Estudio para la determinación de asparagina en alimentos

1 Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Estudio para la determinación de asparagina en alimentos Autora: Henar González Diez Tutores: Dr. Luis Mariano Debán Miguel y Dra. María Isabel Campos Labadie (Departamento de Química Analítica) 2 AGRADECIMIENTOS El siguiente trabajo ha sido realizado por la alumna del Grado en Química de la Universidad de Valladolid HENAR GONZÁLEZ DIEZ, en el departamento de Química Analítica, bajo la dirección del Dr. LUIS MARIANO DEBÁN MIGUEL y la Dra. MARÍA ISABEL CAMPOS LABADIE. La realización de este trabajo ha supuesto para mí un periodo de aprendizaje intenso tanto en el campo científico como a nivel personal. Por lo tanto, me gustaría expresar mi agradecimiento a todas las personas que me han acompañado en este camino. Agradecer a mis tutores el haberme facilitado la realización de este estudio y el haberme permitido tomar iniciativa en todo momento. Del mismo modo, agradecer a los profesionales FRANCISCO DE LA ROSA y ROSARIO GÓMEZ los cuales me han brindado su ayuda y el material de laboratorio necesario. 3 INDICE 1. ACRÓNIMOS ........................................................................................................................ 4 2. RESUMEN/ABSTRACT .......................................................................................................... 5 3. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 6 3.1. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ..................................................................................... 8 4. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 13 5. TÉCNICAS Y MATERIALES UTILIZADOS EN LA DETERMINACIÓN ....................................... 14 5.1. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN ............................................................................................. 14 5.2. DETECCIÓN ...................................................................................................................... 14 6. RESULTADOS EXPERIMENTALES ........................................................................................ 15 6.1. REACTIVOS Y EQUIPOS EMPLEADOS ............................................................................... 15 6.1.1. REACTIVOS ............................................................................................................ 15 6.1.2. EQUIPOS ............................................................................................................... 15 6.2. ANÁLISIS DE ASPARAGINA .............................................................................................. 16 6.2.1. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES PATRÓN .......................................................... 16 6.2.2. ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS ............................................................................ 16 6.2.3. ESPECTROSCOPÍA RAMAN .................................................................................... 22 6.2.4. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS CON DETECTOR DE ULTRAVIOLETA .................. 24 6.2.5. CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA .......... 29 6.3. REACCIÓN DE DERIVATIZACIÓN CON ORTO-FTALDEHIDO (OPA) Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS …………………………………………………………………………………………………………………………………………30 6.3.1. PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN DEL AGENTE DERIVATIZANTE........................ 32 6.3.2. ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA ................................................................ 32 6.3.3. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS CON DETECTOR DE FLUORESCENCIA ................ 36 6.4. EXTRACCIONES DE LAS MUESTRAS Y MEDIDAS .............................................................. 42 6.4.1. EXTRACCIONES...................................................................................................... 42 6.4.2. MEDIDAS ............................................................................................................... 43 6.4.3. MEDIDAS CON ADICIONES PATRÓN ..................................................................... 53 7. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 55 8. BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIAS .......................................................................................... 56 9. ANEXOS ............................................................................................................................. 60 9.1. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS CON DETECTOR DE ULTRAVIOLETA ............................ 60 9.2. CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA ..................... 62 9.3. MEDIDAS ......................................................................................................................... 