Desarrollo y validación de un método HPLC para la determinación simultánea de paracetamol, ácido acetilsalicílico y cafeína en productos farmacéuticos

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Desarrollo y validación de un método HPLC para la determinación simultánea de paracetamol, ácido acetilsalicílico y cafeína en productos farmacéuticos Autor: Adrián de la Fuente Ballesteros Tutor: Marisol Vega Alegre Julio 2019 AGRADECIMIENTOS El trabajo que se expone a continuación ha sido realizado por el alumno del Grado en Química de la Universidad de Valladolid ADRIAN DE LA FUENTE BALLESTEROS, en el departamento de Química Analítica. En primer lugar, quisiera expresar mi agradecimiento a MARISOL VEGA ALEGRE, tutora de este proyecto, por su apoyo incondicional en todo momento y por compartir conmigo sus conocimientos. Del mismo modo, también me gustaría mencionar a los profesionales ROSARIO GÓMEZ y FRANCISCO DE LA ROSA por facilitarme el material de laboratorio y prestarme ayuda con los equipos. RESUMEN Desarrollo y validación de un método HPLC para la determinación simultánea de paracetamol, ácido acetilsalicílico y cafeína en productos farmacéuticos A. de la Fuente Ballesteros1, M. Vega Alegre1,2 1Departamento de Química Analítica, Universidad de Valladolid, Campus Miguel Delibes, Paseo de Belén 7, 47011 Valladolid. 2Instituto de Procesos Sostenibles, Universidad de Valladolid, Dr. Mergelina s/n, 47011 Valladolid. E-mail: [email protected] Palabras clave: analgésicos, validación, incertidumbre, RP-HPLC, optimización, diseño de experimentos, paracetamol, ácido acetilsalicílico, cafeína. Los métodos usados en los análisis farmacéuticos deben ser validados para demostrar que son lo suficientemente exactos, específicos, sensibles y precisos para cumplir con los requisitos reglamentarios de la industria farmacéutica, garantizando así la seguridad y la calidad de los productos. La validación es una forma sistemática de evaluar que el procedimiento analítico es adecuado para el propósito previsto, que produce resultados confiables y precisos y cumple con los requisitos de los organismos reguladores. El ácido acetilsalicílico (AAS) y el paracetamol (PCM) se utilizan como agentes analgésicos y antipiréticos y aparecen generalmente asociados con la cafeína (CFN). Estos compuestos pueden determinarse simultáneamente en medicamentos y en otras formulaciones utilizando la técnica RP-HPLC-UV-Vis. Las mediciones se realizaron con un cromatógrafo de líquidos Agilent Technologies serie 1200 equipado con una columna RP C18 y un detector UV-Vis de longitud de onda variable. Antes de la validación del método, las condiciones cromatográficas se optimizaron utilizando un diseño experimental de Taguchi para identificar los factores más significativos y sus niveles. Se seleccionaron seis factores a tres niveles (composición de metanol, acetonitrilo y tampón de fosfato 0,01 M en la fase móvil, pH, velocidad de flujo y longitud de onda) y un factor a dos niveles (temperatura de columna) para elaborar un diseño L18(2137) de matriz ortogonal. La sacarosa se utilizó como factor de ruido para simular el efecto del excipiente con el fin de aumentar la robustez del método analítico. El análisis de varianza de las áreas de los picos para los tres compuestos indicó que el factor que más influyó fue la longitud de onda, sin embargo la composición y el pH de la fase móvil fueron los factores que más influyeron en la resolución de los picos. La sacarosa no afectó ni a las áreas de los picos ni a los tiempos de retención. Las condiciones de RP-HPLC optimizadas y posteriormente utilizadas en la realización de experimentos fueron: temperatura, 25 ºC; composición de la fase móvil MeOH: Acetonitrilo: Tampón fosfato, 30: 5: 25; pH, 2,7; velocidad de flujo, 1 mL·min-1 y longitud de onda, 230, 246 y 273 nm para AAS, PCM y CFN, respectivamente. Los parámetros de validación estimados han sido: exactitud, precisión, selectividad, robustez, límite de detección y límite de cuantificación, linealidad e intervalo lineal. La veracidad se evaluó para AAS y PCM mediante la participación en una prueba de aptitud para estudiantes de Química Analítica. Todos los parámetros de validación cumplieron los objetivos previamente especificados. La incertidumbre de medida se evaluó a partir de los resultados de la validación. La incertidumbre obtenida superó ligeramente el objetivo propuesto. El método RP-HPLC optimizado es simple, rápido, sensible y preciso y, por lo tanto, adecuado para el análisis rutinario del ácido acetilsalicílico, paracetamol y cafeína en analgésicos. Este se aplicó a la determinación de estos analitos en formulaciones comerciales vendidas en España. ABSTRACT Development and validation of a HPLC method for the simultaneous determination of paracetamol, acetylsalicylic acid and caffeine in analgesics A. de la Fuente Ballesteros1, M. Vega Alegre1,2 1Department of Analytical Chemistry, University of Valladolid, Campus Miguel Delibes, Paseo de Belén 7, 47011 Valladolid. 2Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, Dr. Mergelina s/n, 47011 Valladolid. E-mail: adriandelafuenteballe[email protected]m Key words: analgesics, validation, uncertainty, RP-HPLC, optimization, design of experiments, paracetamol, acetylsalicylic acid, caffeine. Methods used in pharmaceutical analysis must be validated to demonstrate that they are sufficiently accurate, specific, sensitive and precise to conform to the regulatory requirements of the pharmaceutical industry, thus ensuring safety and quality of pharmaceutical products. Validation is a formal and systematic way to assess that the analytical procedure is suitable for its intended purpose, produces reliable and accurate results and also fulfils the requirements of regulatory bodies. Acetylsalicylic acid (AAS) and paracetamol (PCM) are used as analgesic and antipyretic agents. They may appear associated with caffeine (CFN) in many pharmaceutical formulations. These compounds can be simultaneously determined in tablets