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Abstract The plant-parasitic nematodes of the genus Meloidogyne (root-knot nematodes - RKN) are obligate parasites of plants, in which they produced galls in the roots, causing nonspecific symptomatology in the aerial part of the plant that goes from a delayed or irregular growth to wilting, lack or deficiency of essential nutrients, decrease in crop yield and even death of the host plant. Meloidogyne is widely distributed around the world and causes high production losses in a wide range of crops, including horticultural crops. The growing demand of the population for the products generated in the horticultural sector makes it necessary to increase the yields of these crops, but through environmentally and health friendly techniques. Thus, the management of plantparasitic nematodes by means of antagonistic organisms that act directly on the pathogen or that act indirectly by inducing plant defense mechanisms can be a good alternative to chemical fumigants or nematicides. The present study evaluated the ability of three commercial formulations based on nematode antagonist microorganisms, specifically based on the fungi Purpureocillium lilacinum strain 251 and Trichoderma asperellum strain T34 and the bacterium Bacillus firmus strain I-1582, to induce resistance against Meloidogyne incognita in tomato, pepper, melon and watermelon, four of the main horticultural crops that cultivate in our country. The trials were conducted under controlled conditions. The seeds were superficially disinfected and sown in trays containing sterile vermiculite and kept in a climatic chamber at 25 ᵒC temperature and 16:8 h photoperiod (light: dark). The plants were transplanted in containers of 200 cm3 capacity containing sterilized sand as a substrate when they had the second true leaf spread and after one week 20 mL of suspension of 109 CFU of BF, 7, 5 · 105 CFU of PL and 2 · 106 CFU of T34 was applied in the sand and were kept in climatic chamber under the same conditions. One week later, the soil became infested with 200 juveniles of M. incognita per plant. The trials lasted long enough for the nematode to complete a generation. At the end of the trial, the effect of different microorganisms on the infectivity, reproduction and fertility of the nematode in each culture was determined by comparing the different variables between treated and untreated plants with the microorganisms. The results showed that the ability of microorganisms to induce resistance to M. incognita was dependent on the type of culture. Application of BF reduced M. incognita infection, reproduction and fertility by 81%, 87% and 32%, respectively, in tomato cultivation, as well as fertility in melon by 32%. Watermelon crop showed a low tolerance to BF causing the death of 80% of plants. Application of T34 reduced the number of masses formed by M. incognita by 38% in melon cultivation. Application of PL had no effect on infectious, reproductive capacity, or on fertility of females in any crop. Keywords: Purpureocillium lilacinum, Trichoderma asperellum, Bacillus firmus, root-knot nematodes, pepper, tomato, melon and watermelon. Sumari ÍNDEX DE FIGURES______________________________________________________________ 8 ÍNDEX DE TAULES ______________________________________________________________ 9 SÍMBOLS I ACRÒNIMS __________________________________________________________ 10 AGRAÏMENTS ________________________________________________________________ 11 1. INTRODUCCIÓ ___________________________________________________________ 12 1.1. Importància dels cultius hortícoles .................................................................................... 12 1.2. Meloidogyne spp ................................................................................................................ 15 1.2.1. Cicle de vida ................................................................................................................ 16 1.2.2. Efecte sobre els cultius hortícoles .............................................................................. 18 1.3. Gestió de Meloidogyne spp. mitjançant agents de control biològics................................ 19 1.3.1. Bacillus firmus soca I-1582 ......................................................................................... 20 1.3.2. Purpureocillium lilacinum soca 251 ........................................................................... 21 1.3.3. Trichoderma asperellum soca T34 ............................................................................. 22 2. OBJECTIUS ______________________________________________________________ 24 3. MATERIALS I MÈTODES ___________________________________________________ 25 3.1. Material vegetal, productes comercials a base de microorganismes i nematode ........... 25 3.2. Assajos ................................................................................................................................ 25 3.2.1. Sembra, germinació i trasplantament ....................................................................... 26 3.2.2. Tractament amb els formulats comercials a base de microorganismes ................... 27 3.2.3. Extracció de DNA i detecció dels microorganismes mitjançant PCR ......................... 27 3.2.4. Inoculació del nematode ............................................................................................ 29 3.2.5. Anàlisis estadístiques ................................................................................................. 31 4. RESULTATS _____________________________________________________________ 32 5. DISCUSSIÓ ______________________________________________________________ 37 CONCLUSIONS ________________________________________________________________ 41 BIBLIOGRAFIA ________________________________________________________________ 42 Referències bibliogràfiques ........................................................................................................... 42 ANNEXOS ____________________________________________________________________ 50 Annex A: Concentració de l’inòcul i la seva viabilitat .................................................................... 50 Annex B: Resultats del pes, recompte de masses i ous i determinació de la fertilitat. ................ 52 Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 8 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Índex de figures Figura 1. Distribució de la producció de fruites i hortalisses. A: Mundial (FAOSTAT, 2016). B: Europea (EUROSTAT, 2017). ______________________________________________________________________ 12 Figura 2. Producció mitjana de tomàquets (frescs); xilis, pebrots picants i pebrots (verds); melons (inclosos cantalupe) i síndries, a Espanya des de l’any 1994 al 2019 (FAOSTAT, 2019). ________________________ 13 Figura 3. Evolució temporal del rendiment dels cultius de tomàquets (frescs); xilis, pebrots picants i pebrots (verds); melons (inclosos cantalupe) i síndries a Espanya (FAOSTAT, 2019). __________________________ 15 Figura 4. Morfologia dels nematodes formadors de nòduls (Meloidogyne spp). A: ous i juvenils; B: femella adulta piriforme; C: regió anterior de la femella on es pot veure l’estilet (es); D: regió anterior de la femella que mostra el porus excretor (pe); E, F: regions anterior i posterior del juvenil infectiu (J2); G: regió caudal del mascle (Castillo i Verdejo-Lucas, 