64 4 1. ACRÓNIMOS ADN: Ácido desoxirribonucleico. Asn: Asparagina. CDs: Carbon dots. Nanopartículas de carbono. CE: Electroforesis capilar. CG-MS: Cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas. CL-MS: Cromatografía de líquidos con detector de espectrometría de masas. ELSD: Evaporative Light Scattering, detector evaporativo de dispersión de luz. FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. FDL: Fluorescencia. FID: Detector de ionización de llama. HPLC: High performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alta eficacia. M.A.P.: Métodos de adiciones patrón. NBD-Cl: 4-cloro-7-nitrobenxofurazan. NIR: Near-infrared spectroscopy. Espectroscopía de infrarrojo cercano. OPA: Orto-ftalaldehido. OPT: OPA+ etanol+ 2-mercaptoetanol + tampón borato. OMS: Organización Mundial de la Salud. SPE: Extracción en fase sólida. TFIR: Fourier-transform infrared spectroscopy, espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier. UV: Ultravioleta. UV-Vis: ultravioleta-visible. 5 2. RESUMEN/ABSTRACT La asparagina (Asn) es un aminoácido que puede encontrarse en múltiples alimentos. En la actualidad, está tomando mucha importancia su estudio puesto que es uno de los principales componentes en la reacción de Maillard que puede derivar en la producción de acrilamida, compuesto cancerígeno. En el siguiente trabajo se ha realizado un estudio para la determinación de asparagina mediante cromatografía de líquidos (HPLC) con detector ultravioleta/visible (UV-Vis) y con detector de fluorescencia (FLD); realizando en el último caso una derivatización previa con orto-ftaldehido (OPA). Además, también se procedió a realizar un breve estudió por cromatografía de gases (CG) con detector de ionización de llama (FID). A lo largo del trabajo se plantean los inconvenientes y las ventajas que presentan cada una de las técnicas de análisis utilizadas, así como el interés de llevar a cabo su determinación mediante un proceso de derivatización. Asparagine (Asn) is an amino acid that can be found in a lot of foods. Currently, its research is becoming very important because asparagine is one of the main components of the Maillard reaction that can lead to the production of acrylamide, a carcinogenic compound. In the following work, a study has been carried out for the determination of asparagine by liquid chromatography (HPLC) with a ultraviolet / visible detector (UVVis) and with a fluorescence detector (FLD); in the last one it is necessary a derivatization with o-Phthalaldehyde (OPA). In addition, a brief study was also carried out by gas chromatography (GC) with flame ionization detector (FID). Throughout the work, we raise the disadvantages and advantages presented by each of the analysis techniques used, as well as the interest of carrying out its determination with a derivatización process. 6 3. INTRODUCCIÓN La asparagina (Asn) se obtuvo por primera vez mediante extracción del jugo del esparrago en 1806 por el químico francés Pierre Robiquet [1]. Es un aminoácido no esencial, es decir, el organismo es capaz de sintetizarlo partiendo de otros compuestos (ácido aspártico y amonio) en el hígado. Las características de la asparagina se indican a continuación:  Fórmula molecular: C4H8N2O3.  Peso molecular: 132.12 g/mol.  Punto de fusión: 235 °C.  Densidad: 1g/cm3.  pK1=2.14 y pK2=8.72.  Posee en su estructura cadenas laterales capaces de formar enlaces de hidrógeno. El grupo amina actúa como donador de hidrógenos, mientras que el grupo carboxilo es receptor de hidrógenos (Fig.1). Figura 1: Estructura química de la asparagina Este aminoácido puede encontrarse en diferentes alimentos como: harinas, huevos, frutos secos, carne de aves, marisco, etc [2]. En la actualidad ha tomado importancia el estudio de la asparagina en alimentos por ser un componente básico para la formación de acrilamida a partir de la reacción de Maillard [3]. Esta reacción consiste en hacer reaccionar el grupo amino de un aminoácido, la asparagina, y un grupo carbonilo de un azúcar reductor como la glucosa, fructosa, maltosa o lactosa. Para poder llevar a cabo la reacción se necesita: temperaturas generalmente superiores a 120 °C (la temperatura ideal oscila entre los 150°C y 250 °C), humedad y pH alcalino (el valor óptimo es pH 10). Dependiendo de las 7 condiciones de trabajo se forman diferentes compuestos intermedios, dando lugar a los productos finales, entre ellos la acrilamida (Fig. 2) [4,5]. Figura 2: Reacción directa e indirecta de Maillard La acrilamida, como hemos comentado, es uno de los compuestos resultantes de la reacción de Maillard, se transforma en el cuerpo humano en un compuesto químico conocido como glicidamida, (Fig.3), la cual es la causante de mutaciones y daños en el ADN [6-8]. Como subproductos de esta reacción cuando se lleva a cabo tanto por vía Vía directa Vía indirecta Vía indirecta Vía directa e indirecta Vía directa e indirecta 8 directa como indirecta son los mismos: se obtiene agua, dióxido de carbono y una imina. [9]. Figura 3: Estructura de la glicidamida La formación de la acrilamida dependerá de los niveles de asparagina y azucares reductores presentes en el alimento, por eso son necesarias técnicas sensibles, precisas y selectivas que sean capaces de determinar la cantidad de asparagina en las muestras. El Reglamento (UE) 2017/2158 de la Comisión, de 20 de noviembre de 2017, establece los niveles de acrilamida de referencia para reducir su presencia en los alimentos [10]. En la actualidad la herramienta más eficaz para el control del contenido de acrilamida es el empleo de la enzima asparaginasa. Esta enzima es capaz de hidrolizar la asparagina obteniendo como producto final el ácido aspártico y amoniaco, (Fig. 4). Sin embargo, su elevado coste (100 U/mg son 171 €) limita su aplicación a gran escala [11]. Figura 4: Reacción de hidrólisis catalizada por la L-asparaginasa. 3.1. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS En la revisión bibliográfica realizada se encuentran diversos métodos analíticos para el análisis cualitativo y cuantitativo de la asparagina. Uno de los más utilizados es la cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de fluorescencia, debido 9 a su alta sensibilidad del orden de nanogramos. A las muestras, diferentes tipos de alimentos y bebidas, se les realiza un tratamiento previo, el cual consiste en una extracción con tiodiglicol acidificado con HCl, precipitación de las proteínas con ácido 5-sulfosalicílico, adición de NaOH (1 M) hasta que el pH se ajusta a 2.2 y finalmente enrase con un tampón de citrato de pH 2.2. Posteriormente se lleva a cabo una derivatización pre-columna utilizando fenilisotiocianato (Fig.5). En la separación cromatográfica se trabaja en gradiente para facilitar la separación de los diferentes aminoácidos [12-15]. + Figura 5: Reacción de fenilisotiocianato con un aminoácido También mediante HPLC con detector fluorimétrico, en otras investigaciones se analizó la asparagina pero llevando a cabo una derivatización post-columna con ninhidrina (Fig.6) [12,14-16]. Figura 6: Reacción de ninhidrina con un aminoácido 16  Cromatografía de gases-FID Equipo AGILENT TECHNOLOGIES 6890N Columna Polietilenglicol 30 m x 0.25 mm diámetro interno x 0.25 µm de espesor  Espectrometría de fluorescencia Equipo Hitachi F-3000 Cubeta Cuarzo Lámpara Xenón  Cromatografía HPLC-FLD Equipo AGILENT 1100 Columna Col Kromaphase 100, C18, 5.0, 150 mm x 4.6 mm  Espectrometría Raman Equipo i-Raman Láser Láser de Diodos (λ=785 nm) 6.2. ANÁLISIS DE ASPARAGINA 6.2.1. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES PATRÓN La muestra patrón original de Lasparagina, es un sólido blanco. A partir del mismo, se prepararon diferentes disoluciones, utilizando agua, metanol, acetonitrilo, hexano y etanol como disolvente. Se estudió en esa gran variedad de disolventes para evaluar el comportamiento y estabilidad del analito en los distintos medios. Se toman alrededor 0.025 g, se disuelven en el medio correspondiente y se enrasan a 50 ml para preparar, en cada caso, las disoluciones patrón de máxima concentración; a partir de estas se prepararon otras de menor concentración tomando diferentes alícuotas y enrasando al volumen adecuado. 6.2.2. ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS Se realiza un estudio para determinar la longitud de onda óptima de absorción de la asparagina en los distintos disolventes, con el fin de fijar las condiciones de 17 medida para llevar a cabo su determinación por HPLC-UV/Vis. En todos los espectros se observó un máximo de absorción entre 200 y 210 nm. Se muestran los espectros correspondientes a la disolución de asparagina en los distintos disolventes en la Fig.9. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 190 240 290 340 390 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en agua 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 200 250 300 350 400 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en etanol 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 200 250 300 350 400 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en acetonitrilo 204 nm 207 nm 200 nm 18 Figura 9: Espectro UV-Vis de la disolución de asparagina en los distintos disolventes INFLUENCIA DEL TIEMPO Se mantuvieron las muestras en recipientes de plástico cerrados y en ausencia de luz durante un periodo de tiempo de hasta dos meses, procediéndose a medir la absorbancia de las disoluciones anteriormente citadas con el fin de observar su estabilidad. Se comprobó que en metanol y etanol el espectro variaba, posiblemente por la reacción del alcohol con la asparagina obteniéndose el correspondiente éster (Fig.10). Cuando el disolvente utilizado era el hexano también se observaban modificaciones en su espectro; debido a la posible epimerización de la asparagina. En agua y acetonitrilo los espectros de absorción sufrieron ligeras modificaciones. 0 0,5 1 1,5 2 200 250 300 350 400 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en hexano 0 0,2 0,4 0,6 0,8 200 250 300 350 400 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en metanol 207 nm 210 nm 19 Figura 10: Esterificación asparagina al reaccionar con etanol. Es similar con metanol. A continuación, se muestran los espectros correspondientes a la disolución de asparagina en los distintos disolventes al cabo de dos meses. (Fig.11). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 190 240 290 340 390 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en agua 0 0,4 0,8 1,2 190 240 290 340 390 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en etanol 204 nm 207 nm 20 Figura 11: Espectro UV-Vis de la disolución de asparagina en los distintos disolventes al cabo de dos semanas de su preparación. 