and other formulations using RP-HPLC with UV/visible detection. Measurements were made with an Agilent Technologies series 1200 HPLC equipped with a RP C18 column and a variable wavelength UV/visible detector. Prior to method validation, the chromatographic conditions were optimized using a Taguchi experimental design to identify the most influencing factors and their optimal levels. Six factors at three levels (composition of methanol, acetonitrile and 0.01 M phosphate buffer in the mobile phase, pH, flow rate and detection wavelength) and one factor at two levels (column temperature) were assigned to the columns of a L18(2137) orthogonal array. Saccharose was used as a noise factor to simulate the effect of the excipient in order to increase robustness of the analytical method. ANOVA of the peak areas for the three compounds indicated that the most influencing factor was wavelength, but the composition and pH of the mobile phase was the most influencing factors on peak resolution. Saccharose didn’t affect either the peak areas or the retention times. The optimized HPLC conditions used in further experiments were: temperature, 25 ºC; composition of the mobile phase MeOH:AcN:Phosphate buffer, 30:5:25; pH, 2.7; flow rate, 1 mLmin-1 and wavelength, 230, 246 and 273 nm for AAS, PCM y CFN respectively. The validation parameters to be estimated include accuracy, precision, selectivity, limit of detection, limit of quantitation, linearity, linear range and robustness. Trueness was evaluated for AAS and PCM through participation in a proficiency test for students of Analytical Chemistry. Validation parameters satisfied the quality objectives previously established. The measurement uncertainty was evaluated from the validation results. Expanded uncertainty was slightly higher than the proposed value. The optimized RP-HPLC method is simple, rapid, sensitive and accurate and therefore suitable for the routine analysis of acetylsalicylic acid, paracetamol and caffeine in analgesic formulations. It was applied to the determination of these drugs in commercial formulations sold in Spain. INDICE 1.- INTRODUCCION TEÓRICA ....................................................................................... 1 1.1.- Parámetros técnicos de validación. ............................................................................. 2 1.2.- Incertidumbre. ............................................................................................................. 4 1.3.- Determinación de analgésicos por RP-HPLC-UV-Vis. .............................................. 6 2.- OBJETIVOS ................................................................................................................... 9 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 11 3.1. Evaluación de la incertidumbre de medida. ................................................................ 11 3.1.1.- Balanzas.................................................................................................................. 11 3.1.2.- Material volumétrico. ............................................................................................. 11 3.2. Selección de las longitudes de onda de máxima absorción de los analitos. ............... 12 3.3. Determinación por RP-HPLC-UV-Vis. ...................................................................... 12 3.4.-Optimización de la determinación cromatográfica. ................................................... 13 3.4.1.-Análisis de datos, ANOVA. .................................................................................... 15 3.4.2.- Participación en un ejercicio interlaboratorio. ....................................................... 16 3.5.- Aplicación del método a muestras reales. ................................................................. 16 4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 19 4.1.-Validación de equipos de medida. .............................................................................. 19 4.1.1.- Balanzas.................................................................................................................. 19 4.1.2.- Material volumétrico. ............................................................................................. 20 4.2.- Validación del método............................................................................................... 27 4.3.- Evaluación de la incertidumbre de medida. .............................................................. 36 4.4.- Aplicación del método a muestras reales. ................................................................. 37 5.- CONCLUSIONES ....................................................................................................... 41 6.- REFERENCIAS. .......................................................................................................... 43 7.- MATERIAL COMPLEMENTARIO ........................................................................... 45 Trabajo Fin de Grado 4 | define como el grado de concordancia entre el valor medido experimentalmente (xi) y el valor verdadero, aceptado o de referencia, siendo la diferencia el error de la medida (ei=xi−μ0). Si se realizan n medidas de la magnitud en idénticas condiciones se obtendrá un valor promedio (x). De este modo el error se puede descomponer en dos términos: ei=xi−μ0=(xi−xi)+(xi−μ) Ecuación. 1 De este modo se verifica que las causas por las que el resultado analítico difiere del valor verdadero es la existencia de errores aleatorios (primer sumando) y sistemáticos (segundo sumando). Puesto que el error sistemático causa sesgo en el resultado y los errores aleatorios producen imprecisión, la exactitud hace referencia a una combinación de veracidad y precisión.  Veracidad. Es la concordancia entre el valor medio de una serie de medidas y el valor aceptado como referencia. Se relaciona con la ausencia de sesgo (bias), esto es, con la ausencia de error sistemático.  