Actividad electroquímica de productos naturales

TRABAJO DE FIN DE GRADO Grado en Química ACTIVIDAD ELECTROQUIMICA DE PRODUCTOS NATURALES Autora: Andrea Gregorio Castaño Tutoras: Romana Sokolová y Laura Toribio. 2 Agradecimientos Me gustaría agradecer a mi tutora Romana Sokolová por toda la ayuda que siempre me ha ofrecido y a todos mis compañeros del instituto J. Heyrovsky en Praga que siempre estuvieron dispuestos a ayudarme y apoyarme. También al instituto por permitirme realizar allí mis prácticas y mi trabajo. También a Laura Toribio por todos los consejos para llevar a cabo este trabajo lo mejor posible. Y por supuesto a mis padres, ya que sin ellos no hubiese sido posible mi estancia en Praga y por el apoyo que me han dado a lo largo de toda la carrera. 3 INDICE Agradecimientos............................................................................................................................................ 2 Abstract ......................................................................................................................................................... 4 1. Introducción .......................................................................................................................................... 5 1.1. Compuestos naturales estudiados ..................................................................................................... 5 1.1.1. Quinina ........................................................................................................................................ 5 1.1.2. Luteolin-7-O-Glucosido ............................................................................................................... 7 1.2. Métodos analíticos ............................................................................................................................. 9 1.2.1. Voltamperometría cíclica ............................................................................................................ 9 1.2.2. Espectroelectroquímica UV-Vis. ................................................................................................ 13 1.2.3. Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) ...................................................................... 15 1.2.4. Culombimetría ........................................................................................................................... 17 2. Objetivo del estudio ................................................................................................................................ 18 3. Materiales y métodos utilizados ............................................................................................................. 19 3.1. Reactivos .......................................................................................................................................... 19 3.2. Instrumentación y procedimiento. ................................................................................................... 20 3.2.1. Voltamperometría cíclica .......................................................................................................... 20 3.2.2. Culombimetría ........................................................................................................................... 21 3.2.3. Espectroelectroquímica Ultravioleta-Visible. ............................................................................ 22 3.2.4. Cromatografía liquida de alta resolución con detector de diodos alineados (HPLC-DAD) ....... 23 4. Resultados ............................................................................................................................................... 25 4.1. QUININA ........................................................................................................................................... 25 4.1.1. Voltamperometría cíclica .......................................................................................................... 25 4.1.2. Espectroelectroquímica UV-Vis. ................................................................................................ 33 4.1. 3. Culombimetría. ......................................................................................................................... 35 4.1.5. Cromatografía liquida de alta resolución. ................................................................................. 36 4.2. LUTEOLIN-7-O-GLUCOSIDO .............................................................................................................. 45 4.2.1. Voltamperometría cíclica .......................................................................................................... 45 4.2.2. Espectroelectroquímica UV-Vis. ................................................................................................ 55 4.2.4. Culombimetría. .......................................................................................................................... 58 4.2.5. Cromatografía liquida de alta resolución. ................................................................................. 59 5. Conclusión ............................................................................................................................................... 66 6. Referencias .............................................................................................................................................. 70 4 Abstract The oxidation of quinine ((R)-[(2S,4S,5R)-5ethenyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]-(6methoxyquinolin-4-yl)methanol) and luteolin-7-O-glucoside (3’,4’,5trihidroxiflavona-7-O -glucoside) has been studied. These natural compounds have bioactive activities: quinine has analgesic, antiseptic and muscle relaxant properties and luteolin-7-O-glucoside has a potentially positive effect against certain diseases like some forms of cancer and coronary heart disease and exhibits antioxidant, antiinflammatory and anti-hepatotoxic properties. This work was focused on the determination of oxidation mechanism of both compounds; quinine and luteolin-7-O-glucoside.The oxidation and degradation processes of compounds were studied in aqueous buffered media by electroanalytical techniques, molecular absorption spectrophotometry and chromatographic techniques. The oxidation mechanism involves electron transfer coupled with proton transfer and other following chemical reactions and it is influenced by