Análisis de la interacción específica de moléculas frente a un marcador tumoral mediante microbalanza de cuarzo QCM-D (Quartz Cristal Microbalance with Dissipation monitoring)

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Título del Trabajo ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN ESPECÍFICA DE MOLÉCULAS FRENTE A UN MARCADOR TUMORAL MEDIANTE MICROBALANZA DE CUARZO QCM – D (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE WITH DISSIPATION MONITORING). Autor: Carmen María Martínez Martínez Tutor/es: Francisco Javier Arias Vallejo Raquel Muñoz Martínez AGRADECIMIENTOS Me gustaría aprovechar este espacio para mostrar mi agradecimiento a todas las personas que de alguna manera forman parte de este trabajo. En primer lugar, agradecer a Javier y Raquel, tutores de este trabajo fin de Grado, su implicación y orientación a lo largo de todo el proyecto, así como la confianza depositada en mí. Del mismo modo, agradecer a Merche y Sofía sus propuestas, supervisiones y motivación para llevar el día a día. También a todos los compañeros del laboratorio de Bioforge por el tiempo dedicado, consejos y generar, no sólo un clima de trabajo excelente, sino una especie de gran familia donde ha sido un placer desarrollar este trabajo. Gracias a la Universidad de Valladolid y a su profesorado, personal de limpieza, personal de cafetería, de reprografía, biblioteca… porque ya sea de manera directa o indirecta, han hecho de estos años, unos GRANDES AÑOS. Finalmente, gracias a mi familia y en especial a mis padres, por acompañarme, apoyarme y motivarme para continuar cada día sin tirar la toalla. GRACIAS. ÍNDICE 1. RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………………………….1 2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………………………4 2.1 ELRs (Elastinlike Recombiamers)………………………………………………………………………………….…..5 2.2 Liberación dirigida de fármacos y agentes génicos mediante ELRs, fragmentos de anticuerpo y aptámeros…………………………………………………………………………………………………………….………...6 2.2.1 Terapia génica en cáncer de mama………………………………………………………….………..…8 2.2.1.1 Tenascina C………………………………………………………………………………………….……….9 2.2.1.2 Aptámeros………………………………………………………………………………………………..…10 2.3 QCM-D (Microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación)………………………..10 3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………………….…….....12 4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………………………………………………..14 4.1 Materiales………………………………………………………………………………………………………………………..15 4.2 Métodos………………………………………………………………………………………………………………………....19 4.2.1 Microbalanza de cuarzo……………………………………………………………………………………..19 4.2.1.1 Q -Sense D-find……………………………………………………………………………………………20 4.2.2 PlasmaFlow……………………………………………………………………………………………………..20 4.2.3 Balanza de precisión…………………………………………………………………………………………..27 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………………..…...28 5.1 Puesta a punto del método………………………………………………………………………………………..…….28 5.1.1 Preparación del sensor de oro…………………………………………………………………………….29 5.1.1.1 Condiciones óptimas de limpieza…………………………………………………………………29 5.1.1.2 Condiciones óptimas de activación ……………………………………………………….……30 5.1.2 Optimización de las condiciones de trabajo……......................................................31 5.1.2.1 Relación óptima de TTA1/MCH………………………………………………………………..….32 5.1.2.2 Concentración de Tenascina-C (1nM, 2nM,5nM y 20nM)…………………………....34 5.2 Estudio de la especificidad de la interacción entre la molécula de Tenascina-C y las moléculas de aptámeros GBI10 y TTA1………………………………………………………….………………………….………37 5.3 Estudio de la ausencia de la especificidad en la interación entre la inmunoglobulina IgA con las moléculas de aptámero GBI10 y TTA1………………………………………………………………………....42 5.4 Interpretación de la interacción entre el DSP con las moléculas de BSA, IgG y Tn-C…………...50 6. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………………….…55 7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………………………………….58 8. ANEXOS…………………………………………………………………………………………………………………………………..61 ABREVIATURAS Aptámeros: TTA1, GBI10 y 5TR1 Au : oro BSA: Proteína sérica bovina DSP: Ditiobis succinimidyl propionato IgA: Inmunoglobulina A IgG: Inmunoglobulina G MCH: 6-mercapto-1-hexanol QCM-D Microbalanza de cuarzo con monitoreo de dispación. Tn-C: Tenascina-C 1 1.RESUMEN 2 El estudio se enmarca en el desarrollo de nuevos sistemas de dosificación controlada de fármacos mediante el uso de recombinámeros tipo elastina (ELRs), los cuales, son una familia de biopolímeros proteicos producidos mediante técnicas de ADN recombinante, inspirados en la elastina natural y cuyas propiedades (biocompatibilidad, capacidad de autoensamblado, comportamiento inteligente) han permitido su aplicación en distintos campos biomédicos, entre ellos, liberación dirigida y controlada de fármacos o agentes génicos, que es en el que se centra el proyecto. Los ELRs pueden formar microo nanopartículas mediante autoensamblado y, de esta forma, encapsular fármacos o formar poliplexos (complejos polímero-ADN) con ácidos nucleicos. Su direccionamiento se puede llevar a cabo mediante fusión recombinante de los ELRs a fragmentos de anticuerpo (conservan el sitio de unión al antígeno), como scFv, o mediante conjugación química con aptámeros (ssRNA o ssDNA seleccionados por su unión específica a una diana). En el presente trabajo, se evaluará esta última haciendo uso de una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación QCM-D (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring), técnica a nanoescala en tiempo real para analizar fenómenos de superficie que incluyen formación de película delgada, mediante interacciones y/o reacciones. Tras estudios recientes, ha podido considerarse una estrecha relación entre la Tenascina-C y la posibilidad de desarrollo de un cáncer de mama. Los niveles de Tenascina-C son elevados en recién nacidos pero, al crecer, dichos niveles comienzan a disminuir; sin embargo, en pacientes que han desarrollado un cáncer de mama, se ha observado una sobreexpresión de dicha proteína, por lo que se puede decir que la Tenascina-C parece constituir una buena diana terapéutica para el tratamiento del cáncer de mama metastásico. Este trabajo se enmarca en el estudio de la interacción específica entre los aptámeros TTA1 y GBI10 y la Tenascina-C, con objeto de evaluar la posibilidad de utilizarlos como moléculas dirigidas frente a la Tenascina-C, y así direccionarlos en la terapia génica. Este trabajo también comprende la puesta a punto y optimización de las condiciones de trabajo y limpieza del sensor utilizado en el método de análisis. 