Precisión. Se define como la proximidad de los valores medidos en una colección de observaciones replicadas, e informa de la dispersión de los valores individuales alrededor del valor medio. La precisión se estima mediante la desviación típica o la varianza. Dependiendo de las condiciones experimentales hay varios tipos de precisión: Repetibilidad. Proximidad o concordancia de los n resultados individuales obtenidos por el mismo método analítico sobre la misma muestra, en idénticas condiciones (material, reactivos, analista…) y en un corto intervalo de tiempo. Reproducibilidad. Proximidad o concordancia de los n resultados obtenidos con el mismo método y muestra, bajo condiciones experimentales diferentes (diferente laboratorio, diferente instrumento, materiales, reactivos, analista…) y en diferentes momentos. Dependiendo de las condiciones que se modifican se puede hablar también de precisión intermedia. 1.2.- Incertidumbre. La evaluación de la incertidumbre de medida de los resultados de un método de ensayo es un requisito fundamental del proceso de validación. El Vocabulario Internacional de 1. Introducción teórica 5 | Metrología, VIM, define la incertidumbre de medida como la estimación que caracteriza el intervalo de valores en el que se sitúa, con una alta probabilidad, el valor verdadero de la magnitud de medida. Las incertidumbres derivadas de efectos aleatorios y sistemáticos se tratan de la misma manera, es decir, se expresan como desviaciones típicas de distribuciones de probabilidad asociadas y se combinan como varianzas. Las incertidumbres típicas de las fuentes de error se clasifican en dos tipos:  Incertidumbre tipo A: es debida a la repetibilidad de los resultados de las mediciones del objeto de prueba, es una incertidumbre estadística y se calcula mediante la desviación estándar.  Incertidumbre de tipo B: se evalúa a partir de información externa disponible sobre la variabilidad de la magnitud: conocimientos y experiencia sobre comportamiento y propiedades de materiales e instrumentos, datos obtenidos de mediciones anteriores, especificaciones de los fabricantes, datos obtenidos de calibraciones y otros certificados, catálogos, manuales… Las distribuciones más habituales de incertidumbre de tipo B son la normal o gaussiana, rectangular y triangular. La Figura 1 muestra cómo se convierte la dispersión de estas distribuciones en incertidumbre típica de la magnitud x. Figura 1. Incertidumbre típica de las distribuciones de probabilidad más frecuentes. En aquellos casos en los que no se conozca la forma de la distribución, lo más recomendado es suponer una distribución de tipo rectangular para evitar que sea subestimada. Tras identificar cuáles son las fuentes de incertidumbre de un resultado, estas se cuantifican como incertidumbres típicas. A continuación, se combinan según la u(x)=s u(x)=a √3 u(x)=a √6 Trabajo Fin de Grado 6 | ley de propagación de errores para obtener la incertidumbre combinada y finalmente se calcula la incertidumbre expandida multiplicando la combinada por un factor de cobertura K=2, que se corresponde con un nivel de confianza próximo al 95%. Distintas organizaciones se han fundamentado en la Guía para la expresión de la incertidumbre de medida, GUM (JCGM, 2008), para proponer normas y procedimientos para la evaluación de la incertidumbre. De este modo, surgen distintos modelos como se muestran en la Figura 2. (Pérez., 2012; Hernández., 2013). Figura 2. Modelos de estimación de la incertidumbre de medida. 1.3.- Determinación de analgésicos por RP-HPLC-UV-Vis. La determinación simultánea de componentes presentes en los medicamentos suele ir precedida por una separación cromatográfica. La detección de componentes activos en productos farmacéuticos se lleva a cabo habitualmente mediante espectrofotometría UVVis. La falta de selectividad de la detección espectrofotométrica es compensada por la elevada capacidad de separación de la cromatografía de líquidos en fase inversa. En este trabajo se pretende optimizar y validar un método cromatográfico para la determinación simultánea de paracetamol (PCM), cafeína (CFN) y ácido acetilsalicílico (AAS) en analgésicos comercializados en España. 1. Introducción teórica 7 | La selección de los factores a optimizar para tener una separación adecuada y una sensibilidad máxima requiere un conocimiento previo de las características físicoquímicas de los analitos, las cuales se resumen en las Tablas 2 (AAS), 3 (PCM) y 4 (CFN) (PubChem). Tabla 2. Características del AAS Nombre Ácido acetilsalicílico, aspirina Fórmula Peso molecular 180,16 g·mol-1 Propiedades fisicoquímicas pKa (25ºC) = 3,5. Estabilidad para un pH =2-3. En solución acuosa se hidroliza en una semana a 25ºC a pH=5-7. Solubilidad en agua (25ºC) = 3 mg·mL-1 Se presenta en forma de cristales blancos inodoros o polvo cristalino con un sabor amargo. En el aire se hidroliza gradualmente y adquiere olor a ácido acético. Efectos Tratamiento de dolor leve-moderado. Antiinflamatorio y antipirético. Prevención de trombosis. Tabla 3. Características del PCM Nombre Acetaminofenol, paracetamol Fórmula Peso molecular 151,16 g·mol-1 Propiedades fisicoquímicas pKa = 9,38 Solubilidad en agua (20ºC) = 1,4 g /100 mL. Soluble en agua hirviendo pero no en agua fría y en muchos disolventes orgánicos. Se presenta en forma de sólido cristalino blanco inodoro. Sabor amargo. Efectos Analgésico en el tratamiento del dolor leve-moderado. Se combina con otros agentes para el alivio a corto plazo de leves dolores y otros síntomas como estornudos o congestión. Trabajo Fin de Grado 8 | Tabla 4. Características de la CFN Nombre 1,3,7-trimetilxantina, cafeína. Fórmula Peso molecular 194,19 g·mol-1 Propiedades fisicoquímicas pKa (25ºC) = 14,0 pH =6,9 (1% solución) Solubilidad en agua = 15 mg·mL-1 Se presenta en forma de polvo blanco inodoro o agujas blancas brillantes, generalmente fundidas entre sí. Efectos Estimulante del sistema nervioso. Afecta a los niveles celulares de calcio. Anula los efectos del ciclo celular de varios químicos Inhibe los mecanismos de reparación del ADN. 2. Objetivos 9 | 2.