the acid base properties of both studied compounds. The distribution of oxidation products of these compounds was monitored by HPLCDAD. Se ha realizado un estudio sobre la oxidación de la quinina ((R)-[(2S,4S,5R)-5-ethenyl-1azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]-(6methoxyquinolin-4-yl)metanol) y del luteolin-7-O-glucosido (3’,4’,5trihidroxiflavona-7-O -glucósido). Estos compuestos naturales son bioactivos, la quinina tiene propiedades analgésicas, antisépticas y relajantes musculares y el luteolin-7-O-glucosido tiene un efecto potencialmente positivo contra ciertas enfermedades como algunas formas de cáncer y enfermedades coronarias, además muestra propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y anti hepatotóxicas. Este trabajo se ha centrado en la determinación de los mecanismos de ambos compuestos, la quinina y el luteolin-7-Oglucosido. Los procesos de oxidación y degradación de estos compuestos han sido estudiados utilizando técnicas electroanalitícas en medio acuoso tamponado, espectrofotometría de absorción molecular y técnicas de separación cromatográficas. El mecanismo de oxidación implica la transferencia de electrones acoplada a la transferencia de protones y otras reacciones químicas, y está influenciado por las propiedades acido-base de los compuestos estudiados. La distribución de los productos de oxidación fue monitorizada mediante HPLC-DAD. 5 1. Introducción 1.1. Compuestos naturales estudiados 1.1.1. Quinina La quinina o chinchona ((R)-[(2S,4S,5R)-5-ethenyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]-(6-methoxyquinolin-4yl)metanol), es un alcaloide vegetal con uso medicinal que tiene propiedades analgésicas, antisépticas y relajantes musculares, que se consideraron efectivas como terapia adicional para el síndrome de inmunodeficiencia adquirida 1 , neurodermatitis, rinitis perenne y otras enfermedades 2 , 3 virales. La quinina es producida por algunas especies del género Cinchona. Figura 1. Estructura química de la quinina. La quinina fue utilizada por primera vez para tratar la malaria en Roma en 1631. El mecanismo de reacción anti malaria se debe al compuesto estable que forma la quinina con el ADN en el Plasmodium (genero de protistas, parasito, que infecta a los humanos la malaria, entre otras enfermedades) 4 . De esta forma bloquea la replicación del ADN del Plasmodium y la transcripción del ácido ribonucleico, y, en consecuencia, tiene efectos curativos. La quinina era el principal compuesto empleado en el tratamiento de la malaria hasta que fue sustituido por otros medicamentos sintéticos más eficaces, como la 6 quinacrina, cloroquina y primaquina. La quinina se puede utilizar todavía en el tratamiento de la malaria resistente. También se intentó utilizar para tratar pacientes infectados con priones, pero con un éxito limitado. Es un compuesto empleado frecuentemente en la adulteración de la heroína. Fue encontrado eficaz como terapia adicional para el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, y para la neurodermatitis 5 . Tiene un sabor muy amargo. Es un estereoisómero de la quinidina. Si se toma en exceso, puede inducir efectos secundarios; las manifestaciones clínicas de la sobredosis incluyen problemas gastrointestinales, perturbaciones visuales, efectos sobre el sistema nervioso central, y arritmias cardiacas 6 . En los últimos años, la quinina ha sido ampliamente usada en la industria, en farmacología, bioquímica, y así sucesivamente. Primero, debido a los cuatro centros quirales (átomos de carbono en el tercera, cuarta, octava y novena posición, tal y como se señala en la figura 1) en la molécula, la quinina puede actuar como un ligando quiral y un catalizador en síntesis enantioselectivas 7 . Además, el clorhidrato de quinina o el sulfato de quinina han sido utilizados ampliamente en la industria cosmética (champú) y en bebidas gaseosas, especialmente como agente aromatizante 8 . Varias técnicas han sido desarrolladas para la determinación cuantitativa de la quinina en bebidas, plasma, orina humana, fluidos biológicos, o drogas incluyendo productos no acuosos 9 , quimioluminiscencia 10 , isotacoforesis 11 , fluorodensitometrica 12 , y fluorimetria 13 - 15 , directa 16 , 17 e indirecta8, 18 , 19 fotometría y cromatografía 20 - 21 22 23 . Un artículo publicado recientemente, en el que se determina quinina en refrescos utilizando voltamperometría diferencial de impulsos (VDP) 24 , muestra la actividad electroquímica de la quinina. Se usó una disolución BRB (compuesta por ácido fosfórico, ácido acético y ácido bórico) tampón de pH 7.96 y un electrodo de grafito lápiz (PGE). El valor del límite de detección (LOD) que se obtuvo fue 2*10-7 M. Los voltamperogramas cíclicos muestran que al aumentar los valores de pH se produce un desplazamiento del potencial de pico de oxidación (EPa) hacia valores menos positivos, lo que significa que los protones son parte de la reacción del electrodo. Los autores sugieren que el número de electrones que se transfieren es igual 1. En otro estudio analítico, se determinó quinina usando voltamperometría cíclica en un electrodo de platino modificado por polipirrol-pentacianoferrato 25 . El límite de detección fue 1.08*10-5 M. 7 También se ha utilizado el electrodo de carbono vitrificado modificado por polímero, p-(AHNSA)/GCE, (poli(4-amino-3-hidroxi-nafthalene ácido sulfónico)/ electrodo de carbono vitrificado modificado) para la detección electroquímica de quinina en formulaciones farmacéuticas y de orina humanas 26 . En este estudio se empleó voltamperometría cíclica de onda cuadrada y se observó que la quinina muestra una respuesta más alta en el electrodo modificado comparado con los electrodos de carbono vitrificado sin activar y activados en la solución tampón fosfato de pH 7.0. Utilizando voltamperometría cíclica se descubrió que se trata de un proceso controlado por adsorción, puesto que el pico de corriente es proporcional a la velocidad de barrido en un rango de 0.1-3 V/s. Esto fue utilizado para acumular compuesto en la superficie del electrodo para obtener un límite de detección bajo. El valor obtenido del límite de detección (LOD) fue 1.42*10-8 M. En este estudio se sugiere que son dos electrones y dos protones los que participan en la oxidación. 