Estudio de la incorporación de altos porcentajes de proteínas en productos sin gluten a base de cereales

PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA E INGENIERÍA AGROALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS TESIS DOCTORAL: ESTUDIO DE LA INCORPORACIÓN DE ALTOS PORCENTAJES DE PROTEÍNAS EN PRODUCTOS SIN GLUTEN A BASE DE CEREALES Presentada por Marta Sahagún Carabaza para optar al grado de Doctor Internacional por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Manuel Gómez Pallarés Encarnación Fernández Fernández “Nuestra recompensa se encuentra en el esfuerzo y no en el resultado. Un esfuerzo total es una victoria completa” – Mahatma Gandhi AGRADECIMIENTOS Agradecimientos ¡Quién me lo iba a decir! Después de tres años, estoy escribiendo estas líneas para despedir una de las etapas más importantes de mi vida. Un periodo de tiempo durante el que he vivido una mezcla de sentimientos y gracias al cual he crecido tanto personal como profesionalmente. Y todo ello no hubiera sido posible sin el apoyo de las personas que me han acompañado en este viaje y que me han hecho seguir hacia delante en los momentos de flaqueza. En primer lugar, agradecer tanto al Ministerio de Economía y Competitividad (Proyecto AGL2014-52928-C2) como a la Universidad de Valladolid (Contrato predoctoral) que han hecho posible la realización de la presente tesis doctoral gracias a su apoyo de financiación. Gracias a mis directores de tesis, Manolo y Encarna, los cuales me han guiado en todo momento para dar lo mejor de mí. Especialmente a ti Manolo, por confiar en mí desde el primer momento (más de lo que confío en mí misma) cuando no sabía de qué iba “eso del doctorado”, y por ofrecerme la oportunidad de trabajar contigo. Siempre has respetado mis ideas de futuro y has dado todo lo posible por ayudarme a crecer. Y a pesar de las broncas por la hora (sí, soy una tardona), espero que te acuerdes de mí, aunque sea cuando veas tiendas de cachivaches de cocina (sabemos que me encantan). A Montse, mi compañera de batallas, uno de mis premios del doctorado. Sólo tú y yo sabemos lo mucho que me ayudaste en ciertos momentos. Por todos esos días de compartir consejos, recetas, anécdotas… ¡Gracias! Nunca encontraré una compañera como tú. A mi Angy, mi galletera preferida (¡Viva el Club de la Galleta!), mi otro premio de doctorado. Gracias por aguantarme todos estos años, que tiene su mérito con lo cabezota que soy a veces. Sabes que siempre me tendrás ahí y que tienes una amiga para toda la vida. Ah! Y recuerda, en los futuros viajes, el mapa lo llevo yo ;) A Mayara, mi brasileira emprendedora. Gracias por todos tus consejos, por tu forma de ser y tu generosidad. Es un placer trabajar contigo y sé que en un futuro llegarás muy lejos. Ya sabes que tenemos pendiente lo de crear esa start-up a medias :) AGRADECIMIENTOS A Laura Román y Blas Franco. Gracias por esas comidas y cafés en el seminario que nos daban la vida los días de trabajo y que nos hacían desconectar durante un rato mientras contábamos anécdotas o intentábamos arreglar el mundo. A mis argentinos preferidos, Felipe y Vicky, gracias por enseñarnos tantas cosas y por traernos un trocito de vuestro increíble país hasta un lugar no muy grande llamado Palencia. Espero que estéis tan contentos de habernos conocido como lo estamos nosotros de vuestra visita. Ya sabéis que tenemos un viaje de reencuentro pendiente ;) Thank you Julien for the opportunity of working in your centre to increase my skills through your knowledge. Both us know that the experience of living in Germany was harder than I expected but it made me change positively the way of seeing things. Again, thank you so much for your help, especially the last days. A Marina, Cristina, Andrea, Carol y Jorge. Gracias por escucharme cuando os cuento mis problemas, por alegrarme los días, por ser mis amigos. Sois la familia que he elegido y no os cambiaría por nada en el mundo. A ti, Mario, la parte que me complementa. Sólo tú sabes cómo calmarme esos días no tan buenos y sacarme una sonrisa. No hay palabras para agradecerte todo lo que me has ayudado (y lo que me has aguantado) sin pedir nada a cambio. Supongo que eso es parte del peaje, pero debo recordarte lo importante que has sido durante esta etapa. Sabes que te admiro y que eres el mejor. Te quiero. Y, por último, a mis padres. Gracias por enseñarme a ser. Nunca tendré palabras suficientes para agradeceros todo lo que habéis hecho y seguís haciendo por mí. A ti papá, por tu lucha continua y tu valentía, por no tirar nunca la toalla. A ti mamá, por ser una guerrera, por tirar con todo lo que se pone por delante sin miedo a perder. Y a ti tato, que aunque no nos decimos tantas cosas como deberíamos, que sepas que te quiero, y que si te caes, siempre estaré ahí para ayudarte a levantar. Aquí terminan tres intensos años de mi vida, durante los cuales he luchado muchas veces contra mí misma y los que me han ayudado a descubrir cuáles son mis prioridades en la vida. ¡Gracias a todos los que habeis formado parte de este bonito camino! ÍNDICE Índice Resumen I Abstract V Lista de los artículos VII Introducción 1 Objetivos 55 Estructura 57 Capítulo 1: Enriquecimiento proteico de productos horneados 60 – Influence of protein source on characteristics and quality of gluten-free cookies – Assessing influence of protein source on characteristics of gluten-free breads optimising their hydration level – Influence of protein source on the characteristics of gluten-free layer cakes Capítulo 2: Enriquecimiento proteico de purés 65 – The effect of different protein addition on the rheological, physical and sensory characteristics of extruded maize-based purees Capítulo 3: Utilización de diferentes métodos para análisis sensorial de productos enriquecidos 68 – Assessing protein addition on sensory characteristics of sugar-snap cookies: application of check-all-that-apply questions and projective mapping Conclusiones 72 Anexo 80 TABLE OF CONTENTS Table of contents Resumen I Abstract V List of original papers VII Introduction 1 Objectives 55 Structure 57 Chapter 1: Protein enrichment of bakery products 60 – Influence of protein source on characteristics and quality of gluten-free cookies – Assessing influence of protein source on characteristics of gluten-free breads optimising their hydration level – Influence of protein source on the characteristics of gluten-free layer cakes Chapter 2: Protein enrichment of instantaneous purees 65 – The effect of different protein addition on the rheological, physical and sensory characteristics of extruded maize-based purees Chapter 3: Use of different methods for sensory analysis of protein enriched products 68 – Assessing protein addition on sensory characteristics of sugar-snap cookies: application of check-all-that-apply questions and projective mapping Conclusions 77 Annex 80 RESUMEN I Resumen Las proteínas, junto a carbohidratos y grasas, son macromoléculas que componen la base de la dieta humana. En los últimos años, la presencia de altos contenidos de proteína en productos se ha convertido en un reclamo de los consumidores. Se conoce que un mayor consumo de proteínas puede producir beneficios nutricionales para determinados grupos de población como deportistas, ancianos, etc. Además, la mayor sensación de saciedad que aportan los productos enriquecidos con proteínas los convierte en una buena opción para personas que quieren perder peso. Existen diferentes estudios que analizan el efecto de las proteínas en la funcionalidad de harinas y almidones, así como en las características de productos a base de cereales. Sin embargo, la mayor parte de estos trabajos estudian individualmente las proteínas, no comparan entre diferentes tipos de proteínas y los contenidos de proteínas adicionados son bajos (<15%). Además, algunos de estos estudios presentaron resultados contradictorios, y los diferentes requerimientos de agua de cada proteína podrían ser uno de los motivos. Por ello, el objetivo de la presente tesis fue evaluar el efecto de la incorporación de altos porcentajes de diferentes proteínas (arroz, patata, guisante, suero y huevo) en las características reológicas, físicas y sensoriales de productos sin gluten a base de cereales (galletas, panes, bizcochos y purés). Los tipos de proteína utilizados fueron elegidos en base a los resultados obtenidos en estudios previos realizados por el grupo de investigación. De esta forma, las proteínas seleccionadas presentan propiedades características y engloban la mayor parte de los tipos de proteínas disponibles (leguminosas, cereales, tubérculos, leche y huevo) para que los resultados puedan ser extrapolables a otras