2011) . ___________________________________________________________ 16 Figura 5. Cicle vital dels nematodes del gènere Meloidogyne (Mitkowski i Abawi, 2003). ______________ 17 Figura 6. Agalles formades en una planta de tomàquet cv. Durinta infestada per M. incognita procedent d’un experiment de l’hivernacle d’Agropolis ubicat a Viladecans (Font pròpia). ___________________________ 18 Figura 7. Esquema de les fases a seguir per dur a terme l’experiment. ______________________________ 25 Figura 8. Plantes de pebrot cv. Tinsena just després de trasplantar (Font pròpia). ____________________ 26 Figura 9. Arrels de tomàquet cv. Durinta sense tractar on es poden visualitzar les masses d’ous tenyides amb erioglaucina (Font pròpia). ________________________________________________________________ 30 Figura 10. Gel d’electroforesi al 2% d’agarosa carregat amb 10µL de producte de PCR. M: marcador de pes molecular conegut; T34: DNAg de Trichoderma asperellum soca T34 amplificat amb els encebadors específics; T34 (-) control negatiu de la PCR de T34; BF: Bacillus firmus soca I-1582 amplificat amb els encebadors específics; BF (-) control negatiu de la PCR de BF; PL: Purpureocillium lilacinum soca 251 amplificat amb els encebadors específics; PL (-) control negatiu de la PCR de PL. _____________________________________ 33 Figura 11. Arrels de pebrot cv. Tinsena, tomàquet cv. Durinta, síndria cv. Sugar baby i meló cv. Charentais sense tractar i tractades amb T34, PL I BF cop finalitzat l’experiment (Font pròpia). ___________________ 35 Índex de taules Taula 1. Encebadors utilitzats per a la PCR. ___________________________________________________ 28 Taula 2. Quantificació de T34, PL i BF en NanoDrop on ng/mL indica la concentració en què es troba cada microorganisme i 260/280 la presència d’RNA i la qualitat del material. ____________________________ 32 Taula 3. Pes d’arrel, infectivitat, reproducció i fertilitat del nematode en els cultivars susceptibles de pebrot (Tinsena), tomàquet (Durinta), síndria (Sugar baby) i meló (Charentais) no tractats (Control) o tractats amb T34 Biocontrol (T34), BioAct (PL) o Votivo (BF) una setmana després de trasplantar el cultiu en contenidors de 200 cm3 de capacitat, i inoculats una setmana després amb 200 J2 de M. incognita per planta i mantinguts en cambra climàtica fins que el nematode completés una generació. _________________________________ 34 Taula 4. Eficiència de cada microorganisme a les 48h i 72h després de la sembra. ____________________ 51 Taula 5. Resultats obtinguts en pebrot cv. Tinsena. _____________________________________________ 52 Taula 6. Resultats obtinguts en tomàquet cv. Durinta. __________________________________________ 54 Taula 7. Resultats obtinguts en Síndria cv. Sugar Baby. __________________________________________ 56 Taula 8. Resultats obtinguts en meló cv. Charentais. ____________________________________________ 57 Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 16 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles continua d’aliment a la que romanen units fins acabar el seu cicle vital (Castillo i Verdejo-Lucas, 2011). A la Figura 4, podem observar la morfologia dels nematodes d’aquest gènere. 1.2.1. Cicle de vida El seu cicle vital consta de sis estadis de desenvolupament: ou, quatre estadis juvenils (J1-J4) i l’estadi adult (Figura 5) . Els ous es troben agregats en una matriu gelatinosa (massa d’ous) que els protegeix enfront a condicions adverses. El desenvolupament embrionari dona lloc al juvenil de primer estadi (J1) que mudarà dins l’ou donant lloc al J2. El J2 emergirà de l’ou, i serà l’únic estadi juvenil que es troba lliure al sòl i cercarà una arrel per parasitar. El J2 penetra l’arrel prop de la zona d’elongació mitjançant l’acció mecànica de l’estilet i l’acció dels enzims segregats pel nematode per Figura 4. Morfologia dels nematodes formadors de nòduls (Meloidogyne spp). A: ous i juvenils; B: femella adulta piriforme; C: regió anterior de la femella on es pot veure l’estilet (es); D: regió anterior de la femella que mostra el porus excretor (pe); E, F: regions anterior i posterior del juvenil infectiu (J2); G: regió caudal del mascle (Castillo i Verdejo-Lucas, 2011) . dissoldre el ciment intercel·lular, i migra fins arribar al cilindre vascular (Castillo i Verdejo-Lucas, 2011). Un cop allà, establirà un lloc d’alimentació, induint canvis morfològics i fisiològics en les cèl·lules que envolten el cap , convertint-les en cèl·lules gegants i multinucleades amb una elevada taxa metabòlica que permeten l’alimentació del nematode durant la resta de la seva vida. Les modificacions que causen en els teixits donen lloc als nòduls o agalles que són característics de les plantes parasitades per aquest gènere. Un cop establerta la infecció, el J2 pren forma de salsitxa i esdevé sedentari, a cada muda (J3 i J4), la llargària i amplada del juvenil incrementa abans de diferenciar-se en femella o mascle adults. En condicions optimes per al desenvolupament de la població, arriba a l’estadi de femella adulta, i comença a produir la matriu gelatinosa on s’aniran acumulant els ous a mida que els vagi produint, tancant així el cicle. Si les condicions són adverses, el juvenil esdevé mascle, que és vermiforme i viurà lliure en el sòl sense alimentar-se, reduint així la competència intraespecífica. La durada del cicle de vida depèn principalment de la temperatura del sòl, ja que es tracta d‘un organisme poiquiloterm, i de la planta hoste (Ornat i Sorribas, 2008). Figura 5. Cicle vital dels nematodes del gènere Meloidogyne (Mitkowski i Abawi, 2003). Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 18 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles 1.2.2. Efecte sobre els cultius hortícoles A conseqüència de la infecció per Meloidogyne spp., la part aèria de les plantes afectades poden mostrar símptomes de marciment degut a la dificultat de les arrels per absorbir l’aigua i els nutrients essencials pel seu creixement, cosa que fa que també puguin presentar signes de manca o deficiència de nutrients, com la clorosis. A més, el creixement es veu retardat, el rendiment del cultiu disminueix considerablement i, si la densitat de població és molt elevada, la planta hoste pot arribar a morir. No obstant, aquesta simptomatologia no és específica dels nematodes, sinó que pot estar causada per altres factors biòtics o abiòtics. El símptoma característic de l’atac de Meloidogyne es localitza a les arrels, on s’aprecien les agalles o nòduls (Figura 6). Les pèrdues màximes de producció varien en funció del cultiu, les densitats de població del nematode en el moment del transplantament i el número de cicles que el nematode pugui completar durant el cultiu. Les pèrdues màximes de producció causades per Meloidogyne en tomàquet, pebrot, meló i síndria a la conca mediterrània varien entre el 37% i el 90% (Greco i Di Vito, 2009; López-Gómez et al., 2014; Giné i Sorribas, 2017; Expósito et al., 2020). Figura 6. Agalles formades en una planta de tomàquet cv. Durinta infestada per M. incognita procedent d’un experiment de l’hivernacle d’Agropolis ubicat a Viladecans (Font pròpia). 