1.1.2. Luteolin-7-O-Glucosido El luteolin-7-O-glucosido es un flavonoide que pertenece al grupo de las flavonas. Es un derivado glucósido de la luteolina. El luteolin-7-O-glucósido ha sido identificado en las hojas y flores de diente de león 27 . Figura 2. Estructura química del Luteolin-7-O-Glucosido. La luteolina y sus glucósidos son responsables del color amarillo de varias plantas, por ejemplo: Reseda luteola L., que se usó como colorante amarillo natural para teñir textiles desde la antigüedad 28 . Los tintes amarillos flavonoides utilizados para colorear tapices antiguos se extrajeron de las bayas de algunas especies de Rhamnus y de la corteza de quercitron (Quercus velutina L.), importado de América del Norte 29 o de Alnus jorullensis y salvia sagittata. 8 Estos compuestos pertenecen a un grupo más genérico denominado polifenoles, que engloba a un gran grupo de compuestos relacionados estructuralmente, y ampliamente distribuidos en la naturaleza. Son componentes muy importantes de los alimentos estando presentes en muchos productos naturales, principalmente en frutas y verduras que contribuyen a su sabor y color 30 . La familia de los flavonoides es una forma ubicua de polifenol que los humanos ingieren con una dieta regular. Hasta la fecha, se han identificado más de 4.000 compuestos flavonoides individuales. Los flavonoides en las plantas suelen estar presentes en forma de glucósidos, aunque también se encuentran como agliconas. Existe un interés creciente en el estudio de los polifenoles debido a su efecto potencialmente positivo contra ciertas enfermedades. Principalmente algunas formas de cáncer y enfermedades coronarias. El efecto se atribuye a la inhibición de determinadas enzimas, y a la actividad antioxidante, protección vascular, antihepatotóxico, antialérgico, antiproliferativo, propiedades antiosteoporóticas y antiinflamatorias 31 , 32 . El mecanismo de oxidación de los polifenoles y su estabilidad en solución depende del pH 33 , 34 . La ruta de oxidación de los compuestos hidroxilados viene dada por la distribución de varias formas de disociación en disolución 35 - 39 . Las vías de oxidación de los compuestos hidroxilados se parecen al “scheme carre”. Este esquema fue publicado por Jacq J. para reacciones de reducción 40 , el cual asume que las reacciones de protonación son mucho más rápidas que los procesos de transferencia de electrones. De la misma forma, la oxidación se acopla a la transferencia de protones37 como se muestra en la Figura 3. Figura 3. Esquema cuadrado para la oxidación. 9 Para la caracterización de sus propiedades redox, se requiere el conocimiento de la constante de disociación de estos compuestos; sin embargo, su determinación correcta está relacionada con el problema de la mala estabilidad de sus disoluciones en presencia del oxígeno del aire 41 , 42 . En general, existe un gran interés en el estudio de las propiedades redox de los flavonoides debido a las ya comentadas propiedades beneficiosas para la salud. El mecanismo de oxidación del Luteolin-7-O-glucosido no se ha estudiado todavía, por tanto, para iniciar su estudio se ha tenido en cuenta lo ya publicado respecto a la actividad electroquímica de compuestos parecidos al Luteolin-7-O-glucosido. En los artículos publicados hasta ahora, el mecanismo de oxidación del luteolin no se ha elucidado completamente. Sin embargo, Liu et al. 43 describió la oxidación a pH = 4 involucrando dos electrones y dos protones. Filipiak 44 realizó voltamperogramas cíclicos en diferentes tampones y se encontró que el potencial de oxidación depende del pH de la disolución. También se ha descrito la participación de protones en el proceso de oxidación de polifenoles e hidroquinonas37, 45 - 50 . En varios estudios, se ha encontrado que la oxidación electroquímica del anillo de catecol en la molécula del luteolin incluye la participación de dos electrones y dos protones, y conduce a la formación del derivado de la o-quinona 51 - 54 . También utilizando métodos enzimáticos y espectroscópicos se ha mostrado que en la oxidación de la quercetina y otros compuestos fenólicos interviene un electrón, 55 - 57 . Y además pueden tener lugar, varias reacciones químicas posteriores como la hidroxilación o la dimerización45,52,53,55,57. 1.2. Métodos analíticos 1.2.1. Voltamperometría cíclica La voltamperometría cíclica es una técnica electroquímica que mide la corriente que se produce en una celda electroquímica cuando se aplica un barrido de potencial en el electrodo de trabajo, en condiciones estacionarias; es decir, sin agitación. El barrido de potencial tiene forma triangular, de tal manera que el potencial varía desde un valor inicial (Ei) hasta un vértice y seguidamente se hace un barrido inverso 16 pulsaciones en el flujo que darían lugar a fluctuaciones en el detector y distorsionarían la línea de base. Algunos modelos de bombas de HPLC pueden mezclar múltiples solventes en proporciones que cambian en el tiempo, generando un gradiente de composición en la fase móvil. • El detector genera una señal proporcional a la concentración de analito en la muestra y que emerge de la columna, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes de muestra. Algunos de los detectores de uso más común, son los detectores de UV-Vis, detectores de matriz de fotodiodos (PDA) o los basados en espectrometría de masas. • Un microprocesador digital y un software controlan el equipo y proporcionan el análisis de los datos. • La mayoría de los equipos de HPLC cuentan con un horno de columnas, que permite fijar la temperatura a la cual se realiza la separación. Figura 9. Esquema de un equipo HPLC. (1) Disolventes, (2) desgasificador de los disolventes, (3) válvula de gradiente, (4) mezclador de fase móvil, (5) bomba de alta presión, (6) válvula en posición de inyección, (6’) válvula en posición de descarga, (7) bucle del inyector de muestra, (8) pre-columna, (9) columna analítica, (10) detector, (11) software para la adquisición de datos (12) colector de residuos. 