proteínas. Además, también se pretendió analizar diferencias entre las proteínas animales y las proteínas vegetales. En cuanto a los productos elegidos como matriz, se pretendió evaluar como la adición de proteínas puede influir en diferentes tipos de masas (batidas, cortas, fermentadas) y productos (horneados y mezclados en frío). La incorporación de altos porcentajes de proteína modificó las características de galletas sin gluten elaboradas con harina de maíz blanco. La proteína de clara de huevo incrementó significativamente la dureza de las galletas mientras que la RESUMEN II proteína de suero dio lugar a galletas más oscuras y de mayor diámetro. Por su parte, las proteínas vegetales apenas modificaron las características de las galletas, a excepción del oscurecimiento de los bordes que produce la proteína de patata. La escasa influencia de la proteína de guisante en las características físicas y aceptabilidad de las galletas la convierten en la mejor opción para conseguir un producto de alto contenido proteico. La hipótesis planteada sobre los diferentes niveles de hidratación requeridos por cada tipo de proteína se confirmó tras realizar una optimización de la misma en panes de almidón de maíz. Este estudio reveló que los panes con proteínas vegetales necesitaron más cantidad de agua para conseguir su máximo volumen específico que los panes sin proteína y con proteínas animales. Además, todos los panes enriquecidos presentaron un volumen menor que el pan control. En cuanto al comportamiento reológico, las masas con proteína de suero presentaron los mayores valores de G’ y G’’ debido a su bajo contenido de agua. Por el contrario, las masas con proteína de huevo fueron tan líquidas que no pudieron ser evaluadas con el reómetro aunque consiguieron formar una estructura tras el horneado debido al proceso de coagulación que experimentan. La incorporación de ambas proteínas animales incrementó significativamente, como en el caso de los bizcochos, la dureza de los panes, mientras que las proteínas vegetales no lo modificaron. Por último, la adición de proteína dio lugar a panes más oscuros, siendo mayor este efecto con la proteína de suero. Debido a la gran capacidad de absorción de la proteína de guisante, la presencia de esta proteína en bizcochos de arroz aumentó significativamente la viscosidad de las masas, siendo este efecto mayor, cuanto mayor es el contenido de proteína. En cuanto a las proteínas animales, la adición de proteína de huevo dio lugar a bizcochos con los mayores valores de dureza debido a su característico proceso de coagulación. Por su parte, la proteína de suero, que también aumentó la dureza de los bizcochos, produjo el mayor aumento de volumen específico. Ambas proteínas animales incrementaron la cohesividad y elasticidad de los bizcochos. Por el contrario, las proteínas de guisante y arroz apenas modificaron las características físicas de los bizcochos. En cuanto a las propiedades sensoriales, todas las proteínas disminuyeron la aceptabilidad de los bizcochos, aunque la proteína de suero fue, entre todas las proteínas, la que obtuvo mejores valoraciones. RESUMEN III Además de productos horneados, otros productos a base de cereales, como los purés instantáneos, también pueden ser una matriz adecuada para la incorporación de altos porcentajes de proteína. El uso de harinas extrusionadas reduce el tiempo de preparación de productos, lo cual se adapta a los nuevos modelos de vida donde se busca comodidad sin perder de vista la nutrición. Así, la adición de proteína en purés elaborados con harina de maíz extrusionada modificó su viscosidad. Las proteínas de clara de huevo y de suero redujeron la viscosidad de los purés durante el mezclado. Sin embargo, tras un proceso de calentamiento, se la viscosidad incrementó debido a la agregación que sufren las moléculas de proteínas por acción del calor. Por el contrario, las proteínas de guisante y de arroz apenas modificaron la viscosidad de los purés, pero redujeron su sinéresis tras la congelación, sobre todo la primera de ellas. Por su parte, las proteínas animales incrementaron significativamente la sinéresis tras refrigeración y congelación debido a su baja capacidad de retención de agua. Finalmente, tanto la proteína de guisante como la proteína de clara de huevo apenas modificaron la aceptabilidad de los purés mientras que la proteína de suero la mejoró. Como se ha explicado anteriormente, la incorporación de proteína en galletas responde a la demanda por parte del consumidor de productos ricos en proteínas. Al crear un nuevo producto o reformular uno ya existente, la percepción de ese producto por parte del consumidor apenas debe ser influida en comparación con el producto de referencia. De esta forma, el uso de diferentes técnicas de análisis sensorial es una herramienta muy útil para evaluar el posible efecto de la proteína en la percepción del consumidor por un producto determinado. La evaluación sensorial de las galletas enriquecidas se realizó utilizando diferentes técnicas como test de aceptabilidad, check-all-that-apply (CATA) y projective mapping. Mediante el uso combinado de estas dos últimas técnicas se pudo afirmar que ambos métodos se complementan y son muy útiles a la hora de entender diferencias y similitudes entre muestras. De acuerdo con los resultados obtenidos, la incorporación de proteína modificó las características sensoriales de las galletas. Sin embargo, no hubo diferencias entre las galletas control de maíz blanco (sin gluten) y las de trigo. De esta forma, se pudo concluir que, la presencia de proteína y el tipo de proteína elegido tiene más influencia en la percepción del consumidor que el tipo de harina utilizado. Así, la adición de proteína de gluten y suero dieron lugar a galletas más INTRODUCCIÓN 3 Introducción 1. PROTEÍNAS: ASPECTOS GENERALES Las proteínas son un componente básico de carácter estructural, físico, químico y/o funcional de los alimentos. Una adecuada ingesta de proteína en la dieta es esencial para mantener una integridad y funcionalidad celular (Institute of Medicine, 2005). Las proteínas incluidas en la dieta tienen como función principal proporcionar los materiales necesarios para la síntesis de músculo y otros tejidos (Ustunol, 2015). En cuanto a la fuente proteica, las proteínas alimentarias incluyen proteínas procedentes de la leche, pescado, carne, huevos, cereales, legumbres, etc. Aunque todos estos alimentos han supuesto la fuente tradicional de proteína en la dieta humana, potencialmente cualquier proteína de una fuente biológica podría servir como una proteína alimenticia. Sin embargo, una proteína alimentaria debe: ser adecuada nutricionalmente y digestible, tener una funcionalidad deseable en los alimentos, estar fácilmente disponible, ser agronómicamente sostenible, y no ser tóxica (Ustunol, 2015). 1.1. Estructura de las proteínas Las proteínas se componen de largas cadenas de aminoácidos unidas mediante diferentes enlaces covalentes y no covalentes (puentes de hidrógeno, interacciones iónicas, fuerzas de Van de Waals, enlaces hidrofóbicos, puentes salinos, enlaces disulfuro, etc.) (Yada, 2018). Según Zayas (1997) la estructura molecular de las proteínas está dividida en cuatro niveles claramente identificados: estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La estructura primaria se define como la secuencia específica de aminoácidos; las estructuras secundarias se forman mediante la unión de diferentes secuencias de aminoácidos por medio de puentes de hidrógeno (por ejemplo, α-hélice, hoja plegada, random coil); las estructuras terciarias corresponden con las estructuras tridimensionales formadas por la unión entre estructuras secundarias (la forma en la que las estructuras hélice, lámina o “random coil” se empaquetan) y la estructura cuaternaria es el resultado de la asociación de las estructuras terciarias en proteínas oligoméricas (Yada, Bryksa, & Nip, 2012). INTRODUCCIÓN 4 Cabe destacar que no todas las proteínas tienen estructura cuaternaria, solo aquellas más largas (más de 100 kDa) son más probables de tener más de un polipéptido. En cuanto a las proteínas alimentarias, la mayoría de ellas sí poseen estructura cuaternaria (Ustunol, 2015). 