Heterogeneidad funcional de los depósitos de calcio del retículo endoplasmático y el aparato de Golgi
Abstract
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología
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FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y FISIOLOGÍA INSTITUTO DE BIOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR (IBGM) TESIS DOCTORAL: Heterogeneidad funcional de los depósitos de Ca2+ del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi Presentada por Francisco J. Aulestia Araya para optar al grado de Doctor por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Javier García-Sancho Martín Dra. María Teresa Alonso Alonso .
i Tabla de contenido RESUMEN........................................................................................................................................5 1INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................6 1.1Mecanismos que modifican la [Ca2+]C..........................................................................6 1.2Mecanismos que aumentan la [Ca2+]C.........................................................................7 1.2.1Entrada de Ca2+ desde el medio extracelular: VOC, ROC, SOC, TRP y, SMOC.7 1.2.2Liberación de Ca2+ desde los depósitos intracelulares: IP3R, RyR, TPC y canal de fuga (leak)...............................................................................................................22 1.3Mecanismos que disminuyen la [Ca2+]C.....................................................................30 1.3.1Bombas (ATPasas) de Ca2+: PMCA, SERCA y SPCA....................................32 1.3.2Intercambiadores Na+/Ca2+ (NCX) y Na+/K+/Ca2+ (NCKX)..............................41 1.3.3El uniportador de Ca2+ mitocondrial (MCU).......................................................43 1.3.4Proteínas que ligan Ca2+......................................................................................44 1.4Orgánulos intracelulares y su función como depósitos de Ca2+............................45 1.4.1Retículo endoplásmico (RE)................................................................................45 1.4.2El aparato de Golgi (Go)......................................................................................49 1.4.3Síntesis y tráfico de proteínas RE-Go y la señal de Ca2+...............................52 1.4.4Orgánulos ácidos (lisosomas y vesículas de secreción).................................54 1.4.5Mitocondrias...........................................................................................................56 1.4.6Heterogeneidad funcional de los depósitos de alto Ca2+................................56 2OBJETIVOS...........................................................................................................................59 3MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................................60 3.1Cultivos celulares..........................................................................................................60 3.1.1Células HEK293....................................................................................................60 3.1.2Células HeLa (Henrieta Lacks)...........................................................................60 3.2Plásmidos.......................................................................................................................61 3.2.1Mantenimiento y propagación de plásmidos.....................................................61 3.2.2Vectores de expresión y clonación.....................................................................61 3.3Transfecciones celulares..............................................................................................66 3.3.1Generación de las líneas de HeLa estables.....................................................66
ii 3.3.2Transfección celular para medidas de Ca2+ por bioluminiscencia.................68 3.4Medida de la [Ca2+]RE y la [Ca2+]GO en poblaciones celulares por bioluminiscencia........................................................................................................................69 3.5Medida de [Ca2+]tGO en célula única con tgoGAP1..............................................72 3.6Medida de la [Ca2+]C con fura-2..................................................................................72 3.7Técnicas de inmunodetección.....................................................................................73 3.7.1Inmunofluorescencia y análisis de colocalización............................................75 3.7.2Western blot...........................................................................................................76 3.7.3Determinación de la actividad ATPasa de SERCA3.......................................76 3.8Análisis de la expresión génica...................................................................................77 4RESULTADOS......................................................................................................................79 4.1Movilización de Ca2+ inducida por agonistas en células HeLa y HEK293............79 4.2El subcompartimento resistente a TBH no es un compartimento ácido y ni alcalino........................................................................................................................................83 4.3El RE presenta un subcompartimento resistente a TBH en células HEK293, pero no en HeLa.................................................................................................................................85 4.4La SERCA3d es la responsable de la captación de Ca2+ resistente a TBH........90 4.5Depósitos de Ca2+ del Aparato de Golgi....................................................................94 4.6Las sondas cGoGA y tGoGA son funcionales..........................................................99 4.7El tGo contiene un compartimento resistente a tapsigargina (Tg).....................104 4.8La captación de Ca2+ resistente a Tg en el tGo tiene alta afinidad por Ca2+.....113 4.9La recaptación resistente a Tg en el tGo es mediada por la SPCA....................116 4.10La necesidad de Ca2+ para el proceso secretor.....................................................118 4.11Medidas preliminares de [Ca2+]GO en célula única usando una nueva sonda fluorescente derivada de la aequorina.................................................................................119 5DISCUSIÓN.........................................................................................................................122 5.1Heterogeneidad funcional de los depósitos de Ca2+ del retículo endoplásmico (RE).122 5.2Heterogeneidad funcional de los depósitos de Ca2+ del aparato de Golgi (Go). 126 6CONCLUSIONES...............................................................................................................135 7REFERENCIAS...................................................................................................................137
ABREVIATURAS. 1 ABREVIATURAS. AA: Ácido araquidónico. ACh: Acetilcolina. Aeq: Aequorina. AGT: β-1,6-N-acetilglucosamintransferasa. AMPA: α-amino-3-hidroxi-5metil-4-isoxazol-4-propionato. AraC: Citosina-β-D-arabinofuranosido. ATP: Adenosin trifosfato. BSA: Albumina de suero bovino. [Ca2+]C: Concentración de calcio citosólica. [Ca2+]GO: Concentración de calcio del aparto de Golgi. [Ca2+]tGO: Concentración de calcio del trans-Golgi. [Ca2+]cGO: Concentración de calcio del cis-Golgi. [Ca2+]RE: Concentración del retículo endoplásmico. cADPR: ADP ribosa cíclica. CaM: Calmodulina. CaMKII: Proteína quinasa dependiente de Ca2+-calmodulina tipo II. CCh: Carbamilcolina. cGo: cis-Golgi. cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementario. CICR: Liberación de calcio inducida por calcio. CMV: Citomegalovirus. CPA: Ácido ciclopiazónico. Cz: Celenterazina. DAG: Diacilglicerol. DAPI: 4,6-diamidino-2-fenilindol. dem: desviación estándar de la media. DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium. DHP: Dihidropiridinas.
ABREVIATURAS. 2 DRG: Ganglios de la raíz dorsal. DTT: Ditiotreitol. EE: Ensayo enzimático. eem: Error estándar de la media. EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético. EGTA: Ácido etilenglicol–bis-(β–amino–eti l-éter)-N,N`-tetraacetico. GA: EGFP-aequorina. GECI: Indicador de calcio codificado geneticamente. GAP: Proteína GFP-Aequorina. GFP: Proteína fluorescente verde. GM130: Proteína 130 de Golgi Matrix. GluR: Receptor de glutamato. Go: Aparato de Golgi. GPN: glicil-L-fenilalanina 2-naftilamida. GT: ß-1,4 N-galactosiltransferasa. HBSS: Hank`s Balanced Salt solution. HRP:Horseradish peroxidase protein. HVA: High voltage activated. HEPES: Ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(2 etanosulfonico). HSV: Virus herpes simplex. IF: Inmunofluorescencia. IgG: Inmunoglobulina tipo G. IP3: Inositol 1, 4, 5–trifosfato. IP3R: Receptor de inositol 1, 4, 5–trifosfato. MCU: Uniportador de calcio mitocondrial. MOPS: Ácido 3–(N–morfolino) propanosulfónico. MP: Membrana plasmática. NAADP: Ácido nicotínico-adenin dinucleótido fosfato. nAChR: Receptor de acetilcolina.
ABREVIATURAS. 3 NCKX: Intercambiador Na+ / Ca2+-K+. NCX: Intercambiador Na+ / Ca2+. NE: Envoltura nuclear. NGF: Factor de crecimiento nervioso. NIGER: Nigericina. L: Luminiscencia al el tiempo t. LB: Luria Broth. LTOTAL: Luminiscencia total. P2xR: Receptor de ATP P2x. PBS: Tampón fosfato salino. PIP2: Fosfatidil - inositol, 4, 5 – bisfosfato. PKA: Proteína quinasa A. PKC: Proteína quinasa C. PLA: Fosfolipasa A. PLC: Fosfolipasa C. PLN: Fosfolamban. PMCA: ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática. PMSF: Fluoruro de fenilmetil sulfonilo. PS: Presenilina. PTP: Poro de transición mitocondrial. PROP: Propionato. Q-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa, cuantitativa. RE: Retículo endoplásmico. ROC: Canal de calcio operado por receptores. RS: Retículo sarcoplásmico. RyR: Receptor de rianodina. SERCA: ATPasa de calcio del retículo (sarco) endoplásmico. SDS: Dodecilsulfato sódico. SFB: Suero fetal bovino.
ABREVIATURAS. 4 siRNA: RNA pequeño de interferencia. SMOC: Canal operado por segundos mensajeros. SLN: Sarcolipina. SOC: Canales operados por depósitos de calcio intracelulares. SOCE: Entrada de Ca2+ operada por depósitos intracelulares. SPCA: ATPasa de Ca2+ de la vía secretora. STIM: Molécula de interacción con el estroma. t1/2: tiempo de semirelajación. TAE: Tris-acetato-EDTA. TBH: 2, 5–Di (tert-butil)–1,4–benzohidroquinona. TBE: Tampón Tris/Borato/EDTA. TBS: Tampón salino con Tween. Tg: Tapsigargina. tGo: trans-Golgi. TGN: Trans Golgi Network. TGN46: Proteína 46 del trans Golgi network. TM: Trans membrana. TMA: Trimetilamina. TPC: Two pore chanel. tRE: Retículo endoplásmico de transición. TRP: Receptor de potencial transitorio. Tween 20: Monolaurato de polietilen sorbitan. V0: Velocidad inicial. VOC: Canal de calcio operado por voltaje. VS: Vesícula de secreción. YFP: Proteína fluorescente amarilla. WB: Western blot.
RESUMEN 5 RESUMEN. En esta Tesis se estudia la dinámica del calcio (Ca2+) en los principales depósitos intracelulares, retículo endoplásmico (RE) y aparato de Golgi (Go) en dos modelos celulares humanos, las células HEK293 y las HeLa, y su contribución a la génesis de señales de Ca2+ citosólico. Se han diseñado y construido tres nuevas sondas de Ca2+ derivadas de la fotoproteína aequorina con secuencias de direccionalidad que permiten hacer medidas en diferentes microdominios del Go y el RE de las células vivas, tanto por fotoluminiscencia como por fluorescencia. En el RE de las células HEK293 hemos podido demostrar la coexistencia de dos ATPasas de Ca2+, SERCA2b y SERCA3d. Esta última es responsable de un componente atípico de la captación de Ca2+ en RE, que es resistente a la tertbutilhidroquinona (TBH) y cuya función es desconocida. El Inositol 1, 4, 5– trifosfato (IP3) es capaz de movilizar el Ca2+ de este compartimento. Las células HeLa expresan SERCA3 muy escasamente (20 veces menos que las HEK293) y tampoco muestran captación de Ca2+ resistente a TBH en su RE, de modo que el depósito de Ca2+ del RE es homogéneo en las células HeLa. La captación de Ca2+ resistente a TBH se induce por sobreexpresión de SERCA3d en las células HeLa. El Go como reservorio de Ca2+ se ha estudiado con especial detalle utilizando sondas dirigidas específicamente a las zonas cis (cGo) y trans (tGo) del mismo. Estos compartimentos difieren por su sensibilidad a la tapsigargina y a la TBH y por la expresión de la ATPasa de Ca2+ de la vía secretora (SPCA1). El cGo es un compartimento homogéneo, capaz de acumular Ca2+ a concentraciones próximas a 150 µM vía SERCA y con muy poca expresión funcional de la SPCA. El tGo está compuesto por dos subcompartimentos, tGo1 y tGo2. El tGo2 que supone el 75 % de tGo, lo consideramos un compartimento de transición con muy poca expresión de SPCA y un nivel de Ca2+ relativamente bajo (40 µM). El tGo1 supone el 25 % de tGo, posee actividad SPCA y acumula Ca2+ a gradientes cercanos a 200 µM. La matriz de tGo1 no tiene continuidad difusional con tGo2, por lo que pensamos que podría estar compuesto por vesículas situadas en el extremo más trans del Go. La captación de Ca2+ por tGo1 es de mucha mayor afinidad que en el RE o en los otros compartimentos de Go, por lo que este compartimento mantiene alto su contenido de Ca2+ incluso cuando baja el Ca2+ citosólico a niveles que ocasionan el vaciamiento de los otros depósitos intracelulares. El mantenimiento del alto contenido de Ca2+ en este compartimento parece esencial para el procesamiento de proteínas en el Go.
1.INTRODUCCIÓN. 6 1 INTRODUCCIÓN. La señalización intracelular mediada por calcio (Ca2+). Una de las principales ideas unificadora de la Biología es que, a pesar de la enorme diversidad de seres vivos que habitan en la Biosfera, todos ellos están compuestos de células; asimismo, todas las células comparten propiedades de organización estructural y funcional. La adaptación de la célula a los cambios del medio, empleando señales intracelulares que le permita responder a estas variaciones, es una de sus principales propiedades. La señalización intracelular supone la participación de mensajeros cuya concentración varíe a través del tiempo y permita generar respuestas rápidas y específicas. Lo más bello de la señalización celular es que las diferentes vías de señalización se combinan y adaptan para controlar diversos aspectos de los procesos celulares a muy diferentes escalas y espacios temporales (Berridge, 2012) Quien cumple de buena manera este papel de mensajero es el ión calcio (Ca2+). La señalización mediada por Ca2+ resulta clave para múltiples funciones, adaptaciones y respuestas de la célula como la contracción muscular (Tsugorka y cols., 1995), la excitabilidad neuronal (Albensi, 2007), la secreción de neurotransmisores (Maruyama y Petersen, 1994), la muerte celular (Bernardi y Rasola, 2007) y la expresión génica (Dolmetsch y cols., 2001). La señalización intracelular mediada por Ca2+, a diferencia de otros mensajeros intracelulares, está controlada por procesos biofísicos. La membrana plasmática facilita la formación de un gradiente electroquímico manteniendo la concentración de Ca2+ en el citosol ([Ca2+]C) a niveles de 10-7 M. Del mismo modo, en el interior de la célula también se forman gradientes de concentración por la acumulación de Ca2+ en los distintos orgánulos. (Clapham, 2007). 1.1 Mecanismos que modifican la [Ca2+]C. En la célula existe un equilibrio controlado entre los mecanismos que producen elevaciones de la [Ca2+]C y los que la disminuyen (ver Esquema). Las elevaciones de la [Ca2+]C son consecuencia de los flujos de entrada de Ca2+ a través de la membrana plasmática y de la liberación desde los orgánulos intracelulares;
1.INTRODUCCIÓN 13 Figura I3. Organización estructural típica de un receptor de glutamato (GluR) de tipo ionotrópico. Los tres subtipos de GluR ionotrópicos, N-metil-D-aspartato (NMDA), α-amino-3-hidroxi-5metilisoxazol-4-propiónico (AMPA) y kainato, tienen la misma organización estructural. (A) El receptor funcional es un tetrámero formado por cuatro subunidades homólogas. Cada subunidad contiene cuatro dominios TM y dos dominios extracelulares (a los que se une el glutamato). (B) El NMDAR es un tetrámero compuesto por subunidades NR1 y NR2. La subunidad NR1 presenta una zona de unión a glicina y forma parte del poro. La subunidad NR2 posee una zona de unión a glutamato, forma parte del poro y, a diferencia del NR1, tiene un extremo C-terminal muy largo con numerosos sitios de fosforilación sujetos a la acción de quinasas que regulan la actividad del receptor [figura modificada de (Berridge, 2012)].
1.INTRODUCCIÓN. 14 Los receptores ionotrópicos de glutamato (GluR) (Fig. I3) tienen una organización estructural en tetrameros, cada subunidad tiene 4 dominios transmembrana (TM 1-4) y, en el dominio TM 2, se forma el poro. Entre los dominios TM 2 y TM 3 existe una zona llamada Q/R, rica en residuos de glutamina, que determina la permeabilidad a Ca2+. El sitio de unión a glutamato está formado por la interacción de dos dominios extracelulares: el 1, que es parte de la región N-terminal del dominio TM 1, y el TM 2, que es parte de la región enlazante entre los dominios TM 3 y TM 4. El extremo C-terminal es citosólico y puede fosforilarse por la proteína quinasa A (PKA) y por la quinasa II dependiente de calcio-calmodulina (CaMKII) (Zhorov y Tikhonov, 2004). Existen distintas subunidades que al combinarse en forma de tetrámeros puede generar una gran diversidad de canales funcionales distintos. Particularmente la subunidad del sitio de unión a glutamato es variable y puede interaccionar con moléculas parecidas a glutamato. De hecho, tres familias de estos receptores toman los nombres de los compuestos que los activan: el N-metil-D-aspartato (NMDA), que activa los receptores de NMDA; el α-amino-3-hidroxi-5metil-4isoxazol-4-propionato (AMPA), que activa los receptores AMPA; y el kainato, que activa los receptores de kainato (Stawski y cols., 2010). Los receptores de NMDA son altamente permeables al Ca2+ y están conformados por dos subunidades NR1, que constituyen esencialmente el poro, y dos subunidades NR2. La apertura del canal depende de la unión del glutamato y la glicina. La glicina se une a la subunidad NR1, mientras que el glutamato interacciona con la subunidad NR2. La apertura del canal consta de dos fases: la primera, en la cual se despolariza la membrana y se elimina el Mg2+ que bloquea el canal, y la segunda, en la cual el glutamato se une al receptor y el canal se abre. Los receptores de NMDA son muy importantes en las funciones de aprendizaje y la adquisición de memoria (Albensi, 2007; Paoletti y Neyton, 2007). Los receptores AMPA están formados por 4 subunidades (GluR1-4) con distintas propiedades funcionales dependiendo de la combinación de subunidades y con GluR2 como subunidad clave para la permeabilidad a Ca2+ (Midgett y Madden, 2008; Nakagawa, 2010; Sukumaran y cols., 2012). Estos canales presentan permeabilidad a Na+ que permite la entrada de este catión y la despolarización de la membrana, que finalmente resulta en la activación de los VOC y la entrada de Ca2+. Están localizados principalmente en las sinapsis de neuronas excitatorias y en los astrocitos que forman parte de la sinapsis tripartita.
1.INTRODUCCIÓN 15 Figura I4. Organización estructural del receptor purinérgico P2X1 humano. El receptor P2X tiene dos dominios transmembrana, TM 1 y TM 2, con los extremos N y Cterminales que se extienden hacia el citoplasma. Hay un extenso bucle extracelular, que contiene el sitio de unión a ATP, con dos residuos hidrófobos (Phe-185-291), que se unen al anillo de adenina y residuos cargados (Lys-68, Arg-292 y Lys-309) que interactúan con los fosfatos. La integridad estructural del dominio extracelular se mantiene mediante enlaces disulfuro. El extremo N-terminal es citoplásmico y contiene una treonina, que puede ser fosforilada por la proteína quinasa C (PKC). El extremo C-terminal también mira hacia el citoplasma. El canal P2X funcional es una estructura trimérica [figura modificada de (Khakh y North, 2006)].
1.INTRODUCCIÓN. 16 Finalmente, los receptores de kainato están principalmente distribuidos en el cerebro (corteza, hipocampo y cerebelo). Presentan escasa permeabilidad a Ca2+ pero inducen la entrada secundaria de Ca2+ por activación de los VOC, al igual que los receptores AMPA. Existen cinco tipos de subunidades de receptores de kainato: GluR5, GluR6 GluR7, KA1 y KA2; y que se pueden combinar de distintas maneras para formar tetrámeros. Las subunidades GluR5-7 pueden formar homotetrámeros o heterotetrámeros, mediante combinaciones entre las subunidades GluR y KA. Por el contrario, la subunidades KA1-2 no forman homotetrámeros. La permeabilidad a Ca2+ del receptor de kainato depende principalmente de la subunidad GluR6 (Egebjerg y Heinemann, 1993). Por otra parte, a diferencia de los receptores AMPA, los receptores de kainato juegan un papel minoritario en la señalización de las sinapsis; no obstante, participan en la plasticidad sináptica afectando a la respuesta a posteriori de la célula estimulada (Contractor y cols., 2011; Dingledine y cols., 1999; Huettner, 2003). Los receptores de ATP de tipo P2X (P2XR) (Fig. I4) responden a ATP induciendo la entrada directa de Ca2+ a través del canal y, mediante despolarización de la membrana, indirectamente, por la apertura de los VOCs. Se han descrito hasta siete subunidades distintas con propiedades diferentes que pueden combinarse formando heterotrímeros. Estos canales se disponen con los dos extremos Ny C-terminal hacia el citosol y con dos dominios transmembrana conectados por un gran bucle extracelular que alberga el sitio de unión al ATP. De modo análogo a los receptores de NMDA, la apertura del canal depende además, de la unión de tres moléculas de glicina (Egan y cols., 2006; KaczmarekHajek y cols., 2012; Vial y cols., 2004). Los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) (Fig. I5) responden a acetilcolina (y a nicotina, pero no a muscarina) y controlan procesos, tanto del sistema nervioso central como del sistema nervioso periférico. Normalmente son permeables a Na+ y K+, sin embargo, algunos tienen una considerable permeabilidad a Ca2+. Los nAChRs forman pentámeros con combinaciones de subunidades que dan lugar a distintos canales, que se distinguen por sus particulares valores de permeabilidad a Ca2+. Cada una de las cinco subunidades tiene cuatro segmentos de transmembrana que permiten el anclaje y la formación del poro del canal. Existen dos tipos principales de nAChR, uno responsable del acoplamiento excitación-contracción y otro, que participa en la sinapsis neuronal. Los nAChR pueden transmitir información mediante dos mecanismos: por despolarización de la membrana producto de la entrada de Ca2+ y Na+ en células excitables y, a través de activación de vías de señalización dependientes de Ca2+, esta última tanto en células excitables como en no excitables (Leonard y Bertrand, 2001; Miyazawa y cols., 2003; Rossman, 2011).