3 The study is part of the development of new systems of controlled dosage of drugs through the use of elastin-type recombimers (ELRs), which are a family of protein biopolymers produced by recombinant DNA techniques, inspired by natural elastin and whose properties (biocompatibility, self-assembly capacity, intelligent behavior) have allowed its application in different biomedical fields, among them, directed and controlled release of drugs or gene agents, which is the focus of the project. ELRs can form microor nanoparticles by self-assembly and thus encapsulate drugs or form polypeptides (polymer-DNA complexes) with nucleic acids. Its targeting can be carried out by recombinant fusion of the ELRs to antibody fragments (they preserve the antigen binding site), such as scFv, or by chemical conjugation with aptamers (ssRNA or ssDNA selected by their specific binding to a target). In the present work, the latter will be evaluated using QCM-D (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring). After recent studies, it has been possible to consider a close relationship between Tn-C and the possibility of developing breast cancer. The levels of Tn-C are high in newborns, but when they grow, these levels begin to decrease; but nevertheless; in patients who have developed breast cancer, overexpression of this protein has been observed, so it can be said that Tn-C seems to be a good therapeutic target for the treatment of metastatic breast cancer. This work is part of the study of the specific interaction between the aptamers TTA1 and GBI10, molecules directed against Tn-C, as well as the development and optimization of working conditions and cleaning of said method of analysis. On the other hand; The dependence of the existing covalent interaction between the DSP (Ditiobis succinimidyl propionate) and a series of molecules of different molecular weights will be evaluated. 4 2.INTRODUCCIÓN 5 2.1 ELRs (Elastin-like Recombinamers) Los recombinámeros de tipo elastina son una familia de biopolímeros proteicos inspirados en la elastina natural y producidos mediante técnicas de ADN recombinante. Su naturaleza recombinante permite un control estrecho sobre su composición aminoacídica y propiedades, además de facilitar su producción a gran escala, lo que supone una gran mejora respecto a los polímeros de tipo elastina sintetizados químicamente (Elastin-like Polymers) [1].La mayoría de sus propiedades derivan de la elastina natural, entre ellas, biocompatibilidad, capacidad de deformación reversible, de autoensamblado y comportamiento inteligente, es decir, capacidad de respuesta a estímulos, siendo la temperatura la variable más estudiada. Los ELRs experimentan un fenómeno de transición inversa con la temperatura (ITT), que consiste en que las cadenas poliméricas están hidratadas, desordenadas y relativamente extendidas por debajo de una temperatura específica (temperatura de transición, Tt), mientras que por encima de ella las cadenas se pliegan formando una estructura secundaria dinámica conocida como espiral-β, y se asocian entre sí mediante interacciones hidrofóbicas, produciéndose un cambio de fase (Fig 1). Este proceso es reversible y permite su purificación mediante ciclos de calentamiento y enfriamiento seguidos de centrifugación (Inverse Transition Cycling, ITC). Las propiedades de estos polímeros y la versatilidad en el diseño han permitido su aplicación en distintos campos biomédicos, principalmente ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y liberación de fármacos o agentes génicos, que es en el que se centra el presente trabajo [1]. Figura 1. Representación esquemática de la transición térmica de los ELRs (ITT), de la conformación extendida (T<Tt, regiones hidrofóbicas desordenadas y rodeadas por estructuras de tipo clatrato formadas por el agua) a la conformación plegada de tipo espiral-β (T>Tt, regiones hidrofóbicas ordenadas con exclusión del agua) 12 3.OBJETIVOS 13 Debido a la necesidad del desarrollo de terapias dirigidas en enfermedades con alta incidencia, como el cáncer de mama, y en base al potencial de las combinaciones ELR/ aptámero como sistemas de liberación dirigida de fármacos, este trabajo se desarrolla con varios objetivos: 1. Puesto que la QCM-D se trata de un nuevo método de análisis, uno de los primeros objetivos será el estudio de la puesta en marcha del mismo, (preparación del sensor de Au, optimización de las condiciones de trabajo…). 2. En base a la relación existente entre la Tn-C y el desarrollo de cáncer de mama, se estudiará la especificidad en la interacción entre la molécula de Tn-C y los aptámeros GBI10 y TTA1. 3. Por otro lado, se estudiará la ausencia de especificidad en la interacción entre la inmunoglobulina IgA con los aptámeros 5TR1, GBI10 y TTA1. Este estudio será complementario al anterior y permitirá corroborar la existencia de especificidad entre la molécula de Tn-C con los aptámeros GBI10 y TTA1. 4. Además, se comparará qué interacción es más efectiva; si Tn-C sobre Au o Tn-C sobre DSP (Ditiobis succinimidyl propionato), actuando este último como un agente de interacción covalente. 5. Finalmente, un quinto objetivo será comprobar que la masa depositada sobre la molécula de DSP (Ditiobis succinimidyl propionato), depende del Peso Molecular de la molécula con la que interacciona. 14 4. MATERIALES Y MÉTODOS 15 4.1 MATERIALES: - Materiales de la QCM-D Sensor de Au: Sensores de cuarzo recubiertos de oro (dAu = 100nm) (QSX301, Biolin Scientific), con una frecuencia fundamental de 4.95 MHz. Figura 3. Sensores de cuarzo recubierto de oro. - Materiales Químicos Tampón fosfato salino PBS (10x): (phosphate buffered saline). Gibco PBS (10X) Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X, pH 7.2, 500mL,10X Concentration, 7.1 to 7.3 pH, 2800 to 3200mOsm/kg Osmolality. Disolución Piraña: Solución piraña (70% (v/v) 𝐻2𝑆𝑂4 (Sigma Aldrich, Ref 258105) 30% (v/v) 𝐻2 𝑂2 (Sigma Aldrich,Ref.216763)). Debe realizarse in situ, justo en el momento previo a la realización del ensayo con QCMD (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring). 