Estudio unicéntrico de fase II comparando doxiciclina oral frente a placebo en pacientes con pterigión. Efectos celulares de la doxiciclina en el pterigión

CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DE LA RIOJA TESIS DOCTORAL: ESTUDIO UNICÉNTRICO DE FASE II COMPARANDO DOXICICLINA ORAL FRENTE A PLACEBO EN PACIENTES CON PTERIGIÓN. EFECTOS CELULARES DE LA DOXICICLINA EN EL PTERIGIÓN. Presentada por Óscar Rúa Galisteo para optar al grado de doctor por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Dr. Ignacio Larráyoz Roldán Dra. Sara Velilla Osés PROGRAMA VISIÓN LA DE CIENCIAS EN DOCTORADO DE A mi padre, por ser un referente en mi vida. ÍNDICE AGRADECIMIENTOS ACRÓNIMOS FINANCIACIÓN DIVULGACIÓN CIENTÍFICA 1JUSTIFICACIÓN 6 2 - HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 01 2.1HIPÓTESIS 10 2.2OBJETIVOS 10 Durante estos años han nacido mis dos hijas, Amalia y Ágata, la mayor alegría de mi vida. Gracias al apoyo de mi mujer, Carmen, he podido dedicar tiempo a la realización de esta tesis sin ella no hubiera sido posible. Gracias a mis padres, Antonio y Carmen, por su apoyo durante toda mi vida, en especial a mi padre que falleció hace unos meses. ¡Gracias papa! No lo habría conseguido sin todos vosotros. MUCHAS GRACIAS. ACRÓNIMOS ———————————————————— βFGF factor de crecimiento básico de fibroblastos AEMPS Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios AIF factor inductor de apoptosis Akt protein-quinasa B ANOVA análisis de la varianza BAX proteina X asociada a Bcl-2 Bcl-2 B-cell lymphoma 2 bFGF factor de crecimiento básico de fibroblastos CAT catalasa CD cluster of differentiation cDNA ácido dexosirribonucleico copia CGRP gen de la calcitonina CHOP proteína homóloga C / EBP cNOS óxido nítrico sintetasa constitutiva CNTF factor ciliar neurótico CNV neovascularización coroidea Cols colaboradores COX ciclooxigenasa DAPI 4 ',6-diamino-2-fenilindol DMAE degeneración macular asociada a la edad DNA ácido desoxirribonucleico DIVAA modelo de angiogénesis dirigido in vivo EGF factor de crecimiento epidérmico ER retículo endoplasmático ErbB homólogos eritroblásticos ERSE potenciador del estrés del retículo endoplasmático EudraCT European Union Drug Regulating Authorities Clinical Trials FAK quinasa de adhesión focal FDA administración federal de Alimentos y Medicamentos Americana FDR tasa de descubrimientos falsos FGF factor de crecimiento de los fibroblastos FITC-d isotiocianato de fluoresceína-dextrano GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GSH-Px glutation peroxidasa GSK3-β glucógeno sintasa quinasa 3-beta HBEGF factor de crecimiento epidérmico vinculado a la heparina HLA antígeno de histocompatibilidad HMG-CoA hidroximetilglutaril-coenzima A-reductasa hOGG1 8-oxoguanina glicosidasa humana HPV virus del papiloma humano HSV virus herpes simple H2O2 peróxido de hidrógeno ICAM molécula de adhesión intercelular Ig inmunoglobulina IGF1-BP2 factor de crecimiento insulínico IL interleuquina iNOS óxido nítrico sintetasa inducible LDL lipoproteína de baja densidad MANF factor mesencefálico neurotrófico derivado de astrocitos MAPK protein quinasa activadora de mitógenos MDA malondialdehído MIB antígeno nuclear de células-ciclo-asociado MKI67 antígeno identificado mediante el anticuerpo monoclonal Ki-67 MMC mitomicina C MMP metaloproteinasa MIP proteínas inflamatorias de macrófagos MPTP poro de transición de permeabilidad mitocondrial mRNA ácido ribonucleico mensajero NEK quinasa relacionada con NIMA NF-kB factor nuclear kappa B NGF factor de crecimiento nervioso NK1R receptor de la sustancia P NO oxído nítrico NOS óxido nítrico sintetasa NO3nitrato O2anión superóxido p proteína PBS tampón fosfato salino PCNA antígeno nuclear de células en proliferación PCR reacción en cadena de la polimerasa PDGF factor de crecimiento derivado de plaquetas PEDF factor de crecimiento derivado del epitelio pigmentario de la retina PG prostaglandina PI3K fosfatidilinositol 3-quinasa qRT-PCR reacción de cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real RNA-ss ácido ribonucleico monocatenario negativo ROS especies reactivas derivadas del oxígeno RPKM lecturas por base de kilo por millón SCF factor de crecimiento de células madre SOD superóxido dismutasa SP sustancia P TGF-β factor de crecimiento transformante beta TIMP inhibidor tisular de la metaloproteinasa TNF-α factor de necrosis tumoral alfa tRNA ácido ribonucleico de transferencia TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling UPR respuesta de la proteína desplegada UPRE elemento de respuesta a proteínas desplegada uPA receptor activador del plasminógeno de la uroquinasa UV ultravioleta VEGF factor de crecimento del endotelio vascular VCAM molécula de adhesión vascular celular 8-OHdG 8-hidroxideoxiguanosina FINANCIACIÓN ———————————————————— Este trabajo de investigación ha sido posible gracias al apoyo económico recibido del Ministerio de Sanidad de España, Política Social e Igualdad, N º DIN-021 año 2009. DIVULGACIÓN CIENTÍFICA ——————————————————— Este trabajo ha dado lugar a las siguientes publicaciones, que se puede encontrar como Anexo I, Anexo II y Anexo III: ILarráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, Martínez A. Molecular effects of doxycycline treatment on pterygium as revealed by massive transcriptome sequencing. PLoS One. 2012;7(6):e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359. Epub 2012 Jun 19. PubMed PMID: 22724003; PubMed Central PMCID: PMC3378547. IF (impact factor) 3.53. Cuartil 1º. IIRúa O, Larráyoz IM, Barajas MT, Velilla S, Martínez A. Oral doxycycline reduces pterygium lesions; results from a double blind, randomized, placebo controlled clinical trial. PLoS One. 2012;7(12):e52696. doi: 10.1371/journal.pone.0052696. Epub 2012 Dec 19. PubMed PMID: 23285154; PubMed Central PMCID: PMC3526544. IF 3.53. Cuartil 1º. IIILarráyoz IM, Rúa O, Velilla S, Martínez A. Transcriptomic profiling explains racial disparities in pterygium patients treated with doxycycline. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Oct 30;55(11):7553-61. doi: 10.1167/iovs.14-14951. PMID: 25358733. IF 3.66. Cuartil 1º. Y a las siguientes comunicaciones a congresos: 1Óscar Rúa, Sara Velilla, Alfredo Martínez, Iñaki Larráyoz. Título: “La doxiciclina oral reduce el pterigión. Resultados de un ensayo clínico doble ciego, randomizado y controlado”. Primer premio de comunicación libre en el XXXIV congreso de la Asociación Oftalmológica del Norte (AON) celebrado en Bilbao del 23 al 24 de noviembre del 2012 con premio a la mejor comunicación. 2Óscar Rúa. Títulos: “Estudio unicéntrico fase II: doxiciclina frente a placebo en el pterigión” y “Estudio unicéntrico fase II: efectos de la doxiciclina en la angiogénesis ocular”. Comunicaciones libres en el 88 Congreso de la Sociedad Española de Oftalmología (SEO) celebrado en Barcelona del 26 al 29 de septiembre del 2012. 1JUSTIFICACIÓN ———————————————————— 3INTRODUCCIÓN ——————————————————— 14 3.1.1-Morfología e histología El pterigión es un proceso inflamatorio y degenerativo de la superficie ocular atribuido, principalmente, a una exposición crónica a la radiación UV-B 1. Clínicamente el pterigión implica un crecimiento centrípeto, asociado a inflamación y neovascularización 8. El pterigión es frecuente, benigno, de forma triangular y exclusivo de los humanos. Conceptualmente, la histología del pterigión consiste en una masa de tejido conectivo subepitelial que ha sufrido degeneración elastótica dispuesto sobre un fondo de degeneración hialina 9. La proliferación del tejido conectivo junto con la presencia de angiogénesis provoca un crecimiento elastótico y de conjuntiva anormal sobre la córnea 8. Al estudiar la córnea invadida por el pterigión, cerca de la membrana de Bowman existe una proliferación de las células madres limbares epiteliales originarias, así como una invasión vascular del tejido corneal y una remodelación de las MMPs con destrucción de la membrana de Bowman 9. Tan y colaboradores 10 describieron un sistema de clasificación del pterigión basado en la visibilidad de los vasos epiesclerales como indicador del grosor de la lesión. Según estos investigadores el pterigión se clasifica en: - Atrófico (T1, vasos epiesclerales visibles). - Intermedio (T2, vasos epiesclerales parcialmente borrados). - Carnoso (T3, vasos epiesclerales ocultos). El examen con lámpara de hendidura revela tres áreas bien distintas del pterigión: la cabeza, el cuello y el cuerpo 11. 3.1PTERIGIÓN 15 La cabeza es un área grisácea, plana y avascular situada en el ápex. En el borde anterior de la cabeza se aprecia una línea pigmentada epitelial férrica, llamada línea de Stocker, que aparece en los casos de larga evolución y no en el pterigión de aparición rápida. El cuello conecta la cabeza y el cuerpo, y aquí se encuentran neovasos finos incipientes y anastomóticos. El cuerpo se localiza en la conjuntiva bulbar con vasos rectos y radiales respecto al ápex del pterigión. La cabeza del pterigión se adhiere firmemente a la córnea, pero el cuerpo se puede separar de las capas superficiales del globo ocular. Entre los signos de actividad del pterigión destaca la presencia de pequeñas opacidades grisáceas en la membrana de Bowman que se anteponen a la cabeza del pterigión, son las llamadas islas de Fuchs que, con el tiempo, se multiplican y progresan hacia el centro de la córnea. Son signos de actividad la mayor vascularización, la congestión, la falta de transparencia y las manchas en el epitelio corneal. 3.1.2-Epidemiología La prevalencia del pterigión varía ampliamente según la población estudiada. En uno de los estudios más recientes 12 se comparó la prevalencia del pterigión entre la raza Han y la Uygur en China, la prevalencia global fue del 11.95% siendo mayor la prevalencia en la raza Han. El metaanálisis más reciente sobre la prevalencia del pterigión se publicó en 2013 incluía 20 estudios con un total de 900545 pacientes, la prevalencia del pterigión fue del 10.2% 13. Dos trabajos recientes informan de prevalencias del 17,9% en ancianos mongoles de China 14 y del 19,6% en mayores de 40 años de Myanmar 15. En España también se realizó en 2010 un estudio de prevalencia, concretamente en O Salnés, comarca costera de la provincia de Pontevedra, se incluyeron 619 pacientes y la prevalencia fue del 5,9% 16. 16 En un estudio del 2013 17 realizado en China con 6685 pacientes la prevalencia del pterigión fue del 6% . En otro estudio del 2012 18 realizado también en China con 8906 pacientes de tres etnias distintas: malayos, indios y chinos la prevalencia fue del 10.1%. La prevalencia fue del 15.5% en malayos y del 7% en indios y chinos. Este estudio de personas asiáticas de diferentes razas que viven en la misma zona geográfica indica que la raza puede ser un factor de riesgo significativo para la aparición del pterigión. Otro estudio realizado en la India en 2013 19 sobre 4711 pacientes la prevalencia fue del 12.9%. Los estudios realizados en hispanos son muy escasos. El más reciente de ellos, realizado en 2009 en Arizona 20 entre 4774 latinos fue del 16%, 23.7% en los hombres y 11.5% en las mujeres (Tabla 1). ESTUDIO PAIS N E P CHEN y cols 12 China 4617 >30 11,95 LIU y cols 13 - 900545 - 10,2 LU y cols 14 China 2486 >40 17,9 DURKIN y cols 15 Myanmar 2481 >40 19,6 VISO y cols 16 España 619 >40 5,9 SUN y cols 17 China 6685 >40 6 ANG y cols 18 China 8906 >40 10,9 NANGIA y cols 19 India 4711 >30 12,9 WEST y cols 20 EEUU (latinos) 4774 >40 16 Tabla 1. Prevalencia de pterigión en estudios recientes basados en la población. N: número de pacientes, E: edad (años), P: prevalencia (%). 17 Parece existir una asociación positiva entre mayor edad y presencia de pterigión 12, también una mayor prevalencia en hombres 21. Un metanálisis reciente 22 sobre una población de 95279 pacientes encontró una reducción en el riesgo de presentar pterigión en los fumadores respecto a los no fumadores. Los estudios citados encuentran diferencias en los parámetros raza, latitud y exposición solar; pero generalmente la prevalencia en los trópicos es mayor que en otras latitudes y es claramente inferior en descendientes europeos que en los descendientes africanos. 3.1.3Patogénesis El crecimiento del pterigión se produce a partir del epitelio limbar que invade la córnea de forma centrípeta estando la radiación UV-B implicada en su etiología 8. La contribución de los mediadores inflamatorios, mecanismos inmunológicos, factores de crecimiento, estímulos angiogénicos y la modulación de la matriz extracelular son probablemente factores secundarios en la patogénesis del pterigión. Los estudios clínicos se han centrado principalmente en las características clínicas y en el tratamiento quirúrgico del pterigión. Últimamente se han logrado considerables progresos en el estudio de la patogénesis del pterigión proporcionando avances en el conocimiento de esta compleja enfermedad. Estos estudios recientes implican mecanismos antiapoptóticos, mecanismos inmunológicos, citoquinas, factores de crecimiento, moduladores de la matriz extracelular, factores genéticos, infecciones virales y otras posibles causas 8, 23. 18 3.1.3.1-Estrés oxidativo Como se ha comentado anteriormente, la exposición crónica a la radiación UVB es la principal causa desencadenante del pterigión 24 y la relación entre la exposición a radiación UV y el pterigión está bien establecida en estudios epidemiológicos 23. Un estudio ha mostrado fluorescencia en el limbo nasal en los pacientes con pterigión 25. Estos cambios pueden representar la primera evidencia de daño precoz en la superficie ocular provocado por exposición al sol. La exposición a radiación UV conlleva un mayor estrés oxidativo, el cual causa daño genético y estimulación de mediadores inflamatorios, desembocando en un estado hiperproliferativo 23. Tras la exposición a la radiación UV-Β, la expresión de varias moléculas claves se incrementa, tales como las citoquinas, los factores de crecimiento y las MMPs, que participan probablemente en las fases inflamatoria, proliferativa y de remodelación de esta enfermedad 23. Otros estudios sobre los efectos de UV-B en el pterigión y en las células epiteliales del pterigión en cultivo 26, 27 han demostrado que la inducción de las citoquinas, de los factores de crecimiento y de las MMPs producen la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la activación de las vías de proteínaquinasa activadas por mitógenos (MAPK). La activación del receptor del EGF y de las MAPK inicia la inducción de factores de transcripción de la misma vía, tales como el factor nuclear-kappa B (NF-kB). El NF-kB media la activación de algunas de las respuestas celulares a la radiación UV y al estrés hiperosmótico. Para las células cultivadas del pterigión la vía MAPK se activa por la exposición a la radiación UV-B. El NF-kB es un mediador clave de la expresión de IL-1β y p53 28 que desempeñan papeles importantes en el desarrollo del pterigión. El NF-kB también se suprime por el ácido retinoico, que también inhibe la IL-6 y la IL -8 en las células epiteliales de pterigión irradiadas con UV. Torres y cols 27 analizaron los cambios en las vías del MAPK y NF-kB en el pterigión y, por primera vez, en la conjuntiva ipsilateral libre de pterigión. Los datos obtenidos apoyan el componente inflamatorio en la patogénesis del pterigión. 