1.3. Gestió de Meloidogyne spp. mitjançant agents de control biològics Per tal de disminuir la densitat de nematodes per sota del llindar de tolerància en les plantacions, límit a partir del qual el cultiu comença a experimentar pèrdues de producció, s’han establert diversos tipus d’estratègies. La complexitat de la gestió d’aquests organismes ve donada pel genotip, per la variabilitat de poblacions segons el tipus de sòl, i per les característiques d’aquest tals com la temperatura, humitat i composició, entre d’altres (Ravichandra, 2014). La seva gestió es pot dur a terme de manera: preventiva, emprant material vegetal lliure de nematodes i sòls verges; reduint el nivell de població inicial abans de plantació amb tècniques com la biofumigació, la solarització, el cultiu trampa, l’ús de nematicides químics, el descans i treball del sòl, entre d’altres; o reduint la taxa de multiplicació amb resistència vegetal, rotació de cultius, o mitjançant agents de control biològics (Talavera i Verdejo-Lucas, 2015). Tot i la diversitat de mètodes existents per dur a terme una bona gestió dels nematodes fitoparàsits, cadascun presenta uns determinats avantatges i limitacions. La solarització, per exemple, pot ser altament eficaç enfront els nematodes quan es realitza un mínim de 4 setmanes en l’època de major radiació solar, adquirint el sòl temperatures d’entre els 35 ᵒC i els 50 ᵒC fins uns 30 cm de profunditat, no obstant, no és un mètode selectiu i pot reduir components del sòl que afectin a organismes antagonistes de certs patògens de plantes (inclosos els nematodes). El control químic, té una elevada i ràpida eficàcia, però el seu ús s’ha vist molt restringit en els últims anys, en què s’han prohibit la gran majoria (per exemple el bromur de metil i el 1,3-dicloropropè) degut a les exigències legislatives actuals (Giné et al. 2020) derivades de l’elevat risc potencial de contaminació ambiental que suposen i la toxicitat que poden generar als productors i consumidors (Andrés, 2002). L’ús de varietats resistents limita la capacitat infectiva i/o reproductiva dels nematodes sense afectar a la producció dels cultius de forma significativa i és un mètode efectiu, econòmic i de baix impacte ambiental, però pot generar l’aparició de poblacions virulentes si se’n fa un ús reiterat. Espaiar el temps entre cultius susceptibles mitjançant la rotació de cultius també podria disminuir suficientment les poblacions de nematodes obtenint bons resultats en el control però l’efectivitat és molt dependent de la gamma d’hostes sobre la que pot actuar el nematode (Ornat i Sorribas, 2011). El control biològic consisteix en fer ús de fongs, bacteris Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 20 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles o altres organismes, que són antagonistes d’un determinat paràsit que suposa danys en una plantació per tal de reduir-lo o eliminar-lo. Les soques de l’agent emprat han de tenir la capacitat d’entrar en contacte amb la planta sense produir danys o símptomes de malaltia (Rubio i Fereres, 2005). Amb aquests, es regulen les poblacions de nematodes de manera directa per l’acció antagònica dels organismes, indirecta pels metabòlits produïts per aquests, interferint en el procés de reconeixement de l’hoste o mitjançant la inducció de mecanismes de resistència en la planta (Ornat i Sorribas, 2011) ja que la majoria d’aquests agents estan composts per productes o substàncies capaces d’activar el sistema immunològic (priming) requerint un elevat coneixement, una manipulació delicada i podent necessitar més temps per obtenir resultats visibles (Artal, 2019). Tot i això, el control biològic té un impacte ambiental molt inferior a altres tècniques i, a més, evita l’aparició de resistències. No obstant, l’eficàcia és escassa quan les densitats poblacionals de nematodes són elevades o quan s’utilitza com a únic mètode de control (Giné et al.2020) pel que es podria millorar aplicant formulats comercials a base dels microorganismes de control biològic (Ornat i Sorribas, 2011). Entre els microorganismes capaços de controlar els nematodes fitoparàsits es troben els bacteris, els fongs i els actinomicets. Els bacteris no patògens poden actuar de manera antagònica per diverses vies: induint resistència vegetal (resistència sistèmica o induïda); degradant compostos de senyalització que atrauen als nematodes; o establint-se a les arrels bloquejant així l’entrada de juvenils. Alguns microorganismes actuen produint compostos tòxics pels nematodes i altres, els parasiten, com és el cas dels fongs. Entre els agents biològics més prometedors pels RKN es troben fongs dels gèneres Purpureocillium i Trichoderma i rizobacteris com Bacillus firmus, que es comercialitzen en l’actualitat (Lamovsek et al., 2013). 1.3.1. Bacillus firmus soca I-1582 Bacillus firmus és un bacteri gram-positiu que forma espores del qual només certes soques presenten activitat nematicida (Wilson i Jackson, 2013). Pertany a la família Bacillaceae i es troba present de forma natural al sòl, la rizosfera i el medi aquàtic (Tiraferri et al., 2012). Aquest tipus de bacteris es consideren promotors del creixement de la planta (PGPB) per la qual cosa, en la seva presència és possible observar beneficis en el contingut de nutrients minerals essencials (nitrogen, fòsfor, ferro...), en la quantitat de biomassa i en la llargada d’arrels i brots, així com millores en la germinació i resistència a diversos agents nocius externs, entre d’altres (Mingunova i Sasanelli, 2021). La soca I-1582 d’aquest bacteri ha estat aïllada i seleccionada per la seva activitat nematicida. Actua trencant les parets dels ous de nematode causant la seva mort. A més, el fet que és un organisme que es desenvolupa a la rizosfera de les plantes evita la infecció dels nematodes. No obstant, per tal que la seva activitat sigui eficaç ha d’entrar en contacte amb l’arrel abans que es produeixi la infecció del nematode, ja que no pot actuar si aquest ja ha penetrat l’arrel. També té efectes positius sobre el desenvolupament de les arrels, la planta i el seu rendiment degut a la producció de determinades fitohormones com l’àcid indolacètic (IAA) (Pieterse et al., 2014). Estudis en tomàquet han mostrat una excel·lent activitat nematicida enfront Meloidogyne i també s’ha demostrat la seva eficàcia en el control d’algunes especies en cultius de cogombre, carbassó, meló, síndria, pebrot, albergínia i enciam tant en camp com en hivernacle (Tiraferri et al., 2012). Altres estudis de B. firmus I-1582 marcat amb GFP han demostrat la capacitat d’aquest per degradar la closca dels ous i colonitzar aquests i les arrels de la planta, tot i que, s’ha vist que no en tots els cultius tenen el mateix grau de colonització ni la capacitat d’induir la resistència sistèmica (Ghahremani et al., 2020). Aquesta substància activa està aprovada pel seu ús fitosanitari per la Unió Europea tal com es contempla al reglament d’execució (RE) 366/2013 (DOUE, 2013). 