1.INTRODUCCIÓN 17 Figura I5. Organización estructural de los receptores nicotínicos de acetilcolina nAChR. El nAChR es un receptor típico de bucle-cisteína. Es un pentámero que contiene al menos dos subunidades α junto con diferentes combinaciones de las otras subunidades. Una sección transversal del canal a el nivel de la membrana (parte superior izquierda) revela que cada subunidad se compone de cuatro segmentos que abarcan la membrana (M 1-M 4), con M 2 frente al poro (P). La organización de las dos subunidades en sección longitudinal (parte inferior derecha) ilustra la forma en que el segmento M 2 forma el poro, P. El extremo N-terminal se extiende hacia el lado extracelular y contiene el bucle de cisteína. El extremo C-terminal es también extracelular [figura modificada de (Berridge, 2012). 1.2.1.3 Canales operados por depósitos (SOC) y la entrada capacitativa. La mayor parte del Ca2+ utilizado en señalización proviene de la liberación desde el retículo endoplásmico (RE), que al tener una capacidad finita, ejerce su función a través de mecanismos de transporte que garantizan su rellenado. En respuesta al vaciamiento del RE la célula emplea los denominados canales operados por depósitos (SOC), que se abren y permiten el paso de Ca2+ desde el medio extracelular restaurando los niveles de Ca2+ en este depósito. El proceso por el
1.INTRODUCCIÓN. 18 que se activan los canales tras el vaciamiento de los depósitos intracelulares, principalmente el RE, se conoce como entrada capacitativa o SOCE6 (Putney, 1986, 1990). Hasta la fecha, el canal de Ca2+ que mejor recopila las propiedades biofísicas descritas en la SOCE es el canal Orai1 (Fig. I6). Éste posee cuatro segmentos transmembrana que conforman el poro. Tanto las regiones Ncomo C-terminal se ubican en la cara citosólica, que participaría en el acoplamiento entre el vaciamiento del RE y la apertura del canal (Peinelt y cols., 2006; Prakriya y cols., 2006; Yeromin y cols., 2006). La proteína de la membrana del RE, STIM17 (Fig. I6) a través de una región del N-terminal, situada en el lumen del RE, detectaría la disminución de la [Ca2+]RE y la región del extremo C-terminal interaccionaría directamente con Orai1, provocando su apertura (Liou y cols., 2005; Roos y cols., 2005). El mecanismo responsable de la entrada capacitativa mediada por STIM1 y Orai, se resume en cuatro pasos. (1) Tras la disminución de la [Ca2+]RE, STIM1 oligomeriza en una zona concreta de la membrana del RE, debido a que posee un dominio luminal que funciona como sensor de Ca2+ en el lumen del RE. (2) La porción de membrana del RE donde se concentra STIM1 se desplaza hacia la membrana plasmática. (3) En la membrana plasmática ocurre el reclutamiento de Orai1. La estrecha aproximación de la membrana de RE con la membrana plasmática conduce a la acumulación de Orai1 en forma de tetrámeros, que es la forma activa del canal de Ca2+. (4) Finalmente, se produce la apertura del canal y la entrada de Ca2+ mediada por la interacción de STIM1 y Orai1 (Cahalan, 2009; Lewis, 2007; Putney, 2010) Anteriormente al descubrimiento de Orai, se había propuesto los canales TRPC como los canales implicados en la entrada capacitativa y sigue siendo un tema controvertido (Berridge, 1997; Parekh y Penner, 1997). 6SOCE:StoreOperatedCalciumEntry 7STIM1:StromalInteractingMolecule
1.INTRODUCCIÓN 19 Figura I6. Componentes moleculares de la entrada de Ca2+ operada por depósitos intracelulares (SOC, por Store-Operated Channels), también llamada entrada capacitativa. La entrada de Ca2+ sucede a través de la proteína Orai1, que tiene cuatro regiones transmembrana con los extremos N-y C-terminales que miran hacia el citoplasma y participan en el proceso de activación por acoplamiento a proteínas intracelulares. La proteína STIM1, situada en el retículo endoplásmico, tiene un dominio de mano EF que detecta el nivel de Ca2+ en el lumen del RE. Cuando se vacía el RE (por ejemplo, en respuesta a un aumento del inositol 1,4,5trisfosfato (IP3)), baja la [Ca2+]RE, STIM1 se desliga del Ca2+, se agrega y migra hacia las regiones del RE que se enfrentan a la membrana plasmática (uniones MP-RE, con las dos membranas muy cercanas) e interacciona con Orai1, formándose agregados e iniciándose la entrada de Ca2+ [figura modificada de (Hewavitharana y cols., 2007)] .
1.INTRODUCCIÓN. 20 1.2.1.4 Canales de potencial transitorio (TRP). Estos canales presentan una permeabilidad no selectiva a cationes. Se conocen al menos 28 variedades y son capaces de responder a estímulos como la temperatura, el contacto, los estímulos nocivos, la osmolaridad y el pH (Putney, 2004). En mamíferos, los canales TRP están codificados por 23 genes diferentes y se han descrito siete subfamilias: TRPC8, TRPM9, TRPV10, TRPA11, TRPP12, TPML13 y TRPN14 (Ramsey y cols., 2006). Una de las principales características de esta familia de canales es que tienen baja conductancia y pueden permanecer abiertos durante largos periodos de tiempo. En general, se ensamblan en tetrámeros que conforman el canal; cada subunidad del tetrámero posee seis dominios transmembrana y los extremos C y N-terminales están orientados hacia el citosol (Fig. I7) (Clapham, 2007; Ramsey y cols., 2006). Dentro de la superfamilia TRP, cabe destacar los TRPC, TRPM y TRPV (Fig. I7) por su implicación en la señalización por Ca2+. Los canales TRPC (1-7) tienen en su extremo N-terminal repeticiones de anquirina y se sabe que requieren de la actividad de fosfolipasa C. También se han implicado, en la señal de Ca2+ responsable de la entrada capacitativa (Ambudkar y cols., 2007), de proporcionar la señal de Ca2+ responsable de la proliferación de células musculares lisas y de la señal de Ca2+ de la reacción acrosómica (Yildirim y Birnbaumer, 2007). Los TRPM (1-8) se caracterizan por tener los extremos N y C-terminal muy largos y, algunos miembros de esta subfamilia, se distinguen en que funcionan a la vez como canales y enzimas (Fig. I7). La permeabilidad de estos canales es variable y permite el paso de otros cationes monovalentes (Guinamard y cols., 2011). Debido a la especial sensibilidad a Ca2+, tanto en la activación como en inactivación, se ha implicado a esta familia como canal marcapasos en la inspiración-espiración respiratoria (Mironov, 2008). Los TRPV (1-6) son canales de Ca2+, que típicamente poseen entre tres y cuatro repeticiones de anquirina en la región N-terminal. Responden a estímulos, 8TRPC:TransientReceptorPotentialCanonical. 9TRPM:TransientReceptorPotentialMelastine. 10TRPV:TransientReceptorPotentialVanilloid. 11TRPA:TransientReceptorPotentialAnkyrin. 12TRPP:TransientReceptorPolycystin. 13TRPML:TransientReceptorMucolipin. 14TRPN:TransientReceptorNomechanoreceptor.
1.INTRODUCCIÓN 21 sensoriales como el calor, químicos como la capsaicina y a mediadores inflamatorios (Vay y cols., 2012). Figura I7. Organización estructural de la familia de los canales TRP. Todos los TRP tienen la misma estructura básica (ver el panel superior), que consta de seis dominios transmembrana con los extremos Ny C-terminales situados en el citoplasma. Entre el quinto y el sexto dominio transmembrana, que están muy conservados en todos los homólogos, hay un bucle que forma el poro (P). La mayor parte de las diferencias entre las tres familias se encuentran dentro de los extremos Ny C-terminales. Los TRPC y TRPV son bastante similares en cuanto a que contienen tres o cuatro repeticiones de anquirina (A). Los TRPM se caracterizan por tener los extremos N-y C-terminales muy largos. El dominio C-terminal contiene la actividad enzimática (región roja) en algunos de los canales [figura modificada de (Spassova y cols., 2004)].
1.INTRODUCCIÓN. 22 1.2.1.5 Canales operados por segundos mensajeros (SMOC). Estos canales de Ca2+ se activan por segundos mensajeros generados en distintas cascadas de señalización, como los CNGC15, activados por nucleótidos cíclicos, y los, ARC16, activados por el ácido araquidónico (Bird y cols., 2004). En una sección posterior se tratará la función de los segundos mensajeros en la activación de canales de endomembranas. Los CNGC son canales de Ca2+, y en menor medida de Na+, que desempeñan un papel importante en la transducción sensorial del gusto, la visión y la audición. En mamíferos existen seis genes que codifican para los CNGC y estos se pueden agrupar en dos familias: los CNGA y los CNGB. El canal es un tetrámero que puede resultar de diferentes combinaciones de subunidades con sus particulares características. Las subunidades CNGA1-CNGA3 componen el canal mientras que la subunidades CNGA4 y CNGB tienen una función moduladora. Las regiones N-terminal de las subunidades moduladoras poseen un sito de unión a CaM (Bradley y cols., 2005; Trudeau y Zagotta, 2002). Los ARC son canales altamente selectivos a Ca2+ y son activados por el ácido araquidónico, que es el producto de la fofolipasa A2 (PLA2). La activación de los ARC está regulada por la fosforilación y defosforilación del receptor: la fosforilación por la proteína quinasa A (PKA) activa el canal, mientras que la defosforilación mediada por la fosfatasa calcineurina lo inactiva (Shuttleworth, 2012). Estos canales se han identificado en células de la parótida y en células acinares pancreáticas. 1.2.2 Liberación de Ca2+ desde los depósitos intracelulares: IP3R, RyR, TPC y canal de fuga (leak). La capacidad de la célula de almacenar el Ca2+ en diversos orgánulos intracelulares, mediante sistemas de bombeo, facilita la formación de compartimentos de Ca2+ intracelulares. La apertura y cierre de canales permeables al Ca2+ de las membranas de los orgánulos intracelulares permiten el rápido incremento de la [Ca2+]C. Los orgánulos descritos como depósitos de Ca2+ 15CNGC:Cyclicnucleotide‐gatedchanel. 16ARC:Araquidonicacid‐regulatedchanel.
1.INTRODUCCIÓN 29 1.2.2.3 Canal TPC. El canal TPC22 (Fig. I10) debe su nombre a los dos poros que se deducen de su estructura primaria. Está formado por dos subunidades, cada una con seis segmentos transmembrana (S1-6) interconectados por un bucle a otros seis segmentos, estructura típica de canales activados por voltaje. Hasta la fecha se han descrito tres subtipos de TPC (1, 2 y 3) que se expresan preferentemente en los gránulos ácidos como el lisosoma (TPC2) y el endosoma (TPC1 y TPC3) (Zhu y cols., 2009). El primero se activa con el ácido nicotínico-adenin dinucleótido fosfato (NAADP), que provoca la liberación de Ca2+ contenido en este orgánulo. La señal de Ca2+ provocada por NAADP es de naturaleza bifásica, con una primera fase de liberación del Ca2+ desde el lisosoma y una segunda fase de amplificación resultado del CICR en el RE (Calcraft y cols., 2009; Patel y Docampo, 2010). Actualmente la naturaleza del canal TPC es objeto de gran controversia, con datos contradictorios en la literatura. En este sentido, recientemente se ha propuesto que el canal TPC sería una canal de Na+ en lugar de Ca2+ (Wang y cols., 2012). 1.2.2.4 Canal de fuga (leak). El nivel de Ca2+ en el RE en el estado estacionario se alcanza cuando se igualan el flujo de entrada de Ca2+ a través del transporte activo (llevado a cabo por la ATPasa de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, SERCA) y la salida pasiva o leak, siguiendo el gradiente electroquímico del Ca2+. En estas condiciones, la concentración de Ca2+ en el RE ([Ca2+]RE) se mantiene constante. El leak desde el RE es el más enigmático de los procesos que participan en la señal de Ca2+. Su substrato físico es aún desconocido y se pone de manifiesto por un descenso paulatino en la [Ca2+]RE cuando disminuye [Ca2+]C. Este fenómeno se puede observar también con inhibidores de las SERCAs. (Camello y cols., 2002). Como se ha mencionado ya, en la actualidad no se conoce la entidad molecular que explique la salida pasiva de Ca2+ del RE, aunque se han propuesto hasta 7 22TPC:TwoPoreChanel.
1.INTRODUCCIÓN. 30 candidatos distintos: el translocón (también descrito como SEC61) (Lang y cols., 2011), la SERCA, (Camello y cols., 2002), la Bcl-2 (Pinton y cols., 2000) la presinilina (Supnet y Bezprozvanny, 2011; Tu y cols., 2006), la proteína Bax, la panexina (D'Hondt y cols., 2011) y, finalmente, el canal TRPC (Brinkmeier, 2011). Como hemos mencionado, y aunque los datos no están claros, se ha propuesto que la bomba SERCA, mediante un mecanismo inverso, contribuiría considerablemente a la salida pasiva del RE en algunos tipos celulares (Du y cols., 1996). El resto de candidatos comparten la capacidad de formar poros con permeabilidad a cationes en la membrana del RE. En algunos casos, como la presinilina, se ha sugerido su participación en enfermedades como el Alzheimer, que se vería así como consecuencia de un defecto de la homeostasis de Ca2+ (Tu y cols., 2006). 1.3 Mecanismos que disminuyen la [Ca2+]C. Existe una gran variedad de bombas y transportadores responsables de la retirada de Ca2+ desde el citoplasma, que permiten a la célula volver al estado de reposo tras su activación. Estos sistemas tienen dos funciones importantes: en primer lugar, se encargan de mantener rellenos de Ca2+ los depósitos intracelulares y en segundo lugar, se ocupan de mantener los niveles de Ca2+ de reposo en el citosol. Son sistemas de bombeo de Ca2+, que pueden clasificarse en cinco tipos; PMCA23, SERCA24, SPCA25, MCU26 y NCX27. La PMCA y el NCX se localizan en la membrana plasmática, mientras que el resto lo hace en orgánulos intracelulares. Es importante destacar también que MCU no es estrictamente un transportador, sino un canal de membrana localizado en la mitocondria, pero que, al menos funcionalmente, debe incluirse en este grupo porque colabora con la eliminación del Ca2+ del citosol, especialmente en circunstancias en que la sobrecarga de Ca2+ es muy elevada. Un grupo aparte y especial de mecanismos que pueden colaborar en la amortiguación de cargas de Ca2+ citosólico es el de las proteínas tamponadoras de Ca2+ que presentan gran afinidad y selectividad por ese catión y que colaboran en el mantenimiento de los niveles del Ca2+ en reposo, amortiguando en el tiempo y en el espacio tanto las subidas como las bajadas de [Ca2+]C. 23PMCA:PlasmaticMembraneCalciumATPase. 24SERCA:SarcoEndoplasmicReticulumCalciumATPase. 25SPCA:SecretoryProteinCalciumATPase. 26MICU:MitocondrialCalciumUniporter. 27NCX:NatriumCalciumExchangers.
1.INTRODUCCIÓN 31 Figura I10. Canal TPC2, bomba V-H+ATPasa e intercambiador H+/Ca2+ de los lisosomas. En la parte superior se esquematiza la organización de la bombas (V-H+ATPasa), que bombea protones, con gasto de ATP, al interior de las vesículas lisosomales, los intercambiadores (H+/Ca2+), que permiten la acumulación vectorial de Ca2+, y los canales de Ca2+ (TPC2), que permiten la liberación de Ca2+ al citosol. En la parte inferior, se muestra la estructura del canal de Ca2+ TPC2. El canal puede activarse por NAADP (ácido nicotínico-adenindinucleótido-fosfato). Cada subunidad tiene doce segmentos transmembrana y dos bucles (P loop) [figura modificada de (Galione y cols., 2009)].
1.INTRODUCCIÓN. 32 1.3.1 Bombas (ATPasas) de Ca2+: PMCA, SERCA y SPCA. En mamíferos se encuentran tres grupos de bombas ATPasas: la PMCA, la SERCA y la SPCA, pertenecientes a la superfamilia de las ATPasas de tipo P. Se designan de esta manera por el mecanismo de la reacción, en el cual el fosfato terminal del ATP se transfiere transitoriamente al residuo de aspartato del sitio activo de la enzima, formando así un intermediario fosforilado en su ciclo de transporte iónico. Estas ATPasas transportan Ca2+ y otros cationes a través de las membranas biológicas en contra de su gradiente electroquímico, usando como energía la hidrólisis del ATP. Todos ellas tienen baja capacidad y alta afinidad por el Ca2+, lo que les permite seguir bombeando a bajas concentraciones de este ión, asegurando así el mantenimiento de la [Ca2+] de reposo en el citosol y la alta [Ca2+] de los depósitos intracelulares (Carafoli y Brini, 2000; Vangheluwe y cols., 2009). 1.3.1.1 ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA). La familia de las PMCAs está codificada por cuatro genes que codifican 4 isoformas (PMCA 1-4), de un peso molecular de 138 kDa. A su vez, a partir de cada isoforma se derivan numerosos tipos, por splicing, que se designan, por ejemplo: PMCA1a, PMCA1b, etc (Strehler y Zacharias, 2001). Todos los tipos de PMCA comparten una gran especificidad por Ca2+ y son capaces de transportar una molécula de Ca2+ desde el citosol hacia el medio extracelular, movimiento que está acompañado por el paso de un ión de H+ hacia el citosol. Este cotransporte genera una diferencia de cargas, de ahí el carácter electrogénico y su contribución al potencial de membrana (Hao y cols., 1994). Las isoformas de PMCA 1 y 4 se localizan en la mayoría de los tipos celulares mientras que las PMCA 2 y 3 están más restringidas a neuronas y a células musculares esqueléticas (Greeb y Shull, 1989; Huang y cols., 2010; Stahl y cols., 1992). Una de las consecuencias de la diversidad de PMCAs es que cada tipo celular puede expresar bombas con diferentes velocidades de transporte que permitan generar transitorios de Ca2+ con una cinética acorde a sus necesidades y función. Por ejemplo, el músculo esquelético expresa la PMCA3f, una de las más rápidas, mientras que en células Jurkat se expresa la PMCA4b, la más lenta.
1.INTRODUCCIÓN 33 Figura I11. Organización estructural de bomba de Ca2+ del RE tipo 1a (SERCA1a). En (A) se muestra un modelo en 2D de la SERCA1a con sus 10 dominios de transmembrana (M 1-M 10) y los principales dominios implicados con el bombeo: el dominio unión a nucleótidos N, el dominio de fosforilación P, el dominio activador A. Se puede observar también los residuos conservados TGE, implicados en la defosforilación. Los iones Ca2+ se unen entre las hélices M 4 y M 6, entre M 5 y M 6, y en M 8. Los círculos amarillos indican el número de residuos que se unen a Ca2+ de cada subdomino. En (B) se muestra la estructura tridimensional de SERCA1a. [Figura modificada de (Toyoshima y cols., 2000)].
1.INTRODUCCIÓN. 34 A pesar de la gran diversidad de isoformas de PMCA, todos los miembros poseen una estructura común similar a la SERCA (Fig. I11), con diez dominios transmembrana, y con los extremos Ny C-terminal hacia la cara citosólica. Poseen dos bucles en el lado citosolico, entre los dominios TM 2 y TM 3 y otro entre los TM 4 y TM 5. Este último es particularmente significativo, ya que contiene dos dominios importantes: el dominio de fosforilación (P), con su residuo conservado de aspartato que cambia de estado fosforilado a defosforilado durante el ciclo de la bomba; y el dominio de unión a nucleótidos (N), en donde se une el ATP (Carafoli, 1994). La actividad de la PMCA puede regularse mediante el sistema Ca2+-CaM, que puede permanecer unido a la bomba durante un tiempo, incluso después de que los niveles de Ca2+ han disminuido. Este mecanismo permite generar una especie de “memoria”, de tal forma que la bomba pueda responder más rápidamente frente a otro transitorio de Ca2+ (Benaim y cols., 1984). 1.3.1.2 ATPasa de Ca2+ del retículo (sarco) endoplásmico (SERCA). La ATPasa SERCA está codificada por tres genes que generan tres isoformas (SERCA 1-3), de aproximadamente 110 kDa, y mediante splicing pueden dar lugar a numerosas isoformas con diferentes propiedades y distribución celular. Todas son responsables del rellenado de los orgánulos que funcionan como depósitos intracelulares de Ca2+, principalmente el RE. El movimiento iónico de esta bomba, al igual que la PMCA anteriormente descrita, es de carácter electrogénico, siendo capaz de transportar dos iones de Ca2+ desde el citosol hacia el lumen de los orgánulos, en intercambio por dos iones de H+ hacia el citosol (Yu y cols., 1993). Cada isoforma de SERCA se expresa preferentemente en un tejido distinto, por ejemplo, SERCA1a se expresa específicamente en el músculo esquelético del adulto, mientras que SERCA1b lo hace en el músculo esquelético fetal. La SERCA2a se encuentra principalmente en el músculo cardiaco adulto y la SERCA2b tiene una expresión ubicua en todos los tejidos. La SERCA3, que presenta hasta 6 isoformas (SERCA3a-f), se expresa en todos los tejidos no musculares (Periasamy y Kalyanasundaram, 2007; Wu y cols., 1995). La estructura y mecanismo de acción de las ATPasas de tipo P es, a grandes rasgos, similar en todos sus tipos. En la actualidad la mejor descrita es la SERCA1a cuya estructura cristalina fue la primera descrita, hace ya más de una década (Toyoshima y cols., 2000). Hoy se han descrito al menos una veintena de
1.INTRODUCCIÓN 35 estructuras cristalinas correspondientes a los distintos estados de la reacción cíclica de transporte. En la SERCA1a (Fig. I11) se aprecian distintos dominios. En primer lugar, el dominio de membrana (M), compuesto por 10 hélices que atraviesan la membrana (M 1-M 10), posee residuos específicos con átomos de oxígeno que facilitan la coordinación del Ca2+. En segundo lugar, el dominio activador (A) situado en el lado citosólico, es el más pequeño de todos los dominios, se compone de unos 110 aminoácidos situados entre M 2 y M 3 y su función es la de controlar el movimiento del sistema. Además, posee un motivo con los aminoácidos TGE capaz de controlar la reacción de defosforilación. En tercer lugar, el dominio de fosforilación (P) situado en la cara citosólica también, contiene el residuo catalítico del aspartato (D135) junto con una serie de secuencias altamente conservadas de residuos DKTGTLT, común para todas las ATPasas de tipo P. Finalmente, el dominio de unión a nucleótidos (N), que sobresale hacia el citosol y es el más grande de todos, está conectado al dominio P por una región peptídica de bisagra, que permite el acercamiento de ambos dominios y así la transferencia del grupo fosfato desde al ATP al residuo aspartato del dominio P (MacLennan y Green, 2000; Vangheluwe y cols., 2009). Esta transferencia conlleva un cambio conformacional de los dominios M permitiendo el paso del Ca2+ desde el citoplasma hacia el lumen del retículo. El estudio de la estructura y sus variadas conformaciones condujo a la descripción detallada del mecanismo de transporte de la bomba SERCA1a (Fig. I12). Se distinguen dos estados principales: el E1, de alta afinidad; y el E2, de baja afinidad por el Ca2+. El ciclo catalítico se inicia con el paso del estado E2 al estado E1·2Ca2+ (D→A), que es producto de la entrada de Ca2+ y su unión a los dominios M1 y M2, que tienen residuos con siete átomos de oxígenos que se coordinan con el Ca2+, característico de los sitios de unión a Ca2+ de alta afinidad. El segundo paso transforma el estado E1·2Ca2+, pasando por el estado intermedio E1~P·2Ca2+, en el estado de alta energía E1·ATP~E1P (A→B), resultado del enlazamiento de los dominios P y N y la fosforilación del dominio P en el residuo D135 tras la hidrólisis de ATP, que provoca el cierre del sitio de unión al Ca2+ producto del cambio de orientación del dominio A. El tercer paso implica el cambio del estado de alta energía E1·ATP~E1P al estado intermedio de baja energía E2~P (B→C), liberando el Ca2+ que se intercambia por H+, la reorientación del dominio (A) abre la vía de salida del Ca2+ al lumen. Finalmente, el cambio de estado E2~P a E2 (C→D) que reinicia el ciclo, con la defosforilación del dominio P que comienza con la entrada de una molécula de H2O al dominio P,
1.INTRODUCCIÓN. 36 provocando una nueva rotación del dominio A reposicionando los dominios M1 y M2 (Toyoshima, 2008). Figura I12. Ciclo de reacción de SERCA. El ciclo de la bomba consiste en una serie de reacciones bioquímicas durante las cuales la bomba cambia entre dos estados conformacionales: un estado E1, en que el sitio de unión a Ca2+ se enfrenta al citoplasma, y un estado E2, donde el sitio de unión a Ca2+ ha cambiado al lado opuesto (luz del RE) y el Ca2+ se libera a la luz. Durante cada ciclo, por cada ATP hidrolizado, se bombean dos iones Ca2+ en intercambio por 3 H+. Se destaca el residuo D351 implicado en la reacción de fosforilación [figura modifica da de (Brini y Carafoli, 2009)].
