Efectos combinados de la clorosis férrica y el estado hídrico del viñedo en la calidad de la uva y el vino cv. Tempranillo

PROGRAMA DE DOCTORADO EN ENOLOGÍA, VITICULTURA Y SOSTENIBILIDAD TESIS DOCTORAL: EFECTOS COMBINADOS DE LA CLOROSIS FÉRRICA Y EL ESTADO HÍDRICO DEL VIÑEDO EN LA CALIDAD DE LA UVA Y EL VINO CV. TEMPRANILLO Presentada por Ramón Sánchez Alonso para optar al grado de Doctor por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Pedro Martín Peña Encarnación Fernández Fernández José Manuel Rodríguez Nogales 1 2 ÍNDICE AGRADECIMIENTOS............................................................................................................. 4 RESUMEN ............................................................................................................................ 5 ABSTRACT ............................................................................................................................ 7 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 9 1.1. LA CALIDAD DE LA UVA Y DEL VINO ........................................................................... 11 1.1.1. Componentes de la calidad del vino ....................................................................... 11 1.1.1.1. La composición fenólica y el color del vino .......................................................... 11 1.1.1.2. El perfil aromático ................................................................................................ 15 1.1.1.2.1. Aromas primarios .............................................................................................. 17 1.1.1.2.2. Aromas secundarios .......................................................................................... 20 1.1.1.2.3. Aromas terciarios .............................................................................................. 24 1.1.2. El potencial enológico del viñedo. Factores vitícolas que afectan a la composición de la uva ............................................................................................................................ 25 1.1.2.1. El clima y el suelo ................................................................................................. 25 1.1.2.2. El material vegetal ................................................................................................ 27 1.1.2.3. Las técnicas de cultivo .......................................................................................... 28 1.2. COMPORTAMIENTO PRODUCTIVO Y CUALITATIVO DEL VIÑEDO BAJO CONDICIONES DE ESTRÉS HÍDRICO Y CLOROSIS FÉRRICA ......................................................................... 30 1.2.1. El deficit hídrico ....................................................................................................... 30 1.2.2. La deficiencia de hierro ........................................................................................... 31 1.3. CARACTERIZACIÓN DEL POTENCIAL ENOLÓGICO DE VIÑEDOS DE SECANO AFECTADOS POR DEFICIENCIA DE HIERRO ........................................................................ 33 2. REFERENCIAS ................................................................................................................. 36 3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 63 4. PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL ................................................................................ 63 5. ESTRUCTURA ................................................................................................................. 66 5.1. CAPÍTULO 1................................................................................................................. 67 5.2. CAPÍTULO 2................................................................................................................. 68 5.3. CAPÍTULO 3................................................................................................................. 69 6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 70 3 4 AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradacer en primer lugar a la Junta de Castilla y León (proyecto VA013P17 y fondos FEDER) por financiar esta investigación. Quiero agradecer a mis directores, el Dr. José Manuel Rodríguez Nogales, la Dra. Encarnación Fernández Fernández y en especial a mi director y tutor el Dr. Pedro Martín Peña la oportunidad que me dieron para realizar esta Tesis. Especial agradecimiento también a la Dra. María Rosa González García. Agradezco el trabajo realizado a todos los técnicos, postdoctorandos, doctorandos y alumnos de la Universidad de Valladolid que han colaborado en la obtención de los resultados de esta Tesis. Quiero dar las gracias a mis padres y a Ana su apoyo durante esta etapa. Quiero dar mi agradecimiento a Bodegas Emilio Moro S.L., en cuyo viñedo se han llevado a cabo los estudios de esta Tesis. 5 RESUMEN El déficit hídrico y la deficiencia nutricional de hierro (clorosis férrica) son factores de estrés ambiental que afectan frecuentemente al cultivo de la vid en la zona mediterránea. Los estudios sobre el impacto de ambos factores, cuando actúan simultáneamente, son escasos. En esta Tesis se han evaluado los efectos combinados de la incidencia de clorosis férrica y del estado hídrico de la vid sobre la calidad y el perfil aromático de la uva y del vino Tempranillo y se ha estudiado la viabilidad de la medida del contenido foliar de clorofila en el envero (Chl) como indicador precoz del potencial de calidad de las uvas en esas condiciones. Además, en esta Tesis se ha investigado, por primera vez, cómo niveles moderados de carencia de hierro en la vid pueden afectar a la presencia de compuestos orgánicos volátiles en los vinos. Para ello, se realizó un seguimiento durante varias campañas de 20 subzonas de viñedo de secano (10 m × 10 m cada una), desde no afectadas hasta moderadamente afectadas por clorosis férrica, en la Denominación de Origen Protegida Ribera del Duero. Los niveles de estrés hídrico y nutricional del viñedo, estimados a partir del potencial hídrico foliar antes del amanecer y el contenido de clorofila foliar medidos en el envero, se relacionaron con los valores de vigor, rendimiento y composición de la uva, así como con las características químicas y organolépticas del vino. La incidencia leve a moderada de clorosis férrica no tuvo efectos significativos sobre el vigor de la vid, el rendimiento o el tamaño de las uvas, pero aumentó las concentraciones de algunos terpenos específicos, norisoprenoides C13, ácidos y fenoles volátiles en la uva. Por su parte, el déficit hídrico tendió a incrementar la intensidad del color y el contenido de antocianinas extraíbles de las uvas. Se ha observado que el estrés por deficiencia de hierro disminuye el pH del vino y contribuye a la mejora de atributos sensoriales de tonalidad e intensidad de la capa, intensidad del sabor y persistencia en boca. Se observaron aumentos en el color rojo, en la astringencia y en la persistencia del vino asociados con la incidencia de clorosis férrica, aunque restringidos en condiciones de déficit hídrico elevado. Los resultados muestran que el estrés moderado por deficiencia de hierro aumentó en los vinos las concentraciones de compuestos volátiles asociados a notas florales, como el 2fenilacetaldehído, el 2-feniletanol y el acetato de 2-feniletilo, al tiempo que redujo la presencia de los alcoholes C6, responsables del aroma herbáceo. El mayor contenido total de 6 compuestos fenólicos se observó en las subzonas de viñedo con mejor estado hídrico. En las subzonas más estresadas, tanto por déficit hídrico como por carencia de hierro, se observan menores contenidos de alcoholes C6 que en las subzonas menos estresadas. Los resultados indican que el estrés por deficiencia de hierro de leve a moderado puede tener efectos positivos sobre los compuestos químicos y los atributos sensoriales del vino Tempranillo. Las mediciones del contenido de clorofila foliar en el envero podrían ser muy útiles para mapear el potencial de calidad en viñedos de secano afectados por deficiencia de hierro. 