- OBJETIVOS Cualquier laboratorio que quiera demostrar su capacidad técnica para llevar a cabo métodos de ensayo debe validar dichos procedimientos aplicando la norma ISO/IEC 17025:2017. La norma es aplicable a laboratorios de ensayo y calibración sea cual sea su tamaño. El objetivo de ese Trabajo Fin de Grado es la optimización y validación de un método analítico y la estimación de la incertidumbre de medida, para la determinación simultánea de ácido acetilsalicílico, cafeína y paracetamol en productos farmacéuticos mediante RPHPLC-UV-Vis. La selección del método se ha basado en criterios como la disponibilidad de material de laboratorio y la posibilidad de participación en un ensayo de aptitud (ejercicio de intercomparación de laboratorios), organizado por el Departamento de Química Analítica de la Universidad de Barcelona, que permitirá evaluar la veracidad de los resultados obtenidos. El plan de trabajo seguido ha sido: 1. Revisión bibliográfica tanto de las técnicas y condiciones de separación de los analitos como de las matrices donde se encuentran en forma de mezcla binaria o ternaria. 2. Calibración y estimación de la incertidumbre del material de laboratorio. 3. Ensayos previos espectrofotométricos y cromatográficos para la elección de factores y niveles a optimizar. 4. Optimización del procedimiento mediante un diseño de experimentos factorial fraccional. 5. Evaluación de los parámetros técnicos de validación. 6. Estimación de la incertidumbre de medida del método. La Tabla 5 muestra los parámetros técnicos de validación a evaluar, la metodología a seguir en cada caso y los objetivos de validación perseguidos. Los objetivos de validación se han seleccionado atendiendo a la criticidad de los productos a analizar, pero teniendo en cuenta que las condiciones ambientales en las que se ha desarrollado el trabajo no son tan controladas como las que se tendrían en un laboratorio farmacéutico. Trabajo Fin de Grado 10 | Tabla 5. Características técnicas de validación, metodología empleada en su estimación y objetivos de calidad perseguidos. Parámetro Requisito Estimación Robustez Robusto Revisión bibliográfica junto con diseño de experimentos Sensibilidad Maximizar Pendiente de la línea de calibrado obtenida en condiciones optimizadas Límite de detección < 0,5 ppm A partir de líneas de calibrado Límite de cuantificación < 1,5 ppm Precisión (reproducibilidad) %DER≤15 % %DER=sR x·100 Veracidad (sesgo) %Er≤10 % Mediante la participación en un ensayo de aptitud Especificidad/selectividad Selectivo Revisión bibliográfica Linealidad Intervalo lineal R2 > 0,99 0,25 – 50 ppm Se deben de cumplir las condiciones de precisión, veracidad e incertidumbre impuestas como objetivos Incertidumbre I ≤20% Combinación de errores aleatorios y sistemáticos 3. Materiales y métodos 11 | 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Evaluación de la incertidumbre de medida. 3.1.1.- Balanzas. La calibración se aplicó a una balanza analítica de precisión monoplato Tipo 1601 AMP8-1 (340450) Sartorius. Las fuentes de error que contribuyen a la incertidumbre de la balanza son: histéresis, excentricidad, tara, repetibilidad y la propia de las masas empleadas.  Histéresis. Debida al rozamiento o fricciones entre las piezas móviles de la balanza. Se calcula como la diferencia entre las lecturas inicial Minicial y final Mfinal, después de una medida, M* (Clark, 2000); Croakin, 2010).  Excentricidad. Debida a la variación por pesar en distintos puntos del platillo de la balanza. Se estima como la diferencia entre el valor medio de dos mediciones en el punto central, M 1−1′ y el máximo valor obtenido de los puntos más alejados del centro del platillo, Mmás alejado a mitad de la máxima capacidad de la balanza (CEM ME-005; González et al., 2007; Reichmuth, 2001; Reichmuth et al., 2004).  Tara. Consiste en comprobar que la balanza recupera el valor de la tara después de una medida. Para ello se tara la balanza al 50% de su capacidad máxima, Mtara y se realizan pesadas de masas crecientes. Se evalúa a partir de la diferencia entre el valor leído, Mleída y el valor nominal tarado, Mnominal tarado , siendo este último la diferencia entre el valor real, Mreal menos el valor de la tara Mtara . (Hernández Revilla, 2013).  Repetibilidad. Se determina el comportamiento de la balanza al medir de forma repetitiva una masa. Se evalúa a partir de la desviación típica o estándar (s) de una serie de medidas (N). 3.1.2.- Material volumétrico. Toda la experimentación se ha llevado a cabo con material volumétrico de clase A. Los matraces aforados, de 10, 25 y 50 mL, y las pipetas usadas, de 1, 2, 5 y 10 mL, se han calibrado y se ha estimado su incertidumbre. El método de calibración empleado fue el gravimétrico basado en calcular el valor de masa de un líquido, cuya densidad es conocida, contenido en el material. Trabajo Fin de Grado 12 | Se realizan medidas de repetibilidad por vertido. Homogeneizamos la pipeta con agua desionizada y tomamos un vaso de precipitados limpio y seco el cual taramos. Añadimos el volumen de la pipeta y anotamos la masa. Se repite la medida 10 veces para cada volumen seleccionado. En el caso de los matraces aforados, se pesan inicialmente secos, y luego se llenan hasta el enrase repetidas veces (N=10), anotando la masa en cada ocasión. La masa de agua se relaciona con el volumen a través de la densidad a la temperatura del laboratorio. Conocidas las fuentes de error que contribuyen a la incertidumbre del material volumétrico (repetibilidad, temperatura y calibración), se estima la incertidumbre. 3.2. Selección de las longitudes de onda de máxima absorción de los analitos. Las longitudes de onda a las que absorben cada uno de los analitos de estudio se determinaron registrando el espectro de absorción molecular de disoluciones de los analitos puros, de concentración 5 ppm en agua-metanol, con un espectrofotómetro de absorción molecular UV-Vis (Hewlett Packard modelo 8453) con detector de red de diodos (diode array). 