1.INTRODUCCIÓN 37 Una de las señas de identidad de ATPasas tipo P es su regulación, lo que les permite adaptarse a las circunstancias cambiantes. La forma más directa de regulación son los propios niveles de Ca2+ y de ATP. La SERCA es, además, sensible a la regulación por diferentes proteínas reguladores, tales como el fosfolamban (PLN) y la sarcolipina (SLN). El PLN es una pequeña proteína transmembrana de 52 aminoácidos y que defosforilada se une a SERCA e inhibe su actividad, mientras que cuando está fosforilada por PKA o por CaMKII no se une a SERCA y ésta se activa (MacLennan y Kranias, 2003). La SLN se asemeja a PLN en la región transmembrana pero difiere en la zona citoplasmática. El PLN se expresa preferentemente en las células del músculo cardiaco y la SLN en las células musculares esqueléticas (Vangheluwe y cols., 2005). 1.3.1.3 ATPasa de Ca2+ de la vía secretora (SPCA). La ATPasa de Ca2+ de la vía secretora, denominada SPCA, también pertenece al grupo de las ATPasas de tipo P y es responsable de parte del rellenado de Ca2+ del aparato de Golgi (Go). El gen de la SPCA fue inicialmente descrito en levaduras y se denomino pmr128 por su homología con otro gen llamado pma129(Rudolph y cols., 1989). Los análisis de secuencias revelaban casi un 30% de homología entre el gen pmr1 y el de la SERCA. Posteriormente, se sugirió que pmr1 codificaba una ATPasa de Ca2+ semejante a la SERCA y a la PMCA. En humanos el gen homólogo de pmr1 es el ATP2C y existen dos tipos (ATP2C1 y ATP2C2) capaces de generar las proteínas SPCA1 y SPCA2, respectivamente. Además, el gen ATP2C1 puede generar cuatro variantes más mediante splicing con diferencias en su extremos C-terminales (SPCA1a-d) (Hu y cols., 2000a; Sudbrak y cols., 2000). La SPCA tiene un tamaño aproximado de 104 kDa. Análogamente a SERCA, contiene una región citosólica con un dominio P, uno A, uno N y uno transmembrana formado por 10 hélices (M 1-M 10) (Fig. I11). Poseen un único sitio de unión a Ca2+, también capaz de unirse a otro catión divalente como el Mn2+ (Dode y cols., 2005). La SPCA (1-2) se localiza principalmente en el Go. Por otra parte, la distribución tisular de SPCA1 es más ubicua mientras que SPCA2 se expresa principalmente en tejidos de carácter secretor (Faddy y cols., 2008; Wootton y cols., 2004). Las distintas isoformas de SPCA1 (a-d) poseen diferencias en la velocidad de recaptación y en la afinidad 28Pmr1:Plasmamembranerelated1. 29Pma1:PlasmamembraneATPase.
1.INTRODUCCIÓN. 38 por Ca2+ que responderían a una adaptación a la función de la enzima. Así, la SPCA1 se localiza en el Go de células poco secretoras, con una velocidad de recaptación más baja y una afinidad por Ca2+ muy alta (Van Baelen y cols., 2003). Al contrario, en células secretoras, en donde se forman vesículas con alto contenido de Ca2+, se expresa SPCA2, que tiene una velocidad de recaptación mayor y una afinidad menor a Ca2+ (Vanoevelen y cols., 2005a). Una particularidad de la SPCA1 es que la pérdida de una copia funcional del gen (ATP2C1) causa la enfermedad de Hailey-Hailey, un trastorno de la piel que surge a edad adulta y causa vesículas y erosiones recurrentes en las áreas de flexión articular (Missiaen y cols., 2004a). En distintos pacientes se han identificado 13 tipos de mutaciones diferentes del gen ATP2C1, que incluyen mutaciones sin sentido, inserciones, deleciones y mutaciones en la zona de splicing (Sudbrak y cols., 2000). 1.3.1.4 Propiedades cinéticas de SERCA y SPCA. Las ATPasas, SERCA y SPCA, poseen parámetros cinéticos distintos que permiten distinguirlas unas de otras. Estos parámetros cinéticos proporcionan información como la concentración de saturación de cada enzima y la velocidad máxima de reacción. En esta tesis nos enfocamos en algunas de estas propiedades cinéticas tanto de SERCA y como de SPCA. En la Tabla 2 se han recopilado los valores de afinidad relativa por el Ca2+ y la velocidad máxima de algunas de las isoformas de SERCA y SPCA a partir de los datos disponibles en la literatura (Brini y Carafoli, 2009; Dode y cols., 2005; Lytton y cols., 1992; Periasamy y Kalyanasundaram, 2007; Vangheluwe y cols., 2009).
1.INTRODUCCIÓN 45 La calreticulina es una proteína de unión a Ca2+ de baja afinidad que se encuentra dentro del lumen del RE. También se ha detectado en el núcleo, el citoplasma y en el medio extracelular, ya que puede ser secretada al medio extracelular durante los períodos de estrés celular. Su ubicación principal, sin embargo, es el lumen del RE, en el que funciona como el principal tampón de Ca2+, manteniendo la [Ca2+]RE adecuada para el plegamiento de las proteínas (Berridge y cols., 2003). La presencia de estas proteínas que ligan Ca2+ determina la capacidad amortiguadora de cada célula. Como ejemplo de células con capacidad amortiguadora de Ca2+ reducida se encuentran las células cromafines, que son capaces de generar grandes señales de Ca2+ (Zhou y Neher, 1993). En el otro extremo, las células de Purkinje expresan grandes cantidades de paralbúmina y calbindina y, como consecuencia de ello, estas células tienen una gran capacidad endógena de amortiguación de Ca2+. 1.4 Orgánulos intracelulares y su función como depósitos de Ca2+. 1.4.1 Retículo endoplásmico (RE). El RE realiza variadas funciones en la célula como la síntesis de lípidos, la síntesis y secreción de proteínas y el almacenamiento y liberación del Ca2+ (Baumann y Walz, 2001). Es el orgánulo intracelular membranoso más grande de las células eucariotas y se extiende por toda la célula como una red de membranas continua que rodea un lumen único. El RE tiene diferentes regiones con diversas formas, unas planas y otras tubulares y, a su vez, mantiene una forma global que permite que otros componentes citoplasmáticos puedan difundir a lo largo de la célula. Algunas regiones del RE pueden distinguirse fácilmente mediante microscopia de fluorescencia, como son la envoltura nuclear (NE31), las cisternas citoplasmáticas y los túbulos interconectados, y todos ellos dan forma al conjunto del RE (Fig. I14). La NE es un dominio diferenciado del RE que se compone de dos membranas, una interna y otra externa, separadas por un espacio perinuclear y comunicadas entre si mediante poros (Hetzer y cols., 2005). 31NE:Nuclearenvelope.
1.INTRODUCCIÓN. 46 Figura I14. Dominios morfológicos del RE. (A) Células Cos-7 que expresan el marcador de membrana RE-GFP Sec61β para visualizar el RE. En estas células el RE es una red membranas continua que comparten un lumen común. Esta red está formada por la envoltura nuclear, cisternas y túbulos. En (B) se observa una reconstrucción tomográfica de microscopia electrónica que revela la organización en 3D del RE, en las células de levadura. Se pueden apreciar varias estructuras, la envoltura nuclear NE, la cisterna central (CecER) (ambas en amarillo), la red tubular (TubER) (en verde) y la asociación con la membrana plasmática (PMaER) (en azul). Hay que tener en cuenta que la NE es continua con la PMaER a través de dominios que son tanto tubulares y como cisternas. En (C) se muestra un modelo que representa los dominios tubulares y de cisternas del RE y los sitios de contacto con otros orgánulos [figura cosntruida a partir de (West y cols., 2011)].
1.INTRODUCCIÓN 47 El resto del RE nace de la membrana externa como una extensa red de cisternas y túbulos que se extiende por todo el citoplasma hasta la membrana plasmática. La diferencia entre las cisternas y los túbulos es su forma, que está determinada por la curvatura de sus membranas siendo más pronunciada en los túbulos debido a la presencia de una familia de proteínas llamada reticulones y las proteínas DP1/Yop1 (Fig. I14) (West y cols., 2011). La prevalencia de túbulos frente a cisternas puede variar entre los distintos tipos celulares, lo que sugiere que la forma del RE puede venir determinada por la función celular (Shibata y cols., 2006). Por ejemplo, las células secretoras, como las del páncreas, que deben sintetizar y secretar un gran número de proteínas, están favorecidas con regiones del RE en forma de cisternas que, a su vez, están enriquecidas de ribosomas en sus membranas. Por el contrario, el RE de las células musculares, que controlan rápidos movimientos de Ca2+ durante la contracción está enriquecido de dominios en forma de túbulos, casi desprovistos de ribosomas. Actualmente no existe una evidencia clara para definir las regiones de forma funcional; sin embargo, se cree que los túbulos podrían constituir el sitio preferido para la formación de vesículas que se desplazaron hasta el Go (Hammond y Glick, 2000). El RE, a través de su extensa membrana, mantiene contacto con casi todos los orgánulos intracelulares (Fig. I14C), destacando especialmente la estrecha relación que existe con el Go y con las mitocondrias. Tradicionalmente, la relación entre el RE y el Go se ha descrito en el contexto del transporte vesicular de proteínas que se tratará con más detalle en una sección posterior. Además, cabe destacar una estructura llamada de transición del retículo (tRE), íntimamente relacionada con zonas del Go vinculadas al transporte retrogrado y anterogrado de proteínas. Por último, el RE y el Go parecen tener un estrecho contacto en regiones implicadas en el transporte de lípidos (transporte no vesicular), como el caso del fosfatidi-inositol que puede pasar directamente desde el RE al Go mediante la proteína NIR2, en zonas en donde la distancia entre RE y Go se reduce a 10 nm (Lev, 2010). La existencia de una interacción física entre el RE y la mitocondria se ha sugerido tras resultados de microscopia electrónica donde han observado distancias entre ambos orgánulos de unos 25 nm en algunas zonas (Csordas y cols., 2006; Rizzuto y cols., 1998). La mitocondria tiene la capacidad de captar en su interior entre el 25-50 % del Ca2+ liberado por el RE y gran parte de esto se debe a la estrecha distancia que existe en algunas zonas de la célula entre estos dos orgánulos (Rizzuto y cols., 1998). Recientemente, se han descritos diversas proteínas involucradas en la conexión entre el RE y la mitocondria, como son la mitofusina, DLP-1/DRP-1 y PACS-2
1.INTRODUCCIÓN. 48 (Simmen y cols., 2005; Singaravelu y cols., 2011; Varadi y cols., 2004). Los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias facilitan una adecuada regulación de la sobrecarga de Ca2+ del citosol. A su vez, la estrecha relación RE-mitocondria permite también que la señal de Ca2+ regule la producción de ATP en la mitocondria (Csordas y cols., 2006). El RE es el principal compartimento intracelular de Ca2+ de la célula y su equivalente en las células musculares es el retículo sarcoplásmico (RS). Tiene gran importancia como reservorio de Ca2+, alcanzando una concentración de casi 10-3 M (Montero y cols., 1997). La acumulación de Ca2+ en el RE es producto de la actividad de SERCA y la liberación de este Ca2+ se produce tras la activación de dos receptores del RE: el IP3R y el RyR (Bootman y cols., 2002; Cancela, 2001). La liberación del Ca2+ del RE es activada por distintos agonistas extracelulares que inducen la formación intracelular de IP3, o bien la entrada hacia el interior de la célula de una pequeña cantidad de Ca2+, con la consiguiente activación de los RyR. La modulación específica de la interacción entre cada agonista con su receptor confiere al RE la capacidad de provocar una liberación rápida y controlada de Ca2+. El Ca2+ contenido en el RE no se encuentra de forma libre, sino que está principalmente unido a proteínas ligadoras de Ca2+ que actúan como tampón uniéndose al Ca2+ con baja afinidad (Kd = 10-6 M), como por ejemplo la calreticulina; tratada en una sección anterior, la calnexina o la calsecuestrina. La liberación de Ca2+ del RE juega un papel protagónico en muchos procesos celulares en distintos tipos de células. Por ejemplo, en células marcapasos del nodo seno-auricular, el ritmo de los latidos viene determinado por oscilaciones de Ca2+ citosólico constantes procedentes del acoplamiento de los VOC y la liberación de Ca2+ desde el RE a través de los RyR (Mangoni y Nargeot, 2008). En células musculares esqueléticas, el acortamiento del sarcómero y la consecuente contracción muscular son producto de la unión del Ca2+ liberado desde el RE, tras la activación de los RyR, a la proteína troponina. La liberación de Ca2+ del RE es consecuencia de la entrada de Ca2+ a través de los VOCs, a su vez activados por la ACh liberada por las motoneuronas (Rome, 2006). En el terminal nervioso sináptico, la fusión vesicular y la consecuente exocitosis de neurotransmisores son producto de la liberación de Ca2+ desde el RE tras una despolarización (Bouchard y cols., 2003). En el soma de la neurona la activación de vías de señalización de fosfatasas y quinasas está acoplada a la señal de Ca2+ del RE (Berridge, 2002). Por último, la liberación del Ca2+ del RE en las dendritas se ha involucrado en la regulación de la respuesta post-sináptica y en la plasticidad sináptica (Park y cols., 2008).
1.INTRODUCCIÓN 49 1.4.2 El aparato de Golgi (Go). El aparato de Golgi (Go) es un orgánulo presente en todas las células eucariotas y crucial para la realización de funciones como el procesamiento, la clasificación, el tráfico y la secreción de proteínas. El Go tiene una estructura claramente definida (Fig. I15) en sacos discoidales, apilados e interconectados llamados cisternas, dispuestos en forma de cintas en la proximidad del núcleo (Ladinsky y cols., 1999). Esta disposición, además, presenta una polaridad definida, con una cara cis (cGo) y otra trans (tGo), deducidas inicialmente a partir de la identificación de actividades enzimáticas presentes exclusivamente en cada una de las caras (Novikoff y cols., 1971). Un análisis detallado de la estructura del Go muestra diferencias en las distintas zonas del Go. En el cGo se aprecian fenestras de aproximadamente 60 nm que proporcionarían vías eficaces para la difusión de elementos de unas cisternas a otras; también se reconocen canales que conectan el cGo con el tGo. La presencia de vesículas en el cGo sugiere que esta región participa en el transporte vesicular anterógrado y retrógado. Posteriormente se ha determinado que el cGo exhibe estructuras peculiares en forma de pocillos que permiten diferenciarlo del tGo (Rambourg y cols., 1996). Por otra parte, la zona media del Go carece de muchos de los elementos distintivos del tGo y cGo. La zona intermedia es menos fenestrada y el tamaño de estas es intermedio comparado con el tamaño de las fenestras del tGo y cGo. Además, cuando se analiza su estructura desde el cGo al tGo se observa un gradiente en todos los elementos cuantificados. Finalmente, el tGo aparece mucho más heterogéneo, presentando cisternas con características diferentes con fenestras de distintos tamaños y volúmenes de cisternas variados. Una característica particular del tGo es que parte de sus cisternas, las más alejadas de la zona cGo, exhiben una morfología en brotes y un recubrimiento con clatrina (Klumperman y cols., 1998; Ladinsky y cols., 1999). Una subregión del tGo reticular, con presencia de vesículas y protuberancias, es la definida como TGN32, que está conectada a través de túbulos que permiten la clasificación y el envío de proteínas a través de las distintas vías de secreción (Griffiths y cols., 1995). 32TGN:TransGolgiNetwork.
1.INTRODUCCIÓN. 50 Figura I15. Modelo de la organización estructural del aparato de Golgi (Go). Reconstrucción tomográfica de una porción del Go de las células NRK. Los colores utilizados que representan los diferentes componentes de los modelos son los mismos en todas las figuras: RE (azul-gris), ribosomas (pequeñas esferas color púrpura), el tRE (amarillo), cisternas del Golgi (verde, purpura, rosa, oliva, rosa, bronce y rojo) y vesículas libres (blanco). En (A) se muestra una sección tomográfica en la cual se delimitan con color las diferentes estructuras. Se aprecian principalmente elementos del Go (verde, rosa, oliva), en color amarillo el tRE y en azul la membrana del RE. En (B) se aprecia la modelación tomográfica en 3D de todo el plano Z de la muestra. Se pueden distinguir las cisternas del Go apiladas en contacto con elementos del tRE y el RE. En (C) un esquema de las estructuras derivadas de la representación tomográfica. La zona cis cercana al núcleo y la zona trans más alejada del núcleo (próxima a la membrana plasmática) [figura construida a partir de (Ladinsky y cols., 1999)].