19 La radiación UV actúa directamente por fototoxicidad o indirectamente a través de los radicales libres. Dentro de la célula, el daño oxidativo produce radicales libres que actúan sobre macromoléculas tales como las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos. Los radicales libres generados en el tejido incluyen el anión superóxido (O 2 - ), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el peroxinitrito (NO3 - ), que pueden ser neutralizados por enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT), y la glutatión peroxidasa (GSH-Px). El sistema antioxidante y la cantidad de radicales libres se mantienen en un cierto estado de homeostasis. Cuando los factores exógenos o endógenos aumentan el estrés oxidativo, la homeostasis se ve perturbada y los radicales libres desnaturalizan muchas moléculas intracelulares básicas como los ácidos nucleicos, las proteínas y los lípidos. El estrés oxidativo conlleva una sobreexpresión de algunos mediadores de crecimiento del pterigión. Una forma de cuantificar este daño es midiendo la 8hidroxideoxiguanosina (8-OHdG) que es un marcador usado para la identificación del daño oxidativo en el ácido dexosirribonucleico (DNA) y se ha encontrado en algunos estudios en el tejido del pterigión 1. La 8-oxoguanina glicosilasa 1 humana (hOGG1) es el enzima que metaboliza la 8OHdG y también se sobreexpresa en el pterigión 29. El estrés oxidativo se manifiesta con el aumento del nivel de malondialdehído (MDA), que es un producto de la descomposición de las cadenas de ácidos grasos esenciales insaturados obtenidos principalmente a través del mecanismo de oxidación, y la reducción de la actividad de las enzimas antioxidantes SOD, CAT y GSH-Px. En un estudio reciente 1 se observó que el aumento significativo de MDA siempre acompaña a una disminución significativa en la actividad de SOD, CAT y GSH-Px , lo que nos lleva a pensar que el estrés oxidativo es un mecanismo importante en el desarrollo del pterigión. El MDA se acepta como un marcador fiable de la peroxidación lipídica que se produce como resultado del estrés oxidativo. Existen evidencias de que la producción de óxido nítrico (NO) se incrementa por la acción de la óxido nítrico sintetasa (NOS) incrementada por la exposición a radiación UV. 20 La NOS tiene tres isoformas, dos son constitutivas (cNOS) y la tercera es inducible, sintetasa de oxido nítrico inducible (iNOS). También es evidencia de estrés oxidativo en el pterigión la presencia de la iNOS y la reducción en la cantidad de antioxidantes. La iNOS es insensible al calcio. Hay que tener en cuenta que, habitualmente, la inducción de la iNOS sucede en un ambiente oxidativo, por lo que los altos niveles de NO producidos por la iNOS pueden reaccionar con el anión O2 formando NO3 , que provoca toxicidad . También se sabe que la radiación UV aumenta la liberación de NO por medios no enzimáticos. Parece posible que los altos niveles de NO sea un factor de incremento del estrés oxidativo por medio de su influencia oxidante y de apoptosis. Las ROS, los factores de crecimiento y diversas citoquinas, como la ciclooxigenasa 2 (COX2), desempeñan un papel conocido en el desarrollo de cánceres de piel bajo la influencia de la radiación UV 1. En un reciente estudio se ha demostrado que la SERPINA3K , una proteinasa inhibidora de la serina, suprime la proliferación celular y la migración de las células epiteliales del pterigión, a través del bloqueo de las ROS 30. La mayor actividad de las citoquinas causada por la radiación UV parece ser un posible mecanismo de aumento del NO. En un estudio reciente 1 se evaluó el NO, las enzimas del sistema antioxidante y la peroxidación de lípidos juntos por primera vez, mostrando que el estrés oxidativo juega un papel importante en la etiopatogenia del pterigión. No se puede olvidar, sin embargo, que si la radiación UV es un factor importante en la patogénesis de estrés oxidativo, la inflamación crónica también desempeña un papel importante en el estrés oxidativo ya que éste aumenta apreciablemente con la inflamación. Kim y cols 31 informaron de una mayor expresión de las proteínas ALDH3A1, PDIA3 y PRDX2 en el pterigión, son proteínas conocidas por su importante relación con el estrés oxidativo. El estudio concluye que la exposición a radiación UV y el estrés oxidativo resultante conduce a un aumento de los niveles de estas proteínas, que proporcionan resistencia a la apoptosis inducida por radiación UV y desemboca en un estado hiperproliferativo. 1 - - 27 3.1.3.3-Mediadores inflamatorios Los mediadores inflamatorios parecen asociarse con el desarrollo y crecimiento del pterigión. La exposición a ra diación UV induce a las iquim oquinas, interleuquinas y a los factores de crecimiento a activar las células inflamatorias y la neovascularización. La IL-1, IL-6, IL-8 y el factor alfa de necrosis tumoral (TNFα) se incrementan en el pterigión después de la exposición a radiación UV induciendo la expresión de MMP 26, mientras que la IL-4 puede mediar en la fibrosis de las lesiones recurrentes 50. El TNFα es una citoquina liberada por células del sistema inmune. Su estimulación está relacionada con otros mediadores celulares como la IL-1 y las endotoxinas bacterianas. El TNF-α ejerce distintas funciones en diferentes órganos, una de estas funciones es la activación de la producción de otros mediadores como las IL1 o la IL6. La liberación de TNF-α produce activación local del endotelio vascular, liberación de NO con vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular, que conduce al reclutamiento de células inflamatorias, inmunoglobulinas y complemento, provocando la activación de los linfocitos T y B. También aumenta la activación y adhesión plaquetaria y, probablemente, la oclusión vascular resultante sea la causa de la necrosis tumoral, de donde proviene su nombre. Las funciones del TNF-α se deben a su unión a dos receptores celulares diferentes que se localizan en neutrófilos, células endoteliales y fibroblastos. Además, estos receptores se encuentran en estado soluble en el suero y en el líquido sinovial 26. La IL-1 se incrementa con la exposición a radiación UV lo que contribuye a la sobrerregulación de otros mediadores inflamatorios y de las MMPs y potencialmente a la patogénesis del pterigión 8. La IL-8 es una citoquina de la familia de las quimioquinas de naturaleza proinflamatoria. Su síntesis se realiza en fibroblastos, células endoteliales, monocitos y macrófagos. Es un potente factor quimiotáctico de neutrófilos, regula la producción de proteínas de adhesión y la formación de lípidos bioactivos. Es una citoquina proinflamatoria que amplifica la respuesta inflamatoria local, multifuncional, con actividad angiogénica, de quimiotaxis de neutrófilos y de actividad proliferativa de queratocitos. También ha demostrado inducir la producción de MMPs. 28 La IL-6 es una glucoproteína proinflamatoria sintetizada por los macrófagos, células T, células endoteliales y fibroblastos. Localizada en el cromosoma 7, su liberación está inducida por la IL-1 y el TNF-α. Al igual que la IL-8, las IL-6 también pueden inducir la expresión de MMPs y también existen evidencias de que la producción de estas citoquinas puede ser inducida por la radiación UV 26 . La COX es una enzima que permite al organismo producir prostaglandinas a partir del ácido araquidónico. La COX2 tiene como función mediar en los procesos de inflamación y en la señalización por prostanoides. La COX2 produce prostaglandina E2 que juega un papel importante en la angiogénesis inducida por citoquinas inflamatorias. Si bien la COX1 se expresa constitutivamente en la mayoría de tipos de células y tejidos, la COX2 es inducida por los factores de crecimiento, las citoquinas, las endotoxinas bacterianas y por el daño tisular. La COX2 también está implicada en la patogénesis de los tumores de piel en respuesta al estrés oxidativo generado por la radiación UV. La COX2 puede mediar el incremento de MMP-1 y de MMP-9 a través del aumento de la lipocalina 2 (NGAL) y puede contribuir también a la elevada expresión de las MMPs en el pterigión. Recientemente, se vio que la COX2 mediaba en el incremento de los niveles de VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular) en la inflamación crónica y en diversos tumores 51-54. La COX2 se sobreexpresa en el pterigión promoviendo el aumento de prostaglandinas y de la cascada inflamatoria 55, también esta sobreexpresión de la COX2 se asocia con el factor antiapoptótico survivina 37. Algunos estudios recientes indican que la expresión de la COX2 en el pterigión influye en la patogénesis de la enfermedad y en el pronóstico después de la resección quirúrgica 37, 55-57. Chiang y cols 55 encontraron que más del 80% de los pterigiones estudiados mostraron expresión positiva de la COX2 en la capa epitelial. Sin embargo, no encontraron ninguna expresión de la COX2 en la capa estromal. Estudios posteriores de Karahan y cols 57 y Maxia y cols 37 encontraron expresión de la COX2 en la capa epitelial de pterigión primario, del 84,2% en el estudio de Karahan y del 67,7% en el estudio de Maxia. También informaron de la expresión COX2 en las capas estromales, localizadas en capilares y células inflamatorias. La alta expresión de la COX2 se sugirió como un factor de riesgo para la recurrencia del pterigión 55-57. En un estudio reciente, 9 de 17 pterigiones 29 (52,9%) expresaron COX2 en la capa epitelial y el 100% expresaron la COX2 en la capa estromal, especialmente en los macrófagos infiltrantes de la lesión 58. La heterogeneidad en la expresión epitelial de la COX2 puede estar relacionada con el estado inflamatorio de la superficie ocular. Sin embargo, el hallazgo constante en el estroma de la COX2 sugiere que estas células están estrechamente relacionadas con la patogénesis y/o el mantenimiento del pterigión. La coexpresión de la COX2 y el VEGF en varios tumores ha sido descrita previamente 53, 59, 60. La prostaglandina E2 (PGE2), producto de la actividad COX2, también es angiogénica por influencia directa sobre las células endoteliales o mediante la inducción de la liberación de factores de crecimiento angiogénicos, tales como el receptor activador del plasminógeno de la uroquinasa (uPA), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el VEGF 61. La fosfolipasa D es una enzima localizada en la membrana plasmática que hidroliza el lípido fosfatidilcolina a ácido fosfatídico (que queda alojado en la membrana) y colina (hidrosoluble y capaz de difundir en el citosol). Este ácido es hidrolizado rápidamente por parte de la ácido fosfatídico fosfohidrolasa, dando lugar a diacilglicerol, el cual es un compuesto clave en las rutas de señalización celular. Un incremento en la fosfolipasa D, que está implicada en la inflamación y la diferenciación celular, se puede también encontrar en el pterigión 62. Las proteínas S100A son una familia de pequeñas proteínas dimérica que e unen a calcio. El heterodímero S100A8 / A9 se expresa abundantemente en la superficie ocular y parece participar en la patogénesis de diversas enfermedades de la superficie ocular, tales como el ojo seco, la angiogénesis corneal y el pterigión 63, 64. En un reciente estudio 65 se encontró proteína S100A6 en la capa epitelial y estromal del pterigión y también en el epitelio conjuntival normal. Las proteínas S100A8 y A9 se localizaron en niveles muy altos en el epitelio del pterigión y en mucha menor medida en el epitelio conjuntival normal. La proteína S100A11 se expresó en las células basales del epitelio conjuntival, pero sólo en las capas suprabasales de epitelio del pterigión. El estudio concluyó que las proteínas S100A6, A8 y A9 se sobreexpresaban en el tejido de pterigión en comparación con la conjuntiva normal. Además, se observó una clara alte- 30 ración de la localización de la expresión de S100A11 en el epitelio pterigión en comparación con el conjuntiva. En otro estudio 66 se quería determinar si la naturaleza inflamatoria del pterigión se reflejaba en los componentes proteicos de las lágrimas. En comparación con las lágrimas de los ojos de control (sin pterigión u otras anomalías), el nivel de la proteína S100A8 aumentó en los pacientes con pterigión un promedio de 4,5 veces y la proteína S100A9 se incrementó un promedio de 2,3. Se concluyó que la expresión regulada por el incremento de α-defensinas humanas, S100A8 y A9 en las lágrimas de pacientes con pterigión sugiere que estas proteínas pueden ser parte de la respuesta inflamatoria de la superficie ocular, o una respuesta al proceso de fibrovascularización del pterigión. Estos marcadores se sugirieron también como posibles indicadores para predecir la recurrencia después de la cirugía de pterigión. A pesar de su importancia en la evolución de la lesión, probablemente los mediadores inflamatorios se elevan secundariamente en el pterigión y no son la causa primaria de su aparición. 3.1.3.4Mecanismos inmunológicos Es importante señalar que la cantidad de células T inflamatorias en el pterigión no se correlaciona con los parámetros clínicos ni con la severidad de la inflamación ni con el uso de esteroides tópicos ni antiinflamatorios no esteroideos 67. Esto implica que la inflamación no actúa sola y que otros factores pueden contribuir a la recurrencia del pterigión. Los mecanismos inmunológicos pueden jugar un papel importante en la patogénesis del pterigión dada la presencia en éste de linfocitos T, células plasmáticas, células cebadas, células de Langerhans, monocitos, macrófagos, imnunoglobulinas (Ig G e IgE) , expresión aberrante del antígeno leucocitario humano (HLA-DR) en el epitelio del pterigión y la sobreexpresión de las moléculas de adhesión vascular celular -1 (VCAM-1) y de las moléculas de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) 8. El pterigión muestra niveles elevados de señales celulares y moléculas de adhesión. En un estudio reciente 68, se ha detectado una elevada infiltración de linfocitos CD4 y 31 CD8, un incremento en la expresión de las VCAM-1e ICAM, y una expresión aberrante del HLA-DR en el epitelio del pterigión, no encontrándose diferencias en el número de células cebadas entre el epitelio del pterigión y el epitelio de la conjuntiva normal. La VCAM-1 es una proteína que, en los seres humanos, es codificada por el gen CADM1. Esta molécula actúa en la adhesión celular al endotelio vascular de los linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos. La ICAM-1 (CD54) es una proteína transmembrana, que se encuentra en células endoteliales y leucocitos, es de gran importancia en la estabilización de las interacciones célula-célula en células endoteliales y facilita la transmigración de los leucocitos. Debido a estas asociaciones con la respuesta inmune, muchos investigadores han supuesto que ICAM-1 podría ser parte del mecanismo de transducción de señales. La ICAM-1 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que incluye a los anticuerpos y a los receptores de células T, posee sitios de unión para una serie de ligandos asociados con el sistema inmune 8. Otras moléculas de señalización, como las E-cadherinas y β-cateninas, están sobreexpresadas y se concentran en la cabeza del pterigión 69. El incremento de las βcateninas estimula ciertas proteínas del ciclo celular y a las MMPs 70. Las cadherinas son una clase de proteínas transmembrana de tipo-1, que juegan un papel importante en la adhesión celular, asegurando que las células dentro de los tejidos estén unidas. Las E-cadherinas se encuentran en el tejido epitelial. La pérdida de la función de la E-cadherina se ha implicado en la progresión y metástasis del cáncer. Un estudio reciente comparó la expresión genética del pterigión con tejido conjuntival normal encontrando un significativo incremento de las proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP) 71. Estas proteínas pertenecen a la familia de citoquinas quimiotácticas conocidas como quimioquinas. En los seres humanos hay dos formas principales, MIP-1α y MIP-1β, que ahora reciben el nombre oficial de CCL3 y CCL4, respectivamente. Ambas son factores importantes producidos por los macrófagos después de ser estimulados con endotoxina bacteriana. Activan a los granulocitos ( neutrófilos , eosinófilos y basófilos ) y por lo tanto pueden conducir a la inflamación neutrofílica aguda. También inducen la síntesis y liberación de otras citoquinas proinflamatorias como IL1, IL-6 y TNF-α, a partir de fibroblastos y macrófagos. 