1.2. Clasificación de las proteínas Desde el punto de vista químico, las proteínas pueden clasificarse en dos grupos: homoproteínas, que únicamente contienen aminoácidos, y heteroproteínas, que están formadas por aminoácidos y un grupo prostético como, por ejemplo, lípidos o glúcidos (Cheftel, Cuq, & Lorient, 1989). Otra forma de clasificar las proteínas puede ser según su organización tridimensional. Las proteínas fibrosas están formadas por cadenas polipeptídicas enlazadas a lo largo de un eje común lineal dando lugar a fibras (Figura 2a). Por otro lado, las proteínas globulares se componen de una o varias cadenas polipeptídicas enrolladas sobre sí mismas, formando una estructura tridimensional (Figura 2b). Existen proteínas que poseen propiedades de las proteínas fibrosas y globulares a la vez (Cheftel et al., 1989). Figura 1. Niveles que componen la estructura de la proteína. a) Primaria b) Secundaria c) Terciaria d) Cuaternaria. Fuente: Petsko & Ringe (2004) b) a) d) c) Figura 2. Microfotografías tomadas por el microscopio electrónico de barrido (x3000 aumentos) sobre los gránulos de proteína fibrosa (A: colágeno) y proteína globular (B: clara de huevo). B A INTRODUCCIÓN 5 Por último, las proteínas también pueden clasificarse en función de su solubilidad. Así, en 1907 Osborne separó las proteínas en cuatro grupos: albúminas (solubles en agua), globulinas (solubles en soluciones salina [NaCl 0,4mol/L]), prolaminas (solubles en EtOH 70%) y glutelinas (residuo soluble en ácidos diluidos, bases diluidas y detergentes) (Belitz, Grosch, & Schieberle, 2004). 2. INTERÉS NUTRICIONAL DE LAS PROTEÍNAS Las proteínas, junto con los hidratos de carbono y los lípidos, son los macronutrientes básicos de la dieta humana necesarios para el mantenimiento de la vida. Su función principal es aportar el nitrógeno y los aminoácidos necesarios para la síntesis de las proteínas corporales y demás sustancias nitrogenadas (Cheftel et al., 1989). Cuando se habla de proteína consumida, hay dos factores muy importantes a tener en cuenta: calidad y cantidad (Ustunol, 2015). La calidad nutricional de una proteína se puede definir como la capacidad de la proteína para cumplir con los requerimientos de aminoácidos y nitrógeno establecidos (Schaafsma, 2005). De este modo, la calidad de la proteína varía en función de la fuente proteica y se define por su composición en aminoácidos esenciales y su digestibilidad (Woodward, Nielsen, Liesman, Lavin, & Trottier, 2011). Los aminoácidos pueden dividirse en dos grupos diferenciados: aminoácidos esenciales y no esenciales. Los aminoácidos no esenciales se sintetizan eficazmente en el organismo, ya sea a partir de metabolitos intermedios o de aminoácidos esenciales (Cheftel et al., 1989). Sin embargo, los aminoácidos esenciales (histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina), formados por moléculas de carbono, no pueden ser sintetizados por el propio organismo y deben ser adquiridos a través de la dieta (Institute of Medicine, 2005). Esta dificultad en la obtención de aminoácidos hace que la presencia de aminoácidos esenciales, aumente la calidad nutricional de la proteína. En cuanto a la digestibilidad de la proteína, existen factores intrínsecos (composición de aminoácidos y estructura química) e extrínsecos (tratamiento térmico, factores antinutricionales y fijación a metales, lípidos, ácidos nucleicos, celulosas y otros polisacáridos) que afectan a esta característica (Cheftel et al., 1989; Ustunol, 2015). INTRODUCCIÓN 6 En cuanto a la cantidad, los requerimientos de proteína y aminoácidos pueden estar expresados en varios términos (Tabla 2) y dependen de varios factores, como edad, sexo y peso (Institute of Medicine, 2005). Mujeres embarazadas (1,10g/kg/día) y en fase de lactancia (1,30g/kg/día) requieren mayor ingesta de proteínas que mujeres y hombres en general (0,95-0,80g/kg/día). Los niños lactantes también presentan un requerimiento de proteínas mayor (1,50-1,20g/kg/día) en comparación con niños de entre 1 y 13 años (1,05-0,95g/kg/día). A medida que aumenta la edad durante la etapa infantil, la cantidad de proteína necesaria disminuye (Institute of Medicine, 2005). Tabla 1. Términos para expresan la ingesta diaria de referencia Término Definición Recommended Dietary Allowance (RDA) Nivel de ingesta diaria promedio suficiente para cumplir con la necesidad nutricional de casi todos (97-98%) los individuos sanos que forman un grupo según su etapa de vida y sexo Adequate Intake (AI) Nivel de ingesta diaria promedio recomendada basado en aproximaciones determinadas experimentalmente por un grupo (o grupos) de personas aparentemente sanas que se usan cuando un RDA no puede ser determinado. Estimated Average Requirement (EAR) Nivel de ingesta diaria promedio estimado para cumplir con la necesidad de la mitad de los individuos sanos que forman un grupo según su etapa de vida y sexo Sin embargo, existen estudios que determinan que una mayor ingesta de proteína podría tener efectos beneficiosos para la salud de ciertos grupos de población. Es sabido que a medida que pasan los años se produce una pérdida de masa muscular esquelética y fuerza, lo cual conduce a una pérdida de capacidad funcional (Koopman & van Loon, 2009; Welch, 2014). De hecho, la existencia de enfermedades geriátricas, como la sarcopenia, está relacionado con dicha pérdida muscular (Fielding et al., 2011). Este tipo de problema se debe a un trastorno en la regulación del proceso de renovación de las proteínas musculares que produce un desequilibrio entre su síntesis y su degradación (Koopman & van Loon, 2009). Varios estudios afirman que la combinación de ejercicio físico y la ingesta de proteínas presenta un efecto sinérgico en la preservación del músculo esquelético INTRODUCCIÓN 7 (Isanejad et al., 2016; Landi et al., 2017). Sin embargo, las personas ancianas presentan evidencias de una resistencia anabólica, por lo que requieren una mayor ingesta proteica (1,00–1,30 g/kg/día) para estimular la síntesis de músculo, y por tanto, la conservación del músculo esquelético (Ni Lochlainn, Bowyer, & Steves, 2018; Welch, 2014). Entre las posibles proteínas a utilizar, la proteína de suero de leche, debido a sus altos niveles de aminoácidos de cadena ramificada (Millward, Layman, Tomé, & Schaafsma, 2008), podría ser una buena opción. La presencia de este tipo de aminoácidos, entre los que se encuentran leucina, isoleucina y valina, incrementa la síntesis de proteínas y disminuyen su degradación (Boland, 2011; Casperson, Sheffield-Moore, Hewlings, & Paddon-Jones, 2012), al activar las enzimas principales involucradas en el proceso de síntesis (Blomstrand, 2006). Así, Katsanos et al. (2008) indicó la existencia de una relación positiva entre los niveles de este tipo de aminoácidos y el incremento de proteína muscular en personas ancianas. Además de las personas ancianas, los deportistas conforman un grupo de población para el cual una mayor ingesta de proteínas también conlleva beneficios nutricionales. Un entrenamiento compuesto por ejercicios de resistencia puede incrementar de forma eficaz la masa y fuerza muscular, así como mejorar la capacidad funcional (Evans, 1995) ya que, como se ha dicho anteriormente, estimula la síntesis de proteínas. Sin embargo, la degradación de las proteínas musculares también se estimula después del ejercicio, aunque en menor medida (Phillips, Tipton, Aarsland, Wolf, & Wolfe, 1997). Para conseguir una mayor tasa final de estimulación del proceso de síntesis es necesario un incremento de la ingesta de proteínas (Koopman & van Loon, 2009). En pacientes con problemas renales crónicos, la ingesta diaria recomendada de proteína es baja (0,60-0,80g/kg peso). Sin embargo, para pacientes con enfermedad renal en etapa terminal y/o sometidos a tratamientos de hemodiálisis, la recomendación diaria debe ser mayor que la propia de personas sin la enfermedad (>1,20g de proteína/kg de peso) (National Kidney Foundation, 2000; Tallman, Sahathevan, Karupaiah, & Khosla, 2018). Estos pacientes con frecuencia tienen poco apetito y fatiga, lo cual reduce las ganas de cocinar, y la existencia de productos listos para consumir puede facilitar la ingesta de una mayor cantidad de proteína (Alquist & Stall, 2018). INTRODUCCIÓN 8 Por último, existen estudios que analizan la saciedad tras la ingesta de una comida rica en carbohidratos y una rica en proteínas, y todos ellos coinciden en que tras esta última se presenta menor sensación de hambre (Bertenshaw, Lluch, & Yeomans, 2008; Latner & Schwartz, 1999). Algunos autores han estudiado el efecto de una mayor ingesta de proteínas en la saciedad y han visto que existe una relación positiva entre ambos parámetros (Porrini, Crovetti, Testolin, & Silva, 1995; Vandewater & Vickers, 1996). Esto parece explicarse porque las proteínas tienen una tasa de oxidación más rápida que los carbohidratos y estimulan una mayor termogénesis, lo cual está relacionado con un aumento de la saciedad (Bertenshaw et al., 2008; Halton & Hu, 2004). Así, la ingesta de proteínas proporciona un efecto de saciedad más a largo plazo, y esto puede ayudar en dietas para bajar o controlar el peso corporal (Purwanti, Peters, & van der Goot, 2013). 