1.INTRODUCCIÓN 51 En casi todos los organismos eucariotas el Go se compone de cisternas apiladas (Fig. I15), como hemos descrito, y cada cisterna contiene enzimas residentes que procesan secuencialmente proteínas y lípidos, moviéndose a través de ellas vectorialmente. El mecanismo de transporte de proteínas y lípidos en el Go es aún discutido, habiéndose propuesto hasta cinco modelos distintos. El de mayor consenso es el de maduración y progresión de cisternas. Según este modelo, las agrupaciones vesículo-tubulares proceden del RE y se fusionan formando la red de distribución del cGo, esta red madura progresivamente hasta formar primero una cisterna de cGo, después una cisterna medial y así sucesivamente. Así, en la cara cGo se están formando continuamente nuevas cisternas, que migrarían a medida que vayan madurando. Este modelo viene apoyado por observaciones de microscopia electrónica. (Glick y Luini, 2011; Nakano y Luini, 2010). La estabilidad y la diversidad funcional de muchas proteínas recién sintetizadas dependen de su correcta glicosilación llevada a cabo en el Go. La estructura subcompertimentalizada del Go permite la optimización de las condiciones para que ocurra cada reacción de gicosilación de forma ordenada. Las distintas enzimas responsables de las reacciones de glicosilacion se localizan en distintas cisternas, de tal forma que las enzima que deben actuar tempranamente se localizan en cisternas del cGo y las enzimas que ejercen su acción tardiamente se localizan en la zonas más distales, como el tGo (Puthenveedu y Linstedt, 2005). Las primeras evidencias indirectas del Go como compartimento de alto contenido de Ca2+ se remontan al año 1991, cuando se describió que una zona perinuclear de la célula era capaz de almacenar una pequeña fracción de Ca2+ (5% del total de la célula) (Chandra y cols., 1991). En la misma dirección, se publicaron varios articulos que describían la misma zona perinuclar con una significativa sensibilidad a IP3 (Hofer y cols., 1995; Zha y cols., 1995). Años más tarde se logró determinar directamente que el Go albergaba en su lumen altas concentraciones de Ca2+ (2·10-4 M) y que gran parte de este Ca2+ sería almacenado gracias a la actividad de la bomba SERCA (Pinton y cols., 1998). La acumulación activa de Ca2+ en el Go es también producto de otra ATPasa, la SPCA, que presenta propiedades diferentes a la bomba SERCA, como hemos descrito anteriormente (Van Baelen y cols., 2003). La bomba SPCA es también capaz de bombear Mn2+ al lumen del Go, que es requerido para numerosas reacciones enzimáticas que se realizan en este compartimento. La movilización del Ca2+ desde el lumen del Go hacia el citosol se produce, al igual que el RE, mediante receptores y canales de Ca2+ de tipo IP3R y RyR; sin embargo, los cursos temporales de liberación de Ca2+, de ambos depósitos, son
1.INTRODUCCIÓN. 52 diferentes (Lissandron y cols., 2010; Missiaen y cols., 2004b). Se ha sugerido también que en células que expresan altos niveles de RyR, por ejemplo musculares y neuronales, el Go podría ser un candidato potencial para la activación mediante segundos mensajeros como el NAADP y la ADP ribosa cíclica (cADPr) (Pizzo y cols., 2011). Del mismo modo que en el RE, el Go está equipado con proteínas en el lumen que se unen al Ca2+. Cabe destacar que las proteínas de unión al Ca2+ del Go no se encuentran en el RE y viceversa. La proteína de unión a Ca2+ del Go más abundante y mejor caracterizada es CALNUC. Aunque esta proteína tiene una baja afinidad por Ca2+, su efecto tamponador se justifica por su gran abundancia (Lin y cols., 1999). Del conjunto de elementos descritos se puede esperar que el Go se comporte como un depósito de Ca2+, con bombas ATPasas y receptores-canales. En la última década se ha intentado entender la importancia de este depósito de Ca2+. Se ha descrito que la liberación de Ca2+ del Go puede modular la duración y el patrón de los incrementos de la [Ca2+]C (Vanoevelen y cols., 2005b). Por otro lado, el Ca2+ acumulado en el TGN, a través de la bomba ATPasa SPCA, tendría una estrecha relación con la secreción de proteínas (von Blume y cols., 2011). La alteración de la función como depósito de Ca2+ del Go se ha relacionado también con un tipo específico de afección de la piel conocida como Haley-Haley (Behne y cols., 2003). 1.4.3 Síntesis y tráfico de proteínas RE-Go y la señal de Ca2+. Las proteínas recién sintetizadas son transportadas desde el RE al Go, mediante el transporte anterógrado para ser secretadas; otras, en cambio, son devueltas al RE, mediante el transporte retrógrado (Fig. I16) (Spang, 2009). En el transporte anterógrado las proteínas se concentran y se empaquetan en vesículas. Cada proteína posee secuencias específicas de secreción que son reconocidas por un receptor específico del RE ubicado en su membrana. Tras el reconocimiento proteína-receptor, una proteína llamada COPII interactúa con este complejo induciendo la formación de la vesícula, proceso que es coordinado por la proteína clatrina; sin embargo, solo las proteínas bien ensambladas continúan por la vía de secreción, las que no son retenidas en el RE y capturadas por la proteína chaperona BiP (Gorelick y Shugrue, 2001). Las vesículas ya formadas, producto de la acción de COPII y clatrina, comienzan a fusionarse, proceso llamado fusión homotípica. Tras la fusión de vesículas se forma un compartimento de transición,
1.INTRODUCCIÓN 53 el tRE, separado y carente de las principales proteínas del RE (AppenzellerHerzog y Hauri, 2006). Mediante la acción de quinesinas y microtúbulos, las vesículas del tRE, constantemente en formación, se desplazan hasta fusionarse con el cGo para verter su contenido. Figura I16. Esquema del transporte de proteínas desde el RE al AG. Después de la síntesis, las proteínas salen del RE (a) y esto ocurre en vesículas COPII (COP de Coating Proteins). Las vesículas se funden con la membrana del cGo y vacían su contenido en (b) Las proteínas se mueven progresivamente a lo largo del Golgi (de cis a trans; flecha) hasta alcanzar el tGo. Una vez en él las proteínas son clasificadas para la secreción o para la formación de vesículas COPI, implicadas en el transporte retrogrado [figura modificada de (Klumperman, 2000)]. En un paso siguiente, y producto del proceso de progresión y maduración de cisternas, las proteínas se concentran en el TGN en donde son seleccionadas y agrupadas en distintas vesículas (sorting), según sea el destino final de cada proteína. Se han descrito tres tipos de vesículas según el destino final de las proteínas: vesículas que continuarán la vía endosoma-lisosoma, vesículas de la vía constitutiva cargadas con proteínas que forman parte de la membrana plasmática y vesículas de secreción (Glick, 2000; Mellman y Warren, 2000). El transporte de proteínas residentes del RE al Go induce el transporte retrógrado de estas proteínas para ser devueltas al RE. Estas proteínas son reconocidas por el receptor KDEL del Go y seguidamente se activa la proteína COPI que induce la formación de vesículas que retornan al RE (ver Fig. I16) (Klumperman, 2000). En la actualidad existe exigua evidencia de que la homeostasis del Ca2+ intracelular es relevante para el tráfico de proteínas. Se ha sugerido que el gradiente de concentración de Ca2+ entre el RE, Go y el citosol es necesario para el correcto funcionamiento del transporte anterógrado y retrógrado. Ensayos con
1.INTRODUCCIÓN. 54 inhibidores de SERCA, como la tapsigargina, inducen tanto la acumulación de proteínas residentes del RE en el Go, como también la acumulación de proteínas de secreción en el Go (Di Jeso y cols., 1998; Ivessa y cols., 1995). Por otro lado, la inhibición de la expresión de SPCA por silenciamiento con siRNA33 refleja que la modificación del contenido de Ca2+ del Go también afecta a la secreción proteica (von Blume y cols., 2011). 1.4.4 Orgánulos ácidos (lisosomas y vesículas de secreción). 1.4.4.1 Lisosomas. Los lisosomas son orgánulos altamente ácidos, con un tamaño variable entre 0,1 y 1,2 µm, que realizan un complejo grupo de funciones en las células eucariotas. El lumen de los lisosomas contiene enzimas hidrolíticas que sirven para degradar o procesar tanto macromoléculas exógenas (heterofagia) como endógenas (autofagia) (Saftig y Klumperman, 2009). Recientemente se ha descrito que los lisosomas pueden ser depósitos de Ca2+ (Morgan y cols., 2011), función en la cual nos centraremos en esta sección. Los lisosomas están rodeados por una única membrana en la cuál están incluidos una serie de transportadores iónicos que permiten mantener un complejo equilibrio electroquímico (Fig. I10). Cabe destacar la bomba de protones vH+ATPAasa, descrita inicialmente en vacuolas, de ahí su nombre. Tiene un tamaño de 910 kDa, está compuesta por catorce subunidades y es capaz de transportar entre dos y cuatro protones hacia el lumen del lisosoma por cada molécula de ATP hidrolizada (Forgac, 2007). En las membranas de los lisosomas se han descrito también intercambiadores de H+ (Fig. I10), que participa conjuntamente con la v-H+ATPAasa en el transporte de protones y en el mantenimiento del pH, entre 4,5 y 6,5. Entre estos cabe mencionar los intercambiadores Na+/H+, K+/H+ y Cl-/H+. La captación de Ca2+ en el lisosoma depende de la fuerza motriz generada por el gradiente de protones en el lumen del lisosoma. Así es, como cualquier alteración en el pH, celular o del lumen lisosomal, provocará una alteración en la homeostasis del Ca2+ en el lisosoma. Un ejemplo de este fenómeno es la 33siRNA:smallinterferenceRNA
3.MATERIALESYMÉTODOS 61 AeqD119A (cgoGA) para medir en los dos compartimentos cis y el trans del aparato de Golgi, respectivamente. Todas ellas se mantuvieron en G-418 200 μg/ml. 3.2 Plásmidos. 3.2.1 Mantenimiento y propagación de plásmidos. Los vectores plasmídicos se transformaron en las siguientes cepas de E.Coli: XL2-Blue (Stratagen, Cat.Nº. 200130), XL10Gold (Stratagen, Cat.Nº. 200315) y DH5α (Invitrogen, Cat.Nº.18265-017), según el protocolo descrito en detalle en el manual de laboratorio Molecular Cloning (Sambrook, 2001). Se seleccionó una única colonia que se propagó en un medio líquido de Luria-Broth (LB) selectivo con 100 μg/ml de ampicilina, o bien 100 μg/ml canamicina, según la naturaleza del plásmido, a 37 ºC y agitación a 250 r.p.m. La purificación del plásmido transformado se realizó según las especificaciones del kit comercial, JetStarTM Plasmid Purifications Kits (Nº Cat. 220020). 3.2.2 Vectores de expresión y clonación. 3.2.2.1 Plásmidos derivados del vector pcDNA3. El plásmido de expresión pcDNA3, de 5,4 Kb, posee el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV) y está diseñado para obtener un elevado nivel de expresión en células eucariotas. Posee dos genes de resistencia a antibióticos: uno a ampicilina, para la selección de bacterias, y otro a neomicina para la selección de células eucarióticas. En este trabajo se utilizaron dos vectores derivados de este plásmido: uno que contiene la secuencia completa del gen humano de SERCA3d, el pcDNA3.1-SERCA3d, cedido por la Dra. Enouf (INSERM. Paris) (Bobe y cols., 2004); y el vector pcDNA3-C2(1-32)-EGFP, cedido por el Dr. El-Battari (INSERM, Marsella) (Zerfaoui y cols., 2002), que contiene la secuencia de direccionalidad al cGo correspondientes a 96 bp (32 aminoácidos) del gen de la β-1,6-N-acetilglucosamintransferasa y se fusionó con EGFPAeqD119A, como se describe a continuación.
3.MATERIALESYMÉTODOS. 62 Figura M1. Vectores de expresión de las proteínas de fusión bioluminiscente erGA y cgoGA. En (A) el plásmido pHSV-erGA en el cual se aprecian sus principales elementos: el gen de la proteína de fusión erGA (IgG-EGFP-AeqD199A, en rojo, verde y azul), el origen (oriS), el gen de la beta lactamasa, la secuencia “a” y el promotor (IE4/5). En (B) el plásmido pcDNA3.1-cgoGA y también se aprecian sus principales elementos: el gen de la proteína de fusión cgoGA (AGT(32)- EGFP-AeqD199A, en rojo, verde y azul), el origen (f1 ori y pUC ori), los genes de resistencia a ampicilina y neomicina y el promotor (Pcmv).
3.MATERIALESYMÉTODOS 63 El clonaje de pcDNA3.1-cgoGA (Fig. M1B) se inició con la purificación de la secuencia EGFP-AeqD119A por PCR a partir del plásmido pHSV-erGA (Fig. M1A), con la combinación de los cebadores siguientes: sentido-5’- ATaccggtCGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’, que incluye la secuencia de AgeI, y antisentido-5’-CCgaattcTTAGGGGACAGCTCCACCG-3’, que incluye la secuencia del enzima EcoRI. El inserto EGFP-AeqD119A ya purificado fue digerido con AgeI. El vector pcDNA3.1-C2(1-32)-EGFP, que contiene la secuencia de direccionalidad a cGo, fue digerido con XhoI y rellenado con Klenow. A continuación se digirió con AgeI para eliminar la EGFP. El vector purificado se ligó con el inserto para dar el vector pcDNA3.1-cgoGA. 3.2.2.2 Plásmidos derivados del vector pHSVpUC. El vector pHSVpUC es un plásmido híbrido de 4,8 Kb que contiene tanto secuencias de procariotas como secuencias del Virus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1). Entre las primeras se encuentran el origen de replicación bacteriano (ori) y el gen que le confiere resistencia a ampicilina. Como secuencias víricas se encuentran: el origen de replicación del virus herpes simplex (HSVoriS), el promotor del gen IE (Immediate Early) 4/5 del virus y la secuencia “a” del HSV-1, esencial para el empaquetamiento en partículas víricas infectivas en células permisivas. Este vector vacío se utilizó como control de transfección y para la clonación de los genes que describiremos a continuación. El vector pHSV-erGA (Fig. M1A), que contiene el gen Igγ2b-EGFP-AeqD119A (erGA), fue clonado anteriormente en nuestro laboratorio (Alonso y cols., 1998). La secuencia de retención en el RE corresponde a 2,8 Kb del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina-γ-2b (Igγ2b). El vector pHSV-tgoGA (Fig M2A), que contiene el gen GT(81)-EGFP-AeqD119A (tgoGA) dirigido al tGo, se clonó específicamente para este trabajo. La secuencia de direccionalidad al tGo corresponde a 243 pb (81 aminoácidos) del gen de la ß1,4 N-galactosiltransferasa (GT). Esta secuencia fue amplificada por PCR a partir del plásmido parental GT(81)-EYFP (Llopis y cols., 1998) con la siguiente combinación de cebadores: sentido-5’-CCCaagcttGCCACCATGAGGCTTC-3’ y antisentido-5’-TAaagcttGGCCCCTCCGGTCCG-3’, ambos incluyen la secuencia HindIII. La PCR se realizó con la enzima polimerasa Taq, que añade una adenina a cada extremo del fragmento que permite la subclonación del mismo en el vector de clonación pGEM-T-Easy, paso intermedio que facilita la obtención de
3.MATERIALESYMÉTODOS. 64 Figura M2. Vectores de expresión de las proteínas de fusión bioluminiscente tgoGA y cgoGA. En (A) el plásmido pHSV-tgoGA que contiene el gen de la proteína de fusión tgoGA (GT(81)- EGFP-AeqD199A, en rojo, verde y azul). En (B) el plásmido pHSV-cgoGA que contiene el gen de la proteína de fusión cgoGA (AGT-EGFP-AeqD199A, en rojo, verde y azul).
3.MATERIALESYMÉTODOS 65 cantidades suficientes de DNA cuando se desea clonar fragmentos pequeños. Posteriormente, el fragmento se digirió con HindIII y se ligó con el vector receptor pHSV-erGA, también previamente digerido con HindIII para eliminar la secuencia de direccionalidad a RE (Igγ2b). El plásmido resultante es el pHSV-tgoGA (Fig. 2A). El vector pHSV-cgoGA (Fig. M2B), que contiene el gen AGT(32)-EGFP-AeqD119A (cgoGA) dirigido al cGo, se generó a partir del pcDNA3-cgoGA (Fig. M1B). Se aisló la secuencia completa de AGT(32)-GFP-Aeq, mediante la digestión con EcoRI y HindIII, y se clonó en el vector pHSV-erGA, también previamente digerido con EcoRI y HindIII. El vector pHSV-tgoGAP1 (Fig. M3) contiene el gen GAP1 dirigido al tGo usando la misma secuencia de direccionalidad que el gen tgoGA. El gen GAP1 se ha desarrollado recientemente en nuestro laboratorio (datos en proceso de publicación (Rodriguez-Garcia, 2013)) y permite medir el Ca2+ siguiendo los cambios de fluorescencia, en lugar de biolumiscencia como el gen GA descrito hasta el momento. Se purificó la secuencia de direccionalidad al tGo a partir del vector pHSV-tgoGA mediante digestión con HindIII. En paralelo, se aisló el vector a partir del pHSV-erGAP1, clonado anteriormente, escindiendo la secuencia de direccionalidad al RE (Igγ) mediante digestión con HindIII y sustituyéndola, mediante ligación, por el fragmento HindIII-GT(81)-HindIIIpreviamente purificado. El vector pHSV-erTomato contiene el gen Igγ2b-Tomato-AeqD119A y es una variante de aequorina con direccionalidad al RE que en vez de tener fusionada la proteína fluorescente GFP tiene la Tomato (un tipo de proteína fluorescente roja). Este plásmido ya había sido clonado anteriormente en nuestro laboratorio (Manjarres y cols., 2008) y se utilizo en esta Tesis únicamente para los ensayos de colocalización. 3.2.2.3 Plásmido PMT2hSPCA1. El vector PMT2 es un plásmido de 4,9 Kb que contiene el promotor SV40. Además, posee resistencia a ampicilina y es comúnmente utilizado para la expresión génica en mamíferos. En este trabajo se ha utilizado el plásmido PMT2hSPCA1 que posee la secuencia completa del gen hSPCA1, cedido por el Dr. Wuytack (Universidad de Lovaina, Bélgica).
3.MATERIALESYMÉTODOS. 66 Figura M3. Vector de expresión de la proteína de fusión fluorescente tgoGAP1. En la figura se representa el plásmido pHSV-tgoGAP1 que contiene el gen de la proteína de fusión tgoGA (GT(81)-GFP-Aeq, en rojo, verde y violeta). 3.3 Transfecciones celulares. 3.3.1 Generación de las líneas de HeLa estables. En este trabajo se obtuvieron 3 líneas celulares derivadas de HeLa que expresan de forma estable los siguientes vectores: pHSV-tgoGA (Fig. M2A), pHSV-cgoGA (Fig. M2B) y pcDNA3.1-tgoGAP1 (Fig. M3). Los dos primeros se realizaron transfectando pHSV-tgoGA o pHSV-cgoGA en conjunto con el pcDNA3.1 vacío, que confiere el gen de resistencia a la neomicina. La obtención de las líneas estables se inició con la siembra de 106 células HeLa en placas de 100 mm. Al día siguiente se cambió el medio de cultivo por 1,5 ml de medio OPTI-MEM (Gibco, 51985) y se procedió a la transfección como se describe a continuación:
3.MATERIALESYMÉTODOS 67 (1) Línea estable HeLa-tgoGA: en un tubo eppendorf se mezclaron 1 µg de pHSVtgoGA, 1 µg de pcDNA3.1 y 500 µl de OPTI-MEM. En otro tubo se mezclaron 3 μl de lipofectamina 2000 (Invitrogen, 11668-019) y 500 μl de OPTI-MEM. (2) Línea estable HeLa-cgoGA: en un tubo eppendorf se mezclaron 2 µg de pHSV-cgoGA, 1 µg de pcDNA3.1 y 500 µl de OPTI-MEM. En otro tubo se mezclaron 6 μl de lipofectamina 2000 y 500 μl de OPTI-MEM. (3) Línea estable HeLa-tgoGAP1: en un tubo eppendorf se mezclaron 1 µg de pHSV-tgoGAP1 y 500 µl de OPTI-MEM. En otro tubo se mezclaron 3 μl de lipofectamina 2000 y 500 μl de OPTI-MEM. En los tres casos, y tras 5 minutos de incubación, se mezcló el contenido de los dos tubos y se añadió a las células. Al día siguiente las células se tripsinizaron, se centrifugaron a 300 r.c.f, durante 5 minutos, y se resuspendieron en 1 ml de medio DMEM sin suero. Las células se traspasaron a un tubo de citometría de flujo y se dejaron en hielo. Posteriormente, se sometieron al citómetro de flujo FACSAria configurado con la línea de láser a 488 nm para la selección de células que expresan la EGFP (tgoGA y cgoGA) y con la línea de laser a 407 nm para la selección de células que expresan la GFP (tgoGAP1). Tras pasar las muestras por el separador de células (Sorter), las fracciones EGFP o GFPUV positivas se sembraron en placas de 100 mm que contenían un medio completo suplementado con 800 mg/ml de G-418, con el objetivo de seleccionar las células que habían integrado establemente en su genoma los distintos plásmidos. Tras 10 a 15 días se seleccionaron los clones resistentes al tratamiento con G-418, mediante una punta de micropipeta cargada con una solución de tripsina. Las células así recogidas se sembraron en placas de 24 pocillos con medio completo y suplementado con 100 mg/ml de G-418. Tras observar la evolución de los clones, se seleccionaron aquellos que cumplían dos criterios: una correcta localización de la EGFP o GFPUV en el aparato de Golgi y una morfología celular no apoptótica. Estos clones se tripsinizaron y se traspasaron a una placa de 100 mm con medio completo suplementado con 100 µg de G-418. Posteriormente, y con el fin de enriquecer las poblaciones de células EGFP y GFP positivas, los clones se sometieron a un segundo ciclo de citometría de flujo y de separación de células positivas, hasta obtener poblaciones 100 % de tgoGA, de cgoGA y de tgoGAP1. Los clones se mantuvieron en una atmósfera con un 5 % CO2 y a 37ºC. Cada 2-3 días se tripsinizaron con una solución de 0,25 % de tripsina-EDTA y se resembraron 104 células en una placa de 100 mm, con 10 ml de medio fresco de cultivo suplementado con 100 µg de G-418.
3.MATERIALESYMÉTODOS. 68 3.3.2 Transfección celular para medidas de Ca2+ por bioluminiscencia. La preparación del ensayo comienza con la siembra de células sobre un cubreobjeto de 12 mm de diámetro previamente tratado con poli-L-lisina (Sigma, P-1274) (10 μg/ml) en una placa de 4 pocillos (NUNC). En experimentos piloto previos se optimizaron la densidad celular y la cantidad de DNA o de siRNA añadidos, según el tipo celular y los días in vitro antes de realizar las medidas de Ca2+, como detalla la Tabla 4. Tabla 4. Protocolos de transfección en los distintos tipos celulares. Tipo celular Nº de células Tipo plásmido Cantidad Horas en cultivo tras la transfección HeLa HeLa 5·10 4 5·104 5·104 5·104 5·104 7·104 7·104 pHSV-erGA pHSV-erTomato pHSV-tgoGA pHSV-cgoGA pcDNA3.1-tgoGAP1 Co-transfección (3:1) pHSV-erGA + pcDNA3.1-SERCA3d 0,2-0,5 µg 0,2-0,5 µg 0,05-0,1 µg 0,1-0,2 µg 0,1-0,5 µg 0,1-0,3 µg 0,3-0,9 µg 24-48 24-48 24-48 24-48 24-48 24-48 24-48 HeLa-erGA HeLa-tgoGA HeLa-cgoGA 2.5·104 siRNA: hSPCA1/Scramble 30-300 nM 48-72 HeLa-erGA HeLa-tgoGA HeLa-cgoGA 5·10 4 2·104 pMT2-hSPCA1 siRNA: hSPCA 0,2-0,4 µg 30-300 nM 24-48 48-72 HEK293-erGA 7·10 4 pcDNA3-SERCA3d 0,3-0,9 µg 24-48 La transfección consistió en la preparación de 2 tubos eppendorf, con las siguientes mezclas por cada pocillo a transfectar. En el primer tubo se añadió la cantidad indicada en la Tabla 4 de DNA o siRNA y 50 μl de OPTI-MEM. En el segundo tubo se agregaron 50 μl de OPTI-MEM y 3 µl de lipofectamine 2000 por cada µg de DNA del tubo 1 o 1µl de lipofectamine 2000 por cada pocillo transfectado con siRNA. Los tubos 1 y 2 se incubaron durante 5 minutos antes de mezclarse; a continuación, la mezcla se añadió a las células que permanecieron durante 5-6 horas en las transfecciones de DNA y 24 horas en las transfecciones de siRNA. Posteriormente, la mezcla se lavó sustituyéndose con el medio de cultivo completo previamente descrito.