16 DSP (Ditiobis succinimidyl propionato) Sigma Aldrich Ref.57757-57 MCH: (6-mercapto-1-hexanol) Sigma Aldrich Ref. 451088 HS(C𝑯𝟐 )𝟔OH. Peso Molecular: 134.24 g/mol Debido a que se trabaja con concentraciones muy pequeñas, del orden de nanomolaridades, la preparación de las disoluciones es una etapa clave. Se prepararon disoluciones seriadas de MCH en tampón PBS (x1) y, para ello, se partió de una disolución de MCH (7.00 M), a partir de la cual se preparó una disolución STOCK de concentración 100 mM. A partir de la disolución STOCK, se prepararon, por disoluciones seriadas, una disolución de 500 µM, 200µM y de 100µM. Figura 4.Representación de la preparación de las disoluciones seriadas. 800µL 1000µL 500µM 200µM 100µM 100 mM MCH/PBS (1x) 10µL 7.00 M (MCH) 7.14µL 17 - Materiales biológicos Tenascina C: Proteína purificada humana Tenascina - C (20nM, 280-300kDa) (Merck Millipore). Aptámeros: TTA1, GBI10 y 5TR1: Aptámeros GBI10 y TTA1 presentan grupos tioles que permiten su inmovilización a el sensor mediante formación de un enlace covalente con el oro. Ambos aptámeros han sido comprados en la empresa METABION y son específicos para la molécula de Tn-C. - Aptámero TTA1. Presenta una modificación en 5' (5'-Thio-C3-),de tal forma que tiene la siguiente secuencia: GGGAGGACGATGCGGAACAATGCACTGTGGCCGTAATGGATGTTTTGCTCCC TG. Nº de bases: 55 - GBI10. Nuevamente, presenta una modificación 5',tomando la siguiente secuencia: CCCAGAGGGAAGACTTTAGGTTCGGTTCACGTCC Nº de bases: 34 - 5TR1. También comprado en la empresa METABION. Tiene la siguiente secuencia: 5´GAAGTGAAAATGACAGAACAACA´3 BSA Proteína de suero bovina. Sigma Aldrich Ref. 9048-46-8. 18 Inmunoglobulina A: IgA Antibodies ABIN 3119782 Inmunoglobulina G: IgG Procedente de suero humano cedido por el centro de hemoterapia de Valladolid. 19 4.2 MÉTODOS: 4.2.1 Quartz Crystal Micobalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). El trabajo presentado se basa en el análisis con la QCM-D, de las interacciones entre moléculas inmovilizadas a una superficie de Au y otras moléculas en disolución. La microbalanza nos permite determinar la masa depositada en la superficie del sensor de oro mediante los cambios de frecuencia de un cristal de cuarzo piezoeléctrico, al ser perturbado por la adición de una pequeña masa. La medida de frecuencias se hace con gran precisión y de forma sencilla lo que permite medir masas pequeñas. La correlación entre la masa y la frecuencia se obtiene por medio de la ecuación de Sauerbrey (apartado 4.2.1) Además de medir la frecuencia, f (Hz), también mide la disipación de energía, D (1𝐸−6). La disipación es una cantidad adimensional con relación inversa a la frecuencia de resonancia y a la constante de tiempo de descenso (decay time constant). Como tal, da una medida cualitativa de la amortización (damping) del sistema. En este trabajo, f y D se midieron a la frecuencia de resonancia fundamental (4,95 MHz), así como a los armónicos 3, 5 y 7 (i = 3, 5, y 7), dichos armónicos deberán tomar unos determinados valores para saber que los resultados obtenidos son viables. - Armónico 3 : < 35 - Armónico 5 : < 15 - Armónico 7 : < 10 Se presentan los cambios de frecuencia normalizados Δf = Δf𝑖/i y los cambios de disipación ΔD = ΔD𝑖. Los experimentos se realizaron en las siguientes condiciones: ¾ En un flujo continuo de tampón PBS (1x) con un caudal de 20µL 𝑚𝑖𝑛−1 , utilizando una bomba peristáltica. ¾ La temperatura de la plataforma y todas las soluciones se estabilizaron para garantizar una operación estable a 23 ºC. Todos los tampones se desgasificaron previamente para evitar la formación de burbujas en el sistema fluídico. 20 ¾ En el caso de películas homogéneas, casi rígidas ( para un sensor de 4.95 MHz), los desplazamientos de frecuencia son proporcionales a la absorción de masa por unidad de área (ng𝑐𝑚2) que se puede deducir de la relación Sauerbrey: 𝑚𝑄𝐶𝑀 = -CΔf Donde la sensibilidad de la masa, c, es igual a 18 ng cm-2 Hz-1 en f1 = 4.95 MHz. Debe tenerse en cuenta que si la película está solvatada, la densidad de masa acústica del área de la película estará compuesta por las densidades de masa por área del adsorbato, las partículas, y el disolvente acoplado hidrodinámicamente, el disolvente 𝑚𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡: 𝑚𝑄𝐶𝑀 = 𝑚𝑎𝑑𝑠 + 𝑚𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡 Las sustancias que forman películas de carácter viscoso, por ejemplo aquellas con alto contenido en agua, se deforman durante la oscilación produciendo una disipación elevada, sucediendo lo contrario con las películas rígidas. Por lo tanto, este factor permite determinar cuándo no se puede aplicar la ecuación de Sauerbrey así como realizar un modelado viscoelástico, en su lugar, para conocer las propiedades y la masa depositada, que incluye la masa de disolvente [12, 13] 21 Figura 5. Imagen del equipo “Quartz Crystal Micobalance with Dissipation Monitoring” (QCM-D) Los datos dados por el equipo son visualizados en el monitor del siguiente modo: Figura 6. Representación gráfica de los resultados registrados a partir del programa “Q Soft” del equipo QCM-D. La línea azul, se corresponde con los valores de las frecuencias (Hz), mientras que las línea roja se corresponde con los valores de disipación (1𝑬−𝟔).Del mismo modo, a la derecha del monitor aparecen hasta 13 armónicos pudiendo ser seleccionados aquellos de interés. Bomba peristáltica Sistema de encendido/apagado Monitor/ Equipo de registro de datos Microbalanza con cristal de cuarzo Toma de corriente Armónicos seleccionados Valores de frecuencias (Hz) Valores de disipación (1𝐸−6) Plataforma de Temperatura 28 5.1 Puesta a punto del método 5.1.1 Preparación del sensor de Au. Debido a que se trata de un método con una elevada sensibilidad y precisión y las concentraciones con las que se trabaja son del orden de nanomolaridades la optimización de cada una de las etapas es imprescindible. En este primer apartado, el objetivo será poner a punto las condiciones óptimas para la limpieza del sensor de Au, así como su activación. 