3.3. Determinación por RP-HPLC-UV-Vis. Se preparó una disolución stock multipatrón conteniendo 1000 ppm de cada uno de los analitos. Para ello se pesaron las cantidades necesarias de los compuestos puros (50 mg) y se disolvieron con 5 mL de metanol, enrasando finalmente a 50 mL con agua desionizada. La disolución se sumergió en el baño de ultrasonidos durante 20 min para asegurar la completa solubilización de los compuestos. Por diluciones sucesivas de la disolución stock se prepararon por pesada patrones de calibración de concentraciones comprendidas entre 0,25 y 40 ppm que fueron medidas por duplicado, registrando en cada caso los tiempos de retención y las áreas de pico. La determinación se llevó a cabo en un cromatógrafo de líquidos Agilent Technologies serie 1200 equipado con bomba cuaternaria (G1311A), termostato de columna (G1316A), detector UV-Vis de longitud de onda variable (G1314B) y desgasificador, empleando una columna de fase inversa Scharlau KromaPhase C18. Previamente se realizaron ensayos con el objetivo de evaluar el efecto en la separación de los analitos y en la sensibilidad de parámetros como: longitud de onda y composición y 3. Materiales y métodos 13 | pH de la fase móvil. Los valores de pH a los que se trabajó fueron 2,7 y 7, y los componentes de la fase móvil ensayados fueron metanol, acetonitrilo y tampón fosfato; todos ellos de grado HPLC. El tampón fosfato para cada pH fue elaborado mezclando en la proporción adecuada cada uno de los componentes del sistema ácido-base del fosfórico, a partir de disoluciones patrón de concentración 0,5 M. El valor final del pH se verificó con el pH-metro. Todos los ensayos previos se realizaron con patrones puros o conjuntos conteniendo 8 ppm de los analitos. En los cromatogramas obtenidos se analizaron la forma y tamaño de los picos, la separación y los tiempos de retención. 3.4.-Optimización de la determinación cromatográfica. Con objeto de optimizar las condiciones experimentales se recurrió a un diseño de experimentos factorial. En primer lugar se identifican cuáles son los factores experimentales que pueden afectar al resultado y se seleccionan los niveles de dichos factores entre los que se sospecha que está el óptimo. Los factores a optimizar y los niveles seleccionados a partir de los ensayos previos se encuentran recogidos en la Tabla 6. Tabla 6. Factores ensayados y sus niveles. La simbología de nivel, -1, 0, +1, hace referencia al valor más bajo, valor intermedio y valor más alto respectivamente para cada factor seleccionado. Para ensayar todas las posibles combinaciones de los niveles de los factores se requiere un número excesivo de experimentos. Con el fin de reducir la experimentación sin pérdida significativa de información se seleccionó un diseño factorial fraccional. El arreglo ortogonal de Taguchi L18(21x37) permite estudiar todos los factores y niveles seleccionados con solo 18 experimentos. La Tabla 7 muestra la combinación de niveles Factor Unidades Nivel -1 Nivel 0 Nivel +1 Temperatura ºC 25 - 35 MeOH % 30 40 50 Acetonitrilo % 0 5 10 Buffer % 25 40 35 pH uds. pH 2,7 5 7 Velocidad de flujo mL·min-1 0,8 1 1,2 Longitud de onda nm 230 246 273 Trabajo Fin de Grado 20 | Figura 4. Contribuciones individuales a la incertidumbre total. Las contribuciones de tara, repetibilidad o excentricidad tienen un reparto aleatorio, destacando entre ellas como más influyentes la debida a las masas patrón, la tara y la excentricidad. Sobre esta última se puede actuar realizando las medidas en el centro del plato. La incertidumbre debida a la histéresis es nula en todos los casos excepto para la masa de 10 g. En cuanto a la incertidumbre de las masas patrón es notorio como aumenta para masas altas y disminuye para masas pequeñas. Esto puede ser debido a que el juego de masas disponible no es de primera calidad. 4.1.2.- Material volumétrico. La Figura 5 muestra los porcentajes de contribución de las fuentes de incertidumbre individuales. La contribución debida a la calibración del matraz es en general la más significativa. La Figura 6 representa la variación de la incertidumbre expandida con el volumen nominal de pipetas (trazo azul) y matraces aforados (trazo rojo). En ambos casos se obtuvieron relaciones polinómicas. El aumento con el volumen de la pipeta es mucho más acusado que en el caso de los matraces aforados. 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018 100 50 10 1 0.1 0.02 u/g Masa nominal/g u(Rep) u(Histe) u(Tara) u(Masas) u(Excen) 4. Resultados y discusión 21 | Figura 5. Contribuciones individuales a la incertidumbre del material volumétrico. Figura 6. Variación de la incertidumbre expandida con el volumen nominal. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1p 1'p 2p 2'p 5p 5'p 10p 10'p 10m10'm25m25'm50m 50'm %Contribucción Pipetas y Matraces %Contr,Vrep %Contr,Vt %Contr,Vcal y = -0.0006x2 + 0.0151x + 0.0005 R² = 0,9764 y = 2·10-5x2 - 0,0004x + 0,0769 R² = 0,8866 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 010 20 30 40 50 60 U expandida (K=2) V nominal /mL Trabajo Fin de Grado 22 | 4.2. Optimización del método RP-HPLC-UV-Vis. Las longitudes de onda óptimas para cada analito se muestran en la Figura 7. Las líneas azul, verde, rojo y amarillo hacen referencia a AAS, CFN, PCM y blanco MeOH/H2O respectivamente. Figura 7. Espectro de absorción para la determinación de las longitudes de onda. Al representar la absorbancia frente a la longitud de onda se obtienen tres máximos de absorbancia a: 273 nm para CFN, 246 nm para PCM y 230 nm para AAS. La Figura 8 muestra 3 cromatogramas obtenidos en condiciones de repetibilidad a pH = 2,7, λ=230 nm, 40% MeOH, 0% Ac, 40% Tampón, 25ºC. Figura 8. Repetibilidad de la separación: PCM (2,1 min); CFN (2,9 min), AAS (6,1 min). 