3.MATERIALESYMÉTODOS 69 3.4 Medida de la [Ca2+]RE y la [Ca2+]GO en poblaciones celulares por bioluminiscencia. La mayor parte de las medidas de [Ca2+]RE, [Ca2+]tGO y [Ca2+]cGO se realizaron en las líneas celulares estables o excepcionalmente en células transfectadas de modo transitorio, en cada caso como se indicó en la Tabla 4. Antes de realizar las medidas la apoaequorina debe reconstituirse con su cofactor, celenterazina nativa o n, según el tipo de experimento (Shimomura y cols., 1974; Shimomura y cols., 1993). Las medidas de bioluminiscencia en los depósitos de alto contenido en Ca2+ requieren el vaciamiento de estos antes de la reconstitución de la aequorina, según los protocolos siguientes. 1) Para las medidas de [Ca2+]RE, las células se incubaron durante 10 minutos en un medio con EGTA 0,5 mM y con inhibidores de ATPasas, bien TBH 10 µM o Tg 0,05-1 µM (Alvarez y Montero, 2002; Chamero y cols., 2008; Villalobos y cols., 2002). 2) Para las medidas de [Ca2+]GO, las células se incubaron en un medio con EGTA 0,5 mM y con los inhibidores de ATPasas, TBH 10 µM o Tg 0,05-1 µM; además, para asegurar el completo vaciamiento de los depósitos insensibles a los inhibidores de ATPasa se añadió ionomicina 200 nM. Posteriormente, la ionomicina se lavó con una solución libre de Ca2+ y con BSA al 1 %. A continuación, se añadió celenteracina n o nativa, para reconstituir la apo-aequorina, según se indique, en el medio anteriormente descrito durante 1-2 horas, a temperatura ambiente y en oscuridad. Las medidas de bioluminiscencia se realizaron con un sistema de perfusión que permite el intercambio rápido de soluciones con un flujo constante de 5-6 ml/min. Todos los experimentos se realizaron a temperaturas entre 2225 ºC. Utilizamos dos modelos celulares, células intactas o permeabilizadas con digitonina. En el primero, las células se perfundieron inicialmente con un medio externo estándar compuesto de (en mM): NaCl, 145; KCl, 5; MgCl2, 1; EGTA, 0,5; glucosa, 10; HEPES-Na, 10; pH = 7,4. De este modo se lavó la celenterazina y los inhibidores de la ATPasas y, a continuación, se perfundió un medio con la misma composición pero reemplazando EGTA 0,5 mM por CaCl2 1 mM. Esta solución permite el rellenado de los depósitos intracelulares. En los experimentos con células permeabilizadas la perfusión se realizó con un tampón cuya composición remeda a la intracelular (medio interno estándar), que tiene la siguiente composición (en mM): KCl, 140; KH2PO4, 1; succinato disódico, 2; piruvato sódico, 2; MgCl2, 1; Mg-ATP, 1; HEPES-Na, 20; pH = 7,0. La [Ca2+] final se consiguió mezclando los tampones valorados que contienen EGTA 0,2 M y EGTA-Ca2+ 0,2 M, ambos a pH = 7,0 según los datos calculados por el programa
3.MATERIALESYMÉTODOS. 70 MaxChelator (Bers y cols., 1994) y cuyas concentraciones finales en el medio interno se indican en la Tabla 5. Tabla 5. Concentraciones relativas de EGTA y de EGTA-Ca (en mM) necesarias para obtener distintas concentraciones de calcio iónico (Ca2+ en nM). Cálculos realizados para pH = 7,0; fuerza iónica = 0.15; temperatura, 25 ºC. [Ca2+] (nM) 0 20 50 100 200 300 500 1000 [EGTA]FINAL (mM) 2 1,91 1,78 1,6 1,34 1,13 0,9 0,58 [EGTA-Ca]FINAL (mM) 0 0,09 0,22 0,4 0,66 0,87 1,1 1,42 La monitorización de la bioluminiscencia se realizó en un luminómetro construido a tal efecto por Cairn Research Ltd. Éste, consta principalmente, de un fotomultiplicador, justo debajo de la placa de 4 pocillos, de 15 mm de diámetro donde se realizan las perfusiones. Los fotones se capturan integrando las lecturas cada segundo y se transforman en cuentas por segundo utilizando el programa AquisitionEngine (Cairn Research Ltd.), que se tratan después oportunamente. Al final de cada experimento las células se lisaron durante unos 2 a 5 minutos con una solución que contenía 0,1 mM digitonina y CaCl2 en exceso (10 mM) con el fin de consumir toda la aequorina que quedaba hasta ese momento. Esto permite obtener el valor de luminiscencia total. La conversión de los valores de L / L TOTAL a valores de [Ca2+] se deriva del siguiente algoritmo (Brini y cols., 1995): [Ca2+] (M) = [(L / LTotal·λ)1/n + (L / LTotal·(KTR-1)] / [KR -(L / LTotal·λ)1/n·KR]. KR: es la constante de asociación de Ca2+. KTR: es la proporción de sitios en estado T frente a los sitios en estado R de las manos EF de la aequorina. n: es el numero de sitios de unión a Ca2+. λ: es la velocidad de consumo de la aequorina. L: Luminiscencia en el tiempo. LTOTAL: Luminiscencia total. Los valores de cada constante utilizados para cada combinación de aequorinacelenterazina (cz) utilizados en esta Tesis se muestran en la Tabla 6. Las curvas de calibración para ambas aequorinas (AeqD119A + cz. n a 22 ºC y AeqD119A + cz.
3.MATERIALESYMÉTODOS 77 Lytton, 2003). La concentración proteica se determinó según el método de Bradford. Entre 50-60 μg de proteína SERCA 3 se resuspendió en el tampón de ensayo que contenía MOPS, 21 mM; NaN3, 4,9 mM; EGTA, 0,06 mM; KCl, 100 mM; glicerolfosfato, 1mM; MgCl2, 3 mM; NADH, 0,1 nM; fosfoenolpiruvato, 1 mM, piruvato kinasa 1 U/ml y lactato deshidrogenada 1 U/ml. La hidrólisis de ATP se cuantificó siguiendo la absorbancia a 340 nm, reflejo de la oxidación de NADH durante 5 minutos a 37 ºC. El ensayo dió comienzo tras la adición de ATP (1 mM) en un lector de placas de 96 pocillos TECAN infinite M200. La actividad SERCA 3 se calculó a partir de los cambios de absorbancias dividido por el coeficiente de extinción de NADH (6,22 cm2 /μmol) · μg de proteína · min. La actividad ATPasa se determinó en presencia (Ca2+ 1mM) o ausencia de Ca2+ (EGTA 4 mM), ambos con o sin TBH (10 μM). 3.8 Análisis de la expresión génica El RNA total se aisló a partir de 5·104 células HEK293 o HeLa sembradas en placas de 6 pocillos (3 pocillos para cada tipo celular). Cada pocillo se procesó individualmente para obtener triplicados. El protocolo de extracción se hizo según las especificaciones del kit comercial de extracción fenólica TRIzol (Reagment®, InvitrogenTM). La concentración de RNA obtenida se midió en un espectrofotómetro NanoDrop® (ND-1000), utilizándose 1 µl de cada muestra y obteniéndose valores entre 100 y 500 μg/ml. Posteriormente se comprobó la integridad del RNA mediante una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1 % en TBE-MOPS. La síntesis de cDNA a partir del mRNA maduro se llevó a cabo con el kit comercial High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). La reacción enzimática contenía 1-2 μg del RNA purificado; 2,5 μl del tampón 10 X; 2,5 μl dNTPs 10 mM; 2,5 μl de Oligo dT 10 X; 1 μl de la transcriptasa reversa; y, H2O libre de nucleasas hasta completar un volumen total de 25 μl. La reacción enzimática se llevó a cabo en un termociclador (Applied Biosystems, Veriti 96-well) según el siguiente programa: 1. 20 ºC 10 minutos. 2. 42 ºC 90 minutos. 3. 99 ºC 5 minutos.
3.MATERIALESYMÉTODOS. 78 La concentración de cDNA obtenida se midió en un espectrofotómetro NanoDrop® (ND-1000) utilizándose 1 µl de cada muestra y obteniéndose valores entre 100 y 200 ng/µl. La expresión de SERCA3d en las células HEK293 y las HeLa se compararon según el método de cuantificación relativa descrito por (Livak y Schmittgen, 2001). La PCR cuantitativa (Q-PCR) se realizó en un termociclador LightCycler 480 (Roche, Alemania) mediante el kit SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Las reacciones contenían 200 ng de cDNA y 100 nM de cada cebador en un volumen final de 20 μl. Como gen de expresión constitutiva se utilizó el gen RPL18 (Miguel-Velado y cols., 2005). Las secuencias de los cebadores del gen control RPL18 fueron: sentido 5’-GGTTGTGGGG ACCATAACTG-3’ y antisentido 5’-GGACGTAGGGTTTGGTGTG-3’ y el producto amplificado tenía un tamaño de 276 pares de bases. Las secuencias de los cebadores del gen humano SERCA3d fueron: sentido 5’-GACCACACC GGGGCCAGGGACACA-3’ y antisentido 5’-GCCTGTCATTTATCCGGCG-3’ y el producto amplificado era de 226 bp. El programa de amplificación fue el siguiente: 1. 95 ºC 10 minutos, activación de la enzima y desnaturalización del DNA. 2. 95 ºC 30 segundos, desnaturalización del DNA. 3. 55 ºC o 58 ºC 30 segundos, temperatura de alineamiento (dependiendo del gen). 4. 72 ºC 30 segundos, extensión. 5. 35 ciclos desde el paso dos. 6. 72 ºC 1 minuto, extensión final. Para determinar la especificidad de la reacción de amplificación y descartar productos inespecíficos o dímeros de cebadores se realizó una curva de desnaturalización para cada gen, aumentando la temperatura cada 5 ºC desde 70 ºC hasta 95 ºC y monitorizando la fluorescencia para cada temperatura. La temperatura de desnaturalización se observa como una drástica caída de la fluorescencia debido a la disociación del fluoróforo (SYBR® Green). De este modo tanto los productos inespecíficos, como los dímeros de cebadores tendrán diferentes temperaturas de desnaturalización de las obtenidas para el producto específico y al representar la derivada de la fluorescencia frente a la temperatura se observarán distintos picos.
4.RESULTADOS 79 4 RESULTADOS. 4.1 Movilización de Ca2+ inducida por agonistas en células HeLa y HEK293. La movilización del Ca2+ contenido en los depósitos intracelulares ocasiona su aumento transitorio en el citoplasma, con la génesis de un pico de [Ca2+]C. La relajación de este pico es debida al aclaramiento del Ca2+ citosólico por las distintas ATPasas (PMCA, SERCA, SPCA) y, cuando existen, por los intercambiadores Na+/Ca2+ (NCX y NCKX). En un primer abordaje experimental comparamos el tamaño del pico de [Ca2+]C obtenido tras la estimulación con agonistas en dos modelos celulares, las células HeLa y las HEK293. Para obtener un efecto máximo, la liberación de Ca2+ se indujo por estimulación conjunta con dos agonistas: uno colinérgico (carbacol, CCh) y otro purinérgico (ATP), que estimulan la producción de IP3 en los dos tipos celulares (Short y cols., 2000; Smit y cols., 1993). En una serie de experimentos preliminares (no mostrados), comprobamos que, en efecto, CCh y ATP añadidos conjuntamente provocan una mayor liberación que cada uno de ellos por separado. Por esta razón, en los experimentos sucesivos se utilizaron los dos agonistas juntos para obtener una respuesta máxima. La figura R1 compara las respuestas obtenidas en las células HEK293 (A-D) y en las células HeLa (E-H). Los experimentos se realizaron en ausencia de Ca2+ extracelular (en presencia de EGTA; A, B, E, F) y con o sin incubación con tres inhibidores distintos de la SERCA: tert-butil-hidroquinona (TBH, C y G), tapsigargina (Tg, D y H) y ácido ciclopiazónico (CPA, no mostrado en la Fig. R1A-H). Los experimentos se realizaron tanto en las células HEK293 como en las HeLa. La eliminación del Ca2+ extracelular evita la posible contribución de la entrada de Ca2+ a través de receptores P2X de ATP en ambos tipos celulares (Welter-Stahl y cols., 2009; Worthington y cols., 1999). Con los inhibidores de la SERCA se intenta evitar que los orgánulos que tienen esta bomba recapten el Ca2+ liberado. En los paneles A y E (controles) las células se perfundieron con EGTA durante 30 segundos antes de añadir el estímulo. Este periodo previo garantiza el lavado del Ca2+ extracelular, pero es lo suficientemente breve para evitar un vaciamiento pasivo substancial de los depósitos intracelulares de Ca2+. En los paneles B y F se muestran los picos de [Ca2+]C obtenidos por estimulación con CCh + ATP tras 12 minutos de incubación en medio libre de Ca2+. En este caso, la altura del pico obtenido fue, en ambos tipos celulares, un 20 % menor que el obtenido en la situación control, con solo 30 segundos de pretratamiento en EGTA (comparar
4.RESULTADOS. 80 Figura R1. Comparación de la movilización de Ca2+ de los depósitos intracelulares en las células HEK293 y HeLa. Las mediciones de la movilización del Ca2+ de los depósitos intracelulares inducidas por estimulación máxima con carbacol (CCh, 100 µM) y ATP (100 µM) (CCh + ATP) por 1 min se realizaron en células HEK293 (A-D) y en HeLa (E-H), cargadas con la sonda fura-2 AM. Se muestra el efecto de la eliminación del Ca2+ extracelular (con la adición de 0,5 mM EGTA) como indican las barras. La retirada del Ca2+ se llevó a cabo 30 s. (A y E), o 12 min. Antes de la estimulación (B y F). En algunos experimentos, además de retirar el Ca2+ extracelular se inhibió la SERCA con TBH (10 μM) (C y G), o tapsigargina (Tg, 1 μM) (D y H). Cada trazo representa el promedio de tres experimentos similares. Los valores se expresan como cociente de las fluorescencias obtenidas con excitación a 340 nm y 380 nm. La calibración en [Ca2+] se muestra en la escala de la derecha. En (I) y (J) se muestran valores de las medias ± eem (n = 3-6) de los picos de [Ca2+]C obtenidos en las diferentes condiciones en las células HEK293 (I) y HeLa (J). La cuantificación se hizo a partir del aumento del cociente F340 / F380. Las diferentes condiciones se muestran en el eje de las abscisas: Control (el Ca2+ se retiró 30 s antes del estimulo), EGTA (el Ca2+ se retiró 12 min antes del estimulo), TBH (12 min de tratamiento con 10 µM de TBH, en medio libre de Ca2+ antes del estimulo), Tg (12 min de tratamiento con 1 µM de Tg en medio libre de Ca2+ antes del estimulo), y CPA (12 min de tratamiento con 15 µM de CPA en medio libre de Ca2+ antes del estimulo).
4.RESULTADOS 81 con paneles A y E). Esto indica que la salida pasiva de los depósitos intracelulares de Ca2+ durante la incubación en medio sin Ca2+ extracelular es relativamente lenta, tanto en las células HeLa como en las HEK293. En una tercera serie de experimentos (paneles C y G), la acumulación de Ca2+ en orgánulos que contienen SERCA se evitó por incubación con TBH, un inhibidor reversible de la SERCA (Moore y cols., 1990). La [Ca2+]C aumenta de modo lento y transitorio durante el tratamiento con TBH debido a la liberación pasiva y gradual del Ca2+ contenido en los depósitos. Tras la incubación con TBH el depósito de Ca2+ sensible a IP3 se vació casi completamente en las células HeLa, donde el aumento de la [Ca2+]C inducido por CCh + ATP fue de solo un 2 % del control (estimado de la altura del pico; Fig. R1G), mientras que en células HEK293 el pico de [Ca2+]C fue aún sustancial, un 64 % del obtenido en la situación control (Fig. R1C). El tratamiento con Tg, un inhibidor irreversible de la SERCA (Thastrup y cols., 1989), evitó completamente la respuesta inducida por CCh + ATP en ambos tipos celulares, HEK293 (Fig. R1D) y HeLa (Fig. R1H). Esto indica que los depósitos intracelulares de Ca2+ sensibles a IP3 se vacían completamente con este inhibidor. El mismo resultado que con la tapsigargina se observó con ácido ciclopiazonico (CPA), otro inhibidor de la SERCA (Seidler y cols., 1989) (datos no mostrados). El resultado del promedio de muchos experimentos similares se muestra en los paneles I y J de la figura R1. En resumen, nuestros resultados indican que en las células HEK293 existe una fracción substancial del depósito de Ca2+ sensible a IP3 que es resistente a TBH, pero sensible a Tg o CPA. Por el contrario, en las células HeLa el 100% del Ca2+ liberado por IP3 es sensible a TBH. Lo primero que nos planteamos fue si el depósito de Ca2+ resistente a TBH de las células HEK293 sería capaz de vaciarse de forma completa por agonistas, y sí una vez vacío podría rellenarse con Ca2+ en presencia de TBH. Para estudiar este segundo punto, las células HEK293 se incubaron con TBH durante 12 minutos en un medio libre de Ca2+, y posteriormente se aplicaron tres estímulos consecutivos de CCh + ATP. Los resultados obtenidos con este diseño experimental se muestran en la figura R2. El primer estímulo con los agonistas produjo un pico de [Ca2+]C que alcanzó valores de 1000 nM (ver calibración de Ca2+ a la derecha); el segundo estímulo produjo un pico mucho menor, de aproximadamente 200 nM, y el tercer pico fue casi indetectable. Esto indica que el depósito de Ca2+ resistente a TBH es liberado por IP3 y que con los tres estímulos consecutivos se logró vaciarlo completamente. La re-introducción de Ca2+ en presencia de TBH, provocó
4.RESULTADOS. 82 Figura R2. Vaciamiento y rellenado reversible de los depósitos intracelulares resistentes a TBH en las células HEK293. Las células se incubaron en medio sin Ca2+ (0,5 mM EGTA) y en presencia de TBH (10 μM) durante 12 min. Posteriormente se estimularon 3 veces durante 1 min con la mezcla de agonistas CCh + ATP con un lapso de tiempo de 2 min entre cada estimulo para vaciar los depósitos de Ca2+. A continuación se incubaron con Ca2+ 1 mM en presencia de TBH durante 9 min para permitir su rellenado y, finalmente, se llevó a cabo el mismo protocolo de activación con tres pulsos de CCh + ATP dado al principio. Representación característica de 3 experimentos similares. un gran aumento transitorio de [Ca2+]C, que declinaba lentamente, sin llegar a los niveles basales al cabo de los 8 minutos que se prolongó la incubación con Ca2+ + TBH. La primera parte refleja la rápida entrada del Ca2+ a través de mecanismos capacitativos, activados por el vaciamiento de los depósitos (SOCE por Store Operated Ca2+ Entry) (Parekh y Penner, 1997). La segunda parte corresponde a la desactivación de la entrada capacitativa como consecuencia del rellenado de los depósitos intracelulares, con la consecuente disminución de la [Ca2+]C debido al aclaramiento de Ca2+ llevado a cabo por las ATPasas de Ca2+, la SERCA bombeándolo hacia el interior de los depósitos y la PMCA hacia el medio extracelular. Por este motivo, durante estos 8 minutos los depósitos intracelulares deberían rellenarse con Ca2+. Así sucede en efecto, como se muestra en la última parte del experimento: cuando se eliminó el Ca2+ extracelular y se repitió el protocolo de estimulación en medio sin Ca2+ (EGTA + TBH) aplicando tres estímulos de CCh + ATP volvió a aumentar [Ca2+]C. El primer estímulo produjo un pico de [Ca2+]C de altura comparable a la del pico control (un 80 % de su amplitud), lo que indica que el depósito se había rellenado substancialmente. El segundo estímulo provocó un pequeño efecto residual, indicando que la mayoría del Ca2+ ya había sido movilizado por el primer estimulo; y el tercer estímulo no produjo efecto alguno. Así pues, estos experimentos demuestran que el
4.RESULTADOS 83 compartimento de los depósitos intracelulares de Ca2+ que es resistente a TBH puede liberarse completamente por estimulación vía IP3 y que, una vez vacío, el depósito se rellena de nuevo en unos minutos en presencia de TBH cuando se repone Ca2+ en el medio extracelular. 4.2 El subcompartimento resistente a TBH no es un compartimento ácido y ni alcalino. En diferentes tipos celulares se ha descrito la existencia de gránulos ácidos (Churchill y cols., 2002; Lopez y cols., 2005) o alcalinos (Fonteriz y cols., 1991) capaces de acumular Ca2+. Parece que el gradiente de pH es necesario para la acumulación de Ca2+, pues su colapso inhibe la acumulación (Fonteriz y cols., 1991; Lopez y cols., 2005). Entre los agentes empleados destacan la bafilomicina, que bloquea a la H+-ATPasa e impide la acidificación de los gránulos (Moriyama y Nelson, 1989); la nigericina, que disipa el gradiente de protones intercambiando H+ por K+; la trimetilamina (TMA), un álcali que se acumula en los gránulos ácidos y colapsa el gradiente de H+; y el propionato, un ácido débil que se acumula en gránulos alcalinos y colapsa su gradiente de H+. Por otra parte, la disrupción osmótica de los lisosomas con el tripéptido glicil-L-fenilalanina 2-naftilamida (GPN) elimina también el depósito de Ca2+ en los lisosomas (Berg y cols., 1994). En el caso de los gránulos alcalinos de los neutrófilos humanos, el tratamiento con propionato, que transporta H+ al interior de los gránulos colapsando el gradiente de pH, evita la acumulación de Ca2+ (Fonteriz y cols., 1991). Utilizando estos agentes se diseñaron una serie de experimentos para evaluar la contribución de los compartimentos intracelulares ácidos y alcalinos a la acumulación del Ca2+ del depósito resistente a TBH en las células HEK293. Los resultados se muestran en la figura R3. Las células HEK293 se incubaron con TBH en medio libre de Ca2+ (1 o 2 minutos) y a continuación se añadieron los distintos inhibidores para estudiar su efecto sobre el pico de [Ca2+]C inducido por CCh + ATP. El efecto de estos agentes, capaces de modificar el pH intracelular debe considerarse con especial cuidado, ya que los cambios de pH pueden modificar también la afinidad de las sondas por el Ca2+ y, por tanto falsear las medidas. En primer lugar, se probó el efecto de la base débil trimetilamina (TMA, Fig. R3B) que se acumula dentro de los compartimentos ácidos y colapsa el gradiente de pH. En el panel siguiente se muestra el efecto del ácido débil
4.RESULTADOS. 84 Figura R3. Efecto de distintos tratamientos que disipan los gradientes de pH sobre la movilización del Ca2+ intracelular resistente a TBH en células HEK293. Las células HEK293, se cargaron con fura-2 AM para monitorizar los cambios en la [Ca2+]C. Cada trazo de la figura representa el promedio de 3-6 experimentos similares. Se realizaron distintos tratamientos de 7 min de duración: (A) con la base débil trimetilamina (TMA, 6 mM); (B) con el acido débil propionato (PROP, 6 mM); (C) con el ionóforo intercambiador de H+/K+ nigericina (NIG, 10 μM) (D), con el péptido disruptor de los lisosomas GPN (10 μM), y se observó el efecto sobre el incremento de [Ca2+]C inducido por CCh + ATP. Los valores mostrados en (G) son medias ± eem de 3 determinaciones. propionato (PROP., Fig. R3C), que se acumula en los compartimentos alcalinos. En tercer lugar se muestra el efecto de la nigericina, que colapsa el gradiente de pH, tanto de compartimentos ácidos como alcalinos, intercambiando H+ por K+ (NIG., Fig. R3D). En conjunto, todas estas maniobras (Figs. R3A-R3D) tuvieron un efecto pequeño sobre el pico de [Ca2+]C, que además fue muy similar en los tres casos, indicando que no es un efecto atribuible al colapso del pH de compartimentos ácidos o alcalinos. Finalmente, el GPN más que inhibir el aumento de [Ca2+]C inducido por CCh y ATP, pareció estimularlo, ya que el pico fue mayor que el control (Fig. R3E). Este sorprendente resultado indica, en todo caso, que la liberación de Ca2+ desde los lisosomas no contribuye al pico de Ca2+ resistente a TBH. La figura R3G muestra los promedios (± eem) de los resultados obtenidos en tres experimentos similares, que indican que ni los gránulos ácidos
4.RESULTADOS 85 ni los alcalinos contribuyen de forma significativa al pool de Ca2+ acumulado en el compartimento resistente a TBH de las células HEK293. 4.3 El RE presenta un subcompartimento resistente a TBH en células HEK293, pero no en HeLa. Está ampliamente aceptado que el RE es el principal reservorio intracelular de Ca2+, y existen evidencias de que este compartimento puede presentar cierta heterogeneidad, al menos en algunos tipos celulares. En nuestro laboratorio contamos con distintas construcciones de aequorinas dirigidas al RE para poder medir directa y selectivamente la [Ca2+]RE, (Alonso y cols., 1999; Montero y cols., 1995). Por este motivo, nuestro siguiente objetivo consistió en explorar directamente la acumulación de Ca2+ en el RE y la sensibilidad a TBH en los dos tipos celulares estudiados, las células HEK293 y las HeLa. Los resultados de esa serie de experimentos se muestran en la figura R4. En los experimentos del panel A se utilizó la línea celular HEK293 que expresa constitutivamente el gen de la GFP-AeqD119A dirigida al RE (erGA). En el panel B, las células HeLa fueron transfectadas el día anterior con un vector erGA (ver «Materiales y Métodos»). En ambos tipos celulares el RE se vació de Ca2+ por incubación previa en un medio sin Ca2+ y con TBH como se ha descrito en «Materiales y Métodos». En los experimentos mostrados en la figuras R4A y R4B tras 1 minuto de incubación en medio sin Ca2+, se inició el experimento por perfusión con Ca2+ 1 mM, durante 5 minutos para permitir el rellenado con Ca2+ del RE. Se comparó la situación control (trazo negro continuo); con lo que sucedía cuando, además del Ca2+, el medio de perfusión contenía TBH (+TBH, trazo punteado en rojo). Tras 5 minutos de rellenado las células se estimularon con CCh + ATP durante 1 minuto. En la situación control el rellenado del RE alcanzó niveles de unos 500 µM en ambos tipos celulares. La estimulación con CCh + ATP causó un vaciamiento del RE en un 50 % en las células HEK293 (A), mientras que el vaciamiento fue prácticamente completo en las células HeLa (B). En presencia del inhibidor TBH casi no hubo rellenado en las células HeLa, mientras que en las células HEK293, se alcanzó una [Ca2+]RE que era de aproximadamente 100 µM, un 20 % del valor del control de 500 µM. La estimulación con CCh + ATP vació casi por completo este compartimento del RE, resistente a TBH. La figura R4C muestra los promedios de los valores de la [Ca2+]RE obtenidos en varios experimentos similares.