2.1. Tendencia de mercado de productos ricos en proteínas En EE. UU, el 55% de la población declara que “alto en proteína” es un atributo a tener en cuenta cuando realizan la compra y el 6% de los hogares tienen al menos un miembro que sigue una dieta alta en proteína (más de 5.4 millones de personas) (Nielsen, 2018). Sin embargo, los motivos que llevan a elegir este tipo de productos y el momento de consumirlo son diferentes en función de la edad o la situación familiar (Tabla 4). Ante esta situación, la industria alimentaria responde a la creciente demanda mediante la creación de nuevos productos o la reformulación de los ya existentes para conseguir un alto contenido proteico. La manera de clasificar o etiquetar un producto según su contenido proteico varía en función de la legislación alimentaria de cada continente. En Canadá o Estados Unidos, las alegaciones sobre el contenido proteico dependen de la calidad de la proteína (Marinangeli, Mansilla, & Shoveller, 2018). Así, para personas >1año, la calidad proteica de un alimento se cuantifica mediante el método PER (Protein Efficiency Ratio) (Government of Canada, 2018) o mediante el método PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score) (U.S. Food and Drug Administration and Department of Health and Human Services, 2018). De esta forma, las proteínas vegetales (cereales, legumbres, frutos secos, semillas) generalmente tiene menores niveles de aminoácidos esenciales (mg/g de proteína) y menores coeficientes de INTRODUCCIÓN 9 digestibilidad comparado con las proteínas animales, lo cual afecta a la calidad de la proteína y, por tanto, a la alegación nutricional (Marinangeli et al., 2018) Tabla 2. Who is searching for what in the protein space? Fuente: Nielsen Panel Survey, June 2018 Senior Couples Por razones de salud (diabetes, colesterol..) Lácteos, cereales de desayuno, productos para untar, frutos secos y semillas, legumbres. Desayuno, comida de diario Established Couples Para perder peso/ lograr objetivos forma física Sustitutos de carne, batidos, frutos secos, semillas, suplementos Cena Independent Singles Por razones de salud (diabetes, colesterol..) Lácteos, productos para untar, frutos secos, semillas Comida, Desayuno diario Young Transitionals Para lograr objetivos relaciones con la forma física Sustitutos de carne y lácteos, snacks, dips, batidos, suplementos Picoteo en fin de semana, tentempié Bustling Families Llevar una dieta más sana Snacks, cereales de desayuno Cena de diario Small Scale Families Para perder peso/ compensar el no comer alimentos de origen animal Snacks, galletas/ crackers, batidos, cereales de desayuno Tentempié Start-up families Para compensar el no comer alimentos de origen animal Sustitutivos, productos de bebe, snacks, legumbres Comidas de diario, desayunos de semana, picoteo ¿Por qué? ¿Qué? ¿Cuándo? Start-up Families – Hogares con niños menores de 6 años Small Scale Families - Hogares con niños de edades comprendidas entre los 6 y 11 años Bustling Families - Hogares con niños de edades comprendidas entre los 12 y 17 años Young Transitionals – Hogares adultos (>17 años) y el cabeza de familia menor de 35 años Independent Singles – Hogares de una sola persona Established Couples – Hogares de dos o más adultos (>17 años) y el cabeza de familia con una edad entre 35 y 39 años Senior Couples - – Hogares de dos o más adultos (>17 años) y el cabeza de familia con una edad >= 60 años T INTRODUCCIÓN 10 Sin embargo, según la legislación europea (European Parliament and of the Council, 2006), el contenido proteico de un alimento se basa en la energía que la proteína representa en la energía total del producto. De este modo, un producto puede presentar dos tipos de alegaciones:  Fuente de proteína: al menos el 12% del valor energético del producto debe ser proporcionado por la proteína.  Alto contenido proteico: al menos el 20% del valor energético del producto debe ser proporcionado por la proteína. En la actualidad, existe una gran variedad de productos que alega un alto contenido proteico. Por un lado, muchas empresas, siguiendo la tendencia actual, han decidido reformular productos que ya se encontraban en el mercado para ofrecer una nueva variedad con mayor cantidad de proteína, como por ejemplo Vitalinea PRO (Danone), Mars HiProtein (Mars) y Thins PRO (Bimbo). Por otro lado, la demanda de productos ricos en proteína ha desencadenado la creación de nuevas empresas que se dedican a la producción, distribución y/o comercialización de este tipo de productos. Estos productos se venden como una nueva forma de consumir una mayor cantidad de proteína y están inmersos en un marketing muy cuidado basado en la salud y/o la forma física. La proteína se incluye en la formulación del producto final o también se comercializa como ingrediente para que sea el propio consumidor quien la integre dentro de sus comidas o recetas. De acuerdo con el estudio de mercado realizado por la empresa NMI, sobre el 40% de los millennials identifica la declaración “alto en proteína” como un atributo muy importante que hace más recomendable el producto (Berry, 2018). 2.2. Proteínas en productos sin gluten Está comprobado que la mayoría de los productos sin gluten disponibles en el mercado tienen un bajo contenido proteico, son deficientes en lisina, y su contenido en grasas es alto (Fry, Madden, & Fallaize, 2018; Matos & Rosell, 2011; Missbach et al., 2015; Naqash, Gani, Gani, & Masoodi, 2017; Rosell & Matos, 2015; Wu et al., 2015). Miranda, Lasa, Bustamante, Churruca, y Simon (2014), comparando diferentes productos comerciales con y sin gluten disponibles en España, INTRODUCCIÓN 11 observaron que los panes sin gluten analizados presentaban un contenido proteico tres veces menor que sus homólogos con gluten. Además, en el caso de los productos horneados (bollería, galletas...etc.), este mismo estudio determinó que la cantidad de proteína incluida en los productos sin gluten era casi la mitad que la presente en aquellos con gluten. Por su parte, Cornicelli et al. (2018) hizo un estudio similar al de Miranda et al. (2014), pero con productos sin gluten disponibles en el mercado italiano, y también observó que el contenido proteico era, en casi todos los productos analizados, aproximadamente la mitad que el encontrado en los mismos productos con gluten. La explicación a este hecho podría ser la propia formulación de los productos sin gluten, la cual incluye ingredientes con un bajo contenido proteico. El almidón y las harinas sin gluten son los ingredientes con los que frecuentemente se elaboran los productos libres de gluten (Capriles & Arêas, 2014). La composición nutricional del almidón es fundamentalmente carbohidratos, y a diferencia de la harina de trigo (comúnmente utilizada en productos con gluten), que tiene un 8-15% de proteína (Uthayakumaran, Gras, Stoddard, & Bekes, 1999), su contenido proteico es menor de 0,6% (Tester, Karkalas, & Qi, 2004). Por otro lado, existen productos sin gluten que contienen solo harina sin gluten o una mezcla harina-almidón. Cabe pensar que el uso de estas harinas podría mejorar el perfil nutricional del producto. Sin embargo, de acuerdo con Miranda et al. (2014), el contenido proteico de los preparados a base de harina y/o almidón sin gluten (1.43 g/100 g producto) frente al de harinas comunes (9.77 g/100 g producto) estudiadas es muy inferior, por lo que su uso tampoco permitiría obtener productos sin gluten con un contenido proteico similar al de un producto con gluten. Así, una opción que nos permitiría conseguir el objetivo deseado sería la adición de proteínas exógenas, la cual será analizada en la presente tesis. 3. PROPIEDADES TECNOLÓGICAS DE LAS PROTEÍNAS EN LOS ALIMENTOS Las propiedades fisicoquímicas que poseen las proteínas definirán su influencia en las características finales de los productos que las contienen. Las proteínas son comúnmente utilizadas como ingredientes estructurantes en alimentos sólidos o semisólidos para conferirle una resistencia mecánica y unas características INTRODUCCIÓN 18 reformulación para dar lugar a productos que puedan ser procesados a partir de una formulación ya existente, y que continúen siendo aceptados por los consumidores. En la actualidad, existen diferentes artículos que estudian la incorporación de proteína en galletas, panes, bizcochos, etc. Sin embargo, en la mayoría de ellos no se incorporan altos porcentajes de proteína y/o no se compara entre diferentes tipos de proteínas. Sabiendo que cada proteína posee unas propiedades tecnológicas específicas, la profundización en el conocimiento sobre su posible efecto de forma individual y comparativa completaría la información conocida hasta el momento. 