17 1.2.4. Culombimetría En los métodos culombimétricos se mide la cantidad de electricidad (expresada en culombios) necesaria para producir una transformación cuantitativa de una sustancia (oxidación o reducción). Utiliza corriente eléctrica directa (DC;) para provocar reacciones químicas no espontaneas; y es comercialmente importante como una etapa en la separación de elementos de fuentes naturales tales como minerales. Se puede diferenciar entre dos técnicas culombimétricas: la potenciostática y la amperostática. En la primera, el potencial del electrodo de trabajo se mantiene constante en un valor determinado, al cual se produce la oxidación o reducción cuantitativa del analito sin que interfieran otros componentes de la muestra. En la segunda lo que se mantiene constante es la intensidad de corriente. En cuanto a la instrumentación, se necesita una celda de electrólisis, un potenciostato (para mantener un potencial constante en el electrodo de trabajo) y un dispositivo integrador para calcular la carga transferida. Habitualmente se utiliza una celda con tres electrodos. El electrodo auxiliar se encuentra en el compartimento catódico y está separado por un plato poroso del compartimento anódico, donde se encuentran el electrodo de trabajo y el de referencia. La superficie del electrodo de trabajo es grande y se suele trabajar con agitación. Figura 10. Celda electrolítica. 18 2. Objetivo del estudio El objetivo principal de este trabajo es el estudio electroquímico de dos compuestos bioactivos naturales seleccionados, quinina y luteolin-7-O-glucosido. Más concretamente, se estudiará el proceso de oxidación electroquímica de los compuestos antes mencionados ya que, hasta ahora en los trabajos publicados, todavía no se ha llegado a conclusiones claras. Para llevar a cabo este estudio se utilizarán diferentes técnicas de análisis como son las técnicas electroquímicas, las espectrofotométricas y las cromatográficas. 19 3. Materiales y métodos utilizados 3.1. Reactivos Los compuestos estudiados han sido: - Quinina (C20H24N2O2, fig. 1; Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa) - Luteolin 7-O-glucosido (C21H20O11, fig.2; Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa) Para la realización de las voltamperometrías cíclicas, el electrolito utilizado varía dependiendo del compuesto estudiado. Se utilizaron tampones de diferentes pH pero constituidos por las mismas disoluciones, siendo una de ellas una disolución acida (BRB, Britton-Robinson Buffer) 0.04M compuesta por tres reactivos ácidos todos en la misma proporción: ácido fosfórico (H3PO4; Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa), ácido acético (CH3COOH; Lachema, Brno, Republica Checa) y ácido bórico (H3BO3; 99.5% Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa), y la otra disolución es una básica 0.2M de hidróxido de sodio (NaOH; Lachema, Brno, Republica Checa). Estos tres ácidos, debido a sus diferentes pK, forman diferentes sales y gracias a esto cubre un rango muy grande de valores de pH. En el caso del Luteolin-7O-glucosido a estos tampones usados de electrolitos se le añadía la misma cantidad de etanol (C2H5OH; 96% ADR/RID Lachner Company). Para el estudio de espectroelectroquímica UV-Vis se utilizó una disolución 0.1M de cloruro de potasio (KCl; Lachema, Brno, Republica Checa) y Argón (Ar; Messer technogas, Praga, Republica Checa). Para limpiar esta celda se utilizó agua, etanol (C2H5OH; 96% ADR/RID Lachner Company), acetonitrilo (CH3CN; anhídrido 99.8%, Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa) y una disolución de acetonitrilo y hexafluorofosfato de tetrabutilamonio (TBAPF6; Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa). Los eluyentes utilizados en el análisis cromatográfico (HPLC) fueron una disolución al 0.1% de ácido fosfórico (H3PO4; Sigma-Aldrich, Praga, Republica Checa) en agua y acetonitrilo. En la realización de la culombimetría el electrolito utilizado fue una disolución 0.1M de cloruro de potasio (KCl; Lachema, Brno, Republica Checa) y una disolución 4mM de hidróxido de potasio (KOH; Lachema, Brno, Republica Checa). 20 3.2. Instrumentación y procedimiento. 3.2.1. Voltamperometría cíclica Se utilizó una celda electroquímica de tres electrodos: - Electrodo de referencia (RE): Ag|AgCl|1M LiCl separado del resto de la disolución por tabique poroso. - Electrodo de trabajo (WE): de carbono vitrificado de diámetro 0.7 mm. Este tipo de electrodo se utiliza para procesos de oxidación y tiene la ventaja de tener una amplia ventana de potencial, además de la facilidad para renovar la superficie para el intercambio electrónico 60 . - Electrodo auxiliar (CE): de platino. Figura 11. Celda electroquímica utilizada en la voltamperometría cíclica. Todos ellos fabricados por el propio laboratorio del instituto J. Heyrovsky. Para realizar estas medidas se utilizó un potenciostato AutoLab PGSTAT 30 (Metrolim Switzerland) y el software Nova 2.1.3. El procedimiento llevado a cabo consistía en someter, primero solo a la disolución del electrolito y después a la disolución junto con el compuesto natural a estudiar, a un barrido de potencial que varía 21 dependiendo del compuesto, de su concentración y del pH del tampón. Para eliminar el oxígeno disuelto, en primer lugar, la disolución se burbujeaba directamente con Argón. Con el luteolin-7-O-glucosido, al ser la disolución hidroalcohólica (tampón-etanol 1:1), se hacía pasar el argón por el etanol (96%) primero para saturarlo de este y luego por la celda. Después de cada medida, el electrodo de trabajo de carbono vitrificado era limpiado con agua, frotándolo de forma circular en una tela de terciopelo (Buehler, Alemania) en la cual se colocaba óxido de aluminio (III) con agua. A continuación, el electrodo, se aclaraba con agua, se secaba y se volvía a introducir en la celda listo para una nueva medida. Se realizaron experimentos variando la concentración y la velocidad de barrido de potencial. Los datos obtenidos con estos experimentos fueron estudiados con el programa OriginPro8. 3.2.2. Culombimetría Esta parte experimental, se realizó utilizando una celda con dos compartimentos, anódico y catódico, separados por un plato poroso y el potenciostato utilizado fue PGSTAT 12 AUTOLAB. Además, se realizó de forma simultánea al análisis por HPLC con el fin de determinar los posibles productos de la oxidación de los compuestos. En el compartimento anódico se encontraban los electrodos de trabajo y de referencia. El electrodo de referencia es el mismo que en el caso de la voltamperometría cíclica y también se encontraba separado del resto de la disolución. En cambio, el electrodo de trabajo se trata de un electrodo pasta de carbono. En el compartimento catódico se encontraba el electrodo auxiliar de carbono. Todos ellos fabricados por el propio laboratorio. La preparación de la celda fue igual en ambos compuestos. En primer lugar, antes de añadir el compuesto, se pipetea parte del electrolito inerte en el compartimento anódico y se burbujea con argón. Se hace en el anódico ya que el catódico no tiene entrada para el argón. Tras diez minutos aproximadamente burbujeando la disolución, con ayuda de una pipeta se pasa al compartimento catódico. El resto de la disolución se introduce en el compartimento anódico y se vuelve a burbujear con argón, de esta forma tenemos la disolución en una atmosfera inerte en ambos compartimentos. Tras esto ya se puede añadir el compuesto y empezar con las medidas. 