4.RESULTADOS. 86 Figura R4. Comparación del rellenado de Ca2+ y del vaciamiento inducido por los agonistas en el RE en células HEK293 y HeLa. Las células HEK293 (A) y HeLa (B), que expresan la aequorina dirigida al RE (erGA), reconstituidas con celenterazina n 1 µM (ver «Materiales y Métodos»), se lavaron con un medio libre de Ca2+ el tiempo que se indica. Posteriormente, se perfundieron con un medio que contiene Ca2+ 1 mM (Control, línea continua) o Ca2+ 1 mM + TBH 10 µM (+TBH, línea de puntos). En el momento que se indica en la figura las células se estimularon con CCh + ATP (100 µM de cada uno). Los valores se representan como L / LTOTAL (izquierda) y calibrados como [Ca2+] en µM (derecha). Cada trazo es representativo de 3 experimentos similares. En el diagrama de barras de (C) se muestran los valores de media ± eem (n = 3) de los niveles de Ca2+ alcanzados en el estado estacionario (en L / LTOTAL en las diferentes condiciones de rellenado (Ca2+ y Ca2+ + TBH), en ambos tipos celulares. Los recuadros rayados corresponden a la fracción del depósito liberado por estimulación con CCh + ATP.
4.RESULTADOS 93 Figura R8. La expresión de SERCA3d en las células HeLa genera un compartimento resistente a TBH en el RE. El vector de expresión de SERCA3d se cotransfectó junto con el vector de expresión de erGA por adición a una proporción de 3:1 (véase «Materiales y Métodos»); los controles fueron transfectados con el vector vacío (pcDNA3) junto con erGA. En (A) y (B) se muestran los experimentos en los que las células se cargaron con fura-2 y se midió [Ca2+]C. Los detalles son los descritos en la leyenda de la figura R1. En (C) y (D) se muestran las medidas de RE con la aequorina dirigida a este orgánulo (erGA). Los detalles son los descritos en la leyenda de la figura R4. Los resultados son representativos de tres o cuatro experimentos similares. En (E) se muestran los promedios (± eem) del tamaño del pico de Ca2+ y; en (F) la [Ca2+]RE alcanzada en el estado estacionario medido como L / LTOTAL. Las diferencias entre las células de control y las células que expresan SERCA3d (S3d) fueron estadísticamente significativas (ANOVA; P < 0,02 en (E) y P < 0,0004 en (F)).
4.RESULTADOS. 94 Aunque está claro que el RE es el principal responsable de la acumulación de Ca2+ resistente a TBH (nuestra sonda, erGA, se expresa selectivamente en el RE y el RE es el depósito de mayor tamaño), otros depósitos intracelulares de Ca2+ podrían colaborar en la génesis de la señal inducida por movilización del Ca2+ almacenado. Se ha propuesto que el aparato de Golgi (Go) es también un compartimento con alto contenido de Ca2+, capaz de liberarlo en respuesta a diferentes agonistas acoplados a la cascada de IP3 (Missiaen y cols., 2004b; Pinton y cols., 1998). Por estos motivos, pensamos que sería interesante complementar nuestro estudio en el RE con un estudio en el Go. En un experimento preliminar, expresando la sonda GAP dirigida al trans-Golgi en las células HEK293 encontramos una expresión relativamente pobre y no pudimos evidenciar un componente de la captación de Ca2+ resistente a TBH (datos no mostrados), que sí encontramos en las células HeLa (véase más adelante). Por otro lado, la estructura microscópica y el marcaje del Go eran mucho mejores en estas células que en las células HEK293. Por estos motivos decidimos llevar a cabo el estudio sistemático de la captación de Ca2+ en el Go en las células HeLa. Este estudio se describe en los apartados siguientes. 4.5 Depósitos de Ca2+ del Aparato de Golgi Como ya hemos mencionado, se ha propuesto que el aparato de Golgi (Go) es un compartimento de alto contenido de Ca2+, y capaz de liberarlo en respuesta a diferentes agonistas acoplados a la cascada de IP3 (Missiaen y cols., 2004b; Pinton y cols., 1998). Por este motivo quisimos estudiar también el comportamiento del Go, del que además se conocen muchos menos detalles con respecto a la homeostasis de Ca2+. Una complejidad añadida es que, como se ha comentado en la «Introducción», Go no es homogéneo, sino que se distinguen varios subcompartimentos (cis, medial y trans) que se especializan en diferentes funciones, por lo que la homeostasis del Ca2+ podría ser diferente. Con este fin, generamos dos nuevas sondas de Ca2+ basadas en la proteína de fusión bioluminiscente EGFPaequorina (GA), que nos permitieran medir la [Ca2+] en el lumen, tanto de la sección cis del aparato de Golgi (cGo), como en la sección trans del mismo, (tGo).
4.RESULTADOS 95 Figura R9. Co-localización de las sondas tGoGA y cGoGA con marcadores de cGo y tGo células HeLa. Se utilizaron líneas clonales de células HeLa, que expresan de forma estable los sensores tGoGA y cGoGA. (A y C) tGoGA y (B y D) cGoGA. En la parte izquierda se muestra la superposición de la imagen tomada con óptica de contraste interdiferencial (DIC) en grises, y la fluorescencia verde de la proteína GA en una sección ecuatorial En la parte derecha se muestra una reconstrucción tridimensional de la fluorescencia de 30-40 secciones en el plano Z. En (C) se muestra, de izquierda a derecha la señal fluorescente de la sonda tGoGA (verde), la señal del anticuerpo antiTGN46 (anticuerpo secundario, Alexa Fluor 568; en rojo) y la superposición de ambos canales; la coloración amarilla indica la colocalización de las señales verde y roja. En (D) se muestra, de izquierda a derecha la señal de la sonda cGoGA (verde), la señal del anticuerpo anti-GM130 (anticuerpo secundario, Alexa Fluor 568) y la superposición de ambos canales. La marca de calibración corresponde a 10 µm.
4.RESULTADOS. 96 Decidimos utilizar la variante GA, portadora de la fusión EGFP-AeqD119A, que tiene la ventaja sobre la aequorina no fusionada de poder monitorizar la distribución de la sonda con la señal fluorescente de la EGFP. Además, la variante que utilizamos contiene la aequorina con la mutación D119A (Montero y cols., 1995), que tiene baja afinidad por Ca2+, y que habíamos desarrollado previamente para medidas en el RE (Alonso y cols., 1998). La elección de esta variante de GA es debida a que esperábamos que la [Ca2+]GO estuviese en el rango µM alto (Pinton y cols., 1998). Para poder expresar de forma específica las sondas GA en cada región del Golgi utilizamos las secuencias de direccionalidad de dos enzimas localizadas selectivamente en una u otra región, la β-1,6-acetilglucosamiltransferasa, para el cGo; y la β-1,4 N-galactosiltransferasa, para el tGo. En las figuras R9A y R9B se muestran algunas imágenes de microscopia confocal representativas de la localización de las sondas. A la izquierda, se ha superpuesto la imagen de la fluorescencia verde de la GA sobre la de transmisión, tomada con óptica de contraste interdiferencial (DIC, también llamado Nomarski), para que pueda apreciarse mejor la localización. En ambos casos, A y B, se observa la morfología característica del aparato de Golgi, con un patrón punteado perinuclear y, en general, asimétrico, con un lado predominante sobre el otro. En la reconstrucción en 3D (lado derecho de la Fig. R9), tanto de la sonda tGoGA (Fig. R9A) como del cGoGA (Fig. R9B), se aprecia la estructura típica del Go, con cisternas apiladas y distribuidas unas a continuación de otras. Aunque el patrón de localización de ambas sondas era característico del Go, no apreciábamos, a primera vista, diferencias entre la distribución de las dos sondas cisy trans-Golgi, y consideramos pertinente hacer un análisis más detallado usando marcadores específicos para el cisy el trans-Golgi y estudiando su colocalización o exclusión con nuestras sondas. Como se puede observar en la figura R9C, la sonda tGoGA (en verde) colocaliza con el marcador especifico de este compartimento, la proteína de 46 kDa Trans Golgi network 46 (TGN46, en rojo), apareciendo la imagen de superposición en amarillo. De forma paralela, la sonda tGoGA colocaliza con el marcador específico de cGo, la proteína de 130 kDa Golgi Matrix 130 (GM130). De nuevo, en la imagen superpuesta aparecen en amarillo las estructuras del Go (Fig.R9D). La localización de las sondas cGoGA y tGoGA se comparó también con la de otras estructuras utilizándose marcadores específicos para el RE (ERTomato) (Figs.R10A y 10B) o los lisosomas (Lamp2) (Figs. R10C y 10D).
4.RESULTADOS 97 Figura R10. Exclusión de las sondas tGoGA y cGoGA con los marcadores de RE (ERTomato) y lisosomas (Lamp2). La correspondencia de las señales verde y roja de cada fila se muestra a la izquierda. Otros detalles como en la figura 9. Obsérvese la independencia de ambas señales en todos los casos.
4.RESULTADOS. 98 Figura R11. Cuantificación y análisis estadístico de la colocalización y la exclusión de las sondas tGoGA y cGoGA con los marcadores de distintos compartimentos intracelulares. La exclusión y la colocalización de cGoGA y tGoGA con los marcadores ERTomato, Lamp2, GM130 y TGN46, se expresa como medias ± eem (n = 25), del índice de correlación de (r) de Pearson. La colocalización de cGoGA y tGoGA con sus correspondientes marcadores es muy significativa, así como la exclusión de los marcadores del RE y lisosomales (en todos los casos p < 0.0001). Como se observa en la imagen superpuesta, se distinguen los dos colores primarios, verde y rojo, lo que indica que no hubo solapamiento de ninguna de las dos sondas con ninguno de estos marcadores. La figura R11 muestra la cuantificación y el análisis estadístico de las colocalizaciones. Como puede apreciarse, la colocalización de cGoGA y tGoGA con sus correspondientes marcadores, cuantificada como valores del índice de correlación (r) de Pearson, es positiva y muy significativa (P < 0,0001); la exclusión de los marcadores del RE y lisosomales (coeficientes de Pearson negativos) es también significativa (P < 0,0001). La Tabla 9 muestra un resumen de los datos numéricos de colocalización de varios marcadores, con determinaciones de la r de Pearson en reconstrucciones biy tri-dimensionales. Los valores obtenidos confirman la correcta localización de las sondas con direccionalidad a cGo y tGo. Se incluye un control negativo mostrando la correlación negativa de los marcadores de cis y trans Golgi (GM130 vs TGN46).
4.RESULTADOS 99 Tabla 9. Co-localización y exclusión de cis y trans GA con marcadores de otros orgánulos. Se muestran los valores de r Pearson (media ± dem) en secciones 2D confocales y o reconstrucciones de volumen 3D. Se muestran los valores de P (t de Student de dos colas) para la comparación de la media de cada combinación de marcadores con respecto a 0 (sin correlación) asumiendo una distribución normal. Marcadores Dimensión n r de Pearson P (t-test) Reticulo endoplásmico cGoGA vs ERTomato 2D 25 -0,49±0,21 < 0,0001 cGoGA vs ERTomato 3D 5 -0,39±0,05 < 0,0003 tGoGA vs ERTomato 2D 25 -0,50±0,13 < 0,0001 cGoGA vs ERTomato 3D 5 -0,35±0,05 < 0,001 Lisosomas cGoGA vs Lamp2 2D 25 -0,65±0,02 < 0,0001 cGoGA vs Lamp2 3D 5 -0,57±0,02 < 0,001 tGoGA vs Lamp2 2D 25 -0,47±0,02 < 0,0001 tGoGA vs Lamp2 3D 5 -0,51±0,02 < 0,0001 Aparato de Golgi GM130 vs TGN46 3D 5 -0,43±0,05 < 0,0005 tGoGA vs GM130 3D 5 -0,18±0,02 < 0,005 tGoGA vs TGN46 3D 5 +0,27±0,02 < 0,0001 tGoGA vs TGN46 2D 25 +0,48±0,02 < 0,0001 cGoGA vs GM130 3D 5 +0,28±0,03 < 0,0001 cGoGA vs GM130 2D 25 +0,41±0,03 < 0,0001 cGoGA vs TGN46 3D 5 -0,17±0,04 < 0,02 4.6 Las sondas cGoGA y tGoGA son funcionales. Una vez demostrada la correcta localización de las sondas de Ca2+ dirigidas al Go, analizamos su funcionalidad. Para ello se utilizaron las líneas de HeLa que expresan de forma estable erGA, cGoGA y tGoGA, desarrolladas en este trabajo (ver «Materiales y Métodos»). Los tres tipos celulares se reconstituyeron con celenterazina n en medio sin Ca2+ según se detalla en la sección de «Materiales y Métodos». Como se muestra en la figura R12, la posterior adición de Ca2+ extracelular (1 mM) produjo un incremento progresivo de la [Ca2+]RE durante unos 2 minutos hasta alcanzar un nivel estable en los tres depósitos. En la figura R12A puede compararse la captación de Ca2+ del RE, cGo y tGo. La concentración de [Ca2+] alcanzada en el estado estacionario en el interior del RE es mayor que la del Go. Los promedios (± eem de 3 experimentos similares) fueron: 686 ± 15 µM en el RE comparado con 219 ± 9 µM en el cGo y 289 ± 18 µM, en el tGo. Las velocidades iniciales también fueron consistentemente mayores en el RE (553 ±
4.RESULTADOS. 100 107 µM/min) que en los compartimentos del aparato de Golgi (220 ± 15 en cGo y 193 ± 43 µM/min en tGo) A continuación, exploramos la sensibilidad al inhibidor irreversible de la SERCA, tapsigargina (Tg), que se usó a 20 nM, una concentración más que suficiente para inhibir completamente la SERCA (Thastrup y cols., 1989; Vangheluwe y cols., 2009). Sorprendentemente, la sensibilidad a Tg 20 nM fue muy diferente en los distintos depósitos (Fig. R12A). La captación fue prácticamente abolida en el RE y en el cGo; alcanzándose valores tan bajos como (media ± eem; n = 3) 4,0 ± 0,3 µM y 15 ± 1 µM; respectivamente. Por el contrario, en el tGo la captación de Ca2+ fue solo parcialmente inhibida, alcanzándose valores de [Ca2+] bastante más altos, de 119 ± 25 µM. A continuación, estudiamos la liberación de Ca2+ inducida por dos agonistas: i) el ATP, que mediante la producción de IP3 activa los IP3Rs; y ii) la cafeína, que activa los RyRs (Fig. R12B). Los tres compartimentos respondieron liberando el Ca2+ que contienen al estimular las células, tanto con ATP como con cafeína, aunque la sensibilidad al primer estímulo fue mayor que al segundo. Los datos de % de liberación obtenidos fueron los siguientes: ATP, del 77 al 83 % (media ± eem; n = 3) de: 78, ± 14 % en el RE; 78 ± 21 % en el cGo y; 83 ± 6 %. En el caso de la cafeína los porcentajes de liberación fueron menores, del 48 al 51%: 51 ± 11 % en el RE; 49 ± 8 % en el cGo y; 49±13 % en tGo. En el panel C se resumen y comparan las liberaciones por los distintos estímulos. Las acciones fueron muy similares en los tres depósitos. En las células tratadas con digitonina, se permeabiliza la membrana plasmática, pero la sonda GA se mantiene dentro de los orgánulos intracelulares. Esta preparación ofrece unas condiciones excelentes para estudiar el efecto de los mensajeros intracelulares, ya que sus receptores son ahora accesibles desde el medio de incubación. En los experimentos que se resumen en la figura R13 se estudió directamente el efecto de tres conocidos mensajeros intracelulares, que liberan Ca2+ de los depósitos intracelulares, el IP3, la ADP ribosa cíclica (cADPR) y el ácido nicotínico-adenin dinucleótido fosfato (NAADP) (Cancela y cols., 2000). En los experimentos de la figura R13 se compararon sus efectos sobre los tres depósitos intracelulares estudiados aquí, RE, cGo y tGo. Este abordaje experimental tiene tres ventajas sobre los experimentos en células intactas: i) permite estudiar de forma directa la cinética de captación en los depósitos fijando la concentración de Ca2+ del medio (equivalente en estas condiciones a la concentración citosólica de Ca2+) a una similar a la que se encuentra en el medio intracelular durante el reposo ([Ca2+]C = 100 nM);
4.RESULTADOS 101 Figura R12. Comparación de la captación de Ca2+ de los depósitos intracelulares del RE, cGo y tGo en las células HeLa. Las mediciones de la captación de Ca2+ se realizaron en los clones estables de HeLa, que expresan las sondas GFP-aequorinas (GA) dirigidas al RE, al cGo y al tGo. Las células se reconstituyeron con celenterazina n (1 µm) en medio sin Ca2+ y en presencia de TBH (10 µM). En el momento indicado por la flecha se inició la perfusión con medio extracelular que contenía Ca2+ (1 mM). Los valores se representan como L / LTOTAL (izquierda) y calibrados como [Ca2+] en µM (derecha). Cada trazo representativo de 3-6 experimentos similares. En el caso (A) se compara la captación en células controles y pretratadas con tapsigargina (Tg) 20 nM por 10-20 min antes de la adición del Ca2+ 1 mM. En (B) el efecto de los agonistas ATP y cafeína. El panel (C) se reproduce en la página siguiente.