7 ABSTRACT Water deficit and iron nutritional deficiency (iron chlorosis) are environmental stress factors that frequently affect grapevine cultivation in the Mediterranean area. Studies on the impact of both factors, when acting simultaneously, are scarce. In this Thesis, the combined effects of the incidence of iron chlorosis and the water status of the vine on the quality and aromatic profile of the Tempranillo grape and wine have been evaluated, and the feasibility of measuring the foliar chlorophyll content in veraison (Chl) has been studied as an early indicator of the quality potential of the grapes under these conditions. In addition, this Thesis has investigated, for the first time, how moderate levels of iron deficiency in grapevines can affect the presence of volatile organic compounds in wines. During several campaigns a group of 20 subareas of non-irrigated vineyards (10 m × 10 m each), from not affected to moderately affected by iron chlorosis, was monitored in the Ribera del Duero Designation of Origin. The water status and nutritional stress levels of the vineyard, estimated from the leaf water potential before sunrise and the foliar chlorophyll content measured at veraison, were related to the values of vigor, yield and grape composition parameters, as well as with the chemical and organoleptic characteristics of the wine. Mild to moderate incidence of iron chlorosis had no significant effects on vine vigor, yield, or berry size, but increased concentrations of some specific terpenes, C13 norisoprenoids, volatile acids, and phenols in grapes. On the other hand, the water deficit tended to increase the color intensity and the extractable anthocyanin content of the grapes. It has been observed that iron deficiency stress lowers the pH of the wine and contributes to the improvement of sensory attributes as tonality, layer intensity, flavour intensity and persistence in the mouth. Increases in red color, astringency and wine persistence associated with the incidence of iron chlorosis were observed, although restricted in conditions of high water deficit. The results show that moderate stress due to iron deficiency increased the concentrations of volatile compounds associated with floral notes, such as 2-phenylacetaldehyde, 2phenylethanol and 2-phenylethyl acetate, in wines, while reducing the presence of C6 alcohols, responsible for the herbaceous aroma. The highest total content of phenolic compounds was observed in the vineyard subzones with the best water status. In the most stressed subzones, 8 both due to water deficit and iron deficiency, lower contents of C6 alcohols are observed than in the less stressed subzones. The results indicate that mild to moderate iron deficiency stress can have positive effects on chemical composition and sensory attributes of Tempranillo wine. Measurements of leaf chlorophyll content at veraison could be very useful to map quality potential in rainfed vineyards affected by iron deficiency. 15 Las coordenadas CIELab se ubican dentro de un espacio tridimensional, estando cada una de ellas en cada uno de los ejes que definen el espacio (Cheftel y Cheftel, 1992). La coordenada L* se encuentra en el eje vertical, tomando valores entre 0 y 100 (indicando el valor 0 alta claridad y 100 baja claridad). La coordenada a*, corresponde al eje de abscisas, tomando valores entre +60 y -60 (siendo +60 la gama de matices rojos y -60 la gama de matices verdes). Y por último la coordenada b*, corresponde al eje de ordenadas con valores entre +60 y -60 (siendo +60 la gama de matices amarillos y -60 la gama de matices azules) (figura 2). Figura 2. Diagrama secuencial y/o continuado de las coordenadas colorimétricas a* y b*, y de su magnitud derivada como es el tono (H*) (OIV, 2006). 1.1.1.2. El perfil aromático El aroma del vino es un marcador esencial de su calidad, es muy complejo y su percepción es el resultado de una gran cantidad de compuestos orgánicos volátiles (libres y ligados) presentes en concentraciones muy bajas. Se ha demostrado que el vino tiene más de 800 compuestos volátiles con un amplio rango de concentración, desde ng/L hasta cientos de mg/L (Machyňáková et al., 2019). No todos los compuestos contribuyen de la misma forma al aroma del vino. De hecho, se ha definido el cálculo del “valor activo de olor” (OAV, de sus siglas en inglés “odour activity value”) como el cociente entre la concentración del compuesto a evaluar y el umbral de percepción de dicho compuesto, permitiendo estimar la contribución al espectro aromático del vino cuando ese resultado es ≥ 1. Según Guth (1997) este concepto es necesario para cuantificar las diferencias aromáticas entre vinos con diferente procedencia 16 varietal o geográfica. Sin embargo, actualmente se encuentra en debate la fiabilidad del OAV como indicador de la importancia real del odorante en el vino (Ferreira et al., 2022). Los compuestos volátiles libres contribuyen directamente al aroma del vino, mientras que los compuestos ligados se encuentran en el mosto en forma de compuestos inodoros, que pueden convertirse en formas volátiles, mediante hidrólisis ácida y enzimática, durante los procesos de vinificación, almacenamiento y envejecimiento del vino (López et al., 2004). Algunos de los compuestos de más impacto en el espectro aromático del vino se describen en la tabla 1. Tabla 1. Compuestos considerados como compuestos de impacto en los distintos tipos de vinos (Ferreira, 2007). Compuesto arómatico Descripción Linalol Aroma varietal de moscatel. Floral, cítrico Óxido de rosa cis Aroma floral. Varietal de Gewürztraminer (E)-whiskylactona Olor a madera Sotolón (3-hidroxi-4,5-dimetil2(5H)-furanona) Vinos oxidativos. Oporto, Madeira, Jerez 4-metil-4-mercaptopentanona Aroma a boj. Varietal de Sauvignon Blanc 3-mercapto-hexanol Mango verde y boj Acetato de 3-mercaptohexilo Fruta tropical. Varietal de Verdejo Furfuriltiol (FFT, o 2furanmetanetiol) Aroma a café. Característico de los champagne envejecidos Bencilmercaptano Aroma a tostado. Champagne envejecido, Chardonnay sobre lías Sulfuro de dimetilo (DMS) Olor azufrado. Vinos envejecidos Metional (metil-tiopropanal) Chocolate Diacetilo Mantequilla (Chardonnay) Acetato de isoamilo Aroma característico en Pinotage y Tempranillo Rotundona Pimienta (Shiraz) 17 Según el momento en que se generen, los compuestos aromáticos se clasifican en tres categorías:  Formados en la uva: primarios o varietales.  Formados por la acción de las levaduras o las bacterias: secundarios o fermentativos.  Relacionados con la crianza en barrica y botella: terciarios. 