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 190 210 230 250 270 290 310 330 350 A /UA λ / nm 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0246810 Área / UA·min tr /min 4. Resultados y discusión 23 | Se observa la repetibilidad de los picos tanto en tiempo de retención como en área. Las áreas de pico obtenidas para cada combinación experimental del diseño se recogen en la Tabla III del material complementario. Estos resultados se trataron mediante análisis de varianza para identificar los factores significativos que maximizan dicha respuesta. La visualización de los gráficos de interacciones entre los factores y el ruido (Figura 9) proporcionó para los tres analitos el mismo resultado: no existen diferencias significativas entre el nivel de ruido 1 (muestras sin sacarosa) y el 2 (muestras dopadas con sacarosa) ya que el solapamiento de líneas es prácticamente completo. Consecuentemente la presencia del excipiente sacarosa no afecta a los resultados. Figura 9. Representación de las áreas de pico medias a cada nivel de cada factor. Las líneas moradas y naranjas corresponden al estudio con y sin excipiente mientras que la línea horizontal refleja la gran media. Se observa de forma cualitativa que los factores que afectan de forma más significativa al área de pico del PCM son la longitud de onda, la velocidad de la fase móvil y en menor medida el pH. Se obtuvieron conclusiones similares para los otros analitos. El ANOVA de los resultados experimentales permitió identificar los factores con un efecto significativo en el área de pico de los tres analitos. La Tabla 9 resume las ecuaciones empleadas para hacer los cálculos de ANOVA. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 T1 T2 Me1Me2Me3 Ac1Ac2Ac3 B1 B2 B3 pH1pH2pH3 F1 F2 F3 L1 L2 L3 Medias / UA · min Trabajo Fin de Grado 24 | La Tabla 10 resume los valores de probabilidad p-value obtenidos a partir del estadístico F de Fischer de cada factor. Si el valor de F es mayor que el F crítico, entonces p < α (=0.05) lo que implica que el factor es significativo. En la Tabla también se recogen los % de contribución a la varianza de cada factor. Tabla 9. Fórmulas empleadas para el ANOVA. Suma de cuadrados totales SST=∑(xi−x)2=∑xi2−(∑xi)2 n Donde n es el número total de valores SST=∑SSF+SSR Donde SSR es la suma de cuadrados del residual Suma de cuadrados de cada factor SSF=∑(∑xi2)F nF−(∑xi)2 2 m i=1 Donde m es el número de niveles de cada factor Donde n es el nº de resultados a un mismo nivel del factor Suma de cuadrados del ruido SSN=∑(∑xi2)N nN−(∑xi)2 2 m i=1 Cuadrados medios MS=SS gdl Estadístico F F=MSF MSR % Contribución %=SSF SST·100 Grados de libertad gdlT=nº de experimentos − 1 gdlF=nº de niveles −1 gdlFxN=gdlF·gdlN gdlR=gdlT−∑gdlF−∑gdlF×N 4. Resultados y discusión 25 | Tabla 10. Valores del p-value y % de contribución para cada fuente de variación. Los factores significativos se muestran en color verde. PCM CFN AAS Fuente p-value %Contrib. p-value %Contrib. p-value %Contrib. T 0,037 0,735 0,574 0,005 0,082 1,666 Me 0,093 0,562 0,344 0,042 0,082 3,467 Ac 0,112 0,453 0,063 0,330 0,060 4,900 B 0,185 0,252 0,092 0,221 0,061 4,791 pH 0,033 1,691 0,070 0,296 0,011 26,766 F 0,005 10,984 0,003 8,818 0,054 5,431 L 0,001 81,797 0,000 88,641 0,009 35,408 TxMe 0,025 2,223 0,019 1,125 0,030 10,199 N 0,794 0,003 0,614 0,004 0,763 0,019 TxN 0,676 0,007 0,934 0,000 0,401 0,173 MexN 0,552 0,046 0,972 0,001 0,648 0,169 AcxN 0,954 0,003 0,927 0,002 0,852 0,054 BxN 0,818 0,013 0,588 0,016 0,739 0,109 pHxN 0,861 0,009 0,450 0,027 0,560 0,244 FxN 0,790 0,015 0,819 0,005 0,887 0,040 LxN 0,920 0,005 0,983 0,000 0,873 0,045 Residual 1,204 0,468 6,521 Total 100 100 100 Los factores significativos para cada uno de los analitos se resumen en la Tabla 11. Tabla 11. Factores significativos para cada analito. Una vez identificados los factores significativos, la aplicación de la prueba Duncan indicó para estos mismos, entre qué niveles las diferencias eran significativas. La Tabla 12 recoge las conclusiones extraídas. Un factor a destacar fue el porcentaje de acetonitrilo ya que se vio que al aumentar este, los picos se desplazaban a tiempos de retención inferiores y aparecían antes en el cromatograma hasta llegar a solaparse. Para solucionarlo, se realizaron ensayos variando el porcentaje de este disolvente en un intervalo 5 - 10 % hasta conseguir una separación óptima. Analito Factores significativos PCM L, F, pH, T AAS L, F, pH CFN L, F Trabajo Fin de Grado 26 | Tabla 12 Resultados de la prueba Duncan. Durante la realización de estos ensayos, se observó en los cromatogramas obtenidos a pH=7 la aparición de un cuarto pico que se atribuyó a la hidrolisis del AAS en condiciones alcalinas transformándose en ácido salicílico y ácido acético (Poma M., Amanda M., 2016). Figura 10. Reacción de degradación del ácido acetilsalicílico. Con objeto de verificar este hecho y para establecer la frecuencia de preparación de los patrones de dicho analito, sucesivos espectros de una disolución de AAS fueron tomados con el espectrofotómetro a distintos intervalos de tiempo. De este modo se comprobó la interferencia del salicílico en la determinación y la inestabilidad del AAS en medios básicos. Por consiguiente, se eligió un pH ácido de trabajo y los patrones se renovaron con la mayor frecuencia posible. Finalmente, se seleccionaron las condiciones óptimas para la determinación cromatográfica que se muestran en la Tabla 13. Con estas condiciones se observó que se obtenían los picos cromatográficos con una resolución adecuada y con un tiempo de retención y área reproducibles. Además, gracias a que el equipo tiene un detector de longitud de onda variable y que este es el factor más influyente, se optó por medir cada analito a su longitud de onda óptima. Para ello entre los minutos 0 – 2 min el detector se mantuvo a 246 nm para detectar PCM ; entre 2 – 3 min a 273 nm (CFN) y entre 3 – 4 min a 230 nm (AAS). Analito Factor Resultado PCM L Diferencias significativas entre los tres niveles F Diferencias significativas entre F1 y F2-F3 pH Diferencias significativas entre los tres niveles T Diferencias significativas entre T1 y T2 AAS L Diferencias significativas entre L1 y L2-L3 F Diferencias significativas entre F3 y F1-F2 pH Diferencias significativas entre los tres niveles CFN L Diferencias significativas entre los tres niveles F Diferencias significativas entre los tres niveles 4. Resultados y discusión 27 | Tabla 13. Condiciones óptimas de separación. La Figura 11 muestra un cromatograma obtenido en las condiciones optimizadas. Figura 11. Cromatograma con las condiciones optimizadas para una concentración de 15ppm donde se observan tres picos PCM (2,3 min); CFN (3,3 min); AAS (9,2 min). 