4.RESULTADOS. 102 Figura R12C. Comparación de la captación de Ca2+ de los depósitos intracelulares del RE, cGo y tGo en las células HeLa. Los paneles A y B se han explicado en la página anterior. Panel (C): Liberación inducida por ATP y cafeína. Valores promedio (± eem) de 3-6 experimentos similares. ii) permite estudiar la capacidad de liberación de los diferentes mensajeros intracelulares, simplemente añadiéndolos a este medio y; iii) excluye las barreras y otras distorsiones que podría crear la membrana plasmática. Se utilizaron las líneas celulares que expresaban erGA (A), cGoGA (B) o tGoGA (C), respectivamente, lo que permitía medir selectivamente [Ca2+] en estos tres compartimentos, siendo las condiciones exactamente las mismas en los tres casos. Tras 5 minutos de incubación para permitir la acumulación del Ca2+ en el depósito intracelular, se aplicaron los diferentes estímulos durante 30 s, como se muestra en la figura R13. Durante la incubación con el tampón de Ca2+ 100 nM se alcanzó un máximo de [Ca2+]RE, que corresponde al estado estacionario (concentración intracelular constante con iguales flujos de entrada y salida), en los tres casos. Los niveles obtenidos fueron diferentes, alcanzándose mayor
4.RESULTADOS 109 Figura R16. Comparación del consumo de aequorina de alta afinidad en el cGo y el tGo en células HeLa al rellenar los depósitos de Ca2+. Las células cGo y tGo se reconstituyeron con celenterazina nativa (que aumenta la afinidad por el Ca2+ y la velocidad de consumo con respecto a la celenterazina n) durante 60 min y se permeabilizaron con digitonina 60 µM en un medio interno. Posteriormente, y previo tratamiento con Tg 20 nM, en (A), cGo y tGo, se incubaron con una solución tamponada a una concentración de Ca2+ 100 nM, previo tratamiento con Tg 20 nM y cuando se indica (flecha) se aumentó la [Ca2+] a 500 nM. (B) El consumo de aequorina del cGo durante periodos prolongados. El cGo se perfundió, desde el inicio con una solución tamponada a una concentración de Ca2+ 500 nM. Los resultados se expresan como un porcentaje de la aequorina total restante en las células en un momento dado. Nótese escala logarítmica. Trazado representativo de 3 experimentos.
4.RESULTADOS. 110 Las velocidades iniciales de captación fueron también muy diferentes en los distintos compartimentos (en µM·min-1; media ± eem; n = 4): 0,3 ± 0,1 para el RE, 3,3 ± 0,2 para el cGo y 19 ± 2 para el tGo (Fig. R17B). En experimentos realizados utilizando la celenterazina nativa en lugar de la n (no mostrados), los valores de [Ca2+] en el equilibrio fueron los siguientes (en µM; media ± eem; n = 3): 2,8 ± 0,7 en el RE, 4,4 ± 0.3 en cGo y 78 ± 5 en tGo. La velocidad inicial de recaptación fue también muy diferente (en µM·min-1; media ± eem; n = 3): 1,2 ± 0,4 en el RE; 2,8 ± 0,8 en el cGo y 63 ± 5 en el tGo (resultados no mostrados). Los resultados obtenidos con el tratamiento con TBH 10 µM fueron muy similares a los obtenidos con Tg 20 nM y se muestran en las figuras R17C y R17D. La [Ca2+]GO en el equilibrio en el tGo fue 187 ± 7 µM ( media ± eem; n = 3), mucho mayor que en el cGo, 2,9 ± 0,1 µM y que en el RE, 1,9 ± 0.1 µM (Fig. R17C). La velocidad inicial de recaptación de Ca2+ en el tGo fue de 103 ± 1 µM·min-1 también mucho mayor que en cGo 0,6 ± 0.1 µM·min-1 y que en el RE 0,14 ± 0,08±1 µM·min-1 (Fig. R17D). Todos los experimentos descritos hasta ahora se centran en el componente del transporte de Ca2+ resistente a Tg 20 nM. Desafortunadamente, no hemos encontrado ningún inhibidor específico del componente resistente a Tg, por lo que no hemos podido aislar y estudiar independientemente la contribución del otro componente, el dependiente de SERCA (el sensible a Tg). Sin embargo, aprovechando las ventajas del consumo de la aequorina en medio con Ca2+ y de la reversibilidad del inhibidor de la SERCA, TBH; diseñamos un protocolo para medir selectivamente el transporte de Ca2+ en el espacio del tGo dependiente de SERCA. Para este propósito la células se permeabilizaron y se incubaron durante 10 min en un medio intracelular con 100 nM de Ca2+ y 10 µM de TBH. Durante este periodo el Ca2+ es captado solamente en el subcompartimento del tGo resistente a la Tg (y a TBH), y toda la aequorina contenida en este subcompartimento es consumida. Posteriormente, se lava la TBH y se puede estudiar íntegramente el componente sensible a TBH ya que en este subcompartimento es el único en el que se ha preservado la aequorina y está libre de la contaminación del otro subcompartimento, donde se ha consumido completamente. Realizamos esta maniobra en el cGo y en el tGo y los resultados obtenidos, muy diferentes, se ilustran en la figura R18. La incubación con Ca2+ 100 nM durante 10 minutos produjo un consumo del 25 % de la aequorina de tGo (Fig. R18A) durante los primeros 5 minutos, reduciéndose entonces el consumo, lo que indicaba que ya se había consumido toda la aequorina de ese compartimento.
4.RESULTADOS 111 Figura R17. Captación de Ca2+ por RE, cGo y tGo en células tratadas con tapsigargina (A y B) o con TBH (C y D). Las células RE, cGo y tGo, se reconstituyeron con celenterazina n y se permeabilizaron con digitonina 60 µM en un medio intracelular, posteriormente se lavaron con un medio libre de Ca2+ y después se incubaron con una solución tamponada de Ca2+ 100 nM. En (A) células tratadas con Tg 20 nM durante 10 min. En (C) células tratadas con TBH 10 µM durante el rellenado. En las graficas (B) y (D) se ha expandido la escala temporal de A y C para mostrar mejor las velocidades iniciales. Los valores se representan como L / LTOTAL. Los valores calibrados en [Ca2+] se muestran a la derecha.
4.RESULTADOS. 112 Esto corresponde a una captación de Ca2+ muy rápida con una V0 cercana a 150 µM/min y una concentración en el equilibrio de unos 300 µM en los 2-3 primeros minutos (Fig. R18B). Tras unos minutos (minutos 11-13), el consumo se hizo muy lento, pero el lavado de la TBH en ese momento desencadenó un aumento en la tasa de consumo de la aequorina remanente (Fig. R18A), que corresponde a una lenta captación de Ca2+ (4-7 µM/min; Fig. R18B) en este subcompartimento sensible a TBH (alrededor del 75 % de la aequorina total del tGo). Después de 58 minutos de incubación se alcanzó una concentración en el equilibrio de unos 40 µM (Fig. R18B). En ese momento, la adición de Ca2+ saturante (1 mM) aceleró la entrada de Ca2+ en el tGo. El cGo (Fig. R18C y R18D) se comportó de manera muy diferente. La captación de Ca2+ en presencia de TBH fue insignificante (Fig. R18D) y, al quitar el inhibidor de SERCA, la captación de Ca2+ aumentó hasta alcanzar una velocidad de aproximadamente 11 µM/min, sin que se llegase al nivel del estado estacionario durante el periodo de tiempo que duro el experimento. La adición de Ca2+ saturante (1 mM) en el minuto 22 aumento la captación (Fig. R18D) y la tasa de consumo de la aequorina (Fig. R18C). Al final del experimento casi el 80 % de la aequorina se había consumido sin signos aparentes de compartimentación. Nótese la alta velocidad de consumo que se alcanza tras la adición de Ca2+ 1 mM y que se mantiene hasta el final del experimento (minutos 27-30) (Fig. R18C). En otra variante de experimento (Fig. R19), se comparó la captación en el tGo a 100 nM [Ca2+]C: i) en presencia de TBH (Control en la figura; componente resistente a TBH) o ii) tras una preincubación de 15 min con TBH y 100 nM Ca2+ (componente sensible a TBH; la aequorina contenida en el espacio resistente a TBH se ha consumido tras los 15 min de preincubación). Las velocidades iniciales de captación fueron de 98 y 11 µM/min, respectivamente; y los niveles alcanzados en el estado estacionario fueron de 186 y 40 µM (Fig. R19). Estos resultados son congruentes con y confirman plenamente los resultados ya expuestos en la Fig. R18.
4.RESULTADOS 113 Figura R18. Comparación del consumo de aequorina y de la captación de Ca2+ “resistente” y “sensible” a TBH en cGo y tGo. Las células tGo (A, B) y cGo (C, D), se reconstituyeron con celenterazina n, se permeabilizaron con digitonina y se sometieron al protocolo que se indica, prefundiendo secuencialmente con: 1). Ca 100 nM + TBH (componente resistente a TBH); 2). Ca2+ 100 nM sin TBH (componente sensible a TBH; preservado en la etapa anterior) y; 3). Ca2+ 1 mM, para consumir lo más rápidamente posible la aequorina residual. En a (A) y (C) se muestran los consumos de aequorina. En (B) y (D) las cinéticas de captación. 4.8 La captación de Ca2+ resistente a Tg en el tGo tiene alta afinidad por Ca2+. Como ya se ha mostrado en la figura R15B, la velocidad de captación de Ca2+ en el tGo no parece cambiar mucho al aumentar la [Ca2+] de 100 a 500 nM, mientras que la captación en el cGo claramente se acelera. Estos resultados sugieren que el transporte en el tGo podría estar ya saturado a 100 nM de Ca2+. Se ha descrito previamente que la SPCA tiene mayor afinidad por el Ca2+ que la SERCA (Dode y cols., 2005; Vangheluwe y cols., 2009) (ver Tabla 2 en la «Introducción»), con una Kd de 20-50 nM. Esta propuesta es consistente con las observaciones de la figura R15B.
4.RESULTADOS. 114 Figura R19. Comparación de la captación de la captación de Ca2+ en los compartimentos sensible e insensible a TBH del tGo. Protocolo alternativo al de la figura R18. Las células tGo se reconstituyeron con celenterazina n y se permeabilizaron con digitonina. Previo al experimento las células se trataron durante 10 min con: 1). (Control; trazo negro) Ca2+ 0 + TBH 10µM seguido de captación con Ca2+ 100 nM en presencia de TBH; esto refleja la captación en el componente resistente a TBH. 2) (Pre. Trat.; trazo rojo) Ca2+ 100 nM + TBH 10µM durante 10 min para consumir toda la aequorina del compartimento resistente a TBH. Acto seguido, las células se incubaron con Ca2+ 100 nM en ausencia de TBH para estudiar la captación por el compartimento sensible a TBH. Para ratificar nuestra hipótesis de trabajo, en el experimento de la figura R20 comparamos la captación a dos concentraciones de Ca2+, 20 y 100 nM, tanto en el en el cGo y como en el tGo (Fig. R20A). El experimento se realizó en células permeabilizadas y tratadas con Tg 20 nM. La velocidad de captación del cGo fue mucho menor a ambas concentraciones. La [Ca2+]GO que se alcanza en el estado estacionario fue muy baja, de (media ± eem; n = 3) 3,6 ± 0,1 µM a 20 nM y 8,3 ± 4,9 µM a 100 nM. En el tGo la [Ca2+]GO a 20 nM [Ca2+]C; una concentración que
4.RESULTADOS 115 Figura R20. La captación de Ca2+ resistente a la Tg del tGo es de muy alta afinidad. En (A) las células cGo y tGo, se reconstituyeron con celenterazina n y se permeabilizaron con digitonina y se pretrataron con Tg 20 nM. Se inició la captación por adición de Ca2+ 20 nM y tras 5 min la concentración de Ca2+ se aumentó a 100 nM. Se compara la captación por cGo (trazo azul) y tGo (trazo rojo). Los datos se representan como L / LTOTAL. Los valores calibrados en [Ca2+] se muestran a la derecha. Nótese que la escala es logarítmica. Cada trazo es representativo de 3 o más resultados individuales. Los promedios de la [Ca2+]GO en el estado estacionario fueron (en µM; media ± eem; n = 3): con Ca2+ 20 nM: 3,6 ± 0,1 en el cGo; y 131 ± 7 en el tGo; con Ca2+ 100 nM: 8,3 ± 4 en el cGo; y 306 ± 37 en el tGo. En (B) se representa la cinética de la captación en función de la concentración. Se compara el RE (triángulos invertidos, en negro) y el componente resistente a Tg del tGo (círculos; en rojo). Nótese que la escala de concentración, que se expresa como % de la velocidad máxima) es logarítmica. Cada valor es la media ± eem de 3-8 datos individuales. El trazo punteado horizontal indica valor de captación semi-máxima. La concentración a la que se alcanza corresponde a la Kd.
4.RESULTADOS. 116 está claramente por debajo de la normal a la encontrada en el citosol en reposo (Alvarez y cols., 1999), alcanzó niveles tan altos como (media ± eem; n = 3) 131 ± 7 µM y a la concentración habitual del citosol (100 nM) alcanzo una concentración de 306 ± 37 µM. Teniendo en cuenta que la entrada de Ca2+ debe ser proporcional a la segunda potencia de la concentración (Villalobos y cols., 2002) la diferencia en la acumulación a 20 y 100 nM es sorprendentemente pequeña (lo esperado sería un cambio de 52=25 veces). Esto sugiere que la captación está sucediendo por un sistema de más afinidad que la SERCA, que tiene una Kd de 100-200 nM. Estudiamos entonces la cinética de la captación de Ca2+ en el tGo a diferentes concentraciones de [Ca2+]C. En la figura R20B se comparan las cinéticas de captación de Ca2+ del componente sensible a Tg del RE (mediado por la SERCA), y del componente insensible a Tg del tGo. La afinidad por el Ca2+ de éste último fue mucho más alta que la del RE, con una K50 cercana a 35 nM comparada con 170 nM del RE. Debido a la cinética de segundo orden, las diferencias se exageran a las concentraciones bajas de Ca2+. Así por ejemplo, a 50 nM en el RE prácticamente no existe ningún rellenado, mientras que la captación en el tGo supera el 50 % del máximo (Fig. R20B). 4.9 La recaptación resistente a Tg en el tGo es mediada por la SPCA. Por otra parte, investigamos el papel de la SPCA en el transporte de Ca2+ en los depósitos del Go resistente a Tg, mediante el silenciamiento de su expresión con siRNA. La figura R21A muestra que la expresión de la proteína hSPCA, cuantificada a partir de la banda especifica en un Western blot, se inhibió un 49 % con 30 nM de siRNA y un 72 % con 100 nM de siRNA. Por esta razón para los experimentos funcionales se eligió la concentración de siRNA 100 nM. En células pretratadas Tg 20 nM y con siRNA 100 nM se observó que la captación de Ca2+ en el tGo está prácticamente abolida (Fig. R21B; nótese la escala logarítmica). La [Ca2+]tGO en el estado estacionario alcanzó (en µM; media ± eem; n = 3) 122 ± 22 en la situación control (tratados con un siRNA no especifico) frente a los valores de 2,1 ± 0,3 obtenidos tras el tratamiento con el siRNA para SPCA1. La velocidad inicial de recaptación de Ca2+ fue 54 ± 12 µM/s, en la situación control, frente a 1,1 ± 0,2 µM/s, tras el tratamiento con el siRNA. Por otra parte, en el cGo la captación resistente a Tg fue mucho menor que en el tGo (nivel de Ca2+ en el estado estacionario, media ± eem; n = 3;) 6,8 ± 3 µM y se redujo aún más por el tratamiento con siRNA llegando a valores de 1,7 ± 0,4 µM (Fig. R21C).
4.RESULTADOS 117 Figura R21. Efecto del silenciamiento de SPCA sobre la captación de Ca2+ resistente a Tg en el tGo. En (A) se muestra el Western blot de extractos de células HeLa visualizado con anticuerpos antiSPCA1 y anti-α-actina. En los carriles de izquierda a derecha: (Control), transfectadas con el control scramble; (+siRNA 100 nM), tansfectadas con siRNA 100 nM y; (+siRNA 30 nM), tansfectadas con siRNA 30 nM. En (B) se muestra el efecto del tratamiento de 48h con siRNA 100 nM sobre la captación de Ca2+ por el tGo (pretratado con Tg 20 nM). Tras el tratamiento con siRNA las células se reconstituyeron con celenterazina n y se permeabilizaron con digitonina 60 µM en un medio intracelular. Posteriormente, y previo tratamiento con Tg 20 nM, se incubaron con una solución tamponada a una concentración de Ca2+ 100 nM. Los valores se representan como L / LTOTAL. Los valores calibrados en [Ca2+] se muestran a la derecha. Nótese la escala logarítmica. Cada trazo es representativo de 3 o más datos. En (C) se muestran los valores promedios de 3 experimentos similares en el RE, cGo y tGo. Nivel alcanzado en el equilibrio, en µM; nótese escala logarítmica, (en µM; media ± eem; n = 3). Se comparan 3 tratamientos: Control (scramble; barra blanca); +siRNA 100 nM (barra roja) y; sobre expresión de SPCA1 (barra negra).
4.RESULTADOS. 118 Finalmente, la captación de Ca2+ del RE, en presencia de Tg 20 nM, fue casi despreciable con o sin tratamiento con siRNA (Fig. R21C). En experimentos paralelos, se estudió el efecto de la sobreexpresión de hSPCA1. Con el fin de lograr esta sobreexpresión en las líneas estables de HeLa que expresan las sondas de RE y cGo, se les transfectó con el plásmido pMT2hSPCA2 (cedido por el Dr. Wyutack, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium) a una concentración final de 0,4 µg/pocillo. La sobreexpresión ocasiono un gran incremento en la captación de Ca2+ resistente a Tg en todos los depósitos de Ca2+, sugiriendo que existe, en estas condiciones, una expresión heterotópica de SPCA1 (Fig. R21C). De estos resultados, sumados a toda la evidencia expuesta más arriba, concluimos que el mecanismo responsable de la captación de Ca2+ resistente a Tg en el tGo se debe a la acción de la SPCA1. 4.10 La necesidad de Ca2+ para el proceso secretor. En un intento de encontrar una conexión entre la función y la diversidad de depósitos de Ca2+ presentes en Go, que será objetivo de un nuevo trabajo, hemos realizado un estudio preliminar de la relación entre la secreción de proteínas y la señal de Ca2+ en el Go. Para esto diseñamos una serie de experimentos basados en la secreción de la peroxidasa de rabanito (HRP38) por una línea de células HeLa que la expresan de forma estable (cedidas amablemente por el Dr. Malhorta (Laboratorio de Fisiología y Canalopatias, Centro de Regulacio Genomica, Barcelona, España). En este mismo laboratorio se había sugerido ya una relación entre la expresión de SPCA1 y la secreción de proteínas utilizando este mismo modelo celular (von Blume y cols., 2011). En la figura R22 hemos estudiado la secreción de HRP en varias condiciones que afectan la homeostasis del Ca2+ en RE y Go, concretamente, el tratamiento con Tg, la eliminación del Ca2+ extracelular o la suma de las dos condiciones. En el primer caso debe vaciarse completamente el RE y solo parcialmente Go, en el segundo, tanto RE como Go deben estar afectados. y en el tercer caso el vaciamiento de Ca2+ debe ser más intenso en ambos compartimentos. Como puede verse, el vaciamiento selectivo del RE con Tg tuvo un efecto relativamente pequeño, mientras que las otras maniobras, que afectan más al Go, tuvieron un efecto mayor. 38Horseradishperoxidase.