1.1.1.2.1. Aromas primarios Los aromas primarios del vino, también definidos como aromas varietales, son compuestos aromáticos que representan en el vino el aroma típico de las variedades de uva. Las formas libres de estos compuestos contribuyen de forma directa al aroma (Zalacaín et al., 2007). Sin embargo, las formas no volátiles se encuentran en más proporción, siendo en su mayoría compuestos glicosilados. La hidrólisis de estos compuestos glicoconjugados puede producir agliconas aromáticamente activas, como terpenos, norisoprenoides C13, derivados bencénicos y alcoholes alifáticos (Gunata et al., 1985; Ribéreau-Gayon et al., 2021). Estos compuestos son de gran relevancia debido a que desempeñan un papel fundamental en la diferenciación de vinos procedentes de las distintas variedades de uva usadas en enología (Dimitriadis y Williams, 1984; Gunata et al., 1985). La viticultura y las prácticas culturales son factores que influyen en la composición aromática de la uva (González-Barreiro et al., 2015; Vilanova et al., 2007, 2017). Los aromas primarios pertenecientes a una misma variedad de uva pueden presentar diferentes características en función de factores naturales derivados del clima, tipo de suelo, fertilización, presencia/ausencia de plagas o incluso la ubicación geográfica, que pueden provocar diferentes condiciones de cultivo en cada zona y también cada año. Además, el período de maduración y el cuidado del viticultor a la hora de seleccionar las uvas pueden influir en el aroma primario final del vino (Pereira et al., 2020). Se sabe que las uvas contienen terpenos libres y combinados con enlaces glicosídicos con glucósidos, siendo los monoterpenos y sesquiterpenos los que aportan aroma y sabor. Si bien pocos aromas se han asociado directamente a variedades específicas, cada variedad de uva posee una huella aromática. Los glicósidos o ésteres de monoterpeno no muestran cambios significativos en su cantidad por la acción de las levaduras en la fermentación. Por tanto, se pueden utilizar para clasificar diferentes variedades, como los vinos elaborados a partir de uvas Muscat y Riesling, mediante el estudio de su composición analítica basada en tan solo 12 compuestos monoterpénicos (Rapp y Mandery, 1986; Styger et al., 2011). Sin embargo, la baja 18 concentración de estos compuestos no permite su apreciación sensorial a no ser que su potencial se vea reforzado en etapas posteriores por reacciones enzimáticas que tengan mayor impacto en el aroma final del vino (Belda et al., 2017). Además, otros precursores que no poseen características olorosas están involucrados en el desarrollo de otras sustancias aromáticas (por ejemplo, monoterpenos, dioles o terpenos, polioles, ácidos grasos, carotenoides, precursores glicosilados del aroma y fenoles volátiles) (Pereira et al., 2020). Las principales familias de compuestos involucradas en los aromas primarios o varietales del vino son los terpenos, los norisoprenoides C13 y los compuestos C6. - Terpenos Los terpenos son compuestos que derivan de las uvas y contribuyen en gran medida al aroma varietal de algunos vinos aromáticos. Con umbrales de percepción relativamente bajos, muchos terpenos contribuyen al aroma floral del vino directamente o mediante efectos sinérgicos (Swiegers y Pretorius, 2005). Aparecen de forma libre, percibidos directamente, y de forma combinada. Los terpenos combinados o ligados, cuyo contenido aumenta durante la maduración (Bayonove, 1993), se liberan en el transcurso de la vinificación por las enzimas de la uva y las levaduras o por las enzimas añadidas. Son fácilmente perceptibles desde cantidades muy bajas de concentración (mg/L) y son responsables del aroma de uva asociado a la variedad Muscat, pero también presentes en otras variedades de uva. Entre ellos, los alcoholes monoterpenos más olorosos son el linalol, geraniol, nerol, citronelol, 3,6-dimetil-1,5octa-dien-1,7-diol, hotrienol y α-terpineol, que aportan aromas florales, afrutados y cítricos al vino (Jeromel et al., 2019; Ruiz et al., 2019). - Norisoprenoides C13 Los norisoprenoides son un grupo de compuestos aromáticos derivados de la degradación de los carotenoides, un grupo de pigmentos no aromáticos tetraterpenoides que existen ampliamente en las plantas. Estos compuestos son responsables, entre otros, de los olores a flores (violeta), fruta (compota de manzana, frutas exóticas), tabaco y petróleo. Los norisoprenoides C13, con 13 átomos de carbono, se encuentran entre muchos compuestos aromáticos conocidos con umbrales sensoriales extremadamente bajos y son fuente importante de aromas derivados de la uva en los vinos. Los norisoprenoides C13 más comunes son la β-damascenona, la β-ionona, el 1,1,6-trimetil-1,2-dihidronaftaleno (TDN), el (E)-1-(2,3,6trimetilfenil)buta-1,3-dieno (TPB) y el vitispirano (Yuan et al., 2015). Sus estructuras químicas se muestran en la figura 3. 19 Figura 3. Estructuras químicas de algunos norisoprenoides C13 importantes en las uvas (Yuan et al., 2015). La β-damascenona y la β-ionona fueron observadas por primera vez en el vino por Schreier y Drawert (1974). Dado que la β-damascenona y la β-ionona se encuentran comúnmente a niveles por encima de sus umbrales sensoriales en los vinos, se sugiere que contribuyen de manera importante en variedades de uva no florales como Merlot, Cabernet Sauvignon y Pinot Noir (Fang y Quian, 2005; Gürbüz et al., 2006; López et al., 1999; Pineau et al., 2007). La βdamascenona tiene un olor dulce y parecido a la miel o la manzana asada (Kováts, 1987) con un umbral sensorial de 50 ng/L en etanol acuoso al 10% (Guth, 1997). Sin embargo, la contribución de la β-damascenona al aroma del vino sigue siendo controvertida. La evidencia hasta la fecha indica que probablemente actúa como un potenciador de la intensidad del aroma, particularmente de los aromas de tipo afrutado (Escudero et al., 2007; Ferreira et al., 2002; Pineau et al., 2007; Sefton et al., 2011), y tiene la capacidad de enmascarar el aroma "herbáceo" asociado con la 2-isobutil-3-metoxipirazina (Pineau et al., 2007). La β-ionona se describe a menudo como aroma a violeta y frambuesa, con umbrales sensoriales de 90 ng/L en el vino (Kotseridis et al., 1999). El TDN tiene aromas similares al queroseno con un umbral sensorial de 2 μg/L tanto en un vino patrón como en los vinos blancos naturales (Sacks et al., 2012). El TPB fue encontrado por primera vez en vinos por Janusz et al. (2003). Se asocia con un aroma floral agradable en bajas concentraciones pero con aromas químicos cuando se encuentra en concentraciones altas (Cox et al., 2005). El vitispirano fue identificado por primera vez en vinos por Simpson et al. (1977). Tiene dos carbonos quirales y, por lo tanto, dos pares de diastereoisómeros (a menudo referidos como vitispirano A y vitispirano B). El aroma de los diastereoisómeros es distinto, la forma cis se describe con aromas florales (crisantemo) y afrutados mientras que la forma trans se relaciona a aromas de flores exóticas y terrosos. Posteriormente Rapp y Mandery (1986), asociaron el vitispirano con aromas de alcanfor y eucalipto. El umbral sensorial de 800 µg/L determinado para el vitispirano corresponde a la suma de sus diastereoisómeros (Eggers et al., 2006). - Compuestos C6 20 Los alcoholes C6 suelen tener, aromáticamente, un carácter vegetal y herbáceo, lo que provoca un efecto negativo en el aroma del vino (Ferreira et al., 2000). Se ha observado que cuanto más oxígeno disuelto hay en el mosto, se generan más aldehídos C6 a través de la degeneración de los ácidos lipídicos catalizados por las enzimas lipoxigenasa e hidroperóxido liasa (LOX/HPL) (Jackson, 2008). Una porción de aldehídos C6 se transformará en alcoholes C6 durante la fermentación (Forde et al., 2011). Los aromas herbáceos que evocan el pimiento verde o el puerro se pueden percibir en ciertas variedades de uva mal maduradas de Cabernet Sauvignon y Sauvignon Blanc. Estos olores se deben a la presencia de diversas metoxi-pirazinas a una concentración entre 5-40 ng/L. Su cantidad disminuye a lo largo de la maduración (Roujou y Dubourdieu, 1999). 