1.3.2. Purpureocillium lilacinum soca 251 Purpureocillium lilacinum, anomenat anteriorment Paecilomyces lilacinus és un fong de la família Trichocomaceae existent al sòl de forma natural que té un gran interès científic pel seu antagonisme enfront els nematodes paràsits de plantes (Vinces, 2019). És un fong sapròfit, que es caracteritza pel color rosat de les seves colònies (Perdomo et al., 2012). La seva acció nematicida consisteix en infectar diferents estadis del desenvolupament dels nematodes, especialment s’alimenta dels ous ja que és l’estadi menys mòbil, però també de juvenils, causant la seva mort . Els avantatges principals del seu ús són: la reducció de la taxa de multiplicació dels nematodes, la fàcil manipulació i baixa dosificació i el potencial que té per incrementar la collita millorant el vigor i salut de les arrels (Bayer CropScience, 2021). A més, s’ha Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 22 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles vist que durant el seu creixement produeix metabòlits secundaris que impedeixen que el nematode trobi les arrels (Farfan, 2011). Experiments en camp realitzats per Rojas (2017) mostren reduccions significatives de l’índex d’agalles en tomàquet respecte al control amb un 58,4% d’eficàcia. En aquests també es van observar efectes positius a la part aèria de la planta, tals com un creixement major i uns resultats superiors en quant a l’alçada, pes, biomassa i producció obtingudes. No obstant, la seva presència en el sòl no és garantia pel control eficaç dels RKN ja que en molts casos es requereixen múltiples aplicacions de conidis viables (Gortari i Roque, 2016). La soca 251 d’aquest fong conté una quantitat de espores viables de 4,7·1010 UFC/g i està registrada com a producte fitosanitari essent autoritzada únicament per usos nematicides al RE-540/2011 (DOUE, 2011). 1.3.3. Trichoderma asperellum soca T34 Trichoderma fa referència a un gènere de fongs pertanyents a la família dels Hypocreaceae que inclouen diferents formes de vida: sapròfita, micoparasita o simbionts. S’associen a la rizosfera i es consideren agents de control biològics eficaços per a varis patògens de plantes (Martínez-Medina, et al., 2017). Alhora, es coneix que algunes soques són capaces de millorar el creixement de les plantes i activar mecanismes de defensa induïda d’aquesta (ISR). Els ISR venen regulats principalment per quatre senyals hormonals: àcid abscísic (ABA), àcid salicílic (AS), àcid jasmònic (AJ) i etilè (ET) (Grant i Jones., 2009) que interactuen entre elles adaptant-se a les necessitats del moment. La soca T34 del fong Trichoderma asperellum és un agent de control biològic desenvolupat per Biocontrol Technologies S.L (Universitat de Barcelona). Està composta per conidis secs, concretament conté una concentració de 1012 UFC/Kg (Biocontrol Technologies, 2021). Aquest microorganisme inoculat en el substrat indueix resistència sistèmica a la planta i actua com agent de control biològic enfront a diverses malalties associades als cultius (Casanova et al., 2008). Martínez-Medina et al. (2016) va analitzar les alteracions hormonals de la planta en les rutes de l’àcid salicílic i l’àcid jasmònic en la interacció planta-fong-nematode, i van concloure que la interacció del fong amb la planta aporta protecció al incrementar l’expressió de gens implicats en aquestes vies metabòliques incrementant la resistència de la planta envers el nematode. No obstant, no totes les especies i aïllats capaços de induir resistència a una espècie vegetal ho són a totes. Per exemple T34 inductor de resistència en tomàquet en front a Meloidogyne no ho és en cogombre (Pocurull et al. 2020). L’ús de Trichoderma per combatre nematodes no està aprovat a la unió europea, sinó que la legislació vigent només permet l’ús de determinades soques per tractar els efectes nocius d’altres fongs (Pocurull et al., 2020). La soca T34 Biocontrol està certificada pel seu ús com a bio-fungicida en producció agrícola amb el nº de registre ES-00283 (MAPA, 2016). Tenint en compte els resultats d’estudis previs, és important determinar a quines especies hortícoles s’indueix resistència per part de microorganismes a fi d’aprofitar la interacció pel control del nematode. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 24 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles 2. Objectius L’objectiu general del treball va ser avaluar la capacitat de tres productes fitosanitaris comercials a base dels microorganismes Bacillus firmus, Purpureocillium lilacinum i Trichoderma asperellum d’induir resistència envers nematodes de l’espècie Meloidogyne incognita en cultius de gran importància econòmica pertanyents a la família de solanàcies (tomàquet i pebrot) i cucurbitàcies (meló i síndria). Per tal d’aconseguir l’objectiu general es van analitzar els següents paràmetres del nematode: • La infectivitat, a través d’un recompte del nombre de masses d’ous produïdes per planta. • La reproducció, quantificant el nombre d’ous produïts per planta. • La fertilitat, calculada a partir de la relació entre el nombre d’ous i el nombre de masses d’ou per planta. 3. Materials i mètodes 3.1. Material vegetal, productes comercials a base de microorganismes i nematode El material vegetal emprat per la realització d’aquest estudi va ser tomàquet cv. Durinta; pebrot cv. Tinsena; meló cv. Charentais; síndria cv. Sugar baby. Els productes comercials a base de microorganismes utilitzats van ser: T34 Biocontrol (T34), a base de Trichoderma asperellum soca T34 i comercialitzat per Biocontrol Technologies; BioAct (PL), a base de Purpureocillium lilacinum soca 251 i comercialitzat per Bayer CropScience; i Votivo (BF), a base de Bacillus firmus soca I-1582 i comercialitzat per BASF. La població Agròpolis de M. incognita utilitzada en els assajos es mantenia multiplicant-se en tomàquet a Agròpolis. 3.2. Assajos Els assajos es van dur a terme als laboratoris i cambres climàtiques del Departament d’Enginyeria Agroalimentària i Biotecnologia i de l’Escola d’Enginyeria Agroambiental i de Biosistemes de Barcelona de la Universitat Politècnica de Catalunya. Es va fer un assaig per cada espècie vegetal. Cada assaig constava de 4 tractaments, tres corresponents a cada producte comercial a base de microorganismes i un control sense tractar per a comparar. Cada tractament constava de 20 repeticions. El procediment i la cronologia de cada assaig va seguir l’esquema que es mostra a la Figura 7. Figura 7. Esquema de les fases a seguir per dur a terme l’experiment. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 32 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles 4. Resultats El resultat de la verificació de que els formulats emprats contenien els microorganismes amb què es volia inocular a partir de la detecció mitjançant PCR es mostren a continuació. La qualitat del DNA dels microorganismes que es va obtenir amb el NanoDrop va ser la que es mostra a la Taula 2. Microorganisme ng/mL 260/280 T34 225,3 1,85 PL 38,8 1,98 BF 68,7 1,94 Els resultats de la PCR van demostrar que vàrem inocular amb els microorganismes desitjats (Figura 10) ja que es troben els amplicons específics de T34 (144pb) de PL (94 pb) i de BF (93 pb) als carrils on vam inserir el DNAg d’aquests, respectivament. Taula 2. Quantificació de T34, PL i BF en NanoDrop on ng/mL indica la concentració en què es troba cada microorganisme i 260/280 la presència d’RNA i la qualitat del material. Els resultats relatius al pes radicular, la capacitat infectiva, reproductora i la fertilitat de les femelles en els diferents cultius tractats i no tractats amb els diferents microorganismes es detallen a l’Annex B. Els resultats mostren que l’aplicació de T34 o BF en els diferents cultius no ha tingut el mateix efecte sobre el nematode, però sí el tractament amb PL, que no va afectar la capacitat infectiva i reproductora del nematode, ni tampoc la fertilitat de les femelles, independentment del cultiu tractat (Taula 3). Val a dir, que el pes radicular de la majoria de cultius tractats va ser inferior al control sense tractar. La longitud de les arrels, tot i que no es va mesurar, va ser menor en relació al control sense tractar, el que podria explicar part dels resultats dels experiments (Figura 11). Figura 10. Gel d’electroforesi al 2% d’agarosa carregat amb 10µL de producte de PCR. M: marcador de pes molecular conegut; T34: DNAg de Trichoderma asperellum soca T34 amplificat amb els encebadors específics; T34 (-) control negatiu de la PCR de T34; BF: Bacillus firmus soca I-1582 amplificat amb els encebadors específics; BF (-) control negatiu de la PCR de BF; PL: Purpureocillium lilacinum soca 251 amplificat amb els encebadors específics; PL (-) control negatiu de la PCR de PL. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 34 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Cultiu Tractament Nº repeticions Pes (g) Infectivitat (nº masses) Reproducció (nº ous) Fertilitat (nº ous / nº masses) Pebrot cv. Tinsena Control 16 0,8430 ± 0,06 2 ± 0,5 653 ± 175 300 ± 61 T34 16 1,8212 ± 0,18* 4 ± 0.5 * 1709 ± 240 * 448 ± 48 PL 16 1,1703 ± 0,01 * 3 ± 0,5 716 ± 119 215 ± 29 BF 12 1,0896 ± 0,11 * 1± 0,3 283 ± 76 226 ± 32 Tomàquet cv. Durinta Control 16 0,8943 ± 0,07 70 ± 15 25232 ± 2343 375 ± 36 T34 16 0,6083 ± 0,03 * 75 ± 3,8 31602 ± 1733 422 ± 21 PL 16 0,5891 ± 0,04 * 68 ± 3,5 22286 ± 1718 333 ± 23 BF 16 0,2947 ± 0,03 * 18 ± 3 * 4080 ± 722 * 255 ± 37 * Síndria cv. Sugar Baby Control 10 0,4211 ± 0,05 14 ± 3,5 8155 ± 2103 564 ± 59 T34 15 0,5076 ± 0,04 6 ± 0,8 3296 ± 618 522 ± 75 PL 14 0,2531 ± 0,03 * 9 ± 1,6 4711 ± 753 634 ± 102 BF 3 0,1410 ± 0,02 * 3 ± 1,2 1289 ± 610 418 ± 100 Meló cv. Charentais Control 10 0,7871 ± 0,04 17 ± 1,9 10473 ± 1902 599 ± 64 T34 10 0,6757 ± 0,08 11 ± 1,9 * 7124 ± 1639 704 ± 73 PL 10 0,4591 ± 0,03 * 14 ± 1,9 7297 ± 1077 560 ± 86 BF 10 0,3655 ± 0,02 * 27 ± 3,2 * 10496 ± 1583 409 ± 39 * Taula 3. Pes d’arrel, infectivitat, reproducció i fertilitat del nematode en els cultivars susceptibles de pebrot (Tinsena), tomàquet (Durinta), síndria (Sugar baby) i meló (Charentais) no tractats (Control) o tractats amb T34 Biocontrol (T34), BioAct (PL) o Votivo (BF) una setmana després de trasplantar el cultiu en contenidors de 200 cm3 de capacitat, i inoculats una setmana després amb 200 J2 de M. incognita per planta i mantinguts en cambra climàtica fins que el nematode completés una generació. Cada dada es la mitjana ± l’error estàndard de les diferents repeticions. Els valors de la mateixa columna i cultiu seguits de d’asterisc indiquen diferències (p < 0,05) entre els tractaments d’un mateix cultiu respecte el control, segons la prova paramètrica t de Student o la prova no paramètrica Wilcoxon. En el cultiu de pebrot, la infectivitat del nematode en el tractament control va ser força baixa, al voltant de l’1% dels J2 inoculats. El nematode va infectar i reproduir-se més (p < 0,05, p < 0,01) en les plantes tractades amb T34 que en les plantes no tractades, sense detectar-se diferències en la fecunditat de les femelles. Les plantes tractades amb PL i BF no van mostrar cap efecte sobre el Figura 11. Arrels de pebrot cv. Tinsena, tomàquet cv. Durinta, síndria cv. Sugar baby i meló cv. Charentais sense tractar i tractades amb T34, PL I BF cop finalitzat l’experiment (Font pròpia). Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 36 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles nematode, però sí un augment del pes d’arrel (p < 0,05) del 34% i 25%, respectivament, respecte al de les plantes no tractades. Pel que fa al cultiu de tomàquet, l’únic tractament que va tenir efecte sobre el nematode va ser BF, reduint la infectivitat en un 81% (p < 0,01), la reproducció en un 87% (p < 0,01), i la fertilitat en un 32% (p < 0,05) respecte les plantes no tractades. El sistema radicular de les tomaqueres no tractades estava poc desenvolupat, i encara menys en les plantes tractades, diferint del control sense tractar (p < 0,05). Els tractaments T34, PL i BF no van tenir cap efecte significatiu (p > 0,05) sobre la infectivitat, reproducció i fertilitat del nematode en el cultiu de síndria. En el cas de BF i PL el pes va sortir un 66% (p < 0,01) i un 40% (p < 0,05) inferior que en el cultiu sense tractar, respectivament. A més, en el tractament amb BF van morir la major part de les plantes (80%), quedant només 3 en finalitzar l’experiment. En meló, les plantes tractades amb T34 van presentar un 38% menys d’infecció (p < 0,05) que les plantes no tractades, però no va afectar ni la reproducció ni la fertilitat de les femelles. La infectivitat del nematode en les plantes tractades amb BF va ser un 36% major que en el control (p < 0,05), però no va haver-hi diferències en reproducció (p > 0,05), essent la fertilitat un 32% menor (p < 0,05) en les plantes tractades que en les no tractades. El pes de les arrels de les plantes tractades amb BF va ser un 54% menor (p < 0,01) que el de les plantes control. 5. Discussió Els resultats d’aquest estudi han mostrat que no tots els formulats estudiats tenen la capacitat d’induir resistència al nematode en les quatre espècies i cultivars vegetals utilitzats, i que la resposta de la planta depèn de la interacció específica entre la planta i el microorganisme, com ha estat posat de manifest en treballs anteriors (Gharhemani et al., 2020; Pocurull et al., 2020). Conseqüentment, l’optimització en l’ús d’aquests productes per maximitzar la seva eficàcia de control estarà condicionada pel resultat de la seva interacció amb l’espècie vegetal que es consideri. Els microorganismes que indueixen resistència al nematode podrien ser aplicats en pretrasplantament del cultiu per tal de reduir la capacitat infectiva i/o reproductora del nematode, reduir la severitat de la malaltia i afavorir la colonització dels ous, per aquells que tenen capacitat de fer-ho, reduint així la taxa de multiplicació de la població i disminuir les pèrdues de producció del conreu i dels que el succeeixin per enfrontar-se a una menor densitat de població just abans de trasplantar. En altres casos, com per exemple l’aplicació de T34 en pebrot, l’efecte ha estat clarament negatiu, ja que la infecció i la reproducció del nematode ha estat major que en les plantes no tractades, tot i que també va augmentar la biomassa radicular. Resultats similars van ser obtinguts per Herrera-Parra et al. (2017) utilitzant diverses espècies de Trichoderma en pebrot. En tomàquet, en canvi, Pocurull et al. (2020) van reportar reduccions del 71% i 54% en el nombre de masses d’ous i d’ous per planta, respectivament, gràcies a l’ús de T34 i també van observar que no va tenir efecte contra el fong Pochonia chlamydosporia, un paràsit d’ous del nematode i inductor de resistència en tomàquet quan s’aplica una setmana abans de trasplantar (Gharhemani et al., 2019), estudi interessant ja que demostra que tot i esser T34 un biofungicida no té perquè afectar als microorganismes que es troben al sòl i actuen induint el priming de la planta. Altres experiments, com el d’ Affokpon et al. (2011) van mostrar que diverses soques de T. asperellum van tenir la capacitat d’inhibir la reproducció dels nematodes, reduir la severitat de la malaltia i d’augmentar el rendiment del cultiu de tomàquet. En el nostre estudi, però, no es va observar cap efecte, possiblement degut a problemes per establir-se el fong en l’arrel a conseqüència del pobre desenvolupament radicular observat al final de l’experiment. En altres casos, com l’aplicació de T34 en síndria o meló, l’efecte sobre el nematode no és concloent. En el present estudi, l’efecte va ser nul o insuficient, ja que en síndria no es va veure cap efecte