5.1.1.1 Condiciones óptimas de limpieza. Tal como se ha explicado en métodos, la superficie del sensor se limpió sumergiéndolo en solución piraña (70% (v/v) 𝐻2𝑆𝑂4, 30% (v/v) 𝐻2𝑂2 durante una hora sin agitación (apartado métodos 4.2.2) (Anexo 2). La preparación de la misma se llevó a cabo en una campana de extracción ya que se trata de una reacción muy exotérmica. El sensor debe de estar completamente sumergido en la disolución, ya que de no ser así, la limpieza no será plena. Transcurrido ese tiempo, se lavó con agua desionizada dos veces durante 5 minutos cada una de ellas y finalmente se procedió a un lavado con etanol diluído en agua desionizada al 98% de pureza, con el objetivo de facilitar la etapa de secado [19]. El secado se llevó a cabo con una corriente de 𝑁2 gas. Una vez limpio y seco se guardó en una placa Petri tapada para evitar la humedad y el polvo. El proceso de limpieza del sensor es de gran importancia para la obtención de óptimos resultados porque al realizar los primeros ensayos, lo que se observó es que dependiendo del momento en que se llevara a cabo su limpieza, los resultados que se obtenían eran diferentes. Al comenzar con el desarrollo de este trabajo, la limpieza del sensor se llevaba a cabo el día previo al ensayo según las instrucciones de los fabricantes, obteniéndose unos valores de armónicos fuera del rango considerado como aceptables [apartado 4.2.1]. Por el contrario, cuando la limpieza se realizaba en momentos previos a la colocación del sensor en la microbalanza, los resultados que se obtenían eran adecuados. Una posible razón para explicar los resultados anómalos que se obtenían llevando a cabo la limpieza del sensor de Au el día antes a la realización del ensayo con la microbalanza, es que al tratarse de un método especialmente 29 sensible, pequeñas partículas de polvo podrían ocasionar problemas en los resultados. 5.1.1.2 Condiciones óptimas de activación. Una vez completada la etapa de limpieza y secado, se procede a la etapa de activación del sensor con un equipo de Plasma Flo PDC – FMG tal y como se ha indicado en Métodos (apartado 4.1) y presente en las dependencias de los laboratorios Bioforge. El gas usado para generar el plasma fue el Ar, al cual, se le aplica una energía de 1520.6 kJ/mol permitiendo su ionización y la formación del plasma (gas fuertemente ionizado). Los electrones liberados podrán moverse libremente, chocando con la superficie de Au del sensor con la energía suficiente como para completar la etapa de limpieza, rompiendo aquellos enlaces existentes entre las moléculas que se hacen pasar con la superficie del sensor de Au que pudieran permanecer tras la etapa de limpieza con la disolución piraña. Cada vez que el sensor se somete a plasma, éste pierde masa por lo que, va a tener un tiempo de vida media eficaz. En algunos casos, se han observado modificaciones macroscópicas de la superficie del sensor, debidas a su reutilización y limpieza, pudiéndose establecer un número máximo de usos. En esta etapa de activación, también hay que hacer hincapié en la limpieza. En el interior del equipo, se dispone de un cristal que actúa como soporte para el sensor, por lo que es conveniente que este, se encuentre perfectamente limpio. Para ello, con unas toallitas especiales que no dejan restos y con etanol de alta pureza diluido en agua desionizada al 70% se limpia el soporte. Una vez limpio, con un nivel, se coloca el soporte completamente horizontal y se sitúa el sensor sobre este. De este modo, nos aseguramos que el plasma va a incidir de forma homogénea sobre la superficie del sensor de Au. Finalmente, se cierra la puerta se enciende la bomba del vacío y se genera el vacío. Cuando se consigue una presión de aproximadamente entre 500 y 600 mtorr, se genera el plasma y a partir de ese momento se dejará actuar durante 6 minutos. Una vez finalizadas las etapas de limpieza y activación, el sensor de Au está listo para su utilización en los ensayos con la QCMD. 30 5.1.2 Optimización de las condiciones de trabajo con la QCM-D Es importante establecer las condiciones óptimas con las que se va a trabajar con la QCM-D. - Temperatura - Flujo Basándose en datos bibliográficos, la temperatura a la que se han llevado a cabo los ensayos es de 23 º C, mientras que el flujo es continuo y de 20 µL/s [19]. Es necesario conocer las concentraciones óptimas de los reactivos / moléculas, que se van a utilizar. - Relación óptima de MCH / TTA1 - Concentración óptima de Tn-C - Concentración óptima de los aptámeros 5TR1, TTA1 y GBI10 - Concentración óptima de las inmunoglobulinas IgG e IgA. - Concentración óptima del DSP - Concentración óptima de BSA 5.1.2.1 Relación óptima de MCH / TTA1 Las moléculas de aptámero anti-Tenascina TTA1 presentan un plegamiento secundario formando bucles (Figura 11). El objetivo del uso del MCH (6-mercapto-1-hexanol) será recubrir de forma inespecífica los huecos generados por los aptámeros como consecuencia de las posibles repulsiones electroestáticas existentes entre las moleculas, así como evitar los posibles impedimentos estéricos. Figura 11. Representación de las moléculas de aptámero TTA1 (estructura secundaria formando bucles) y moléculas de MCH recubriendo de manera inespecífica los huecos generados por las moléculas de TTA1 a través de grupos tiol. GOLD Aptámero: TTA1 MCH Grupo tiol 31 Se prepara en primer lugar 2ml de las soluciones 1:100 y 1:200 de APT /MCH respectivamente. Una vez hecho el blanco con una disolución de PBS (1x) y comprobando que los armónicos se encontraban dentro de los valores registrados como aceptables mencionados en el apartado de métodos (4.2.1), los 2mL de la mezcla 1:100 APT/MCH se inyectaron a través de un capilar y se bombearon con la ayuda de una bomba peristáltica hacia la cámara que encierra el sensor. El equipo va registrando el proceso, monitorizándose la inmovilización a la superficie del sensor de la mezcla del aptámero TTA1 con la molécula espaciadora MCH. Los 2mL de la mezcla 1:200 se inyectaron