5.DISCUSIÓN 125 depósitos de Ca2+ intracelular y permitir la coexistencia de diferentes compartimentos y, tal vez, el control diferencial por Ca2+ de distintas funciones en la misma célula. Se ha propuesto recientemente que las isoformas de SERCA3 podrían participar en la diferenciación (Pegoraro y cols., 2011) y estar relacionadas con la transducción de reacciones tanto fisiológicas y como patológicas (Brouland y cols., 2005; Dally y cols., 2009; Hadri y cols., 2006; Vangheluwe y cols., 2009). La presencia de dos compartimentos distintos de Ca2+ en el RE de las células HEK293 podría tener relevancia funcional, como se ha propuesto ya en otras células, donde compartimentos específicos de Ca2+ regularían diferentes funciones celulares a través de diferentes vías de señalización. Por ejemplo, en las plaquetas humanas los depósitos ácidos sensibles a TBH son liberados por agonistas que se unen al receptor de trombina y cuya activación está implicada en la agregación plaquetaria. (Ben-Amor y cols., 2006; Jardin y cols., 2007). Del mismo modo, en células de la pituitaria de Carassius auratus existen dos depósitos de Ca2+ diferentes que pueden regular diferencialmente el almacenamiento y la secreción de la hormona del crecimiento (Johnson y cols., 2002). Nuestros hallazgos permiten seguir avanzando en el conocimiento de la heterogeneidad de los depósitos de Ca2+ de los orgánulos intracelulares, que se sustenta en la diversidad de isoformas de ATPasas y que subyacen a la generación diferencial de señales Ca2+ inducidas por diferentes agonistas. En la figura D1 se resumen nuestras propuestas principales en un modelo simplificado con dos subcompartimentos del retículo endoplásmico, RE1 y RE2. En RE2 se alcanza en el estado estacionario una concentración de [Ca2+] de 400500 µM. El compartimento RE2 es sensible a IP3 (capaz de vaciar hasta un 50% aproximadamente) y el Ca2+ se capta principalmente a través de la SERCA2b, que es sensible a TBH. Por su parte, el RE1 alcanza en el estado estacionario una concentración de Ca2+ de entre 100 y 200 µM, es sensible a IP3 (capaz de vaciar hasta un 90% aproximadamente) y la captación de Ca2+ es gobernada principalmente por la SERCA3d (Fig. R7), que es insensible a la TBH, pero sensible a la Tg y al ácido ciclopiazónico. Aunque RE1 y RE2 se representan como dos compartimentos distintos en la figura D1, deben estar comunicados, como demuestran nuestras medidas del consumo de aequorina en presencia de TBH (Fig. R5), que alcanza más del 80% del total de la aequorina. Alternativamente, pueden visualizarse RE1 y RE2 como un compartimento único que contiene las dos ATPasas, SERCA2b, que sería más potente, y SERCA3d, resistente a TBH, y que sería la única operativa en presencia de este inhibidor. Otra característica peculiar del RE es que una parte importante del Ca2+ que
5.DISCUSIÓN. 126 acumula en su interior (hasta el 50%), no es liberado por IP3. El modelo es muy distinto en las células HeLa, donde el RE es un compartimento homogéneo, con un solo sistema de bombeo de Ca2+, la SERCA2b, y completamente liberado por IP3. Figura D1. Modelo ER en células HEK293. 5.2 Heterogeneidad funcional de los depósitos de Ca2+ del aparato de Golgi (Go). La información que existe actualmente sobre la dinámica de Ca2+ en el Go se basa principalmente en medidas realizadas en poblaciones celulares usando aequorinas dirigidas al tGo por fusión de la sonda de Ca2+ a una porción del dominio de transmembrana de la sialil-transferasa (Callewaert y cols., 2003; Missiaen y cols., 2001; Pinton y cols., 1998; Vanoevelen y cols., 2004). Nosotros hemos elaborado tres nuevas sondas de Ca2+ para Go por fusión de aequorinas con GFPs. Dos de ellas, tGoGA y cGoGA, son útiles para ensayos de bioluminiscencia en poblaciones celulares. La tercera es apta para ensayos de
5.DISCUSIÓN 127 fluorescencia en célula única (tGoGAP1). Estos tres indicadores pertenecen a la familia de las GECIs39, y pueden dirigirse específicamente a los distintos compartimentos del Go, cGo y tGo. Para ello hemos utilizado las secuencias de direccionalidad de dos enzimas que se localizan selectivamente en el cGo (β-1,6acetilglucosamiltransferasa) (Zerfaoui y cols., 2002) y en el tGo (TGN) (β-1,4 Ngalactosiltransferasa) (Llopis y cols., 1998), respectivamente. En el caso del cGo, es la primera vez que esta secuencia de direccionamiento se utiliza en GECIs. En cambio, en el tGo ya se había reportado registros con la misma secuencia de direccionalidad en camaleones (Griesbeck y cols., 2001). La ventaja de nuestros indicadores sobre otros basados en la tecnología de la aequorina, es que tanto tGoGA, como cGoGA y tGoGAP1, conservan la fluorescencia de la GFP, lo que permite monitorizar su localización en las células vivas en cualquier momento, y detectar fácilmente defectos o errores en su expresión y su topología. Según nuestra experiencia, y en concordancia con otros artículos (Girotti y Banting, 1996; Lissandron y cols., 2010), las transfecciones celulares transitorias, especialmente de sondas dirigidas al aparato de Golgi, generan con frecuencia una localización incorrecta del indicador. Para paliar este problema empleamos un doble abordaje. En primer lugar, seleccionamos el vector pHSV que lleva como promotor el IE4/5 del virus herpes, que induce menor expresión que otros plásmidos de uso habitual como el pcDNA3. En segundo lugar generamos líneas de células HeLa que expresan de forma estable cada una de nuestras sondas. Otra ventaja de utilizar transfeccion estable es que se reduce la inevitable variabilidad entre experimentos. En las figuras R-9 y R-23 puede apreciarse que la localización de nuestras sondas recuerda la morfología característica del aparato de Golgi: perinuclear, asimétrica, en media luna y con sus cisternas apiladas. Además, la señal de GFP de ambas sondas se solapa perfectamente con sus respectivos marcadores, TGN46 para tGoGA y GM130 para cGoGA (Tabla 9). Nuestros resultados con las sondas de aequorinas de RE, cGo y tGo ponen de manifiesto tanto similitudes como diferencias entre ambos sistemas de endomembranas. Aunque ambos son orgánulos con alto contenido de Ca2+, la concentración de Ca2+ no alcanza valores tan altos en el Go como en el RE. En el estado estacionario encontramos valores de la [Ca2+]RE es de unos 600 µM mientras que la [Ca2+]GO es próxima a 200 nM (Fig. R13). Nuestros valores están básicamente de acuerdo con los obtenidos en otro laboratorio en los que utilizarón una sonda de aequorina con diferente secuencia direccionlaidad al tGo 39GECIs:GeneticEncodeCalciumIndicator.
5.DISCUSIÓN. 128 en células HeLa (Pinton y cols., 1998); pero son menores a los obtenidos en otro laboratorio con las mismas condiciones ([Ca2+]GO = 600µM) (Missiaen y cols., 2004b). Una explicación a esta divergencia podría ser la localización inapropiada de la sonda en los otros estudios, que podría deberse a tres razones: i) la incorrecta localización al realizar transfecciones transitorias (Girotti y Banting, 1996), ii) la utilización de vectores de alta expresión; y iii) la falta de monitorización del estado de los orgánulos al momento de realizar el experimento. Por nuestra parte, en todos los experimentos mostrados aquí hemos utilizado clones de células HeLa que expresan establemente nuestras sondas, evitando así la mala localización y reduciendo la variabilidad de experimento a experimento. En relación con el contenido de Ca2+ en el cGo, es, hasta donde nosotros sabemos, la primera vez que se aborda este tema. Según nuestros resultados, la [Ca2+]cGO alcanzada en el equilibrio es de aproximadamente 200 µM, muy similar a la obtenida en el tGo (Fig. R13). La velocidad inicial de rellenado de Ca2+ fue también similar en las células intactas (Fig. R13). Cuando se estudiaron las propiedades de la captación de Ca2+ del RE y del cGo en presencia del inhibidor irreversible de SERCA tapsigargina (Tg, 20 nM) (Thastrup y cols., 1989), la inhibición fue completa en ambos orgánulos. En contraste, en el tGo la inhibición de la captación fue solo parcial, alcanzandose valores residuales de [Ca2+]GO cercanos a 100 µM. Los experimentos con células permeabilizadas nos permitieron analizar con mayor detalle las propiedades de captación de Ca2+ en los distintos depósitos, ya que con esta maniobra eliminamos los artefactos introducidos por la presencia de la membrana plasmática. Nos permite, además, controlar la concentración de Ca2+ en el medio de incubación (equivalente al citosol en este caso). Al estudiar la captación, en el RE y en el tGo, a distintas concentraciones de Tg nos dimos cuenta de que la Ki (concentración que inhibe un 50%) era muy diferente en ambos compartimentos. En el RE la inhibición es de alta afinidad, prácticamente completa con Tg 20 nM. En contraste, en el tGo la inhibición por Tg no responde a una exponencial simple. Con Tg 20 nM se inhibe aproximadamente el 80 % de la captación (con Ki aprox. 5 nM), mientras que el 20 % restante requiere concentraciones muy superiores (Ki = 200-300 nM) de modo que ni siquiera con Tg 1000 nM, la concentración más alta probada, es la inhibición completa (Fig. R14). En resumen, nuestros resultados indican que la captación de Ca2+ en el tGo está compuesta por dos componentes diferentes, uno muy sensible y otro poco sensible a Tg. Se estima que la inhibición de Tg sobre la actividad SERCA1 es de muy alta afinidad, con un IC50 = 0,03 nM, mientras que para SPCA1 y SPCA2 se
5.DISCUSIÓN 129 han propuesto valores de IC50 = 28 µM y 2 µM, respectivamente (Vangheluwe y cols., 2009). Recientemente, se ha comunicado que el bis (2-hidroxi-3-tert-butil-5-methilphenil)-metano (bis-fenol, también llamado ralox 46; no confundir con bis-fenol A) es un inhibidor muy especifico de SPCA. Los valores de IC50 del bis-fenol para SPCA1d y SERCA2b fueron de 0,013 µM y 62 µM, respectivamente (Lai y Michelangeli, 2012). Sin embargo, en una serie de experimentos realizados por nosotros (no mostrados) estudiamos el efecto del bis-fenol (generosamente suministrado por el Dr. Michelangeli, University of Birmingham, Great Britain) sobre la captación en el cGo y tGo sin observar efecto ninguno. Esta discrepancia es desconcertante y la única diferencia que se nos ocurre entre nuestros protocolos y los usados por Lai y Michelangeli, es que ellos midieron actividad ATPasa, mientras que nosotros hemos medido transporte de Ca2+. En los experimentos con células permeabilizadas encontramos también diferencias en las velocidades de captación de Ca2+ entre los tres depósitos, siendo mayor (2-3 veces) en el RE (120 µM·min-1, aprox.) que en el Go (Fig. R13). Estos hallazgos apuntan a que, tanto el RE como el Go, son depósitos de Ca2+ distintos y de estructura muy definida. El Go presenta, a su vez, características diferentes en sus lados cis y trans. Un punto importante es la sensibilidad a agonistas liberadores de Ca2+. En el cGo es la primera vez que se documenta esta cuestión, mientras que en el tGo se había propuesto previamente la existencia de IP3R y RyR, aunque es un tema controvertido (Lissandron y cols., 2010; Pinton y cols., 1998). En nuestras manos, de los experimentos en células intactas podemos deducir que existen ambos tipos de receptores en el tGo y el cGo, ya que tanto el ATP, que activa los IP3Rs, como la cafeína, que activa los RyRs, producen una liberación similar en el RE, el cGo y el tGo (Fig. R12). Por otra parte, en los experimentos con células permeabilizadas de los tres mensajeros intracelulares estudiados el (IP3, el NAADP y el cADPr) solamente el IP3 fue capaz de liberar Ca2+ de los depósitos intracelulares, comportándose los tres depósitos el (RE, el cGo y el tGo) de forma similar (Fig. R13). La liberación inducida por el IP3 fue casi completa en los tres casos (Fig. R13). Los consumos de aequorina en el equilibrio, nos permiten estimar el tamaño de los depósitos involucrados en la captación de Ca2+. La aequorina consumida nos traza, entonces, los compartimentos que han tenido Ca2+ en su interior. De esta manera, cuando dejamos que los depósitos se rellenen con una [Ca2+]c de 100 nM (similar a la que se encuentra en condiciones fisiológicas), se consume toda la aequorina del RE, el cGo y el tGo. Si bloqueamos la SERCA con Tg o con TBH se
5.DISCUSIÓN. 130 evita totalmente el consumo en el RE y el cGo, pero no en el tGo (Fig. R15 y R16), indicando que existe en este último compartimento un mecanismo de transporte distinto. En presencia de Tg (o TBH) se consume solamente el 20 % de la aequorina del tGo y el consumo sigue una exponencial cuya asíntota corresponde a este valor (Fig. R15B y R15C; véase también el resto de los paneles en la Fig. R15 y R16). Debemos concluir entonces que el mecanismo de captación de Ca2+ resistente a la Tg es distintivo del tGo, ya que es prácticamente inexistente en el RE y muy reducido en el cGo, donde puede apreciarse, no obstante, algún consumo residual (Fig. R15B), que aumenta cuando se aumenta la concentración de Ca2+ a 500 nM, maniobra que no tiene ningún efecto en el tGo. Una posible explicación al comportamiento en el cGo es que, como compartimento de transición entre el RE y el tGo, la captación de Ca2+ en este compartimento esté gobernada por más de un ATPasa (Behne y cols., 2003; Pizzo y cols., 2011) o, simplemente, que esté tenuemente comunicado con el tGo, de modo que el Ca2+ captado pueda difundir lentamente desde el tGo al cGo. Sin embargo, esta posibilidad no parece probable porque si los dos compartimentos estuviesen comunicados, debería observarse también un aumento del consumo en el tGo al aumentar [Ca2+]C, cosa que no se ve (Fig. R15B; Fig. R16A). Lo que es claro es que cuando se inhibe la SERCA con Tg o TBH, la acumulación de Ca2+ en el tGo es, a concentraciones fisiológicas de [Ca2+]C (100 nM), 10-100 veces mayor que en el RE o el cGo, alcanzándose concentraciones cercanas a 200 µM, (entre 100 y 300 µM dependiendo del experimento: Figs. R12, R13, R17, R18). La velocidad inicial a través de este componente resistente a Tg es también mucho más rápida en el tGo que en el RE o el cGo, alcanzándose cifras de 50-150 µM/min en varios experimentos (Figs. R17B y 17D). Los valores de [Ca2+] que nosotros estimamos en el tGo en esta fracción resistente a Tg son el doble a los obtenidos en otro laboratorio utilizando una sonda de similares características y dirigida a este compartimento (Vanoevelen y cols., 2004), pero la concentración de Tg usada por Vanoevelen y cols. fue de 10 µM, 500 veces superior a la nuestra y capaz de inhibir nuestro componente “resistente a Tg” (Fig. R14). Por otro lado, nuestra estimación está corregida para el tamaño de cada compartimento (en el caso del compartimento resistente a la Tg, aproximadamente 20% del total de las cuentas (Fig. R15B). ¿Cuál podría ser la base estructural que justifique las diferencias de almacenamiento del Ca2+ intracelular entre RE, cGo y tGo? Nuestros datos indican claramente que, en el tGo además de SERCA existe otra bomba de Ca2+, que no se expresa a niveles significativos en el RE (Fig. R12, R14, R15, y R17).
5.DISCUSIÓN 131 La presencia de SPCA podría explicar las propiedades biofísicas de la captación en este compartimento y sería concordante con los datos bioquímicos publicados en otros laboratorios (Lissandron y cols., 2010; Missiaen y cols., 2007; Van Baelen y cols., 2003; Vangheluwe y cols., 2009; von Blume y cols., 2011). En las células humanas, se han clonado dos genes diferentes que codifican para SPCA, ATP2C1 y ATP2C2. El gen ATP2C1 se localiza en el cromosoma 3 y por splicing, genera 4 isoformas de SPCA1 (Hu y cols., 2000b; Sudbrak y cols., 2000). El gen ATP2C2 se localiza en el cromosoma 16 y codifica la SPCA2 (Vanoevelen y cols., 2005a; Xiang y cols., 2005). Las dos SPCAs difieren de la SERCA, además de la ya mencionada sensibilidad a Tg, en que solo tienen un sitio de unión a Ca2+. Además de esto, las SPCAs también transportan Mn2+ con alta afinidad y esta propiedad representa una diferencia funcional importante con las SERCAs (Vangheluwe y cols., 2009).) Otra diferencia que encontramos entre el bombeo de Ca2+ resistente a Tg en tGo y los otros compartimentos, cGo y RE, es la afinidad por el Ca2+, que es mayor en el tGo. Así, al utilizar 20 nM de [Ca2+]C, una concentración a la que prácticamente no hay captación en el RE y ni en el cGo, la acumulación en el tGo se mantiene relativamente alta, por encima de 100 µM (Fig R20). La comparación directa de las cinéticas de captación a distintas concentraciones de [Ca2+]c del componente sensible a Tg del RE y del componente resistente a la Tg del tGo (Fig. R20B) mostraron que la afinidad por el Ca2+ de este último es mucho mayor, con una K50 cercana a 30 nM comparada con 170 nM para el RE. Estos datos son concordantes con los publicados para la actividad ATPasa, donde se ha propuesto una mayor afinidad por el Ca2+ para la SPCA que para la SERCA (Dode y cols., 2005; Vangheluwe y cols., 2009) Los experimentos de silenciamiento de SPCA1 nos han permitido ratificar el mecanismo molecular responsable de la captación de Ca2+ resistente a Tg en el tGo. Nuestros resultados con siRNA para la SPCA demuestran que prácticamente se abole la recaptación de Ca2+ del componente resistente a Tg del tGo (Fig. R21B). Así, la [Ca2+]tGo en el equilibrio y la velocidad inicial de recaptación de Ca2+ presentan una disminución de aproximadamente un 98%. En el cGo la recaptación resistente a Tg fue mucho menor que en el tGo, pero se redujo también por el tratamiento con siRNA (Fig. R21C). En conjunto, nuestros resultados demuestran que la captación resistente a Tg que se encuentra en el tGo está mediada por la SPCA1. ¿Cuál es la relevancia funcional de esta heterogeneidad en la distribución de ATPasas en los distintos compartimentos del Go?
5.DISCUSIÓN. 132 Se ha postulado que la actividad de la SPCA1 es requisito indispensable para la correcta clasificación y transporte de proteínas en el tGo mediante la interacción con una proteína citoplasmática llamada ADF/Cofilina. El silenciamiento de SPCA1 con siRNA induce la retención de proteínas de secreción en el TGN (von Blume y cols., 2011). En otro laboratorio también se ha observado que el silenciamiento de SPCA1 reduce el tráfico de proteínas RE-Go-membrana plasmática (Lissandron y cols., 2010). En experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio con una línea celular de HeLa que expresa de forma estable la peroxidasa del rábano (HRP) (von Blume y cols., 2011) obtenemos resultados coherentes con las observaciones mencionadas más arriba. Así, el tratamiento con Tg 20 nM, que bloquea compleramente la captación de Ca2+ en RE, pero no en tGo, inhibe poco la secreción de HRP; pero si se combina con la ausencia de Ca2+, que probablemente induce un vaciamiento mayor de tGo, inhibe intensamente la secreción. De estas observaciones se puede especular que el rellenado de Ca2+ del compartimento de Ca2+ resistente a Tg y enriquecido en SPCA1 es necesario para que ocurra la secreción de proteínas. Por otro lado, el hecho de que el tGo (y la SPCA) tenga mayor afinidad por el Ca2+ que el RE (y la SERCA) puede tener sus implicaciones funcionales, de modo que aún en condiciones de baja [Ca2+]C, que ocasionan vaciamiento del RE, el tGo mantendría mejor su contenido de Ca2+ y, en consecuencia, su función en el procesamiento de proteínas. En resumen, podemos concluir que hemos detectado y caracterizado un compartimento de Ca2+ distinto en el tGo con las siguientes características: i) es resistente a los inhibidores clásicos de SERCA (Tg y TBH) (Figs. R15B y R15C), ii) alberga una [Ca2+] alta, de aproximadamente 200 µM (Figs. R17A y R17C); iii) la cinética de captación de Ca2+ concuerda con los valores de afinidad de la SPCA (Kd = 40 nM, Tabla 2) y iv) se abole por silenciamiento de la SPCA1. La información disponible en la literatura (Lissandron y cols., 2010; von Blume y cols., 2011) y nuestros resultados preliminares (Fig. R22) sugieren que el adecuado relleno de Ca2+ de este subcompartimento del tGo es crucial para la secreción de proteínas. La figura D2 resume un modelo simplificado de nuestras propuestas acerca de ls estructura funcional y la dinámica del Ca2+ de las dos zonas principales, cis y trans, que componen esta compleja estructura. El cGo tiene características funcionales similares a las del RE: es un compartimento de alto Ca2+ (aunque la concentración es solo 1/3 de la del RE) y su bombeo de Ca2+ es llevado a cabo por la SERCA. El tGo es un compartimento heterogéneo compuesto de 2 subcompartimentos. Una fracción del 20-25% contiene la SPCA1, que utiliza para el bombeo de Ca2+ (tGo1 en la figura). Por este motivo, tGo1 es resistente a la
5.DISCUSIÓN 133 TBH y a la Tg (a concentraciones de 20 nM, aunque puede inhibirse por concentraciones extremadamente altas de Tg, > = 1 µM). Figura D2. Modelo Go en células HeLa. El compartimento tGo1 tiene un alto contenido de Ca2+ (alrededor de 200 nM). La otra fracción de tGo, tGo2, comprende el 80% de tGo, y tiene un contenido de Ca2+ menor (del orden de 40 µM). Sus mecanismos de bombeo son muy débiles (Figs. R18 y R19), de ahí que se alcance un contenido menor en el estado estacionario. Parece que no hay comunicación (difusión de Ca2+) ente tGo1 y tGo2, pues puede rellenarse tGo1 (por ejemplo en presencia de TBH) sin rellenado aparente de tGo2 (Fig. R18). Tal como se representa esquemáticamente en la figura D2, nos imaginamos cGo como una pila de cisternas comunicadas entre si y aisladas de un segundo sistema de cisternas (tGo2) también comunicadas entre sí. Finalmente, nos imaginamos tGo1 como un
5.DISCUSIÓN. 134 sistema de vesículas sin conexión con tGo2. La concentración de Ca2+ en cada uno de estos subcompartimentos se mantendría independientemente. Mención especial merece el tGo1, que por poseer una ATPasa de Ca2+ de mayor afinidad (SPCA1) mantendría más tenazmente su alto contenido de Ca2+, con cierta independencia de los cambios de [Ca2+]C, preservándose así el procesamiento de las proteínas. Todos los compartimentos del Go contienen receptores/canales de IP3 que pueden liberar esencialmente todo el Ca2+ acumulado en su matriz (Fig. R13). Pueden, por tanto, participar en respuestas fisiológicas mediadas por Ca2+ a través de esta vía de señalización. Tanto cGo como tGo poseen también RyRs, que producen una liberación incompleta de Ca2+, de aproximadamente el 50% del Ca2+ contenido. Sin embargo, no encontramos receptores funcionales para NAADP o cADPR.
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