4.2.- Validación del método. Se han estimado los siguientes parámetros de validación: robustez, especificidad, linealidad, sensibilidad, límites de detección y cuantificación, veracidad y precisión. Robustez Esta propiedad del método analítico se ha evaluado introduciendo una variación incontrolada durante los experimentos de optimización en forma de factor de ruido. Como ya se ha explicado, el efecto de la sacarosa en las áreas de pico y en los tiempos de retención no fue significativo. Los gráficos de interacciones de los factores de control con el factor de ruido evidenciaron para todos los analitos que no existen diferencias significativas entre los resultados de las muestras dopadas con excipiente y sin dopar. El 0 50 100 150 200 250 300 1 3 5 7 9 Área / UA·min tr /min Parámetro Valor Temperatura (ºC) 25 Metanol (%) 30 Acetonitrilo (%) 5 Tampón fosfato (%) 25 pH (uds. pH) 2,7 Velocidad de flujo (mL·min-1) 1 Longitud de onda (nm) 230, 246, 273 Trabajo Fin de Grado 28 | método analítico puede considerarse por tanto robusto y permanece inalterado ante variaciones de la matriz analítica, que suele ser una de las principales fuentes de error de los métodos de análisis. Especificidad/selectividad Cuantificar la selectividad de un método analítico no es una tarea sencilla dado que existen muy pocos métodos que den respuesta a un solo analito. De este modo, se hace notable la dificultad por conocer todas las posibles interferencias presentes en varias matrices y para distintos intervalos de concentración. Por ello, para evaluar la selectividad se han variado las condiciones cromatográficas con el objeto de seleccionar aquellas que proporcionaran picos cromatográficos estrechos y con solapamiento nulo. Los picos de cada analito obtenidos en las condiciones óptimas estaban separados en el tiempo lo suficiente como para poder ser cuantificados y su área era perfectamente diferenciable del ruido de fondo. Por tanto, el método es selectivo. Linealidad / Intervalo lineal El proceso para evaluar el intervalo lineal del método a validar consiste en medir patrones de concentraciones conocidas de analito, representando gráficamente los datos señal/concentración, y determinar cuáles son los límites de concentración entre los cuales la respuesta del método varía linealmente con la concentración. Se observó linealidad en la relación área de pico - concentración en el intervalo 0,25 - 80 ppm para los tres analitos. No obstante, el rango de calibración se redujo al intervalo 0,25 – 40 ppm para disminuir el error típico del ajuste y mejorar la linealidad y los límites de detección, calculados a partir del error típico del ajuste y de la pendiente. La linealidad se evaluó a partir del coeficiente de determinación R2 de las líneas de calibrado, obtenidas diariamente con 8 patrones de calibración con concentraciones dentro del intervalo 0,25 – 40 ppm, preparados por pesada para mejorar su precisión y medidos por duplicado para estimar la falta de ajuste de la regresión. Como se muestra en la Figura 12, al representar la señal frente a la concentración de analito se vio que la respuesta del método es proporcional a la concentración en la muestra, de modo que la relación respuesta/concentración permanecía constante. Los patrones fueron analizados 4. Resultados y discusión 29 | en sentido creciente de concentración con el fin de hacer mínimo el efecto memoria del equipo. Figura 12. Líneas de calibrado para los distintos analitos. Se realizó un análisis de regresión con objeto de conocer la relación entre la respuesta y la concentración. Esta relación se expresa con una función matemática, la cual es empleada para predecir el valor de una de las variables siendo desconocida la otra. La técnica que se empleó fue el ajuste de los puntos experimentales a la mejor relación lineal entre señal y concentración por el método de mínimos cuadrados. Simultáneamente se analizaron los residuales y el coeficiente de determinación como se refleja en la Tabla 14 y en la Figura 13. Tabla 14. Parámetros estimados para evaluar la linealidad. Los valores que se muestran son promedios de todas las líneas de calibrado obtenidas. y = 63.932x+ 1.1611 R² = 0,9998 y = 52,48x - 10.377 R² = 0,9997 y = 97,65x -0.1599 R² = 0.999 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 010 20 30 40 50 Área /UA·min Concentración / ppm CFN AAS PCM Parámetro PCM CFN AAS b0 -1,09 -11,16 64,41 b1 98,09 64,41 53,34 se 16,68 11,24 13,22 R2 0,9998 0,9998 0,9997 Trabajo Fin de Grado 36 | 4.3.- Evaluación de la incertidumbre de medida. La incertidumbre se ha estimado a partir de los resultados de la validación como una combinación de la incertidumbre debida a la componente de precisión más la incertidumbre correspondiente al sesgo. Esta última es a su vez una combinación de la incertidumbre de las medidas realizadas junto con la incertidumbre del material de referencia, como se muestra en la Ecuación 10. uc2=uR 2+uδ 2=sR 2+(ux2+uref 2)=sR 2+(s √n)2+(IC k)2 Ecuación. 10 No obstante, el cálculo también puede realizarse a partir de la concentración consensuada en el ejercicio interlaboratorio aplicando la Ecuación 11 y usando los valores de consenso de la Tabla 21. uδ 2=∑δi2 n+∑uCrefi 2 n=∑δi2 n+∑(si √p)2 n Ecuación. 