32 3.1.3.5-Factores de crecimiento Otros mecanismos de señalización como son los factores de crecimiento y sus receptores se han estudiado como partícipes en el desarrollo del pterigión. Estas moléculas inducen proliferación y/o migración de células epiteliales, fibroblastos o células vasculares, procesos que contribuyen a la hiperplasia, fibrosis y angiogénesis en el pterigión 23. Las citoquinas profibróticas y los factores de crecimiento expresados en el pterigión incluyen el factor de crecimiento epidérmico vinculado a la heparina (HBEGF), VEGF, la proteína unidora del factor de crecimiento parecido a la insulina (IGF-BP), al factor derivado del epitelio pigmentario de la retina (PEDF), el factor de crecimiento básico de fibroblastos (βFGF), los factores de crecimientos derivados de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y al factor de crecimiento de células madre (SCF). El HBEGF induce la migración celular de células epiteliales y de fibroblastos en el pterigión 8. Estudios previos han demostrado una sobreexpresión de βFGF, HBEGF y VEGF después de la exposición a radiación UV 72 . El VEGF, el factor proangiogénico más estudiado, está elevado en las lágrimas, en el plasma y en el tejido ocular de los pacientes con pterigión. La expresión del VEGF en el pterigión puede ser debida a múltiples estímulos (UV, hipoxia, citoquinas y factores de crecimento) 66, 73y probablemente representa una vía común de la proangiogénesis. Además, la inhibición del VEGF está siendo investigada por este motivo como posible tratamiento 73 . La presencia del polimorfismo VEGF-460C se ha correlacionado con la formación precoz de pterigión en mujeres jóvenes 74. El VEGF es una proteína señalizadora implicada en la vasculogénesis (formación de novo del sistema circulatorio embrionario) y en la angiogénesis (crecimiento de vasos sanguíneos provenientes de vasos preexistentes). Las acciones del VEGF han sido estudiadas en las células del endotelio vascular, aunque también tiene efectos sobre otros tipos celulares (por ejemplo, estimula la migración de monocitos/macrófagos, neuronas, células epiteliales renales y células tumorales). Se ha demostrado, in vitro, que el VEGF 33 estimula la división y la migración de células endoteliales. El VEGF también es un vasodilatador e incrementa la permeabilidad vascular. El hallazgo de que dos importantes moléculas inflamatorias, COX2 y VEGF, se expresan de forma importante en los macrófagos infiltrantes del pterigión humano sugiere el papel clave de estos macrófagos en la patogénesis del pterigión. Se han descrito macrófagos con expresión de la COX2 en varias enfermedades inflamatorias y tumores 58. Además, algunos estudios recientes han demostrado que la expresión del VEGF en los macrófagos es importante en la génesis de la fibrosis y la angiogénesis de la superficie ocular 45. Por lo tanto, los macrófagos que expresan tanto la COX2 como el VEGF pueden tener potencial para promover la angiogénesis, la deposición de colágeno, y el crecimiento del pterigión. Además, la COX2 y la expresión del VEGF en los macrófagos sugieren el papel que desempeñan estas células como puente entre el proceso inmunológico y las características tumorales del pterigión, porque tanto la COX2 como el VEGF son importantes en la carcinogénesis inducida en la piel por la radiación 73. En el pterigión se ha descrito un aumento en la expresión de factores neurotróficos, incluyendo el factor de cremiento nervioso (NGF), el factor neutrófico ciliar (CNTF), la sustancia P, la neurotrofina-4 y la neurotrofina-5 75. La elevación de los factores proangiogénicos (IL-8, TNF, βFGF, HBEGF y VEGF) junto con la falta de inhibidores angiogénicos (PEDF y la trombospondina-1) fomentan la neovascularización en el pterigión 76. Se ha encontrado una disminución del PEDF en el pterigión. El PEDF actúa como inhibidor de la angiogénesis, por ello la disminución de sus niveles contribuye a la estimulación angiogénica y a la formación y progresión del pterigión. El SCF es una citoquina que se une al receptor c-Kit (CD117), aunque se trate de una citoquina se incluye también dentro de los factores de crecimiento como su nombre indica. El SCF puede existir tanto como una proteína transmembrana como una proteína soluble. Esta citoquina desempeña un papel importante en la hematopoyesis, la espermatogénesis, y la melanogénesis. El SCF también se encuentra elevado en el plasma y en el tejido ocular de los pacientes con pterigión 77. Se han encontrado células de Langerhans en el tejido del pterigión por inmumohistoquímica y en estudios in vivo 78, 79. 34 3.1.3.6Estimulación angiogénica La inflamación provoca diferentes patrones de angiogénesis produciendo neovascularización que contribuye a la formación y desarrollo del pterigión. La estimulación de la angiogénesis debida a la exposición a radiación UV-B o a los procesos inflamatorios probablemente sean fenómenos secundarios, que contribuyen al crecimiento del pterigión 8. Algunos marcadores de las células endoteliales vasculares, como el CD31 están aumentados en el pterigión. F actores angiogénicos, como el VEGF están P, sustancia la y incrementados isminuidad está trombospondina-1 la que mientras 8. Estos factores están tados aumen en la lágrima y el plasma, aumentando la actividad del factor de transcripción ETS-1, que activa directamente la angiogénesis. La familia ETS está presente en todo el cuerpo y está implicada en una amplia variedad de funciones, incluyendo la regulación de la diferenciación celular, control del ciclo celular, la migración celular, la proliferación celular, la apoptosis y la angiogénesis. 3.1.3.7-Modulación de la matriz extracelular Como se ha indicado anteriormente, en el desarrollo y progresión del pterigión se han involucrado factores de crecimiento tales como el βFGF, el PEDF, el TGF-β y el TNF-α. De estos estudios se ha postulado que estos factores de crecimiento y otras citoquinas contribuyen a la inflamación, proliferación celular, remodelación del tejido conectivo y angiogénesis observadas en el pterigión. Es importante resaltar que estas citoquinas modulan a las enzimas proteolíticas llamadas MMPs, las cuales son activas contra todos los componentes de la matriz extracelular. Las MMPs han sido implicadas en tumores invasivos, en las metástasis, en la destrucción articular en pacientes con artritis reumatoide y en la degradación de la esclera en pacientes con escleritis necrotizante. A consecuencia de la exposición a la radiación UV y con la acumulación de suficientes mutaciones, las células del pterigión invaden la membrana basal de la córnea y colocan células epiteliales de la conjuntiva junto con éstas. La degradación de la membrana 35 de Bowman es consecuencia de un aumento en la concentración de proteasas que degradan los componentes de la membrana basal como el colágeno tipo IV y el colágeno fibrilar del estroma corneal. Recientemente se observó que los fibroblastos del pterigión tienen una expresión elevada de MMPs 9. Estas proteasas facilitan la degradación de los componentes de la membrana basal (como la membrana de Bowman) adyacente a la matriz estromal. Las MMPs también degradan moléculas de la superficie ocular. Algunas mutaciones en los genes de la elastina y la tropoelastina, componentes del tejido conectivo, se han asociado al pterigión 9. En el tejido fibrovascular del pterigión se han encontrado miofibroblastos. Se ha relacionado la presencia de células derivadas de la médula ósea, hematopoyéticas y mesenquimales con la formación del estroma fibrovascular. Esto es apoyado por el aumento de linfocitos CD34+ en la sangre de los pacientes con pterigión 76. Las células epiteliales del margen del pterigión producen niveles elevados de MMPs y VEGF. Las gelatinasas, que pertenecen a la familia de las MMPs, juegan un papel muy importante en la migración celular y en la angiogénesis. Estas enzimas son capaces de degradar todo tipo de matriz extracelular, pero también pueden procesar un cierto número de moléculas bioactivas solubles o asociadas a membrana. Se sabe que participan en la escisión de receptores de la superficie celular, en la liberación de ligandos proapoptóticos (como el ligando FAS ) y en la activación o inactivación de quimioquinas y citoquinas. Las MMPs también juegan un papel importante en los comportamientos celulares tales como la proliferación celular, la migración ( adherencia / dispersión), la diferenciación , la angiogénesis , la apoptosis y la defensa del huésped. Algunas MMPs, incluyendo MMP-1 (colagenasa intersticial), MMP-2 (gelatinasa A), MMP-3 (estromelisina 1), MMP-7 (matrilisina) y la MMP-9 (gelatinasa B), están aumentadas sobre todo en la parte anterior de la cabeza del pterigión 9. También se expresan la MMP-8 ( colagenasa de neutrófilos) y algunas MMPs unidas a membrana (MMP-14 y MMP-15). En cultivo de fibroblastos de pterigión, la adicción de mediadores inflamatorios produce un incremento en la expresión de MMP-1 y MMP-3 9. La MMP-7 es capaz de desnaturalizar un amplio espectro de proteínas de matriz incluyendo fibronectina, vitronectina, elastina, colágeno IV y proteoglicanos. Esta proteinasa puede amplificar la respuesta inflamatoria a través de facilitar el proceso en la superficie celular implicando al TNF-α. 36 Además, la MMP-2 y la MMP-9 (gelatinasas) se han asociado con progresión del pterigión 80 lo que sugiere que las MMPs pueden ser un objetivo atractivo para el manejo de esta enfermedad. Los incrementos de las diferentes MMPs en el pterigión son recogidas en la tabla 2. Tabla 2. En el encabezado (rosa) observamos las diferentes MMPs que se modifican en el pterigión. El pterigión está dividido en la tabla entre cabeza y cuello/cola. Las flechas gruesas hacia arriba significan que esas MMPs están incrementadas, las estrellas significan que las MMPs no experimentan variación.(tabla adaptada del artículo Solomon A, Li DQ, Lee SB, Tseng SC. Regulation of collagenase, stromelysin, and urokinase-type plasminogen activator in primary pterygium body fibroblasts by inflammatory cytokines. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41(8):2154-2163). Las MMPs activadas son controladas por inhibidores endógenos como la α-2macroglobulina y los TIMPs. La disregulación de las MMPs y la actividad de los TIMPs se han asociado al pterigión 8. Además de la rotura de la matriz extracelular, se han descrito alteraciones en la síntesis de otros componente de la matriz extracelular en el pterigión, incluyendo alteraciones en la tropoelastina, en los glicosaminoglicanos, en el ácido hialurónico y en la periostina 50. La alteración de los componentes de la matriz extracelular puede incrementar la biodisponibilidad de HBEGF y de las citoquinas, las cuales normalmente están unidas a la matriz extracelular y se liberan por la degradación de ésta. La expresión de las MMPs juega un papel importante en la migración y crecimiento del pterigión, pero probablemente no sea un prerrequisito para su formación. Las variaciones de las MMPs pueden explicar las diferencias en el crecimiento del pterigión vistas en la clínica 8. 43 3.1.4.5Mitomicina C comparada con el autoinjerto de conjuntiva o limbar Seis de los ocho ensayos aleatorizados 93 sobre el pterigión primario que comparan el uso de MMC postoperatoria (al 0,02% dos veces al día durante 5 días) o de MMC intraoperatoria (al 0,02% durante 2,5 minutos, al 0,04% durante 3 minutos, al 0,02% durante 2 minutos o al 0,02% durante 3 minutos) con el autoinjerto de conjuntiva o autoinjerto limbar no encontraron diferencias significativas en la tasa de recurrencia. No existen datos que sugieran que la MMC intra o postoperatoria sea más eficaz cuando se combina con autoinjerto conjuntival o limbar. Una limitación potencial en los resultados de estos análisis comparativos son los diferentes métodos utilizados durante la aplicación de la MMC intraoperatoria (MMC en papel de filtro o esponja aplicada a la esclera desnuda o en la tenon). 3.1.4.6Membrana amniótica comparada con autoinjerto de conjuntiva o limbar Algunos estudios han demostrado una tasa de recurrencia del pterigión inferior entre en el grupo de autoinjerto conjuntival o limbar, lo que sugiere que el autoinjerto de conjuntiva o de limbo es más eficaz que el injerto de membrana amniótica 94. 3.1.4.7Otras combinaciones de adyuvantes para el pterigión La ciclosporina es una sustancia derivada de un hongo (Tolypocladium inflatum). La ciclosporina es un fármaco inmunosupresor, con una acción relativamente específica sobre el sistema inmune, sin efectos tóxicos sobre las propias células en las que actúa. Los efectos inmunosupresores de la ciclosporina se deben a su capacidad de interferir el normal funcionamiento de determinadas células que intervienen en la respuesta inmune, sobre todo en los linfocitos T. En condiciones normales estas células producen citoquinas, que están implicadas en la defensa del organismo contra agentes extraños, como microorganismos que causan infecciones u órganos trasplantados. En determinadas circunstancias, la producción de estas citoquinas aumenta y esto puede favorecer el 44 desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas. En estas enfermedades, el tratamiento con ciclosporina puede ser útil, ya que la mayoría de sus efectos sobre la respuesta inmunitaria son debidos a la inactivación de linfocitos T. Estas células inmunes menos reactivas tendrán una menor capacidad para reaccionar contra el injerto o, en el caso de las enfermedades inflamatorias, producirán menos sustancias que faciliten la inflamación. A pesar de que su principal indicación es el trasplante de órganos sólidos, también se utiliza para el tratamiento de determinadas enfermedades reumáticas, como por ejemplo la artritis reumatoide, la artritis psoriásica o el lupus eritematoso sistémico. Dos estudios analizaron la tasa de recurrencia tras la administración tópica de ciclosporina A. Los dos estudios demostraron una tasa de recurrencia del pterigión inferior en el grupo tratado con ciclosporina A 95, 96. El bevacizumab ha demostrado su eficacia en el tratamiento de algunas enfermedades neoplásicas como el cáncer de colon, cáncer de mama, e1 cáncer de pulmón no microcítico y el carcinoma de células renales. El bevacizumab y el ranibizumab son antiangiogénicos usados actualmente en patologías oculares como la DMAE y la retinopatía diabética. Actualmente se han utilizado en la cirugía del pterigión. Recientemente se han realizado nueve estudios con bevazizumab y dos tras realizar una resección con esclera desnuda y administración intraoperatoria de bevacizumab subconjuntival a dosis de 1,25 mg/0.1 ml, sin observarse una disminución significativa en la tasa de recurrencia 93. Los adhesivos biológicos son una nueva terapia que ha revolucionado la cirugía del pterigión y otras cirugías del polo anterior al disminuir de forma clara el tiempo de intervención quirúrgica en el caso de autoinjertos conjuntivales o limbares, así como el transplante de membrana amniótica. El adhesivo de fibrina es una herramienta segura y eficaz en la cirugía del pterigión con autoinjerto conjuntival o limbar y en el transplante de membrana amniótica. La ventaja más importante del adhesivo de fibrina es el menor tiempo de cirugía postoperatoria 45 mejorando el confort del paciente. Aunque la tasa de recurrencia es menor con el adhesivo de fibrina que con la sutura se precisa un seguimiento a más largo plazo. Son necesarios otros ensayos controlados y aleatorizados en cirugía de pterigión para evaluar la relativa seguridad y eficacia del autoinjerto conjuntival o limbar, los diversos tiempos de exposición y las técnicas asociadas con el uso de MMC, los nuevos adyuvantes tales como la membrana amniótica, los tratamientos antiinflamatorios, los antiangiogénicos, los adhesivos y las combinaciones de estos adjuvantes 97, 98. El uso de una escala uniforme, como la clasificación del pterigión propuesta por Tan y colaboradores 10 ayuda en la evaluación de estas opciones en la cirugía del pterigión. Parece que un método satisfactorio de intervención del pterigión sería aquel en el que las complicaciones fueran mínimas y el índice de recurrencias fuera bajo, menor del 5%. El seguimiento de al menos un año sería necesario para identificar al menos el 95% de las recurrencias. Son necesarios más estudios controlados para valorar los diferentes métodos de intervención en el pterigión, tanto para el seguimiento a largo plazo como para observar sus complicaciones. 