0 0,4 0,8 1,2 1,6 190 240 290 340 390 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en acetonitrilo 0 0,5 1 1,5 2 2,5 190 240 290 340 390 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en hexano 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 200 250 300 350 400 Absorbancia (UA) Longitud de onda (nm) Disolución asparagina en metanol 207 nm 200 nm 210 nm 21 INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN Se realizó una línea de calibrado de diferentes patrones de asparagina en agua; en la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos para un intervalo de entre 1 y 52 ppm, cuando se representan, Fig. 12, la buena linealidad se observa entre 1 y 20 ppm. No se tiene en cuenta el valor de 52 ppm en la representación dado que el resultado nos indica una saturación en la medida, con un elevado error. El valor de la absortividad molar es 4.24 · 104 L/mol · cm. Tabla 1: Línea de calibrado UV-Vis, patrones de asparagina en agua. Concentración (ppm) Absorbancia (UA) 1.04 0.239 2.09 0.280 4.18 0.268 10.50 0.441 20.88 0.880 52.20 1.614 Figura 12: Línea de calibrado UV-Vis. Asparagina disuelta en agua. En el caso de las disoluciones patrón en metanol, su línea de calibrado no presenta una buena linealidad, debido a la reacción secundaria de formación de esteres metílicos anteriormente citada. En medio acetonitrilo se realizó también una línea de calibrado con diferentes patrones. En la Tabla 2 se muestran los resultados obtenidos para el intervalo de entre 0.08 y 8,08 ppm. La mejor linealidad se observa aproximadamente en dicho intervalo y = 0,0321x + 0,1736 R² = 0,9641 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 5 10 15 20 Absorbancia (UA) Concentración (ppm) Línea de calibrado UV-Vis, patrones en agua 22 como se puede comprobar en la Fig. 13. El valor de la absortividad molar es 4.88·103 L/mol · cm. Tabla 2: Línea de calibrado UV-Vis, patrones de asparagina en acetonitrilo. Concentración (ppm) Absorbancia (UA) 0.08 0.095 0.32 0.197 0.81 0.211 1.62 0.213 4.04 0.221 8.08 0.238 Figura 13: Línea de calibrado UV-Vis. Asparagina disuelta en acetonitrilo. 6.2.3. ESPECTROSCOPÍA RAMAN Se realizan diferentes medidas por esta técnica para caracterizar la muestra sólida correspondiente al patrón de asparagina (Fig. 14). Los desplazamientos e intensidades relativas de las bandas podrían permitir identificar el compuesto en dicho tipo de muestras. La asparagina está compuesta por 17 átomos, por lo que posee 45 modos normales de vibración; además como no existen elementos de simetría en una molécula aislada todos los modos normales son activos en Raman. Los desplazamientos más característicos que se pueden apreciar en el espectro Raman de la asparagina se reflejan en la tabla 3. y = 0,0037x + 0,2073 R² = 0,9928 0,19 0,2 0,21 0,22 0,23 0,24 0,25 0246810 Absorbancia (UA) Concentración (ppm) Línea de calibrado UV-Vis, patrones en acetonitrilo 23 Figura 14: Espectro Raman de la asparagina. Tabla 3: Desplazamientos del espectro Raman de la asparagina Desplazamiento (cm−1) Descripción 247 Torsión C-C 323 Flexión C-C-C 537 Torsión NH2 750 Aleteo NCO 874 Balanceo CH2 937 Extensión C-C 1070 Extensión C-N 1110 Balanceo NH3+ 1150 Aleteo NH2 1328 Flexión C-H 1410 Extensión C-N (amida primaria) 1500 Flexión NH3+ 2950 Extensión CH2 2980 Extensión CH En el intervalo entre 2900 y 3000 cm−1 aparece también la molécula de agua. 24 6.2.4. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS CON DETECTOR DE ULTRAVIOLETA Se estudiaron las disoluciones patrón de acetonitrilo, agua y metanol a distintas concentraciones, se fijó la longitud de onda a 200 nm, 204 nm y 210 nm respectivamente; y se trabajó con diferentes fases móviles. Dadas las características del compuesto y de la columna utilizada, se procedió en primer lugar a su estudio con una fase constituida únicamente con acetonitrilo para posteriormente modificar los porcentajes de este; con el fin de encontrar las condiciones más óptimas de medida. (Tabla 4) Tabla 4: Fases móviles Fase móvil % Acetonitrilo % Agua % Metanol % Tampón fosfato pH=2.8 1 100 0 0 0 2 80 10 10 0 3 20 70 10 0 4 40 40 20 0 5 5 85 0 10 Todas las disoluciones patrón fueron medidas al menos por triplicado para comprobar la reproducibilidad de los resultados. En patrones en acetonitrilo los mejores resultados se obtienen con fase móvil 1; en medio acuoso con fase móvil 3; y las disoluciones patrón en metanol las condiciones idóneas de trabajo son las correspondientes a fase móvil 5. En la tabla 5 se recogen los tiempos de retención de la asparagina en los distintos medios y condiciones que ha sido medida, los cuales pueden verse reflejados en las Figuras 15, 16 y 17 que corresponden a los diferentes cromatogramas. Tabla 5: Tiempos de retención de la asparagina Disolvente Fase móvil Tiempo de retención de la L-asparagina(min) Acetonitrilo 1 3.63 Agua 3 1.31 Metanol 5 1.40 25 Figura 15: Disolución asparagina en acetonitrilo. Fase móvil 1. Figura 16: Disolución asparagina en agua. Fase móvil 3. Figura 17: Disolución de asparagina en metanol. Fase móvil 5. A continuación y en las condiciones óptimas de medida, se procedió a realizar las correspondientes líneas de calibrado en acetonitrilo, agua y metanol. Los resultados se reflejan en las Tablas 6, 7, 8 y Figuras 18, 19 y 20. 32 Según lo descrito en la bibliografía [14], no es necesario eliminar el exceso de OPA antes de medir la muestra ya que el reactivo por sí mismo no interfiere en la separación o detección. Sin embargo, como los derivados OPA-aminoácidos son inestables, para conseguir unos resultados reproducibles es esencial controlar de manera muy precisa el tiempo de reacción. La reacción se completa totalmente en un minuto a temperatura ambiente. Como se carece de una pre-columna, se realiza esta etapa en un tubo de ensayo. 