11 p hace referencia al número de laboratorios participantes Tabla 21. Valores de consenso para la muestra de analgésico. Una vez estimada la incertidumbre combinada, se calcula la incertidumbre expandida como: U=K·uc Ecuación.12 Donde K es el factor de cobertura. Se ha usado un valor de 2 correspondiente a un nivel de confianza del 95% aproximadamente. Los resultados de incertidumbre para AAS y PCM contenidos en las muestras del ejercicio de intercomparación se muestran en la Tablas 22 y 23. Para CFN no se pudo completar la evaluación de la incertidumbre por no disponer de datos de veracidad. Parámetro Valores Ácido acetilsalicílico (%) 4,12 ±0.68 Paracetamol (%) 3,27 ±0.56 4. Resultados y discusión 37 | Tabla 22. Incertidumbre para AAS del ejercicio de intercomparación. Tabla 23. Incertidumbre para PCM del ejercicio de intercomparación. La incertidumbre estimada ha resultado superior al valor objetivo. La razón es doble, por un lado la incertidumbre consensuada para los materiales del ejercicio interlaboratorio era alta debido a que los participantes eran alumnos en formación de diferentes universidades españolas. Por otro lado, la reproducibilidad de las medidas realizadas en este trabajo fue elevada. Ambas contribuciones dan lugar a una incertidumbre ligeramente superior al 25%. 4.4.- Aplicación del método a muestras reales. La concentración de cada analito en el analgésico estudiado se obtuvo por interpolación en la línea de calibrado y se comparó con la concentración real dada por el fabricante observándose una buena concordancia entre ambos valores como se puede ver en la Tabla 24. Tabla 24. Comparativa entre la concentración obtenida y la declarada. Muestra Media uR u uc U 31 4.3 0.282 0.326 0.431 0.9 32 3.6 0.579 0.326 0.664 1.3 33 3.9 0.728 0.326 0.797 1.6 34 4.1 0.659 0.326 0.735 1.5 Muestra Media uR u uc U 31 3.4 0.497 0.223 0.545 1.1 32 2.9 0.255 0.223 0.339 0.7 33 3.2 0.208 0.223 0.305 0.6 34 3.1 0.506 0.223 0.553 1.1 Medicamento Cmedia (mg / comprimido) Cdeclarada (mg / comprimido) CFN AAS PCM CFN AAS PCM Desenfriol 34 336 0 32 389 0 llvico 28 0 297 30 0 325 Actron 40 245 125 40 267 133 Cafiaspirina 50 478 0 50 500 0 Frenadol Complex 23 0 633 30 0 650 Trabajo Fin de Grado 38 | Como es evidente, estos fármacos contenían además de los analitos de estudio, otros que ayudan a establecer las propiedades idóneas, de modo que en las Figuras 14, 15, 16, 17 y 18 aparecen otros picos que no han sido identificados. Figura 14. Cromatograma para Desenfriol: CFN (3,3 min), AAS (9,1 min) Figura 15. Cromatograma para Ilvico: PCM (2,3 min); CFN (3,3 min) 0 100 200 300 400 500 0246810 Área / UA · min tr /min 0 100 200 300 400 500 2 2.5 3 3.5 4 Área / UA · min tr/min 4. Resultados y discusión 39 | Figura 16. Cromatograma para Actron: PCM (2,3 min); CFN (3,2 min); AAS (9.1 min) Figura 17. Cromatograma para Cafiaspirina: CFN (3,2 min); AAS (9,1 min) Figura 18. Cromatograma para Frenadol Complex PCM (2,4 min); CFN (3,3 min) 0 50 100 150 200 250 300 350 0 2 4 6 8 10 12 Área /UA · min tr /min 0 20 40 60 80 100 120 140 0246810 Área /UA · min tr /min 0 100 200 300 400 500 600 700 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Área / UA · min tr /min Trabajo Fin de Grado 40 | 5. Conclusiones 41 | 5.- CONCLUSIONES Las conclusiones a las que se ha llegado mediante la realización de este trabajo han sido: 1. Las contribuciones que más afectan a la incertidumbre de medida en la calibración de equipos son las masas para el caso de la balanza y el factor de calibración para el material volumétrico. 2. Es preferible el empleo de un pH ácido cuando se trabaja con AAS para evitar su hidrólisis y por consiguiente efectos de ruido e interferencias. Además, los patrones de dicho analito son muy inestables en agua y es recomendable su preparación con frecuencia. 3. El excipiente sacarosa presente en la mayoría de los fármacos no tiene efecto significativo en la optimización cromatográfica. La longitud de onda es el factor más influyente en el área mientras que la composición y el pH de la fase móvil fueron los factores que más influyeron en la resolución de los picos. 4. Las condiciones óptimas de separación de los analitos son: temperatura, 25ºC, composición de la fase móvil: Metanol: Acetonitrilo: Tampón fosfato, 30: 5: 25, pH 2,7, flujo 1mL·min-1 y longitud de onda 230, 246 y 273 nm para aspirina, paracetamol y cafeína respectivamente. 5. Se han estimado los parámetros técnicos de validación del método RP-HPLC-UVVis desarrollado. Los objetivos de validación propuestos se han cumplido excepto en el caso de la incertidumbre expandida. Trabajo Fin de Grado 42 | 6. Referencias 43 | 6.- REFERENCIAS. BIMP (2012). International vocabulary of metrology-Basic and general concepts and associated terms. 3rd ed. JCGM 200:2012. Bureau International des Poids et measures, BIMP. Cámara C., Fernández P., Martín-Esteban A., Pérez-Conde C., Vidal C. (2002). Toma y tratamiento de muestras. Síntesis, Madrid, España. CEM ME-005 (s.f). Procedimiento de calibración para la calibración de balanzas monoplato. Centro Español de Metrología, CEM. Chandra P., Rathore A., Lohidasan S., Mahadik K. (2012). Application of HPLC for the Simultaneous Determination of Aceclofenac, Paracetamol and Tramadol Hydrochloride in Pharmaceutical Dosage Form. Sci Pharm, 80: 337–351. Clark, J. (2000). Evaluation of methods for estimating the uncertainty of electronic balance measurements, W.S. Company, Ed. Consulta de densidades. 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Material complementario 45 | 7.- MATERIAL COMPLEMENTARIO Tabla I. Cuantificación de las fuentes de error que contribuyen a la incertidumbre de la balanza Histéresis u(Histe)=|Minicial−Mfinal| √3 Excentricidad u(Excen)=|M 1−1′−Mmás alejado| √3 Tara u(Tara)=|Mleída−Mnominal tarado| √3 Mnominal tarado=Mreal −Mtara Repetibilidad u(Rep)=smasa √N Incertidumbre combinada uc=√uexcen 2+urep 2+uhiste 2+utara proemdio 2+umasas 2 Incertidumbre expandida U=K·uc Tabla II. Cuantificación de las fuentes de error que contribuyen a la incertidumbre de pipetas. Repetibilidad u(V,rep)=√s2 n Temperatura u(V,temp)=Vnominal·∆T·ρ √3 ρ representa el coeficiente de expansión cúbico del agua Calibración u(V,cal)=Vmedio−Vnominal √3 u(V,cal)=√∑δi2 n u (V,cal)=Tolerancia √3 Incertidumbre combinada u(Volumen)= √u(V, rep)2+u(V,temp) 2+u(V,cal) 2 Incertidumbre expandida U=K·u(Volumen) % de Contribución % Vi=u2Vi u2VC·100