seguidamente, siguiendo el mismo procedimiento. Como el flujo es conocido, 20 µL/s, puede calcularse el tiempo muerto de la disolución hasta el sensor siendo este de 6 minutos. Se observa una disminución de la frecuencias y un aumento de la disipación. Figura 12. Representación de los valores de frecuencia y disipación obtenidos para una relación 1:100 TTA1 /MCH. La línea roja refleja un aumento de la disipación haciendo referencia a las propiedades viscoelásticas de la nanocapa formada, mientras que la línea azul refleja una disminución de la frecuencia,haciendo referencia a la deposición de masa. 32 Figura 13. Representación de los valores de frecuencia y disipación obtenidos para una relación 1:200 TTA1 /MCH. La línea roja refleja un aumento de la disipación haciendo referencia a las propiedades viscoelásticas de la nanocapa formada, mientras que la línea azul refleja una disminución de la frecuencia,haciendo referencia a la deposición de masa. Los valores de frecuencia y disipación obtenidos para ambas relaciones, 1:100 y 1:200 de TTA1 / MCH se muestran en la Tabla 1. Frecuencia (Hz) Disipación (1𝑬−𝟔) Relación 1:100 TTA1 /MCH -12 + 0.6 Relación 1:200 TTA1 /MCH -11 +0.8 Tabla 1. Valores de frecuencia y disipación obtenidos para evaluar las interacciones de las disoluciones de TTA1 /MCH 1:100 y 1:200 con la superficie de Au del sensor. Los valores de frecuencia obtenidos en ambas situaciones, revelan la existencia de la formación de una nanocapa debida a la interacción establecida entre los grupos tioles de la molécula de MCH y el aptámero TTA1 con la superficie de Au del sensor. El valor positivo que toma la disipación, una vez estabilizada la nanocapa formada tras el lavado con una solución de PBS (1x) , indica que la película que se ha formado sobre el sensor no es rígida, sino que posee propiedades viscoelásticas, por lo que, cuando se lleve a cabo el modelado de los resultados, no podrá emplearse Sauerbrey., sino que 33 será necesario evaluar cuál de los otros dos modelos se ajusta mejor a los datos obtenidos: Smat-fit o Broad-fit tal como se ha explicado en Métodos (apartado 4.2.1.1). La disminución de la frecuencia es algo mayor para el caso de la relación 1: 100 que para la relación 1:200 de TTA1 / MCH, sin embargo, con los valores de la disipación, ocurre de manera inversa, se obtiene un valor mayor para el caso de una relación 1:200 frente a un menor valor para la relación 1:100. Las moléculas de TTA1 presentan un mayor peso molecular que las moléculas de MCH. El hecho de que la relación 1:100 presente una mayor frecuencia es debido a que se produce una mayor deposición de TTA1 frente a MCH, mientras que la disipación es menor porque la nanocapa originada es más rígida que para la capa que posee más cantidad de MCH (1:200). 5.1.2.2 Evaluación de las masas depositadas de Tenascina-C sobre la capa del aptámero Anti Tenascina-C (TTA1) Una vez que las moléculas de aptámero se han unido al sensor a través de los grupos tiol tal como se muestra en la Figura 14A, el siguiente paso consiste en la deposición especifica de moléculas de Tn-C representadas en la Figura 14B. Para la evaluación de las masas depositadas de Tn-C se hace uso de las disoluciones utilizadas previamente ( apartado 5.1.2.1) y sobre estas, se estudiará lo que ocurre cuando se hacen pasar soluciones de Tn-C de diferentes concentraciones. La manera de proceder es la siguiente: Una vez fijado el MCH y el aptámero TTA1 al sensor de Au (soluciones del aprtado anterior) ,y tras una etapa de lavado con 2mL de una disolución de PBS (1x), se pasan a través del circuito un volumen de 2 mL de varias disoluciones de Tn-C preparadas en PBS (1x) de concentraciones 1nM, 2nM, 5nM y 20nM. Se bombean en el orden creciente con el objetivo de evitar la saturación de los agentes ligantes. 34 Figura 14. A) Representación de las moléculas de TTA1 y MCH interaccionando a través de sus grupos tioles con la superficie de Au del sensor. B) Representación de las moléculas de Tn-C fijadas de forma específica sobre la nanocapa de TTA1 y MCH. En la figura 15 se muestra un histograma en el que se representa la masa depositada de la nanocapa originada cuando se hace uso de una relación TTA1 /MCH (1:100) y la masa registrada tras el depósito de las diferentes concentraciones de Tn-C. Del mismo modo, en la figura 16 se muestra un histograma en el que se representa las masas depositadas de las diferentes concetraciones de Tn-C y la masa depositada de la nanocapa originada cuando se hace uso de una relación TTA1 /MCH (1:200). Para poder obtener este tipo de representaciones ha sido necesario modelar los datos a través del programa Qsense Dfind (apartado 4.2.1.1), donde a partir de las características y propiedades viscoelásticas que presentan las distintas nanocapas formadas,se hace uso del tipo de modelo más adecuado. En este caso y como se mencionó en el apartado anterior (apartado 5.1.2.1),debido a los valores obtenidos para la frecuencia, y disipación, se concluyó que la capa originada por la adición de TTA1/MHC no era rígida, por lo que no podía utilizarse el modelo Sauerbrey. Hemos optado por la utilización del modelo Smart-fit, el cual, tiene en cuenta las propiedades viscoelásticas de dicha nanocapa.(apartado 5.1.2.1). GOLD GOLD Aptámero: TTA1 Tn-C MCH Grupo tiol 35 Figura 15. Representación de la masa depositada en ng/𝒄𝒎𝟐 según se van añadiendo capas al sensor incluyendo una etapa de lavado en PBS (1x) previa al paso de las disoluciones de las distintas concentraciones de Tn-C. Figura 16. Representación de la masa depositada en ng/𝒄𝒎𝟐 según se van añadiendo capas al sensor 36 incluyendo una etapa de lavado en PBS (1x) previa al paso de las disoluciones de las distintas concentraciones de Tn-C. Teniendo en cuenta los resultados representados en los histogramas de las Figuras 15 y 16, se observa como la masa depositada en cada una de las nanocapas originadas, sigue prácticamente la misma tendencia tanto para una relación 1:100 como para una relación 1:200 de MCH /TTA1. En la tabla 1 se mostraron los valores de frecuencia de -12 Hz para la relación 1:100 MCH /TTA1 y de -11 Hz para la relación 1:200 MCH/TTA1, cabría suponer un mayor valor de