22 3.2.3. Espectroelectroquímica Ultravioleta-Visible. Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis-modelo Agilent 8453 de matriz de diodos y una celda espectro electroquímica de capa delgada con electrodo de capa fina ópticamente transparente (OTTLE, Specac UK) o Quinina: Se preparó la disolución en ausencia de oxígeno. Para conseguir esto, se pesó y se introdujeron en un vial 0.51mg de quinina, se tapó el vial y se inyectó argón. En otro vial se pipeteó 8 mL una disolución de KCl 0.1M, se tapó y se inyectó argón. Tras unos minutos, ambos viales se conectaron con una aguja y debido a la presión que ejercía el argón sobre la disolución, 3mL de la disolución pasaron a través de la aguja, hasta el vial con el compuesto, disolviéndolo. De esta forma el oxígeno no interviene ni contamina la muestra. La concentración de la quinina fue de 0.5mM. A continuación, se inyectó en la celda espectroelectroquímica la disolución de 0.5mM, ésta se colocó en el espectrómetro y se midió su espectro UV-Vis; habiendo realizado previamente un blanco con agua. A continuación, se realizó una voltamperometría cíclica, con un rango de potencial entre 0.2V a 1.1V y una velocidad de barrido de 5mV/s, a la vez que se registraba el espectro UV-Vis. Después de cada medida, se realizó una limpieza química de la celda;, para ello se utilizó agua, etanol, acetonitrilo. Cada disolvente se inyecto de manera individual con una jeringuilla, y en una cantidad de 0.5 mL. Para terminar la limpieza de la celda se utiliza una disolución 0.1M de acetonitrilo y TBAPF6 (hexafluorofosfato de tetrabutilamonio) que se coloca la celda en el espectrómetro y se impone un potencial reductor. De esta forma se realiza también una limpieza electroquímica, donde la superficie del electrodo de trabajo se limpia con la formación de H2 a un potencial negativo, dando lugar a PtH2 (platinum black) en la superficie y después lavándolo con acetonitrilo. Este proceso se repitió varias veces. Una vez limpiado el sistema, se puede volver a realizar otra medida. 23 o Luteolin 7-O-Glucosido: Se prepara una disolución en ausencia de oxigeno de la misma forma que con la quinina. En este caso se utilizó una disolución compuesta por una disolución tampón de pH=4,18 (NaOH 0.2M y BRB 0.04 M) y una disolución de etanol 1:1. La concentración de Luteolin-7-O-glucosido fue 0.7 mM. La primera medida tomada fue de la disolución tampón junto con el etanol, el blanco. La limpieza de la celda se realizó de la misma forma que con la quinina. 3.2.4. Cromatografía liquida de alta resolución con detector de diodos alineados (HPLCDAD) El equipo de HPLC utilizado fue un Agilent serie 1200; equipado con un desgasificador a vacío, una bomba cuaternaria, un inyector de muestras automático, un detector DAD y un detector de fluorescencia. Para la separación de los compuestos se usaron diferentes columnas, para la quinina se usó una columna C18 (HyPurity C18, 150x3mm), con un tamaño de partícula de 5μm, de Thermo Scientific, (USA, Dubuque), y en el caso del luteolin-7-O-glucosido se usó una columna C8 (HyPurity C8, 150x3mm) también con un tamaño de partícula de 5μm y de Thermo Scientific, (Dubuque USA). En ambos casos, la columna estaba unida a una pre-columna C18 (HyPurity C18, 10x3mm, 5μm, Thermo Scientific, USA, Dubuque). La columna se colocó dentro de un horno termostatado a 20ºC. El equipo de HPLC se controló a través del software ChemStation (Agilent OpenLAB CDS Chemstation). Con este equipo se analizaron muestras de quinina y de luteolin-7-O-glucosido antes y después del proceso de electrolisis. La composición de la fase móvil y flujo fue diferente según el analito analizado. En la tabla 1 y tabla 2 se muestran los gradientes de elución y flujos utilizados en el análisis de las muestras de quinina y de luteolin-7-O-glucosido, respectivamente. El método usado para el luteolin-7-O-glucosido fue usado previamente en un trabajo publicado para el análisis de los productos de oxidación del luteolin 61 , obteniéndose una buena separación por lo que se mantuvo con ligeras modificaciones. 24 Tabla 1. Método usado para el análisis por HPLC de la quinina. Flujo: 0.600 mL/min. Time (min) % ACN % 0.1% H3PO4/agua 0 5 95 5 5 95 30 50 50 40 70 30 41 100 0 45 100 0 46 15 85 Tabla 2. Método para el análisis por HPLC del luteolin-7-O-glucosido. Flujo: 0.2mL/min. Time (min) % ACN % 0.1% H3PO4/agua 0 5 95 2 5 95 30 60 40 35 100 0 55 100 0 70 5 95 75 5 95 77 5 95 25 4. Resultados 4.1. QUININA 4.1.1. Voltamperometría cíclica Se hicieron experimentos cambiando la concentración y a una velocidad constante de barrido y viceversa. También se comparó el comportamiento de la quinina a diferentes pH, pero trabajando a concentración y velocidad de barrido constantes. En la Figura 12 se observa la dependencia de la velocidad de barrido a una concentración y un pH constante. El potencial de pico que se obtiene con estas medidas es constante al variar la velocidad de barrido. Sin embargo, el pico de corriente (Ip) va aumentando de forma proporcional a la velocidad de barrido. Figura 12. Voltamperograma cíclico de la quinina a diferentes velocidades de barrido a pH=2.1 y concentración 0.2 mM. 32 Figura 19. Dependencia de Ep con la velocidad de barrido para A) pH=2.10 y B) pH=4.18. Figura 20. Dependencia del potencial con la concentración a diferentes pH, A) pH=2.10 y B) pH=4.18. Velocidad de barrido constante de 0.1 V/s. La dependencia que muestra el potencial de pico (Ep) con la concentración o la velocidad de barrido puede dar información sobre el proceso de transferencia de electrones acoplado a la reacción de oxidación, y determinar el esquema de reacción. Dependiendo del esquema de reacción que se produzca, los valores teóricamente conocidos para la pendiente varían. Unos ejemplos de mecanismos de reacción son: EC (transferencia de electrones - reacción química), ECE (transferencia de electrones - reacción química - transferencia de electrones), CE (reacción química - transferencia de electrones). En el caso de la dependencia del potencial de pico con la concentración (Figura 20) los valores de