46 Aparte de las propiedades antimicrobianas, las tetraciclinas tienen otras muchas características, incluyendo su capacidad para inhibir la actividad de los miembros de la familia de las MMPs. Se han desarrollado numerosos compuestos sintéticos con potente actividad inhibidora de las MMPs y se han realizado numerosos ensayos clínicos. Sin embargo, debido a la falta de eficacia y los efectos secundarios musculoesqueléticos, ninguno ensayo clínico ha progresado a la fase III. Actualmente, sólo disponemos clínicamente de un inhibidor de MMPs, la doxiciclina. Tras el experimento realizado por Golub y cols 99 en mujeres postmenopáusicas, en el que la doxiciclina oral a dosis subterapéuticas redujo la severidad de la inflamación gingival a través de la inhibición de la actividad de la colagenasa y la reducción de los niveles proteicos, especialmente de la MMP-8; las tetraciclinas han sido cada vez más estudiadas por esta capacidad. El mecanismo por el que las tetraciclinas inhiben las MMPs no ha sido completamente dilucidado. Se cree que ejercen sus efectos por la inhibición directa de las MMPs y por inhibición de su expresión. En cardiología, las MMPs, además de su papel en la mediación de la cicatrización postinfarto y la remodelación, pueden contribuir realmente a la muerte del miocito y disfunción producida por la isquemia-reperfusión. El tratamiento con doxiciclina mejoró significativamente la función cardiaca y la hipertrofia cardiaca en un estudio reciente. La observación histológica reveló que la doxiciclina redujo significativamente . corazón el en colágeno de expresión la Este estudio reveló que podría doxiciclina con tratamiento el promover la autofagia, reducir la ex -pre sión de péptido natriurético del y cólageno atrial en los corazones post-infarto, e inhibir doxiciclina La .9MMPyMMP-2 podría actuar como terapia en cardiaca disfunción la 4. Otra propiedad característica de las tetraciclinas es su capacidad para eliminar las ROS. El exceso de ROS se produce bajo muchas condiciones patológicas, incluyendo lesión de miocardio después de la isquemia-reperfusión y los procesos inflamatorios, y puede conducir a la destrucción oxidativa o la disfunción de muchos constituyentes ce3.2AINCLICIDOX 47 lulares. Tanto la doxiciclina como la minociclina y la tetraciclina tienen un anillo múltiple fenol similar a la vitamina E. El anillo de fenol es clave para las capacidades de bloqueo de las ROS que tienen estos compuestos. La reacción del anillo de fenol con un radical libre genera un radical fenólico que se vuelve relativamente estable. Aunque sabemos que la doxiciclina es un eliminador eficaz de las ROS, en un estudio reciente no encontramos una relación directa entre la eliminación de las ROS y la inhibición de las MMPs 100. Un acontecimiento clave en la ejecución de la cascada de la apoptosis es la activación de las caspasas, una familia de proteasas de cisteína. Las caspasas pueden ser activadas por vía extrínseca (mediada por receptor) o intrínseca (mitocondrial). En la vía extrínseca 101 las proteínas inductoras de apoptosis tales como el TNF-α se unen a los receptores de la superficie celular del ligando Fas y, a través de cascadas de transducción de señales, conducen a la activación de una caspasa iniciadora, la caspasa 8. La caspasa 8 a su vez activa otras caspasas por debajo de la cascada, como la caspasa 3. En la vía intrínseca 102 una variedad de estímulos de estrés extra e intracelulares convergen en las mitocondrias para desestabilizar y provocar la liberación de factores proapoptóticos en el citosol. Un factor mediador clave de desestabilización mitocondrial es la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP), un poro grande de alta conductancia que abarca tanto la membrana mitocondrial interna como la externa. Una vez que el MPTP se abre, hay una afluencia de agua, lo que conduce a un hinchamiento de la matriz mitocondrial y a la rotura de la membrana mitocondrial externa. El citocromo c y otras proteínas proapoptóticas, tales como Smac / DIABLO y el factor inductor de apoptosis (AIF) se liberan desde el espacio intermembrana en el citosol. El citocromo c se une a la proteína adaptadora citosólica Apaf-1, que permite el reclutamiento y la activación de una caspasa iniciadora, caspasa 9, que a continuación, activa las caspasas inferiores de la cascada. El Smac / DIABLO se une e inhibe a las proteínas inhibidoras de las caspasas. El AIF se transloca al núcleo e induce la condensación de la cromatina y fragmentación del DNA de una manera independiente de caspasas 103. La vía de la apoptosis mitocondrial también está parcialmente regulada por la familia de proteínas Bcl-2 104. Los miembros de la familia Bcl-2 pueden ser proapoptóticos (BAX, Bid Bad) o antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-XL). Hay evidencias que sugieren que las tetraciclinas poseen propiedades antiapoptóticas. La minociclina se evaluó en modelos de lesión neuronal y demostró proteger con- 48 tra la enfermedad de Huntington, lesión traumática del cerebro y la enfermedad de Parkinson 3. En cada uno de estos casos, la neuroprotección por minociclina se asoció con una reducción en la expresión de la caspasa 1 y / o de la caspasa 3, lo que sugiere protección de la minociclina mediante la inhibición de la expresión de los factores clave en la cascada apoptótica. Además de la inhibición en la expresión de las caspasas, la minociclina también inhibe la actividad de las caspasas mediante el bloqueo de su activación. Festoff y cols 2 demostraron que la minociclina inhibe la liberación de citocromo c y la activación de la caspasa 3 en ratones con esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Huntington. En otro estudio, el mismo grupo mostró que la minociclina inhibía la liberación de citocromo c, Smac / DIABLO, y el AIF tanto en un modelo de cultivo como en un modelo in vivo de ratón con la enfermedad de Huntington, indicando que la minociclina inhibe tanto las vías dependientes de caspasas (citocromo c y Smac / DIABLO) como las vías independientes. La minociclina también protege los cultivos de células epiteliales renales de la lesión de isquemia-reperfusión e inhibe la liberación mitocondrial de citocromo c 105. Tomados en conjunto, estos estudios demuestran que la minociclina, y posiblemente también la doxiciclina 106, poseen propiedades antiapoptóticas, efectos mediados por la inhibición de la expresión de caspasa y por la estabilización mitocondrial. Estos compuestos que pueden actuar como eliminadores antiproteolíticos y de las ROS es probable que ejerzan acciones antiinflamatorias. Es bien conocido en el campo de la dermatología que la rosácea es una enfermedad de naturaleza inflamatoria 5, 6. La doxiciclina se utiliza con éxito en el tratamiento de enfermedades de la piel tales como el acné y la rosácea. En las biopsias de lesiones inflamatorias de los pacientes con acné, están elevadas las citoquinas proinflamatorias, tales como el TNF-α, la IL-8 y la IL-1β. Estas citoquinas son inductoras de las MMPs y de su actividad. Las ROS y el NO también juegan cierto papel en la fisiopatología de la rosácea 6. El NO provoca aumentos en la permeabilidad de los vasos y edema, y puede apoyar el desarrollo de eritema que se produce con la rosácea. 49 Cox y cols 7 determinaron in vivo el efecto de la doxiciclina sobre la angiogénesis mediante el uso de tres modelos animales: un modelo murino de CNV, un modelo de DIVAA y otro modelo murino de pterigión. En primer lugar, demostraron que la doxiciclina inhibe la migración de las células endoteliales, y por ello la eficacia de este fármaco fue probada en un ensayo de neovascularización coroidea. La CNV se indujo experimentalmente en ratones. Se administró a estos animales agua con doxiciclina 4 horas , antes y a continuación, se dañaron las membranas de Bruch con láser para inducir la CNV. Los animales recibieron agua sola o conteniendo doxiclina durante siete días y se determinaron los volúmenes de las lesiones, observándose una disminución importante (50-60%) en el volumen de la lesión coroidea en ratones que recibieron doxiciclina. En el ensayo de DIVAA se implantaron tubos de silicona con Matrigel conteniendo tampón fosfato salino (PBS), 7 nM de βFGF o 10.000 células epiteliales de pterigión humanos bajo la piel de ratones desnudos. Después de 11 días, se inyectó en la vena de la cola isotiocianato de fluoresceína-dextrano (FITC-d) y diez minutos más tarde se sacrificaron y se cuantificó el grado de la neovascularización midiendo la fluorescencia de los tubos, demostrando que las células epiteliales del pterigión humano eran altamente angiogénicas en comparación con Matrigel solo o Matrigel con ßFGF , indicando así que las células epiteliales de pterigión inducen neovascularización. En un experimento posterior, se añadió doxiciclina al agua después de implantar tubos de silicona con 10.000 células epiteliales de pterigión humano en los ratones. La doxiciclina a dosis de 30 mg / kg / día en el agua redujo la neovascularización en un 30% en comparación con agua sola o doxiclina a 5 mg / kg / día. Este resultado demuestra la capacidad de la doxiciclina para inhibir la angiogénesis cuando se proporciona por vía oral. Hasta ese estudio no se había generado un modelo animal de pterigión. Estos mismos autores mezclaron 10.000 células epiteliales de pterigión humano con 5 microlitros de Matrigel y se inyectó bajo el espacio subconjuntival nasal paralimbar en ratones atímicos. A los 6 días, de los 26 ojos inyectados, 18 ojos (aproximadamente 70%) tenían 3.3PTERIGIÓN Y AINCLICIDOX 50 lesiones notables. No hubo otros cambios observados en el ojo o en el fenotipo general del animal. Algunas de las lesiones tenían afectación de vasos sanguíneos visibles y los ratones a los que se les inyectó solo Matrigel no mostraron lesiones visibles. Para comprobar si la doxiciclina era capaz de revertir estas lesiones en un modelo in vivo, se trató a la mitad de los ratones con doxiciclina mientras los otros recibían agua sola. A los 9 días de tratamiento se observó una regresión total de las lesiones oculares (Fig.1). Fig.1. En esta figura se aprecia como la doxiciclina causó la regresión de las lesiones de las células epiteliales del pterigión en un modelo de ratón desnudo. Las flechas de las fotos superiores muestran a los ratones 6 días después de la inyección de células de pterigión; se administró dosis de 50 mg / kg / día de doxiclina junto con agua. Las flechas de las fotos inferiores muestran a los ratones 15 días después de la inyección de células de pterigión y de recibir doxiciclina durante 9 días. Los ratones que sólo recibieron agua no mostraron regresión de las lesiones. Reproducido con la autorización del editor : Cox CA, Amaral J, Salloum R et al. Doxycycline's effect on ocular angiogenesis: an in vivo analysis. Ophthalmology 2010;117(9):1782-1791. 51 La doxiciclina inhibió significativamente la angiogénesis en los tres modelos murinos. El efecto más claro se encontró en el modelo de CNV seguido por el DIVAA. El modelo de pterigión también mostró regresión histológica. Esto sugería que la doxiciclina podía tener éxito como tratamiento adyuvante en la neovascularización coroidea y en el pterigión humano; en esta suposición se ha basado nuestro ensayo clínico. La doxiciclina es segura, barata y fácil de obtener. Podría ser útil como terapia en el pterigión primario o como terapia coadyuvante para prevenir las recurrencias después de las cirugías. Otro estudio con modelo corneal murino sobre la inhibición de la angiogénesis comparó doxiciclina oral con dexametasona tópica y oral. Mostró un 37,4% de reducción en la neovascularización después de tratamiento con doxiciclina durante 14 días, mientras que la reducción fue del 70,7% y del 67,4% usando dexametasona tópica y oral, respectivamente 107. Esto muestra nuevamente que los esteroides son buenos agentes antiangiogénicos, pero sus potenciales complicaciones y sus efectos secundarios pueden ser prohibitivos. Los escasos efectos colaterales de la doxiciclina la hacen una buena candidata para el tratamiento del pterigión. La doxiciclina ha demostrado que posee propiedades antiinflamatorias y reduce significativamente los niveles de TNF-α, IL-10 e interferón-γ en un modelo murino in vivo 108. Las células epiteliales del pterigión más externas producen niveles elevados de MMPs y de VEGF 8. En los experimentos del DIVAA se muestra cómo las células epiteliales del pterigión tienen capacidad para inducir neovascularización y que la doxiciclina es un inhibidor efectivo de este proceso. La capacidad de secretar gelatinasas por parte de las células epiteliales del pterigión fue valorada en cultivo celular durante 24 horas en un medio libre de suero. Estas proteinasas fueron inhibidas de forma dependiente de la dosis por la doxiciclina 7. La doxiciclina es el único inhibidor de las MMPs que está ampliamente disponible clínicamente. El uso de doxiciclina en la neovascularización ocular puede servir como terapia coadyuvante de otros tratamientos antiangiogénicos, aunque no se han realizado ensayos clínicos humanos prospectivos. La doxiciclina podría reducir la recidiva del pterigión, especialmente en los pacientes que viven cerca del ecuador y tiene una alta exposición a la radiación UV-B. El coste bajo y la seguridad que proporciona, así como 52 la capacidad de la doxiciclina para reducir la neovascularización y el crecimiento fibrovascular, sugirieron que la doxiciclina podía ser un candidato prometedor para ensayos clínicos en humano 7. 59 Fig.2. Diagrama de flujo. De los 120 pacientes con pterigiones primarios iniciales, se excluyeron 22, 14 no reunieron los criterios de inclusión y 8 declinaron participar. Las principales razones para no cumplir con los criterios de inclusión fueron el embarazo (8) y estar en tratamiento con medicamentos incompatibles doxiciclina (6). De los 98 pacientes que iniciaron el estudio, 49 se asignaron al grupo de placebo y 49 al grupo tratado con doxiciclina. En el grupo placebo 14 pacientes (21 pterigiones) se perdieron en el seguimiento y 21 pacientes (30 pterigiones) se perdieron en el grupo tratado con doxiciclina. Muchos pacientes se perdieron durante el seguimiento, probablemente debido a la gran cantidad de inmigrantes, una población muy móvil, que fueron incluidos en el ensayo. 35 pacientes (44 pterigiones) se incluyeron en el análisis por intención de tratar en el grupo placebo y 28 pacientes (36 pterigiones) en el grupo tratado con doxiciclina. Seis pacientes tuvieron que suspender el tratamiento debido a efectos adversos leves entre ambos grupos. Finalmente, 34 pacientes (42 pterigiones) en el grupo placebo y 23 pacientes (29 pterigiones) en el grupo tratado con doxiciclina se incluyeron en el análisis por protocolo al mes. Varios de los pacientes tenían más de un pterigión, por lo que se incluye el número total de pterigiones. Figura adaptada de: Rúa O, Larráyoz IM, Barajas MT, Velilla S, Martínez A (2012) Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions; Results from a Double Blind, Randomized, Placebo Controlled Clinical Trial. PLoS ONE 7(12): e52696. doi: 10.1371/journal.pone.0052696 60 Tabla 3. En esta tabla aparecen las características basales demográficas y clínicas de los pacientes incluidos en el ensayo. Se dividen en dos grupos (placebo y tratados con doxiciclina) con 49 pacientes en cada uno de ellos. El sexo predominante en ambos en el masculino con proporción similar. En ambos predomina los hispanos en proporción también similar. La edad de ambos grupos ronda los 50 años. El tamaño inicial medio es algo mayor en los tratados con doxiciclina (5.25 mm2) frente al grupo placebo (4.65 mm2). En cuanto a la morfología del pterigión predomina en ambos grupos el T2 (intermedio) seguido del T3 (carnoso) y en menor número el T1 (atrófico). Tabla adaptada de: Rúa O, Larráyoz IM, Barajas MT, Velilla S, Martínez A (2012) Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions; Results from a Double Blind, Randomized, Placebo Controlled Clinical Trial. PLoS ONE 7(12): e52696. doi: 10.1371/journal.pone.0052696 61 4.2MATERIAL Y MÉTODO DEL ESTUDIO MOLECULAR MEDIANTE SECU IÓNACICEN Para el estudio se extrajeron quirúrgicamente los pterigiones de 10 pacientes y se inició el cultivo primario. Las células en pasajes 3-5 se pusieron en contacto con 0 (control), 50, 200 y 500 µg/ ml de doxiciclina durante 24 horas, después su mRNA se purificó, se realizó transcripción inversa y secuenciación, según los protocolos de secuenciación masiva de Illumina. Los datos adquiridos fueron sometidos a normalización por cuantiles y analizados utilizando el software GENEMANIA (plug-in de Cytoscape) para conocer las vías involucradas. Se utilizó la tasa de descubrimientos falsos (FDR) para identificar aquellos genes cuya expresión se había modificado de una forma dependiente de la dosis después de la exposición a doxiciclina. 4.2.1Pacientes y Cultivo Primario Los pterigiones extirpados fueron trasladados al laboratorio para ser cultivados como se describió previamente. Los pterigiones se cortaron en trozos pequeños y se cultivaron durante 3 días en medio DMEM/F-12 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 200 mM de L-glutamina, DMSO 0,5% y 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina (todos los reactivos de cultivo son de Invitrogen, Carlsbad, CA). Una vez que las células habían migrado de los explantes y se habían unido a la superficie de la placa, los fragmentos de explantes fueron retirados y se cambió a medio de queratinocitos, con suero fetal bovino al 5% y 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina. Cuando las células alcanzaron el 80% de confluencia, se pasaron a placas frescas con 0,25% de tripsina. El medio se renovaba cada 2-3 días y fue reemplazado por medio fresco 24 horas antes de añadir el antibiótico. Las células de cada paciente fueron sometidas a cuatro tratamientos: 0 (control), 50, 200 y 500 µg / ml de doxiciclina (Vibravenosa, Pfizer, Madrid, España) durante 24 horas. 