6.3.1. PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN DEL AGENTE DERIVATIZANTE El OPT se obtiene disolviendo una cantidad aproximada de 270 mg de OPA en 5 ml de etanol, a dicha disolución se añaden 200 μl de 2-mercaptoetanol y seguidamente se enrasa a 50 ml con una disolución tampón borato/ ácido bórico pH de 9,5. Es conveniente dejar envejecer el OPT durante 24 horas antes de llevar a cabo la reacción de derivatización. La disolución derivatizante deja de ser útil cuando la disolución incolora cambia a amarillo. 6.3.2. ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA Una vez hecha la derivatización en las diferentes disoluciones patrón de asparagina en agua, con el espectrofluorímetro se realiza el espectro de emisión y excitación para fijar las condiciones óptimas en cada uno de los casos. En primer lugar, se fija la longitud de onda de absorción (excitación) a fin de obtener la correspondiente de emisión. A continuación para concretar de forma más precisa la longitud de onda de excitación, se fija la de emisión y se hace el barrido correspondiente para encontrar la idónea en excitación, el espectro (Fig. 25) se recogió manteniendo constante la longitud de onda de emisión a 430 nm, obteniéndose como longitud de onda de excitación 339 nm. 33 Figura 25: Espectro de excitación del ácido 4-amino -2-(1-((2-hidroxietil) tio)-2H-isoindol-2-il)- 4-oxobutanoico (derivado isoindólico). Posteriormente con la longitud de onda de absorción de 339 nm se realiza el correspondiente barrido en emisión, obteniéndose dos bandas, la más intensa a 430 nm y otra de mucha menor intensidad a una longitud de onda aproximadamente igual a 680 nm. (Fig. 26) Figura 26: Espectro de emisión del derivado isoindólico INFLUENCIA DEL TIEMPO Se estudia la estabilidad del derivado isoindólico fluorescente resultante de la derivatización; para ello se mide su fluorescencia dejando pasar intervalos de tiempo diferentes. De ese modo se comprueba que los mejores resultados se obtienen en los dos primeros minutos después de la derivatización. A fin de comprobar la conveniencia 339 nm 430 nm 34 de dejar envejecer el reactivo derivatizante durante 24 horas antes de su utilización; se procedió a medir la intensidad de emisión de los patrones en función del tiempo de preparación del OPT, a los 15 minutos de ser preparada y a las 24 horas, los resultados se recogen en las tablas 10, 11, 12, 13 y figuras 27 y 28.  Medidas de la intensidad después de la derivatización y sin dejar envejecer el OPT. Tabla 10: Resultados de la espectrometría de fluorescencia. Disoluciones de asparagina en agua derivatizadas in-situ. Sin dejar envejecer el OPT. Concentración Asn (ppm) Intensidad 0.397 57.18 0.978 108.50 1.936 346.30 3.872 423.10 5.808 963.10 9.680 1404.00 15.488 2041.00 19.360 2224.00 Figura 27: Línea de calibrado espectrometría de fluorescencia. Disoluciones de asparagina en agua derivatizadas in-situ. Sin dejar envejecer el OPT. y = 133,15x + 59,559 R² = 0,9884 0 500 1000 1500 2000 2500 0 5 10 15 20 Intensidad Concentración (ppm) Línea de calibrado espectrometría de fluorescencia 35  Medidas de la intensidad después de la derivatización y con disolución OPT envejecida 24 horas. Tabla 11: Resultados de la espectrometría de fluorescencia. Disoluciones de asparagina en agua derivatizadas in-situ. Disolución OPT envejecida 24 horas. Concentración Asn (ppm) Intensidad 0.194 18.66 0.397 46.74 0.978 95.47 1.936 253.90 3.872 409.60 5.808 719.50 9.680 1150.00 15.488 1389.00 19.360 1787.00 Figura 28: Línea de calibrado espectrometría de fluorescencia después de derivatización. Disoluciones de asparagina en agua. Disolución OPT envejecida 24 horas. y = 91,759x + 64,007 R² = 0,9773 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 5 10 15 20 Intensidad Concentración (ppm) Línea de calibrado espectrometría de fluorescencia 36  Medidas de la intensidad después de 2 horas y media de la derivatización y con disolución OPT envejecida 24 horas. Tabla 12: Resultados de la espectrometría de fluorescencia. Disoluciones de asparagina en agua medidas tras dos horas y media de la derivatización. Disolución OPT envejecida 24 horas Concentración Asn (ppm) Intensidad 0.003 36.72 0.006 17.99 0.012 18.01 0.024 66.23 0.048 24.53 0.097 45.04 0.194 45.27 0.387 75.85  Medidas de la intensidad después de 24 horas de la derivatización y con disolución OPT envejecida 24 horas. Tabla 13: Resultados de la espectrometría de fluorescencia. Disoluciones de asparagina en agua medidas tras 24 horas de la derivatización. Disolución OPT envejecida 24 horas. Concentración Asn (ppm) Intensidad 0.387 17.03 0.968 14.15 1.936 14.36 3.872 20.26 5.808 56.59 9.680 59.37 15.488 56.71 Con estos ensayos se puede comprobar que las medidas de intensidad realizadas con el derivado isoindólico al cabo del tiempo recomendado no presenta una relación lineal con la concentración; además de que el hecho de dejar envejecer la disolución derivatizante para mejorar los resultados no supone un progreso apreciable. 6.3.3. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS CON DETECTOR DE FLUORESCENCIA Se estudiaron las disoluciones derivatizadas de los patrones en agua y metanol, se fijó la longitud de onda de excitación a 339 nm y la de emisión a 460 nm. Dadas las características del compuesto, y de los estudios anteriormente realizados con 37 disoluciones patrón de asparagina en agua y metanol (apartado 6.2.4.) se procedió a realizar las medidas de los derivados isoindólicos en las mismas fases que las reflejadas en dicho apartado, fase móvil 3 en agua y fase móvil 5 en metanol. Fase móvil % Acetonitrilo % Agua % Metanol % Tampón fosfato pH=2.8 3 20 70 10 0 5 5 85 0 10 La derivatización se lleva a cabo dos minutos antes de la inyección en el cromatógrafo, para que el compuesto presente su máxima fluorescencia. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN Se procede al estudio de disoluciones patrón en agua de diferentes concentraciones entre 3 ppb y 4 ppm. En la figura 29 se muestra el resultado obtenido para una concentración de asparagina de 0.2 ppm, donde el pico del derivado de la asparagina es el correspondiente a 1.962 minutos, se observa otro pico a 1.316 minutos, posiblemente debido a impurezas en el patrón o los reactivos. Figura 29: Disolución de asparagina derivatizada en agua de concentración 0.2 ppm. Condiciones 3. Cuando la concentración de la asparagina era igual o superior a 2 ppm se aprecia una amplia banda que posiblemente incluye varios picos en el cromatograma a un tiempo de retención de 1.598 minutos (Fig. 30) que dificulta la medida del derivado isoindólico, quizás por reacciones secundarias no controladas. En consecuencia a partir 38 de dicha concentración, la relación lineal entre la intensidad y la concentración del derivado isoindólico deja de existir. Figura 30: Disolución de asparagina derivatizada en agua. Condiciones 3. Al medir las disoluciones patrón en metanol se observan dos picos, uno correspondiente al derivado a 1.640 minutos de retención y otro posiblemente de impurezas a 1.358 minutos. Cabe destacar que la intensidad de fluorescencia en este medio es mucho menor debido a la reacción de esterificación de la asparagina ya explicada en apartados anteriores (5.2.2). En la Figura 31 se muestran los picos obtenidos para 50 ppb. Figura 31: Disolución de asparagina derivatizada en metanol. Condiciones 5. Como en el caso anterior (disolución de asparagina en agua), al aumentar la concentración de asparagina en metanol por encima de 1 ppm, se aprecia un nuevo 39 pico en el cromatograma con un tiempo de retención de 2.054 minutos (Fig.32) e igual que anteriormente la relación lineal entre la concentración y la intensidad deja de ajustarse a una recta. Figura 32: Disolución de asparagina derivatizada en metanol. Condiciones 5. INFLUENCIA DEL TIEMPO Se analizaron después de la derivatización las disoluciones de asparagina en agua (fase móvil 3) y en metanol (fase móvil 5). Dichas disoluciones se midieron, unas al momento de ser preparadas y otras a las dos semanas de su preparación con el fin de comprobar si se producía alguna modificación en la señal. En los cromatogramas de las disoluciones en agua recién preparadas aparecen los dos picos correspondientes a tiempo de retención en torno a 1.3 y 1.9 minutos, mientras que en los cromatogramas de disoluciones de asparagina preparadas al cabo de dos semanas se observan una amplia aparición de picos incluyendo los anteriores pero de área menor, lo que induce a concluir que con el transcurso del tiempo se produce una modificación del compuesto originando otros derivados. Los resultados se observan en la Figura 33. Por consiguiente se procederá a realizar las medidas inmediatamente después al proceso de preparación de la disolución y derivatización de la misma. 40 Figura 33: Disolución de asparagina derivatizada en agua. Tiempo de la disolución patrón de asparagina 2 semanas. Condiciones 3. En metanol, al medir las disoluciones preparadas in-situ, en el cromatograma se pueden visualizar dos picos diferentes siendo el compuesto de interés el que posee un tiempo de retención de 1.6 minutos. En los cromatogramas de disoluciones de asparagina preparadas al cabo de dos semanas los picos son muy similares y no aparecen otros picos como ocurría en el caso de las disoluciones acuosas Figura 34: Disolución de asparagina derivatizada en metanol. Tiempo de la disolución patrón de asparagina 2 semanas. Condiciones 5. 41 LÍNEA DE CALIBRADO DEL DERIVADO ISOINDÓLICO EN AGUA, FASE MÓVIL 3. Tabla 14: Valores áreas del pico con tiempo de retención 1.9 min. HPLC-FLD, fase móvil 3, asparagina disuelta en agua derivatizada. Concentración (ppm) Área pico (LU·s) 0.387 831.15 0.194 349.60 0.048 38.79 0.024 28.96 0.012 24.70 Figura 35: Línea de calibrado del derivado isoindólico en agua. Condiciones 3. LÍNEA DE CALIBRADO DEL DERIVADO ISOINDÓLICO EN METANOL, FASE MÓVIL 5. Tabla 15: Valores áreas del pico con tiempo de retención 1.65 min. HPLC-FLD, fase móvil 5, asparagina disuelta en metanol derivatizada. Concentración (ppm) Área pico (LU·s) 0.920 1.03 0.368 0.70 0.184 0.62 0.092 0.58 0.046 0.52 0.023 0.49 0.011 0.44 y = 2186,2x - 36,127 R² = 0,9915 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 Área pico (LU·s) Concentración (ppm) Línea de calibrado en agua HPLC-FLD 48 9) ESPARRAGOS VERDES EXTRAIDOS CON METANOL Figura 46: Extracto de espárragos en metanol. Soxhlet. Fase móvil 5 Se detecta en todos los casos el pico correspondiente a la asparagina, aunque con solapamiento de otros picos probablemente debido a la alta presencia de aminoácidos en este alimento, lo que dificulta su determinación. 6.4.2.2. MEDIDAS: HPLC-FLD Se determinó la asparagina presentes en las muestras por HPLC-FLD, para ello se realiza primeramente su derivatización según lo descrito en el apartado 6.3. Las condiciones de medida fueron; λ de absorción 339 nm, λ de emisión 430 nm y la fase móvil varía según el medio de trabajo, son las referidas en el apartado 6.3.3. 