masa depositada, tras la adición de Tn-C, para el caso de la relación 1:100 y efectivamente, esto se corrobora en el histograma,tomando un valor de 966.475 ng/𝑐𝑚2 frente a 949.342 ng/𝑐𝑚2 para el caso de una relación 1:200, por lo que se llegó a la conclusión de que en una relación 1:100 de MCH/TTA1 la superficie del sensor de Au ya estaba saturada. Al evaluar la masa depositada de las distintas concentraciones de Tn-C sobre el sensor de Au funcionalizado con MCH/TTA en una relación 1:100 y 1:200, pudo llegarse a la conclusión que para valores de concentraciones de 1nM, 2nM y 5nM la deposición de masa no es significante,pero para una concentración de 20 nM hay un cambio notorio tanto para una relación 1:100 MCH/TTA1 como para una relación 1:200 MCH/TTA1, por lo que, de este modo, se optimizó la concentración de Tn-C a 20 nM, considerando que el aumento de masa es suficiente para evaluar adecuadamente las modificaciones de masa depositada. 37 5.2 Estudio de la especificidad de la interacción entre la molécula de Tenascina C y las moléculas de aptámeros GBI10 El siguiente apartado se centra en el estudio de la especificidad de la interacción entre la molécula de Tn-C y el aptámero GBI10, debido a su posible utilización terapéutica; si bien en este caso será la Tn-C la que forme la nanocapa sobre la que se deposite de manera selectiva el aptámero GBI10. En la Figura 17 se muestra la unión del sensor funcionalizado con Tn-C al áptamero GBI10 así como la propia unión del aptámero a la superficie de Au del sensor. Figura 17: A) Representación de la interacción entre las moléculas de Tn-C con la superficie del sensor de Au a través de los grupos tiol. B) Representación de la interacción específica entre las moléculas de Tn-C y las moléculas de aptámero GBI10 a través de una interacción específica encimasustrato. Para el estudio de la especificidad de la unión Tn-C/ GBI10 se utilizó el aptámero 5TR1 como control negativo (apartado 4.1), ya que no debería interaccionar con las moléculas de Tn-C que recubren la superficie del sensor de Au por ser específico de mucinas. De esta manera, si posteriormente se comprobase una interacción entre Tn-C/ GBI10, se podría justificar que la interacción es específica (si previamente comprobamos la no interacción con el aptámero 5TR1). GOLD GOLD Aptámero: GBI10 Tn-C Grupo tiol 44 PBS (1x) Figura 25. Representación de la disminución de la frecuencia en Hz y el aumento de la disipación (1𝑬−𝟔) registrados por el equipo QCM-D al pasar una disolución de DSP y posterior lavado con una solución de PBS (1X), indicando la formación de una película estable. Seguidamente se pasó una solución de IgA (20nM), la muestra tardó aproximadamente 6 minutos en llegar, formando una nanocapa estable; pudiéndose medir de este modo los cambios de frecuencia y disipación originados, obteniéndose unos valores de -60Hz y +5 (1𝐸−6) (Figura 26). Una vez formada la capa, se lava con una solución PBS (1x), no observándose cambios significativos ni para las frecuencias ni para las disipaciones, lo que muestra la estabilidad de dicha capa PBS (1x) Figura 26. Representación de la disminución de la frecuencia en Hz y el aumento de la disipación (1𝑬−𝟔) cuando se hace pasar una disolución de IgA (20nM), indicando la formación de una película estable. 45 A continuación, se hizo pasar una solución de 5TR1 (10µM), actuando como control negativo, sobre el sensor funcionalizado con la IgA (20nM); tardando aproximadamente 5minutos en llegar, y no apreciándose cambios significativos ni en las frecuencias ni en las disipaciones, es decir, no hay existencia de interacción específica entre la Tn-C y el aptámero 5TR1, ni se deposita de manera inespecífica. Al igual que en las etapas anteriores, se pasó una solución de PBS (1x) de lavado, no observándose ningún cambio significativo ni en las frecuencias ni en la disipación, con objeto de eliminar las moléculas de 5TR1 que hubieran podido quedar en las proximidades. PBS (1X) Figura 27. Representación de los valores tomados para la frecuencia (Hz) y la disipación (1𝑬−𝟔) registrados por el equipo QCM-D cuando se hace pasar una disolución de 5TR1 (10µM) y posterior lavado con una solución de PBS (1X). Finalmente, se procedió a evaluar la interacción del aptámero GBI10 con la inmunoglobulina A, IgA, y para ello, se hizo pasar una solución de dicho aptámero con una concentración (10µM) sobre la superficie previamente recubierta de IgA, no apreciándose cambios significativos ni en los valores de frecuencia ni en los de la disipación. Al igual que en el resto de etapas, se pasó una solución de PBS (1X) con el objetivo de arrastrar todas aquellas moléculas que no hubieran interaccionado. 46 PBS (1x) Figura 28. Representación de los valores tomados para la frecuencia (Hz) y la disipación (1𝑬−𝟔) cuando se hace pasar una disolución de GBI10 (10µM), y posterior lavado con una disolución de PBS (1X). Figura 29. Interacción establecida entre los grupos amino de las moléculas Ig A con los carbonos electrofílicos del NHS-ester,el cual se encuentra recubriendo la superficie desnuda de Au. El análisis de los resultados se realizó con el software Q sense Dfind (apartado 5.1.1) considerando los armónicos tercero, quinto y séptimo (n = 3, 5, 7). Se descartó la frecuencia fundamental debido a que es más inestable y se ignoraron armónicos superiores porque su área de sensibilidad es inferior [19]. A continuación, se representa un histograma con la masa total depositada hasta cada una de las nanocapas originadas sobre la superficie de Au del sensor (figura 30). GOLD IgA DSP 47 Figura 30. Representación de la masa depositada en ng/𝒄𝒎𝟐 según se van añadiendo capas al sensor incluyendo cuatro etapas de lavado con PBS (1x). De este modo, puede conocerse el valor de masa depositada en ng/𝑐𝑚2 de cada una de las nanocapas originadas, restando el valor de cada una de ellas, frente al valor de la nanocapa previa. DSP IgA 5TR1 GBI10 Tabla 3. Resultados en ng/𝒄𝒎𝟐 de las nanocapas formadas a partir de DSP e IgA. El valor de masa depositada en ng/𝑐𝑚2 de IgA sobre la nanocapa de NHS-ester que se encuentra interaccionando con la superficie desnuda del sensor de oro es de 181.576 ng/𝑐𝑚2 de