1.1.1.2.2. Aromas secundarios Los aromas secundarios que aparecen en el vino se pueden dividir en prefermentativos, derivados del tratamiento mecánico de la uva, y fermentativos, los potenciados durante los procesos de fermentación alcohólica o maloláctica (Pereira et al., 2020; Perestrelo et al., 2020). La especie de levadura más utilizada para la fermentación alcohólica es Saccharomyces cerevisiae, aunque existen alrededor de 20 géneros de levadura con la misma capacidad fermentativa como Saccharomycodes, Candida, Issatchenkia, Pichia, Hanseniaspora (Kloeckera) o Brettanomyces (Dekkera) (Jeromel et al., 2019). Estas especies no-Saccharomyces impulsan la liberación de aromas mediante la secreción de enzimas y la síntesis de nuevos metabolitos secundarios. Además, contribuyen a la estabilidad del color del vino. Por lo tanto, se utilizan estratégicamente para crear cultivos iniciadores múltiples, mixtos o secuenciales en combinación con S. cerevisiae (Belda et al., 2017; Blanco-Padilla et al., 2014; Van Wyk et al., 2019). En vinos tintos, normalmente después de la fermentación alcohólica tiene lugar la fermentación maloláctica conducida por bacterias lácticas. Durante esta etapa, el ácido málico se descarboxila por la acción de Oenococcus oeni o Lactobacillus plantarum, dos especies de bacterias lácticas (Belda et al., 2017). A lo largo de la fermentación, los principales aromas creados pertenecen a las categorías de ácidos grasos volátiles, alcoholes superiores, acetatos y ésteres etílicos que hacen evolucionar el perfil aromático del vino (Jeromel et al., 2019). Estas moléculas suelen estar presentes en umbrales sensoriales elevados (los productos de oxidación del linalol poseen un umbral de percepción de 6000 µg/L) y su combinación crea la matriz del aroma del vino (Fariña et al., 2015; Jeromel et al., 2019). Por tanto, aunque la composición final del aroma del vino depende 21 en gran medida de las especies y cepas fermentativas, el microbioma de la uva está ganando atención, ya que diferentes trabajos apuntan a su relevancia en las propiedades sensoriales finales de los vinos (Belda et al., 2014, 2017; Van Wyk et al., 2019). Entre los principales volátiles que definen el vino, los ácidos grasos volátiles, los alcoholes superiores, los ésteres y los fenoles volátiles juegan un papel clave en la creación de los aromas secundarios. - Ácidos grasos volátiles En la categoría de los ácidos grasos alifáticos, además del ácido volátil más abundante que es el ácido acético, los principales ácidos grasos de cadena media son los ácidos hexanoico, octanoico o decanoico. Además, en el grupo de los ácidos grasos insaturados cabe mencionar el ácido 9-decenoico que posee propiedades conservantes y es relevante desde el punto de vista del aroma cuando se transforma en éster etílico (Schreier y Jennings, 1979). Las levaduras son las principales productoras de estos ácidos grasos que son el sustrato inicial para la formación final de los ésteres etílicos. Entre las levaduras, S. cerevisiae es capaz de sintetizar principalmente los ácidos hexanoico y octanoico en grandes cantidades, pero también los ácidos pentanoico, decanoico y 3-metilbutanoico. Se ha descrito que otras especies noSaccharomyces como el género Hanseniaspora producen ácido acético (en rangos muy variables, de 0,6 a 3,4 g/L) y como los géneros Hanseniasporavineae y Candidazemplinina, y las especies H. uvarum y H. guilliermondii muestran tasas de síntesis más altas para el ácido isobutírico (Jeromel et al., 2019; Padilla et al., 2016). - Alcoholes superiores Los alcoholes más abundantes en el vino, además del etanol y el glicerol, son los dioles y los alcoholes superiores. El etanol proporciona viscosidad, equilibra el sabor y fija los olores, mientras que los alcoholes superiores y el glicerol contribuyen en gran medida a la complejidad del aroma del vino y a la sensación en boca general del vino. Los alcoholes superiores son el resultado del catabolismo de los aminoácidos mediante un proceso conocido como reacción de Ehrlich, y afectan directa o indirectamente a la síntesis de compuestos aromáticos. Los alcoholes superiores también están implicados como precursores de ésteres, que son compuestos importantes en el aroma del vino (Padilla et al., 2016; Styger et al., 2011). Los principales alcoholes superiores son el 1-propanol, el isobutanol y el alcohol isoamílico. Otros volátiles importantes son el 2-feniletanol, el tirosol o triptofol y otros alcoholes 22 superiores presentes en cantidades inferiores, como el 2-metilbutanol-1, el 3-metil-1-butanol. Concentraciones moderadas de algunos de los compuestos volátiles considerados de alta intensidad de olor, como el 3-metil-1-butanol, el 2-feniletanol o el alcohol isoamílico, pueden tener un impacto positivo en el vino aportando notas aromáticas de flores, miel y frutas. La concentración de los alcoholes juega un papel clave en la complejidad de la composición del aroma. Valores de estos alcoholes por debajo de 300 mg/L proporcionan notas frutales y florales, mientras que valores por encima de 400 mg/L pueden ser negativos al agregar aromas picantes y desagradables (Belda. et al., 2017; Jeromel et al., 2019; Padilla et al., 2016; Pereira et al., 2020). Entre los diferentes parámetros de fermentación que afectan a la concentración final de los alcoholes superiores en el vino, la cepa de levadura es uno de los parámetros clave, seguido de la temperatura, el pH y el oxígeno, además de la madurez y variedad de la uva (Muñoz et al., 2006). La síntesis de alcoholes superiores ha sido ampliamente estudiada y relacionada con diferentes especies y/o protocolos de inoculación para obtener vinos con una composición de alcohol equilibrada (Padilla et al., 2016; Stribny et al., 2015; Tokpohozin et al., 2019). - Ésteres Los ésteres son otro grupo relevante, responsables también de la complejidad aromática de los vinos con más de 160 compuestos representantivos identificados. Los ésteres son los segundos constituyentes volátiles más importantes del vino y durante mucho tiempo se han considerado como contribuyentes especialmente importantes al aroma del vino porque son la fuente principal de aromas afrutados (Sumby et al., 2010). La mayoría de los ésteres que se encuentran en las bebidas alcohólicas son metabolitos secundarios producidos por las levaduras durante la fermentación alcohólica (Swiegers y Pretorius, 2005). Desde un punto de vista químico, se pueden clasificar en ésteres etílicos de ácidos grasos o ésteres de acetato. En la primera categoría, el hexanoato de etilo, el octanoato de etilo y el decanoato de etilo son los más abundantes. En estas moléculas, el etanol representa una contribución importante a su estructura. Los ésteres etílicos de ácidos grasos se producen durante la fermentación alcohólica por la acción de la levadura mediante la etanólisis del acil-CoA que se forma durante la síntesis o degradación de los ácidos grasos (Sumby et al., 2010; Swiegers y Pretorius, 2005). La mayoría 23 de los ésteres etílicos tienen umbrales de percepción bastante bajos y, por lo tanto, tienen un fuerte efecto sobre el aroma del vino (Gómez-Míguez et al., 2007). En el vino, los principales ésteres etílicos de los ácidos grasos incluyen