1) HARINA DE TRIGO EN AGUA Figura 47: Extracto al baño maría de harina de trigo en agua. Fase móvil 3. Asparagina Isoindol 49 2) HARINA DE TRIGO EN METANOL Figura 48: Extracto al baño maría de harina de trigo en metanol. Fase móvil 5. 3) HARINA DE ARROZ EN AGUA Figura 49: Extracto al baño maría de harina de arroz en agua. Fase móvil 3. Isoindol Isoindol 50 4) HARINA DE ARROZ EN METANOL Figura 50: Extracto al baño maría de harina de arroz en metanol. Fase móvil 5. 5) PAN RALLADO EN AGUA Figura 51: Extracto al baño maría de pan rallado en agua. Fase móvil 3. Isoindol Isoindol 51 6) PAN RALLADO EN METANOL Figura 52: Extracto al baño maría de pan rallado en metanol. Fase móvil 5 7) SÉMOLA DE TRIGO EN AGUA Figura 53: Extracto al baño maría de sémola de trigo en agua. Fase móvil 3. Isoindol Isoindol 52 8) SÉMOLA DE TRIGO EN METANOL Figura 54: Extracto al baño maría de sémola de trigo en metanol. Fase móvil 5. 9) ESPARRAGOS VERDES EN METANOL Figura 55: Extracto de espárragos en metanol. Soxhlet. Fase móvil 5 Se detecta en todos los casos el pico correspondiente al derivado isoindólico, aunque en medio acuoso se observa un gran solapamiento con otros picos debido probablemente al efecto matriz de componentes de las distintas muestras. Sin embargo, en metanol este efecto es más leve. Isoindol Isoindol 53 6.4.2.3. CANTIDAD DE ASPARAGINA EN CADA MUESTRA Para poder cuantificar la asparagina de cada muestra, se procedió a hacer una extrapolación del área del pico en la línea de calibrado resultante de las diferentes técnicas de análisis. Las áreas de los picos de cada muestra y la cantidad de asparagina que ha sido extrapolada se recogen en la tabla 16. Tabla 16: g Asn/ 100 g muestra. Muestra Disolvente HPLC-UV/VIS HPLC-FLD Área (mAU· s) g Asn /100 g muestra Área (LU·s) g Asn /100 g muestra Harina de trigo Agua 8.90 0.004 29.28 0.000 Harina de trigo Metanol 154.85 0.136 0.52 0.000 Harina de arroz Agua 79.34 0.043 4.89 0.000 Harina de arroz Metanol 96.72 0.055 0.67 0.001 Pan rallado Agua ---- ---- 16.17 0.000 Pan rallado Metanol 103.43 0.061 35.83* 0.206 Sémola de trigo Agua 1.90 0.001 46.35 0.000 Sémola de trigo Metanol 160.23 0.145 0.82 0.002 Espárragos Metanol 799.27 0.305 13.63* 0.022 *Preciso hacer diluciones. 6.4.3. MEDIDAS CON ADICIONES PATRÓN Dado el efecto matriz, para contrastar los resultados se procede a efectuar a cada muestra adiciones patrón. Para llevar a cabo las adiciones primero se realiza un blanco y posteriormente se procede a las adiciones sobre las muestras. Las condiciones de trabajo óptimas son las mismas que se indicaron en el apartado 6.2.4 y 6.3.3. 6.4.3.1. ADICIONES PATRÓN: HPLC-UV/VIS A continuación, se presentan los resultados una vez calculado el volumen equivalente. A partir de él se obtiene la concentración de cada una de las muestras (Tabla 17). 54 Tabla 17: Volúmenes equivalentes y concentración de Asn determinada por HPLCUV/VIS con adiciones patrón Muestra Disolvente V eq (ml) V eq – V eq, blanco (ml) g Asn /100 g muestra Harina de trigo Agua -0.78 -0.51 0.003 Harina de trigo Metanol -18.10 -14.68 0.090 Harina de arroz Agua -3.49 -3.22 0.021 Harina de arroz Metanol -15.92 -12.50 0.078 Pan rallado Agua -19.85 -19.58 0.128 Pan rallado Metanol -15.72 -12.30 0.072 Sémola de trigo Agua -0.23 -0.23 ---- Sémola de trigo Metanol -59.19 -55.77 0.345 Espárragos Metanol -62.69 -59.27 0.267 6.4.3.2. ADICIONES PATRÓN: HPLCFLD Igual que en el apartado anterior, se trabajó del mismo modo con las muestras, pero procediendo a su derivatización, los resultados para la determinación de los volúmenes equivalentes y las correspondientes concentraciones de asparagina se recogen en la tabla 18. Tabla 18: Volúmenes equivalentes y concentración de Asn determinada por HPLC-FLD con adiciones patrón Muestra Disolvente V eq (ml) V eq – V eq, blanco (ml) g Asn /100 g muestra Harina de trigo Agua -21.67 -19.89 0.128 Harina de trigo Metanol -207.91 -189.12 1.158 Harina de arroz Agua -12.92 -11.14 0.073 Harina de arroz Metanol -80.42 -61.63 0.373 Pan rallado Agua 1.53 1.53 ---- Pan rallado Metanol -22.03 -3.24 0.019 Sémola de trigo Agua -32.12 -30.34 0.195 Sémola de trigo Metanol -0.10 -0.10 ---- Espárragos Metanol -4.79 -4.79 ---- 55 7. CONCLUSIONES 1) Se ha realizado un estudio de la estabilidad de la asparagina en diferentes disolventes. En alcohol, se ha comprobado que la asparagina es inestable, debido a la reacción entre el grupo carboxílico que posee el aminoácido y el alcohol del disolvente. En agua y acetonitrilo las disoluciones de asparagina presentan alta estabilidad. En hexano la asparagina se epimeriza con el paso del tiempo. 2) Se analizó la asparagina por absorción molecular UV-VIS para determinar la longitud de onda a la que aparece su máximo de absorción. Las longitudes de onda idóneas para realizar su determinación por HPLC son: 200 nm en acetonitrilo, 204 nm en agua y 210 nm en metanol. 3) Se ha determinado la asparagina utilizando como técnica de análisis HPLC-UV/Vis, su separación y determinación se produce a un tiempo de retención de 3.631 min (acetonitrilo), 1.313 min (agua) y 1.403 min (metanol). Los límites de detección obtenidos en agua y metanol son de 0.11 y 0.26 ppm respectivamente. 4) Se realizó un breve estudio de la asparagina en metanol por CG-FID llegando a la conclusión, de que esta metodología no es la más adecuada debido a la reacción de esterificación que se lleva a cabo de manera espontánea entre el aminoácido y el disolvente. 