superficie del sensor. Por otro lado, en el apartado anterior, se formaba una nanocapa estable de Tn-C de 1458.170 ng/𝑐𝑚2; sin embargo, en este experimento la capa que se deposita de IgA (que estaría actuando como la Tn-C del ensayo anterior, la cual interaccionaba directamente sobre el oro), es de 181.576 ng /𝑐𝑚2, por lo que, se obtiene una mayor ng / 𝑐𝑚2 1252.621 181.576 ±0 ±0 48 interacción entre la Tn-C y la superficie desnuda del sensor de manera directa, sin hacer uso del DSP. 5.4 Interpretación de la interacción entre el DSP con las moléculas de BSA, IgG y Tn-C. Finalmente, en este último apartado se estudia la interacción existente entre las moléculas de la capa formada a partir de la unión al Au de DSP, con otras moléculas de distintos pesos moleculares como son: la BSA (Proteína de suero bovina, 66KD), la IgG (Inmunoglobulina G, 150 KDa) y la Tn-C (280-300 KDa). El DSP, al unirse al Au a través de los grupos tiol, genera una nanocapa estable de moléculas que actúan como “atrapadoras” de proteínas. Lo que se va a estudiar en este apartado es cómo varía la masa depositada en las nanocapas formadas en función del peso molecular de las moléculas. Para los tres ensayos el modo de proceder fue el mismo: Una vez hecho el blanco y comprobando que los armónicos se encontraban dentro de los valores registrados como aceptables, se procedió a su análisis. En primer lugar, se hizo pasar una solución de DSP en PBS (1x), la cual tardó en llegar aproximadamente 6 minutos, siendo el flujo de 20 µL, y formándose una película estable, donde se midieron los cambios en la frecuencia y en la disipación producidos, obteniéndose unos valores de aproximadamente -10 Hz y +1.5 (1𝐸−6), respectivamente, tras el paso de 2mL una solución de PBS (1X) como etapa de lavado. En una segunda etapa, sobre el sensor funcionalizado con DSP se procedió a evaluar la interacción con las moléculas de BSA, IgG y Tn-C, obteniéndose los siguientes resultados: 5.4.1Interpretación de la interacción entre el DSP y la BSA (66KDa). Sobre la superficie del sensor de Au funcionalizada con DSP, se hicieron pasar 2mL de una solución de BSA (10µM); y tras la etapa de lavado con PBS (1X) se obtuvo una nanocapa estable, pudiéndose medir los cambios de frecuencia y disipación originados, obteniéndose unos valores de -24Hz y +1.4 (1𝐸−6) respectivamente. 49 Figura 31. Interacción establecida entre la BSA (66KDa) y la superficie del sensor de Au funcionalizada con DSP. Teniendo en cuenta esto, a continuación se representó en un histograma los ng/𝑐𝑚2 depositados de cada una de las nanocapas originadas sobre la superficie de Au del sensor. Figura 32. Representación en ng/𝒄𝒎𝟐 de las nanocapas originadas de DSP y BSA (66KDa) sobre la superficie del sensor de Au. GOLD DSP BSA (66KDa) 50 De este modo, pudo conocerse el valor de masa depositada en ng/𝑐𝑚2 de BSA, al restar el valor obtenido para la misma del valor obtenido una vez lavada la capa de DSP con PBS (1x). DSP BSA ng / 𝑐𝑚2 1117.294 72.300 Tabla 4. Resultados en ng/𝒄𝒎𝟐 de las nanocapas formadas de DSP y BSA sobre la superficie del sensor de Au. 5.4.2 Interpretación de la interacción entre el DSP y la IgG (150KDa). Se pasaron 2 mL de una solución de IgG (10µM) en PBS (1x) sobre la superficie de Au. La muestra tardó aproximadamente 7 minutos en formar una nanocapa estable tras una etapa de lavado con una solución de PBS (1X), pudiéndose medir los cambios de frecuencia y disipación originados, tomando unos valores de -40Hz y +1 (1𝐸−6) respectivamente. Figura 33. Interacción establecida entre la IgG (150KDa) y la superficie del sensor de Au funcionalizada con DSP. Los datos fueron representados en un histograma con la masa depositada de cada una de las nanocapas originadas sobre la superficie de oro del sensor. GOLD DSP IgG (150KDa) 51 Figura 34. Representación de la masa depositada en ng/𝒄𝒎𝟐 de cada una de las nanocapas originadas de DSP e IgG (150 KDa) sobre la superficie de Au del sensor. De nuevo, pudo conocerse el valor de masa depositada en ng/𝑐𝑚2 de IgG, al restar el valor obtenido para la misma del valor obtenido una vez lavada la capa de DSP con PBS (1x). DSP IgG ng / 𝑐𝑚2 1193.422 260.707 Tabla 5. Resultados en ng/𝒄𝒎𝟐 de las nanocapas formadas de DSP e IgG sobre la superficie de Au del sensor. 5.4.3 Interpretación de la interacción entre el DSP y la Tn-C (300KDa). Se pasaron 2mL de una solución de Tn-C (20nM) en PBS (1x), la muestra tardó aproximadamente 9 minutos en formar una nanocapa estable una vez lavado con una 52 solución de PBS (1X), pudiéndose medir los cambios de frecuencia y disipación originados, obteniéndose unos valores de -80Hz y +25 (1𝐸−6) respectivamente. Figura 35. Interacción establecida entre la Tn-C (300KDa) con la superficie de oro del sensor funcionalizada con DSP. Al restar el valor de masa depositada en ng/𝑐𝑚2 de Tn-C del valor obtenido una vez lavada la capa de DSP con PBS (1x), puede conocerse el valor de masa depositada a través de los resultados representados en el histograma (Figura 36). Figura 36. Representación de la masa depositada en ng/𝒄𝒎𝟐 de cada una de las nanocapas originadas de DSP y Tn-C (300 KDa). GOLD DSP Tn-C (300KDa) 53 DSP Tn C ng / 𝑐𝑚2 1169.850 286.056 Tabla 6. Resultados en ng/𝒄𝒎𝟐 de las nanocapas formadas de DSP y Tn-C sobre la superficie de Au de sensor. De los resultados obtenidos, lo que se observa es que a medida que aumenta el peso molecular de las moléculas que interaccionan con el DSP que cubre la superficie desnuda del sensor de Au, aumenta la masa depositada en ng/𝑐𝑚2 sobre el DSP. De este modo, con la Tn-C aumentan los ng/𝑐𝑚2 depositados frente a la BSA e IgG. Sin embargo, la diferencia en ng/𝑐𝑚2 que se depositan disminuye a medida que aumenta el peso molecular, es decir, que el aumento no es lineal, no son directamente proporcionales. BSA IgG Tn C ng / 𝑐𝑚2 sobre DSP 72.300 260.707 286.056 Tabla 7. Resultados en ng/𝒄𝒎𝟐 de las nanocapas de BSA, IgG y Tn-C formadas sobre el DSP que se encuentra funcionalizando el sensor de Au. Este hecho, podría explicarse debido a que a medida que aumenta el peso molecular, también aumentan los impedimentos estéricos y las mayores repulsiones electroestáticas entre los grupos cargados de las moléculas. Por otro lado, los ng/ 𝑐𝑚2 depositados de DSP toman un mayor valor frente a los ng/𝑐𝑚2 de por ejemplo la Tn-C de mayor peso molecular que el DSP, el cual es muy pequeño en peso. Este hecho se debe a que la QCM-D valora lo que se deposita y no distingue pegado covalentemente o si se encuentra formando una esfera de hidratación, incluye el agua, por ello cada capa es diferente (pesa diferente). Además, otro dato importante a evaluar es la disipación. En estos experimentos con DSP la disipación toma unos valores elevados y sin embargo, sólo de 0,5 cuando se pega directamente la Tn-C al Au directamente. 