o només va afectar la infectivitat en meló, el que significa que la densitat de població al final del cultiu no difereix de la del control sense Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 38 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles tractar i per tant no hi hauria cap efecte protector sobre el cultiu següent. Area (2020) i Nieto (2020) no van detectar cap efecte en meló i només sobre la reproducció en síndria, respectivament. Com en el cas del tomàquet, el pobre desenvolupament radicular podria haver afectat la colonització de les arrels per part del fong afectant així la resposta de la planta. Així doncs, considerant el nivell de coneixement actual, l’ús de T34 en aquests cultius no seria una garantia de protecció envers el nematode, pel que caldria repetir l’assaig, fent l’aplicació del producte quan la planta tingui un bon creixement radicular, i determinar el grau de colonització de les arrels per part del fong mitjançant qPCR per estimar el possible efecte de la mateixa en la resposta de la planta com apunta Dhimdi (2021). BF va ser el formulat que millors resultats va donar. En pebrot va tenir el mateix efecte que PL, únicament les arrels varen incrementar el seu pes de forma significativa. Un estudi de Requena (2013) on es van utilitzar diversos microorganismes antagonistes de nematodes i diferents combinacions d’aquests van mostrar que l’addició de Bacillus firmus a una combinació de Paecilomyces lilacinus i Trichoderma harzianum en pebrot tampoc va suposar una millora en l’efectivitat de la combinació dels dos fongs. No obstant, es tractava d’una soca diferent a la del formulat emprat en aquest estudi i la concentració aplicada de Bacillus firmus era inferior (5·107 UFC/g d sòl) a l’emprada en el nostre experiment (109 UFC/planta). Pel que fa al cultiu de tomàquet, els resultats van mostrar reduccions significatives tant en el nombre de masses (infectivitat) com en el recompte d’ous (reproducció) i el nombre d’ous per cada massa (fertilitat) en el tractament amb BF. Aquests resultats són similars als de Terefe et al. (2008) que van reportar la eficàcia d’un altre formulat de Bacillus firmus (BioNem) enfront M. incognita en tomàquet, on van aconseguir reduccions en l’eclosió d’ous, inhibició de la mobilitat dels J2 en proves de laboratori; disminució de la formació d’agalles, de la població final de nematodes i el nº d’ous en hivernacle i camp obert, on també va augmentar l’alçada i biomassa de les plantes. Ghahremani et al. (2020) van estudiar també l’efecte de BF en tomàquet amb èxit, concretament l’efecte sobre els ous dels nematodes i la colonització d’arrels de tomàquet en experiments d’arrel dividida en els quals, van poder demostrar que BF va ser capaç de degradar les closques dels ous, colonitzar aquests i les arrels de la planta i induir resistència sistèmica. En el cas del cultiu de síndria, no van quedar suficients mostres per realitzar un anàlisi estadístic concloent ja que la majoria de les plàntules van morir abans de la finalització de l’experiment. Com ja vam comentar, la dosi aplicada d’aquest microorganisme va ser la utilitzada en un experiment de tomàquet, pel que podria haver generat fitotoxicitat per ser massa elevada (Terefe et al., 2008) per aquest altre cultiu i com a conseqüència haver causat la mort de les plantes. En meló es va trobar un increment significatiu en el nombre de masses de les plantes inoculades respecte les no inoculades. Encara que el nº d’ous no va diferir de forma significativa, es va poder determinar una reducció en la fertilitat de les plantes tractades, fet que concorda amb un dels mecanismes que utilitza aquest microorganisme per controlar els RKN, que consisteix en trencar la paret dels ous. Per això, tot i l’elevada quantitat de masses, es varen trobar pocs ous/massa. Pel que fa al formulat PL, aquest no va mostrar cap efecte sobre les variables analitzades en cap cultiu. En pebrot no va presentar diferències en quant a la infecció, reproducció i fertilitat respecte les plantes control però si va haver-hi un augment significatiu del pes radicular, tal com es reporta en altres estudis com el de Fernández-Santillán et al. (2016). Tot i així, al contrari que en el nostre cas, en aquest mateix estudi Paecilomyces lilacinus sí que mostra una gran eficàcia en el cultiu de pebrot (60,3%) en la reducció de les poblacions finals de M. incognita en hivernacle i en la severitat dels símptomes causats, entre altres factors. No obstant, la dosi de Paecilomyces lilacinus inoculada en aquest (de 10 Kg/Ha a 40 Kg/Ha) és molt superior a la quantitat emprada en el nostre estudi. A més l’experiment va tenir una durada major (10 setmanes) pel que el nematode pot haver completat més d’una generació i és més probable que el microorganisme hagi pogut controlar la població infectant els ous en aquest temps, obtenint així diferències significatives, ja que el seu mecanisme d’actuació no és basa en induir resistència sinó que és un paràsit d’ous, pel que es poc eficaç a curt termini. En el cas de tomàquet, té sentit que no hi hagi hagut efecte en les plantes tractades respecte el control ja que segons un estudi de Kiewniek i Sikora (2006) que es va realitzar en cambres de creixement es va determinar que la dosi efectiva de PL en tomàquet per un control biològic suficient de M. incognita és de 1·106 UFC/g de sòl, bastant superior a la dosi utilitzada (7,6·105 UFC/planta que es correspon amb aproximadament 2,5·103 UFC/g de sòl), tot i esser la recomanada en la fitxa tècnica del fabricant. Giné i Sorribas (2016) van analitzar l’efecte de PL enfront M. incognita en una rotació de cultius tomàquet-cogombre obtenint un parasitisme del 94% dels ous per part de PL en condicions in vitro però només un 2,6% en parcel·les. Això indueix a pensar que, tot i aplicar les dosis adequades, l’ús d’aquest fong en cultius sota hivernacle està molt condicionat per l’acceptació del sòl i per tant pot ser poc eficaç a la pràctica tot i el seu elevat potencial observat in vitro. Per altra banda, estudis comparatius de diferents nematicides en el cultiu de síndria van mostrar que Paecilomyces lilacinus no va impedir el desenvolupament de M. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 40 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles incognita, com és el nostre cas, tot i que si es va observar una incidència inferior del nematode respecte a altres tractaments (Orrala et al., 2016). En el cas de l’aplicació de PL en melò, no es va poder determinar cap efecte significatiu respecte a la infectivitat, reproducció ni fertilitat, però el pes de les arrels sí que es va veure reduït significativament. Aquests resultats són contraris als reportats en aquest cultiu per Cárdenas (2006) qui sí que va trobar reduccions en la infecció per Meloidogyne. El potencial que alguns microorganismes tenen per induir defenses deu ser explorat per a ser utilitzats com eina de control que permeti interferir l’acció d’agents estressants per la planta que redueixin la seva productivitat. Com consideracions finals, proposaria, com a possible continuació d’aquest projecte, determinar la colonització de l’arrel per part dels microorganismes aplicats, quantificant-los mitjançant qPCR per analitzar si hi ha alguna correlació entre la concentració i l’efecte generat. Així mateix, proposo estudiar la potencial fitotoxicitat que poden causar aquests productes en alguns cultius, com és el cas de BF en