62 4.2.2Inmunofluorescencia y microscopía confocal Antes del tratamiento con doxiciclina, algunas células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio durante la noche, se fijaron con 10% de formol tamponado durante 10 minutos, se permeabilizaron con 0,1% triton X-100 en PBS durante 10 minutos, y se expusieron a una mezcla de tres anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Estos anticuerpos primarios incluyen: ratón anti-vimentina (1:40, Sigma, Madrid, España), conejo anticitoqueratina 4 (1:100, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y cabra anti-CD31 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Después de varios lavados, se añadió la segunda capa durante 2 horas a temperatura ambiente. Esta segunda capa incluía anticuerpos conjugados: Alexa 633 burro anti-cabra, Alexa 546 burro anti-conejo y Alexa 488 burro anti-ratón (1:200, Invitrogen). Después de otra serie de lavados, los cubreobjetos fueron montados con medio de montaje que contiene DAPI (Invitrogen). Como controles positivos, se procesaron en paralelo algunas secciones de parafina de útero y apéndice humano. Para visualizar los cortes se utilizó un microscopio confocal (Leica TCS SP5, Leica, Badalona, España). 4.2.3Extracción del RNA El RNA total fue aislado a partir de cultivos de células de pterigión con TRIzol (Invitrogen), se purificó mediante el kitRNeasy Mini(Qiagen, Valencia, CA) y se trató con DNasa I (Qiagen),siguiendo las instrucciones de los fabricantes. 4.2.4Preparación del cDNA y Ultrasecuenciación En primer lugar, se evaluó la integridad y calidad del RNA total con el sistema de electroforesis automatizada de Experion (BioRad, Hercules, CA). Entonces, el mRNA se aisló a partir de1µg de RNA total usando perlas magnéticas recubiertas de oligo d-T. Este mRNA se fragmentó en trozos de aproximadamente 200 pb usando cationes diva- 63 lentes a temperatura elevada. Los fragmentos escindidos de RNA se transcribieron utilizando la transcriptasa inversa y cebadores aleatorios. A continuación, la segunda cadena se sintetizó utilizando la DNA polimerasa I y RNasa H. Estos fragmentos de cDNA de doble cadena fueron finalmente reparados por la DNA polimerasa T4, y fosforilados por polinucleótido quinasa de T4. Los productos de cDNA se incubaron con Klenow DNApolimerasa para generar extremos cohesivos con una adenina en el extremo 3’, lo que permitió la ligadura de los adaptadores de indexación Illumina a los extremos del cDNA. Los productos ligados a los adaptadores se purificaron con perlas magnéticas XP (Corporación Agencourt Bioscience, Beverly, MA, EE.UU.) y las bibliotecas fueron amplificadas mediante 15 ciclos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con la DNA polimerasa Phusion (Reactivos Finnzymes, Vantaa, Finlandia). Las bibliotecas construidas fueron validadas y cuantificadas mediante electroforesis en el sistema Experion y por qPCR. Los datos de las seis bibliotecas indexadas fueron mezclados (multiplexado) en proporciones equimolares para dar una mezcla de oligonucleótidos con una concentración total de 10 nM. Por último, las bibliotecas resultantes fueron secuenciadas en la plataforma Genome Analizador IIx (Illumina) para generar lecturas de unas 150 pb. En cada carril de la celda de flujo se secuenciaron seis bibliotecas agrupadas e indexadas. 4.2.5Tratamiento de datos Los datos brutos de secuencia en formato fastq se procesaron a través de una serie de pasos secuenciales: a) Eliminación del adaptador: el adaptador de secuencias fue retirado de las secuencias en bruto con una serie de comandos determinados para este fin mediante un enfoque no conservador. Así, incluso las representaciones más cortas (un nucleótido) fueron eliminadas. b) Alineación del mRNA al DNA genómico: la alineación fue realizada por tophat (un alineador Bowtie DNA). Los resultados fueron ordenados e indexados utilizando samtools. 64 c) Se calcularon valores de cobertura para cada muestra en el entorno estadístico “R” usando la biblioteca rsamtools. La anotación GTF de ensembl para el genoma humano se aplicó como referencia para los rangos. Los datos de expresión de exones de las 40 muestras diferentes se normalizaron por cuantiles y la expresión fue calculada por simple adición de todos los eventos de expresión en cada exón. d) Las muestras fueron agrupadas por paciente y cada valor de expresión se redujo al intervalo [0,1] con el fin de corregir los rangos de respuesta observados para el mismo gen en diferentes fondos genéticos. e) Se usó la librería siggenes para seleccionar los genes expresados de forma diferencial utilizando método SAM basado en FDR. f) Los datos obtenidos fueron enviados a GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) y están disponibles con el número de acceso GSE34736. g) Los genes cuya expresión se modula por la doxiciclina, con un valor de FDR < 0,05, se representaron como un mapa de calor mediante el uso de un método de Manhattan para la disimilitud y un método de Ward para la agrupación jerárquica, calculado en un entorno R. h) Análisis de redes y vías metabólicas: El plugin FI cytoscape reactome (www.reactome.org) y el genemania cytoscape plugin (www.genemania.org) 110 se utilizaron para identificar las vías y redes reguladas por el tratamiento con doxiciclina. 4.2.6Confirmación de los resultados de la ultrasecuenciación Se eligieron algunos genes cuya expresión cambiaba de manera significativa tras la aplicación de doxiciclina para una confirmación posterior. Se sintetizó cDNA por transcripción inversa de 1 µg de RNA total utilizando el kit de síntesis (Invitrogen) en un volumen total de 20 μl de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se amplificó por qRT-PCR utilizando sondas TaqMan (Tabla 4) en el sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) y su expresión génica fue calculada utilizan- 65 do una cuantificación por interpolación en una curva estándar 111. Todos los valores se dividieron por la expresión del gen GAPDH, para evitar posibles errores de pipeteo. Tabla 4. Sondas TaqMan utilizadas para la cuantificación de genes expresados mediante qRT-PCR. Los parámetros del termociclador fueron 10 min de desnaturalización a 95 ºC, seguido por 40 ciclos de 95 ºC durante 15 segundos y 60 ºC durante 1 min. Los valores se interpolan en un curva estándar para calcular la expresión absoluta. Estos valores dividieron después por la expresión de GAPDH en las mismas muestras para corregir posibles errores de pipeteo. Tabla adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 66 4.3ANÁLISIS ESTADÍSTICO La variación de la superficie ocupada por el pterigión, una variable continua, se comparó entre los dos grupos experimentales con la prueba t de Student-Fisher. La normalidad se determinó mediante el test de Shapiro-Wilk. El análisis de subgrupos se realizó mediante pruebas de regresión logística. Las interacciones entre variables se estudiaron con modelos de regresión. Las variables categóricas se compararon mediante la prueba de chi-cuadrado. Las pruebas de correlación (coeficiente de correlación de Spearman) se utilizaron para comparar la edad y la respuesta al fármaco. Valores p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Todos estos análisis se realizaron con el programa SPSS 17,0. Se realizaron análisis tanto por protocolo como por intención de tratar. Con ANOVA de dos vías se analizaron los datos de ultrasecuenciación y de qRTPCR. Mientras que para comparar los datos de la ultrasecuenciación y de la qRT-PCR se utilizó el análisis de correlación. 5RESULTADOS ———————————————————— 75 Fig.6. Imagen confocal de células de pterigión en cultivo teñidas con anticuerpos contra vimentina (verde), CD31 (blanco), y queratina 4 (rojo). DAPI se utilizó como contratinción nuclear (azul). Todas las células fueron vimentinapositivas y no se encontró inmunoreactividad para marcadores epiteliales o linajes endoteliales. Barra = 20 µm. Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 Los cultivos se trataron con doxiciclina y el RNA de las muestras se analizó mediante ultrasecuenciación. Debido a las características del protocolo de multiplicado y otras razones técnicas, había una amplia variabilidad en el número de lecturas de secuencia por muestra, que van desde 82,040 a más de7,5 millones de lecturas (Fig. 7). Para hacer frente a esta variabilidad los datos se normalizaron en todas las muestras. Para probar la eficacia de nuestro protocolo de normalización, se hicieron varias predicciones y se 76 comprobaron en el banco de datos. Una de las pruebas consistió en la predicción del sexo del paciente mediante el análisis de expresión de los genes codificados por el cromosoma Y (Fig..8 A,B) o de otros genes cuya expresión está ligada al sexo del individuo, tales como XIST o RPS4Y1. El sexo de todos los pacientes se predijo correctamente. Una segunda prueba consistió en el análisis de los genes cuya expresión no había sido modificada por el tratamiento con doxiciclina. En estos casos, los antecedentes genéticos de cada paciente son muy homogéneos en comparación con la expresión en otros pacientes, que es más variable (Fig. 8 C-H). Fig.7. Histograma que muestra el número de secuencias alineadas para cada una de las 40 muestras experimentales (profundidad secuenciación). Los números representan los donantes individuales y las 4 barras de cada donante se corresponden con control no tratado, y las células de pterigión tratadas durante 24 h con 50, doxiciclina 200 y 500 µg / ml (de izquierda a derecha). Hay una gran variación en la profundidad de secuenciación que va desde 82.040 lecturas para las células (menos representados de paciente número 7, se trató con 500 µg / ml de doxiciclina) a 7.653.010 lecturas para las células tratadas con 50 µg/ ml de doxiciclina (mejor representados de paciente número 6). Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 77 Fig.8. Demostración experimental de que fue aplicado un protocolo correcto de ultrasecuenciación. Representación de los niveles de expresión en el cromosoma Y en un paciente hombre (A) y en una paciente mujer (B). Cada línea oscura representa la expresión de un exón a lo largo de la longitud del cromosoma. Las pocas líneas observadas en las hembras corresponden a regiones repetidas del genoma. Niveles de expresión de 3 genes: H19 (C, D), clusterina (E, F), y MMP 2 (G, H), tal como aparecen antes (C, E, G) y después (D, F, H) de la aplicación de nuestro protocolo de normalización. El éxito de la normalización se puede apreciar ya que las variaciones individuales son más grandes que los cambios inducidos por el tratamiento en estos genes. Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 Después de la normalización, la primera observación fue confirmar el tipo celular predominante en los cultivos. Varios marcadores de fibroblastos, incluyendo la fibronectina 1, el colágeno tipo 1α y β, la vimentina y el colágeno de tipo III se encontraron en las diez muestras con un alto nivel de expresión, mientras que los marcadores de las células epiteliales tenían una expresión muy baja. 78 Después, la expresión génica de las muestras tratadas con doxiciclina se comparó con los controles no tratados. Se identificaron 332 genes cuya expresión variaba de acuerdo a la exposición al antibiótico y se representan en un mapa de calor tipo Manhattan, donde se muestra que los tratamientos tienden a agruparse, lo que indica que estas variaciones en los genes debidas al tratamiento son mayores que las debidas a la idiosincrasia individual (Fig.9). Fig. 9. Agrupación jerárquica (mapa de calor Manhattan) de todas las muestras (columnas) y de los 332 genes que experimentaron los mayores cambios tras el tratamiento con doxiciclina (líneas). Todos los controles tienden a agruparse (a la izquierda) lo cual indica una buena técnica de normalización. El color rojo expresa niveles bajos de expresión y el amarillo expresa niveles altos de expresión. Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 79 Para investigar las vías celulares que estaban involucradas en la respuesta a la doxiciclina por parte de las células del pterigión, se analizaron los resultados de la ultrasecuenciación con software especializado. El grupo de genes que experimentó mayor variación después del tratamiento con el antibiótico son los genes expresados por el genoma mitocondrial. El DNA mitocondrial está compuesto por 15 genes importantes, de los cuales un solo gen el MT-ATP8 no cambió, la expresión de 2 genes que codifican el RNA ribosomal aumentó mucho en función de la dosis, mientras que la expresión de los otros 12 genes disminuyó sustancialmente, también en una forma dependiente de la dosis (Tabla 5). Tabla 5. Valores de la ultrasecuenciación de los genes mitocondriales. Los valores se representan como el cambio medio de 10 pacientes con respecto a los controles no tratados. En esta tabla se aprecia que la expresión de los 12 primeros genes mitocondriales que aparecen en ella disminuyen sustancialmente de forma dosis dependientes con el tratamiento con doxiciclina y los dos últimos, que codifican el RNA ribosomal, aumentaron su expresión según aumentaba la dosis de doxiciclina. Tabla adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 80 Otra vía cuya expresión se modificó de forma importante por el tratamiento con doxiciclina (todos los genes en esta vía se sobreexpresan) incluye casi todas las proteínas que aparecen en el retículo endoplásmico (ER) en respuesta al estrés (Fig. 10). Esta vía está implicada a todos los niveles, desde el acoplamiento del ribosoma al ER (SSR2, RRBP1, SEC61A1), a las moléculas implicadas en el plegamiento de proteínas (PPIB, PDIA1a 6, etc), a las proteínas de control de calidad (BIP, SIL1, HSP47), a los miembros de la respuesta a proteínas desplegadas (ATF6, IRE1, PERK) y al proceso de degradación de proteínas asociadas al ER (EDEM1, SEC61, complejo ubiquitina ligasa, etc). Cuando se activa la respuesta a proteínas desplegadas (UPR), las señales de varios mediadores son enviadas al núcleo para activar los genes que responden a UPR y para promover la apoptosis. Uno de ellos es CHOP, que también está aumentado en las células tratadas con doxiciclina. 81 Fig.10. Todas las proteínas representadas en el esquema son sobrerreguladas significativamente con el tratamiento doxiciclina. Esquema de las principales vías del retículo endoplasmático (ER) en respuesta al estrés. Las proteínas se translocan directamente desde el ribosoma en el ER y el plegamiento de las proteínas tiene lugar con la ayuda de chaperones específicos. Si se pliegan correctamente, las proteínas siguen su camino hacia el complejo de Golgi y la vía secretora. Si las proteínas mal plegadas se acumulan en la luz del ER, el UPR se activará, se enviarán señales al núcleo y se inducirá apoptosis a través del CHOP. Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 82 Otro conjunto de genes que se afectan por el tratamiento con doxiciclina incluye varias integrinas, colágenos y otros componentes de la matriz extracelular (Tabla 6), lo que indica que la doxiciclina tiene un impacto significativo en la remodelación de la matriz. Además, varios factores de crecimiento como el VEGF y el factor mesencefálico neurotrófico derivado de astrocitos (MANF), citoquinas como la IL-6, y algunos factores relacionados con el ciclo celular (TP53, CDKN1A, CDK2AP2) también tenían modificadas su expresión en las células tratadas con doxiciclina. Tabla 6. Valores de ultrasecuenciación de las integrinas y de los genes de la matriz extracelular. Los valores se representan como el cambio medio de 10 pacientes con respecto a los controles no tratados. La expresión de los genes de la matriz extracelular, las colagenasas y las integrinas que interaccionan con proteínas se reduce de forma dosis dependiente en los tratados con doxiciclina. En cambio, algunas integrinas aumentan su expresión dependiendo de la dosis de doxiciclina mientras otras la disminuyen no estando tan clara su relación con la dosis. Tabla adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 83 Los resultados de la ultrasecuenciación se confirmaron mediante un estudio con reacción de cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). En todos los casos, se confirmó la dirección y magnitud del cambio en la expresión (Fig. 11). Para todos los genes seleccionados existe una estrecha correlación entre los datos obtenidos a través de la ultrasecuenciación y los recogidos por qRT-PCR (Fig. 12), lo que indica la eficacia de nuestro método de cuantificación y normalización. Fig 11. Expresión de varios genes cuantificados por ultrasecuenciación (barras abiertas) y qRT-PCR (barras sólidas) involucrados en las diferentes vías. Los genes mitocondriales (AC), la respuesta de estrés del retículo endoplasmático (DF), los miembros de la familia de las integrinas (GI), y los genes relacionados con el ciclo celular (JL). Las barras representan incremento (o disminución) con respecto a los controles no tratados +/- SEM para 10 muestras independientes. Las diferencias estadísticamente significativas con los controles no tratados están representados por asteriscos * (por ultrasecuenciación) o almohadillas # (por qRT-PCR). **: P, 0,01; ***: p, 0.001; #: p, 0,05; # #: p, 0,01; # # #: p, 0.001. Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 84 Fig.12. Análisis de correlación entre los valores obtenidos a través de ultrasecuenciación (abscisas) y mediante qRT-PCR (ordenadas). El coeficiente de Pearson es 0.9110 y R2 = 0,8299; p, 0.0001. Indica la eficacia de nuestro método de normalización. Figura adaptada de: Larráyoz IM, de Luis A, Rúa O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi: 10.1371/journal.pone.0039359 Para algunos genes que generan proteínas secretoras, tales como el MANF, la IL-6 y el VEGF, se realizó una confirmación adicional mediante la determinación de proteínas por ELISA en el sobrenadante de los cultivos tratados y sin tratar. Una vez más, se observó una alta correlación entre los datos de la secuenciación, la cuantificación mediante qRT-PCR y ELISA (Fig.13). 91 6.1.3COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS Al comparar las superficies de los pterigiones en pacientes tratados con doxiciclina, se observó que al mes de la inclusión en el estudio los pacientes de raza caucásica y los de edad más avanzada presentaron una disminución de la superficie del pterigión respecto a los pacientes de raza hispana y respecto a los pacientes más jóvenes. 6.2EFECTOS MOLECULARES DE LA DOXICICLINA EN EL PTERIGIÓN En este estudio hemos demostrado a través del análisis de ultrasecuenciación que las células de pterigión responden al tratamiento con doxiciclina mediante la modificación de los niveles de expresión de un amplio número de genes responsables de importantes funciones celulares. Entre las rutas que fueron más modificadas encontramos a los genes mitocondriales, la cascada relacionada con el estrés del ER, los factores de crecimiento, las interleuquinas, los reguladores del ciclo celular, las integrinas y los componentes de la matriz extracelular. 6.3NORMALIZACIÓN DE DATOS La secuenciación masiva para el análisis del transcriptoma es una técnica relativamente nueva y, como tal, necesita un tiempo y una serie de mejoras adicionales antes de lograr su potencial real. En este sentido, la normalización de datos es uno de los problemas más relevantes en los documentos actuales que manejan datos de ultrasecuenciación. En un principio se suponía que las técnicas de RNA-ss estaban libres de las distorsiones no lineales que plagaron las técnicas de hibridación. Por lo tanto los valores de expresión se derivaban directamente de la cantidad total de alineaciones de un exón particular, dividida por su longitud 118. Más tarde, esa medida fue mejorada por la lecturas por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas asignadas (RPKM)119. Sin embargo, 92 estos métodos y similares se ven afectados por un sesgo de secuenciación importante. Hoy en día, están apareciendo nuevos métodos de normalización para hacer frente a todos estos problemas 120. Nuestro protocolo de normalización utiliza la amplia experiencia acumulada en los últimos años de análisis de microarrays, donde la normalización por cuantiles ha sido el “gold standard” 121. Este enfoque evita la introducción de sesgos importantes en los genes con baja expresión, así como en aquellos con altos niveles de expresión. La calidad de nuestro método fue confirmada por una serie de pruebas biológicas. En primer lugar, nuestros datos predijeron correctamente el sexo de todos los pacientes basándose en la expresión de los genes codificados por el cromosoma Y. En segundo lugar, los genes cuya expresión está unida a la muestra genética se diferencian claramente con este método. Además, los datos de expresión obtenidos mediante la suma de las alineaciones de secuencia presentan una alta correlación con los datos obtenidos en las mismas muestras por qRT-PCR. Una ventaja sobresaliente de esta metodología es que muestras con profundidad de secuenciación muy diferente (desde 80.000 a más de 7.000.000 lecturas) pueden ser utilizadas para el análisis mientras que en otras metodologías deben ser desechadas con el fin de evitar sesgos 122. 6.4ESTUDIOS PREVIOS DE SECUENCIACIÓN EN PTERIGIÓN A pocos estudios anteriores se les habían aplicado técnicas de alto rendimiento para estudiar la transcriptómica del pterigión. Por ejemplo, en un estudio reciente 123, la expresión de los genes del pterigión se comparó con la de la conjuntiva autóloga normal, encontrando un aumento significativo de fibronectina, CD24, MIP-4, y NGAL en el pterigión. Un trabajo reciente 124 ha demostrado que el pterigión presenta patrones aberrantes de metilación del DNA en regiones cercanas a los genes de remodelación de la matriz tales como TGM-2, MMP-2 y CD24. Este estudio es el primero en analizar los cambios en el mRNA y en las proteínas producidas por un tratamiento antibiótico en las células del pterigión. 93 Las células que cultivamos fueron positivas para vimentina y negativas para marcadores epiteliales y endoteliales. Por tanto, las clasificamos como fibroblastos. Sin embargo, Dushku y Reid 113 mostraron que el pterigión se origina a partir de la alteración de las células epiteliales basales del limbo. Estas células expresan vimentina, pero no se tiñen para la queratina, por lo que estos cultivos primarios parecen representar las células características del pterigión. 6.5ACCIONES DE LA DOXICICLINA EN LA MITOCONDRIA Las mitocondrias son esenciales para mantener la vida en todos los organismos superiores, ya que mediante la cadena respiratoria proporcionan 36 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa en contraste con las 2 moléculas de ATP producidas por glucólisis. Cualquier problema con alguna de las numerosas enzimas usadas por las mitocondrias puede ser devastador para la célula. El genoma mitocondrial contiene 13 genes codificantes de proteínas. Muchos de estos genes codifican proteínas de la cadena de transporte de electrones. La doxiciclina es un inhibidor reversible de la traducción mitocondrial en bacterias 125. La doxiciclina inhibe la unión del aminoacil-RNA transferasa en la subunidad 30S del ribosoma concluyendo de esta forma el proceso de traducción. Esta inhibición de la traducción se ha asociado con la detención del ciclo celular, la apoptosis / necrosis y el desprendimiento de las células debido a la activación de la caspasa 3, 8 y 9 125, 126. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia de que la doxiciclina actúa como un inhibidor selectivo de la transcripción de los genes mitocondriales. La inhibición es potente y plantea la pregunta de si el efecto de la doxiciclina como un inhibidor de la síntesis de proteína mitocondrial es debido, al menos en parte, a la inhibición de la transcripción de los genes mitocondriales codificados, además de a su unión a los ribosomas. Sin embargo, el pretratamiento con doxiciclina ha demostrado que contrarresta la apoptosis y la respuesta de estrés del ER inducida por la doxorrubicina en el corazón y tes- 94 tículo del ratón 125, 127, 128 probablemente a través de un mecanismo de precondicionamiento. Esto concuerda con nuestros datos que muestran el aumento de moléculas de supervivencia tales como IL-6, VEGF, p21 o RelA. Una exposición durante un breve periodo de tiempo a la doxiciclina puede provocar un daño transitorio mitocondrial y de estrés del ER que estimula a los factores de supervivencia que pueden proteger a las células del daño producido por otros fármacos. Sin embargo, en nuestro paradigma experimental los factores de supervivencia parecen estar superados por la producción de factores proapoptóticos tales como CHOP, BAX y la activación de caspasas. 6.6VÍA DE RESPUESTA DEL ESTRÉS DEL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO El ER cumple múltiples funciones 128, 129. El lumen del ER es un entorno único, que contiene la mayor concentración de calcio dentro de la célula debido al transporte activo de iones de calcio por las ATPasas. El lumen es un entorno oxidativo, crítico para la formación de enlaces disulfuro y el plegamiento correcto de las proteínas destinadas a la secreción o a la formación de la superficie celular. Debido a su papel en el plegamiento de proteínas y en el transporte, el ER es también rico en chaperones dependientes de calcio tales como el GRP78 y GRP94 calreticulina que estabilizan los intermediarios del plegamiento de las proteínas 130. Muchos trastornos, incluidos los de regulación redox celular, causan la acumulación de proteínas desplegadas en el ER lo que provoca una activación de la UPR. La privación de glucosa también conduce al estrés del ER, al interferir con la glicosilación de las proteínas N-enlazadas. La infección viral también puede activar la UPR, lo que provoca estrés del ER con el fin de evitar la propagación del virus. Con una cierta cantidad de proteínas mal plegadas producidas en el ER se podría producir un colapso y atasco del tráfico de proteínas que puede incluso causar cuerpos de inclusión relacionados con las enfermedades neurodegenerativas, esta situación mejora por el transporte retrógrado de estas proteínas mal plegadas. La intención inicial de la UPR es adaptarse a los cambios del entorno y restablecer la función normal del ER. Estos mecanismos de adaptación implican programas transcripcionales que inducen la expresión de genes que aumentan la capacidad de plegado de las proteínas del ER y promueven la degradación y eliminación de las proteínas mal 95 plegadas. La traducción de los mRNA también está inicialmente inhibida, reduciendo la llegada de nuevas proteínas al ER. Si falla la adaptación el ER envía la señal de alarma mediante la activación del NF-kB, un factor de transcripción que induce la expresión de genes que codifican mediadores de defensa del huésped. El estrés excesivo y prolongado del ER provoca la apoptosis celular, lo que representa un último recurso de los organismos multicelulares para deshacerse de células disfuncionales. Cuando se acumulan proteínas en el ER, la liberación de proteínas transmembrana del ER se implican en la inducción de la UPR. Estas proteínas transmembrana del ER, con su extremo N-terminal en el lumen del ER y su C-terminal en el citosol, proporcionan un puente que conecta estos dos compartimentos. Normalmente, los extremos Nterminales de estas proteínas transmembrana del ER se unen por chaperones ER GRP78 (BiP), evitando su agregación. Sin embargo, cuando las proteínas mal plegadas se acumulan se unen a la GRP78, lo que permite la agregación de estas proteínas de señalización transmembrana y la iniciación de la UPR. Entre estas proteínas de señalización transmembrana se encuentran la PERK, la Ire1 y la ATF6 131(Fig.14). 96 Figura 14. Esta figura muestra las señales en los eventos relacionados con el ER de estrés. La Chaperona GRP78 une los extremos N de Ire1, PERK y ATF6, impidiendo su activación. Las proteínas desplegadas provocan que las GRP78 liberen a Ire1, PERK y ATF6. Al liberarse de las GRP78, el Ire1 y la PERK se oligomerizan en las membranas del ER. La Ire1 oligomerizada se une a TRAF2, más tarde se activan las quinasas que activan NF-kB y c-Jun (AP-1), que causan la expresión de genes asociados con la defensa del huésped (alarma). La actividad de ribonucleasa intrínseca de Ire1 también estimula la producción de XBP-1, un factor de transcripción que induce la expresión de genes implicados en la restauración del plegamiento de proteínas. La oligomerización de la PERK estimula su actividad de quinasa intrínseca, lo que resulta en la fosforilación de eIF2α y la supresión de la traducción del mARN. De esta forma, sólo los mRNAs seleccionados, incluyendo ATF4, se traducen. La ATF4 induce la expresión de genes implicados en la restauración de la homeostasis del ER. La liberación del GRP78 de la ATF6 permite a esta proteína la translocación al aparato de Golgi para el procesamiento proteolítico y liberar ATF6 activo, que controla la expresión de genes UPR. Figura adaptada de: Xu C, Bailly-Maitre B, Reed JC. Endoplasmic reticulum stress: cell life and death decisions. Journal of Clinical Investigation. 2005;115(10):2656-2664. doi:10.1172/JCI26373. La PERK (quinasa PKR del ER) es una quinasa, con el dominio compartido con otras quinasas de la familia de iniciación eucariótica 2α (eIF2α). Tras la eliminación del GRP78 se oligomeriza en la membrana del ER y se induce su autofosforilación activándose la quinasa. La PERK fosforila e inactiva la eIF2α, con lo que se ralentiza la traducción del mRNA con la consecuente reducción del número de proteínas que llegan al ER. Sin embargo, ciertos mRNA obtienen una ventaja selectiva para la traducción en 97 estas condiciones, incluyendo la ATF4 mRNA que codifica un factor de transcripción. La proteína ATF4 es un miembro de la familia de factores de transcripción bZIP, que regula los promotores de varios genes implicados en la UPR. La importancia de las señales PERK para la protección contra el estrés del ER ha sido documentada en varios estudios 131, 132. La Ire1 se oligomeriza, de forma similar al PERK, en las membranas del ER cuando se libera del GRP78. La proteína Ire1α es una proteína transmembrana de tipo I, que contiene dos dominios, una quinasa y una endorribonucleasa; esta última procesa un intrón del la familia de la proteína X-1 (XBP-1) mRNA, haciéndola competente para la traducción y la producción del la proteína XBP-1. XBP-1 se heterodimeriza con la proteína NF-Y y se une a elementos que actúan en los genes, incluyendo el potenciador del estrés del ER (ERSE) y el elemento de respuesta a proteínas desplegadas (UPRE) 133. La liberación de GPR78 de la ATF6 desencadena un mecanismo diferente de activación de la proteína, en comparación con la PERK y la Ire1. En lugar de oligomerización, la liberación de GRP78 hace que el ATF6 se traslade al aparato de Golgi, donde las proteasas escinden a la ATF6 en un sitio cercano a la membrana, liberando este factor de transcripción en el citosol y permitiendo que migre hacia el núcleo a regular la expresión génica 131. La ATF6 colabora con la Ire1, donde la ATF6 induce la transcripción para aumentar XBP-1 mRNA, y la actividad de la endorribonucleasa. La producción masiva de glicoproteínas se asocia con muchas infecciones virales, por ello no es sorprendente que el estrés del ER active las mismas vías de transducción de señal asociadas con la inmunidad innata. En este sentido, la Ire1 tiene en común con muchos miembros de la familia de receptores de TNF la capacidad de unirse al adaptador de proteína TRAF2. La TRAF2 es una ligasa E3 que se une al UBC13 134. La TRAF2 activa las quinasas implicadas en la inmunidad y la inflamación, incluyendo la ASK1, que activa la JNK, y las quinasas relacionadas con la activación del NF-kB. La respuesta de adaptación a las proteínas mal plegadas en el ER proporciona protección contra la muerte celular, ya que la transferencia de genes mediada por la sobreexpresión de GPR78 reduce la muerte celular inducida por el estrés oxidativo, por las alteraciones en el calcio y por la hipoxia. Sin embargo, si el mal plegamiento de proteínas es persistente o excesivo, el ER desencadena la muerte celular, generalmente por apoptosis. Existen diversos mecanismos propuestos de muerte celular inducida por el 98 estrés del ER, que incluyen la activación directa de las proteasas, de las quinasas, de los factores de transcripción, de las proteínas de la familia Bcl-2 o por sus moduladores. 