butanoato, caproato, caprilato, caprato y laurato de etilo. Como otros ésteres, también pueden proporcionar aromas afrutados que se vuelven más suaves con el creciente número de carbonos en su estructura química. La formación de estos ésteres depende de la selección de las especies de levadura y otros parámetros de fermentación como las bajas temperaturas (Rapp y Mandery, 1986). Falcao et al. (2012) indicaron que el leucato de etilo podría ser el responsable del aroma de mora fresca de los vinos tintos de Burdeos. Estos autores determinaron el umbral sensorial de este compuesto en 300 µg/L en un patrón vínico y señalaron una interacción perceptiva sinérgica con el butanoato de etilo. Los ésteres de acetato se producen a partir de la reacción del acetil-CoA con alcoholes superiores formados por degradación de aminoácidos o carbohidratos (Sumby et al., 2010; Swiegers y Pretorius, 2005). Los alcoholes superiores son esenciales para la formación de estos ésteres. Los principales ésteres de acetato son el acetato de isobutilo, amilo, hexilo, etilo (aroma afrutado), isoamilo (aroma de plátano) y 2-feniletilo, que contribuyen aromáticamente en el vino con notas de miel, afrutadas y florales (Jeromel et al., 2019; Perestrelo et al., 2020; Rapp y Mandery, 1986). En términos generales, los ésteres tienen efectos positivos sobre el aroma de los vinos jóvenes. Sin embargo, como ocurre en el caso de los alcoholes superiores, cantidades excesivas de ésteres pueden inducir efectos negativos sobre la calidad del vino. Una alta concentración de ésteres puede ocultar los aromas varietales y simplificar la composición del aroma del producto final o estropear el vino, por ejemplo, si el acetato de etilo supera los 150-200 mg/L (Padilla et al., 2016; Perestrelo et al., 2020). - Fenoles volátiles Estos compuestos proceden de la degradación de los ácidos fenoles presentes en la uva (Zamora, 2003). Las notas aromáticas positivas de este grupo de moléculas se han relacionado principalmente con el proceso de envejecimiento donde los principales fenoles volátiles son el guayacol, el 4-metilguayacol, el 4-etilguayacol, el fenol, el o-cresol o la vainillina. Las enzimas implicadas en estos pasos metabólicos están principalmente asociadas con las bacterias lácticas, tales como las β-glucosidasas, las proteasas, las esterasas, las citrato liasas y las descarboxilasas del ácido fenólico. Entre los fenoles no volátiles presentes en la uva es común 24 encontrar ácidos fenólicos (ácidos cafeico, ferúlico y ρ-cumárico) o sus ésteres tartáricos (ácidos caftárico, feruloil tartárico, ρ-cumaroil tartárico). Las bacterias lácticas tienen la capacidad de metabolizar a los ácidos cinámicos, como el ácido ρ-cumárico o ferúlico, que mediante un paso de descarboxilación pueden transformarse en 4-vinil guayacol y 4-vinilfenol (Carpena et al., 2020). 1.1.1.2.3. Aromas terciarios Los aromas terciarios se crean durante el último paso de la elaboración de un vino, la crianza y envejecimiento, donde el almacenamiento del producto final es el principal responsable de la transferencia de aromas y sabores al vino. El método de envejecimiento típico es el uso de barricas de madera construidas en su mayoría con diferentes especies de roble como Quercus alba, Q. robur o Q. petraea (Carpena et al., 2020). El vino envejecido en estas barricas se enriquece en compuestos volátiles como las lactonas de guayacol y las vainillinas e incluso por compuestos como el furfural, el 5-metilfurfural, el eugenol, el 5-hidroximetilfurfural, el 4metilguayacol, la β-metil-γ-octalactona, el guayacol y el siringol, al aplicar diferentes tratamientos de tostado a la madera (Chatonnet et al., 1992; Tao et al., 2014). El uso de diferentes tipos de madera proporciona diferentes compuestos volátiles al vino envejecido. El roble americano contribuye más a la presencia de la cisy trans-β-metil-γ-octalactona en el vino (Chatonnet y Debourdieu, 1998; Guichard et al., 1995). De hecho, el análisis de estos dos isómeros se ha utilizado para distinguir entre vinos envejecidos en roble francés y americano (Díaz-Plaza et al., 2002; Pérez-Coello et al., 1999; Waterhouse y Towey, 1994). Otras diferencias significativas entre los compuestos arómaticos aportados por las barricas de origen americano y francés son la ratio de los isómeros cis/trans de whiskylactona, siendo el roble francés más favorable hacia el isómero trans, o la diferencia en las concentraciones de eugenol y guaiacol, significativamente más alta en los vinos criados en roble americano (Chatonnet et al., 1997; Fernández et al., 2003) Además del Quercus, se sabe que otro tipo de maderas como la Acacia, el Prunus o la Castanea contienen altas concentraciones de taninos que se utilizan para envejecer los vinos, ya que este tipo de polifenoles no volátiles pueden transferirse y contribuir a algunas propiedades sensoriales del vino como el color, la astringencia y el amargor (Fraga-Corral et al., 2020; Perestrelo et al., 2020). 31 El cierre de los estomas es la respuesta más temprana a la baja disponibilidad de agua para la planta y esto induce una disminución de la actividad fotosíntética (Chaves, 1991). Además, el estrés hídrico favorece la fotoinhibición, que daña el centro de reacción del fotosistema II (PS II) y que resulta también en un descenso en la asimilación de CO2 (Adir et al., 2003). Las necesidades de agua aumentan en proporción al área foliar desplegada por la vid. Las vides más grandes y vigorosas requieren más agua que las vides pequeñas y más débiles. Sin embargo, el estrés hídrico suele ser más severo en un viñedo joven porque aquí las plantas tienen sistemas radiculares menos desarrollados (Goldammer, 2013). La velocidad de maduración de las bayas aumenta cuando el estado hídrico de la vid es bajo. Esto repercute en un aumento del contenido de antocianinas y taninos en las uvas (Van Leeuwen et al., 2003). El efecto del estrés hídrico sobre el contenido de azúcar del mosto depende del rendimiento. Con rendimientos bajos el déficit de agua de la vid aumenta el contenido de azúcares, mientras que con rendimientos altos lo reduce (Tregoat et al., 2002). El estrés hídrico también afecta al potencial aromático de la uva. Chapman et al. (2005) observaron que los vinos de Cabernet Sauvignon elaborados a partir de vides sometidas a estrés hídrico mostraban en el análisis sensorial puntuaciones significativamente más altas en el aroma frutal y de frutos secos, que los vinos elaborados a partir de vides regadas. En este mismo estudio, los vinos procedentes de un tratamiento de riego estándar fueron calificados mejor en aroma vegetal, aroma de pimiento morrón, aroma de pimienta negra y astringencia que los vinos de un tratamiento de riego mínimo, indicando que el déficit hídrico en la vid conduce a vinos con aromas y sabores más afrutados que un alto estado hídrico. Por otra parte, Des Gachons et al. (2005) indicaron que el potencial aromático de las uvas blancas puede disminuir en condiciones de estrés por déficit hídrico severo. 