síndria, per saber si es deu a components de la formulació i/o per la dosi aplicada, fent experiments comparatius entre el producte comercial i la matèria activa a diferents dosi d’aplicació. Conclusions A partir dels resultats obtinguts en aquest treball s’ha arribat a les conclusions següents: • L’efecte d’aplicar Votivo, a base de Bacillus firmus soca I-1582, y de T34 Biocontrol, a base de Trichoderma asperellum soca T34, per induir resistència envers M. incognita és dependent de l’espècie vegetal. Mentre que l’aplicació de BioAct, a base de Purpureocillium lilacinum soca 251, no ha induït cap resposta en cap cultiu envers el nematode, pel que la seva capacitat antagònica es restringeix a l’acció directa com a paràsit d’ous del nematode. • L’aplicació de Votivo, a base de Bacillus firmus I-1582, redueix la infecció, reproducció i fertilitat de M. incognita en tomàquet cv. Durinta, així com la fertilitat en meló cv. Charentais, però no té cap efecte sobre el nematode quan s’aplica en pebrot cv. Tinsena o síndria cv. Sugar baby, pel que seria indicat per a ser aplicat com a inductor de defenses de la planta només en tomàquet. • L’aplicació de T34 Biocontrol redueix la infectivitat però no la reproducció de M. incognita en el meló cv. Chanterais, el que seria insuficient per a gestionar el desenvolupament de les poblacions del nematode en aquest cultiu en condicions de camp. • La tolerància de la síndria cv. Sugar baby a Votivo és baixa, produint fitotoxicitat en les condicions de l’assaig. Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 48 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Ornat, C. i Sorribas, F.J. (2011). Estrategias de control integrado de nematodos fitoparásitos. Andrés-Yeves, M. F., i Verdejo-Lucas, S. (2011). Enfermedades causadas por nematodos fitoparásitos en España (Vol. 2). Phytoma-España [en línia]. [Consulta: 1 juliol 2021] Recuperat de https://www.phytoma.com/tienda/libros/product/enfermedadescausadas-por-nematodos-fitoparasitos-en-espana Orrala, N., Herrera, L., Arzube, M., i Pozo, L. (2016). Effect of biological nematicides and the rootstock on watermelon (Citrullus lanatus L.) production in Ecuador. Centro agrícola [en línia]. [Consulta: 17 juny 2021]. Recuperat de http://oaji.net/articles/2017/2674- 1489589253.pdf Perdomo, H., Cano, J., Gené, J., García, D., Hernández-Restrepo, M., i Guarro, J. (2012). Polyphasic analysis of Purpureocillium lilacinum isolates from different origins and proposal of the new species Purpureocillium lavendulum. https://doi.org/10.3852/11- 190 Pieterse, CM, Zamioudis, C., Berendsen, RL, Weller, DM, Van Wees, SCM i Bakker, AHM (2014). Resistencia sistémica inducida por microbios beneficiosos. Annu. Rev. Phytopathol. 52, 347–375. doi: 10.1146 / annurev-phyto-082712-102340 Pocurull, M., Fullana, A. M., Ferro, M., Valero, P., Escudero, N., Saus, E., Gabaldón, T., i Sorribas, F. J. (2020). Commercial Formulates of Trichoderma Induce Systemic Plant Resistance to Meloidogyne incognita in Tomato and the Effect Is Additive to That of the Mi-1.2 Resistance Gene. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.03042 PrivatewaterhouseCoopers (PwC). (2019). El futuro del sector agrícola español [en línia]. [Consulta: 1 abril 2021]. Recuperat de https://www.pwc.es/es/publicaciones/assets/informe-sector-agricola-espanol.pdf Ravichandra, N. G. (2014). Horticultural Nematology. Springer Publishing. https://doi.org/10.1007/978-81-322-1841-8 Requena, A. M. (2013). Control Biológico de Meloidogyne incognita en Pimiento (Capsicum annuum) [en línia]. Tesis Doctoral. Departamento de Ciencia y Tecnologia Agraria. Universidad Politécnica de Cartagena. [Consulta: 23 abril 2021] Recuperat de https://pdfs.semanticscholar.org/3d2b/cb4fc0b168620039b0962cdb538ffdb0162b.pdf Rojas, L. A. (2017). Control biológico del nematodo agallador del tomate (Solanum lycopersicum L) utilizando hongos nematófagos en condiciones de campo [en línia]. Tesis fin de grado. Ingeniería Agrónoma. Facultad Agropecuaria y de recursos naturales renovables. Universidad Nacional de Loja. [Consulta: 17 abri 2021]. Recuperat de https://dspace.unl.edu.ec/jspui/bitstream/123456789/19236/1/LIVIA%20ANABEL%20 ROJAS%20VIVANCO.pdf Rubio, V., i Fereres, A. (2005). Control biológico de plagas y enfermedades de los cultivos [en línia]. [Consulta: 19 abril 2021] Recuperat de https://core.ac.uk/download/pdf/36025273.pdf Talavera, M., i Verdejo-Lucas, S. (2015). Estrategias para la Gestión Integrada de Nematodos en Horticultura Protegida [en línia]. [Consulta: 26 març 2021]]. Recuperat de https://www.researchgate.net/publication/322386789_Estrategias_para_la_Gestion_I ntegrada_de_Nematodos_en_Horticultura_Protegida Talavera, M., Verdejo-Lucas, S., Ornat, C., Torres, J., Vela, M. D., Macias, F. J., Cortada, L., Arias, D. J., Valero, J., i Sorribas, F. J. (2009). Crop rotations with Mi gene resistant and susceptible tomato cultivars for management of root-knot nematodes in plastic houses. Crop protection. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2009.03.015 Terefe, M., Tefera, T., i Sakhuja, P. K. (2008). Effect of a formulation of Bacillus firmus on rootknot nematode Meloidogyne incognita infestation and the growth of tomato plants in the greenhouse and nursery. Journal of Invertebrate Pathology. https://doi.org/10.1016/j.jip.2008.11.004 Tiraferri, S. R., Arcangeli, G., Boebel, A., Gollo, M., Gualco, A., Ramella, S., i Cantoni, A. (2012). Flocter® (Bacillus firmus I-1582): nuovo nematocida biologico per il controllo delle principali specie di nematodi parassiti dannosi alle colture orticole. Giornate Fitopatologiche. Vinces, E. L. (2019). Selección de aislados nativos de Purpureocillium lilacinum spp y materiales orgánicos en el control del nematodo Meloidogyne incognita (Kofoid & White) Chitwood en tomate. Tesis de final de grado. Ingeniería agrónoma. Facultad agropecuaria y de recursos naturales renovables. Universidad Nacional de Loja. Recuperat de https://dspace.unl.edu.ec/jspui/bitstream/123456789/21660/1/EDITA%20LUCIA%20V INCES%20VIDAL.pdf Wilson, M., i Jackson, T. A. (2013). Progress in the commercialisation of bionematicides. BioControl, 58(6), 715–722. doi:10.1007/s10526-013-9511-5 Xing, L., i Westphal, A. (2012). Predicting Damage of Meloidogyne incognita on Watermelon. Journal of Nematology [en línia] 44(2):127–133. [Consulta: 14 juny 2021]. Recuperat de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3578463/pdf/127.pdf Zamora-Gómez, L. L., i Loredo-Treviño, A. (2020). Importancia del Melón (Cucumis melo) y Técnicas para su Conservación. Journal of BioProcess and Chemical [en línia] vol.14, no.24. [Consulta: 6 maig 2021]. Recuperat de http://www.biochemtech.uadec.mx/Articulos/No.24/1%20JBCT-2020-001.pdf Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 50 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Annexos Annex A: Concentració de l’inòcul i la seva viabilitat · Bacillus firmus soca I-1582 La concentració de Bacillus firmus amb què es va inocular va ser obtinguda de l’experiment de Ghahremani et al. (2020) que va ser de 109 UFC/planta. · Purpureocillium lilacinum soca 251 La quantitat recomanada de PL a afegir per hectàrea als cultius de tomàquet, pebrot, síndria i meló són 0,75 L (BioAct Prime, s. f.). A partir d’això, de la densitat d’aquest, 1’08 g/cm3 (Bayer CropScience, 2021) i la concentració de microorganisme que conté el formulat (4,7·1010 UFC/g), podem determinar la concentració