4.1. Proteínas en galletas El término galleta se refiere a un producto horneado de baja humedad (1-5%) que incluye generalmente como ingredientes mayoritarios harina, azúcar y grasa (Chevallier, Colonna, Buléon, & Della Valle, 2000; Chevallier, Della Valle, Colonna, Broyart, & Trystram, 2002). Otros ingredientes minoritarios que pueden incluirse en la formulación son levadura, gasificantes, siropes, sal o emulsificantes (Pareyt & Delcour, 2008). Según las combinaciones y proporciones de ingredientes mayoritarios y minoritarios utilizados se pueden encontrar diferentes tipos de galletas, entre las que se encuentran las galletas de masa corta o quebrada, las cuales fueron estudiadas en la presente tesis. El papel tecnológico o estructural de la proteína en las galletas de masa quebrada se fundamenta en la teoría de considerar este tipo de masa como un sistema bi-continuo. Baltsavias, Jurgens, y van Vliet (1997) describieron la masa quebrada como un sistema bi-continuo, compuesto por una fase grasa y una no grasa formada por una solución saturada de sacarosa que rodea partículas harina/almidón. Chevallier et al. (2000) también comparte la visión de la masa corta de galletas como un sistema bi-continuo, y considera que está formada por una suspensión de proteínas, asociaciones almidón-proteína y gránulos aislados de almidón dispersas en una solución continua de azúcar donde las grasas están emulsionadas. Por su parte, Manley (2000) coincide con esta última descripción y describe una masa corta como una matriz compuesta por una mezcla de partículas proteicas y almidón con la grasa presente como glóbulos de gran tamaño. De esta forma, la cantidad y calidad de las proteínas presentes tiene una gran influencia en el comportamiento reológico de las masas y, por lo tanto, en las características finales de las galletas. INTRODUCCIÓN 19 Durante el proceso de amasado de algunos tipos de galletas se produce el desarrollo de la red de gluten. Un nivel adecuado de agua junto con trabajo mecánico son requisitos clave para que esto ocurra. Sin embargo, en el caso de las galletas de masa corta, la cantidad de agua utilizada es muy reducida, por lo que el agua disponible para la proteína es mínima. Además, otras sustancias, como la grasa y el azúcar, también compiten por ese agua libre, y en este tipo de galletas, ambos ingredientes se encuentran en altas concentraciones (Gaines, 1990). El reducido trabajo mecánico aplicado y la baja cantidad de agua disponible explican que en este tipo de galletas no se desarrolle la red de gluten y los resultados obtenidos en galletas con y sin gluten pueden ser comparables. Existen numerosos estudios basados en el análisis del posible efecto que la adición de proteínas puede producir en la reología de galletas. Tanto Tang y Liu (2017) como Gani et al. (2015) observaron una disminución de la capacidad de absorción de agua de las mezclas harina-proteína con la adición de proteína de suero. A su vez, esta reducción influye en la reología de las masas ya que redujo los valores del módulo elástico (G’), módulo viscoso (G’’) y consistencia (G*) (Sarabhai & Prabhasankar, 2015), siendo este efecto mayor cuanto mayor era el contenido de proteína. Por su parte, Mancebo, Rodríguez y Gómez (2016) también observaron esta correlación positiva entre la capacidad de absorción de agua y la reología de las masas ya que, con la adición de proteína de guisante (0, 10 y 20%), se incrementaron ambos parámetros. Por otra parte, son numerosos los autores que han estudiado como la incorporación de proteína puede interferir en los cambios que la galleta experimenta durante el horneado y como esto afecta en sus características físicas y sensoriales. Respecto a las dimensiones de las galletas, Rababah, Al-Mahasneh y Ereiifej (2006), Singh and Mohamed (2007) y Sarabhai et al. (2015) observaron una reducción del diámetro con el aumento del porcentaje de proteína de soja añadido. Gani et al. (2015) y Mancebo et al. (2016) no observaron ningún cambio en el índice de expansión (diámetro/espesor) de galletas enriquecidas con hasta un 15% de proteína de suero y un 20% de proteína de guisante, respectivamente. Sin embargo, Tang y Liu (2017), Sarabhai et al. (2015), Sarabhai y Prabhansankar (2015) y Wani et al. (2015) mostraron un incremento de este parámetro con la adición de proteína de suero. Gallagher, Kenny y Arendt (2005) determinaron que la adición de proteína INTRODUCCIÓN 20 de suero disminuía el diámetro y el espesor de las galletas. Sin embargo, en el estudio de Parate et al. (2011), al incorporar un 20 y 40% de la misma proteína, el diámetro se reduce y el espesor aumenta. Variaciones, tanto de ingredientes como de proporciones, en las formulaciones utilizadas para la elaboración de las galletas podrían explicar estos resultados contradictorios. En cuanto al color, la mayoría de los estudios coinciden en el hecho de que las galletas enriquecidas con proteínas son más oscuras (Conforti & Lupano, 2004; Gallagher et al., 2005; Gani et al., 2015; Mancebo et al., 2016; Parate et al., 2011; Sarabhai et al., 2015; Tang & Liu, 2017; Wani et al., 2015). Este oscurecimiento de las galletas se puede explicar por un aumento del número de reacciones de Maillard entre las proteínas y los azúcares reductores (Gallagher et al., 2005; Pérez, Matta, Osella, de la Torre, & Sánchez, 2013). La textura de las galletas también se ve afectada de diferente forma en función del tipo de proteína utilizado. Varios autores observaron un aumento de la dureza con la adición de proteína de suero (Gallagher et al., 2005; Gani et al., 2015; Sarabhai & Prabhasankar, 2015; Tang & Liu, 2017). Sin embargo, Sarabhai et al. (2015) y Conforti y Lupano (2004) mostraron que las galletas con proteína de suero presentaron una dureza menor que el control. De nuevo, las diferencias entre estudios pueden deberse a diferentes formulaciones de galletas. Por su parte, Mancebo et al. (2016), Sarabhai et al. (2015) y Tang y Liu (2017) redujo la dureza de las galletas de arroz al sustituir la harina por diferentes porcentajes de proteína de guisante. 4.2. Proteínas en bizcochos Los bizcochos son productos horneados elaborados principalmente con harina, azúcar, huevos, grasa o aceite y gasificante (Wilderjans, Luyts, Brijs, & Delcour, 2013). Durante el mezclado, los glóbulos de grasa de gran tamaño se transforman en otros de menor tamaño para conseguir una emulsión estable. Esta reducción de tamaño se consigue mediante la disminución de la tensión interfacial entre las fases agua y aceite, proceso en el que participan las proteínas del huevo (Pyler, 1988). Mine (2002) afirma que, en primer lugar, las lipoproteínas de la yema se descomponen en la interfase aceite-agua. A continuación, sus proteínas se adsorben en la interfase mientras que sus lípidos se unen con las gotas de aceite presentes en INTRODUCCIÓN 21 la masa. Las interacciones moleculares dentro de la capa adsorbida que rodea las gotas de grasa contribuyen a la formación de una película que intenta estabilizar la mezcla para evitar fenómenos de coalescencia (Wilderjans et al., 2013). Además de una reducción del tamaño de los glóbulos de grasa, durante el mezclado también se produce una incorporación de aire en forma de burbujas las cuales se retienen en la fase grasa (Wilderjans et al., 2013). Cuando los cristales de grasa se derriten durante el horneado, las burbujas de aire migran de la fase grasa a la fase acuosa y las proteínas de la clara de huevo se encargan de estabilizar dichas burbujas. Así, interacciones entre las diferentes proteínas de la clara de huevo pueden contribuir a la formación (globulina) y estabilización (ovomucina) de la espuma mediante un rápido reordenamiento conformacional y la posterior formación de una película alrededor de las burbujas de aire (Mine, 1995; Weijers, van de Velde, Stijnman, van de Pijpekamp, & Visschers, 2006). A diferencia de la clara de huevo, la presencia de yema de huevo afecta de forma negativa en la formación de espuma ya que influye en las interacciones proteína-proteína y produce una disminución de la elasticidad de la película que rodea la grasa (Kiosseoglou & Paraskevopoulou, 2006). A su vez, esta reducción de la elasticidad tiene un efecto negativo sobre el producto final ya que durante el horneado se produce una expansión de las burbujas de aire, y la elasticidad debe ser suficiente para soportar la presión ejercida por las burbujas y que no se produzcan fenómenos de coalescencia. Durante las últimas etapas del horneado, la masa de bizcocho pasa de ser una masa líquida a una espuma sólida debido a la gelatinización del almidón y