las pendientes fueron: δEp/δlog c = 50 mV y 40 mV respectivamente para pH=2.10 y pH=4.18. El esquema de reacción que mejor explicaría los resultados podría ser el del mecanismo ECE 63 ya que los valores teóricos para este mecanismo son: δEp/δlog v y δEp/δlog c = 29 mV. Aunque los valores de las 33 pendientes obtenidas no son tan aproximados al valor teórico, pero esto puede ser debido que para la concentración no se adapte bien, además, la pendiente puede llegar a tener valores más altos de 100mV. Lo más importante es que este valor no sea de 19 mV, ya que eso indicaría que se trata de una dimerización radical. Los valores que más importancia tienen son los relacionados con la velocidad de barrido, y en este caso se aproximan al valor teórico y de ello se deduce que pueda corresponder al mecanismo ECE. Este mecanismo se explica en la Figura 21. Durante este mecanismo, el producto de la primera transferencia electrónica da lugar a una reacción química, y el producto de esta reacción química toma el segundo electrón para dar lugar al producto final de la oxidación. Figura 21. Mecanismo de reacción. 4.1.2. Espectroelectroquímica UV-Vis. La espectroelectroquímica UV-Vis fue estudiada en una disolución 0.1M de KCl, lo que al principio de la medida corresponde a un pH=7. Con esta técnica, a la vez que se realiza una voltamperometría cíclica, se registra el espectro de absorción molecular UV-Vis de la capa de disolución cercana al electrodo de trabajo. El intervalo de potencial para la voltamperometría cíclica fue de 0.2 a 1.1 V y la velocidad de barrido fue 5mV/s. Los resultados obtenidos se pueden ver en la Figura 22. Durante la oxidación, el espectro de absorción de la quinina cambia. La banda de absorción a 234 nm decrece al igual que la absorción en torno a 279 nm y las bandas a 206, 249, 346 nm incrementan durante la oxidación (A). Cuando la polaridad del electrodo cambia, y se produce la re-reducción del producto formado, los espectros de absorción muestran justo el efecto contrario, por lo que se puede hablar de reversibilidad del proceso, lo que significa que el compuesto que se había generado tras la oxidación de la quinina se redujo, volviéndose a obtener la quinina. Este comportamiento se encontró con una solución ligeramente alcalina e indica que el proceso ECE es químicamente reversible. 34 Figura 22. Espectroscopia UV-Vis de la quinina a pH=7. 35 Con el fin de evitar problemas en el estudio espectroelectroquímico debidos a la posible oxidación de la quinina por parte del oxígeno atmosférico; en todos los ensayos se utilizaron disoluciones de quinina libres de oxígeno. Posteriormente se realizaron una serie de experiencias para comprobar si efectivamente la quinina podía ser oxidada por el oxígeno atmosférico. Con este objetivo se llevó a cabo el estudio de la estabilidad de la quinina en condiciones ambientales. La disolución de la quinina (0.5 mM) fue preparada en 0.1 M KCl y 4 mM KOH bajo una atmosfera de Argón. Esto significa que los disolventes se eliminó el oxígeno burbujeando argón la solución antes de ser utilizados. Se midió el espectro de absorción de esta disolución. A continuación, se realizó la medida del espectro de absorción en presencia de oxígeno, es decir, con la cubeta abierta y agitada manualmente. El espectro de absorción de la quinina no sufrió ningún cambio durante su medida. Esto significa que la quinina es estable en esta disolución alcalina. 4.1. 3. Culombimetría. Antes de cada culombimetría se realizaron voltamperometrías cíclicas para observar el potencial de oxidación del compuesto y de esta forma saber el potencial que se debía aplicar a la electrolisis. En el caso de la quinina se utilizaron dos disoluciones distintas para llevar a cabo este experimento. La concentración de la disolución electrolizada era 0.2 mM en una disolución 0.1M de KCl. Por último, se utilizó una disolución tampón BRB de pH=7.82 de concentración 0.2 mM. El número de los electrones que participan se calcula teniendo en carga la carga consumida de acuerdo con la ecuación de Faraday: Q= Ecuación 1. Donde Q es la carga puesta en juego, en coulomb (C), m la masa pesada en gramos, M la masa molar en gramos/mol, z el número de electrones y F la constante de Faraday=96485.3 C/mol. 36 Este experimento se realiza de forma conjunta con el análisis cromatográfico HPLC, por tanto, se explica en el siguiente apartado. 4.1.5. Cromatografía liquida de alta resolución. En primer lugar, se inyectó una disolución de quinina en agua. A esta muestra se la denominó “quinina estándar” (Q standard) y el tiempo de retención de la quinina fue de 12.0 minutos. El proceso de electrolisis fue estudiado junto con el HPLC para los dos medios en los que se disolvió el compuesto: en 0.1M de cloruro potásico (Q1-Q3) y en una disolución tampón BRB de pH=7.82 (Q4-Q7). La longitud de onda fijada en el detector fue de 210nm. Disolución 0.1 M KCl: La concentración de la quinina en la disolución era de 0.2 mM. Antes de la electrolisis se realizó una voltamperometría cíclica en un intervalo de potencial de -0.3 V a 1.5 V. Se extrajo una alícuota, Q1, de 500μL de la disolución antes de someterla a la electrolisis y se analizó por HPLC. El voltamperograma cíclico antes de la electrolisis se muestra en la Figura 23, curva a. Figura 23. Voltamperograma cíclico a) antes y b) después de la electrolisis de la quinina en 0.1 M KCl. 37 A continuación, se realizó una electrolisis a un potencial de 1.23V, mismo potencial del pico de la voltamperometría. Durante esta, se tomó una alícuota, Q2, de 500μL de la disolución, con un paso de carga de 1.00C, lo que corresponde a la participación de 3.5 electrones; y se analizó por HPLC. Después de la electrolisis se tomó la última alícuota de la disolución, Q3, con un paso de carga de 0.85C, la cual se suma a la carga anterior dando una carga total de 1.84C y que corresponde a la participación de 6.5 electrones. Este número es muy alto ya que está desafortunadamente influenciado por la descomposición del electrolito y no se puede usar para la determinación del número de electrones participantes. Se realizó una última voltamperometría cíclica después de la electrolisis, curva b en la Figura 23. Se puede observar que la curva de oxidación de la quinina desaparece después de la electrolisis. En la Figura 24, donde se muestran los cromatogramas obtenidos, se puede observar que a medida que avanza la electrolisis y por tanto aumenta el número de electrones intercambiados, el pico de la quinina disminuye y otros picos aparecen, lo que corresponde a productos de oxidación formados durante la electrolisis. 