necessària a afegir, tal com es mostra a continuació: 0,75 𝐿 ℎ𝑎 ·1000 𝑐𝑚3 1 𝐿 ·1 ℎ𝑎 1010 𝑐𝑚3·200 𝑐𝑚3 𝑠𝑜𝑟𝑟𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 ·1,08 𝑔 𝑐𝑚3·4,7 · 1010 𝑈𝐹𝐶 𝑔=7,6 · 105 𝑈𝐹𝐶 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 · Trichoderma asperellum soca T34 La dosi que es va aplicar va ser la recomanada pel fabricant, 10g/1000 L (T34 Biocontrol, 2021). Tenint en consideració els volums dels pots on realitzem l’experiment i la concentració que conté el formulat comercial emprat, vam arribar a la quantitat que vàrem posar per planta: 0,01 𝑔 𝐿·1 𝐿 1000 𝑐𝑚3·200 𝑐𝑚3 𝑠𝑜𝑟𝑟𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 ·1012 𝑈𝐹𝐶 𝐾𝑔 ·1𝐾𝑔 1000𝑔=2 · 106 𝑈𝐹𝐶 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎 Per tal d’avaluar la viabilitat es varen sembrar 200 UFC de cada microorganisme repartides en tres plaques del medi de cultiu apte per al creixement de cadascun, concretament BF en Plate Count Agar (PCA) i PL i T34 en Potato Dextrose Agar (PDA). El procediment es va dur a terme en condicions estèrils a la cambra de flux laminar on, sempre prop de la flama, la suspensió de microorganismes es va distribuir de manera uniforme a les plaques amb l’utensili de sembra evitant la formació de bombolles. Posteriorment, les plaques foren segellades amb parafilm i emmagatzemades a temperatures de 35 ᵒC en el cas de BF i 25 ᵒC per PL i T34. Finalment, es va fer un recompte del número de colònies a les 48h i 72h, d’on es va obtenir l’eficiència, excepte en el cas de BF que només es va realitzar a les 72h. Microorganisme Eficiència (%) 48h 72h BF - 92 PL 64,5 >100 T34 63,3 82,5 A més de mirar l’eficiència amb el número de colònies, per tal d’assegurar que les quantitats de cada microorganisme eren correctes, es va dur a terme un recompte dels conidis a la placa de Neubauer que varen confirmar que estàvem en les concentracions adequades. Taula 4. Eficiència de cada microorganisme a les 48h i 72h després de la sembra. Annex B: Resultats del pes, recompte de masses i ous i determinació de la fertilitat. Tractament Repetició Pes (g) Infectivitat (nº masses) Reproducció (nº ous) Fertilitat (nº ous / nº masses) Control 1 0,818 1 700 700,00 2 0,742 2 800 400,00 3 0,631 5 1176 235,20 4 0,831 0 0 - 5 0,960 1 810 810,00 6 0,686 2 609 304,50 7 0,999 1 145 145,00 8 0,740 0 0 - 9 1,200 1 168 168,00 10 0,482 4 250 62,50 11 0,894 2 320 160,00 12 1,336 2 50 25,00 13 1,082 6 2254 375,67 14 0,776 2 792 396,00 15 0,800 7 2162 308,86 16 0,511 2 207 103,50 PL 1 1,582 5 1365 273,00 2 1,607 4 920 230,00 3 1,637 1 25 25,00 4 0,924 8 1232 154,00 5 1,637 3 1375 458,33 6 1,128 2 650 325,00 7 1,477 3 891 297,00 8 0,534 3 231 77,00 9 0,691 3 1080 360,00 10 0,541 1 224 224,00 11 1,343 5 990 198,00 12 1,500 2 459 229,50 13 0,900 3 153 51,00 14 1,220 8 1248 156,00 15 1,218 2 455 227,50 16 0,786 1 152 152,00 Taula 5. Resultats obtinguts en pebrot cv. Tinsena. T34 1 2,238 9 1296 144,00 2 0,760 6 1224 204,00 3 1,892 3 1533 511,00 4 0,669 5 2108 421,60 5 1,743 2 864 432,00 6 0,990 4 1232 308,00 7 1,502 1 780 780,00 8 2,799 3 1269 423,00 9 2,451 3 2622 874,00 10 2,789 3 1650 550,00 11 2,463 7 4280 611,43 12 0,711 5 2071 414,20 13 1,851 5 2200 440,00 14 2,520 8 2831 353,88 15 1,752 2 861 430,50 16 2,009 2 529 264,50 BF 1 2,080 3 714 238,00 2 1,452 0 0 - 3 1,085 1 0 0,00 4 0,445 0 0 - 5 1,094 1 304 304,00 6 1,410 1 324 324,00 7 1,206 1 96 96,00 8 1,322 1 234 234,00 9 0,907 0 0 - 10 0,661 0 0 - 11 1,033 4 368 92,00 12 1,267 2 450 225,00 13 0,968 1 234 234,00 14 0,574 1 384 384,00 15 1,032 3 770 256,67 16 0,898 2 651 325,50 Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 54 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Tractament Repetició Pes (g) Infectivitat (nº masses) Reproducció (nº ous) Fertilitat (nº ous / nº masses) Control 1 0,567 52 26303 505,83 2 0,71 66 26810 406,21 3 0,588 56 26496 473,14 4 0,783 70 33540 479,14 5 1,164 102 6951 68,15 6 0,98 71 30250 426,06 7 0,751 49 22320 455,51 8 1,435 59 25685 435,34 9 0,815 68 31968 470,12 10 0,942 84 22750 270,83 11 1,385 52 3504 67,38 12 1,181 87 35000 402,30 13 0,852 62 30951 499,21 14 0,733 74 20944 283,03 15 0,823 79 39000 493,67 16 0,6 83 21250 256,02 PL 1 0,483 75 9716 129,55 2 0,618 70 22082 315,46 3 0,594 66 24500 371,21 4 0,56 75 23520 313,60 5 0,592 66 28512 432,00 6 0,837 85 27132 319,20 7 0,715 71 31152 438,76 8 0,539 86 27508 319,86 9 0,306 43 21148 491,81 10 0,839 82 23092 281,61 11 0,43 50 14980 299,60 12 0,564 73 17370 237,95 13 0,49 83 34176 411,76 14 0,543 44 11000 250,00 15 0,541 58 23478 404,79 16 0,774 57 17216 302,04 T34 1 0,462 59 30456 516,20 2 0,45 78 23358 299,46 3 0,679 70 37584 536,91 Taula 6. Resultats obtinguts en tomàquet cv. Durinta. 4 0,554 75 28728 383,04 5 0,628 81 31648 390,72 6 0,342 62 24592 396,65 7 0,814 69 32800 475,36 8 0,635 82 34944 426,15 9 0,523 65 34916 537,17 10 0,666 92 40704 442,43 11 0,755 94 40508 430,94 12 0,801 64 21450 335,16 13 0,498 75 36120 481,60 14 0,733 72 29172 405,17 15 0,63 90 40112 445,69 16 0,563 76 18532 243,84 BF 1 0,201 18 4462 247,89 2 0,323 21 3198 152,29 3 0,372 13 3591 276,23 4 0,418 25 5412 216,48 5 0,379 10 2044 204,40 6 0,262 9 792 88,00 7 0,164 4 1932 483,00 8 0,313 13 8380 644,62 9 0,447 34 7287 214,32 10 0,153 10 875 87,50 11 0,346 23 4806 208,96 12 0,183 5 851 170,20 13 0,48 50 11110 222,20 14 0,138 8 3450 431,25 15 0,268 31 4600 148,39 16 0,269 9 2496 277,33 Capacitat de microorganismes antagonistes de nematodes d’induir 56 resistència envers Meloidogyne incognita en cultius hortícoles Tractament Repetició Pes (g) Infectivitat (nº masses) Reproducció (nº ous) Fertilitat (nº ous / nº masses) Control 1 0,399 22 11775 535,23 2 0,666 23 12012 522,26 3 0,417 11 6634 603,09 4 0,568 12 4960 413,33 5 0,345 2 1728 864,00 6 0,13 1 160 160,00 7 0,568 8 5010 626,25 8 0,28 4 2790 697,50 9 0,306 30 16005 533,50 10 0,532 30 20480 682,67 PL 1 0,406 10 6014 601,40 2 0,313 12 4860 405,00 3 0,209 4 3108 777,00 4 0,283 10 8126 812,60 5 0,452 7 4832 690,29 6 0,064 1 280 280,00 7 0,243 8 3886 485,75 8 0,186 9 2842 315,78 9 0,234 23 8680 377,39 10 0,299 9 6968 774,22 11 0,113 1 336 336,00 12 0,287 14 5890 420,71 13 0,329 10 8370 837,00 14 0,125 1 1768 1768,00 T34 1 0,464 13 8640 664,62 2 0,143 8 4216 527,00 3 0,564 7 3840 548,57 4 0,4 2 468 234,00 5 0,499 5 2912 582,40 6 0,461 4 3776 944,00 7 0,763 6 6264 1044,00 8 0,53 1 224 224,00 9 0,701 7 4704 672,00 10 0,613 6 4284 714,00 11 0,603 9 4144 460,44 12 0,531 5 3630 726,00 13 0,215 7 1452 207,43 Taula 7. Resultats obtinguts en Síndria cv. Sugar Baby. 14 0,415 3 832 277,33 BF 1 0,141 3 1276 425,33 2 0,169 4 2352 588,00 3 0,113 1 240 240,00 Tractament Repetició Pes (g) Infectivitat (nº masses) Reproducció (nº ous) Fertilitat (nº ous / nº masses) Control 1 0,885 17 8064 474,35 2 0,940 17 7504 441,41 3 0,870 14 10416 744,00 4 0,901 9 3944 438,22 5 0,775 9 4200 466,67 6 0,623 14 9120 651,43 7 0,847 18 8284 460,22 8 0,788 28 12690 453,21 9 0,518 17 16642 978,94 10 0,724 27 23868 884,00 PL 1 0,3 23 11739 510,39 2 0,361 14 9108 650,57 3 0,503 20 4214 210,70 4 0,634 19 10504 552,84 5 0,625 9 4108 456,44 6 0,392 12 8160 680,00 7 0,508 4 1216 304,00 8 0,347 9 10412 1156,89 9 0,497 16 5432 339,50 10 0,424 11 8075 734,09 T34 1 0,932 5 3920 784,00 2 0,771 9 10044 1116,00 3 0,617 22 18486 840,27 4 0,388 14 7280 520,00 5 1,094 15 12582 838,80 6 0,425 3 2448 816,00 7 0,734 17 5750 338,24 8 0,377 7 3978 568,29 9 0,607 10 4452 445,20 Taula 8. Resultats obtinguts en meló cv. Charentais.