5) Se procedió a estudiar el derivado isoindólico resultante de la reacción entre la asparagina y el agente derivatizante OPA por espectrometría de fluorescencia; obteniéndose las longitudes de onda óptimas de emisión (λ=430 nm) y excitación (λ=339 nm) para su posterior determinación por HPLC/FLD. 6) La separación y determinación cromatográfica del compuesto se produce a un tiempo de retención de 1.962 minutos (agua) y 1.598 minutos (metanol) con LoD y LoQ de 0.01 ppm y 0.03 ppm respectivamente en los dos medios. 7) En medidas sobre muestras de alimentos el efecto matriz es muy importante por lo que se debe aplicar el método de adicciones patrón. 8) Como conclusión general, indicamos que, el mejor método para determinar esta sustancia en alimentos es HPLC-UV/Vis. Presenta mayores ventajas puesto que no se precisa de una derivatización previa, los tiempos de retención son cortos lo que disminuiría el coste por análisis y la separación de los picos es adecuada. 56 8. BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIAS [1] Vauquelin, L.N. y Robiquet, P.J. La découverte d'un nouveau principe végétal dans le suc des asperges. Annales de Chimie, nº 57, 88–93. (1806). [2] Euston96. Asparagina. Recuperado de: https://www.euston96.com/asparagina/ [3] Maillard, L. C. Action des acides amines sur les sucres; formation des melanoidines par voie Méthodique. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. Vol. 154, 66-68. (1912). [4] Echeverri, M.L, Jaramillo, L.A., Quiroz J. ACRILAMIDA: Formación y mitigación en procesamiento industrial de alimentos. (Trabajo Fin de Grado). Corporación Universitaria Lasallista, Caldas Antioquia. (2014). Recuperado de: http://repository.lasallista.edu.co/dspace/bitstream/10567/1573/1/ACRILAMIDA_Fo rmacion_mitigacion_procesamiento_industrial_ali.pdf. [5] Hedegaard, R. V., Frandsen, H. y Skibsted L. H. Kinetics of formation of acrylamide and Schiff base intermediates from asparagine and glucose. Food Chemistry, Vol. 108, 917-925. (2008). [6] Instituto Nacional del Cáncer. Acrilamida y el riesgo de cáncer. (2017). Recuperado de: https://www.cancer.gov/espanol/cancer/causas-prevencion/riesgo/dieta/hojainformativa-acrilamida. [7] Morillo, M. La acrilamida tiene un “color” especial. (2019). Recuperado de: https://blog.cartif.com/la-acrilamida-tiene-un-color-especial/. [8] Sociedad Española de Oncología Médica. La repercusión en la prensa española de las noticias relacionadas con el mundo de la Oncología. (2002).Recuperado de: www.seom.org/seomcms/images/stories/recursos/.../26/i26.pdf. [9] Ministerio de Salud y Protección Social. Concepto científico acrilamida en panela. (2012). Recuperado de: https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/Biblioteca Digital/RIDE/IA/INS/Concepto-acrilamida-panela.pdf. [10] Reglamento (UE) 2017/2158 de la Comisión, de 20 de noviembre de 2017, por el que se establecen medidas de mitigación y niveles de referencia para reducir la presencia de acrilamida en los alimentos. 57 [11] Sáenz, S. Acrilamida y su presencia en los alimentos. (Trabajo Fin de Grado). Universidad de Soria, Departamento de enfermería, Soria. (2017). [12] Aranda, J. Desarrollo de un método por cromatografía de líquidos de alta resolución para análisis de aminoácidos en ingredientes utilizados en alimentación animal. Universidad Autónoma de nuevo León, Facultad de Agronomía, División de estudios de posgrado. (2002). Recuperado de: http://eprints.uanl.mx/5793/1/1020148806.PDF. [13] Beaver, R.W., Wilson, D.M., Jones, H M. y Haydon, K.D. Amino acid analysis in feeds and feedstuffs using precolumn phenylisothiocyanate derealization and liquid chromatography - Preliminary study. Journal Association of oficial analytical Chemists, Vol.70, 425428. (1987). [14] Cavazos, N. Determinación de aminoácidos libres en jugos de naranja por cromatografía de liquidos de alta resolución. Universidad Autónoma de nuevo León, Facultad de medicina. Tesis. (1994). Recuperado de: http://eprints.uanl.mx/7211/1/1020091227.PDF. [15] Liyanaarachchi G.V.V., Mahanama K.R.R., Somasiri H.P.P.S. y Punyasiri P.A.N. Validation of a reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of free amino acids in rice using L-theanine as the internal standard. Elsevier, Food Chemistry, Vol. 240, 196-203. (2018). [16] González, M. Reacciones de reconocimiento de proteínas. Química de los alimentos. (2017). Recuperado de: http://blog.pucp.edu.pe/blog/quimicaalimentos/ 2017/10/31/reacciones-de-reconocimiento-de-proteinas/. [17] Lindroth, P. y Mopper, K. High performance liquid chromatographic determination of subpicomole amounts of amino acids by precolumn fluorescence derivatization with o-phtaldialdehyde. Analytical chemistry. Vol. 51, nº11, 1667-1674. (1979). [18] Peñafiel, R., Monserrat, F., Solano, F. y Lozano, J.A. Análisis de aminoácidos en muestras biológicas impregnadas en papel de filtro por técnicas fluorimétricas. Aplicación a la detección precoz de errores congénitos del metabolismo. Universidad 64 9.3. MEDIDAS Figura 66: Harina de trigo en agua contaminado con asparagina. Baño maría. Fase móvil 3. Figura 67: Harina de trigo en agua contaminado con acrilamida. Baño maría. Fase móvil 3. Figura 68: Harina de trigo en metanol contaminada con acrilamida. Baño maría. Fase móvil 5. 65 Figura 69: Harina de trigo en metanol contaminada con asparagina. Baño maría. Fase móvil 5.