la coagulación de la proteína de huevo (Guy & Pithawala, 1981). Algunos autores afirman que las proteínas de la clara y de la yema de huevo coagulan entre sí y dan lugar a una red de proteínas cuando se desnaturalizan (Kiosseoglou & Paraskevopoulou, 2006; Wilderjans et al., 2013). Además, de las proteínas del huevo, la proteína de la harina también presenta cierta funcionalidad durante el mezclado de los ingredientes y/o horneado de los bizcochos. Durante el mezclado, las partículas de harina dificultan la coalescencia de los glóbulos de grasa debido a una obstrucción física y/o un incremento de la viscosidad de la fase acuosa (Shepherd & Yoell, 1976). Además, este incremento de la viscosidad reduce los fenómenos de coalescencia de las burbujas de aire, lo cual contribuye a obtener una emulsión y una espuma más estable, y por tanto, un INTRODUCCIÓN 22 bizcocho con mayor volumen (Wilderjans et al., 2013). Debido al hecho de que la proteina absorbe dos veces su peso en agua (Pareyt & Delcour, 2008), un mayor contenido proteico puede aumentar la capacidad de absorción de agua de la harina y por tanto, mejorar el volumen final del producto. Por otro lado, Donelson y Wilson (1960) observaron que cuando el porcentaje de gluten aumentaba, el volumen de bizcocho se incrementaba hasta alcanzar un máximo. Así, a pesar de que el desarrollo de la red de gluten en bizcocho es limitado (Wilderjans et al., 2013), las proteínas del gluten pueden ser importantes para la formación de la estructura del bizcocho durante el horneado (Wilderjans, Pareyt, Goesaert, Brijs, & Delcour, 2008). Como se ha explicado anteriormente, las proteínas del huevo se desnaturalizan durante el horneado y esto hace que se vuelvan más susceptibles para sufrir entrecruzamientos (Wilderjans, Luyts, Goesaert, Brijs, & Delcour, 2010). Wilderjans et al. (2008) observaron un descenso de la extractabilidad proteica durante el horneado, el cual era más pronunciado cuanto mayor era el contenido de gluten. Este descenso podría indicar un entrecruzamiento entre las proteínas de huevo y el gluten, dando lugar a una red de proteínas mixtas que forma una estructura estable con una mayor resistencia a la coalescencia (Deleu, Wilderjans, Van Haesendonck, Brijs, & Delcour, 2016; Kiosseoglou & Paraskevopoulou, 2006; Wilderjans et al., 2010; Wilderjans et al., 2013). Existen varios trabajos que estudian la influencia de la proteína en las características de bizcochos. En general, la adición de proteína disminuyó la densidad del batido: >30% de suero (Camargo et al., 2018; Jyotsna, Manohar, Indrani, & Rao, 2007), 20% de proteína de soja (Majzoobi, Ghiasi, Habibi, Hedayati, & Farahnaky, 2014; Ronda, Oliete, Gómez, Caballero, & Pando, 2011) y 15% de gluten (Wilderjans et al., 2008). De esta forma, la disminución de la densidad puede ser la explicación al aumento del volumen específico observado por varios autores al incluir diferentes tipos de proteína: guisante y amaranto, (Shevkani & Singh, 2014) suero (Camargo et al., 2018; Jyotsna et al., 2007), clara de huevo y caseína (Matos, Sanz, & Rosell, 2014), judía (Subagio & Morita, 2008), soja (Majzoobi et al., 2014) y trigo (Ronda et al., 2011; Shevkani & Singh, 2014). Sin embargo, existen autores como Sung, Park y Chang (2006), Shevkani et al. (2015) y/o Campbell, Euston y Ahmed (2016) que observaron un efecto contrario de la adición de proteína en el volumen de bizcochos. INTRODUCCIÓN 23 Respecto a la textura, la adición de caseina (Matos et al., 2014), proteína de alubia (Shevkani et al., 2015) y soja (Majzoobi et al., 2014; Sung et al., 2006) aumentó la dureza de los bizcochos. Por el contrario, la incorporación de suero (Jyotsna et al., 2007), guisante, amaranto y gluten (Shevkani & Singh, 2014) disminuyó dicho parámetro. Finalmente, como en el caso de las galletas, la mayoría de los autores coinciden en que la presencia de proteína da lugar a productos más oscuros, debido a un aumento de las reacciones de Maillard entre las proteínas y los azúcares reductores (Camargo et al., 2018; Majzoobi et al., 2014; Matos et al., 2014; Shevkani et al., 2015; Shevkani & Singh, 2014). Sin embargo, al no compararse diferentes tipos de proteínas, no es posible conocer el grado de influencia de cada tipo de proteína. Así, aunque en general la presencia de proteína disminuyó la luminosidad de los productos, algunas de ellas podrían influir en mayor medida sobre el producto final. Esta posible diferencia entre proteínas se estudiará en la presente tesis. 4.3. Proteínas en pan La proteína presente en la harina juega un papel muy importante durante las diferentes etapas del proceso de elaboración del pan. El pan se caracteriza por presentar una estructura tipo esponja donde los elementos estructurales principales son el almidón gelatinizado y la proteína desnaturalizada obtenidos durante la cocción (Stauffer, 2007). La proteína de trigo se caracteriza por presentar una fracción de almacenamiento que posee la habilidad de formar una masa viscoelástica tras ser hidratada y sometida a trabajo mecánico. Esta proteína de almacenamiento insoluble es mayoritaria en la proteína de trigo y está formada por gluteninas y gliadinas (Lai & Lin, 2007). Otra fracción proteica presente en la harina de trigo es la fracción soluble en agua, la cual contiene albúminas y globulinas. Estas proteínas engloban fundamentalmente enzimas, inhibidores enzimáticos, lipoproteinas, lecitinas y globulinas de función desconocida. Actualmente, la única función conocida de estos compuestos durante el horneado es la acción de la βamilasa en el almidón, la cual da lugar a maltosa que sirve como azúcar fermentable durante el proceso de fermentación (Stauffer, 2007). Cuando se habla de “desarrollo de la masa” este término incluye todos los cambios que los ingredientes del pan comienzan a experimentar cuando se mezclan, entre INTRODUCCIÓN 24 los que se incluyen el desarrollo de la red de gluten (Cauvain, 2007). La hidratación de la harina y la aplicación de trabajo mecánico hacen que se formen estructuras fibrosas de proteína (Amend & Belitz, 1991). Durante las primeras etapas de mezclado, las fibrillas de proteína hidratadas se adhieren entre ellas dando lugar una red aleatoria de largas hebras. Estas hebras se estiran por la acción de mezclado, haciendolas más finas, orientándolas en la misma dirección y permitiendo la interacción de unas con otras. Cuando se alcanza el pico de consistencia, las fibrillas proteicas presentan un diámetro bastante reducido en comparación al original y comienzan a interactuar bidimensionalmente en lugar de, como venían haciendo, a lo largo de los ejes de las hebras individuales (Stauffer, 2007). De esta forma, las proteínas de gluten se convierten en una red continua y cohesiva que rodea los gránulos de almidón y que proporciona propiedades viscoelásticas a la masa (Delcour et al., 2012b). A nivel molecular, algunos autores afirman que durante el mezclado se rompen los enlaces disulfuro que forman las gluteninas (Ewart, 1977; Graveland et al., 1985). Así, la glutenina se despolimeriza en subunidades más pequeñas, y se vuelve a polimerizar durante la etapa de reposo posterior. El tiempo de mezclado requerido para conseguir el desarrollo de la masa está directamente relacionado con la cantidad de glutenina contenida en la harina. Cuanto mayor es el contenido de glutenina, mayor es la energía que necesita para ser descompuesta y reorganizarse en polímeros lineales (Orth & Bushuk, 1972; Singh, Donovan, & MacRitchie, 1990). Un aspecto a evitar durante el proceso de fermentación de las masas es la coalescencia de las burbujas de gas. Durante el mezclado, se introduce hasta un 15% de gas en la masa y se estima que el número de burbujas de gas varía entre 1011 y 1014 m-3 (Bloksma, 1990; Hamer, MacRitchie, & Weegels, 2009). El dióxido de carbono genereado por las levaduras durante la fermentación se difunde dentro de estas burbujas y produce un aumento de volumen de la masa (Hamer et al., 2009). Si la masa no presenta la viscosidad y elasticidad suficiente para soportar la expansión de las burbujas, las burbujas comenzarán a tocarse, uniéndose y dando lugar a otras de mayor tamaño (Campbell, 2003; Wiggins & Cauvain, 2007) . De esta forma, la masa sufrirá una pérdida de volumen durante la fermentación, lo cual se considera un efecto no deseable. Existen varios artículos que estudian el efecto de la INTRODUCCIÓN 25 calidad y cantidad de proteína en el volumen del pan y su correlación con la reología de la masa (Bloksma, 1990; Hoseney & Rogers, 1990). Durante el horneado, las propiedades reológicas del gluten cambian significativamente cuando éste se somete a una temperatura de 50-55°C