1.2.2. La deficiencia de hierro El hierro es un elemento esencial para las plantas, constituyente de los citocromos y enzimas implicados en la sintesis de la clorofila, la fotosíntesis, la respiración y la reducción de los nitratos (Medrano et al., 2010). La deficiencia de hierro en las plantas se denomina “clorosis férrica” o “clorosis cálcica” porque en la mayoría de los casos está inducida por un exceso de caliza en el suelo (Morlat et al., 1980). Los suelos calizos suponen el 39 % de la superficie total en el mundo con un total de 1.000 millones de hectáreas y es muy frecuente en el viñedo (Çelik y Katkat, 2010). Las altas concentraciones de bicarbonato y el elevado pH en estos suelos 32 reducen la disponibilidad de hierro y afectan también a los procesos metabólicos de asimilación en las plantas (Pestana et al., 2005). Debido a la baja movilidad del hierro dentro de la planta, los primeros síntomas de la carencia se aprecian en las hojas más jóvenes. Dichas hojas toman una tonalidad amarillenta, al principio, permaneciendo verdes las zonas próximas a las nervaduras (Del Campillo y Torrent, 1992). Si la carencia persiste, se llega a una decoloración total de las hojas, que acaban necrosando (Hidalgo y Hidalgo, 2011). En muchas ocasiones, el contenido de hierro en las hojas cloróticas, expresado sobre materia seca, es similar o incluso superior al de las hojas verdes. El hecho, conocido como “paradoja de la clorosis férrica”, es consecuencia de una acumulación de hierro fisiológicamente inactivo en las hojas afectadas, así como de un menor desarrollo de estas, lo que produce un efecto de concentración del elemento en los tejidos (Bavaresco et al., 1999; Römheld, 2000; Zaharieva y Römheld, 2000). La actividad fotosintética se ve reducida en las plantas afectadas por clorosis férrica según el contenido en clorofila va disminuyendo, con lo cual la carencia provoca un menor crecimiento vegetativo, área foliar y producción de materia seca (Bertamini y Nedunchezhian, 2005; Chen et al., 2004; Pestana et al., 2003; Tagliavini y Rombolà, 2001), así como problemas en el cuajado y en el desarrollo del fruto (Bavaresco et al., 2010; Hidalgo y Hidalgo, 2011). La carencia puede conducir a reducciones importantes del rendimiento y pérdidas de calidad de la uva (Álvarez-Fernández et al., 2006; Bavaresco et al., 2006). Bajo condiciones de clorosis férrica los mostos reducen los contenidos en azúcar y antocianos e incrementan la acidez total (Castino et al., 1987; Veliksar et al., 2005). Sin embargo, la restricción en el crecimiento vegetativo, con niveles de estrés por carencia de hierro de leve a moderado, puede tener efectos positivos en la calidad de la uva. Esta reducción del crecimiento genera un menor rendimiento y bayas más pequeñas, provocando una concentración de constituyentes como son los azúcares y los compuestos fenólicos (Balint y Reynolds, 2017; González et al., 2019). Bavaresco et al. (2005) detectaron que un nivel moderado de clorosis férrica puede mejorar la calidad del vino debido a cambios positivos en la composición de la uva en cuanto al pH, y los contenidos en sólidos solubles, antocianos y resveratrol. Estos autores relacionaron estos cambios con un peso medio del racimo y de la baya más bajos en las plantas afectadas. 33 1.3. CARACTERIZACIÓN DEL POTENCIAL ENOLÓGICO DE VIÑEDOS DE SECANO AFECTADOS POR DEFICIENCIA DE HIERRO Dentro de los viñedos de secano, la variación local en las condiciones del suelo, como la profundidad de la capa explorable por el sistema radicular, la textura, el pH o el contenido de caliza activa, pueden generar una amplia variabilidad espacial en el estado hídrico y/o en la disponibilidad de hierro para las plantas, afectando al rendimiento y a la composición de la uva (Li et al., 2006; Martín et al., 2007). La delimitación de zonas de viñedo en función del nivel de estrés, puede mejorar enormemente la gestión integral del cultivo en viticultura de precisión. La separación de la vendimia de diferentes zonas permite hacer distintas elaboraciones en bodega de acuerdo al potencial de calidad de la uva (Santos et al., 2012). Se han desarrollado diversas herramientas para monitorizar el estado hídrico del suelo y de las plantas individuales. Sin embargo, estas técnicas pueden no ser adecuadas para estudiar el estado hídrico de la vid a nivel de parcela o sub-parcela (Rienth y Scholasch, 2019; Van Leeuwen et al., 2011). La toma de muestras en el viñedo ayudará a conocer mejor la variabilidad entre las diferentes parcelas (Santos et al., 2012). Para su aplicación en viticultura de precisión es necesario aplicar técnicas simples, no destructivas, rápidas y económicas para evaluar así de una forma práctica el nivel de estrés en el viñedo, delimitar su variación espacial y evaluar su impacto (Kalaji et al., 2011; Tuccio et al., 2015). En las últimas décadas se ha producido un gran desarrollo de las técnicas de viticultura de precisión (Ammoniaci et al., 2021; Bramley, 2010; Sassu et al., 2021). Con ellas se abre la posibilidad de diseñar diferentes estrategias de gestión del viñedo basadas en la variación espacio-temporal del crecimiento vegetativo (Tardáguila et al., 2011), del rendimiento (Bramley y Hamilton, 2004) o de la composición de la uva (Bramley, 2005; Trought y Bramley, 2011). La composición de la uva en el momento de la vendimia muestra una mayor variabilidad espacial en los compuestos fenólicos y las antocianinas que en los azúcares y el pH (Bramley, 2005), mientras que los patrones de variación del rendimiento son estables en el tiempo y están impulsados por la variabilidad en la topografía y el suelo. El conocimiento de estos patrones de variación puede generar oportunidades para una gestión zonal más precisa y la realización de una vendimia selectiva (Agati et al., 2018). El vigor de las vides es un parámetro que se ve influenciado de forma determinante por el estado hídrico y el estrés por clorosis férrica. Su control asegura el equilibrio entre las fases 34 vegetativa y reproductiva, lo que a su vez repercute en la calidad de la uva (Mota et al., 2010). La gestión específica del vigor y del rendimiento en las parcelas de viñedo puede beneficiar enormemente al manejo del cultivo y aumentar la calidad de la uva (Bramley et al., 2011). La síntesis y acumulación de los compuestos fenólicos en las uvas durante la maduración dependen en gran medida de la capacidad fotosintética de la vid y la exposición de las uvas a la radiación solar (Rienth et al., 2021). La vid es rica en compuestos fenilpropanoides, como los flavonoides y los estilbenos, los cuales están presentes en la mayoría de los tejidos vegetales. Estos compuestos se describen como antioxidantes que se acumulan en respuesta al estrés biótico y abiótico (Tavares et al., 2013). En este sentido, Bavaresco et al. (2005) encontraron que las condiciones de estrés por deficiencia de hierro inducida en suelos calcáreos aumentaban los niveles de biosíntesis de antocianinas en los hollejos de las uvas. Los mecanismos bioquímicos involucrados no están claros, pero se puede especular que el hierro es parte constitutiva de las enzimas implicadas en la síntesis de la lignina, y su deficiencia puede derivar la vía del shikimato hacia la síntesis de otros compuestos fenólicos, incluyendo antocianinas. Las consecuencias de la clorosis férrica en la calidad de la uva están en función del nivel que alcance la fisiopatía en la campaña, y también en función de los efectos acumulativos de la misma que se manifiestan en las cepas año tras año, como la disminución progresiva del vigor (Martín et al., 2007). El efecto más obvio de la deficiencia de hierro es la disminución de las concentraciones de pigmentos fotosintéticos en las hojas de las plantas afectadas (Morales et al., 1990). Algunos instrumentos portátiles como por ejemplo el SPAD (Soil Plant Analysis Development) estiman el nivel de clorofila a partir de las diferencias en las absorbancias de las hojas a 650 nm y 940 nm (Minolta, 1989) y proporcionan una medición cuantitativa objetiva de la clorosis foliar asociada a la deficiencia de hierro (Ates y Kaya, 2021; Peryea y Kammereck, 1996). No obstante, el amarillamiento del tejido foliar puede ser causado por otros factores distintos a la clorosis férrica, como un drenaje insuficiente del suelo, ataques parasitarios u otras deficiencias nutricionales, como las de manganeso y zinc (Keller, 2005). Por esta razón, el contenido clorofílico foliar no debe ser la única herramienta para el diagnóstico de la clorosis férrica. Los procesos bioquímicos implicados en la fotosíntesis pueden ser modificados de manera diferencial por estreses ambientales, de forma que mientras algunos son inactivados o 35 regulados a la baja, otros permanecen relativamente inalterados. En el caso de la deficiencia de hierro, la reducción de la tasa fotosintética en las hojas cloróticas se ha relacionado con una reducción de la eficiencia de fotosistema II (Covarrubias et al., 2014; Morales et al., 2000), una variable que puede ser estimada mediante medidas de la fluorescencia de la clorofila. Estas medidas podrían ser una herramienta muy útil para detectar el estrés en las plantas en una etapa temprana, cuando no hay síntomas visibles. Las técnicas de medida de la fluorescencia de la clorofila no son invasivas y proporcionan información completa acerca de la eficiencia fotosintética, la integridad del aparato fotosintético y la tasa de transferencia de electrones (Baker y Rosenqvist, 2004; Maxwell y Johnson, 2000). El comportamiento de diferentes parámetros de la fluorescencia de la clorofila de las hojas en condiciones de clorosis férrica ha sido estudiado por numerosos autores (Allakhverdiev et al., 1987; Bavaresco et al., 2006; Bertamini et al., 2001, 2002; Heilemichael et al., 2016; Netto et al., 2005). Dobrowski et al. (2005) y Zarco-Tejada et al. (2013) han correlacionado la fluorescencia estacionaria, en condiciones de luz natural, con la fotosíntesis neta tanto en ensayos a nivel de hoja como con imágenes hiperespectrales, confirmando resultados anteriores, como los obtenidos por Flexas et al. (2000), en hojas de vides afectadas por estrés hídrico. En muchas zonas vitícolas de secano afectadas por clorosis férrica sería interesante avanzar en métodos para la caracterización de la variabilidad en el potencial enológico de la uva dentro del viñedo. Esto permitiría optimizar la gestión del cultivo en base al efecto combinado del déficit de hierro y del estado hídrico sobre los parámetros de calidad de la uva, delimitando zonas diferenciadas que se podrían vendimiar de forma separada. Así se podrían hacer elaboraciones diferentes con el objetivo de maximizar la calidad final del vino. 36 2. REFERENCIAS Abeysinghe, S. K., Greer, D. H. & Rogiers, S. Y. (2019). The effect of light intensity and temperature on berry growth and sugar accumulation in Vitis vinifera ‘Shiraz’under vineyard conditions. Vitis, 58(1), 7-16. Adir, N., Zer, H., Shochat, S. & Ohad, I. (2003). Photoinhibition–a historical perspective. Photosynthesis Research, 76, 343-370. Agati, G., Soudani, K., Tuccio, L., Fierini, E., Ben Ghozlen, N., Fadaili, E. M., Romani, A. & Cerovic, Z. G. (2018). Management zone delineation for winegrape selective harvesting based on fluorescence-sensor mapping of grape skin anthocyanins. 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OBJETIVOS El objetivo general de esta Tesis es evaluar el impacto de la carencia nutricional de hierro y el estado hídrico del viñedo en la composición química y en las características sensoriales del vino, aportando información útil para manejar, en el marco de la viticultura de precisión, la variabilidad espacial del potencial enológico en viñedos de secano afectados por clorosis férrica. Los objetivos específicos son: 1. Estudiar los efectos combinados de la incidencia de la clorosis por deficiencia de hierro y el estado hídrico del viñedo en el envero, sobre la composición y el perfil aromático de la uva Tempranillo. 2. Evaluar la viabilidad del contenido de clorofila foliar, medido en el envero, como herramienta para evaluar el potencial aromático de las uvas en viñedos de secano afectados por clorosis férrica. 3. Evaluar los efectos aditivos e interactivos de la incidencia de la deficiencia de hierro y el estado hídrico de la vid en el envero sobre la composición volátil y las características químicas y sensoriales del vino Tempranillo. 4. Estudiar las relaciones entre los parámetros de calidad del vino, el vigor de la vid, el tamaño y el grado de madurez de la uva en viñedos de secano afectados por clorosis férrica. 4. PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL El estudio se realizó durante los años 2016, 2017, 2018 y 2019, en 20 subzonas de viñedo de secano de la variedad Tempranillo con una edad de 15 a 20 años, ubicadas en Pesquera de Duero (Valladolid), dentro de la Denominación de Origen Protegida Ribera del Duero. Los suelos del área de estudio son calcáreos, muy básicos y pobres en materia orgánica, con alta variabilidad espacial en los contenidos extraíbles de potasio, fósforo y magnesio (ZarcoTejada et al., 2013). Las concentraciones de caliza activa (33-160 g/Kg) y hierro extraíble con ácido dietilentriaminopentaacético (2,3-6,4 mg/Kg) son muy heterogéneas dentro del área. Tales propiedades del suelo, junto con la presencia de un patrón sensible a la caliza como el 110-Richter, causaron diferentes niveles de clorosis por deficiencia de hierro en los viñedos, 64 desde no afectados hasta moderadamente afectados. Por otro lado, las diferencias en la topografía, la textura y las raíces explorables, y la profundidad de los suelos aseguraron una amplia variabilidad del estado hídrico de la vid dentro del área de estudio. Las subzonas estudiadas (10 m × 10 m cada una) se ubicaron dentro de 9,2 ha de viñedo, con 1,5 km de distancia máxima entre ellas. Los sitios se seleccionaron después de una evaluación visual previa de la variabilidad espacial en el tamaño y el color del dosel. Se eligieron diferentes topografías, profundidades y propiedades fisicoquímicas del suelo para asegurar la máxima variabilidad en el estado hídrico y nutricional en las subzonas, de acuerdo con los propósitos de la investigación. Las vides están dispuestas en espaldera con un marco de plantación de 3,0 m × 1,5 m (2.222 plantas/ha), podadas en cordón Royat doble, con una carga media de 16 yemas por cepa. El rendimiento promedio de las subzonas fue de 7.500 Kg/ha en 2016, 4.400 Kg/ha en 2017, 4.000 Kg/ha en 2018 y 5.800 Kg/ha en 2019. La zona de estudio tiene un clima mediterráneo continental, con bajas temperaturas en invierno y veranos calurosos y secos. La temperatura media anual es de 12,3 °C y la precipitación total anual es de 427 mm, de los cuales 71 mm corresponden a junio, julio y agosto. La temperatura media registrada en 2017 (12,7 °C) fue la más alta de los cuatro años de estudio, seguida de la de 2018 (12,2 °C), 2019 (12,1 °C) y 2016 (11,9 °C). Las precipitaciones acumuladas entre el 1 de abril y el 30 de septiembre registraron el mínimo de los cuatro años de estudio en 2017 (142 mm), seguidas de las registradas en 2019 (170 mm), 2016 (176 mm) y 2018 (267 mm). Sin riego, estos insuficientes suministros de agua en los suelos, generaron una amplia variabilidad del estado hídrico de la vid dentro del área. Durante los años de estudio, en el momento del envero, se obtuvieron los datos de contenido clorofílico foliar (Chl) y potencial hídrico