60 14 Brack SS, Silacci M, Birchler M, Neri D. Tumor-targeting properties of novel antibodies specific to the large isoform of tenascin-C. Clin Cancer Res. 2006; 12(10):3200–8. 30 15 Dr. Luis Álvarez-Vallina (Hospital Universitario Puerta de Hierro) – Dr. Ignacio Casal (Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas) – Dr. Francisco SánchezMadrid (Hospital Universitario de la Princesa-Universidad Autónoma de Madrid). Anticuerpos monoclonales terapeúticos. Informe de vigilancia tecnológica.2007; 16 Osypova A, Thakar D, Dejeu J, Bonnet H, Van der Heyden A, Dubacheva G V, Richter RP, et al. Sensor based on aptamer folding to detect low-molecular weight analytes. Anal Chem. 2015; 87(15):7566– 74. 17 Lee H, Contarino M, Umashankara M, Schön A, Freire E, Smith III AB, et al. Use of the quartz crystal microbalance to monitor ligand-induced conformational rearrangements in HIV-1 envelop protein gp120. Anal Bioanal Chem. 2010; 396(3):1143–52. 18 Reimhult E, Larsson C, Kasemo B, Höök F. Simultaneous Surface Plasmon Resonance and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring measurements of biomolecular adsorption events involving structural transformations and variations in coupled water. 2004; 76(24):7211–20. 19 Formisano N, Jolly P, Bhalla N, Cromhout M, Flanagan SP, Fogel R. Optimisation of an electrochemical impedance spectroscopy aptasensor by exploiting quartz crystal microbalance with dissipation signals. Sensors Actuators B Chem. 2015; 220:369–375. 20 Alina Osypova, Dhruv Thakar, Jérome Dejeu, Hugues Bonet, Angeéline Van der Heyden, Galina V. Dubacheva, Ralf P. Ritcher, Eric Defrancq, Nicolas Spinelli, Liliane Coche – Guérente, and Piere Labbé. Sensor Base on aptamer folding to detec low – molecular weight analytes. Analytical Chemistry, American Chemical Society, 2015, 87 (15).7566 - 74. 21 Mª Isabel Sanchez de Rojas,Mª Pilar de Luxon, Moisés Frías. La espectrometría de emission con fuente de plasma de acoplamiento inductivo. 2015 61 8.ANEXOS 62 ANEXO 1 PROTOCOLO NORMALIZADO EN EL USO DE LA MICROBALANZA DE CUARZO (BIOFORGE) 1. Encender el equipo (software y bomba). 2. Abrir el programa Q-soft. x Adquisition x Set up meassurement /find all (con el objetivo de comprobar los armónicos). Los armónicos se considerarán adecuados para continuar con el ensayo cuando tomen los siguientes valores: Primer armónico < 36 Segundo armónico < 15 Resto de armónicos < 10 x Se comprueban las condiciones óptimas de trabajo. (flujo: 20µL, T =23 ºC). x Se coloca un tubo con PBS (1x) en el capilar de entrada. x Adquisiton / Start meassurement (Sin encender la bomba). x Se pasa aire durante 2 minutos. x Se enciende la bomba y comienza a pasar el PBS (1x). (El PBS (1x) tarda en llegar aproximadamente 15 minutos). x Set up meassurement. x Stop bomba / stop meassurement. x Se cambia el tubo de PBS (1x) por un tubo que contenga la disolución de interés. x Set up meassurement / Start bomba. x Después de cada etapa se realizará un lavado con 2mL de una solución de PBS (1x) durante 15 minutos. x Una vez realizados los ensayos de interés se dejará pasar una solución de PBS (1x) y posterior agua desionizada con el objetivo de limpiar el equipo así como los capilares utilizados. 3. Finalmente, se apaga el equipo (software y bomba). 4. Se desconectan los capilares utilizados y se recogen en su caja perfectamente etiquetada para posteriores usos. 63 5. Se saca el sensor de Au de la cámara, 6. Se seca la cámara con papel adsorbente y se vuelve a montar para posteriores usos. El lavado del sensor con “Piraña” (𝐻2𝑆𝑂4 :𝐻2𝑂2 en una proporción 7:3 respectivamente), es preferible realizarlo previamente a la activación con plasma, ya que realizando la limpieza con plasma el día antes, los armónicos y posteriores resultados obtenidos con la QCM-D son peores. 64 ANEXO 2 PROTOCOLO NORMALIZADO DEL LAVADO CON PIRAÑA. Con el objetivo de la limpieza y activación de la superficie del sensor de Au, se procede a un lavado con una disolución piraña. A continuación, se expone el protocolo normalizado del mismo. 1. En un vaso de precipitados de vidrio pírex se prepara la disolución de piraña, la cual consiste en una disolución de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en una relación de 𝐻2𝑆𝑂4 / 𝐻2𝑂2 (7:3) respectivamente. INCISO: Siempre el ácido sobre la base, ya que si no la reacción es muy exotérmica corriendo el riesgo de una posible explosión. Con una pipeta de medición se toman 3 ml del peróxido de hidrógeno al 94% de pureza y se vierten en el vaso de precipitados. Del mismo modo, y haciendo uso de otra pipeta diferente, se toman 7ml de una disolución de ácido sulfúrico al 98% de pureza y se vierten sobre el peróxido de hidrógeno. 2. A continuación, con unas pinzas metálicas de punta redonda, para evitar de este modo rayar la superficie del sensor de interés, se introduce dicho sensor en la mezcla piraña durante 1 hora. 3. Una vez transcurrido el tiempo estipulado, se saca el sensor con mucha precaución de la disolución piraña y se traspasa a otro vaso de precipitados con agua miliQ durante 15 min. 4. Se hará un segundo lavado de otros 15 minutos con agua desionizada. 5. Finalmente, se sumergirá durante un tiempo de 5 minutos en una disolución de etanol de alta pureza diluido en agua desionizada al 95% con el objetivo de facilitar la etapa de secado. Se retira el sensor con las pinzas de punta redonda 65 y se transportará en una placa Petri, sobre la cual se ha depositado papel de celulosa que absorberá parte del etanol, antes de ser secado o bien con nitrógeno gas o con aire a presión.