ya que disminuye el módulo viscoso (G’’) (Bale & Muller, 1970; LeGrys, Booth, & AlBaghdadi, 1981) y, o se mantiene constante (Bale & Muller, 1970) o reduce el módulo elástico (G’) (LeGrys et al., 1981). Por encima de 55°C, ambos módulos se incrementan, especialmente G’’, lo cual aumenta el carácter viscoso del gluten (Bale & Muller, 1970; LeGrys et al., 1981). Esta mayor proporción de propiedades viscosas mejora el volumen del pan ya que, como afirmaron LeGrys et al (1981), el módulo elástico de la masa está inversamente relacionado con el volumen del producto final. Por otro lado, la desnaturalización de la proteína junto con la gelatinización del almidón afectan a la difusión del agua ya que lo liberan y absorben. La gelatinización del almidón capta agua de las proteínas de gluten haciendo que las paredes de las células de aire se vuelvan más rígidas (Delcour et al., 2012b). Además, el incremento de la temperatura producido durante el horneado promueve la formación de interacciones entre proteínas (Lagrain, Thewissen, Brijs, & Delcour, 2007; Singh, 2005; Veraverbeke, Courtin, Verbruggen, & Delcour, 1999). Al principio del horneado, las gluteninas se polimerizan a través de la oxidación de los grupos SH libres y de las reacciones de intercambio SH-SS (Veraverbeke et al., 1999). A medida que continúa el proceso de horneado, los grupos SH libres promueven las interacciones gliadina-glutenina dando lugar a una gran red proteica (Lagrain et al., 2007). En el caso de los panes sin gluten, la función estructural del gluten se intenta simular mediante el uso de otros ingredientes como almidones, hidrocoloides, enzimas y/o proteínas para mejorar su estructura, aceptabilidad y vida útil (Gujral & Rosell, 2004; Mancebo, San Miguel, Martínez, & Gómez, 2015; Moore, Heinbockel, Dockery, Ulmer, & Arendt, 2006). Ziobro, Juszczak, Witczak y Korus (2016) afirmaron que la adición de proteínas lácteas reforzó la estructura, y mejoró la textura y color y ralentizó el envejecimiento de algunos productos. El incremento de temperatura alcanzado durante el horneado también posibilita la formación de reacciones de Maillard, las cuales se producen entre azúcares reductores y aminoácidos, proteínas y/o otros compuestos nitrogenados (Purlis & Salvadori, 2009). El transporte de calor y la consecuente evaporación del agua son los INTRODUCCIÓN 26 responsables de la formación de la corteza (Mondal & Datta, 2008; Zanoni, Pierucci, & Peri, 1994). Este gradiente de temperaturas hace que la temperatura en el exterior esté por encima de 100°C (Purlis & Salvadori, 2009) y que se produzcan las interacciones proteína-azúcares reductores. Los panes sin gluten se caracterizan por presentar cortezas de color pálido y la adición de proteínas exógenas puede conseguir mejorar su aspecto y aceptabilidad (Pico, Reguilón, Bernal, & Gómez, 2019). Finalmente, diversos autores han estudiado la participación de las proteínas en el proceso de endurecimiento del pan. Algunos afirman que existen enlaces de hidrógeno entre los grupos –OH de las cadenas de almidón y los grupos –NH2 de proteínas, y que éstos aumentan en número y fuerza durante el tiempo de almacenamiento, incrementando la dureza de la miga (Martin & Hoseney, 1991; Martin, Zeleznak, & Hoseney, 1991). Kim y D’Appolonia (1977a, 1977b) concluyeron que existe una relación inversamente proporcional entre el contenido proteico y el proceso de endurecimiento durante el almacenamiento del pan. Por su parte, He y Hoseney (1991) determinaron que la proteína procedente de harinas de baja calidad interaccionaba con el almidón con mayor fuerza que la proteína de harinas de mayor calidad, lo cual suponía que el pan iba a endurecerse más rápidamente. Debido a la influencia que la proteína puede tener en las propiedades del pan elaborado con harina de trigo, existen numerosos estudios que analizan como la adición de proteínas exógenas modifica sus características reológicas y/o físicas. Chinma, Ilowefah, Shammugasamy, Mohammed, y Muhammad (2015) observaron que la presencia de proteína de salvado de arroz (5-15%) en la formulación de panes de trigo redujo sus propiedades reológicas (G’ y G’’), y como consecuencia, disminuyó también su volumen. Como se ha explicado anteriormente, si una masa pierde consistencia, su capacidad de retener las burbujas de gas que se expanden durante la fermentacion es menor y como resultado, el volumen del pan disminuye. Otros autores coinciden en el hecho de que, al incorporar proteína en panes de trigo, su volumen se reduce (Campbell et al., 2016; Chinma et al., 2015; Erben & Osella, 2017; López & Goldner, 2015; Serventi, Vittadini, & Vodovotz, 2018). En cuanto a la dureza, autores como Campbell et al. (2016), Serventi et al. (2018) y Chinma et al. (2015), observaron que al añadir proteína de alubia carilla, garbanzo y salvado de arroz, respectivamente, este parámetro aumentó. Sin embargo, INTRODUCCIÓN 27 mientras que la proteína de garbanzo redujo la elasticidad y cohesividad de los panes (Campbell et al., 2016), la proteína de salvado de arroz las incrementó (Chinma et al., 2015). La incorporación de proteína de salvado de arroz y altramuz también redujo la luminosidad de panes de trigo, haciendo que estos sean más oscuros (Chinma et al., 2015; López & Goldner, 2015). Respecto a panes sin gluten, la incorporación de proteína de soja aumentó G’ y G’’ de panes elaborados con harina (Crockett, Ie, & Vodovotz, 2011; Srikanlaya, Therdthai, Ritthiruangdej, & Zhou, 2018) y almidón (Horstmann, Foschia, & Arendt, 2017; Villanueva, Pérez-Quirce, Collar, & Ronda, 2018; Ziobro et al., 2016; Ziobro, Witczak, Juszczak, & Korus, 2013). Las proteínas de patata (Witczak, Juszczak, Ziobro, & Korus, 2017), caseína (Villanueva et al., 2018), salvado de arroz (Phongthai, D’Amico, Schoenlechner, & Rawdkuen, 2016), guisante (Ziobro et al., 2016) y colágeno (Ziobro et al., 2013) también incrementaron las propiedades reólogicas de masas de pan sin gluten. Mientras que Crockett et al. (2011) y Ziobro et al. (2013) observaron que al sustituir parte de la harina y/o almidón por proteína de clara de huevo las propiedades reológicas se redujeron, Phongthai, D’Amico, Schoenlechner y Rawdkuen (2016) consiguieron aumentar el carácter elástico de panes de harina de arroz al adicionar un 2 y un 4% de proteína de clara de huevo. Otros autores tambien observaron una reducción de los parámetros G’ y G’’ con la incorporación de proteína de suero y altramuz (Srikanlaya et al., 2018; Ziobro et al., 2016). Estas diferencias pueden deberse al hecho de que unos autores sustituyeron parte del almidón por proteína, y otros adicionaron la proteína y por tanto, aumentaron el contenido de sólidos de la formulación. Este aumento puede producir un incremento de la capacidad de absorción de agua de la masa, y como resultado, dar lugar a una masa con mayor consistencia. Debido a la reducción de la consistencia de la masa, los panes con proteína de suero presentaron mayores volumenes con respecto al pan control (Aprodu, Alexandra Badiu, & Banu, 2016; Krupa-Kozak, Baczek, & Rosell, 2013; Shin, Gang, & Song, 2010). Este mismo efecto fue observado en panes que contenían proteína de clara de huevo (Crockett et al., 2011; Nozawa, Ito, & Arai, 2016; Phongthai et al., 2016; Storck et al., 2013; Ziobro et al., 2016, 2013) y caseinato (Aprodu et al., 2016; Shin INTRODUCCIÓN 34 Damodaran, S. (2005). Protein stabilization of emulsions and foams. Journal of Food Science, 70(3), R54–R66. Damodaran, S. (2008). Amino acids, peptides and proteins. In S. Damodaran, K. Parkin, & O. . Fennema (Eds.), Food Chemistry. Boca Raton, USA: CRC Press. Davis, J. P., & Foegeding, E. A. (2007). Comparisons of the foaming and interfacial properties of whey protein isolate and egg white proteins. 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Evaluar el efecto del nivel de hidratación en las características reológicas y físicas de panes sin gluten enriquecidos con altos porcentajes de diferentes proteínas. III. Evaluar los cambios reólogicos y físicos de los purés de harina extrusionada de maíz enriquecidos con proteína, así como la influencia de los procesos de calentamiento, refrigeración y congelación sobre la calidad del producto final. IV. Aplicar diferentes técnicas sensoriales (test de aceptabilidad, check-all-thatapply (CATA) y projective mapping) para evaluar las características sensoriales de galletas sin gluten y hacer una comparativa con otras galletas presentes en el mercado. ESTRUCTURA ESTRUCTURA 58 Estructura La presente tesis doctoral está dividida en tres capítulos diferenciados en base al tipo de producto estudiado y/o técnica de análisis empleada. El capítulo 1 se subdivide en tres apartados en función del producto horneado a evaluar. Estos capítulos y apartados se corresponden con las publicaciones científicas obtenidas a partir de la investigación llevada a cabo durante la tesis. Capítulo 1: Enriquecimiento proteico de productos horneados  Sahagún, M., & Gómez, M. (2018). Influence of protein source on characteristics and quality of gluten-free cookies. Journal of Food Science and Technology, 55(10), 4131–4138. https://doi.org/10.1007/s13197-0183339-z  Sahagún, M., & Gómez, M. (2018). Assessing influence of protein source on characteristics of gluten-free breads optimising their hydration level. Food and Bioprocess Technology, 11(9), 1686–1694. https://doi.org/10.1007/s11947-018-2135-0  Sahagún, M., Bravo-Núnez, Á., Báscones, G., & Gómez, M. (2018). Influence of protein source on the characteristics of gluten-free layer cakes. LWT, 94, 50– 56. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.04.014 Capítulo 2: Enriquecimiento proteico de purés instantáneos.  Sahagún, M., & Gómez (2019). The effect of different protein addition on the rheological, physical and sensory characteristics of extruded maize-based purees. International Journal of Food Science & Technology, 54(11): 30663073. https://doi.org/ 10.1111/ijfs.14227 Capítulo 3: Utilización de diferentes métodos para análisis sensorial de productos enriquecidos  Sahagún, M., Gómez, M., Orden, D., & Fernández-Fernández, E. (2019). Assessing protein addition on sensory characteristics of sugar-snap cookies: application of check-all-that-apply questions and projective mapping. *Pendiente de aceptación. 66 67 THE EFFECT OF DIFFERENT PROTEIN ADDITION ON THE RHEOLOGICAL, PHYSICAL AND SENSORY CHARACTERISTICS OF EXTRUDED MAIZE-BASED PUREES Marta Sahagún, Manuel Gómez Food Technology Area. College of Agricultural Engineering. University of Valladolid, 34004 Palencia, Spain. International Journal of Food Science and Technology, 54(11): 3066-3073 doi: 10.1111/ijfs.14227 Abstract Over last years, consumers demand products that are easy to eat with health benefits. The use of extruded flours would be a good choice to reduce the preparation time. Moreover, high protein intakes would have a positive influence on the health of specific population groups. Therefore, this study aims to assess how the addition of vegetal (rice and pea) and animal (egg white and whey) proteins could influence the characteristics of purees prepared with extruded maize flour. Rheological behaviour, microstructure, viscosity, syneresis and sensory evaluation of purees were determined. The incorporation of vegetal proteins hardly modified the puree viscosity before and after heating, and reduced the syneresis after the freeze-thaw process. Animal proteins reduced the viscosity and G′–G′′ at 30°C and increased them after heating, and also increased the syneresis after cooling and freezing. Finally, pea and egg white proteins hardly modified the overall acceptability while whey protein improved it. CAPÍTULO 3: Utilización de diferentes métodos para análisis sensorial de productos enriquecidos 70 ASSESSING PROTEIN ADDITION ON SENSORY CHARACTERISTICS OF SUGAR-SNAP COOKIES: APPLICATION OF CHECK-ALL-THAT-APPLY QUESTIONS AND PROJECTIVE MAPPING Marta Sahagún1, Manuel Gómez1, David Orden2, Encarnación Fernández-Fernández1 1Food Technology Area. College of Agricultural Engineering. University of Valladolid, 34004 Palencia, Spain. 2Applied Mathematics Area. Physics and Mathematics Department. Alcalá University, 28805 Alcalá de Henares, Spain. *Pendiente de aceptación Abstract The aim of this study was to combine projective mapping and check-all-that-apply (CATA) analysing the characteristics of protein-enriched cookies. Two evaluations were performed, analysing commercial cookies together with control elaborated cookies in a first evaluation to test the use of both methods with protein-enriched samples. After that, control and protein-enriched cookies were examined in a second evaluation. According to the results, it is possible to conclude that the incorporation of high protein levels modified the sensory characteristics of cookies. There were not significant differences between maize and wheat control samples so, the addition and type of protein achieve more influence on consumer perception than the type of flour used. Thus, the inclusion of whey and gluten protein lead to crispy and dry cookies while the addition of hydrolysed gluten protein increase the darkness and give rise to strong aftertaste. For his part, potato and egg white proteins provide a medium-dark colour to maize cookies whereas pea protein was the responsible of the mealy texture of cookies. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 74 Conclusiones La principal conclusión que se extrae de la presente tesis es la posibilidad de obtener productos sin gluten a base de cereales con un alto contenido proteico sin modificar significativamente ni sus características finales ni su aceptabilidad. Además, la influencia de la proteína en cada matriz fue diferente según el tipo y cantidad utilizados debido a las propias condiciones de cada masa y/o producto. De esta forma, las conclusiones específicas más relevantes que se obtienen a partir de los diferentes trabajos de investigación realizados son:  La proteína de huevo aumenta excesivamente la dureza de las galletas mientras que la proteína de suero da lugar a galletas más oscuras y de mayor diámetro. Por otra parte, las galletas con proteína de guisante apenas presentaron diferencias con la galleta original.  La presencia de proteína de guisante, y especialmente de proteína de arroz, produce una reducción del número de burbujas presentes en las masas de bizcocho, siendo estas menos estables y dando lugar a fenómenos de coalescencia durante el proceso de calentamiento. Por su parte, las proteínas de clara de huevo y suero, debido a sus excelentes propiedades emulgentes, ayudan a estabilizar las burbujas incorporadas durante el mezclado y dan lugar a bizcochos de mayor volumen.  Los fenómenos de agregación y coagulación que sufren las proteínas de suero y huevo, respectivamente, aumentan de forma significativa la dureza de los bizcochos. De hecho, la adición de un 45% de proteína de clara de huevo multiplicó por nueve la dureza del producto final. Por otro lado, las proteínas vegetales apenas modifican las propiedades de los bizcochos, aunque son menos cohesivos y elásticos.  La optimización del volumen específico de panes sin gluten en función del nivel de hidratación proporciona información adicional en comparación con los métodos tradicionales de hidratación constante o ajuste por reología. Las proteínas vegetales requieren mayor cantidad de agua que las proteínas CONCLUSIONES 75 animales para obtener su volumen específico máximo. Además, el valor de volumen máximo de los panes con proteínas animales fue menor que el obtenido con las proteínas vegetales.  A pesar de la necesidad de un valor de consistencia mínimo para conseguir un volumen aceptable, la proteína de huevo, gracias a su capacidad coagulante, permite conseguir panes con un alto volumen a partir de masas con una consistencia muy baja.  El menor volumen de los panes con proteína de suero provoca que su dureza sea muy elevada. En el caso de la proteína de huevo, aunque su volumen sea similar a la muestra control, sus propiedades coagulantes incrementan la dureza de los panes.  El proceso de calentamiento modifica la influencia que las proteínas de suero y clara de huevo ejercen sobre la viscosidad de purés instantáneos a base de harina extrusionada. La adición de estas proteínas reduce la viscosidad del puré a 30°C mientras que, tras ser calentado, su viscosidad aumenta con respecto al puré sin proteína.  La incorporación de proteínas de guisante y arroz reduce la sinéresis que los purés sufren tras un proceso de calentamiento. Esto, junto con su alta aceptabilidad, hace que la proteína de guisante sea la mejor opción para obtener purés instantáneos enriquecidos con proteína.  Projective mapping y check-all-that-apply (CATA) son técnicas de análisis sensorial con un efecto complementario, lo cual permite comprobar algunos datos de textura y color medidos instrumentalmente, así como obtener una información más completa sobre sabor y/o aroma que no se pueden conseguir con otras mediciones. De esta forma, estas técnicas permitieron observar que el tipo y la cantidad de proteína adicionada tenían mayor influencia en la aceptabilidad que el tipo de harina utilizado. Además, se demostró que el uso de proteína de suero permitió conseguir galletas sin gluten más similares a aquellas elaboradas con harina de trigo. Por último,