foliar al amanecer (LWP), que se utilizaron como indicadores de los niveles de estrés hídrico y nutricional del viñedo. Las subzonas se clasificaron en cuatro grupos, cruzando valores altos y bajos de Chl y valores altos y bajos de LWP. Se tomaron como valores límite entre grupos la mediana de las dos variables. Los niveles de estrés hídrico y nutricional se relacionaron con los valores de vigor, rendimiento y composición de la uva, así como con las características químicas y organolépticas del vino. La vendimia se llevó a cabo cada año cuando el valor del contenido en sólidos solubles en el mosto llegó a los 22 °Brix en el conjunto de subparcelas. En ese momento se tomaron dos muestras de 100 uvas en cada zona de estudio. El mosto obtenido a partir de la primera muestra se utilizó para determinar los sólidos solubles, la acidez total, el nitrógeno fácilmente 65 asimilable, el pH, el contenido en potasio, la intensidad de color y el tono del mosto. Las uvas de la segunda muestra se usaron para analizar el contenido total de polifenoles, las antocianinas totales y las fácilmente extraíbles. Después de la vendimia, 30 kg de uvas de cada subzona se vinificaron siguiendo un esquema clásico de vinificación en tinto. Se recogieron 300 mL de mosto de uva despalillada/estrujada de cada muestra, para la determinación de los compuestos aromáticos volátiles del mosto. En los vinos elaborados se determinó la acidez total, el pH, el grado alcohólico, las coordenadas CIELAB, el índice de polifenoles totales y los compuestos volátiles. Los vinos se sometieron a un análisis sensorial llevado a cabo por un panel de catadores previamente entrenado. Para determinar los efectos del año, el estado hídrico y la incidencia de clorosis férrica sobre las variables agronómicas del viñedo y las características de mostos y vinos se realizaron análisis multifactoriales de la varianza (ANOVA), empleando el test de comparación de medias de Tukey. Se usaron análisis de componentes principales y coeficientes de correlacion de Pearson para estudiar las relaciones entre variables. 66 5. ESTRUCTURA La Tesis se ha dividido en tres capítulos. En el primer capítulo se estudiaron los efectos combinados de la incidencia de la clorosis férrica y el estado hídrico del viñedo en el envero, sobre el perfil aromático (compuestos libres y ligados) de las uvas Tempranillo y se evaluó la viabilidad de la medición de la clorofila foliar en el envero, para determinar la calidad aromática de la uva en viñedos de secano afectados por clorosis férrica, de acuerdo con los objetivos 1 y 2 de la Tesis. En el segundo capítulo se investigaron los efectos de la incidencia de la clorosis férrica en el viñedo sobre la composición volátil y las características sensoriales de los vinos Tempranillo (objetivo 3 de la Tesis). En el tercer capítulo se evaluaron los efectos aditivos e interactivos de la incidencia de la deficiencia de hierro y el estado hídrico de la vid en el envero sobre las características químicas y sensoriales del vino Tempranillo, y se estudiaron las relaciones entre la calidad del vino y el vigor de la vid y el tamaño y la madurez de la uva en viñedos de secano afectados por clorosis férrica (objetivos 3 y 4 de la Tesis). 67 5.1 . Capítulo 1. Composición aromática de la uva Tempranillo en viñedos afectados por clorosis férrica y estrés hídrico. Sánchez, R., García, M. R. G., Vilanova, M., Rodríguez-Nogales, J. M. & Martín, P. (2020). Aroma composition of Tempranillo grapes as affected by iron deficiency chlorosis and vine water status. Scientia Agricola, 78, e20190112. DOI: 10.1590/1678-992X-2019-0112 68 5.2. Capítulo 2. Composición volátil y propiedades sensoriales de vinos procedentes de viñedos afectados por clorosis férrica. Sánchez, R., Rodríguez-Nogales, J. M., Fernández-Fernández, E., González, M. R., MedinaTrujillo, L. & Martín, P. (2022). Volatile composition and sensory properties of wines from vineyards affected by iron chlorosis. Food Chemistry, 369, 130850. DOI: 10.1016/j.foodchem.2021.130850 69 5.3. Capítulo 3. Relaciones entre el contenido de clorofila foliar de la vid, el potencial hídrico de la hoja antes del amanecer en el envero y los atributos químicos y sensoriales del vino. Sánchez, R., González, M. R., Fernández‐Fernández, E., Rodríguez‐Nogales, J. M. & Martín, P. (2020). Relationships between chlorophyll content of vine leaves, predawn leaf water potential at veraison, and chemical and sensory attributes of wine. Journal of the Science of Food and Agriculture, 100(14), 5251-5259. DOI: 10.1002/jsfa.10575 70 6. CONCLUSIONES  Los resultados obtenidos muestran que las zonas más afectadas por clorosis férrica dieron lugar a mostos con una menor acidez total, menor concentración en nitrógeno fácilmente asimilable y mayor contenido de polifenoles totales que las subzonas menos afectadas. Por su parte las subparcelas con estado hídrico más desfavorable mostraron mayor contenido en potasio, en antonicianinas extraíbles e intensidad de color.  Las uvas procedentes de vides con mayor nivel de estrés hídrico o por carencia de hierro restringieron las concentraciones de los alcoholes C6 y alcanzaron niveles de madurez aromática más favorables que las uvas de plantas menos estresadas. Se ha demostrado, además, que una deficiencia de hierro de leve a moderada puede tener efectos positivos en la calidad aromática de la uva, con un aumento de la biosíntesis de los norisoprenoides C13 y los fenoles volátiles, independientemente de su impacto en el crecimiento vegetativo, el rendimiento o el tamaño de la baya. • Los resultados presentados confirman que el estrés por deficiencia de hierro de leve a moderado en el viñedo puede contribuir a mejorar la calidad del vino, disminuyendo el pH y mejorando los atributos sensoriales de tonalidad e intensidad de la capa, intensidad del sabor y persistencia en boca. En este contexto, las medidas del contenido foliar de clorofila en el envero podrían ser de gran utilidad para distinguir subzonas con diferente potencial de calidad en viñedos afectados por deficiencia de hierro. • En comparación con la incidencia de clorosis férrica, el estado hídrico de la vid tuvo poco impacto en la composición y características cromáticas del vino en el área de estudio. En cuanto a los parámetros sensoriales, las subparcelas con bajo LWP mostraron puntuaciones más altas en los descriptores de limpidez, astringencia y persistencia en boca.  Los efectos de interacción detectados entre estado hídrico y nivel foliar de clorofila en envero sugieren que el aumento del color rojo, de la astringencia y de la persistencia en boca del vino asociados a la incidencia de la clorosis férrica podrían verse restringidos si el déficit hídrico es elevado. 71 • Las variables de composición y los atributos sensoriales de los vinos, en general, no se correlacionaron con el tamaño de la baya ni con el grado de madurez tecnológica de la uva en el área de estudio. • Un nivel moderado de estrés por deficiencia de hierro en la vid aumentó las concentraciones de compuestos orgánicos volátiles asociados a notas florales, como el 2-fenilacetaldehído, el 2-feniletanol y el acetato de 2-feniletilo en los vinos, y redujo la presencia de los alcoholes C6, responsables del aroma verde-herbáceo. Como efecto negativo, los vinos de zonas afectadas por clorosis férrica redujeron la concentración de ésteres. Estos resultados pueden ser de utilidad para evaluar el potencial de calidad de los viñedos afectados por clorosis férrica. 72