38 Figura 24. Cromatograma de la quinina en una disolución 0.1M de KCl a una longitud de onda de 210nm. A) Cromatograma sin ampliar, B) Cromatograma ampliado. 39 Tampón pH=7.82: La concentración de la quinina en la disolución fue de 0.2mM. En la figura 25 se puede ver el voltamperograma cíclico a) antes, b) durante y c) después de la electrolisis. Cada alícuota (Q4-Q7) que fue tomada fue medida en el HPLC. Después de la electrolisis la carga consumida fue de 1.19C, que corresponde a 4.2 electrones. Durante la electrolisis participaron dos electrones y, además, un producto de la reacción de oxidación fue electrolizado por dos electrones. El voltamperograma cíclico después de la electrolisis (c) muestra una curva que podría significar la aparición de un producto o la incompleta electrolisis de la quinina. Figura 25. Voltamograma cíclico a) antes b) durante y c) después de la electrolisis de la quinina en el tampón a pH=7.82. En la Figura 26 se muestran los cromatogramas obtenidos. Al igual que en el caso anterior, a medida que aumenta el número de electrones intercambiados el pico de la quinina disminuye. La diferencia es que se puede observar el pico de un producto (P13) que en la otra disolución no aparecía. 40 Figura 26. Cromatograma de la quinina en una disolución tampón a pH=7.82 a una longitud de onda de 210nm. A) Cromatograma sin ampliar, B) Cromatograma ampliado 41 En las Figuras 27-29 se pueden observar los espectros UV-Vis correspondientes a los diferentes picos obtenidos en los cromatogramas. Pertenecen tanto al experimento realizado en la disolución tampón y en la disolución de KCl, ya que los espectros coincidían. Si bien para obtener una información sobre la estructura de los compuestos y conseguir su identificación es necesario continuar el estudio utilizando detectores de espectrometría de masas. 48 49 En la Figura 34 y la Figura 35 se muestran los voltamperogramas obtenidos para diferentes concentraciones de Luteolin-7-O-Glucosido y a un valor de pH ácido. Como se puede observar, en disoluciones acidas el potencial de pico aumenta proporcionalmente con la concentración. Esto puede significar un proceso de dimerización. Figura 34. Voltamperograma cíclico a diferentes concentraciones a un pH=5.2. Velocidad de barrido=0.1 V/s. Figura 35. Voltamperograma cíclico a diferentes concentraciones a pH=6. Velocidad de barrido=0.1 V/s. 50 Al igual que en el estudio con quinina, se realizaron voltamperogramas a diferentes velocidades de barrido y manteniendo constantes la concentración y el pH. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 36 y la Figura 37. Figura 36. Voltamperograma cíclico a diferentes velocidades de barrido a pH=4.2 y concentración 0.04 mM. Figura 37. Relación entre los picos de corriente y la raíz cuadrada de la velocidad de barrido. A pH=4.2 y concentración 0.04 mM. 51 La relación entre la intensidad de pico y la raíz cuadrada de la velocidad de barrido es lineal, como se observa en la Figura 37, lo que significa que el proceso es controlado por difusión. En la Figura 38 se representa la variación del potencial de pico con la velocidad de barrido. Como puede observarse la dependencia también es lineal y confirma que le proceso está controlado por la difusión. Figura 38. Dependencia de los máximos de potencial con la velocidad. A) pH=4.2. B) pH=9. En la Figura 39 se representa el potencial de pico frente a la concentración de luteolin-7-O-glucosido: Figura 39. Dependencia de los máximos de potencial con la concentración a pH=7.3, y velocidad de barrido 0.1 V/s. A B 52 Al igual que con la quinina los valores de las pendientes en la representación del potencial de pico (Ep) frente a la velocidad de barrido (v) y a la concentración (c) fueron δEp/δlog v = 26 mV (Figura 38) y δEp/δlog c = 25mV (Figura 39), los cuales son próximos a los valores teóricos δEp/δlog v y δEp/δlog c = 29 mV lo que indica que el mecanismo de oxidación se corresponde con el mecanismo tipo ECE63. En disoluciones alcalinas (Figuras 40-43) el potencial de oxidación se desplazó hacia valores más bajos al aumentar la concentración del luteolin-7-O-glucosido. Esto significa que la adición de compuesto facilita el proceso de oxidación. Por tanto, es posible que se produzca una reacción química que favorece en la transferencia de electrones. Figura 40. Voltamperograma cíclico a diferentes concentraciones. Velocidad de barrido constante 0.1 V/s y pH=8.5. 53 Figura 41. Voltamperograma cíclico a diferentes concentraciones. Velocidad de barrido constante 0.1 V/s y pH=9. Figura 42. Voltamperograma cíclico a diferentes concentraciones. Velocidad de barrido constante 0.1 V/s y pH=10. 54 Figura 43. Voltamperograma cíclico a diferentes concentraciones. Velocidad de barrido constante 0.1 V/s y pH=11. Como se puede observar en la Figura 44, a pH básico la relación entre Ip y la concentración no es lineal, lo que indica que el proceso está controlado por la adsorción, al contrario que en las disoluciones acidas. Figura 44. Relación entre los máximos de corriente y la concentración a pH=10 y velocidad de barrido 0.1 V/s. 55 En disolución alcalina, al representar el potencial de pico frente a la concentración, la pendiente de la recta tiene un valor más alto, δEp/δlog c = 122 mV. Esto no corresponde con ningún esquema de reacción de los publicados en la literatura. Lo que podría ser debido a una reacción química del compuesto de partida a lo largo de la oxidación. 4.2.2. Espectroelectroquímica UV-Vis. Al igual que con la quinina, también se realizó una voltamperometría cíclica a la vez que se registraba el espectro de absorción molecular UV/Vis de la capa de disolución cercana al electrodo de trabajo. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 45 y Figura 46. El intervalo de potencial fue de -0.5 a 1.0 V para la Figura 45 y de -0.5 a 0.7 V para la Figura 46. En ambos casos la velocidad de barrido fue 5mV/s. Se pueden observar que en los resultados obtenidos a pH=4.20 (Figura 45), el espectro de absorción cambia. Las bandas de absorción a 205 y 353 nm decrecen, mientras que la banda a 248 aumenta al igual que la absorbancia entorno a 290nm y 430nm y además la banda de 248 se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. Figura 45. Espectroscopia UV-Vis del Luteolin-7-O-glucosido a pH=4.20. 