6.7LA MATRIZ EXTRACELULAR Y LAS INTEGRINAS Las integrinas son una superfamilia de glicoproteínas que participan mayoritariamente en la unión de las células con la matriz extracelular, aunque hay algunas que también participan en la unión célula-célula. Están presentes en la superficie celular en elevadas concentraciones. Fundamentalmente son receptores de membrana y son componentes mayoritarios de la matriz extracelular. Algunas de estas integrinas pueden ser específicas para una sola molécula, pero en cambio hay otras que pueden reconocer diferentes ligandos. Las integrinas asocian la matriz extracelular con el citoesqueleto de la célula. El tipo de ligando que se unirá a una u otra integrina vendrá dado por el tipo de subunidades α y β que posea la integrina. Entre los múltiple ligandos de las integrinas se encuentran la fibronectina, la vitronectina, el colágeno y la laminina. La conexión entre la célula y la matriz extracelular podría ayudar a que la célula soporte fuerzas de empuje sin ser arrancada de la matriz. El anclaje de la célula a la matriz extracelular es un requerimiento básico para la formación de un organismo pluricelular. Las integrinas no son simples garfios, sino que transmiten numerosas señales claves sobre el entorno que rodea a la célula. Junto con las señales recibidas por los receptores celulares para factores de crecimiento solubles como VEGF o EGF, refuerzan la capacidad de la célula a la hora de tomar decisiones biológicas: moverse, ser anclada, morir, diferenciarse, etc. Por ello, las integrinas se encuentran en el centro de multitud de procesos biológicos. El anclaje de la célula se produce a través de la formación de complejos de adhesión celular, que se componen de integrinas y otras muchas proteínas citoplásmicas tales como la talina, vinculina, paxilina y α -actinina. Dicho anclaje es regulado por quinasas tales como la FAK (quinasa de adhesión focal) y los miembros de la familia Src quinasa, que fosforilan ciertos sustratos como la p130CAS, dando lugar al reclutamiento de adaptadores de señalización del tipo CRK. Estos complejos de adhesión se anclan al citoesqueleto de actina. 99 Las integrinas juegan un papel crucial en la señalización celular. La conexión con los componentes de la matriz extracelular pueden causar una señal que será transmitida al interior celular por medio de una quinasa que se encuentra indirecta y temporalmente conectada con el extremo intracelular de la integrina, probablemente recibiendo los cambios conformacionales inducidos por la unión con componentes de la matriz extracelular 135. Los receptores de las integrinas y las mismas integrinas regulan muchos aspectos de la fisiología celular, siendo de particular importancia en la adhesión celular y la migración. En un epitelio normal, las α / ß integrinas funcionan como receptores para la familia de laminina, proteínas de la matriz extracelular (como la laminina 1 y la laminina 5) y median en la unión estable de las células epiteliales a la membrana basal subyacente. La función de algunas integrinas, como la integrina α6/ß4, se altera sustancialmente a medida que el epitelio normal sufre una transformación maligna y evoluciona a carcinoma invasivo. La señal de cooperación entre las integrinas y los homólogos eritroblásticos 2 y 3 (ErbB2 y ErbB3) son necesarias para promover la activación del fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). Esta activación está mediada por GAB1 136. La integrina α6/β4 también puede formar complejos con receptores específicos de señalización del factor de crecimiento que actúan sinérgicamente para activar PI3K 136. En nuestros experimentos, el tratamiento con doxiciclina disminuye la expresión de múltiples factores implicados en la interacción entre la célula y la membrana extracelular, incluyendo ligandos tales como la laminina 1, la laminina 5 y la THBS1, también las integrinas β1 y ErbB3, mediadores intracelulares como vinculina, GAB1, PI3K, p85 y EIF4E3, lo que sugiere que la anoikis puede ser otro mecanismo por el cual la doxiciclina ejerce su acción sobre las células de pterigión. 100 6.8FACTORES DE CRECIMIENTO E INTERLEUQUINAS Varios factores de crecimiento como el VEGF, el MANF e interleuquinas como la IL-6 se encuentran elevados en las células del pterigión expuestas a doxiciclina. El VEGF ha atraído mucha atención en el estudio de las lesiones de pterigión, ya que son lesiones muy vascularizadas y el aumento del VEGF en el pterigión se ha apreciado claramente comparándolo con la conjuntiva normal 74. Además, las mujeres con un polimorfismo en el gen VEGF (VEGF-460C) tienen un riesgo 2,5 veces mayor de desarrollar pterigión 137. Estas observaciones fueron fundamentales en el diseño de ensayos clínicos en los que utilizó bevacizumab, un anticuerpo humanizado contra el VEGF, para tratar el pterigión 89. El hecho de que en los resultados del tratamiento con doxiciclina aparezca una mayor expresión del VEGF sugiere que esto puede ser una reacción compensatoria de las células cuya supervivencia se ve comprometida por la disminución en la síntesis de proteínas mitocondriales y del incremento del estrés del ER. En la misma línea, el MANF no sólo actúa como un factor de crecimiento de los astrocitos y otras células nerviosas, sino también como un factor protector contra el estrés del ER 138. Como existe un aumento enorme en los genes relacionados con la respuesta del estrés del ER al tratamiento con doxiciclina, la expresión del MANF se puede interpretar como un intento de compensar estas circunstancias perjudiciales. La IL-6 es una citoquina proinflamatoria que aparece en el pterigión por exposición a la luz UV y podría ser parte de la vía patológica que conduce a la formación de la lesión 26. La elevación de esta citoquina se relaciona con un aumento de la angiogénesis, la proliferación celular, el potencial de invasión y la inflamación. La elevación de los niveles de IL-6 después del tratamiento con doxiciclina puede ser también parte del programa de supervivencia de las células de pterigión que se enfrenten a las duras condiciones creadas por el antibiótico. 108 Tras este estudio y valorando los resultados sabemos que la doxiciclina actúa en la estructura molecular del pterigión, especialmente en caucásicos, y clínicamente parece disminuir también el tamaño del pterigión con lo que se abren nuevas expectativas de tratamiento de esta patología. Sería interesante seguir investigando en esta línea por lo que tenemos en proyecto realizar otro estudio administrando doxiciclina tópica a un grupo de paciente con pterigión y valorar su evolución. Queremos saber si el fármaco sería tan efectivo a nivel tópico como sistémico y si de esta manera evitaríamos los efectos secundarios de la vía oral. A parte de las implicaciones clínicas en los pacientes de pterigión también podría ser interesante iniciar nuevas investigaciones en otras patologías que puedan beneficiarse de las alteraciones descritas por la doxiciclina a nivel molecular. 9BIBLIOGRAFÍA ———————————————————— 112 1. Balci M, Sahin S, Mutlu FM, Yagci R, Karanci P, Yildiz M. Investigation of oxidative stress in pterygium tissue. Mol Vis 2011;17:443-447. 2. Festoff BW, Ameenuddin S, Arnold PM, Wong A, Santacruz KS, Citron BA. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem 2006;97(5):1314-1326. 3. Kim HS, Suh YH. Minocycline and neurodegenerative diseases. Behav Brain Res 2009;196(2):168-179. 4. Zhu H, Sun X, Wang D, Hu N, Zhang Y. Doxycycline ameliorates aggregation of collagen and atrial natriuretic peptide in murine post-infarction heart. Eur J Pharmacol 2015;754:66-72. 5. Casas C, Paul C, Lahfa M et al. 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Here we present the results of a double blind, randomized, placebo controlled clinical trial in patients suffering from primary pterygium comparing 30 days of treatment with oral doxycycline vs. placebo. Results were very influenced by the race and age of the patients, with Caucasian and older people benefiting most from the treatment. Materials and Methods Ethical issues All procedures were approved by the local review board (Comite´E ´tico de Investigacio´n Clı ´nica de La Rioja, CEICLAR) and the Spanish Agency for Drugs and Medical Products (Agencia Espan˜ola de Medicamentos y Productos Sanitarios, AEMPS). All described procedures adhere to the tenets of the Declaration of Helsinki. Moreover, the trial was registered in the European Union Clinical Trials Register with code number EudraCT 2008007178-39. The protocol for this trial and supporting CONSORT checklist are available as supporting information; see Checklist S1, Protocol S1 (in Spanish), and Protocol S2 (in English). Patients The study was designed as a unicentric trial with patients diagnosed with primary pterygium at the Ophthalmology Service of the Hospital San Pedro (Logron˜o, Spain). Ninety-eight consecutive patients fulfilling inclusion criteria signed the informed consent documents and were recruited into the trial. Inclusion criteria called for patients suffering from untreated primary pterygium producing at least one of the following symptoms: i) astigmatism with no other cause, ii) foreign body sensation, and/or iii) corneal involvement threatening the visual axis. In addition, patients had to be at least 18 years old. Exclusion criteria encompassed pregnant or lactating women, fertile women not following a contraceptive plan, allergies to doxycycline, conditions where doxycycline is contraindicated such as lupus eritematosus or miastemia gravis, treatment with doxycycline incompatible drugs, and patients whose characteristics would prevent proper follow-up. The number of patients needed on each arm of the study was estimated assuming a mean reduction of the pterygium lesion in the placebo group of 5% vs. a 15% reduction for the doxycycline group, and a maximum standard deviation of 15%. Using a Student’s ttest for 2 independent samples, a two-sided alpha level of 5%, and a power of 90%, 49 patients are needed on each arm to detect a significant difference between groups of 10% in pterygium surface reduction. Experimental drug and placebo Doxycycline was provided as Vibracinaß100 mg (Invicta Farma, Madrid, Spain). Capsules were extracted from their blisters and repackaged by the Hospital’s Pharmacy in brown-glass bottles containing 60 capsules/each. The placebo was prepared by the Hospital’s Pharmacy using empty Vibracinaßcapsules, that were generously provided by Invicta Farma. These capsules were filled up with lactose solution, desiccated, closed, and packaged in brown-glass bottles (60 capsules/bottle). Each bottle (doxycycline or placebo) was assigned a randomly generated trial code and issued to patients accordingly, thus guaranteeing a double-blind masking of the trial. The dose of 200 mg/day was chosen based on the study by Smith et al. where they described this dose as the most efficient in reducing MMP activity in patients [23]. Study design and procedures Each patient completed 4 visits to the Ophthalmology Department. On the first visit, a diagnosis of the pterygium was made and clinical history data were collected. If the patient fulfilled the inclusion criteria and none of the exclusion criteria applied to him/her, he/she was asked to be included in the trial. After signing the informed consent forms, a code was assigned to this patient for the duration of the trial. To estimate the size of the lesions, the diameter of the cornea was first measured with a compass, then a photograph was taken of the affected eye (or both in the case of bilateral pterygia) with a Zeiss FF 450 plus I.R. camera (Carl Zeiss, Meditec AG, Berlin, Germany) attached to a retinographer. The size of the pterygium lesion lining the cornea was calculated with the camera’s image software package (Visupac TM , Carl Zeiss), taking into consideration the compass measurement. Pterygia were classified as T1, T2 or T3, according to Tan’s grading system [24]. Using his/her code, the patient was given a bottle of capsules by the Hospital’s Pharmacy and the pertinent contact information in case adverse events may occur. Patients were asked to take 2 capsules a day, in the morning and the evening, for 30 consecutive days. The second visit was scheduled 31 days after the first one, just as the patient had finished the treatment. At this time a second photograph was taken of the affected eye(s) and a general evaluation was made. After this point, the ophthalmologists performed surgical resections of the pterygia whenever the procedure was clinically indicated. In these cases, the procedure consisted in a simple resection followed by autologous conjunctival transplant and application of a fibrin-based biological glue (Tissucol, Baxter, Valencia, Spain). The third and fourth visits occurred 6 and 12 months after the second one. The ophthalmologists performed follow-up observations and paid special care to record potential recurrences. Objectives and outcomes The main objective of this study was to determine whether oral doxycycline treatment can reduce pterygium growth. Thus, the primary outcome was the variation in the surface area occupied by the pterygium lesion when comparing the photographs taken during the second and the first visit. Photographs were processed with Visupac TM and ImageJ (NIH, Bethesda, MD) and the area occupied by the lesion calculated. As secondary outcome, the number of recurrences at the end of the study (4 th visit) were also considered. Statistical analysis The variation of surface area occupied by the pterygium lesion, a continuous variable, was compared between the two experimental groups with the Student-Fisher ttest. Normalcy was determined by the Shapiro-Wilk test. Subgroup analysis was performed using logistic regression tests. Interactions among variables were studied with backward models based on likelihood ratios. Categorical variables were compared using chi-square test. Correlation tests (Spearman’s correlation coefficient) were used to compare age and response to the drug. pvalues lower than 0.05 were considered statistically significant. All these analyses were Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions PLOS ONE | www.plosone.org 2 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52696 carried out with SPSS 17.0. Both per-protocol and intention-totreat analyses were performed. Results Study population and group assignments Between October 2009 and May 2010, a total of 98 patients diagnosed with primary pterygium underwent randomization (49 in each group) at the Hospital San Pedro (Logron˜o, Spain). In the per-protocol analysis, primary outcome data were available for 34 patients in the placebo group and 23 in the doxycycline-treated group (Fig. 1). Demographic and clinical characteristics at baseline were similar between the two groups (Table 1). Adverse events As expected for doxycycline, adverse events were minimal and resolved quickly after medication was suspended. These included 5 cases of nausea and vomit (1 placebo, 4 doxycycline), 2 cases of Figure 1. Consort flow diagram. The major reasons for not meeting the inclusion criteria were pregnancy (8) and being on a treatment with doxycycline incompatible drugs (6). Many patients were lost to follow-up probably due to the high number of immigrants, a very mobile population, that were enrolled in the trial. Six patients had to suspend treatment due to mild adverse events. Several patients had more than one pterygium, so the total number of pterygia is also included. doi:10.1371/journal.pone.0052696.g001 Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions PLOS ONE | www.plosone.org 3 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52696 eczema (1 placebo, 1 doxycycline), and 1 case of phototoxicity (in the placebo group). Outcomes Photographs of the pterygium lesions were taken in the first two visits (Fig. 2). After a month of treatment, the overall data showed that pterygia that had been treated with oral doxycycline experimented a relative change (size measured in the second visit divided by size in the first visit) of 0.9860.05, whereas in those receiving placebo the relative change was 1.0160.03. These differences were not statistically significant when analyzing either the per-protocol (p= 0.225) or the intention-to-treat (p= 0.191) populations (Student’s ttest). Subgroup analysis was performed through logistic regression to investigate whether doxycycline had a beneficial effect on particular groups defined by age, sex, race, or initial lesion size and morphology. Pterygia whose relative change was $1 (did not change size or grew) were given the value ‘‘0’’ whereas those with a relative change ,1 (growth reduction) were labeled as ‘‘1’’. For race, patients of Caucasian origin were labeled ‘‘0’’, and all others as ‘‘1’’. Other variables included sex, age, initial pterygium morphology, and initial size of the pterygium lesion. A multivariant enter logistic regression (also called simultaneous regression) revealed than only ‘‘age’’ had an independent effect on lesion reduction (p,0.019). To test whether interactions occurred among all these variables, a backward logistic regression model, where all independent variables are entered at one time and then they are removed one at a time based on a preset significance value, based on likelihood ratios was performed (Table 2). On the third step, age, race, and treatment were the only significant variables. When we tried to estimate the particular odds ratios, the model did not converge due to insufficient sample size, thus only the statistical significance is shown. In summary, doxycycline effect on pterygium is heavily dependent on the race and age of the patient, being more efficient on people of Caucasian descent and older age. The effect of age on the efficacy of the doxycycline treatment was further investigated by correlation analysis. There was a positive correlation (Spearman’s r=20.4783, 95% CI 20.7025 to 20.1678, p= 0.003) between increasing age and larger reduction of the pterygium lesion on the treated individuals. Obviously, no such correlation occurred in patients receiving placebo (Fig. 3). The contribution of race is represented through a waterfall graph (Fig. 4) where the effect of doxycycline is clearly seen in Caucasians (Fig. 4B) but is undistinguishable from placebo in Hispanic patients (Fig. 4D). Something unexpected was the wide variation in pterygium size we observed in the placebo-treated patients (Fig. 4 A, C). Only 15 patients underwent corrective surgery during the trial period and none of these presented a relapse during the 12 months following the end of the treatment, Table 1. Baseline demographic and clinical characteristics of the patients enrolled in the trial. Placebo (n = 49) Doxycycline (n = 49) Statistical test p value Sex (male/female) 28/21 27/22 x 2 1.00 Race or ethnic group* (Caucasian/Hispanic/Other) 19/24/6 19/25/5 x 2 0.95 Age{[range] 51.2961.98 [29–80] 49.7162.14 [20–86] t0.59 Initial size of pterygium{[range] 4.6560.39 [1.07–14.48] 5.2560.48 [0.71–17.49] t0.34 Initial pterygium morphology1(T1/T2/T3) (9/21/19) (6/22/21) x 2 0.69 *Race or ethnic group was self-reported. { Plus-minus values are means 6E. { Pterygium size is expressed in mm 2 . 1 As classified by Tan et al. [24]. doi:10.1371/journal.pone.0052696.t001 Figure 2. Photographs of the eye of patient number 20 (male, 61 year-old, Caucasian)before (A)and after (B)the treatment with doxycycline for 30 days. A clear reduction of the lesion’s size can be appreciated, from 5.44 mm 2 to 3.95 mm 2 . doi:10.1371/journal.pone.0052696.g002 Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions PLOS ONE | www.plosone.org 4 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52696 therefore not enough data was available to evaluate whether the treatment had any influence on recurrence frequency. Discussion In this study we have shown that oral doxycycline, given during 30 days at 200 mg/day, does modify the growth pattern of pterygium lesions in Caucasian patients, a result which is in agreement with previous observations in a mouse model [21]. Moreover, older patients responded better to the treatment. We were surprised by the low compliance seen in this trial. In fact, only 64% of patients came back for their second visit, which was needed to allow measurement of the primary outcome. Two reasons may explain this behavior. First, not being a lifethreatening disease, pterygium is often viewed as a cosmetic problem rather than a serious condition. Second, pterygium is more prevalent in subtropical regions of the world, probably in relation with a higher UV light exposure [25]. In consequence, a large proportion of all diagnosed cases in Spain corresponds to Southand Central-American immigrants, which is a very mobile population, often depending on temporary employment. This issue should be taken into consideration for the design of future clinical trials on pterygium patients. One of the most predictive variables of doxycycline response was race. Hispanic patients did not respond to doxycycline treatment whereas their Caucasian counterparts did. Broad differences have been reported in the prevalence of pterygium in various ethnic backgrounds [26–28]. There are also reports on different recurrence rates between Hispanic and white patients [29]. In addition, doxycycline has been shown to influence up to 332 genes when applied to pterygium cells, involving relevant cellular pathways such as mitochondrial gene expression, endoplasmic reticulum stress, integrins, extracellular matrix components, cell cycle regulators, and growth factors [21]. Any differences in theses pathways among races may be responsible for their differential responses to the drug. Gene profiling studies comparing pterygia originated in Caucasian and Hispanic patients may shed some light on this unexpected behavior. In addition, studies can be designed for the study of pterygium tissue collected after surgical removal to see the differences elicited by doxycycline treatment in these patients. There is a significant correlation between pterygium incidence and age [28,30,31] but an explanation is needed for the observation that doxycycline treatment was more efficient in older patients. Perhaps the eye of older patients becomes more Table 2. Statistically significant variables in the backward logistic regression model based on likelihood ratio. Variable Significance level Treatment ,0.001 Age by treatment ,0.001 Race by treatment 0.002 Age by race by treatment 0.002 doi:10.1371/journal.pone.0052696.t002 Figure 3. Correlation plot between patient’s age (abscises)and relative response to treatment (ordinates)for patients that received either placebo (green circles)or doxycycline (red squares).The green and red lines represent the correlation slope for each set. There is a significant correlation for doxycycline treatment (Spearman’s r=20.4783, 95% CI 20.7025 to 20.1678, p= 0.003). Relative change in surface is the quotient between the size of the lesion in the second visit divided by the size in the first visit. doi:10.1371/journal.pone.0052696.g003 Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions PLOS ONE | www.plosone.org 5 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52696 permeable to systemic doxycycline, thus allowing a higher dosage on the eye surface. This may be in connection with the fact that the beneficial effect of doxycycline was much larger in mice [21] than in humans, which may be due to several reasons. First of all, the anatomy and physiology of mouse and human eyes are very different [32]. These differences include size, diurnal vs. nocturnal habits, and histological features such as a rudimentary Bowman’s membrane in the mouse [33], and might influence the pharmacokinetics of an orally administered drug. There are some discrepancies on the amount of orally administered doxycycline that can reach the eye surface. For instance, in a set of patients and healthy individuals which were given oral doxycycline, the drug was easily found in the blood but the tear film was devoid of it [34]. A similar result was found in horses [35]. Nevertheless, an experiment performed in macaques found that oral administration of doxycycline was enough to induce transgene activation in the eye of these animals [36]. In the same direction, oral doxycycline was able to reduce angiogenesis in the rat cornea [19]. Therefore, there seems to be an inverse correlation between eye size and doxycycline ability to reach the outer surface of the eye. Other antibiotics encounter also some difficulties to cross the hematoocular barrier in humans [37]. There may be an age-dependent relaxation of this barrier or just an increase on doxycycline sensitivity in older patients. Another unexpected observation was the ample variation in pterygium size modifications seen in placebo-treated patients. A small part of this variation may be due to measurement errors and the difficulty to properly measure the size of pterygium lesions has been previously recognized [38]. But, apart from that, there were real changes in size in the four weeks between photographs, including both increases and decreases of the total affected area. This may represent an intrinsic feature of the biology of pterygium which had not been previously recognized. There may exists an unstable equilibrium between factors promoting pterygium growth and host defence mechanisms trying to reduce it, which results in this ‘‘wobbling’’ behavior. This fact should be taken into consideration for the design of future clinical trials. In conclusion, oral doxycycline reduces pterygium lesion size in white patients and could be used as a treatment for pterygium symptoms or as a means to delay surgical resection. In this trial we have used a systemic treatment to follow our previous experience on an animal model [21] but topical application of doxycycline may be even more efficient in controlling pterygium size. Larger clinical trials are needed to better characterize this effect and to investigate the efficiency of doxycycline on other ethnic backgrounds. Supporting Information Checklist S1 CONSORT Checklist. (DOC) Protocol S1 Trial protocol (in Spanish). (DOC) Figure 4. Waterfall representation of the relative changes in pterygium surface for all intention-to-treat patients treated with placebo (A, C)or with doxycycline (B, D), according to race. Each bar represents an individual pterygium. To comply with waterfall representation conventions, values are represented as relative change in surface minus 1, so that positive values represent lesion growth and negative values represent lesion reduction. doi:10.1371/journal.pone.0052696.g004 Oral Doxycycline Reduces Pterygium Lesions PLOS ONE | www.plosone.org 6 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52696 Protocol S2 Trial protocol (in English). (DOC) Acknowledgments We are very grateful to Dr Enrique Ramalle-Go´mara (Epidemiology and Health Prevention Service, Logron˜o, Spain) for his help with the statistical analysis. Author Contributions Conceived and designed the experiments: SV AM. Performed the experiments: OR IML MTB. Analyzed the data: IML AM. Contributed reagents/materials/analysis tools: OR IML AM. Wrote the paper: AM. References 1. Dushku N, John MK, Schultz GS, Reid TW (2001) Pterygia pathogenesis: corneal invasion by matrix metalloproteinase expressing altered limbal epithelial basal cells. 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Larra ´yoz 1 , Alberto de Luis 2 , Oscar Ru ´a 3 , Sara Velilla 3 , Juan Cabello 1 , Alfredo Martı ´nez 1 * 1Oncology Area, Center for Biomedical Research of La Rioja (CIBIR), Logron ˜o, Spain, 2Ultrasequencing and Bioinformatics Core Facility, Center for Biomedical Research of La Rioja (CIBIR), Logron ˜o, Spain, 3Ophthalmology Service, Hospital San Pedro, Logron ˜o, Spain Abstract Pterygium is a lesion of the eye surface which involves cell proliferation, migration, angiogenesis, fibrosis, and extracellular matrix remodelling. Surgery is the only approved method to treat this disorder, but high recurrence rates are common. Recently, it has been shown in a mouse model that treatment with doxycycline resulted in reduction of the pterygium lesions. Here we study the mechanism(s) of action by which doxycycline achieves these results, using massive sequencing techniques. Surgically removed pterygia from 10 consecutive patients were set in short term culture and exposed to 0 (control), 50, 200, and 500 mg/ml doxycycline for 24 h, their mRNA was purified, reverse transcribed and sequenced through Illumina’s massive sequencing protocols. Acquired data were subjected to quantile normalization and analyzed using cytoscape plugin software to explore the pathways involved. False discovery rate (FDR) methods were used to identify 332 genes which modified their expression in a dose-dependent manner upon exposure to doxycycline. The more represented cellular pathways included all mitochondrial genes, the endoplasmic reticulum stress response, integrins and extracellular matrix components, and growth factors. A high correlation was obtained when comparing ultrasequencing data with qRTPCR and ELISA results. Doxycycline significantly modified the expression of important cellular pathways in pterygium cells, in a way which is consistent with the observed efficacy of this antibiotic to reduce pterygium lesions in a mouse model. Clinical trials are under way to demonstrate whether there is a benefit for human patients. Citation: Larra ´yoz IM, de Luis A, Ru ´a O, Velilla S, Cabello J, et al. (2012) Molecular Effects of Doxycycline Treatment on Pterygium as Revealed by Massive Transcriptome Sequencing. PLoS ONE 7(6): e39359. doi:10.1371/journal.pone.0039359 Editor: Pedro Gonzalez, Duke University, United States of America Received March 29, 2012; Accepted May 21, 2012; Published June 19, 2012 Copyright: ß2012 Larra ´yoz et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: Supported by a Grant from Spain’s Ministry of Health, Social Policy, and Equality, No. DIN-021. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: [email protected]s Introduction Pterygium is a very common ocular surface lesion attributed to chronic ultraviolet light exposure which typically afflicts a younger population, adding tremendous burden, both human and financial, in many countries [1]. At the cellular level, pterygium is characterized by proliferation of limbal cells, inflammatory infiltrates, fibrosis, angiogenesis, and extracellular matrix breakdown [2–4]. Traditionally regarded as a degenerative condition, pterygia also display tumor-like features, such as propensity to invade normal tissue and high recurrence rates following resection [5]. The mechanism of pterygium formation is not completely understood but several processes have been suggested as part of the pathogenesis of this disease, including genetic predisposition, anti-apoptotic mechanisms, cytokines, growth factors, extracellular matrix remodelling, immunological mechanisms, and viral infections [6]. Currently, the only approved treatment for pterygium is surgery [7], a group of different procedures that, in some cases, result in high recurrence rates [8]. Recently, based on the profuse irrigation of the pterygium lesion, bevacizumab-mediated antiangiogenic therapies have been tested, but these protocols have produced inconclusive results [9,10]. In a recent article, it was shown that doxycycline, a common oral antibiotic, was able to dramatically reduce pterygium-like lesions in a mouse model [11]. The same antibiotic was responsible for reducing neovascularisation in a burn model of the rat cornea [12]. Apparently, doxycycline and other tetracyclines posses numerous properties which are independent of their antibiotic activity [13]. Specifically, the antiangiogenic effects of doxycycline seem to be related with the inhibition of matrix metalloproteinases [14,15], although alternative and/or synergistic mechanisms cannot be excluded. In the present study we decided to investigate the molecular effects of doxycycline on short-term primary cultures of pterygium cells, using ultrasequencing techniques, to better understand all the pathways affected by the antibiotic in pterygium. Results Primary cultures were established from pterygia surgically removed from 10 patients. To identify the cell population present in these cultures, immunofluorescence for different markers was performed. Confocal microscopy of these samples showed that the predominant cell population is composed of vimentin-positive cells, with a fibroblast-compatible morphology (Fig. 1). PLoS ONE | www.plosone.org 1 June 2012 | Volume 7 | Issue 6 | e39359