56 En el caso del espectro obtenido a pH=8.3, las bandas de absorción que decrecen son a 207, 226, 259 y 379 nm, además la banda de 259nm se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. Además, la absorbancia entorno a 243nm, 298nm y 494 nm aumenta. Figura 46. Espectroscopia UV-Vis del Luteolin-7-O-glucosido a pH=8.3. Aunque la forma química del luteolin-7-O-glucosido es diferente según el pH sea ácido o básico; el comportamiento de los espectros en ambos medios es muy parecido a excepción de la banda entorno a los 250nm, que a pH ácido aumenta durante la oxidación y a pH alcalino disminuye. Al igual que con la quinina, se realizó un experimento para comprobar la estabilidad del luteolin-7-oglucosido en condiciones ambientales. La disolución del luteolin-7-O-glucosido fue preparada en 0.1 M KCl y 4 mM KOH bajo una atmosfera de argón. Esto se realizó inyectando argón para extraer el oxígeno de la solución antes de ser utilizada. El esquema del proceso se muestra en la Figura 47. 57 Figura 47. Esquema del proceso de preparación de la disolución 5.5*10-5 M del luteolin-7-O-glucosido en KCl 0.1 M y KOH 0.2 M sin la presencia de oxígeno. 1) Burbujeo en la disolución soporte 2) Burbujeo en el recipiente con el compuesto 3) Traspaso de la solución al tubo con el compuesto por medio de presión del argón. En primer lugar, se obtuvo el espectro de la disolución libre de oxígeno, y posteriormente los de la disolución habiendo estado expuesta a la presencia de oxígeno durante diferentes tiempos. Los resultados se muestran en la Figura 48. O2 O2 64 Figura 52. Espectros UV-Vis de los productos de la oxidación del Luteolin-7-O-Glucosido obtenidos por HPLC-DAD. 65 Figura 53. Espectros UV-Vis de los productos de la oxidación del Luteolin-7-O-Glucosido obtenidos por HPLC-DAD (D13, D14) y del Luteolin-7-O-Glucosido. 66 5. Conclusión Se ha estudiado el comportamiento electroquímico de dos compuestos naturales bioactivos, la quinina y el luteolin-7-O-glucosido, y se ha encontrado que la oxidación de ambos compuestos está influenciada por sus propiedades acido-básicas. En el caso de la quinina, las controversias en las publicaciones relativas al número de electrones que participan en el proceso de oxidación se explican en los resultados obtenidos. Las medidas de la voltamperometría cíclica y la culombimetría muestran que dos electrones y dos protones participan en la oxidación de la quinina en el rango de pH de 2,1 hasta 10. Los resultados de la voltamperometría cíclica muestran que el mecanismo de oxidación de la quinina es complicado, la transferencia electrónica esta acoplada con reacciones químicas y sugiere que el esquema de reacción sea un mecanismo de tipo ECEC. En los voltamperogramas cíclicos obtenidos en disoluciones acidas donde la molécula de quinina está protonada, se observa la aparición de un producto electroactivo (P). Además, los cálculos teóricos muestran que los orbitales HOMO están localizados en el grupo funcional etenil. Esto sugiere que la molécula protonada de la quinina sufre la oxidación del grupo etenil (Figura 55). Por otro lado, los voltamperogramas cíclicos en disoluciones alcalinas y neutras no muestran la aparición de ningún producto electroactivo. Los cálculos teóricos muestran que los orbitales HOMO están localizados en el anillo de quinolina y en el grupo metoxi. Esto significa que el electrón es extraído de esta parte y que, por tanto, la oxidación sigue el esquema propuesto en la Figura 56. Esta reacción sugiere que después de la oxidación, se produce una adición nucleófila por parte del agua, a las posiciones orto o para del grupo metoxi. Esto estaría de acuerdo con la literatura y con los cálculos realizados de las cargas parciales atómicas. Aunque la quinina es estable en disoluciones alcalinas en presencia de oxígeno, cuando se realiza una electrolisis se han encontrado muchos productos de oxidación, cuyos espectros de absorción son mostrados en este trabajo. 67 Figura 54. Disociación de la quinina en medio acido (QNH+) y en medio alcalino (QN-). Figura 55. Esquema de la oxidación de la quinina y su posible producto en disoluciones acidas. Figura 56. Esquema de la oxidación de la quinina y sus posibles productos en disoluciones neutras y alcalinas. 68 En el caso del Luteolin-7-O-glucosido los resultados de la voltamperometría cíclica muestran que el potencial de oxidación depende del pH, por tanto, los protones están involucrados en la oxidación. Los esquemas de reacción para el luteolin-7-O-glucosido coinciden con el mecanismo de tipo ECE seguido de adición de agua para formar un producto el cual es hidrolizado al finalizar la reacción. Esto coincide con los resultados obtenidos en espectroelectroquímica UV-Vis, que sugieren que es químicamente irreversible. En disoluciones ácidas y neutras se sugiere el mecanismo de oxidación presentado en el esquema de la Figura 57, y que coincide con el esquema de oxidación del Luteolin según la literatura61. Figura 57. Esquema de la oxidación del Luteolin-7-O-Glucosido en disoluciones ácidas. En disoluciones alcalinas las propiedades de oxidación son diferentes a las que el luteolin-7-O-glucosido muestra en disoluciones ácidas y neutras. Por otro lado, la oxidación es más fácil, es decir, el potencial de oxidación es menor, a mayores concentraciones. Lo más probable es que esto sea debido a que se produzca una reacción con el compuesto di aniónico formado por la oxidación. Figura 58. Disociación del Luteolin-7-O-Glucosido en disoluciones alcalinas. En general, los mecanismos de oxidación electroquímica de la quinina y del luteolin-7-O-glucosido son complejos, la transferencia de electrones esta acoplada con la transferencia de protones. Los productos de oxidación se han separado y detectado mediante HPLC-DAD y se han obtenido los correspondientes espectros. 69 ➢ Parte del trabajo de espectro electroquímica UV-Vis del luteolin-7-O-glucosido ha sido presentado en una conferencia internacional en la Republica Checa. La contribución fue: • Castano, A. G., Sokolová, R., Degano, I.: “On UV-Vis Spectroelectrochemistry of Luteolin-7-O-Glucoside.” In: Modern electrochemical methods XXXIX. [Sborník přednášek mezinárodní odborné konference XXXIX. Moderní elektrochemické metody]. Srsenová L. – Best servis Ústí n. L., 2019 - (Navrátil, T.; Fojta, M.; Schwarzová, K.) Jetřichovice (CZ), May 20-24, 2019, p. 31-35. ISBN 978-80-905221-7-6. 70 6. Referencias 1 . 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